ES2217303T3 - Proteinas de micobacterias, microorganismos que las producen y utilizaciones vacunales y para la deteccion de la tuberculosis. - Google Patents
Proteinas de micobacterias, microorganismos que las producen y utilizaciones vacunales y para la deteccion de la tuberculosis.Info
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Abstract
PROTEINAS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS QUE PRESENTAN UN PESO MOLECULAR DE 28.778 DA, Y PROTEINAS HIBRIDAS QUE CONTIENEN AL MENOS PARTES DE SU SECUENCIA. ESTAS PROTEINAS PUEDEN PARTICULARMENTE UTILIZARSE EN VACUNAS O PARA LA DETECCION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS DE LA TUBERCULOSIS.
Description
Proteínas de micobacterias, microorganismos que
las producen y utilizaciones vacunales y para la detección de la
tuberculosis.
La presente invención tiene por objeto las
proteínas de micobacterias y los microorganismos que las
producen.
Se refiere además a la utilización de estas
proteínas y microorganismos con fines vacunales o para la detección
de la tuberculosis.
La tuberculosis continúa siendo un problema de
salud pública en el mundo. El número de fallecimientos anuales que
están relacionados directamente con la tuberculosis es de 3
millones de personas aproximadamente y el número de casos nuevos es
de alrededor de 15 millones. Esta mortalidad debida a la
tuberculosis es todavía elevada para los países desarrollados; por
ejemplo, en Francia, es del orden de 1500 casos por año, cifra
ciertamente subvalorada por un factor de 2 ó 3, si se consideran
las evaluaciones de Roujeau sobre las discordancias entre las
cifras oficiales y los resultados de autopsias sistemáticas. Hay que
tener en cuenta el reciente aumento de los casos de tuberculosis, o
por lo menos, la detención de la disminución de la frecuencia de
esta enfermedad, correlacionada con el desarrollo de la epidemia del
VIH/SIDA. En suma, la tuberculosis sigue siendo la primera
enfermedad infecciosa por su frecuencia en Francia y los países
desarrollados, pero sobretodo en los países en vías de desarrollo,
para los cuales constituye la fuente principal de pérdidas humanas
en relación con una sola enfermedad.
En la actualidad, el diagnóstico de certeza
aportado por la evidencia de bacilos cultivables en una muestra
procedente del enfermo, únicamente se obtiene para menos de la
mitad de los casos de tuberculosis. Incluso en los casos de
tuberculosis pulmonar, que representa del 80 al 90% de los que la
sufren, y que constituye la forma de la enfermedad para la cual la
demostración de la presencia de los bacilos es la más fácil, el
examen de las expectoraciones únicamente es positivo en menos de la
mitad de los casos.
El desarrollo de técnicas más sensibles, tales
como la PCR (reacción en cadena por la polimerasa), tropieza
siempre con la necesidad de obtener una muestra. Ya que las mujeres
y los niños no escupen habitualmente, la toma de muestras para las
formas infantiles requieren a menudo una intervención médica
relativamente especializada (biopsia ganglionar o toma de la muestra
mediante punción lumbar del líquido cefalorraquídeo, por
ejemplo).
Por otra parte, debido a que incluso tienen lugar
inhibiciones de la misma reacción PCR, la toma de muestras mediante
esta técnica puede no resultar factible, teniendo en cuenta la
imposibilidad de controlar sus orígenes.
Por último, el diagnóstico bacteriológico
clásico, el examen microscópico y el cultivo, debido a su límite de
sensibilidad (en el mejor de los casos del orden de 10^{4} a
10^{5} bacilos en la muestra), supone que ya se ha producido un
desarrollo relativamente importante de los bacilos y, por tanto, de
la enfermedad.
La puesta en evidencia de anticuerpos específicos
dirigidos contra el Mycobacterium tuberculosis podría, por
tanto, ayudar en el diagnóstico de las formas frecuentes de la
enfermedad en las que la demostración de los mismos bacilos es
difícil o imposible.
Generaciones sucesivas de investigadores han
intentado la puesta a punto de una técnica de diagnóstico
serológico de la tuberculosis.
Para una revisión general de los estudios
efectuados en este ámbito, se hará ventajosamente referencia a la
solicitud de patente PCT WO-92/21758.
Las técnicas a las que se ha aludido en la
técnica anterior se basan en su mayoría en el aislamiento
preliminar de proteínas mediante sus caracteres bioquímicos. Sólo
hasta después de dicho aislamiento, los autores ensayan la
capacidad de estas proteínas para detectar a los individuos
afectados por la tuberculosis.
La solicitud de patente PCT WO 92/21758 da a
conocer un procedimiento para seleccionar sin ambigüedad los
antígenos representativos de la infección tuberculosa mediante
sueros que provienen de enfermos tuberculosos o de cobayas
inmunizados mediante bacilos vivos. Este procedimiento que se
desmarca de la mayoría de los experimentos descritos en la técnica
anterior, ha permitido el aislamiento de proteínas de M.
bovis que muestran pesos moleculares comprendidos entre 44,5 y
47,5 kD.
Se han determinado los diecisiete aminoácidos del
extremo N-terminal de una de estas proteínas, y son
los siguientes:
El artículo de ROMAIN et al. (1993,
Infection and immunity, 61, 742-750) retoma
sustancialmente los resultados descritos en esta solicitud
internacional. Más particularmente, describe una prueba ELISA
competitiva, que utiliza un suero inmune policlonal de conejo
obtenido mediante inmunización contra estos animales con el
complejo proteico de 45-47 kD mencionado
anteriormente.
Paralelamente, se construyó por JACOBS et
al (1991, Methods Enzymol, 204, 537-557) una
genoteca de Mycobacterium tuberculosis.
Esta genoteca contiene muchos clones
diferentes.
Una proteína de otra especie de micobacterias,
M. leprae, se ha identificado y secuenciado por WIELES et
al. (1994, Infection and Immunity, 62,
252-258). Esta proteína, denominada 43 L, posee un
peso molecular de 25,5 kDa aproximadamente, que se deduce de la
secuencia nucleotídica. Su extremo N- terminal posee una homología
del 47% con la del complejo proteico de 45-47 kDa
identificado en Mycobacterium bovis BCG, y del que
anteriormente se ha reproducido la secuencia de 17 aminoácidos.
Tal como se ha indicado anteriormente, existe un
interés principal en medicina humana, tanto desde un punto de vista
terapéutico como diagnóstico, de identificar con precisión las
proteínas producidas por las Micobacterias y particularmente, por
M. tuberculosis.
Efectivamente, el problema existente hasta la
fecha y todavía no resuelto, reside en la obtención de vacunas
contra muchas enfermedades.
Otro problema es la detección de las enfermedades
inducidas por las micobacterias, como la tuberculosis.
El solicitante se ha aplicado, pues, a determinar
la secuencia de una proteína de Mycobacterium tuberculosis,
la cual se sospecha juega un papel importante en la respuesta
inmunitaria.
El solicitante ha mostrado que el conjunto de las
proteínas que corresponden al complejo de 45-47 kD
descrito anteriormente está codificado por un único y mismo gen, y
que el peso molecular calculado es diferente del que se ha evaluado
sobre gel de poliacrilamida, debido a la riqueza en prolina.
La presente invención tiene, pues, por objeto,
una proteína con la secuencia SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3
siguiente:
SEC ID nº
2:
SEC ID nº
3:
La invención se refiere, además, a proteínas
híbridas que comprenden una de las secuencias SEC ID nº 2 o SEC ID
nº 3 y a una secuencia de un péptido o de una proteína susceptible
de inducir una respuesta inmunitaria en el hombre o en los
animales.
Ventajosamente, el determinante antigénico es tal
que es susceptible de inducir una respuesta humoral y/o
celular.
Tal determinante puede ser de diversos tipos y
ser particularmente un fragmento de antígeno proteico,
glicoproteico ventajosamente, que se utiliza con el fin de obtener
composiciones inmunógenas susceptibles de inducir la síntesis de
anticuerpos dirigida contra epítopos múltiples.
Estas moléculas híbridas pueden estar
constituidas por una molécula portadora de la secuencia SEC ID nº 2
o de la SEC ID nº 3 asociada a una parte, en particular a un
epítopo de la toxina diftérica, de la toxina tetánica, del antígeno
HBS del virus HBV, del antígeno VP1 del virus de la poliomielitis o
de cualquier otra toxina o antígeno vírico.
Los procedimientos de síntesis de moléculas
híbridas engloban los procedimientos utilizados en ingeniería
genética para construir los ADN híbridos que codifican las
secuencias proteicas o peptídicas investigadas.
La presente invención incluye también proteínas
que presentan diferencias secundarias o variaciones limitadas en sus
secuencias en aminoácidos que no las modifican funcionalmente con
relación a las proteínas que presentan las secuencias SEC ID nº 2 y
SEC ID nº 3, o a las proteínas híbridas que incluyen por lo menos
en parte a estas secuencias.
Se observará que la presente invención ha
revelado una diferencia muy considerable del peso molecular entre
el peso calculado de la proteína que responde a la secuencia SEC ID
nº 3 que es de 28779 Da y el del complejo, evaluado mediante gel
SDS, que es del orden de 45-47 kD. Esta diferencia
se debe con toda probabilidad a la alta frecuencia de la prolina
(21,7%) en la cadena polipeptídica.
Otros objetivos de la invención son los
oligonucleótidos, ARN o ADN, que codifican las proteínas definidas
anteriormente. Dicho oligonucleótido presenta ventajosamente por lo
menos una parte de la secuencia SEC ID nº 1 siguiente:
La presente invención se refiere además a un
microorganismo, transformado con un oligonucleótido tal como el que
se ha definido anteriormente, produciendo dicho microorganismo una
de las proteínas tal como las anteriormente descritas y, más
particularmente, un microorganismo que secrete dicha proteína.
Preferentemente, dicho microorganismo es una
bacteria tal como Mycobacterium bovis BCG. Estas bacterias
se han utilizado ya en el hombre con el fin de obtener una
inmunidad contra la tuberculosis.
La síntesis de proteínas híbridas según la
presente invención en M. bovis BCG presenta ventajas
particulares. Efectivamente, M. bovis BCG constituye una
cepa ampliamente utilizada con finalidades vacunales y cuya
inocuidad para el hombre está reconocida. Después de la inyección en
el organismo humano, se desarrolla lentamente durante 15 días a un
mes, lo que permite una excelente presentación del antígeno contra
el cual se quiere obtener una respuesta en el organismo.
En cambio, se conoce muy mal a Mycobacterium
leprae, que causa la lepra en el hombre. Efectivamente, esta
bacteria no se ha podido cultivar hasta la fecha en un medio de
cultivo y presenta un período de crecimiento muy largo respecto a
M. bovis.
Su patogenicidad potencial constituye, además, un
argumento evidente para no utilizarla con fines de vacunación.
Las proteínas que muestran las secuencias SEC ID
nº 2 o SEC ID nº 3 presentan la ventaja de que son reconocidas por
los anticuerpos que se encuentran en los pacientes tuberculosos y
constituyen, pues, a priori, antígenos muy inmunógenos.
Las proteínas proceden de M. tuberculosis,
que es una especie muy cercana a M. bovis, siendo estas dos
bacterias responsables de la tuberculosis en el hombre y en los
bóvidos, respectivamente.
Las proteínas procedentes de M.
tuberculosis son, pues, susceptibles de expresarse en M.
bovis y, para las que poseen un péptido señal, de ser
secretadas en el medio de cultivo.
Presentando M. bovis las ventajas
indicadas anteriormente para la vacunación del hombre, y por otra
parte, induciendo las proteínas que responden a las secuencias SEC
ID nº 2 y SEC ID nº 3 una intensa respuesta inmunitaria en el
hombre, es particularmente ventajoso producir en M. bovis
proteínas híbridas que incluyan parte de la proteína procedente de
M. tuberculosis.
Efectivamente, es notorio que los antígenos de
microbios patógenos contra los cuales se busca una vacunación,
pueden no inducir mas que una respuesta muy débil en el hombre, si
no se presentan de una forma específica.
La presente invención resuelve este problema de
dos maneras:
- -
- por una parte, presentando la proteína híbrida en la superficie de M. bovis BCG, y/o siendo secretada por la bacteria, y
- -
- por otra parte, asociando un determinante antigénico conocido para inducir una intensa respuesta inmunitaria, es decir, el determinante antigénico de una de las proteínas de SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, a un determinante antigénico que induzca una débil respuesta si se inyecta solo.
La asociación del determinante antigénico de una
de las proteínas SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3, permite amplificar la
respuesta inmunitaria contra el segundo determinante antigénico de
la proteína híbrida. Este fenómeno puede compararse con el efecto
transportador hapteno.
Está claro que dicha operación no puede
considerarse con una proteína procedente de M. leprae, tal
como la descrita en el artículo de Wieles et al. (1994,
citado anteriormente), pues, por una parte, debido a la distancia
más grande entre M. tuberculosis y M. leprae, dicha
proteína corre el riesgo de no expresarse convenientemente, y por
otra, se conoce menos la respuesta inmunitaria inducida por esta
proteína de M. leprae. Además, la introducción de una
proteína de una especie patógena con finalidades vacunales,
constituye un riesgo potencial para la salud humana, que las
industrias farmacéuticas se resisten a adoptar.
El conjunto de estos argumentos concurre pues, a
distinguir las proteínas de secuencias SEC ID nº 2 y SEC ID nº 3 de
la proteína de M. leprae, descritas por Wieles et al
(1994, citado antes), a pesar de sus homologías secuenciales
aparentes (ver más adelante la figura 17).
La presente invención se refiere todavía a
vacunas o medicamentos que contienen por lo menos una proteína, o
un microorganismo, tales como los que se han definido
anteriormente.
Las vacunas que contienen proteínas no injertadas
pueden utilizarse para inmunizar a los individuos contra la
tuberculosis. Las proteínas injertadas que transportan un epítopo
procedente de un agente biológico distinto que M. bovis,
pueden utilizarse para la inmunización contra otras
enfermedades.
Como ejemplo, se podrán utilizar de 1 a 500
\mug de proteínas por dosis para un individuo, o de 10^{3} a
10^{7} bacterias recombinantes por individuo por vía
intradérmica.
La presente invención tiene también por objeto
una composición farmacéutica que contiene por lo menos una cantidad
farmacéuticamente eficaz de una proteína o de un microorganismo tal
como los definidos anteriormente, asociados con diluyentes o
adyuvantes farmacéuticamente compatibles.
La presente invención tiene también como objetivo
un procedimiento de detección de anticuerpos específicos de la
tuberculosis, en el que un fluido biológico, en el que se investiga
la presencia de dichos anticuerpos, se pone en contacto con una
proteína tal como la descrita anteriormente.
Ventajosamente, dicha proteína se fija sobre un
soporte.
Dicha detección puede llevarse a cabo
particularmente por el procedimiento de Transferencia Western
(huella inmunológica), por un procedimiento inmunoenzimático
(ELISA), o por un procedimiento radioinmunológico (RIA), mediante
un equipo de dosificación que contiene estas proteínas, así como
especialmente, soluciones tamponadas que permiten efectuar la
reacción inmunológica, y si es necesario, sustancias que permiten
revelar el complejo anticuerpo-antígeno
formado.
La presente invención se ilustra sin por ello ser
limitada, mediante los ejemplos siguientes y los dibujos que se
adjuntan, en los que:
La figura 1 representa el perfil de densidad
óptica (DO) a 240 nm de la filtración molecular (Si300) de una
fracción de M. tuberculosis que no fue retenida en una
columna intercambiadora de iones, en las condiciones descritas más
adelante.
La figura 2 representa el perfil de densidad
óptica a 220 nanómetros de la separación en una columna
intercambiadora de iones (DEAE) a alta presión, de las moléculas
procedentes de la fracción 1, obtenida al realizarse la filtración
molecular anterior.
La figura 3 es el perfil de densidad óptica a 220
nanómetros de la cromatografía en columna en fase inversa de la
fracción 1, procedente de la cromatografía de intercambio de iones
anterior.
Las figuras 4A a 4E constituyen fotografías de
las membranas de PVDF puestas en presencia respectivamente de:
- -
- un colorante de las moléculas (4A) transferidas a la membrana de PVDF. Coloración "Aurodye" (Amersham);
- -
- una mezcla de sueros de cobayas inmunizados con bacilos vivos (4B) o muertos (4C);
- -
- un suero de conejo (4D) inmunizado con antígenos purificados a partir del BCG (Infection and Immunity (1993), 61, 742-750).
- -
- un anticuerpo monoclonal, referencia I-1081 (4E).
Estas membranas de PVDF habían recibido
previamente a las moléculas de las fracciones separadas en la
columna intercambiadora de iones a baja presión, separadas mediante
electroforesis en gel de acrilamida. El carril 0 corresponde al
material en bruto de partida, el carril 1 a la fracción no retenida,
y el carril 2 a la fracción retenida.
Las figuras 5A a 5E representan las membranas de
PVDF que corresponden a un gel obtenido por migración de las 5
fracciones (1 a 5) obtenidas en la columna de filtración en gel
Si300 y de la fracción que no fue retenida en la columna DEAE a
baja presión (0). Después de la transferencia de geles idénticos
sobre las membranas de PVDF, una se reveló con un colorante de
proteínas ("Aurodye", Amersham (5A), o con un suero de cobayas
inmunizados con bacilos vivientes (5B), o muertos (5C), un suero de
conejo (5D) o el anticuerpo monoclonal (5E).
Las figuras 6A a 6E representan las membranas de
PVDF que corresponden a un gel obtenido por migración de las
fracciones obtenidas en la columna intercambiadora de iones a alta
presión (1 a 3) y de la fracción 1 obtenida mediante filtración
sobre filtro molecular (pocillo 0), poniéndose en presencia dicha
membrana de:
- -
- un colorante de proteínas (6A)
- -
- un anticuerpo de sueros de cobayas inmunizados respectivamente con bacilos vivientes (6B) o muertos (6C),
- -
- un suero de conejo (6D)
- -
- anticuerpo monoclonal (6E).
Las Figuras 7A a 7D representan la huella de los
geles sobre las membranas, la cual corresponde a la migración de la
fracción 1 obtenida en la columna intercambiadora de iones (0) y de
las fracciones obtenidas mediante cromatografía en fase inversa (1
a 5), puestas en presencia de los mismos reactivos que en las
figuras 6A a 6B, 6D y 6E, con idénticos códigos.
La figura 8 ilustra el cribado de la genoteca
genómica de expresión de M. tuberculosis H37Rv en M.
smegmatis. Los sobrenadantes de M. bovis BCG, M.
smegmatis no transformados y M. smegmatis transformados
por clones recombinantes que expresaban o no las proteínas
recombinantes reconocidas por los anticuerpos, se ensayaron con
distintas diluciones.
La figura 9 ilustra la migración en gel de
agarosa de tres cósmidos seleccionados en la genoteca, sometidos a
electroporación en E. coli y extraídos mediante lisis
alcalina.
La figura 10 representa la migración sobre un gel
del ADN cosmídico de pLA1 extraído de E. coli NM554 y
digerido con BamHI (a), SmaI (b), HpaI (c), NotI (d), SspI (e),
EcoRI (f) y Hind III (g).
La figura 11 ilustra la expresión de las
proteínas de 45/47 kDa en las micobacterias. Los sobrenadantes del
cultivo bacteriano de 7 días se lavaron y concentraron sobre una
membrana Amicon PM10, liofilizándose y analizándose mediante
Transferencia Western. Las proteínas se revelaron mediante
anticuerpos policlonales de un suero de conejo, diluido 1/500.
Se depositaron por pocillo:
(1) 0,25 \mug de proteínas de 45/47 kDa
purificadas de M. bovis BCG,
(2) 5 \mug de sobrenadante de M.
smegmatis mc^{2} 155 transformado por pLA1,
(3) 5 \mug de sobrenadante de M.
smegmatis mc^{2} 155 no transformado,
(4) 5 \mug de sobrenadante de M. bovis
BCG.
La figura 12 ilustra la expresión de las
proteínas de 45/47 kDa en las micobacterias. Los sobrenadantes del
cultivo bacteriano se lavaron y concentraron sobre una membrana
Amicon PM10, liofilizándose a continuación y analizándose en un
ensayo ELISA competitivo. Distintas concentraciones de los
sobrenadantes liofilizados se pusieron en presencia de una dilución
1/8000 del suero policlonal de conejo, transfiriéndose a
continuación esta mezcla a los pocillos sobre los que se fijaron
las proteínas purificadas.
Las figuras 13A y 13B constituyen perfiles
plasmídicos (13A) y de restricción BamH I (13 B) de diferentes
clones recombinantes pUC18: M. tuberculosis H37Rv, obtenidos
mediante unión de los fragmentos de una digestión BamH I del
cósmido pLA1 en pUC18. En esta figura se presentan 21 de los 36
clones estudiados. Los pocillos "p" corresponden al vector
testigo pUC18, y los pocillos "m" corresponden a los
marcadores de tamaño, que son fragmentos del plásmido pKN
fragmentados por Pvu II.
La figura 14 representa el mapa de restricción de
las inserciones que permiten la expresión de las proteínas de 45/47
kDa en E. coli. Se obtuvo un conjunto de clones mediante
deleciones a partir de los plásmidos pLA34 y pLA4, que contenían la
inserción de 3 kb clonada en los dos sentidos. Las flechas indican
la dirección de la determinación de las secuencias a partir de estos
clones mediante iniciadores "directos" e "inversos".
| B, BamH I | S, Sma I | E, EcoR I | K Kpn I |
| H, Hind III | Sa, Sal I | Sp, Sph I |
La figura 15 ilustra la expresión de las
proteínas de 45/47 kDa en E. coli. Los lisados del cultivo
bacteriano se analizaron mediante Transferencia Western.
Las proteínas se detectaron mediante anticuerpos
policlonales de conejo purificados en DEAE, absorbiéndose a
continuación sobre un lisado de E. coli inmovilizado en una
columna de Sepharosa-4B y activado mediante bromuro
de cianógeno.
En cada pocillo se depositaron:
(1) 0,2 \mug de proteínas purificadas de 45/47
kDa,
(2) 25 \mug de lisado de E. coli
XL-Blue transformado mediante
pLA34-2
(3) 25 \mug de lisado de E. coli
XL-Blue transformado mediante pLA34,
(4) 25 \mug de lisado de E. coli
XL1-Blue no transformado.
La figura 16 ilustra la expresión de las
proteínas de 45/47 ICa en E. coli. Los lisados del cultivo
bacteriano, analizados mediante un ensayo ELISA competitivo, se
utilizaron en bruto.
La figura 17 compara la secuencia SEC ID nº 2
según la invención y la secuencia de la proteína de M.
leprae (mln 431).
La figura 18 es un perfil de hidrofobicidad de la
proteína de secuencia SEC ID nº 2.
Se llevaron a cabo cultivos de M.
tuberculosis (cepa H37Rv) en matraces que contenían 130 ml de
medio sintético de Sauton, según una técnica clásica descrita para
el cultivo de BCG (Gheorghiu et al. Bull. Institut Pasteur
1983, 81: 281-288). Después de 20 días a 37ºC, el
medio de cultivo se recuperó, se decantó y se filtró (0,22 \mum)
a la temperatura del laboratorio. Estas operaciones se llevaron a
cabo en un ambiente adecuado y utilizando guantes, por razones de
seguridad. El medio de cultivo recuperado y filtrado, se filtró de
nuevo (filtro de 0,22 \mum) bajo una campana de seguridad, antes
de utilizarse para las operaciones siguientes:
Situado sobre una membrana Amicon (PM10) bajo una
presión de nitrógeno de 2 bares y a 4ºC, se lavó intensamente el
medio de cultivo con agua que había sido sometida a osmosis y que
contenía 4% de butanol, concentrándose seguidamente de 10 a 20
veces respecto al volumen inicial. Este medio de cultivo
concentrado, que contenía las moléculas que no fueron excluidas por
la membrana PM10 Amicon, se sometió a liofilización, se pesó y se
conservó en polvo a -20ºC. Los 12 g del material de partida que se
utilizaron para el esquema de purificación que se va a describir
seguidamente, se obtuvieron a partir de 70 litros del medio de
cultivo.
Esquema de purificación:
Se preparó una columna preparativa
intercambiadora de iones, a baja presión, con una altura de 300 mm
y un diámetro de 32 mm, con 240 ml aproximadamente de gel Trisacyl
M (SEPRACOR). Se equilibró con una solución salina tamponada
(Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH = 7, y NaCl 10 mM)
que contenía 4% de butanol.
El material concentrado y liofilizado, preparado
en la etapa anterior, se solubilizó (en la solución salina
tamponada anterior), ultracentrifugándose seguidamente durante 120
mn a 40.000 G. Sólo se aprovechó la parte superior (4/5) de la
solución que se había centrifugado, que se aplicó, mediante el
control de la bomba peristáltica, sobre la columna intercambiadora
de iones. Se recuperó una primera fracción mayoritaria que no había
sido retenida en la columna. Después de elución de la columna con
una solución salina tamponada (Na_{2}HPO_{4}) NaH_{2} y 10 mM,
pH = 7,5 y NaCl 1M), se obtuvo una segunda fracción. Cada fracción,
situada sobre una membrana Amicon (PM10), bajo una presión de 2
bares y lavada intensamente con agua que había sido sometida a
osmosis y que contenía 4% de butanol, se concentró hasta 15 veces
aproximadamente. La fracción que no había sido retenida por la
columna contenía 2,9 g de material y la parte esencial de las
moléculas que se iban a purificar en las etapas siguientes. La
fracción retenida por la columna que fue eluida seguidamente por la
solución concentrada salina, contenía alrededor de 1,01 g de
material.
Una columna preparativa a alta presión Si 300, 3
\mum de 50 x 750 mm (SERVA), se equilibró mediante el paso de una
solución salina tamponada (Na_{2} HPO_{4} 50 mM ajustada a pH
7,5 con KH_{2}PO_{4}), que contenía 4% de butanol; filtrándose
previamente esta solución sobre una membrana (0,22 \mum). El
suministro de la columna se ajustó a 1,25 ml bar por mn; no se
alcanzó la presión máxima que se había regulado a 45 bares.
El material a inyectar en la columna se preparó
con una concentración de 50 mg/ml en la solución tampón/butanol. Se
prepararon muestras de 10 ml y se congelaron a -20ºC. Cada muestra
de 10 ml, que se filtró de nuevo después de descongelarla y se
inyectó en la columna, contenía alrededor de 500 mg de material en
bruto. Los perfiles de las densidades ópticas a 240 nm se dan a
conocer en la figura 1 para una secuencia típica de separación. Las
cinco fracciones principales seleccionadas según el perfil se
concentraron a 4ºC y se lavaron intensamente sobre una membrana
Amicon PM10 con agua que había sido sometida a osmosis y que
contenía 4% de butanol. Cada fracción concentrada se liofilizó, se
pesó y se conservó seguidamente a 20ºC. La fracción 1 de esta etapa
contiene las moléculas principales reconocidas por los anticuerpos
de los cobayas inmunizados con los bacilos vivos o por los
anticuerpos de los enfermos tuberculosos. Sólo esta fracción se
sometió a la etapa siguiente.
Una columna preparativa DEAE-TSK
5PW de 21,5 x 150 mM (LKB) Se equilibró con una solución salina
tamponada (Na_{2} HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH = 7,5 y
NaCl 10 mM) que contenía 4% de butanol. La presión máxima era
inferior a 30 bares para un suministro de 6 ml/mn. Para el tampón de
elución, sólo se modificó la concentración de NaCl (1 M). Se aplicó
un gradiente lineal según el esquema indicado en la figura 2,
después de la inyección de un volumen de la muestra de 4 ml que
contenía en total 100 mg del material anterior. Las fracciones
principales se recuperaron según el perfil en densidad óptica a 240
nm. Estas fracciones se concentraron y lavaron sobre una membrana
PM_{10} (Amicon) mediante agua que había sido sometida a osmosis
y que contenía 4% de butanol, liofilizándose a continuación. Una
vez pesada, cada fracción se conservó a -20ºC. Únicamente la
fracción 1 de esta etapa contiene la mayoría de las moléculas
reconocidas por los anticuerpos de los cobayas inmunizados con
bacilos vivientes; se sometió a la etapa siguiente de
separación.
Una columna RP 300 C_{8} 10 \mum de 4,6 x 250
mM (Aquapore Brownlee lab.) se equilibró con un tampón de acetato
amónico (NH_{4} COO CH_{3} 20 mM) filtrado sobre 0,22 \mum
con un suministro de 2 ml/mn bajo una presión máxima de 115 bares.
El tampón de elución que contenía 90% de acetonitrilo se aplicó
según el perfil indicado en la figura 3 después de inyección de una
muestra de 10 mg con un volumen de 1 ml. El perfil de densidad
óptica a 220 nm permitió separar cinco fracciones principales que se
concentraron mediante evaporación al vacío a 40ºC, liofilizándose
seguidamente.
Se prepararon geles desnaturalizantes con un 10%
de poliacrilamida y el 0,1% de SDS, según la técnica clásica de
Laemmli (Nature 1979, 277: 680-685). Muestras que
contenían entre 10 y 2 \mug de material, en función de la etapa
de purificación, se aplicaron a un tampón que contenía 5% de
mercaptoetanol, 3% de SDS e indicios de azul de bromofenol, con un
volumen de 10 \mul en cada carril del gel. Después de
electroforesis hasta el límite de migración del azul, las moléculas
que se encontraban en las muestras se transfirieron a una lámina de
PVDF (Millipore) aplicando un campo eléctrico moderado durante una
noche (Harlow et Lane, Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory (eds) 1988).
La coloración de la lámina de PVDF por una
solución de azul de Coomassie durante menos de un minuto, seguido
por una decoloración, permite la localización de los marcadores de
peso molecular cuyos contornos se rodean mediante un trazo a lápiz.
Después de la decoloración total, la lámina se lava durante 30 mn a
la temperatura del laboratorio mediante PBS + Triton X100 al 3%, y
seguidamente tres veces durante 5 mn con PBS sólo. La lámina se
satura entonces con PBS que contiene 5% de leche descremada en
polvo durante 1 h a 37ºC, lavándose después tres veces con
PBS+Tween 20 (0,2%).
Se lleva a cabo una incubación con los
inmunosueros diluidos a 1/20 en el tampón PBS + Tween 20 (0,2%) +
leche en polvo al 5%, durante 1h 30 a 37ºC con agitación periódica.
Seguidamente se llevan a cabo tres lavados en PBS + Tween antes de
la incubación con los anticuerpos
anti-inmunoglobulínicos marcados con la fosfatasa
alcalina. Los anticuerpos anti-inmunoglobulinas
humanos y anti- inmunoglobulinas de cobayas, marcados con la
fosfatasa (Biosys) se utilizan en la dilución final de 1/2500 en
PBS + Tween 20 (0,2%) + leche (5%). Después de 1h 30 de incubación
a 37ºC, las láminas de PVDF se lavaron tres veces en PBS + Tween,
incubándose seguidamente a la temperatura del laboratorio durante 5
a 10 mn, en el tampón de revelado que contenía BCIP y NBT (Harlow y
Lane, citados anteriormente). La reacción se detuvo y después de
secado de las láminas, éstas se fotografiaron.
Se llevó a cabo un análisis de la composición
global en aminoácidos para cada fracción cromatográfica en la
Unidad de Química Orgánica del Institut Pasteur. Se utilizó un
analizador Beckman LS 6300.
La composición global expresada en la frecuencia
de aminoácidos de las proteínas de 45-47 kD es la
siguiente:
ASN/ASP: 10,4%, THR: 5,7%; SER: 5,6%; GLN/GLU:
6,3%; GLY: 7,1%; ALA:19,3%; VAL: 6,2%; ILE: 2,2%: LEU: 4,4%; TYR:
2,2%; PHE:2,4%; LYS:2,7%: ARG:2,7%:; PRO: 20,9%.
Grupos de 12 a 15 cobayas (hembras Hartley de 250
a 300 g al principio del experimento) recibieron micobacterias
vivientes (2 x 10^{7} unidades viables de BCG en dos inyecciones
intradérmicas en 0,1 ml de solución salina), o 2 mg de
micobacterias de la misma cepa muertas por el calor (120ºC, 30 mn)
en inyección intramuscular en 0,5 ml de una emulsión solución
salina en el adyuvante incompleto de Freund (1/1). Los sueros de
distintos grupos de cobayas se muestrearon de 7 a 12 meses después
de la inmunización, se filtraron (0,22 \mum) y se distribuyeron a
continuación en pequeños volúmenes que se congelaron y conservaron a
-20ºC. Se realizaron ensayos de diversos grupos de inmunosueros (5
después de la inmunización con bacterias vivientes y 6 después de
inmunización con las bacterias muertas). Los resultados que se
indican se obtuvieron con un grupo de sueros representativos de
cada tipo de inmunización; las diferencias entre grupos son mínimas
para el mismo esquema de inmunización.
El medio de cultivo (lavado y concentrado sobre
la membrana Amicon PM10 y después liofilizado) se ultracentrifugó y
se aplicó a continuación sobre la columna intercambiadora de iones
a baja presión. Se recuperaron dos fracciones, una que no quedó
retenida por la columna y otra que se eluyó por una solución
tamponada de alta molaridad, se lavaron y se concentraron sobre una
membrana Amicon PM10, liofilizándose a continuación.
Cada fracción (10 \mug) se situó sobre un
carril de un gel SDS, y seguidamente, después de la secuencia de
electroforesis, se transfirió sobre una membrana PVDF y se detectó
inmunológicamente, localizándose las fracciones que contenían las
moléculas mayoritarias que reaccionaban con los distintos
sueros.
La figura 4 muestra las transferencias Western de
geles idénticos revelados con un colorante de proteínas
transferidas (Aurodye-Amersham) (4A), o sueros de
cobayas inmunizados con bacilos vivos (4B) o muertos (4C). Las
transferencias Western 4D y 4F fueron reveladas con,
respectivamente, un suero de conejo dirigido contra moléculas
idénticas de BCG (Infection and Immunity, 1993, 61
742-750) y el sobrenadante del hibridoma
I-1081 productor de un anticuerpo monoclonal,
depositado en la Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes del Instituto pasteur (CNCM). Sólo la fracción que
no fue retenida por la columna contiene las moléculas de 45/47 kDa
reconocidas por los sueros de cobayas inmunizados con bacilos vivos
o reconocidas por el sobrenadante del hibridoma citado
anteriormente.
La fracción no retenida de la etapa anterior se
inyectó con un volumen de muestra de 10 ml que contenía 500 mg de
material, en una columna Si 300. Las fracciones 1 a 5 se separaron
según el perfil indicado en la figura 1, y se reagruparon para las
inyecciones sucesivas, lavándose después y concentrándose y
liofilizándose.
Cada fracción (10 \mug) se situó sobre un
carril de un gel SDS, y seguidamente, después de la secuencia de
electroforesis, se transfirió sobre una membrana PVDF y se detectó
inmunológicamente, localizándose las fracciones que contenían las
moléculas mayoritarias que reaccionaban con los distintos
sueros.
La figura 5 muestra transferencias Western de
geles idénticos que se revelaron con una coloración de las
proteínas (Aurodyne-Amersham) o con sueros de
cobayas inmunizados con bacilos vivientes (5B) o con bacilos muertos
(5C). Las transferencias Western 5D y 5E fueron reveladas con,
respectivamente, un suero de conejo dirigido contra estas moléculas
purificadas a partir de BCG y con el anticuerpo monoclonal
I-1081.
Dos antígenos de 45 y 47 kD que se encuentran en
la fracción 1, se reconocieron esencialmente mediante los
anticuerpos de los animales inmunizados con los bacilos vivos o con
el suero policlonal de conejo o con el anticuerpo monoclonal. Esta
fracción se seleccionó para la segunda etapa de purificación.
Una muestra de 100 mg de la fracción anterior se
cargó en una columna preparativa DEAE-TSK,
eluyéndose mediante un gradiente de NaCl. El perfil a 220 nm de las
moléculas eluídas definió tres fracciones principales (figura 2).
Después de reagrupamiento, cada fracción obtenida por las
inyecciones sucesivas del material, se lavó, concentró y se sometió
a liofilización.
Después de electroforesis sobre gel SDS de 5
\mug de cada una de las fracciones anteriores, las
inmunotransferencias Western sobre la lámina PVDF se pusieron de
manifiesto mediante el colorante de proteínas (Aurodyne) (Fig. 6A),
los sueros de cobayas inmunizados con bacilos vivos (Fig. 6B) o
muertos (Fig. 6C), el suero de conejo (Fig. 6D), o el anticuerpo
monoclonal (Fig. 6E). La fracción 1-DEAE no
contiene mas que algunos antígenos reconocidos por los anticuerpos
de los animales inmunizados con los bacilos muertos. En cambio, esta
misma fracción 1-DEAE contiene un doblete de 45/47
kD intensamente reconocido por los anticuerpos de los cobayas
inmunizados con los bacilos vivientes, así como por el suero de
conejo o por el anticuerpo monoclonal. Esta fracción
1-DEAE es seleccionada para la etapa siguiente de
purificación.
Una columna RP 300 10 \mum, equilibrada con el
tampón acetato amónico (20 mM), recibió una muestra de 1 ml que
contenía de 5 a 10 mg como máximo de la fracción
1-DEAE anterior. La elución con un gradiente de
acetonitrilo de 0 a 90% según el esquema de la figura 3, permite
recuperar cinco fracciones principales. Estas fracciones se
concentraron mediante evaporación al vacío a 40ºC para eliminar la
mayor parte del acetonitrilo, y seguidamente se liofilizaron.
La fracción 4 (gradiente de 30 a 50% de
acetonitrilo) contenía la mayor parte de las moléculas reconocidas
por los anticuerpos de los animales inmunizados con los bacilos
vivos, o por los anticuerpos presentes en el suero de conejo o por
el anticuerpo monoclonal y esencialmente estas moléculas, según la
coloración de las proteínas mediante Aurodyne (Fig. 6).
M. bovis BCG (cepa 1173P_{2}) se cultivó
7 días a 37ºC en medio sintético de Sauton, filtrándose a
continuación el sobrenadante a través de una membrana de 0,22
\mum. Estos sobrenadantes se conservaron en el estado inicial en
presencia de butanol al 4%, o se concentraron sobre la membrana
Amicon-PM 10, liofilizándose.
M. smegmatis mc^{2} 155 (Snapper et
al. 1990, Molecular Microbiol., 4, 1911-1919),
se cultivó en medio líquido 7H9 + OADC durante 7 días a 37ºC. Cada
clon de M. smegmatis mc^{2} 155 transformado mediante los
cósmidos de la genoteca pYUB18: M. tuberculosis, se cultivó
en presencia de kanamicina a 25 mg/ml. Los cultivos se
centrifugaron a continuación 15 mn a 5.000 rpm, separándose los
sobrenadantes del cultivo y conservándose a 4ºC en presencia de
butanol al 4%. Estas preparaciones se utilizaron cuando se llevaron
a cabo ensayos ELISA en los que la composición de los medios de
cultivo no interfiriera. Cuando los sobrenadantes del cultivo de
clones se analizaron en gel SDS-PAGE, éstos se
cultivaron en medio sintético de Sauton durante 7 días a 37ºC,
filtrándose los sobrenadantes del cultivo a través de una membrana
de 0,22 \mum, concentrándose a continuación sobre una membrana
Amicon-PM10 y sometiéndose a liofilización.
Las cepas de E. coli NM554 y XL
1-Blue se cultivaron en medio
Luria-Bertani (LB) sólido o líquido a 37ºC. Los
clones de E. coli XL 1-Blue, transformados
por el plásmido pUC18, se cultivaron en presencia de ampicilina a
25 \mug/ml.
Los lisados del cultivo bacteriano de E.
coli XL1-Blue y de cada clon transformado
mediante los plásmidos recombinantes pUC18:M. tuberculosis,
se prepararon mediante una serie de congelaciones/descongelaciones
rápidas de -70ºC a + 60ºC de bacterias obtenidas después de un
cultivo de una noche (16 horas). Los lisados se centrifugaron, se
separaron los sobrenadantes y se conservaron a -20ºC. Se realizó la
determinación de la dosis proteica de estas preparaciones mediante
la técnica BCA (Pierce).
La genoteca genómica de M. tuberculosis
utilizada (Jacobs et al, 1991, anteriormente citados) se
suministró mediante electroporación a M. smegmatis mc^{2}
155 por Stewart Cole. El solicitante dispuso de 400 clones
recombinantes.
La genoteca se construyó en un cósmido, vector
lanzadera pYUB18. Éste proviene del plásmido pYUB12 (Snapper et
al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 1988, 85:
6987-6991) en el que se insertó la secuencia Cos del
bacteriófago lambda, lo que permitió una amplificación y una buena
conservación de los cósmidos recombinantes de la genoteca bajo
forma de lisados de fagos. Esta genoteca se construyó de la forma
siguiente: el ADN genómico de M. tuberculosis cepa H37Rv, se
digirió parcialmente mediante el enzima Sau 3a, en condiciones que
permitían obtener un número máximo de fragmentos de 35 kb a 45 kb.
Estos fragmentos se purificaron, y posteriormente se unieron a
pYUB18, se digirieron mediante la endonucleasa de restricción BamHI
y se defosforilaron.
El vector plasmídico pUC18
(Yanisch-Perron et al. Gene, 1985, 33:
103-119) se utilizó para la subclonación en E.
coli XL-Blue. Este plásmido multicopia
transporta un fragmento de ADN derivado del operón lac de E.
coli que codifica un fragmento amino-terminal de
la beta galactosidasa. Este fragmento inducible por la isopropil
beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG)
es capaz de establecer alfa-complementación con la
forma deficiente en betagalactosidasa codificada por la cepa
huésped E. coli XL1-Blue. De este modo, la
inserción del ADN extraño va a inducir una abolición de la alfa
complementación. Los plásmidos recombinantes pueden identificarse
cuando son transformados en la cepa huésped por el color blanco de
las colonias, comparado con el color azul de las colonias cuando
las bacterias son transformadas por el plásmido pUC18. Esta criba
se lleva a cabo en presencia de IPTG y del sustrato del enzima
X-Gal.
Las extracciones de cósmidos recombinantes
pYUB18: M. tuberculosis se realizaron según la técnica de
lisis alcalina adaptada a M. smegmatis (Jacobs et al.
1991, citado anteriormente) con algunas modificaciones. Las
bacterias se recuperan al quinto día del cultivo (final de la fase
exponencial) y se centrifugan 10 mn a 5.000 revoluciones. El
sedimento bacteriano (3 ml) se vuelve a suspender en 5 ml de
solución A (50 mM glucosa, 25 mM tris HCl pH 8, 10 mM EDTA, lisosima
10 mg/ml), y se incuba a 37ºC durante 20 minutos. Dos volúmenes (10
ml) de solución B (0,2 N NaOH, SDS al 1%), se añaden a continuación
y se mezclan por inversión. La mezcla se incuba 30 minutos a 65ºC,
y después 15 minutos a 4ºC. Finalmente, 1,5 volúmenes (7,5 ml) de la
solución C (5 M acetato potásico, ácido acético 11,5%), se añaden y
mezclan por inversión. La mezcla se incuba 30 minutos a 4ºC. La
preparación se centrifuga a continuación durante 15 minutos a
13.000 revoluciones a 4ºC, se recupera el sobrenadante, se mide y
se añade a un mismo volumen de fenol/cloroformo 50/50.
Después de la extracción, el tubo se centrifuga a
4000 revoluciones durante 10 minutos. La fase acuosa se transfiere
a un tubo limpio y se añade un volumen doble de etanol guardado a
-20ºC. Después de retornarlo, éste se conserva por lo menos 1 hora
a -20ºC, centrifugándose después 30 minutos a 12.000 revoluciones.
Finalmente, el sedimento se lavó con un volumen de etanol al 70%
que se conservaba a -20ºC, secándose con el
Speed-Vac durante 5 minutos. El sedimento seco se
vuelve a disolver en 500 \mul de agua estéril, conservándose a
-20ºC.
Las extracciones rápidas de los cósmidos pYUB18 y
de los plásmidos pUC18 recombinantes, se llevaron a cabo mediante
la técnica de lisis alcalina (Birnboim et al.; Nucleic Acids
Res. 1979, 7:1513).
Los cósmidos y plásmidos recombinantes
interesantes se purificaron después de una etapa de lisis alcalina
mediante ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en
presencia de bromuro de etidio (Maniatis et al, Cold Spring
Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982).
Esta técnica clásica se utilizó para transformar
E. coli XL1- Blue mediante plásmidos pUC18 recombinantes. Se
prepararon en primer lugar las bacterias competentes: 20 ml de
medio 2YT se sembraron con un precultivo de una noche a la dilución
1/100. Las bacterias se dispusieron en un cultivo sometido a
agitación durante 2 horas a 37ºC, hasta una DO = 0,6 (DO = densidad
óptica), centrifugándose después durante 10 minutos a 4000
revoluciones, a 4ºC. Se volvió a disolver el sedimento en 8 ml de
CaCl_{2}, 100 mM, y se mantuvo 15 minutos en hielo fundente,
centrifugándose de nuevo a continuación durante 10 minutos a 4000
revoluciones, a 4ºC. El sedimento se volvió finalmente a disolver en
1,6 ml de CaCl_{2} 100 mM, conservándose en hielo fundente durante
30 minutos.
Las bacterias competentes recién preparadas de
esta forma se utilizaron para las transformaciones o se pudieron
conservar algunos días a 4ºC. En el momento de la transformación,
200 \mul de bacterias competentes se mezclaron con 2 \mul de
ADN. La mezcla se mantuvo 45 minutos en hielo fundente, y se
sometió a continuación a un choque térmico a 42ºC de 2 minutos. Se
añadieron 800 \mul de medio 2YT, incubándose a continuación la
preparación una hora a 37ºC, con agitación, y disponiéndola
seguidamente en recipientes de ml-ampicilina a
razón de entre 50 \mul y 200 \mul por cada uno de ellos. Al día
siguiente, se contaron las colonias y se calculó la eficacia de la
transformación calculada.
Esta técnica se utilizó para transformar E.
coli mediante vectores de gran tamaño; La cepa NM554 de E.
coli se sometió a electroporación mediante los cósmidos pYUB18
recombinantes de tamaño superior a 50 kb. Las bacterias competentes
se prepararon de forma reciente: 200 ml de medio 2YT se sembraron
por una dilución 1/100 de un precultivo de una noche; se cultivaron
las bacterias 3 horas a 37ºC, centrifugándose después a 6000
revoluciones durante 10 minutos. Se volvió a disolver el sedimento
en 10 ml de agua estéril a 4ºC, y seguidamente en 190 ml de agua
estéril a 4ºC. Se centrifugaron las bacterias de nuevo a 6000
revoluciones durante 10 minutos y se volvieron a lavar en 10 ml de
agua estéril a 4ºC. Finalmente, el sedimento se vuelve a disolver
en 400 \mul de glicerol al 10%.
La electroporación se llevó a cabo en un
dispositivo Bio-Rad Gene Pulser. 100 \mul de
bacterias se mezclaron con 1 a 4 \mul de ADN en una cubeta de 0,4
mM. La mezcla se sometió a una descarga eléctrica (2500 voltios, 25
\muF). A continuación, se añadió rápidamente a la cubeta 1 ml del
medio 2 YT. El conjunto se transfirió a un tubo y se incubó 1 hora
a 37ºC con agitación. Después de incubación, el cultivo se repartió
en recipientes de ml-ampicilina, a razón de entre
50 \mul y 200 \mul por recipiente. Al día siguiente, se contaron
las colonias y se calculó la eficacia de transformación.
El ADN que iba a clonarse se digirió mediante una
endonucleasa de restricción BamHI. De igual forma, se digirió el
plásmido pUC18. Los fragmentos procedentes de un cósmido pYUB18
recombinante de interés se ligaron al plásmido vector mediante la
actividad del enzima T4 ADN ligasa (Amersham). La unión se llevó a
cabo en un volumen de 20 \mul a 16ºC durante la noche. Para la
transformación en E. coli XL1-Blue, se
utilizó toda la mezcla de unión. Después de la expresión
fenotípica, todas las bacterias se dispusieron en recipientes con
mL-ampicilina a 25 \mug/ml, IPTG,
X-Gal. No permitiendo ya los clones recombinantes la
alfa-complementación, se identificaron éstos
mediante el color blanco de las colonias.
Los clones recombinantes se estudiaron después de
purificación por clonación. El ADN plásmidico se extrajo mediante
lisis alcalina, analizándose a continuación sobre gel de agarosa al
0,8% antes o después de digerirlo mediante la endonucleasa de
restricción BamH I.
Los plásmidos recombinantes pLA34 y pLA4, que
contienen una inserción BamH I-BamH I de 3 kb
clonada en los dos sentidos, se digirieron mediante las distintas
endonucleasas de restricción que presentaban un sitio en el lugar
multisitio (poliengarce) de pUC18. Se llevaron a cabo digestiones
simples y dobles mediante las endonucleasas de restricción BamHI I,
Hind III, Sph I, Xba I, Sal I, Kpn I, EcoR I y Sma I, analizándose
aquéllas a continuación en gel de agarosa al 0,8%. Después de
colorear el ADN con bromuro de etidio, se determinó el tamaño de
los distintos fragmentos en función de su distancia de migración
con relación a los marcadores (un testigo interno de laboratorio, el
plásmido pKN digerido por Pvu II).
Se utilizó un ensayo ELISA competitivo para medir
la concentración de las proteínas 45/47 kDa que se encontraban en
distintas preparaciones procedentes de cultivos bacterianos,
mediante un suero policlonal (Romain et al., 1993, citado
anteriormente).
Este suero policlonal de conejo se obtuvo contra
las proteínas 45/47 kDa mediante una técnica clásica de
inmunización: inyección de 50 \mug de proteínas purificadas en
adyuvante de Freund incompleto y de 25 \mug un mes más tarde.
Los pocillos de una primera microplaca se
recubrieron, bien por las proteínas purificadas en solución a la
concentración de 1 \mug/ml en tampón carbonato, bien por un
sobrenadante de Mycobacterium bovis BCG de 15 días a la
concentración de 10 \mug/ml. La fijación de los antígenos se llevó
a cabo durante una hora a 37ºC, lavándose seguidamente 5 veces la
microplaca con PBS. En una segunda incubación, se saturaron los
pocillos mediante una solución de PBS gelatina al 0,5%, butanol al
4%, durante una hora a 37ºC. La microplaca se lavó a continuación 5
veces con PBS-Tween al 0,1%.
La prueba se realizó de la siguiente forma:
Incubación en una segunda microplaca de 50 \mul
del sobrenadante a analizar, a diluciones distintas (puro, 1/2,
1/4, 1/8, etc..) en PBS-Tween al 0,1%, gelatina al
0,25%, butanol al 4%, y de 50 \mul de suero de conejo preparado a
dilución 1/4000 en PBS-Tween al 0,1%, gelatina al
0,25%, butanol al 4%, una hora a 37ºC, transfiriéndose seguidamente
la mezcla a la primera microplaca e incubándose durante una hora a
37ºC. A continuación, se lavó la microplaca 10 veces con
PBS-Tween al 0,1%. Finalmente, se incubó durante una
hora a 37ºC, un anticuerpo conjugado anti IgG H + L
anti-conejo (BioSys) marcado con fosfatasa
alcalina, preparado a la dilución 1/4000 en
PBS-Tween al 0,1%, gelatina al 0,25%, butanol al
4%. La microplaca se lavó 10 veces con PBS-Tween al
0,1%.
El sustrato del enzima, el
para-nitro-fenil-fosfato
(pNPP) se incubó finalmente a la concentración de 40 mg/24 ml en
tampón NaHCO_{3}, MgCl^{2} pH 9,6, durante una hora o una
noche. Las DO son leídas a 414 nm y 690 nm mediante el lector
Titerteck Twinreader.
Se utilizó la técnica clásica de electroforesis
en gel desnaturalizante SDS-PAGE (Laemmli, Nature
1970, 277:680-685), seguida por una
electrotransferencia en membrana de PVDF (Towbin et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1979, 76:4350-4354, Pluskal
et al. Biotechniques 1986, 4:272-283).
Las muestras analizadas sobre el gel se midieron
cuantitativamente: en \mug de liofilizado para los sobrenadantes
de M. smegmatis (se depositaron 5 \mug), en \mug de
proteínas para los lisados de E. coli (se depositaron 25
\mug).
Las proteínas purificadas de M. bovis BCG
se depositaron sobre gel a razón de 0,25 \mug de proteínas por
carril.
Las proteínas que se transfirieron sobre la
membrana se pusieron de manifiesto mediante el suero policlonal de
conejo a una dilución de 1/500 para las proteínas expresadas en las
micobacterias.
Para poner de manifiesto las proteínas
recombinantes en E. coli, estos anticuerpos policlonales se
purificaron en una columna DEAE (Trisacryl^{D}), absorbiéndose a
continuación las inmunoglobulinas obtenidas en un lisado de E.
coli inmovilizado en una columna Sepharosa-4B
activado por el bromuro de cianógeno (Pharmacia) (Maniatis et
al, 1982). Los anticuerpos que no habían sido retenidos se
conservaron conjuntamente a 4ºC y se utilizaron para poner de
manifiesto las proteínas que se habían transferido sobre la
membrana a una dilución del 1/100.
Un conjugado anti-Ig H + L
(Bio-Sys), específico de la especie, marcado por la
fosfatasa alcalina, se utilizó para poner de manifiesto a los
anticuerpos mencionados anteriormente a una dilución del 1/3000.
Finalmente, la actividad fosfatasa alcalina se puso de manifiesto
mediante dos sustratos artificiales cromógenos: el azul de
tetrazolio y el 5-bromo 4 cloro
3-indolil fosfato.
La secuenciación nucleotídica se llevó a cabo
utilizando un conjunto de clones obtenidos mediante distintas
deleciones a partir de los dos clones pLA34 y pLA4. Las deleciones
se seleccionaron en función del mapa de restricción
establecido.
La secuenciación se llevó a cabo a partir de
matrices del ADN plasmídico bicatenario. La técnica de Sanger se
aplicó para la utilización del equipo T7 de Secuenciación
(Pharmacia) y del ^{35}S ATP.
La secuencia se obtuvo mediante distintos clones
que se eliminaron y de iniciadores universales (Cebadores Directos
e inversos) del plásmido pUC18, y seguidamente de oligonucleótidos
sintéticos.
Las secuencias se establecieron en las dos
cadenas complementarias.
Las zonas de compresión debidas al elevado
porcentaje en GC del ADN genómico de M. tuberculosis (65%),
se secuenciaron mediante el equipo de Secuenciación T7 Deaza G/A
(Pharmacia) que contenía un análogo químico del dGTP, el
7-Deaza dGTP.
Las comparaciones y ensamblajes de las secuencias
contiguas obtenidas, se llevaron a cabo mediante el programa STADEN
en Unix. Las homologías de secuencias investigadas entre las
secuencias de los bancos de dados EMBL y del
Gen-Bank, se llevaron a cabo utilizando los
programas FASTA y T-FASTA de GCG.
La genoteca genómica utilizada (Jacobs et
al., 1991 citados anteriormente) se construyó mediante
clonación de fragmentos de 40 kb procedentes de una digestión
genómica parcial mediante la endonucleasa de restricción Sau 3a en
el vector cosmídico pYUB18. El tamaño del genoma, estimado mediante
electroforesis en campo de impulsos en 4200 kb, se contiene, pues,
en alrededor de 100 a 150 clones.
Se utilizó un ensayo competitivo ELISA que
permitía dosificar las proteínas en medio líquido (Romain et
al., 1993, citados anteriormente). Permite detectar y definir
una cantidad de proteínas de 45/47 kDa en los sobrenadantes del
cultivo de M. bovis BCG de 7 días (figura 8).
Esta prueba presenta ventajas: una buena
sensibilidad, es decir, la capacidad de detectar una cantidad del
orden de 1 ng/ml de proteínas en medio líquido, mediante un suero
policlonal diluido 1/8000 (Romain et al, 1993, citados
anteriormente) y una facilidad para establecer rápidamente la criba
de una serie de muestras.
Se cribó una serie de 400 clones recombinantes
pYUB18::M. tuberculosis H37Rv, sometidos a electroporación
en M. smegmatis.
Para esto, se cultivaron los distintos clones
durante 7 días en un medio 7H9 + OADC. Las proteínas recombinantes
se investigaron en esta prueba analizando los sobrenadantes
obtenidos después de centrifugación de los cultivos.
Se encontraron tres clones capaces de expresar
las proteínas reconocidas por los anticuerpos policlonales
específicos de las proteínas de 45/47 kDa de M. bovis BCG
(figura 8). Cuando se llevó a cabo este primer cribado, los
pocillos de las placas de microtitulación estaban recubiertos por
un sobrenadante del cultivo de M. bovis BCG en el cual las
proteínas de 45/47 kDa se evaluaron en el 2% de la masa total. Los
tres clones seleccionados se confirmaron en un segundo experimento
en el que los pocillos de las placas de microtitulación estaban
recubiertos por las proteínas de 45/47 kDa purificadas.
Con el fin de estudiar los diferentes cósmidos
seleccionados, éstos se sometieron a electroporación en E.
coli NM554 después de extracción del ADN de M. smegmatis
mediante lisis alcalina modificada. La obtención del ADN
extracromosómico de micobacterias es en efecto algo difícil debido a
la complejidad de la pared, por una parte difícil de lisar, y al
escaso número de copias de los vectores que se ha determinado de
entre 3 y 10 de media por bacteria. Los tres clones transformados
en E. coli NM554 se aislaron sobre recipientes conteniendo
mL-kanamicina. El ADN cosmídico, extraído mediante
lisis alcalina, se analizó en gel de agarosa al 0,8%.
Los tres clones presentan un ADN de tamaño
superior a 50 kb. Se llevó a cabo una digestión mediante la
endonucleasa de restricción BamH I para distinguir los perfiles de
estos tres cósmidos seleccionados. Éstos se revelaron idénticos
(figura 9). Los perfiles muestran una banda de 12 kb que corresponde
al vector pYUB18, y a continuación una serie de bandas de peso
molecular más bajo que corresponde al fragmento del ADN clonado
(alrededor de 40 kb). Teniendo en cuenta el número de bandas
obtenidas y su localización en el gel, se puede estimar que los
cósmidos aislados eran idénticos.
Se llevaron a cabo distintas digestiones del
único cósmido pLA1, mediante las endonucleasas de restricción que
presentaban lugares de corte más o menos frecuentes para un ADN
rico en G + C, con el fin de distinguir los fragmentos de
longitudes medias y suficientes para contener el o los genes
estructurales de las proteínas de 45/47 kDa, así como para efectuar
una subclonación de éstos (figura 10).
El cósmido pLA1, que contiene una inserción de
alrededor de 40 kb, permite la expresión de proteínas recombinantes
en M. smegmatis, detectadas en un sobrenadante de cultivo
mediante anticuerpos policlonales.
Con el fin de determinar el tamaño aproximado de
las proteínas expresadas, un sobrenadante de un cultivo de 7 días,
liofilizado, se analizó mediante Transferencia Western. Las
proteínas recombinantes expresadas en M. smegmatis presentan
dos pesos moleculares de 45/47 kDa aparentes idénticos a las
expresadas en M. bovis BCG (figura
11).
11).
En otro experimento, se comparó el nivel de
expresión de estas proteínas recombinantes en M. smegmatis
con el de M. bovis BCG. Se utilizó una cantidad determinada
de proteínas de sobrenadantes liofilizados al aplicar una dosis en
el ensayo ELISA competitivo. Distintas concentraciones de los
sobrenadantes liofilizados se pusieron en presencia de una dilución
al 1/8000 dle suero policlonal de conejo. El M. smegmatis
recombinante permite la expresión de proteínas en una cantidad
alrededor de 5 veces más importante que M. bovis BCG (figura
12).
Se efectuó una subclonación de esta inserción,
así como el análisis de las proteínas recombinantes en un huésped
heterólogo (E. coli), con el fin de determinar el número de
genes que codifican estas proteínas.
Cuando pLA1 se transformó en un huésped
heterólogo E. coli NM554, no se detectó ninguna proteína
recombinante en los sobrenadantes del cultivo o en los lisados
bacterianos. Con el fin de favorecer la expresión de estas
proteínas, se llevó a cabo en el plásmido pUC18 una subclonación de
los fragmentos procedentes de una digestión BamH I del cósmido
(Yanisch-Perron et al, Gene, 1985, 33:103,
119).
Los plásmidos recombinantes pUC18::M.
tuberculosis transformados en E. coli
XL1-Blue se seleccionaron por falta de expresión de
la beta- galactosidasa de la bacteria huésped. Mediante lisis
alcalina, se preparó el ADN plasmídico de cada clon "blanco"
(de una serie de 36 clones) y se digirió mediante la endonucleasa
de restricción BamH I.
El tamaño de los plásmidos obtenidos que se
observó en el gel de agarosa, muestra varios perfiles que indican
que los plásmidos recombinantes son diferentes (figura 13A).
El tamaño de las inserciones clonadas que se
observó igualmente en gel de agarosa, muestra perfiles de
restricción diferentes (figura 13B). Estos perfiles presentan todos
un fragmento de 2,8 kb que corresponde al vector pUC18 y una serie
de fragmentos de tamaños diferentes que corresponden a las
inserciones clonadas.
Todos los fragmentos de la digestión se clonaron
solos, por dos o por tres, excepto el fragmento de 12 kb que,
debido a su gran tamaño, es difícilmente clonable.
Los 36 clones seleccionados se cribaron respecto
a su capacidad para inducir una expresión de proteínas
recombinantes en E. coli XL1-Blue. Este
experimento se realizó en el mismo ensayo ELISA competitivo que
anteriormente.
No se detectó ninguna proteína recombinante en
los sobrenadantes del cultivo bacteriano. En cambio, en los lisados
bacterianos de los clones que contenían todas o por lo menos una
inserción de 3 kb, se detectaron las proteínas recombinantes.
El nivel de expresión de las proteínas medido en
esta prueba, está influenciado por el tamaño de los plásmidos. Se
encontró que 2 de entre los 36 clones estudiados, el pLA34 y el
pLA35, que permitían una expresión, contenían respectivamente
inserciones de 3 kb y 7 kb. La expresión es más importante para el
pLA34, como lo muestran los resultados de la tabla 1 (a
continuación).
Se estableció un mapa de restricción del plásmido
pLA34, localizando distintos sitios de fragmentación (o de corte)
de las endonucleasas habituales de restricción, presentes en el
lugar multisitio (poliengarce) de pUC18 (figura 14). Un sitio único
de restricción EcoR I separa la inserción de 3 kb en dos fragmentos
de 2 kb y 1 kb.
Un clon, el pLA34-2, que presenta
una inserción BamH I-EcoR I de 2 kb, se construyó a
partir del precedente mediante deleción. Éste permite igualmente la
expresión de proteínas recombinantes detectadas en los lisados
bacterianos (figura 15).
El análisis de los lisados bacterianos mediante
transferencia Western muestra proteínas de dos pesos moleculares,
45 y 47 kDa, idénticas aparentemente a las proteínas originales
expresadas en M. bovis BCG (figura 16).
La secuencia nucleotídica completa del gen que
codifica las proteínas de 45/47 kDa, la secuencia de más arriba y
la secuencia deducida en aminoácidos se dan a conocer en la
secuencia SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2. El único gen que permite la
expresión del doblete de proteínas presenta 975 pares de bases
entre las posiciones 1082 y 2056 inclusive de la secuencia
nucleotídica.
Más arriba del gen, se localizó una secuencia
consenso de fijación al ribosoma (Shine Dalgarno).
El gen presenta un alto porcentaje en GC del
69,4%, comparado con el porcentaje en GC del 65% para M.
tuberculosis.
La proteína deducida del gen presenta una
secuencia señal típica con un sitio de fragmentación ANA de la
señal peptidasa.
El gen codifica una proteína de 325 aminoácidos
que incluye una secuencia señal de 39 aminoácidos.
Los resultados obtenidos mediante análisis
bioquímico de la composición en aminoácidos de las proteínas
purificadas de M. bovis BCG y de M. tuberculosis,
comparados con los que se dedujeron de la secuencia proteica,
concuerdan (tabla 2). Esto permite concluir la existencia de un solo
gen que permite la expresión de proteínas de dos pesos moleculares
en Mycobacterium smegmatis y E. coli.
El peso molecular calculado a partir de la
secuencia deducida en aminoácidos, es de 28,7 kDa.
El punto isoeléctrico calculado es de 4,36. Este
último resultado concuerda igualmente con una determinación
bioquímica del punto isoeléctrico realizada sobre las proteínas
purificadas de M. bovis BCG.
La secuencia deducida en aminoácidos muestra un
porcentaje importante en prolina y alanina (21,8% y 19,1%).
La secuencia entera muestra una homología con una
proteína recientemente descrita de Mycobacterium leprae. Las
dos secuencias se comparan en la figura 17. El grado de homología
entre las dos proteínas es del 65,4%. Esta proteína descrita en
Mycobacterium leprae presenta igualmente una secuencia señal
típica de las proteínas secretadas.
Se estableció el perfil de hidrofobicidad de la
proteína deducida de M. tuberculosis, objeto de la presente
invención (SEC ID nº 2). Se representa en la figura 18.
| Clones pUC18: M. tuberculosis | Tamaño de inserciones | Expresión de las proteínas |
| ELISA | ||
| nº 34 | 3 kb | ++ |
| nº 35 | 3 kb + 4 kb | + |
| nº 4 | 3 kb | - |
| nº 17 | 3 kb + 4 kb + 1,7 kb | - |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INSTITUT PASTEUR
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 28, rue du Docteur Roux
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARIS
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CP: 75724
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 4 568 8000
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 43 06 98 35
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 250609 F
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas de micobacterias, microorganismos que las producen y utilizaciones vacunales y para la detección de la tuberculosis
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (OEB)
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2061 pares de bases
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- Nº CADENAS: doble
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1082..2057
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 325 aminoácidos
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 286 aminoácidos
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- Nº CADENAS:
\vskip0.666000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
Claims (17)
1. Proteína con la secuencia SEC ID nº 3
siguiente:
2. Proteína según la reivindicación 1,
caracterizada porque presenta la secuencia SEC ID nº 2
siguiente:
3. Proteína híbrida que incluye cualquiera de las
secuencias SEC ID nº 2 o SEC ID nº 3 según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, y una secuencia de un péptido o de una
proteína susceptible de inducir una respuesta inmunitaria.
4. Proteína según la reivindicación 3,
caracterizada porque la respuesta inmunitaria es una
respuesta humoral y/o una respuesta celular.
5. Proteína según cualquiera de las
reivindicaciones 3 y 4, caracterizada porque el péptido o la
proteína constituye una parte, en particular un epítopo, de la
toxina diftérica, de la toxina tetánica, del antígeno HBS del virus
HBV, o del antígeno VP1 del virus de la poliomielitis, u otra
toxina o antígeno vírico.
6. Oligonucleótido que codifica una proteína
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Oligonucleótido según la reivindicación 6,
caracterizado porque presenta por lo menos una parte de la
secuencia SEC ID Nº1 siguiente:
8. Microorganismo transformado con un
oligonucleótido según la reivindicación 6 o un ADN según la
reivindicación 7, el cual produce una proteína según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5.
9. Microorganismo según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicha proteína se encuentra, por lo
menos en parte, en su superficie.
10. Microorganismo según la reivindicación 9,
caracterizado porque es una bacteria.
11. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque es una
micobacteria, en particular M. bovis BCG.
12. Composición farmacéutica que comprende una
cantidad eficaz de una proteína o de un microorganismo según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 11, asociados con
diluyentes o excipientes farmacéuticamente compatibles.
13. Medicamento o vacuna que comprende una
proteína o un microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 11.
14. Procedimiento de detección in vitro de
anticuerpos específicos de la tuberculosis, en el que un fluido
biológico, susceptible de contener dichos anticuerpos, se pone en
contacto con una proteína según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque dichas proteínas se fijan sobre un
soporte.
16. Equipo de detección para la puesta en
práctica del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones
14 y 15, que comprende por lo menos una preparación proteica según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y soluciones tamponadas
para la puesta en práctica del procedimiento.
17. Equipo según la reivindicación 16,
caracterizado porque incluye un reactivo que pone en
evidencia el complejo anticuerpo-proteína
formado.
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Families Citing this family (28)
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|---|---|---|---|---|
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| US6592877B1 (en) * | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6290969B1 (en) * | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6458366B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| AU4750597A (en) * | 1996-10-11 | 1998-05-11 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| FR2758144B1 (fr) * | 1997-01-08 | 1999-04-02 | Pasteur Institut | Polynucleotide codant pour un polypeptide de 27 kd de mycobacteries appartenant au complexe de mycobacterium tuberculosis, application au diagnostic et a la prevention de la tuberculose |
| FR2766495B1 (fr) | 1997-07-22 | 2001-07-13 | Pasteur Institut | Souche de mycobacterium dont le gene erp est modifie et composition vaccinale la contenant |
| FR2767337B1 (fr) | 1997-08-14 | 2002-07-05 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques de polypeptides exportes de mycobacteri es, vecteurs les comprenant et applications au diagnostic et a la prevention de la tuberculose |
| US6465633B1 (en) | 1998-12-24 | 2002-10-15 | Corixa Corporation | Compositions and methods of their use in the treatment, prevention and diagnosis of tuberculosis |
| US8143386B2 (en) * | 1999-04-07 | 2012-03-27 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| CA2386841A1 (en) * | 1999-10-07 | 2001-04-12 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| US6316205B1 (en) * | 2000-01-28 | 2001-11-13 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Assay devices and methods of analyte detection |
| DE10007771A1 (de) * | 2000-02-14 | 2001-08-23 | Kleine & Steube Entoxin Gmbh | Immunmodulatorisch wirksame Zusammensetzungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| WO2001062893A2 (en) * | 2000-02-25 | 2001-08-30 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
| CA2413959C (en) * | 2000-06-20 | 2015-07-07 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| US7288261B2 (en) * | 2000-07-10 | 2007-10-30 | Colorado State University Research Foundation | Mid-life vaccine and methods for boosting anti-mycobacterial immunity |
| FR2818647B1 (fr) * | 2000-12-21 | 2006-09-29 | Pasteur Institut | Glycopeptides immunogenes, criblage, preparation et applications |
| US20050267025A1 (en) * | 2002-02-01 | 2005-12-01 | Ho John L | Compositions and methods for treatment of infectious and inflammatory diseases |
| US20030199012A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-10-23 | Ho John L. | Compositions and methods for treatment of infectious and inflammatory diseases |
| US7026465B2 (en) | 2002-02-15 | 2006-04-11 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis |
| ES2286212T3 (es) * | 2002-02-25 | 2007-12-01 | Pasteur Institut | Secuencias suprimidas especificamente del genoma de mycobacterium tuberculosis, y su uso en el diagnostico y como vacunas. |
| CN100393876C (zh) * | 2004-05-11 | 2008-06-11 | 中国人民解放军第三○九医院 | 用于结核病诊断的结核分枝杆菌蛋白 |
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| US8475735B2 (en) * | 2004-11-01 | 2013-07-02 | Uma Mahesh Babu | Disposable immunodiagnostic test system |
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