ES2199460T3 - Polipeptidos del virus de la hepatitis b. - Google Patents
Polipeptidos del virus de la hepatitis b.Info
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Abstract
Un polipéptido que comprende (i) el fragmento C de la toxina tetánica o un fragmento del mismo de al menos 6 aminoácidos fusionado a (ii) la región pre-S1 del virus de la hepatitis B (VHB) o a un fragmento de la misma de al menos 6 aminoácidos, y/o a la región pre-S2 del VHB o a un fragmento de la misma de al menos 6 aminoácidos, donde el polipéptido induce un anticuerpo que reconoce la región pre-S1 y/o pre-S2 del VHB.
Description
Polipéptidos del virus de la hepatitis B.
Esta invención se refiere a polipéptidos de
fusión derivados del antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B y a su utilización en composiciones para vacuna.
La infección por hepatitis B y las enfermedades
consiguientes que incluyen la enfermedad hepática crónica, cirrosis
y carcinoma hepatocelular son un problema importante de salud en
todo el mundo. La vacunación sistemática de los individuos con
riesgo de exposición al virus ha sido el método principal para
controlar la infección. La primera vacuna contra el virus de la
hepatitis B (VHB) fue fabricada mediante la purificación y la
inactivación del antígeno de superficie del VHB (HBsAg) obtenido
del plasma de portadores crónicos. Ésta fue seguida pronto por la
producción de HBsAg utilizando técnicas de ADN recombinante. Sin
embargo, una proporción significativa de individuos no presenta
respuestas de anticuerpos hacia el HBsAg presente en las
preparaciones de las vacunas y se considera que estos individuos
permanecen susceptibles a la infección por VHB.
La presente invención proporciona un polipéptido
que comprende el fragmento C de la toxina tetánica, o un fragmento
del mismo, fusionado a la región pre-S1 del virus
de la hepatitis B (VHB), o a un fragmento de la misma, y/o a la
región pre-S2 del VHB o a un fragmento de la
misma.
Preferiblemente, dicho fragmento de la región
pre-S1 y de la región pre-S2
contiene al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos 6
aminoácidos, muy preferiblemente 10, 15 ó 20 aminoácidos.
El fragmento C de la toxina tetánica, o un
fragmento del mismo, puede ser fusionado a la región
pre-S1, o a un fragmento de la misma, del virus de
la hepatitis B (VHB) o a la región pre-S2 del VHB,
o a un fragmento de la misma, a través de una región adaptadora
``bisagra''. De forma similar, cuando están presentes un fragmento
de la región pre-S1 y un fragmento de la región
pre-S2, pueden estar unidos por una región
adaptadora ``bisagra''.
La presente invención proporciona además un
polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención.
La presente invención proporciona también
vectores que contienen un polinucleótido que codifica un
polipéptido de la invención unido operativamente a una secuencia
reguladora. Preferiblemente, la secuencia reguladora permite la
expresión del polipéptido en una célula huésped. Típicamente, la
célula huésped es una bacteria, que puede estar atenuada, o una
célula de un animal, más preferiblemente de un mamífero, incluyendo
primates y humanos.
Los polipéptidos, polinucleótidos, vectores y
células huésped de la presente invención pueden ser utilizados en
la prevención o tratamiento de infecciones por el virus de la
hepatitis B. Así, en un aspecto adicional, la presente invención
proporciona una composición para vacuna que contiene un
polipéptido, un polinucleótido o un vector de la invención junto
con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La
composición para vacuna puede contener una bacteria atenuada
transformada con un polinucleótido de la invención. Puede
preferirse la utilización de los polipéptidos de la invención en
combinación con los constituyentes activos de otras composiciones
para vacuna contra el VHB con el fin de incrementar su eficacia.
Por tanto, la composición para vacuna de la invención contiene
además preferiblemente, por ejemplo, los componentes polipeptídicos
de la vacuna contra el VHB descritos en WO88/10301 (esto es, los
componentes antigénicos S, S+pre-S2 y S+aminoácidos
20 a 47 de pre-S1 de ambos subtipos adw y
ayw).
Los polipéptidos de la invención pueden ser
utilizados también para inducir respuestas de anticuerpos en
animales no humanos. Los anticuerpos resultantes pueden ser
anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales, o fragmentos
de los mismos. Estos anticuerpos pueden ser utilizados en un método
para tratar la infección por VHB en un humano o en un animal.
Además de los usos terapéuticos potenciales de
los polipéptidos, polinucleótidos, vectores y anticuerpos de la
invención, pueden ser utilizados también como herramientas para
determinar, por ejemplo, determinantes antigénicos en las regiones
pre-S1 y/o pre-S2 del antígeno de
superficie del VHB (HBsAg). Se cree que ambas regiones juegan
importantes papeles aumentando las respuestas
anti-HBsAg que impiden la fijación del virus a los
hepatocitos y producen anticuerpos que son eficaces en el
aclaramiento del virus, estimulando respuestas inmunes celulares y
solventando la falta de respuesta genética hacia la región S
sola.
\newpage
Los polipéptidos de la invención comprenden el
fragmento C de la toxina tetánica o un epítopo que contenga un
fragmento del mismo fusionado a un fragmento de la región
pre-S1 del virus de la hepatitis B (VHB) y/o a un
fragmento de la región pre-S2 del VHB.
El gen estructural de la toxina tetánica ha sido
clonado y secuenciado (Fairweather y col. (1986), J.
Bacteriol., 165, p21-27). El fragmento C
es un polipéptido de 50 kDa generado mediante el corte con papaína
y contiene, o se corresponde sustancialmente con, los 451
aminoácidos del extremo C. Pueden utilizarse también en los
polipéptidos de la invención fragmentos del fragmento C de la
toxina tetánica que contengan epítopos. Estos fragmentos contendrán
al menos 5 ó 6 aminoácidos, preferiblemente al menos 10
aminoácidos, más preferiblemente al menos 15, 20, 50 ó 100
aminoácidos. Los fragmentos particularmente preferidos incluyen
desde el aminoácido 80 al 180 aproximadamente, el cual es un buen
epítopo de células B, y desde el aminoácido 83 al 103 y desde el
409 al 420 aproximadamente que son buenos epítopos de células T (la
numeración asume que el aminoácido 1 del fragmento C es el
aminoácido 864 de la toxina tetánica completa).
Preferiblemente, el fragmento de la región
pre-S1 y de la región pre-S2
contiene al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos 6
aminoácidos, muy preferiblemente 10, 15 ó 20 aminoácidos. El
fragmento puede incluir, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 19, 20 a
39, 40 a 59, 60 a 79, 80 a 99 ó 100 a 119 de pre-S1
ó 1 a 19, 20 a 39 ó 40 a 55 de pre-S2. Los
fragmentos adecuados que pueden ser utilizados en los polipéptidos
de la invención están descritos en los Ejemplos. Los fragmentos
particularmente preferidos incluyen los aminoácidos 20 ó 21 a 47 de
pre-S1 (el sitio de unión al hepatocito) y los
aminoácidos 1 a 26 y 14 a 32 de pre-S2.
Además, la secuencia de aminoácidos del fragmento
C de la toxina tetánica y de los fragmentos de las regiones
pre-S1 y pre-S2 puede ser modificada
para proporcionar polipéptidos de la invención. Por ejemplo, esto
puede llevarse a cabo con el fin de incrementar la inmunogenicidad
de los polipéptidos de la invención. Pueden realizarse
sustituciones de aminoácidos, por ejemplo desde 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó
30 sustituciones, siempre que el polipéptido modificado conserve
epítopos.
Pueden realizarse sustituciones conservadoras de
acuerdo, por ejemplo, con la Tabla siguiente. Los aminoácidos en el
mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente en la misma
línea de la tercera columna pueden ser sustituidos unos por
otros:
| No polares | G A P | |
| Alifáticos | I L V | |
| Polares - no cargados | C S T M | |
| N Q | ||
| Polares - cargados | D E | |
| K R | ||
| Aromáticos | H F W Y |
El fragmento C de la toxina tetánica puede ser
fusionado al fragmento de la región pre-S1 del virus
de la hepatitis B (VHB) o al fragmento de la región
pre-S2 del VHB a través de una región adaptadora
``bisagra''. De manera similar, cuando están presentes un fragmento
de la región pre-S1 y un fragmento de la región
pre-S2, pueden ser unidos mediante una región
adaptadora ``bisagra''.
La región adaptadora ``bisagra'' es una región
diseñada para estimular el plegamiento independiente del fragmento
C de la toxina tetánica, del fragmento de la región
pre-S1 y del fragmento de la región
pre-S2 proporcionando una separación espacial y
temporal entre los dominios.
La región bisagra es típicamente una secuencia
que codifica una elevada proporción de aminoácidos prolina y/o
glicina. La región bisagra puede estar compuesta totalmente por los
aminoácidos prolina y/o glicina. La región bisagra puede contener
una o más unidades dipeptídicas glicina-prolina.
Alternativamente, la región bisagra puede contener el extremo
carboxi del fragmento C de la toxina tetánica.
La región bisagra puede contener, por ejemplo,
hasta quince aminoácidos aproximadamente, por ejemplo al menos 4 y
preferiblemente de 6 a 14 aminoácidos, siendo el número de
aminoácidos de tal manera que imparta flexibilidad entre los
diferentes dominios polipeptídicos.
En una realización, la región bisagra puede
corresponder sustancialmente al dominio bisagra de un anticuerpo
inmunoglobulina. Las regiones bisagra de los anticuerpos IgG son en
particular ricas en prolina (T.E. Michaelson y col. (1977) J.
Biol. Chem., 252, p883-9), que se cree
que proporcionan una unión flexible entre el dominio de unión al
antígeno y el dominio de la cola.
La glicina puede ser sustituida por otros
aminoácidos, particularmente por aquéllos sin cadenas laterales
voluminosas, tales como alanina, serina, asparragina y
treonina.
En una realización preferida, la región bisagra
es una cadena de cuatro o más aminoácidos que definen la
secuencia:
-[X]p-Pro-[Y]q-Pro-[Z]r-
en la que Pro es prolina, X e Y son cada uno
glicina o un aminoácido que tenga una cadena lateral no voluminosa;
Z es cualquier aminoácido; p es un número entero positivo; q es un
número entero positivo de uno a diez y r es cero o un número entero
positivo mayor que
cero.
Los polinucleótidos de la invención contienen
secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la
invención. Los polinucleótidos de la invención pueden comprender
ADN o ARN. Pueden ser también polinucleótidos que incluyan en ellos
nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la técnica
varios tipos diferentes de modificaciones de oligonucleótidos.
Éstas incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, la
adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o
5' de la molécula. Para los fines de la presente invención, debe
comprenderse que los polinucleótidos descritos en la presente
pueden ser modificados mediante cualquier método disponible en la
técnica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de
incrementar la actividad in vivo o la duración de los
polinucleótidos de la invención.
Los polinucleótidos preferidos de la invención
incluyen también polinucleótidos que codifican cualquiera de los
polipéptidos de la invención descritos anteriormente. Se
comprenderá por las personas expertas que numerosos polinucleótidos
diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de
la degeneración del código genético.
Los polinucleótidos de la invención pueden ser
incorporados a un vector replicable recombinante. El vector puede
ser utilizado para replicar el ácido nucleico en una célula huésped
compatible. Así, en una realización adicional, la invención
proporciona un método para producir polinucleótidos de la invención
mediante la introducción de un polinucleótido de la invención en un
vector replicable, la introducción del vector en una célula huésped
compatible y el crecimiento de la célula huésped bajo condiciones
que originen la replicación del vector. El vector puede ser
recuperado de la célula huésped. Células huésped adecuadas incluyen
bacterias tales como E. coli, levaduras, líneas celulares de
mamífero y otras líneas celulares eucarióticas, por ejemplo células
Sf9 de insecto.
Preferiblemente, un polinucleótido de la
invención en un vector está unido operativamente a una secuencia
reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la
secuencia codificadora por la célula huésped, esto es, el vector es
un vector de expresión. El término ``unido operativamente'' se
refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos
están en una relación que les permite funcionar de la manera
deseada. Una secuencia reguladora ``unida operativamente'' a una
secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión
de la secuencia codificadora se realiza bajo condiciones
compatibles con las secuencias control.
Tales vectores pueden ser transformados o
transfectados a una célula huésped adecuada según se describió
anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de
la invención. Este proceso puede comprender el cultivo de una
célula huésped transformada con un vector de expresión según se
describió anteriormente bajo condiciones que proporcionen la
expresión por el vector de una secuencia codificadora que codifica
los polipéptidos. Los polipéptidos expresados pueden ser
recuperados in vitro. Las células huésped transformadas con
el fin de que proporcionen la expresión estable de los polipéptidos
pueden ser también utilizadas in vivo. Por ejemplo, una
célula huésped tal como una bacteria atenuada transformada para que
exprese un polipéptido de la invención puede ser utilizada como
vacuna. La bacteria atenuada puede ser seleccionada de
Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria y
Yersinia. Más preferiblemente, la bacteria atenuada es una
enterobacteria tal como E. coli o Salmonella, tal
como S. typhis, S. typhimurium o S. enteritidis.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores
plasmídicos o víricos provistos de un origen de replicación,
opcionalmente de un promotor para la expresión de dicho
polinucleótido y opcionalmente de un regulador del promotor. Los
vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables,
por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un
plásmido bacteriano o un gen de resistencia a neomicina para un
vector de mamífero. Los vectores pueden ser utilizados in
vitro para, por ejemplo, la producción de ARN o pueden ser
utilizados para transfectar o transformar una célula huésped. El
vector puede ser también adaptado para ser utilizado in
vivo, por ejemplo en un método de terapia génica.
Los promotores/intensificadores y otras señales
para la regulación de la expresión pueden ser seleccionados para
que sean compatibles con la célula huésped para la que se ha
diseñado el vector de expresión. Por ejemplo, pueden utilizarse
promotores procarióticos, en particular los que son adecuados para
ser utilizados en cepas de E. coli (tal como E. coli
HB101). En una realización particularmente preferida de la
invención, se utiliza un promotor cuya actividad es inducida en
respuesta a un cambio en el entorno circundante, tal como
condiciones anaerobias. Preferiblemente, puede utilizarse un
promotor htrA o nirB. Estos promotores pueden ser utilizados en
particular para expresar los polipéptidos en una bacteria atenuada
para utilización, por ejemplo, como vacuna. Cuando la expresión de
los polipéptidos de la invención se lleva a cabo en células de
mamífero, ya sea in vitro o in vivo, pueden utilizarse
promotores de mamífero. Pueden utilizarse también promotores
específicos de tejidos, por ejemplo promotores específicos de
células hepatocitos. Pueden utilizarse también promotores víricos,
por ejemplo la repetición terminal larga del virus de la leucemia
murina de Moloney (RTL del VLMM), el promotor RTL del virus del
sarcoma de Rous (VSR), el promotor de SV40, el promotor IE de
citomegalovirus (CMV) humano, promotores del virus del herpes
simple o promotores de adenovirus. Todos estos promotores están
fácilmente disponibles en la técnica.
Los polipéptidos de la invención pueden ser
administrados mediante inyección directa. Preferiblemente, los
polipéptidos son combinados con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable para producir una composición
farmacéutica. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen
soluciones salinas isotónicas, por ejemplo solución salina
tamponada con fosfato. La composición puede ser formulada para
administración parenteral, intramuscular, intravenosa, intranasal,
subcutánea, intraocular o transdérmica. Típicamente, cada
polipéptido es administrado a una dosis desde 0,01 a 30 \mug/kg
de peso corporal, preferiblemente de 0,1 a 10 \mug/kg, más
preferiblemente de 0,1 a 1 \mug/kg de peso corporal. Es también
posible utilizar anticuerpos preparados utilizando los polipéptidos
de la invención, según se describe más adelante, para tratar o
prevenir la infección por el VHB. Anticuerpos neutralizantes, o
fragmentos de los mismos que conserven la especificidad por los
antígenos del VHB, pueden ser administrados de manera similar a la
de los polipéptidos de la invención.
Los polinucleótidos de la invención pueden ser
administrados directamente como una construcción de ácido nucleico
desnudo, conteniendo preferiblemente además secuencias flanqueantes
homólogas al genoma de la célula huésped. Cuando el casete de
expresión es administrado como un ácido nucleico desnudo, la
cantidad de ácido nucleico administrada está típicamente en el
rango de 1 \mug a 10 mg, preferiblemente de 100 \mug a 1
mg.
La captación de construcciones de ácido nucleico
desnudo por células de mamífero es incrementada por varias técnicas
de transfección conocidas, por ejemplo aquéllas que incluyen la
utilización de agentes de transfección. Ejemplos de estos agentes
incluyen agentes catiónicos (por ejemplo, fosfato de calcio y
DEAE-dextrano) y lipofectantes (por ejemplo
Lipofectam™ y Transfectam™). Típicamente, las construcciones de
ácido nucleico son mezcladas con el agente de transfección para
producir una composición.
Preferiblemente, el polinucleótido o el vector de
la invención es combinado con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable para producir una composición
farmacéutica. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen
soluciones salinas isotónicas, por ejemplo solución salina
tamponada con fosfato. La composición puede ser formulada para
administración parenteral, intramuscular, intravenosa, subcutánea,
intraocular o transdérmica.
Las vías de administración y las dosis descritas
tienen la intención de ser solamente una guía, ya que un médico
experto será capaz de determinar fácilmente la vía de
administración óptima y la dosis óptima para cualquier paciente y
condición particular.
Las vacunas pueden ser preparadas a partir de uno
o más polipéptidos de la invención. Pueden incluir también uno o
más polipéptidos inmunogénicos del VHB, por ejemplo los
polipéptidos inmunogénicos del VHB conocidos en la técnica. Por
tanto, una vacuna de la invención puede contener uno o más
polipéptidos de la invención y, opcionalmente, uno o más
polipéptidos seleccionados de los polipéptidos S,
pre-S1, pre-S2 del VHB y fragmentos
inmunogénicos de los mismos.
Los polipéptidos de la invención pueden ser
formulados en la vacuna como formas neutras o sales. Las sales
farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido
(formadas con los grupos amino libres del péptido) y que están
formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido
clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como ácido
acético, oxálico, tartárico y maleico. Las sales formadas con los
grupos carboxilo libres pueden derivar también de bases inorgánicas
tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio,
calcio o férrico, y de bases orgánicas tales como isopropilamina,
trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina y
procaína.
La preparación de vacunas que contienen
polipéptido(s) inmunogénico(s) como
ingrediente(s) activo(s) es conocida por los expertos
en la técnica. Típicamente, tales vacunas son preparadas como
inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; pueden
prepararse también formas sólidas adecuadas para solución, o
suspensión, en un líquido antes de la inyección. La preparación
puede estar también emulsionada, o la proteína puede estar
encapsulada en liposomas.
La vacuna puede contener una bacteria atenuada
capaz de expresar el polipéptido de la invención.
Los ingredientes inmunogénicos activos son a
menudo mezclados con excipientes que sean farmacéuticamente
aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Excipientes
adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa,
glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos.
Además, si se desea, la vacuna puede contener
pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes
humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes de pH y/o
adyuvantes que incrementen la eficacia de la vacuna. Ejemplos de
adyuvantes que pueden ser eficaces incluyen, pero no se limitan a:
hidróxido de aluminio,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP),
N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina
(CGP 11637, referida como nor-MDP),
N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina
(CGP 19835A, referida como MTP-PE) y RIBI, que
contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil
lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular
(MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween 80. La
eficacia de un adyuvante puede ser determinada midiendo la cantidad
de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido inmunogénico que
contenga una secuencia antigénica del VHB que resultan de la
administración de este polipéptido en vacunas que contienen también
los diferentes adyuvantes.
Las vacunas son administradas de manera
convencional parenteralmente, por inyección, por ejemplo
subcutáneamente o intramuscularmente. Formulaciones adicionales que
son adecuadas para otros modos de administración incluyen
supositorios y formulaciones intranasales. Pueden proporcionarse
formulaciones orales, en particular para la administración de una
bacteria atenuada. Para supositorios, los aglutinantes y vehículos
tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilén glicoles o
triglicéridos; tales supositorios pueden ser formados a partir de
mezclas que contengan el ingrediente activo en el rango del 0,5% al
10%, preferiblemente del 1% al 2%. Las formulaciones orales
incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo,
grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de
magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y
similares. Estas composiciones tienen la forma de soluciones,
suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones o polvos
de liberación mantenida y contienen de un 10% a un 95% de
ingrediente activo, preferiblemente de un 25% a un 70%.
La vacuna que contiene, por ejemplo, una bacteria
atenuada es presentada de forma ventajosa en forma liofilizada,
por ejemplo en forma capsular, para la administración oral a un
paciente. Tales cápsulas, tabletas y píldoras para administración
oral a un paciente pueden ser proporcionadas con un revestimiento
entérico conteniendo, por ejemplo, Eudragit ``S'', Eudragit ``L'',
acetato de celulosa, ftalato acetato de celulosa o
hidroxipropilmetil celulosa. Estas cápsulas pueden ser utilizadas
como tales o, alternativamente, el material liofilizado puede ser
reconstituido antes de la administración, por ejemplo como una
suspensión. La reconstitución de efectúa de manera ventajosa en un
tampón a un pH adecuado para asegurar la viabilidad de los
organismos. Con el fin de proteger a las bacterias atenuadas y a la
vacuna de la acidez gástrica, se administra de manera ventajosa una
preparación de bicarbonato de sodio antes de cada administración de
la vacuna.
Las vacunas son administradas en una forma
compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad
tal que sean profilácticamente y/o terapéuticamente eficaces. La
cantidad a administrar, que está generalmente en el rango de 5
\mug a 250 \mug de antígeno por dosis, depende del sujeto que
va a ser tratado, de la capacidad del sistema inmune del sujeto
para sintetizar anticuerpos y del grado de protección deseado. Las
cantidades precisas requeridas de ingrediente activo para ser
administradas pueden depender del criterio del médico y pueden ser
peculiares para cada sujeto.
La vacuna puede ser administrada en un programa
de una sola dosis, o preferiblemente en un programa de múltiples
dosis. Un programa de múltiples dosis es uno en el que un ciclo
primario de vacunación puede ser con 1-10 dosis
separadas, seguido por otras dosis administradas a intervalos de
tiempos posteriores requeridas para mantener y/o reforzar la
respuesta inmune, por ejemplo de 1 a 4 meses para la segunda dosis
y, si se necesita, dosis posterior(es) después de varios
meses. El régimen de dosificación estará también determinado, al
menos en parte, por la necesidad del individuo y dependerá del
criterio del médico.
Además, la vacuna que contiene el(los)
antígeno(s) inmunogénico(s) del VHB puede ser
administrada junto con otros agentes inmunorreguladores, por
ejemplo inmunoglobulinas.
Los polipéptidos inmunogénicos preparados según
se describió anteriormente pueden ser utilizados para producir
anticuerpos, policlonales y monoclonales. Si se desean anticuerpos
policlonales, un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo,
cabra, caballo, etc.) es inmunizado con un polipéptido inmunogénico
que lleve epítopo(s) del VHB. El suero del animal inmunizado
es recogido y tratado de acuerdo con procedimientos conocidos. Si
el suero que contiene anticuerpos policlonales hacia un epítopo del
VHB contiene anticuerpos hacia otros antígenos, los anticuerpos
policlonales pueden ser purificados mediante cromatografía de
inmunoafinidad. Las técnicas para producir y procesar antisueros
policlonales son conocidas en el oficio.
Pueden producirse también fácilmente por una
persona experta en la técnica anticuerpos monoclonales dirigidos
contra epítopos del VHB en los polipéptidos de la invención. La
metodología general para producir anticuerpos monoclonales por
hibridomas es bien conocida. Pueden crearse líneas celulares
inmortales productoras de anticuerpos mediante fusión celular, y
también mediante otras técnicas tales como la transformación
directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o la transfección con
el virus de Epstein-Barr. Paneles de anticuerpos
monoclonales producidos contra epítopos del VHB pueden ser
sometidos a selección por diferentes propiedades; esto es, por
afinidad de isotipo y epítopo.
Los anticuerpos, monoclonales y policlonales, que
están dirigidos contra epítopos del VHB son particularmente útiles
en diagnóstico, y los que son neutralizantes son útiles en
inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales, en particular,
pueden ser utilizados para producir anticuerpos
anti-idiotipo. Los anticuerpos
anti-idiotipo son inmunoglobulinas que llevan una
``imagen interna'' del antígeno del agente infeccioso contra el que
se desea protección.
Las técnicas para producir anticuerpos
anti-idiotipo son conocidas en el oficio. Estos
anticuerpos anti-idiotipo pueden ser también útiles
para el tratamiento del VHB, así como para elucidar las regiones
inmunogénicas de antígenos del VHB.
Es también posible utilizar fragmentos de los
anticuerpos anteriormente descritos, por ejemplo fragmentos
Fab.
Los polipéptidos de la invención y los
anticuerpos producidos utilizando los polipéptidos de la invención
pueden ser ambos utilizados en métodos de inmunoensayo, por ejemplo
los que reaccionan inmunológicamente con suero conteniendo
anticuerpos hacia el VHB, por ejemplo para detectar la presencia de
anticuerpos hacia el VHB, o la presencia de antígenos víricos, en
muestras biológicas, incluyendo por ejemplo muestras de sangre o
suero. En particular, los polipéptidos y anticuerpos de la
invención pueden ser utilizados para mapear regiones altamente
inmunogénicas dentro de las regiones pre-S1 y
pre-S2 del HBsAg. El diseño de los inmunoensayos
está sometido a una gran variación, y se conoce en la técnica una
variedad de estos inmunoensayos. Por ejemplo, el inmunoensayo puede
utilizar un antígeno vírico, por ejemplo un polipéptido de la
invención; o alternativamente, el inmunoensayo puede utilizar una
combinación de antígenos víricos incluyendo un polipéptido de la
invención. Puede utilizar también, por ejemplo, un anticuerpo
obtenido utilizando un método de la invención o una combinación de
estos anticuerpos dirigidos hacia un antígeno vírico o hacia varios
antígenos víricos. Los protocolos pueden estar basados, por
ejemplo, en ensayos de competición o de reacción directa, o en
ensayos de tipo sándwich. Los protocolos de inmunoensayo utilizados
pueden también, por ejemplo, utilizar soportes sólidos o pueden ser
por inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican la
utilización de un anticuerpo o de un polipéptido marcado; las
marcas pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminiscentes,
radioactivas o moléculas de colorante. Se conocen también ensayos
que amplifican las señales de la sonda; ejemplos de los cuales son
ensayos que utilizan biotina y avidina, e inmunoensayos mediados y
marcados por un enzima, tales como ensayos de ELISA.
La invención será descrita con referencia a los
Ejemplos siguientes, que tienen la intención de ser solamente
ilustrativos y no limitantes. Los Ejemplos se refieren a las
Figuras. En relación a las Figuras con más detalle:
La Figura 1 representa el esquema de clonaje del
plásmido pTECH3.
a) Respuesta de inmunoglobulinas totales,
anti-Fragmento C, 14 días después de la dosis de
estimulación con las proteínas de fusión purificadas
(\blacksquare) Fragmento C-S\DeltaS1/S2 y
(\medbullet) Fragmento C-B\DeltaS1/S2.
Respuesta del suero de ratón normal (no inmunizado)
(\blacktriangle).
b) Respuesta de inmunoglobulinas totales,
anti-Fragmento C, 7 días después de la dosis de
refuerzo con las proteínas de fusión purificadas (\blacksquare)
Fragmento C-S\DeltaS1/S2 y (\medbullet)
Fragmento C-B\DeltaS1/S2. Respuesta del suero de
ratón normal (no inmunizado) (\blacktriangle).
a) Respuesta de inmunoglobulinas totales,
anti-S1 (péptido de aa61-81), 14
días después de la dosis de estimulación con las proteínas de
fusión purificadas (\blacksquare) Fragmento
C-S\DeltaS1/S2 y (\medbullet) Fragmento
C-B\DeltaS1/S2. Respuesta del suero de ratón
normal (no inmunizado) (\blacktriangle).
b) Respuesta de inmunoglobulinas totales,
anti-S1 (péptido de aa61-81), 7
días después de la dosis de refuerzo con las proteínas de fusión
purificadas (\blacksquare) Fragmento
C-S\DeltaS1/S2 y (\medbullet) Fragmento
C-B\DeltaS1/S2. Respuesta del suero de ratón
normal (no inmunizado) (\blacktriangle).
a) Respuesta de inmunoglobulinas totales,
anti-S1 (péptido de aa12-24), 14
días después de la dosis de estimulación con las proteínas de
fusión purificadas (\blacksquare) Fragmento
C-S\DeltaS1/S2 y (\medbullet) Fragmento
C-B\DeltaS1/S2. Respuesta del suero de ratón
normal (no inmunizado) (\blacktriangle).
b) Respuesta de inmunoglobulinas totales,
anti-S1 (péptido de aa12-24), 7
días después de la dosis de refuerzo con las proteínas de fusión
purificadas (\blacksquare) Fragmento
C-S\DeltaS1/S2 y (\medbullet) Fragmento
C-B\DeltaS1/S2. Respuesta del suero de ratón
normal (no inmunizado) (\blacktriangle).
a) Respuesta de inmunoglobulinas totales,
anti-S1 (péptido de aa21-47,
presente en partículas S-pre-S1), 14
días después de la dosis de estimulación con las proteínas de
fusión purificadas (\blacksquare) Fragmento
C-S\DeltaS1/S2 y (\medbullet) Fragmento
C-B\DeltaS1/S2. Respuesta del suero de ratón
normal (no inmunizado) (\blacktriangle).
b) Respuesta de inmunoglobulinas totales,
anti-S1 (péptido de aa21-47,
presente en partículas S-pre-S1), 7
días después de la dosis de refuerzo con las proteínas de fusión
purificadas (\blacksquare) Fragmento
C-S\DeltaS1/S2 y (\medbullet) Fragmento
C-B\DeltaS1/S2. Respuesta del suero de ratón
normal (no inmunizado) (\blacktriangle).
El plásmido pTECH-3, el vector de
expresión básico utilizado en estos ejemplos, fue preparado según
se muestra en la Figura 1 a partir de pTECH-2 y
pTEThtrA-1 según esta descrito en nuestra solicitud
anterior PCT/GB95/00196. El pTECH-3 contiene una
secuencia que codifica el fragmento C de la toxina tetánica y
contiene una región bisagra, unidas operativamente al promotor
htrA.
Las construcciones descritas en la tabla
siguiente fueron construidas según sigue:
| Construcción | Secuencia de la hepatitis B |
| pTECH3/S1 | aa21-47 de pre-S1_{ayw} |
| pTECH3/S2 | aa1-55 de pre-S2_{ayw} |
| pTECH3/S1/S2 | aa21-47 de pre-S1_{ayw}/aa1-55 de pre-S2_{ayw} |
| pTECH3/SB | aa120-147 de S_{ayw} |
| pTECH3/S\DeltaS1/S2 | aa21-119 de pre-S1_{adw}/aa1-55 de S2_{adw} |
| pTECH3/B\DeltaS1/S2 | aa42-119 de pre-S1_{adw}/aa1-55 de S2_{adw} |
| pTECH3/WS1/S2 | aa1-119 de pre-S1_{adw}/aa1-55 de S2_{adw} |
El plásmido pMBdS1RN/44 (que contiene el gen de
pre-S1(20/47)/S de la hepatitis B ayw)
fue utilizado como molde para construir pTECH3/S1, pTECH3/SB y
pTECH3/S1/S2. El pMByS2/8 (que contiene el gen de
pre-S2(1-55)/S de la
hepatitis B ayw) fue utilizado como molde para pTECH3/S2 y
pTECH3/S1/S2 y pRIT12793 (que contiene el gen de
pre-S1/S2 de la hepatitis B adw completo en
pBR322) fue utilizado para pTECH3/S\DeltaS1/S2,
pTECH3/B\DeltaS1/S2 y pTECH3/WS1/S2.
Los pares de cebadores siguientes fueron
utilizados para clonar mediante PCR, utilizando condiciones
estándar, las secuencias de pre-S1/S2 de la
hepatitis B para inserción en pTECH3:
| Cebador | Secuencia |
| MGR178(SB) | ACTCTAGATGCAAAACCTGC |
| MGR179(SB) | TAACTAGTAATACAGGTGCA |
| MGR104(S1 y S1/S2) | ATGTCTAGAAATCCTCTGGGATTC |
| MGR238(S2 y S1/S2) | AAGCTTATGCAGTGGAATTCCAGA |
| MGR105(S1) | CGAACTAGTGTTGGGATTGAAGTC |
| MGR106(S2) | AGGGTCACTAGTCCTCGAGAAGAT |
| MGR252(S\DeltaS1/S2) | TCTGTTGCTAGCCCTCTGGGATTC |
(Continuación)
| Cebador | Secuencia |
| MGR254(B\DeltaS1/S2) | TCAAACGCTAGCGATTGGGACTTC |
| MGR243(S\Delta y B\DeltaS1/S2) | TTGCTAGCGTTCAGCGCAGGGTCC |
| MGR250(W31/S2) | CCCGCTAGCATGGGAGGTTGGTCA |
Cada fragmento de PCR fue digerido con enzimas de
restricción, purificado en gel y ligado con un fragmento de pTECH3
de 3,76 kpb. Las primeras cuatro construcciones se produjeron
mediante digestión del plásmido pTECH3 con XbaI/SpeI/CIAP para
producir el fragmento de 3,76 kpb. El fragmento de PCR del VHB
apropiado que había sido precortado con NheI fue ligado
posteriormente al fragmento de 3,76 kpb. Las dos últimas
construcciones fueron producidas mediante digestión del plásmido
pTECH3 con XbaI/CIAP para producir el fragmento de 3,76 kpb que fue
ligado posteriormente con el producto de PCR del VHB apropiado que
había sido precortado con NheI.
Los plásmidos fueron transformados en E.
coli cepa HB101 utilizando técnicas estándar. La expresión de
los polipéptidos de fusión fue inducida mediante estrés térmico a
37ºC. La expresión fue analizada mediante transferencia Western de
extractos celulares de E. coli con un anticuerpo
anti-fragmento C de la toxina tetánica y anticuerpos
específicos para cada secuencia del inserto (ver la Tabla 2).
Los polipéptidos de fusión producidos en el
Ejemplo 2 a partir de los plásmidos pTECH3/S\DeltaS1/S2 y
pTECH3/
B\DeltaS1/S2 fueron purificados de extractos celulares de E. coli mediante cromatografía de afinidad utilizando anti-fragmento C de la toxina tetánica como ligando inmovilizado en una columna de Sefarosa 4B. Las proteínas purificadas fueron preparadas para inyección y administradas a ratones (B10, hembras, 6-8 semanas de edad) utilizando técnicas estándar y según se detalla a continuación.
B\DeltaS1/S2 fueron purificados de extractos celulares de E. coli mediante cromatografía de afinidad utilizando anti-fragmento C de la toxina tetánica como ligando inmovilizado en una columna de Sefarosa 4B. Las proteínas purificadas fueron preparadas para inyección y administradas a ratones (B10, hembras, 6-8 semanas de edad) utilizando técnicas estándar y según se detalla a continuación.
Grupo
1
Inmunizar ratones (dosis de estimulación)
intraperitonealmente I/P con 5 \mug de la proteína de fusión
Frag
C-S\DeltaS1/S2 purificada.
C-S\DeltaS1/S2 purificada.
Extraer una muestra de sangre 14 días después de
la dosis de estimulación.
Inmunizar los ratones (dosis de refuerzo) I/P con
5 \mug de la proteína de fusión Frag
C-S\DeltaS1/S2 purificada, 21 días después de la
dosis de estimulación.
Sangrar a los ratones 7 días después de la dosis
de refuerzo.
Grupo
2
Inmunizar ratones (dosis de estimulación)
intraperitonealmente I/P con 5 \mug de la proteína de fusión
Frag
C-B\DeltaS1/S2 purificada.
C-B\DeltaS1/S2 purificada.
Extraer una muestra de sangre 14 días después de
la dosis de estimulación.
Inmunizar los ratones (dosis de refuerzo) I/P con
5 \mug de la proteína de fusión Frag
C-B\DeltaS1/S2 purificada, 21 días después de la
dosis de estimulación.
Sangrar a los ratones 7 días después de la dosis
de refuerzo.
Las respuestas de anticuerpos totales fueron
determinadas mediante ELISA frente a los péptidos purificados
fragmento C, pre-S1 (aa61-81),
pre-S2 (aa12-24) y
pre-S1 (aa21-47) contenido en
partículas S-S1. Las respuestas están ilustradas en
las Figuras 2, 3, 4 y 5 respectivamente.
En resumen, se detectaron respuestas hacia los
componentes pre-S1 y pre-S2 de las
proteínas de fusión, y hacia la proteína transportadora fragmento
C.
| Transferencias Western | ||||||
| Construcción | Secuencia de | Frag C^{(a)} | S1 | S1 | S2^{(d)} | S^{(e)} |
| la hepatitis B | (20-47)^{(b)} | (61-81)^{(c)} | ||||
| pTECH3/S1 | aa21-47 de pre-S1_{ayw} | + | + | NR | NR | NR |
| pTECH3/S2 | aa1-15 de pre-S2_{ayw} | + | NR | NR | + | NR |
| pTECH3/S1/S2 | aa21-47 de pre-S1_{ayw}/ | + | NR | NR | + | NR |
| aa1-55 de pre-S2_{ayw} | ||||||
| pTECH3/SB | aa120-147 de S_{ayw} | + | + | NR | NR | + |
| pTECH3/S\DeltaS1/S2 | aa21-119 de pre-S1_{adw}/ | + | + | + | + | NR |
| aa1-55 de S2_{adw} | ||||||
| pTECH3/B\DeltaS1/S2 | aa42-119 de pre-S1_{adw}/ | + | + | + | + | NR |
| aa1-55 de S2_{adw} | ||||||
| pTECH3/WS1/S2 | aa1-119 de pre-S1_{adw}/ | + | + | NR | + | NR |
| aa1-55 de S2_{adw} | ||||||
| (a) Suero policlonal de conejo anti-Frag C AB96-05 14/3/97 1:100. | ||||||
| (b) Monoclonal de ratón anti-S1 (20-47) 18/7/97 (de Speke) 1:1000. | ||||||
| (c) Policlonal de conejo anti-S1 (60-80) RA2138 Conejo 9393 27/7/87 1:400. | ||||||
| (d) Monoclonal de ratón anti-S2 1-901 sobrenadante celular recogido el 20/11/97. Fre 26/11/97 1:10. | ||||||
| (e) Policlonal de ratón (SWR/J) anti-HB147 (VRU, Imperial College) 1:50. | ||||||
| NR = no realizado. |
Claims (15)
1. Un polipéptido que comprende
- (i)
- el fragmento C de la toxina tetánica o un fragmento del mismo de al menos 6 aminoácidos fusionado a
- (ii)
- la región pre-S1 del virus de la hepatitis B (VHB) o a un fragmento de la misma de al menos 6 aminoácidos, y/o a la región pre-S2 del VHB o a un fragmento de la misma de al menos 6 aminoácidos,
donde el polipéptido induce un anticuerpo que
reconoce la región pre-S1 y/o
pre-S2 del
VHB.
2. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende un fragmento del fragmento C de la
toxina tetánica de al menos 100 aminoácidos.
3. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende el fragmento C de longitud
completa.
4. Un polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1, 2 ó 3 que comprende un fragmento de la región
pre-S1 de al menos 20 aminoácidos y/o un fragmento
de la región pre-S2 de al menos 20 aminoácidos.
5. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que incluye los aminoácidos 20 a
47 ó 21 a 47 de la región pre-S1.
6. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, que incluye los aminoácidos 1 a
26 ó 14 a 32 de la región pre-S2.
7. Un polinucleótido que codifica un polipéptido
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
8. Un vector que contiene un polinucleótido de
acuerdo con la reivindicación 7 unido operativamente a una
secuencia reguladora.
9. Un vector de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que dicha secuencia reguladora comprende una secuencia del
promotor htrA.
10. Una célula huésped que contiene un vector de
acuerdo con la reivindicación 8 ó 9.
11. Una célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 10, que es una bacteria.
12. Una composición para vacuna que contiene un
polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 7 o un vector
de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, junto con un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable.
13. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 7 o un vector de acuerdo con la reivindicación 8 ó
9, para utilización en un método de tratamiento o prevención de la
infección por el VHB en un humano o en un animal.
14. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, un polinucleótido de acuerdo con la
reivindicación 7 o un vector de acuerdo con la reivindicación 8 ó
9, para ser utilizados en un método para producir anticuerpos en un
mamífero que reconozcan epítopos en la región
pre-S1 y/o pre-S2 del VHB.
15. Utilización de un polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, de un polinucleótido de
acuerdo con la reivindicación 7 o de un vector de acuerdo con la
reivindicación 8 ó 9, para la fabricación de un medicamento para
tratar o prevenir la infección por el VHB en un humano o en un
animal.
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