CN103547286B - 一种用于预防和治疗乙型肝炎的dna疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于治疗乙型肝炎的DNA疫苗组合物,其中该组合物包括表达乙肝表面抗原的重组质粒、表达乙肝核心抗原的重组质粒和重组佐剂质粒。表达乙肝表面抗原的重组质粒优选包含乙肝病毒包膜中蛋白S2S编码基因或乙肝病毒包膜蛋白小蛋白S编码基因。本发明还提供了该DNA疫苗组合物用于预防和/或治疗乙肝病毒感染的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防和/或治疗乙型肝炎的DNA疫苗组合物,具体包括表达乙肝表面抗原的重组质粒、表达乙肝核心抗原的重组质粒和重组佐剂质粒。
背景技术
乙型肝炎严重危害人类健康,目前尚无特效治疗手段,乙肝慢性化的主要原因是乙肝病毒(HBV)感染后机体缺乏持久的特异性细胞免疫及体液免疫。
HBV外壳蛋白是有大蛋白LS(S1S2S抗原,由前S1-前S2-S基因编码)、中蛋白MS(S2S抗原,由前S2-S基因编码)、小蛋白S(S抗原,由S基因编码)三种分子构成,其中,前S2抗原分子量小,抗原性强,涉及乙肝病毒对宿主细胞的吸附。
HBcAg是由乙型肝炎病毒基因C区基因编码,从第2个ATG起始翻译,含183-185个氨基酸多肽,分子量约为21KD,其C端富含精氨酸和多种蛋白酶作用位点,有结合RNA的能力,并与其组装成乙肝核心颗粒密切相关。HBcAg颗粒由多个核心蛋白亚基构成,呈正二十面体对称的颗粒样结构,单个核心蛋白亚基(包括183-185个氨基酸的多肽链)先形成同型二聚体(Homodimer),二聚体再进一步聚集而形成HBcAg颗粒。
Mancini(Mancini M,Hadchouel M,Davis HL,et al.DNA-mediated immunization in a transgenic mouse model of the hepatitis B surface antigen chronic carrier state.Pro Natl Acad Sci USA.1996,93:12496-12501)等应用编码preS2/S HBV包膜蛋白的重组质粒免疫HBV转基因小鼠,证实了DNA疫苗在治疗慢性乙肝携带者的潜在优势。Mancini-Bourgine M等(Mancini-Bourgine M,Fontaine H,Scott-Algara D,et al.Induction or expansion of T-cell responsese by a hepatitis B DanA vaccine administered to chronic HBV carriers.Hepatology.2004,40:874-882)应用编码preS2/S HBV包膜蛋白的重组质粒免疫10例慢性乙肝携带者,这10例携带者未接受过任何的抗病毒治疗。结果发现,他们能够很好地耐受疫苗,其中有2例携带者的 PBMC发生抗原特异性的T淋巴细胞增殖反应,并且HBV特异性分泌IFN-γ的T细胞数目在免疫后有较大幅度的提高,有5例携带者的血清HBV DNA水平下降,但是这种下降仅仅是暂时性的。此次研究也证实了HBV DNA疫苗的安全性以及能够在部分慢性乙肝携带者体内诱导出特异的T细胞免疫应答。
HBcAg作为优势抗原,在乙肝疫苗的研究中也得到了广泛应用,Veremeiko TA等(Veremeiko TA,Lebedev LR,Chikaev NA,et al.Humoral immune response of Balb/c mice immunized with chimer HBcAg proteins carrying the epitopes of surface hepatic B virus protein.Vopr virusol,2007,52:40-45)把HBV外壳蛋白表位插入到HBcAg,成功构建了HBcAg-HBsAg融合蛋白,并以此融合蛋白免疫Balb/cxiaoshi小鼠,产生了高滴度的针对插入表位HBsAg和载体蛋白HBcAg抗体。张炜等(张炜,董生福,孙淑惠,等.乙肝病毒核心抗原DNA疫苗诱导小鼠抗原特异性CD8+T细胞动态变化和动态分布.中国免疫学杂志.2004,20(6):379-383)研究了重组HBcAg真核表达质粒pHBc144对C57BL/6小鼠的免疫作用,结果发现,pHBc144免疫以后抗原特异性CD8+T细胞逐渐增多,在初次免疫的第14天出现第一个免疫应答高峰,此后抗原特异性CD8+T细胞数量逐渐下降进入免疫记忆期并在1年内维持在稳定水平。
中国专利CN1316518A公开了一种重组真核表达质粒pS2S,该质粒中含有细胞集落刺激因子,并将重组疫苗质粒与含IL-2和IFN-γ的重组佐剂质粒联合使用,发现重组佐剂质粒可以提高重组疫苗质粒的免疫和治疗作用。中国专利CN101095951A公开了一种治疗性的HBV DNA疫苗,该疫苗是一种双质粒HBV DNA疫苗,包括重组疫苗质粒pS2.S和重组佐剂质粒pIIF,这种治疗性的双质粒疫苗对Tg-HBV小鼠,能抑制小鼠体内HBV DNA的复制,并降低血清HBsAg和血清ALT的水平,目前这两个项目已进入临床研究阶段。
周陶友等(周陶友,赵连三,陈敏,等.HBsAg和HBcAg融合表达质粒对HBV转基因小鼠的体液免疫治疗效应.中华传染病杂志[J].2005,23(6):372-374)通过构建融合表达质粒pcDNA3.1-SC,以100μg肌肉接种C57BL/6 HBV DNA转基因小鼠,并在2、4周后各加强免疫一次,将乙肝核心C蛋白基因融合到质粒中后,该融合表达质粒不仅能促使小鼠血清抗 -HBs产生,而且也能促进抗-HBc产生,但是抗-HBc的阳转率很低,其阳转水平低于20%。S-H Yang等(S-H Yang,C-G Lee,S-H Park,et al.Correlation of antiviral T-cell responses with suppression of viral rebound in chronic Hepatitis B carriers:a proof-of-concept study.Gene Therapy[J].2006,13:1110-1117)对转基因乙肝小鼠,通过注射给予HB-100疫苗(该疫苗包含5种不同的质粒,分别为pGX10 S、pGX10 S1/S2/X、pGX10 core、pGX10 Pol、pGX10hIL-12N222L),可降低乙肝小鼠体内血清HBV DNA水平,并促使血清HBc-Ab产生。
虽然目前DNA疫苗的研究已取得了一定成果,但其免疫治疗效果仍不令人满意,仍需要开发预防和治疗效果进一步提高的乙肝疫苗产品。
发明内容
本发明提供了一种新的预防和/或治疗乙肝的DNA疫苗组合物,具体地,其是一种由三质粒制成的HBV DNA疫苗组合物。该疫苗组合物对Tg-HBV小鼠显示明显的治疗作用,可使HBV小鼠血清HBV DNA、血清HBsAg水平及血清ALT水平降低,并且可使部分个体HBsAg、HBV DNA转阴,血清ALT恢复至正常水平。本发明的疫苗组合物同时具有较强的HBsAg和HBcAg免疫效果,对乙型肝炎具有显著的预防和治疗作用。
具体地,本发明涉及:
1.一种治疗乙型肝炎的DNA疫苗组合物,包括:表达乙肝表面抗原的重组质粒、表达乙肝核心抗原的重组质粒和重组佐剂质粒。
2.根据项1所述的DNA疫苗组合物,所述表达乙肝表面抗原的重组质粒含乙肝表面抗原蛋白编码基因,该乙肝表面抗原蛋白编码基因优选为乙肝包膜中蛋白S2S编码基因或乙肝表面抗原小蛋白S编码基因。
3.根据项2所述的DNA疫苗组合物,所述乙肝包膜中蛋白编码基因是与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少70%的同源性,且其编码的乙肝表面抗原S2S蛋白具有与天然乙肝表面抗原S2S蛋白相同的免疫原性。
4.根据项3所述的DNA疫苗组合物,所述乙肝包膜中蛋白S2S编码基因具有SEQ ID No.1、No.2、No.3或No.4所示的核苷酸序列。
5.根据项1至4任一项所述的DNA疫苗组合物,其特征在于,所述表达乙肝表面抗原的重组质粒具有SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
6.根据项1-5任一项所述的DNA疫苗组合物,其特征在于,所述表达乙肝核心抗原的重组质粒包含乙肝核心抗原蛋白编码基因。
7.根据项6所述DNA疫苗组合物,所述乙肝核心抗原蛋白编码基因是与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有至少70%的同源性,且其编码的乙肝核心抗原蛋白具有与天然乙肝核心抗原蛋白相同的免疫原性。
8.根据项7所述的DNA疫苗组合物,其特征是所述乙肝核心抗原蛋白编码基因具有SEQ ID No.5、No.6、No.7或No.8所示的核苷酸序列。
9.根据项6-8任一项所述的DNA疫苗组合物,其特征在于所述表达乙肝核心抗原的重组质粒具有SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。
10.根据项1-9任一项所述的DNA疫苗组合物,所述的重组佐剂质粒包含编码选自胸腺肽、G-CSF、IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ的核苷酸序列。
11.根据项10所述的DNA疫苗组合物,其中所述重组佐剂质粒包含编码IL-12的核苷酸序列。
12.项1-11中任意一项所述DNA疫苗组合物在制备预防和治疗乙型肝炎的药物中的用途。
13.一种药物组合物,包括:表达乙肝表面抗原的重组质粒、表达乙肝核心抗原的重组质粒和重组佐剂质粒,以及制药上可接受的载体,其中,所述乙肝表面抗原蛋白优选乙肝包膜中蛋白S2S或乙肝表面抗原小蛋白S;所述佐剂优选IL-12。
14.一种预防和治疗乙型肝炎的方法,包括给哺乳动物施用有效量的项1-11中任意一项所述DNA疫苗组合物或项13的药物组合物。
15.一种疫苗组合物或药物组合物,用于预防和治疗乙型肝炎,该组合物包括表达乙肝表面抗原的重组质粒、表达乙肝核心抗原的重组质粒和重组佐剂质粒,其中,所述乙肝表面抗原优选为乙肝包膜中蛋白S2S或乙肝小蛋白S。
16.一种制品和试剂盒,包含装有本发明疫苗组合物或药物组合物的容器和使用所述疫苗组合物或药物组合物预防和治疗乙肝的说明书。
17.一种微生物,其保藏号为CGMCC No.3726,CGMCC No.3727,CGMCC No.4170和CGMCC No.4181。
附图说明
图1为重组疫苗质粒pRec2.0-S2S(可简称为pS2S)的结构示意图。
图2为重组疫苗质粒pRec2.0-C(可简称为pC)的结构示意图。
图3为重组佐剂质粒phIL12的结构示意图。
图4为重组佐剂质粒pmIL12的结构示意图。
图5为重组疫苗质粒pS2S的酶切电泳图谱,其中:
泳道1为质粒pS2S经Ndel+PstI双酶切图,切出大小为235bp、1294bp和3607bp三条带,其中235bp大小的条带模糊;泳道2为质粒pS2S经PvuII+XbaI双酶切后切出的两条大小为1035bp、4101bp的条带;泳道5为质粒pS2S经EcoRI单酶切后切出的大小约为5136bp的条带;泳道6是未进行酶切的重组质粒pS2S;泳道3为DL15000的分子量标准;泳道4为DL2000的分子量标准。
图6为重组疫苗质粒pC的酶切电泳图谱,其中:
泳道1是质粒pC经NdeI+PstI双酶切后切出的两条大小分别为1294bp、3548bp的条带;泳道2是质粒pC经PstI+XbaI双酶切后切出的两条大小分别为577bp、4265bp的条带;泳道5是质粒pC经PvuII单酶切后切出的大小为484bp、4358bp的两条带;泳道6是质粒经EcoRI单酶切后切出的大小为4842bp的条带;泳道7是未进行酶切的重组疫苗质粒pC;泳道3为DL15000的分子量标准;泳道4为DL2000的分子量标准。
图7是重组佐剂质粒pmIL12酶切电泳图谱,其中:
泳道1为经PstI单酶切后,切出的三条带,大小为275bp、2164bp、3286bp,其中275bp大小条带模糊;泳道2为经NdeI单酶切后切出的两条带,大小分别为1870bp、3855bp;泳道3为经EcoRI+BglII双酶切后切出的两条带,大小分别为1740bp、3985bp;泳道6是质粒经EcoRI单酶切后切出的大小为5725bp的条带;泳道7是未进行酶切的重组佐剂质粒pmIL12;泳道4、5分别为DL15000、DL2000的分子量标准。
图8是重组佐剂质粒phIL12酶切电泳图谱,其中:
泳道1、2分别为DL2000、DL15000分子量标准;泳道3为经HindIII单酶切后,切出的三条带,大小分别为1496bp、1882bp、2343bp;泳道4为经EcoRI+BglII双酶切后,切出的两条带,大小分别为1752、3942bp;泳道5为经EcoRI单酶切后的线性片段,大小约为5694bp;泳道6为未进行酶切的重组佐剂质粒phIL12。
图9a-9b。图9a为ELISA检测不同形式的核心抗原形式HBcAg特异性抗体滴度图,1为将乙肝核心抗原编码基因与乙肝中蛋白编码基因融合至一个质粒中,2为全长乙肝核心抗原编码基因质粒,3为截短后的乙肝核心抗原编码基因质粒,4为阴性对照。图9b为不同形式的乙肝核心抗原IFN-γELISPOT检测HBcAg特异性细胞免疫反应,1为乙肝核心抗原编码基因和乙肝中蛋白编码基因融合至一个质粒上,2为全长的乙肝核心抗原编码基因质粒,3为截短后的乙肝核心抗原编码基因质粒,4为阴性对照。
图10为不同质粒对健康Balb/c小鼠免疫后,IFN-γELISPOT检测特异性细胞免疫(针对HBsAg和HBcAg的细胞免疫)反应图,柱状图中,左至右依次为质粒pRec2.0、pS2S、pC、pS2S-C、pS2S+pC。
图11为IFN-γELISPOT检测特异性细胞免疫(针对HBsAg和HBcAg的细胞免疫)反应图,为加入佐剂质粒pmIL12前后对健康Balb/c小鼠的免疫作用,柱图中从左至右依次为pS2S、pS2S+pmIL12、pS2S+pC、pS2S+pC+pmIL12。
图12a-图12b。图12a为IFN-γELISPOT检测特异性细胞免疫(针对HBsAg和HBcAg的细胞免疫)反应图;图12b为ELISA检测不同免疫方案HBcAg特异性抗体滴度图,柱1为肌肉注射免疫方案,柱2为借助电穿孔免疫方案。
图13a-13b以及图13c-1至图13c-6为对不同组别小鼠免疫后的肝组织切片图。其中图13a为正常小鼠的肝组织切片图,图13b为Tg-HBV小鼠阳性对照组肝组织切片图,图13c-1至图13c-6为给予Tg-HBV小鼠三质粒疫苗pS2S+pC+pmIL12治疗后的小鼠的肝组织切片图,其中三只小鼠肝组织切片与正常组相似。
具体实施方式
本发明的目的之一在于提供一种治疗乙肝的DNA疫苗组合物,该DNA疫苗组合物包含编码乙肝表面抗原的多核苷酸、编码乙肝核心抗原的多核苷酸和编码佐剂,例如细胞因子,如胸腺肽、G-CSF、IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ的多核苷酸,最优选,IL-12。其中,所述乙肝表面抗原优选乙肝包膜中蛋白S2S或乙肝表面抗原小蛋白S,最优选,乙肝表面抗原为乙肝包膜中蛋白S2S。上述多核苷酸通过本领域公知的基因重组方法插入到重组表达载体中,在个 体中表达。
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它多核苷酸的核酸分子。一类载体是“质粒”,指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中,由此随着宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常,在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是载体的最常用形式。
本发明进一步涉及含有编码乙肝表面抗原的多核苷酸的载体、含有编码乙肝核心抗原的多核苷酸的载体,以及编码佐剂的多核苷酸的载体。本发明还涉及这些载体在制备预防和/或治疗乙肝的疫苗组合物的用途,以及所述载体按照本发明所述诱导抗乙型肝炎病毒免疫反应的用途。术语“载体”指本领域技术人员所熟知的任何载体。例如,可以是质粒载体如pBR322、pRec2.0、pcDNA3.1或pUC系列载体。在一优选实施方案中,本发明含有如上所述多核苷酸的载体DNA用作疫苗。该DNA疫苗通过肌内注射进入哺乳动物,例如人个体内,引起由该表达组件编码的蛋白的表达。所表达的蛋白暴露于免疫系统,引起针对乙型肝炎病毒的特异性免疫反应。
在本发明中,“个体”指脊椎动物。在某些实施方案中,脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括,但不限于,牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中,哺乳动物指人。
术语“乙肝包膜中蛋白S2S”、“乙肝表面抗原小蛋白S”和“乙肝核心抗原蛋白”指天然乙肝包膜中蛋白S2S、乙肝表面抗原小蛋白S和乙肝核心抗原蛋白以及它们的衍生物或变体。所述衍生物可以是在上述天然蛋白中取代、缺失和/或插入一个或更多氨基酸所得的蛋白。例如通过保守取代1-50个、1-25个、1-10个、1-5个氨基酸所得的衍生物,且该衍生物具有与上述天然蛋白相同的针对乙型肝炎病毒的抗原性和免疫原性。
本发明中,所述的表达乙肝表面抗原的重组质粒是一种包括乙肝表面抗 原蛋白编码基因的重组质粒,其中,乙肝表面抗原蛋白编码基因优选为乙肝包膜中蛋白S2S的编码基因核苷酸序列或为乙肝表面抗原小蛋白S的编码基因核苷酸序列,更优选为乙肝包膜中蛋白S2S的编码基因核苷酸序列。编码乙肝包膜中蛋白S2S的基因或编码乙肝表面抗原小蛋白S的基因可以是编码全长乙肝包膜中蛋白S2S或乙肝表面抗原小蛋白S的天然核苷酸序列,还可以是该天然核苷酸序列的衍生物或变体。该衍生物与该天然S2S蛋白或小蛋白S编码基因核苷酸序列具有至少70%同源性,优选为具有至少75%同源性,更优选为具有至少80%同源性,更优选为具有至少85%同源性,优选为具有至少90%同源性,更优选为具有至少95%同源性,更优选为具有至少96%,97%,98%,99%同源性,只要所述核苷酸序列编码的蛋白质具有与天然乙肝包膜中蛋白S2S或乙肝表面抗原小蛋白S相同的免疫原性。
本发明中,乙肝包膜中蛋白S2S编码基因优选包含Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3或Seq ID No.4所示的核苷酸序列,或由Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3或Seq ID No.4所示的核苷酸序列组成。
在本发明中,术语“乙肝核心抗原蛋白”、“乙肝核心蛋白”、“乙肝核心抗原”和“乙肝核心蛋白抗原”可互换使用。
在本发明中,所述表达乙肝核心蛋白抗原的重组质粒是一种包括乙肝核心抗原蛋白编码基因的重组质粒,所述的乙肝核心抗原蛋白编码基因可以是天然的编码全长核心抗原蛋白的核苷酸序列,还可以是编码截短的乙肝核心抗原蛋白核苷酸序列,例如,所述截短的乙肝核心蛋白只含N末端的144aa,也可以是与该天然基因核苷酸序列具有至少70%同源性,优选为具有至少75%同源性,更优选为具有至少80%同源性,更优选为具有至少85%同源性,优选为具有至少90%同源性,更优选为具有至少95%同源性,更优选为具有至少96%,97%,98%,99%同源性的核苷酸序列衍生物或变体,只要所述核苷酸序列编码的蛋白质具有与天然乙肝核心蛋白相同的免疫原性。
本发明中,编码乙肝核心抗原蛋白基因的核苷酸序列包含Seq ID No.5、Seq ID No.6、Seq ID No.7、Seq ID No.8所示的核苷酸序列或由Seq ID No.5、Seq ID No.6、Seq ID No.7、Seq ID No.8所示的核苷酸序列组成。
上述乙肝抗原蛋白或其核苷酸序列衍生物或变体可使用本领域已知的方法产生,诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter等,Nucl.Acids Res.13:4331(1986); Zoller等,Nucl.Acids Res.10:6487(1987))、盒式诱变(Wells等,Gene 34:315(1985))、限制性选择诱变(restriction selection mutagenesis)(Wells等,Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317:415(1986))或其它已知技术以产生上述乙肝抗原蛋白变体或DNA变体。
包括在本发明中的与乙肝表面抗原中蛋白S2S、乙肝表面抗原小蛋白S、乙肝核心抗原蛋白或其编码基因有关的术语“衍生物”和“变体”是指与天然对应物相比,其氨基酸序列或核苷酸序列已经以有限的方式被改变。这包括点突变,其可改变蛋白的性质,例如通过在原核系统中表达或除去不希望的活性包括不希望的酶活性。然而,该抗原必须保持与天然抗原足够相似,这样它们可保留疫苗中所希望的抗原性质且因此它们能够引起对天然抗原的免疫反应,即仍然具有与天然抗原相同的抗原性和免疫原性。具体的“衍生物”或“变体”是否引起这类免疫反应可通过适宜的本领域已知的免疫学测定法,例如ELISA(对于抗体反应)或使用细胞标记和细胞因子的适宜染色的流式细胞术(对于细胞反应)测量。
本发明在涉及乙肝表面抗原中蛋白S2S、乙肝表面抗原小蛋白S、乙肝核心抗原蛋白时还涵盖它们的“免疫原性片段”。此处所述免疫原性片段将含有所述抗原的至少一个表位并显示出乙肝表面抗原中蛋白S2S蛋白、乙肝表面抗原小蛋白S或乙肝核心蛋白抗原的免疫原性,且当以适宜的构建体存在时,能够引发针对天然抗原的免疫反应。通常,免疫原性片段含有至少20个,优选50个,更优选100个来自上述抗原蛋白氨基酸序列的连续氨基酸。
上述编码乙肝抗原蛋白的多核苷酸序列可以是与其天然核苷酸序列在严谨条件下杂交的多核苷酸序列。
杂交反应的“严谨度”可以容易的由本领域普通技术人员确定,而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。通常,较长的探针要求较高的温度以正确退火,而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高,可使用的相对温度也越高。结果是,推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格,而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严谨度的另外细节和解释,参见Ausubel等人,《Current Protocols in Molecular Biology》,Wiley Interscience Publishers,1995。
“严谨条件”或“高严谨条件”,如本文中所定义的,可如下鉴别:(1)采 用低离子强度和高温进行洗涤,例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠,50℃;(2)在杂交过程中采用变性剂,诸如甲酰胺,例如50%(v/v)甲酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5,含750mM氯化钠,75mM柠檬酸钠,42℃;或(3)在采用50%甲酰胺,5x SSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠),50mM磷酸钠(pH 6.8),0.1%焦磷酸钠,5x Denhardt氏溶液,超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml),0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃杂交过夜,以及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟,接着在含EDTA的0.1x SSC中于55℃进行10分钟高严格性洗涤。
本发明的疫苗组合物包含重组佐剂质粒,该重组佐剂质粒优选为细胞因子重组佐剂质粒。在本发明的制剂中,优选所述佐剂诱导优先的Th1反应,即为Th1-型佐剂。所谓Th1-型佐剂是当体外使用抗原再次刺激时,刺激分离的T细胞群产生高水平Th1-型细胞因子,并诱导与Th1-型同种型有关的抗原特异性免疫球蛋白反应的佐剂。通常,Th1-型反应与INF-γ、IL-2和IL-12等细胞因子的产生有关。因此,本发明重组佐剂质粒优选为选自INF-γ、IL-2和IL-12的重组佐剂质粒,也可以是选自集落刺激因子和胸腺肽的重组佐剂质粒,或者是表达上述佐剂的任何组合的重组质粒。
可以通过本领域标准方法构建本发明携带乙肝病毒(HBV)蛋白编码基因的重组质粒(重组疫苗质粒)以及携带佐剂编码基因的重组质粒(重组佐剂质粒)。在一个优选的实施方案中,本发明所构建的重组质粒含有携带乙肝病毒(HBV)蛋白编码基因,并含有大肠杆菌复制起始点ColE1、卡那霉素抗性基因序列Kanr、来源于SV40的增强子元件Enhancer、转录调控元件内含子Intron1和外显子Exon1、来源于HBV的转录后调节元件HPRE及免疫调节序列CpG等元件,其中乙肝病毒蛋白基因受增强子、巨细胞病毒启动子、转录调控元件Intron1和Exon1及转录后调节元件HPRE和牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。
在上述构建的重组质粒中,乙肝病毒蛋白编码基因包括编码乙肝包膜中蛋白S2S和乙肝核心抗原蛋白的多核苷酸序列,其中编码乙肝包膜中蛋白S2S和乙肝核心抗原蛋白的多核苷酸序列分别插入到两个不同的重组质粒中,从而分别构建得到重组疫苗质粒pRec2.0-S2S和重组疫苗质粒pRec2.0-C。
在本发明一个实施方案中,所构建的重组佐剂质粒包括白细胞介素12编码基因序列(来自小鼠或人的天然核苷酸序列),还包括大肠杆菌复制起始点ColE1、卡那霉素抗性基因序列Kanr及两个目的蛋白表达盒,以及来源于SV40的增强子元件Enhancer、免疫调节序列CpG等元件。其中,白细胞介素12编码基因是分别将白细胞介素12p35蛋白编码基因和白细胞介素12p40蛋白编码基因插入到同一重组佐剂质粒的不同位置。
在本发明DNA疫苗组合物中,所述的表达乙肝表面抗原的重组疫苗质粒为包含乙肝包膜中蛋白S2S编码基因或乙肝表面抗原小蛋白S编码基因的疫苗质粒,所述重组乙肝核心抗原质粒为包含乙肝核心抗原蛋白编码基因的疫苗质粒,所述重组佐剂质粒为重组白介素12佐剂质粒。
本发明的一个实施方案中,提供了构建本发明重组疫苗质粒pS2S的方法,先构建空载体质粒,并在空载体质粒设置一些调控元件及多处酶切位点,然后将乙肝包膜中蛋白S2S编码基因插入到空载体质粒中,构建得到重组疫苗质粒pS2S。
在本发明的另一个实施方案中,提供了构建本发明重组疫苗质粒pC的方法,将乙肝核心抗原蛋白编码基因插入到预先构建后的空载体质粒中,构建得到重组疫苗质粒pC。
在本发明的再一实施方案中,提供了构建本发明重组佐剂质粒pIL12的方法,将人或鼠的白介素12p35蛋白编码基因和p40蛋白编码基因分别插入到空载体pcDNA3.1中,构建得到人或鼠基因的pcDNA3.1-p35和pcDNA-p40,将构建得到的质粒克隆至重组质粒pS2S,并通过酶切,选择正向克隆的目标物,得到重组佐剂质粒。
本发明中,术语“pRec2.0-S2S”可以简写为“pS2S”;“pRec2.0-C”可以简写为“pC”。
在本发明的再一实施方案中,还提供质粒的制备方法,各质粒(pS2S、pC和pIL12)的制备方法相同,但分开生产,将重组质粒pS2S、pC、pmIL12、phIL12分别转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,含重组质粒的阳性单克隆经发酵培养、扩增,再经裂解和柱纯化后得到提纯的重组质粒,具体可以为:
发酵:在-70℃中取出含有质粒的大肠杆菌DH5α,用接种环沾取少量菌液,于平皿上挑取单克隆置于5-10ml含有相应抗生素的LB液体培养基中,37℃、200rpm培养10-12h,以1∶1000的比例将培养液加入2.5L含相应抗 生素的LB培养基,37℃、200rpm培养12-16h后,将培养物进行离心处理,收集菌体,即得含质粒的发酵培养物。
裂解:将菌体加裂解缓冲液,轻柔的颠倒离心管数次,室温放置,使其裂解充分。
柱层析:裂解后的菌体通过DNA制备柱,洗脱分离,收集质粒并用有机溶剂沉淀,用生理盐水溶解质粒DNA即得。
为了能够更加便捷高效地表达本发明所述的重组疫苗质粒和重组佐剂质粒,还构建了重组质粒的大肠杆菌,应用重组大肠杆菌,可以更为快捷地制备各质粒。
大肠杆菌菌株DH5α/pmIL12,含有重组佐剂质粒pmIL12,通过事先构建重组质粒pmIL12,转化大肠杆菌DH5α菌株后在含卡那霉素抗性的LB平皿中筛选获得,保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所,邮编:100101),保藏日期:2010年04月13日,建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli,保藏编号为:CGMCC No.3726。
大肠杆菌菌株DH5α/phIL12,含有重组佐剂质粒phIL12,通过事先构建重组质粒phIL12,转化大肠杆菌DH5α菌株后在含卡那霉素抗性的LB平皿中筛选获得,保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所,邮编:100101),保藏日期:2010年04月13日,建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli,保藏编号为:CGMCC No.3727。
大肠杆菌菌株DH5α/pRec2.0-S2S,含有重组疫苗质粒pS2S,通过事先构建重组质粒pS2S,转化大肠杆菌DH5α菌株后在含卡那霉素抗性的LB平皿中筛选获得,保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所,邮编:100101),保藏日期:2010年9月15日,建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli,保藏编号为:CGMCC No.4181。
大肠杆菌菌株DH5α/pRec2.0-C,含有重组疫苗质粒pC,通过事先构建重组质粒pC,转化大肠杆菌DH5α菌株后在含卡那霉素抗性的LB平皿中筛选获得,保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所,邮编:100101),保藏日期:2010 年9月15日,建议的分类名为大肠埃希氏菌Escherichia coli,保藏编号为:CGMCC No.4170。
可使用本领域常规方法使核酸,任选包含在载体中的核酸,进入动物个体细胞,例如,将核酸直接肌肉注射到患者体内,或者将其装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利4,892,538和5,283,187),或者通过脂质系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)。将核酸通过脂质体进行包囊化的技术由Fullerton,U.S.Patent 4235877描述。
本发明涉及一种预防和治疗乙肝病毒感染疾病的方法,包括给动物个体施用上述三质粒组合物。同时,本发明还涉及上述三质粒组合物在制备治疗和预防乙肝病毒感染疾病药物中的用途。
施用本发明疫苗组合物的量可选择为在一般疫苗接种者中诱导免疫保护反应,而没有显著的不良副作用的量。这种用量将根据所选择的接种方案而变化。具体疫苗的最佳用量可通过标准研究确定,包括受治疗者中抗体滴度和其它免疫反应的观察。最初接种后,受治疗者可在约4周内接受加强免疫,和随后第二次加强免疫。
如上所述,本发明涉及的组合物是包含乙肝抗原蛋白,例如,乙肝包膜中蛋白S2S或乙肝小蛋白S和乙肝核心抗原蛋白编码基因的表达载体(质粒DNA)的乙肝疫苗组合物,优选,该疫苗组合物中还包含编码佐剂的多核苷酸序列的表达载体(质粒DNA)。优选,所述表达包膜中蛋白S2S的质粒或表达乙肝小蛋白S的质粒与表达乙肝核心抗原蛋白的质粒是不同的,即将编码乙肝表面蛋白(例如乙肝包膜中蛋白S2S或乙肝小蛋白S)和编码乙肝核心蛋白的多核苷酸序列插入到不同的载体中分别表达。因此,本发明的优选实施方案涉及包含三质粒的疫苗组合物,即包含表达乙肝包膜中蛋白S2S的重组质粒或表达乙肝小蛋白S的重组质粒、表达乙肝核心蛋白的重组质粒和重组佐剂质粒。
本发明进一步验证了包含不同乙肝核心蛋白形式的编码基因的三质粒组合物对乙肝的预防和治疗效果。所述的三质粒组合物或者包括编码全长的天然乙肝核心蛋白的多核苷酸序列、或者包括编码截短的天然乙肝核心蛋白的多核苷酸序列、或者包括编码天然乙肝核心蛋白与乙肝包膜中蛋白S2S的多核苷酸序列融合体。通过对健康小鼠的免疫效果对比试验发现,包含编码天然乙肝核心蛋白的三质粒组合物的免疫效果优于包含编码截短或融合的 乙肝核心蛋白多核苷酸序列的三质粒组合物的免疫效果。
在研究中,发明人在构建乙肝核心蛋白与乙肝包膜中蛋白编码基因融合体时,尝试了几种不同的构建方式,即构建优化表达乙肝包膜中蛋白S2S后表达乙肝核心蛋白(S2S-C结合模型),或构建优化表达乙肝核心蛋白后表达乙肝包膜中蛋白(C-S2S模型),将构建所得的质粒注射入动物体内,无论是那种形式,由于两种蛋白的彼此间相互干扰,后表达的蛋白在宿主体内获得的免疫作用很弱;而在发明人将乙肝核心蛋白和乙肝包膜中蛋白编码基因分开至两个载体中,分别构建得到两个乙肝病毒蛋白表达质粒,然后将二者注射到宿主体内时,却发现可以显著降低这二种蛋白在体内的彼此间干扰,从而获得良好的免疫效果。
本发明的再一实施方案中,给出了重组疫苗质粒单用、融合或合用对健康小鼠的免疫治疗效果,即pS2S单用、pC单用、pS2S-C融合形式单用以及pS2S+pC合用四种方式进行免疫,结果证明,pS2S+pC合用形式在小鼠体内可同时获得良好的针对HBsAg和HBcAg的细胞和体液免疫效果,且可将二者的相互影响降到最低,而单用pS2S或pC时,只能获得针对表面抗原或核心抗原的一种免疫效果,当使用pS2S-C融合形式时,虽然可获得针对HBsAg和HBcAg的免疫效果,但针对HBcAg的免疫反应水平与pS2S+pC合用形式相比却大大下降。
在本发明的再一实施方案中,给出了pS2S+pC联合方式时,加入与不加入重组佐剂质粒pmIL12对将抗小鼠的免疫效果对比,加入重组佐剂质粒后,其HBsAg和HBcAg的免疫效果更强。
在本发明的还一实施方案中,提供了对三质粒组合通过不同免疫方式对健康小鼠的免疫影响,即分别采用肌肉注射方式和采用肌肉注射方式配合电穿孔进行免疫,发现借助于电穿孔方式进行免疫,可大幅提升针对HBsAg和HBcAg免疫效果。
在本发明的再一实施方案中,提供了本发明三质粒疫苗组合物对Tg-HBV小鼠的治疗作用,三质粒疫苗组合物可使HBV小鼠血清HBV DNA、血清HBsAg水平及血清ALT水平降低,并有部分HBsAg、HBV DNA转阴,血清ALT恢复至正常水平,对HBV小鼠具有较好的治疗作用。
本发明还涉及包含上述质粒的预防和/或治疗乙肝的疫苗组合物或药物组合物,具体地,该疫苗组合物或药物组合物包括以上所述的表达乙肝表面 抗原的重组疫苗质粒、表达乙肝核心抗原的重组疫苗质粒和重组佐剂质粒,以及制药上可接受的载体。在一个实施方案中,本发明的药物组合物还可以包括其它抗病毒类药物,优选抗乙型肝炎病毒类药物或调节机体免疫反应类药物。
本发明的疫苗组合物或药物组合物可与其它抗病毒类药物,优选抗乙型肝炎病毒类药物和/或调节机体免疫反应类药物同时或顺序施用,例如本发明的疫苗组合物或药物组合物可以在施用所述抗病毒类药物和/或调节机体免疫反应类药物之前、同时和/或之后施用,以达到全面的治疗效果。
本发明还涉及上述质粒、包含所述三质粒的组合物、疫苗组合物或药物组合物在制备预防和/或治疗乙肝病毒感染的药物中的用途,其中,该药物可以和其它抗病毒类药物,优选抗乙型肝炎病毒类药物和/或调节机体免疫反应类药物同时或顺序施用,例如该药物可以在施用所述抗病毒类药物和/或调节机体免疫反应类药物之前、同时和/或之后施用。
本发明还涉及制品和试剂盒,该制品和试剂盒中包含装有本发明疫苗组合物或药物组合物的容器以及使用本发明疫苗组合物或药物组合物预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染的使用说明书。在一个实施方案中,在所述制品和试剂盒中的第一个容器中含有首次接种(初次免疫)所用的本发明的疫苗组合物或药物组合物,在第二个容器中含有二次接种(加强免疫)所用的本发明的疫苗组合物或药物组合物。上述合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成,诸如玻璃或塑料。所述使用说明书指示上述组合物用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染疾病。另外,所述制品或试剂盒还可包括第另外的容器,其中装有药学可接受的缓冲剂,诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。还可包括从商业和用户立场上看所需的其它物质,包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器等。
在一个实施方案中,本发明的制品和试剂盒还可以包含装有其它抗病毒类药物,优选抗乙型肝炎病毒类药物和/或调节机体免疫反应类药物的容器,以及指导本发明的疫苗组合物或药物组合物在所述抗病毒类药物和/或调节机体免疫反应类药物施用之前、同时和/或之后施用的使用说明。
实施例
实施例1:本发明重组疫苗的制备
质粒的构建:
所用试剂及材料:大肠杆菌DH5α购自Invitrogen公司;携带转录后调节元件(HPRE)的DNA质粒pInH、质粒pDRVISV1.0由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室惠赠(该质粒的构建过程及详细资料已在中国专利CN1560259A中完全公开);真核表达质粒pcDNA3.1购自Invitrogen公司;真核表达载体pHPRE(即pInH质粒)由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室构建(该质粒的构建过程及详细资料已在文献DNA Cell Biol.2009 May:28(5):233-40中公开);携带内部核糖体进入位点(IRES)的双顺反子表达质粒pIRESneo购自Clontech公司;293T、COS-7细胞购自于ATCC;小鼠脾细胞以1640完全培养基培养(10%胎牛血清,Invitrogen公司);各种限制性内切酶、pfu聚合酶、DNA连接试剂Sol I均购自NEB公司;质粒抽提纯化试剂盒购自TIANGEN公司;乙肝表面抗原及表面抗体定量ELISA检测试剂盒(化学发光法)购自北京源德生物科技有限公司。小鼠IFN-γ的ELISPOT检测试剂盒购自BD公司。抗原刺激肽由北京赛百盛生物技术有限公司合成。基因合成及基因测序工作委托北京英骏生物科技有限公司进行。
1、重组HBV DNA疫苗质粒pRec2.0-preS2S的构建
(1)先构建重组质粒载体骨架pOE-EKS:
以pDRVISV1.0为模板,以Primer1与Primer2为引物,其中引物2为5’末端磷酸化的引物,扩增获得大小为748bp的复制子区域(Ori),同时引入EcoRI、KpnI及SwaI酶切位点;
引物1:
5’-GGAATTCGGGGTACCATTTAAATTTGAACGTTCGCAAtATGTGAGCAAAAGGCCAGC-3’
引物2:
5’-CGGCGCGCGCCGAAAACGACGATTGCGAACGTTCAACCCGTAGAAAAGATCAAAGG-3’
以pDRVISV1.0为模板,以引物3与引物4为引物,其中引物3为5’末端磷酸化的引物,扩增获得大小为1056bp的卡那霉素抗性标记基因 (Kanr),同时引入EcoRI酶切位点;
引物3:
5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccgTTGAACGTTCGCAAtTCAAGTCAGCGTAATGCTC-3’
引物4:
5’-GGAATTCGGCGCGCGCCGAAAACGACGATGCGAACGTTCAAGAAAGCCACGTTGTGTCT-3’
将上述两个片段分别以EcoRI进行单酶切,连接后构建重组克隆pOK-EKS;
(2)构建重组质粒DNA疫苗pRec2.0-PreS2.S
将合成基因PreS2S通过XhoI+XbaI双酶切与SalI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接,构建获得重组克隆pHPRE-PreS2S;
所用的合成基因PreS2S委托北京雷默生物科技有限公司合成,核苷酸序列Seq ID No.2为优化的S2S蛋白编码基因序列,Seq ID No.2所示的核苷酸序列中未列出其起始端的酶切位点序列及末端的酶切位点及终止序列,合成基因PreS2S的完整序列为在Seq ID No.2所示核苷酸序列的起始端存在CCGCTCGAGCCGCCACC 17个核苷酸,在其末端存在有TTCTAGAGC 9个核苷酸序列。
以pDRVISV1.0为模板,以Primer5与Primer6为引物,扩增获得大小为271bp的BGHpolyA区,同时在上游引入BamHI酶切位点,下游引入BglII-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点;通过BamHI+KpnI双酶切后克隆入BglII+KpnI双酶切的pHPRE-PreS2S载体中,获得重组质粒pHPRE’-PreS2S;
引物5:5’-CGGGATCCgctgtgccttctagttgccag-3’
引物6:
5’-GGGGTACCGTCGACAACGTTGATATCAACGTTAGATCTCATAGAGCCCACCGCATCC-3’
通过EcoRI+KpnI将重组质粒pHPRE’-PreS2S的PreS2S表达盒克隆入载体pOK-EKS中,构建重组质粒pRec2.0-PreS2S。
2、重组HBV DNA疫苗质粒pRec2.0-C的构建
将合成基因CPreS1(核苷酸序列SEQ ID No.11)通过XhoI+XbaI双酶切与SalI+XbaI双酶切的载体pHPRE连接,构建获得重组克隆pHPRE-CPreS1;
以pDRVISV1.0为模板,以引物5与引物6为引物,扩增获得大小为271bp的BGHpolyA区,同时在上游引入BamHI酶切位点,下游引入BglII-EcoRV-SalI-KpnI酶切位点;通过BamHI+KpnI双酶切后克隆入BglII+KpnI双酶切的pHPRE-CPreS1载体中,获得重组质粒pHPRE’-CPreS1;
通过EcoRI+KpnI将重组质粒pHPRE’-CPreS1的CPreS1表达盒克隆入载体pOK-EKS中,构建重组质粒pRec2.0-CPreS1;
以pRec2.0-CPreS1为模板,以引物7与引物8为引物,扩增获得大小为596bp的乙肝核心蛋白基因(C),并通过PstI+XbaI双酶切后克隆入PstI+XbaI双酶切的pRec2.0-CPreS1载体中,获得重组质粒pRec2.0-C,其序列如SEQ ID No.10。
引物7:5’-gtcttttctgcagtcaccgtcgTCGAG-3’
引物8:5’-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3’
构建重组质粒pRec2.0-PreS2S-C
以pRec2.0-C为模板,以引物9与引物8为引物,扩增获得大小为579bp的乙肝核心蛋白基因(C),通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接,构建获得pcDNA3.1-C;
引物9:5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATATTG-3’
引物8:5’-GCTCTAGAATCAACACTGGGATTCGCGGCTCTG-3’
通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-C上切出乙肝核心蛋白(Core)表达盒,克隆入BglII+EcoRV双酶切的pRec2.0-preS2S中,构建获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-C。
3、重组佐剂质粒pmIL12的构建
(1)将合成基因mP35(具有Seq ID No.12所示的核苷酸序列)通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接,构建获得重组质粒pcDNA3.1-mP35;
(2)通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-mP35中切出mP35基因 表达盒,克隆入BglII+EcoRV双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S中,获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-mP35;
(3)将合成基因mP40(具有Seq ID No.13所示的核苷酸序列)通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接,构建获得重组质粒pcDNA3.1-mP40;
(4)通过SalI+PvuII双酶切出mP40基因表达盒,克隆入SalI+SwaI双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S-mP35中,获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-mIL12;
(5)通过NdeI酶切质粒pRec2.0-PreS2S-mIL12,共切出3个条带(1870bp+3448bp+3855bp),回收1870bp片段及3855bp片段,将回收的3855bp片段进行CIP去磷酸化后,与1870bp片段进行连接,筛选正向克隆的重组质粒pmIL12,其核苷酸序列如Seq ID No.16。
4重组佐剂质粒phIL12的构建
(1)将合成基因hP35(具有Seq ID No.14所示的核苷酸序列)通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接,构建获得重组质粒pcDNA3.1-hP35;
(2)通过BglII+PvuII双酶切从质粒pcDNA3.1-hP35中切出hP35基因表达盒,克隆入BglII+EcoRV双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S中,获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-hP35;
(3)将合成基因hP40(具有Seq ID No.15所示的核苷酸序列)通过HindIII+XbaI双酶切与HindIII+XbaI双酶切的载体pcDNA3.1进行连接,构建获得重组质粒pcDNA3.1-hP40;
(4)通过SalI+PvuII双酶切出hP40基因表达盒,克隆入SalI+SwaI双酶切的质粒pRec2.0-PreS2S-hP35中,获得重组质粒pRec2.0-PreS2S-hIL12;
(5)通过NdeI酶切质粒pRec2.0-PreS2S-hIL12,共切出3个条带(1882bp+3446bp+3812bp),回收1882bp片段及3812bp片段,将回收的3812bp片段进行CIP去磷酸化后,与1882bp片段进行连接,筛选正向克隆的重组质粒phIL12,其核苷酸序列如Seq ID No.17。
5、质粒疫苗的制备
疫苗质粒(pS2S、pC)和佐剂质粒(pmIL12、phIL12)的制备方法相 同,各质粒分开生产,具体步骤如下:
1)于平皿上挑取单克隆置于5-10ml含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃,200rpm培养10-12h;
2)以1∶1000的比例将培养液加入2.5L含相应抗生素的LB培养基中,37℃,200rpm培养12-16h;
3)于4℃,6000rpm离心15min,弃去上清,将沉淀重悬于500ml冰预冷的STE溶液中,4℃,6000rpm离心15min,弃去上清;
4)菌体沉淀重悬于125ml的Buffer P1中,振荡至无沉淀团块出现,加入125ml的Buffer P2,轻柔的颠倒离心管数次,室温下静置5min,待裂解充分后加入125ml的Buffer P3,颠倒离心管数次,充分混匀;
5)将混匀后的裂解产物倒入滤器(Mega-Giga Cartridge)中,室温下静置20min以上,打开真空泵加压抽滤,待液体抽滤完毕后,加入50ml的Buffer FWB2,用无菌玻璃棒轻轻搅动沉淀团块,继续进行抽滤;
6)在裂解液中加入30ml的Buffer ER,颠倒混匀,冰浴30min,待溶液澄清后加入预先用75ml的Buffer QBT平衡好的制备柱;
7)待裂解液完全通过DNA制备柱后,用600ml的Buffer QC洗脱杂质,待液体全部过柱后,以100ml的洗脱液Buffer QN洗脱DNA;
8)收集DNA洗脱液,加入70ml的异丙醇,充分混匀后,于12℃,10000rpm离心50min;
9)小心倒去上清,用10ml 70%乙醇洗涤沉淀,倒去乙醇洗液,离心管倒置在纸巾上自然干燥;
10)加入5ml-10ml的生理盐水溶解质粒DNA;
11)分光光度计测定所制备的质粒DNA的浓度,根据测定的质粒浓度相应的进行稀释,稀释为终浓度为1μg/μl(或0.4μg/μl,40ng/μl),-20℃保存。
实施例2:表达不同形式HBcAg的核酸疫苗的免疫效果比较
通过比较截短、全长、全长融合等3种不同形式的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)核酸疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫原性,获得优化的免疫原设计方案。构建经密码子优化的不同形式乙肝病毒HBcAg核酸疫苗,分别为①pRec2.0-Ct:表达截短至144aa的乙肝核心蛋白;②pRec2.0-C表达全长183aa的乙肝核心蛋白;③pRec2.0-CpreS1:表达全长乙肝核心蛋白(Core)和PreS1 融合蛋白。将上述疫苗质粒转染293T细胞,WesternBlot检测目的抗原基因表达。通过肌肉注射法对Balb/c小鼠进行接种免疫后,ELISA方法检测小鼠血清抗-HBc的抗体水平,IFN-γELISPOT方法检测小鼠体内HBcAg特异性T细胞免疫应答。
小鼠分组及免疫:6~8周龄雌性Balb/c小鼠购自军事医学科学院实验动物中心,随机分为以下4组:①阴性对照组,6只小鼠;②pRec2.0-Ct组,12只小鼠;③pRec2.0-C组,12只小鼠;④pRec2.0-C-preS1组,12只小鼠。阴性对照组注射pRec2.0空载体质粒,实验组接种相应核酸疫苗。每只小鼠每次免疫注射质粒DNA 50μg,体积为100μl,每只小鼠两后肢胫前肌处各注射50μl。免疫程序为0、2、4周各免疫一次,第4、6周分别处死各组半数小鼠,采集血清并分离脾淋巴细胞。
结果表明,除阴性对照组小鼠以外,经疫苗免疫后的各组小鼠均产生了HBc抗原特异性抗体和T细胞应答,其中pRec2.0-C组抗-HBc抗体(110.86±87.03U/ml)和T细胞免疫反应水平(IFN-γ:471.3±88.0spots/百万细胞)均显著高于pRec2.0-CpreS1(抗-HBc:34.56±29.51U/ml,IFN-γ:70.8±48.2spots/百万细胞)和pRec2.0-Ct组(抗-HBc:38.60±41.87U/ml,IFN-γ:203.5±126.7spots/百万细胞)(P<0.05)。结论:将HBcAg截短至144个氨基酸或与preS1融合都会降低其体液及细胞免疫效果。
实施例3:重组疫苗质粒pS2S、pC、pS2S-C、pS2S+pC对健康Balb/c小鼠的体液和细胞免疫比较
6-8周龄Balb/c雌性小鼠购自中国医学科学院动物繁殖中心,清洁级饲养。50只小鼠分为5个组,为pRec2.0空质粒组、4个免疫组分别给予重组质粒DNA疫苗pS2S组、重组质粒pC、重组质粒pS2S-C、重组质粒pS2S+pC各50μg进行免疫,每只小鼠按各组剂量注射质粒DNA,体积为100μl,于两后肢胫骨前肌各注射50μl,重组质粒pS2S+pC组给药凡是为质粒pS2S与质粒pC分别注射左右两后肢,免疫程序为0、2、4周各免疫一次,第6周杀鼠取血清并分离淋巴细胞。
(1)、体液免疫检测:取小鼠血清严格按北京源德生物科技公司试剂盒使用说明书方法操作。
(2)、细胞免疫检测:小鼠淋巴细胞制备:颈椎脱臼法处死小鼠,置盛 有75%乙醇的烧杯中,使小鼠体毛完全润湿约3分钟以上,然后切开小鼠腹腔,取出脾脏,将分离的脾脏放于下置无菌烧杯的200目筛网上(有培养液滴),轻轻捻碎脾组织,研磨挤出脾细胞,取5ml无血清1640培养液缓缓冲下细胞至烧杯中,将5ml脾细胞悬浮液缓慢加入装有2.5ml淋巴细胞分离液的15ml离心管中,2000-2500r/min离心20min,收集分离淋巴细胞后,用IC离心洗涤细胞两次,每次1500r/min离心6min,用适量含5%FCS-1640完全培养液重悬分离的脾淋巴细胞,台盼兰染色计数每只小鼠分离淋巴细胞活细胞总数,调整细胞密度至3×105/ml,37℃5%CO2培养箱中培养以供ELISPOT检测。
(3)、ELISPOT检测:严格按BD公司试剂盒使用说明书方法操作,认为符合以下两条者认定为ELISPOT检测HBsAg特异性细胞阳性:(1)一定细胞密度条件下,ELISPOT检测板中同一样品HBsAg与非HBsAg刺激各3个复孔斑点均数(SFC)的比值应不小于2;(2)免疫实验组样品淋巴细胞密度为3×105/ml孔检测是,HBsAg与非HBsAg刺激各3个复孔SFC均数的差值不小于5。
表1 质粒单用与合用对健康Balb/c小鼠的体液和细胞免疫比较
从表1和图10结果可以看出,1)质粒pS2S免疫组,诱导出针对HBsAg抗原的体液免疫值为327.4±146.5mIU/ml,细胞免疫值为271.6±73.9Spots/百万细胞;2)质粒pC免疫组,诱导出的针对HBcAg抗原的体液免疫值为110.8±30.0U/ml,细胞免疫值为471.3±88.0Spots/百万细胞;3)质粒pS2S-C免疫组,其诱导的针对HBsAg抗原的细胞免疫及体液免疫水平与单纯免疫pS2S质粒并没有显著差异,但所诱导的针对HBcAg的体液及细胞免疫反应却显著降低了(P<0.05),其中,细胞免疫检测结果为阴性;4)通过将质粒pS2S与质粒pC分开两腿免疫,从空间上隔开两个抗原彼此间的干扰,该方案可以同时诱导有效的针对HBsAg和HBcAg的细胞免疫及体液免疫反应;5)空载体质粒的HBsAg、HBcAg细胞免疫和体液免疫结果均为阴性。
实施例4:重组疫苗质粒pS2S+p-C与pS2S+pC+pmIL12对健康Balb/c小鼠的体液和细胞免疫比较
6-8周龄Balb/c雌性小鼠购自中国医学科学院动物繁殖中心,清洁级饲养。40只小鼠分为4个组,分别为pS2S组、pS2S+pmIL12组、pS2S+pC组及pS2S+pC+pmIL12组。疫苗质粒及佐剂质粒的用量均为50μg,其中,pS2S+pC组分别在小鼠两腿注射给予质粒pS2S和pC,pS2S+pC+pmIL12组在小鼠两腿分别注射给予pS2S+pmIL12(50+25)μg、pC+pmIL12(50+25)μg,每只小鼠按各组剂量注射质粒DNA,体积为100μl,每只小鼠两后肢胫骨前肌各注射50μl。免疫程序为0、2、4周各免疫一次,第6周杀鼠取血清并分离淋巴细胞。
体液免疫检测、细胞免疫检测及ELISPOT检测方法同实施例3中的方法。结果见表2
表2连同加入佐剂质粒后对健康Balb/c小鼠的免疫效果
从表2和图11中结果可以看出,1)相对于单独免疫pS2S质粒,佐剂质粒pmIL12的加入可以显著提高小鼠所诱导的HBsAg特异性的细胞免疫反应(P<0.05);2)正如实施例3中的描述,将质粒pS2S与质粒pC分开两腿免疫,从空间上隔开两个抗原彼此间的干扰,可以同时诱导有效的针对HBsAg和HBcAg的细胞免疫及体液免疫反应,在此基础上再联合佐剂质粒pmIL12进行小鼠免疫可以进一步提高针对HBsAg和HBcAg抗原的细胞免疫反应;3)佐剂质粒pmIL12的联合应用对于HBsAg和(或)HBcAg特异性的体液免疫反应水平的提高没有明显影响。
实施例5:电穿孔给药方案对健康Balb/c小鼠的体液和细胞免疫反应的影响
6-8周龄Balb/c雌性小鼠购自中国医学科学院动物繁殖中心,清洁级饲养。20只小鼠分为2个组,均给予质粒组合物pS2S+pC+pmIL12(50+50+50)μg进行免疫,一组传统的肌肉注射组,如同实施例4中所述,在小鼠两腿分别注射给予pS2S+pmIL12(50+25)μg、pC+pmIL12(50+25)μg,注射部位为小鼠两后肢胫骨前肌各注射50μl;另一组为电穿孔组,前期的免疫注射方式及剂量与肌肉注射组相同,在肌肉给药后利用WJ-2005电穿孔仪(宁波新芝公司产品)进行小鼠注射部位的电击,电穿孔所用参数为:电压100V、冲击时间60ms、冲击间隔255ms、共电击10次。小鼠的免疫程序为0、2、4周各免疫一次,第6周杀鼠取血清并分离淋巴细胞。体液免疫检测、细胞免疫检测及ELISPOT检测方法同实施例3中的方法,实验结果见表3
表3不同免疫方案对健康Balb/c小鼠的免疫作用
从表3与图结果可以看出,对于三质粒疫苗pS2S+pC+pmIL12,借助电穿孔方式进行免疫,可以显著提高HBsAg及HBcAg抗原特异性细胞免疫反应(P<0.05),而且显著提高了HBcAg抗原特异性的体液免疫反应(P<0.05),现实了电穿孔给药方案在增强免疫反应方面的有效作用。
实施例6:三质粒疫苗pS2S+pC+pmIL12对Tg-HBV小鼠的治疗作用
实验动物:HBV转基因鼠购自北大医学部实验动物科学部,该转基因鼠全称为C57BL/6J-TgN(Alb1HBV)44Bri,引种自美国Jackson实验室,所转移的基因包括HBV S、Pre2S及X基因,转入的HBV基因为ayw亚型,血清乙肝表面抗原(HBsAg)阳性,可稳定垂直传代。10只4~6周龄清洁级转基因鼠全部在北京大学医学部实验动物科学部无菌饲养。
转基因鼠分组及免疫程序:12只Tg-HBV小鼠随机分为两组,其中6只为Tg对照组,注射100μl PBS溶液,并辅予电穿孔免疫给药;6只为Tg实验组,分腿注射乙肝治疗质粒(pC+pmIL12/pS2S+pmIL12,剂量均为50μg+25μg),并辅予电穿孔方式给药。Tg-HBV小鼠每隔2周免疫1次,共注射4次。末次给药后2周进行眼眶采血,并分离血清。处死Tg-HBV小鼠后解剖取肝脏,于固定液中固定,制备肝脏组织切片后进行免疫组化测定。
(1)血清中HBsAg抗原测定结果(ELISA):
实验方法:见梅里埃试剂盒说明书:在板条支架上固定好所需数量的酶标板条,并向指定孔中加入25μL标本稀释液、100μL样品或对照,每个板条支架中包括三个阴性对照和一个阳性对照,于37℃孵育约60分钟,再向每个孔中加入50μL酶结合物溶液,于37℃孵育约60分钟,后用磷酸盐缓冲液将每个小孔清洗和浸泡6次,想每个孔中加入100μL TMB第五,板条置于15-30℃避光孵育约30分钟,后向每个小孔中加入100μL 1mol/l硫酸以终止反应,以620-700nm作为参比波长(双波长发)作为参考,在15分钟内读取450nm时的吸光度,记下其OD值,OD值小于0.1的结果认定为阴性。结果见表4。
表4 HBV DNA疫苗对Tg-HBV小鼠血清HBsAg水平的影响
实验结果显示:Tg实验组中有3只小鼠抗原转阴。
(2)血清中HBsAb、PreS2及HBcAb抗体测定结果
1、HBsAb、PreS2血清抗体水平检测
实验方法:间接ELISA法,化学发光定量检测乙型肝炎核心抗体。
通过酿酒酵母纯化表达、纯化HBsAg VLP颗粒,然后将其包被Elisa酶标板,进行HBsAb抗体水平检测;利用大肠杆菌表达系统表达、纯化PreS2抗原蛋白,然后将其包被Elisa酶标板,进行PreS2抗体水平的检测。结果见表5。
表5 Tg-HBV小鼠血清HBsAb、PreS2抗体检测结果
2、血清HBcAg抗体水平检测
利用北京源德生物医学工程有限公司的乙型肝炎核心抗体(HBcAb)检测试剂盒(化学发光法),进行HBcAb抗体水平的检测,取小鼠血清,按试剂盒上的说明书操作步骤进行检测,结果见表6。
表6 Tg-HBV小鼠血清抗-HBs检测结果
实验结果:从表5和表6的结果可知,Tg实验组中,6只转基因小鼠有3只小鼠HBsAb抗体转阳,5只小鼠的PreS2抗体及HBcAb转阳,5只小鼠HBcAg抗体转阳。
(3)血清中DNA水平检测
乙肝病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒,购自深圳匹基生物工程有限公司,详细检测方法参见试剂盒说明书。
结果判断:
检测样品中5.0×102IU/ml≤HBV DNA≤5.0×107IU/ml,测定结果有效,可直接报告相应浓度值;
检测样本中,HBV DNA>5.0×107IU/ml,可直接报告为>5.0×107IU/ml;
检测样本HBV DNA<5.0×102IU/ml,报告为小于最低检出限,可判断为转阴,检测结果见表7。
表7 HBV DNA疫苗对Tg-HBV小鼠血清HBV DNA水平的影响
实验结果显示:Tg实验组中有3只小鼠的HBV DNA浓度数值低于检 测线以下,表明HBV DNA转阴。
(4)血清ALT水平检测
丙氨酸转移酶试剂盒:购于北京金豪制药股份有限公司。
血清ALT检测方法:(1)于96孔酶标板上,设一孔试剂空白孔,两孔标准孔,空白孔内加蒸馏水20μL,标准孔内分别加校准血清(血浆)20μL,然后每孔加工作液100μL,混匀置37℃温育15分钟;(2)每孔加终止液100μL,混匀,于酶标仪比色,主波长492nm,副波长630nm,输入试剂空白孔、标准孔及测定孔,输入标准浓度,一试剂空白孔调零,进行检测,测定结果按一下公式计算ALT活性:
血清ALT活性(U/L)=测定孔吸光度/标准孔吸光度×56,结果见表8。
表8 HBV DNA疫苗对Tg-HBV小鼠血清ALT水平的影响
实验结果:从表中结果可以看出,Tg实验组中有3只小鼠ATL水平恢复至正常水平。
(5)肝组织免疫组化检测
1 实验材料:
1.1 Tg小鼠肝组织
1.2 抗体来源:Mouse anti-HBsAg单克隆抗体(ZM-0122):中衫金桥生物科技有限公司;
1.3 检测试剂盒:EnVision Detection System(GK500705)DAKO;
1.4 浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9032):中衫金桥生物科技有限公司;
1.5 30%H2O2,规格500ml/瓶,厂家:北京化学试剂公司;
1.6 0.01MPBS(pH7.4)缓冲液实验室自备
2 实验方法
2.1 石蜡切片常规脱蜡去水,去离子水冲洗;
2.2 3%H2O2min室温
2.3 0.01MPBS冲洗3min×3次
2.4 滴加一抗(1∶200),4℃冰箱孵育过夜;
2.5 0.01MPBS冲洗3min×3次;
2.6 滴加EnVision,室温孵育30min;
2.7 0.01MPBS冲洗,3min×3次;
2.8 DAB显色3-5min,去离子水终止显色;
2.9 苏木素复染核-分化-返兰-脱水-透明-封片。
肝组织HBsAg的免疫组化结果(如图13)显示:Tg-HBV阳性对照小鼠细胞浆内呈现大片颗粒状,而经本发明三质粒疫苗治疗后,转阴的小鼠细胞浆内呈及少量颗粒状,与正常小鼠的肝组织切片相似,转阴效果明显。
以上研究结果表明,本发明治疗性三质粒HBV DNA疫苗可使50%的HBV转基因小鼠血清HBsAg及血清HBV DNA转阴,并使半数小鼠血清ALT恢复至正常水平。
Claims (7)
1.一种治疗乙型肝炎的DNA疫苗组合物,其由以下组成:表达乙肝表面抗原的重组质粒、表达乙肝核心抗原的重组质粒和重组佐剂质粒,所述表达乙肝表面抗原的重组质粒含乙肝表面抗原蛋白编码基因,所述乙肝表面抗原蛋白编码基因为乙肝包膜中蛋白S2S编码基因,其中所述乙肝包膜中蛋白S2S编码基因由SEQ ID No.1、No.2、No.3或No.4所示的核苷酸序列组成,其中所述乙肝核心抗原的蛋白编码基因由SEQ ID No.5、No.6、No.7或No.8所示的核苷酸序列组成。
2.权利要求1所述的DNA疫苗组合物,其中所述表达乙肝表面抗原的重组质粒具有SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
3.权利要求1-2任一项所述的DNA疫苗组合物,其中所述表达乙肝核心抗原的重组质粒具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。
4.权利要求1-2任一项所述的DNA疫苗组合物,其中所述的重组佐剂质粒包含编码选自胸腺肽、G-CSF、IL-2、IL-4、IL-12和IFN-γ之一或其任意组合的核苷酸序列。
5.权利要求1-2任一项所述的DNA疫苗组合物在制备预防和治疗哺乳动物乙型肝炎的药物中的用途。
6.一种药物组合物,由以下组成:表达乙肝表面抗原的重组质粒、表达乙肝核心抗原的重组质粒和重组佐剂质粒,以及制药上可接受的载体,其中,所述乙肝表面抗原蛋白为乙肝包膜中蛋白S2S,所述佐剂为IL-12,其中所述乙肝包膜中蛋白S2S的编码基因由SEQ ID No.1、No.2、No.3或No.4所示的核苷酸序列组成,其中所述乙肝核心抗原的蛋白编码基因由SEQ ID No.5、No.6、No.7或No.8所示的核苷酸序列组成。
7.一种制品和试剂盒,包含装有权利要求1-4或6中任一项所述的疫苗组合物或药物组合物的容器和使用所述疫苗组合物或药物组合物预防和治疗乙肝的说明书。
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