JP2001204482A - 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子 - Google Patents
肺炎球菌タンパクの構造遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 肺炎球菌に対する免疫防御のための防御エピ
トープを含むトランケート状のPspAを提供すること。 【解決手段】 肺炎球菌表面タンパク（ＰｓｐＡ）に遺
伝子操作を加えて、機能的細胞膜アンカー領域を欠失
し、かつ全ＰｓｐＡタンパクの約９０％までに、トラン
ケートされた免疫防御性を有する肺炎球菌表面タンパク
（ＰｓｐＡ）を得る。
トープを含むトランケート状のPspAを提供すること。 【解決手段】 肺炎球菌表面タンパク（ＰｓｐＡ）に遺
伝子操作を加えて、機能的細胞膜アンカー領域を欠失
し、かつ全ＰｓｐＡタンパクの約９０％までに、トラン
ケートされた免疫防御性を有する肺炎球菌表面タンパク
（ＰｓｐＡ）を得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、肺炎球菌の感染に
対する改良ワクチンの開発に関する。本出願の対応米国
出願は、米国特許出願番号６５６,７７３、出願日１９
９１年２月１５日の一部継続出願である。
対する改良ワクチンの開発に関する。本出願の対応米国
出願は、米国特許出願番号６５６,７７３、出願日１９
９１年２月１５日の一部継続出願である。
【０００２】
【従来の技術】Streptococcus pneumoniae（肺炎連鎖球
菌）は、中耳炎、髄膜炎、菌血症及び肺炎の重要な病原
菌である。抗生物質やワクチンが使用されているにもか
かわらず、肺炎球菌感染の流行は過去２５年間ほとんど
減少していない。
菌）は、中耳炎、髄膜炎、菌血症及び肺炎の重要な病原
菌である。抗生物質やワクチンが使用されているにもか
かわらず、肺炎球菌感染の流行は過去２５年間ほとんど
減少していない。
【０００３】Streptococcus pneumoniae に対する免疫
は、肺炎球菌の多糖類莢膜に対する特異的抗体によって
仲介されると一般に考えられている。しかし、新生児や
幼児は多糖類抗原に対する免疫反応を示すことができ
ず、同じ莢膜血清型の感染を繰り返す。
は、肺炎球菌の多糖類莢膜に対する特異的抗体によって
仲介されると一般に考えられている。しかし、新生児や
幼児は多糖類抗原に対する免疫反応を示すことができ
ず、同じ莢膜血清型の感染を繰り返す。
【０００４】多くの莢膜型バクテリアに対する免疫を乳
幼児に付与する方法の一つは、莢膜多糖類抗体をタンパ
クに共役させ、免疫性を持たせることである。この方法
は、例えばHaemophilus influenzae bで成功している
（Gordon、米国特許番号４,４９６,５３８及びAnderso
n、米国特許番号４,６７３,５７４参照）。しかし、S.p
neumoniae の場合、８０種以上の莢膜血清型があり、そ
のうち２３種がこの病原菌による疾病のほとんどに関与
することが知られている。肺炎球菌多糖類―タンパク複
合体が成功するためには、ほとんどの肺炎球菌感染に関
与する莢膜型に対して十分な免疫性がなければならな
い。現在利用できるワクチンでは、その中に含まれてい
る２３種類の多糖類が成人に対しても全て十分な免疫性
を有しているとは限らないので、このようなアプローチ
は困難である。
幼児に付与する方法の一つは、莢膜多糖類抗体をタンパ
クに共役させ、免疫性を持たせることである。この方法
は、例えばHaemophilus influenzae bで成功している
（Gordon、米国特許番号４,４９６,５３８及びAnderso
n、米国特許番号４,６７３,５７４参照）。しかし、S.p
neumoniae の場合、８０種以上の莢膜血清型があり、そ
のうち２３種がこの病原菌による疾病のほとんどに関与
することが知られている。肺炎球菌多糖類―タンパク複
合体が成功するためには、ほとんどの肺炎球菌感染に関
与する莢膜型に対して十分な免疫性がなければならな
い。現在利用できるワクチンでは、その中に含まれてい
る２３種類の多糖類が成人に対しても全て十分な免疫性
を有しているとは限らないので、このようなアプローチ
は困難である。
【０００５】子供や老人を肺炎球菌の感染から守る別の
方法は、防御免疫反応を誘発することのできるタンパク
抗原を同定することである。このようなタンパクは、そ
れ自体ワクチンとして利用することができ、優れた多糖
類―タンパク複合体と結合して、または多糖類の担体と
して利用することもできる。
方法は、防御免疫反応を誘発することのできるタンパク
抗原を同定することである。このようなタンパクは、そ
れ自体ワクチンとして利用することができ、優れた多糖
類―タンパク複合体と結合して、または多糖類の担体と
して利用することもできる。
【０００６】McDanielら（I）、J. Exp. Med. １６０：
３８６―３９７、１９８４にはS. peumoniae の細胞表
面多糖類として知られている雑種細胞抗体の製造法と当
該抗体を用いた莢膜肺炎球菌のある種の系統によるマウ
スの感染予防が記載されている。この表面タンパク抗原
は、「肺炎球菌A」または略してPspAと呼ばれている。
３８６―３９７、１９８４にはS. peumoniae の細胞表
面多糖類として知られている雑種細胞抗体の製造法と当
該抗体を用いた莢膜肺炎球菌のある種の系統によるマウ
スの感染予防が記載されている。この表面タンパク抗原
は、「肺炎球菌A」または略してPspAと呼ばれている。
【０００７】McDanielら（II）、Microbial Pathogenes
is １：５１９―５３１、１９８６にはPspAの性質に関
する研究が報告されている。系統が異なることによっ
て、PspA分子にかなりの多様性が認められ、抗体によっ
て識別するエピトープが異なる。
is １：５１９―５３１、１９８６にはPspAの性質に関
する研究が報告されている。系統が異なることによっ
て、PspA分子にかなりの多様性が認められ、抗体によっ
て識別するエピトープが異なる。
【０００８】McDanielら（III）、J. Exp. Med. １６
５：３８１―３９４、１９８７には、PspAを欠く相同遺
伝子肺炎球菌ではないが、PspAを発現する非莢膜肺炎球
菌を用いて、X―連鎖免疫不全（XID）マウスに免疫処置
を行うと、マウスにおけるその後の肺炎球菌による致命
的な感染を防止できることが記載されている。
５：３８１―３９４、１９８７には、PspAを欠く相同遺
伝子肺炎球菌ではないが、PspAを発現する非莢膜肺炎球
菌を用いて、X―連鎖免疫不全（XID）マウスに免疫処置
を行うと、マウスにおけるその後の肺炎球菌による致命
的な感染を防止できることが記載されている。
【０００９】McDanielら（IV）、Infect. Immun., ５
９：２２２―２２８、１９９１には、莢膜型肺炎球菌６
A及び３に対する防御効果を誘導することのできる組替P
spAの完全フラグメントを用いたマウスの免疫処置が記
載されている。
９：２２２―２２８、１９９１には、莢膜型肺炎球菌６
A及び３に対する防御効果を誘導することのできる組替P
spAの完全フラグメントを用いたマウスの免疫処置が記
載されている。
【００１０】Crainら、Infect. Immun., ５６：３２９
３―３２９９、１９９０には、臨床的及び実験的に単離
されたS. pneumoniaeの各種系統を１００％（n＝９５）
検出できるウサギの抗血清が記載されている。７種の単
一クローン性抗体をPspAと反応させると、単離した５７
種のS. pneumoniaeが３１種類の反応パターンを示し
た。
３―３２９９、１９９０には、臨床的及び実験的に単離
されたS. pneumoniaeの各種系統を１００％（n＝９５）
検出できるウサギの抗血清が記載されている。７種の単
一クローン性抗体をPspAと反応させると、単離した５７
種のS. pneumoniaeが３１種類の反応パターンを示し
た。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】PspAのタンパク型は、
莢膜型とは関係がない。環境中における遺伝子の突然変
異または交換によって、莢膜、PspA及び多分そのほかの
分子構造が極めて多様化した系統の大きなプールが発達
するものと考えられる。PspAは、その分子量が６７から
９９kDの範囲にあることからも、系統によって変動する
ことが考えられる。観察された差は安定で、本質的であ
ることから、タンパクの分解によるものではない。
莢膜型とは関係がない。環境中における遺伝子の突然変
異または交換によって、莢膜、PspA及び多分そのほかの
分子構造が極めて多様化した系統の大きなプールが発達
するものと考えられる。PspAは、その分子量が６７から
９９kDの範囲にあることからも、系統によって変動する
ことが考えられる。観察された差は安定で、本質的であ
ることから、タンパクの分解によるものではない。
【００１２】組換えλgt１１クローンから部分的に精製
したPspAを用いて免疫処置すると、McDanielら（IV）、
Infect. Immun. ５９：２２２―２２８、１９９１に記
載されているように、莢膜及びPspA型の異なるいくつか
のS. pneumoniae系統の抗体投与に対する防御が誘発さ
れた。PspA発現クローンを上記の報告にしたがって構成
したが、製品は不溶性で、細胞溶解後も細胞フラグメン
トから単離することができなかった。
したPspAを用いて免疫処置すると、McDanielら（IV）、
Infect. Immun. ５９：２２２―２２８、１９９１に記
載されているように、莢膜及びPspA型の異なるいくつか
のS. pneumoniae系統の抗体投与に対する防御が誘発さ
れた。PspA発現クローンを上記の報告にしたがって構成
したが、製品は不溶性で、細胞溶解後も細胞フラグメン
トから単離することができなかった。
【００１３】
【課題を解決するための手段】タンパクの構造は肺炎球
菌の系統間で異なるが、全てのPspA間で多くの交差反応
が存在することから、単一pspAまたは少なくとも小数の
PspAがS. pneumoniaeの多くの系統に対する防御作用を
誘発するような共通的なエピトープが存在するものと考
えられる。
菌の系統間で異なるが、全てのPspA間で多くの交差反応
が存在することから、単一pspAまたは少なくとも小数の
PspAがS. pneumoniaeの多くの系統に対する防御作用を
誘発するような共通的なエピトープが存在するものと考
えられる。
【００１４】上記の公表文献の他に、本発明者らは、共
同研究者らとともに、以下の文献にPspAの詳細を報告し
ている。
同研究者らとともに、以下の文献にPspAの詳細を報告し
ている。
【００１５】１. American Society for Microbiology
第８９回年次大会要旨、１２５頁アイテムD ―２５
７、１９８９年５月 ２. American Society for Microbiology 第９０回年
次大会要旨、９８頁アイテムD―１０６、１９９０年５
月 ３. International ASM Conference on Streptococcal
Genetics第３回大会要旨、１１頁、アイテム１２、１
９９０年６月 ４. Talkingtonら、Infect. Immun.５９：１２８５―
１２８９、１９９１ ５. Yotherら、J. Bacteriol. １７４：６０１―６０
９、１９９２ ６. Yotherら、J. Bacteriol. １７４：６１０―６１
８、１９９２ 前記のUSSN６５６,７７３出願後、短報を３件発表し
た。
第８９回年次大会要旨、１２５頁アイテムD ―２５
７、１９８９年５月 ２. American Society for Microbiology 第９０回年
次大会要旨、９８頁アイテムD―１０６、１９９０年５
月 ３. International ASM Conference on Streptococcal
Genetics第３回大会要旨、１１頁、アイテム１２、１
９９０年６月 ４. Talkingtonら、Infect. Immun.５９：１２８５―
１２８９、１９９１ ５. Yotherら、J. Bacteriol. １７４：６０１―６０
９、１９９２ ６. Yotherら、J. Bacteriol. １７４：６１０―６１
８、１９９２ 前記のUSSN６５６,７７３出願後、短報を３件発表し
た。
【００１６】以下の明細書及び添付図面では、アミノ酸
に関して通常使用されている略称を使用した。これらの
略称を以下に示す。 アミノ酸の略称： A：Ala：アラニン C：Cys：システイン D：Asp：アスパラギン酸 E：Glu：グルタミン酸 F：Phe：フェニルアラニン G：Gly：グリシン H：His：ヒスチジン I：Ile：イソロイシン K：Lys：リジン L：Leu：ロイシン M：Met：メチオニン N：Asn：アスパラギン P：Pro：プロリン Q：Gln：グルタミン R：Arg：アルギニン S：Ser：セリン T：Thr：スレオニン V：Val：バリン W：Try：トリプトファン Y：Tyr：チロシン 本発明は、トランケート状の免疫性PspAタンパクを分泌
するS. pneumoniae突然変異株の調製及び分泌されたタ
ンパクの単離及び精製に関する。トランケート状PspAタ
ンパクは免疫防御作用を有し、PspAの保護エピトープを
含んでいる。PspAタンパクは生理食塩水に可溶性で、少
なくとも機能細胞膜のアンカー部位を欠失している。
に関して通常使用されている略称を使用した。これらの
略称を以下に示す。 アミノ酸の略称： A：Ala：アラニン C：Cys：システイン D：Asp：アスパラギン酸 E：Glu：グルタミン酸 F：Phe：フェニルアラニン G：Gly：グリシン H：His：ヒスチジン I：Ile：イソロイシン K：Lys：リジン L：Leu：ロイシン M：Met：メチオニン N：Asn：アスパラギン P：Pro：プロリン Q：Gln：グルタミン R：Arg：アルギニン S：Ser：セリン T：Thr：スレオニン V：Val：バリン W：Try：トリプトファン Y：Tyr：チロシン 本発明は、トランケート状の免疫性PspAタンパクを分泌
するS. pneumoniae突然変異株の調製及び分泌されたタ
ンパクの単離及び精製に関する。トランケート状PspAタ
ンパクは免疫防御作用を有し、PspAの保護エピトープを
含んでいる。PspAタンパクは生理食塩水に可溶性で、少
なくとも機能細胞膜のアンカー部位を欠失している。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明は、その１側面で、タンパ
クの免疫防御性エピトープを含み、かつ総PspAタンパク
の約９０％までを占め、機能細胞膜アンカー部位を欠失
するトランケート状のPspAからなる精製した免疫防御性
肺炎球菌表面タンパクを提供するものである。
クの免疫防御性エピトープを含み、かつ総PspAタンパク
の約９０％までを占め、機能細胞膜アンカー部位を欠失
するトランケート状のPspAからなる精製した免疫防御性
肺炎球菌表面タンパクを提供するものである。
【００１８】pspA構造遺伝子のクローン化フラグメント
を含むプラスミッドを有するStreptococcus pneumoniae
のRｘ１株のpspA遺伝子に挿入複製法で突然変異を起こ
させることにより、肺炎球菌により分泌されるPspAの可
溶性フラグメントを製造することができる。
を含むプラスミッドを有するStreptococcus pneumoniae
のRｘ１株のpspA遺伝子に挿入複製法で突然変異を起こ
させることにより、肺炎球菌により分泌されるPspAの可
溶性フラグメントを製造することができる。
【００１９】本発明の別の側面は、pspA遺伝子で細菌に
挿入複製突然変異を起こさせることにより、トランケー
ト状の発現PspAタンパクをコード化し、トランケート状
PspAタンパクが発現されるために突然変異株を培養し、
タンパクを単離することからなる免疫防御作用を有する
トランケート状PspAタンパクを形成させる方法を提供す
るものである。
挿入複製突然変異を起こさせることにより、トランケー
ト状の発現PspAタンパクをコード化し、トランケート状
PspAタンパクが発現されるために突然変異株を培養し、
タンパクを単離することからなる免疫防御作用を有する
トランケート状PspAタンパクを形成させる方法を提供す
るものである。
【００２０】このようにして得られた精製トランケート
状PspAタンパクの分子量は、遺伝子の発現終末を決定す
る挿入点をpspA遺伝子中でいろいろな方向に調整するこ
とによって変えることができる。例えば、約半分は在来
タンパクからなり、見かけ上の分子量４３kDを有するN
―末端フラグメントは、有用であることが明らかとなっ
た。
状PspAタンパクの分子量は、遺伝子の発現終末を決定す
る挿入点をpspA遺伝子中でいろいろな方向に調整するこ
とによって変えることができる。例えば、約半分は在来
タンパクからなり、見かけ上の分子量４３kDを有するN
―末端フラグメントは、有用であることが明らかとなっ
た。
【００２１】この方法で製造することのできるトランケ
ート状セグメントは、S. pneumoniae３型を致命的に抗
原投与したマウスにおいて防御反応を誘発することか
ら、精製PspAが防御反応を誘発すること、またタンパク
のこのトランケート状セグメントがPspAの保護性エピト
ープを含んでいることを初めて実証することができた。
ート状セグメントは、S. pneumoniae３型を致命的に抗
原投与したマウスにおいて防御反応を誘発することか
ら、精製PspAが防御反応を誘発すること、またタンパク
のこのトランケート状セグメントがPspAの保護性エピト
ープを含んでいることを初めて実証することができた。
【００２２】アミノ酸配列の情報は、PspAのトランケー
ト状セグメントのN―末端４５アミノ酸について得たも
のである。この配列を図２に示す。予測的二次構造分析
から、この配列は極めて強いα―螺旋状形態を有し、非
螺旋状の挿入はないことが明らかとなった。セグメント
の約５１％がわずか２種類のアミノ酸、すなわち荷電ア
ミノ酸のリジンと非荷電アミノ酸のアラニンからなって
いる。
ト状セグメントのN―末端４５アミノ酸について得たも
のである。この配列を図２に示す。予測的二次構造分析
から、この配列は極めて強いα―螺旋状形態を有し、非
螺旋状の挿入はないことが明らかとなった。セグメント
の約５１％がわずか２種類のアミノ酸、すなわち荷電ア
ミノ酸のリジンと非荷電アミノ酸のアラニンからなって
いる。
【００２３】また、この４５―アミノ酸配列を分析した
ところ、７残基の周期を含むことが明らかとなった（図
２参照）。PspAにおいては、周期は残基８から始まり、
ほぼ１１回転の螺旋状で配列全体にわたって広がってい
る。“a”及び“b”の位置は非極性アミノ酸で占めら
れ、一般に“b”、“c”及び“f”の位置は親水性のア
ミノ酸で占められている。位置“f”はほとんどリジン
で占められている。このようなことを考慮し、PspAのこ
の領域はα―螺旋状高次コイル立体配置である可能性が
高い。α―螺旋状高次コイル領域全体の推定アミノ酸配
列を図５に示す。
ところ、７残基の周期を含むことが明らかとなった（図
２参照）。PspAにおいては、周期は残基８から始まり、
ほぼ１１回転の螺旋状で配列全体にわたって広がってい
る。“a”及び“b”の位置は非極性アミノ酸で占めら
れ、一般に“b”、“c”及び“f”の位置は親水性のア
ミノ酸で占められている。位置“f”はほとんどリジン
で占められている。このようなことを考慮し、PspAのこ
の領域はα―螺旋状高次コイル立体配置である可能性が
高い。α―螺旋状高次コイル領域全体の推定アミノ酸配
列を図５に示す。
【００２４】pspAのコード化領域全体をクローン化し、
配列を決定した（図３参照）。PspAタンパクの推定アミ
ノ酸配列から、図１に模式的に示したように、３点の特
異的領域が認められる。したがって、本発明の別の側面
は、PspAタンパクまたはそれらのタンパク群をコード化
し、図３で規定した範囲に含まれるコード配列またはそ
れとかなり相同的な配列を有する生物学的に純粋な組換
えDNA分子を提供することである。
配列を決定した（図３参照）。PspAタンパクの推定アミ
ノ酸配列から、図１に模式的に示したように、３点の特
異的領域が認められる。したがって、本発明の別の側面
は、PspAタンパクまたはそれらのタンパク群をコード化
し、図３で規定した範囲に含まれるコード配列またはそ
れとかなり相同的な配列を有する生物学的に純粋な組換
えDNA分子を提供することである。
【００２５】pspA遺伝子のDNA配列は、長さが２０８６
塩基対のHind III―Kpn Iフラグメント上に含まれる。p
spA遺伝子自体は、このフラグメントのうち約１９８５
塩基対を占め、転写及び翻訳シグナルを含み、ATG／met
（ヌクレオチド位置１２７、コドン位置―３１）で翻訳
を開始し、AAG／met（ヌクレオチド位置１２７、コドン
位置―３１）からCGA／ala（ヌクレオチド位置２１７、
コドン位置―１）に伸びるリーダー配列を含む開始領域
からなっている。成熟PspAは、ヌクレオチド位置２２０
（コドン＋１）のgluアミノ酸から始まり、ヌクレオチ
ド位置１９８４の翻訳ストップTAA／OCHで終わる。この
翻訳ストップコドンの次に、翻訳終了シグナルがある。
塩基対のHind III―Kpn Iフラグメント上に含まれる。p
spA遺伝子自体は、このフラグメントのうち約１９８５
塩基対を占め、転写及び翻訳シグナルを含み、ATG／met
（ヌクレオチド位置１２７、コドン位置―３１）で翻訳
を開始し、AAG／met（ヌクレオチド位置１２７、コドン
位置―３１）からCGA／ala（ヌクレオチド位置２１７、
コドン位置―１）に伸びるリーダー配列を含む開始領域
からなっている。成熟PspAは、ヌクレオチド位置２２０
（コドン＋１）のgluアミノ酸から始まり、ヌクレオチ
ド位置１９８４の翻訳ストップTAA／OCHで終わる。この
翻訳ストップコドンの次に、翻訳終了シグナルがある。
【００２６】タンパク配列のアミノ酸末端は、図３のＤ
ＮＡ配列から推察すると、３１のアミノ酸リーダー配列
とPspAのN―末端の４５アミノ酸配列（図２）と全く同
じ４５のアミノ酸配列を含む。推論したタンパク配列の
アミノ酸末端は高度に荷電し、α―螺旋状の性質を持っ
ている。この領域は、アミノ酸レベル（同一性約２２
％、類似性５０％）でトロポマイオシンと類似である。
この類似性は、主として７の残基周期を繰り返すことに
よるものであり、この場合第１と第４のアミノ酸は疎水
性であり、介在アミノ酸は螺旋構造プロモーターであ
り、第７アミノ酸は荷電している。このパターンはα―
螺旋状高次コイル分子のパターンと一致し、分子のN―
末端の半分にα―螺旋状コイルが伸びていることを示し
ている。α―螺旋状コイル領域全体のアミノ酸配列を図
５に示す。
ＮＡ配列から推察すると、３１のアミノ酸リーダー配列
とPspAのN―末端の４５アミノ酸配列（図２）と全く同
じ４５のアミノ酸配列を含む。推論したタンパク配列の
アミノ酸末端は高度に荷電し、α―螺旋状の性質を持っ
ている。この領域は、アミノ酸レベル（同一性約２２
％、類似性５０％）でトロポマイオシンと類似である。
この類似性は、主として７の残基周期を繰り返すことに
よるものであり、この場合第１と第４のアミノ酸は疎水
性であり、介在アミノ酸は螺旋構造プロモーターであ
り、第７アミノ酸は荷電している。このパターンはα―
螺旋状高次コイル分子のパターンと一致し、分子のN―
末端の半分にα―螺旋状コイルが伸びていることを示し
ている。α―螺旋状コイル領域全体のアミノ酸配列を図
５に示す。
【００２７】荷電した螺旋状領域の次に、８１アミノ酸
のうち２３がプロリンであるプロリン・リッチな領域が
存在する。プロリン・リッチな領域の次のカルボキシ
は、相同性の高い２０のアミノ酸反復の最初の１０個の
アミノ酸である。分子の配列決定部位における唯一顕著
な疎水性領域は最後の反復で始まる。この膜スパンニン
グ領域は、翻訳ストップコドンの前に数種の荷電アミノ
酸を含んでいる。
のうち２３がプロリンであるプロリン・リッチな領域が
存在する。プロリン・リッチな領域の次のカルボキシ
は、相同性の高い２０のアミノ酸反復の最初の１０個の
アミノ酸である。分子の配列決定部位における唯一顕著
な疎水性領域は最後の反復で始まる。この膜スパンニン
グ領域は、翻訳ストップコドンの前に数種の荷電アミノ
酸を含んでいる。
【００２８】挿入不活性化され、C―末端アンカー領域
を欠失するS. pneumoniae の変異株は、化学的に限定し
た培地で生育が可能であり、培地中にPspAタンパクのN
―末端部分を分泌する。PspAのN―末端領域は、培地に
対する溶解性が高く、完全な分子に比較して単離がはる
かに容易である。可溶性のトランケート分子は、図４に
示したクローン化PspA DNAフラグメントを用いた挿入重
複突然変異によって製造した。E. coliに同じトランケ
ート状構造を発現させる（肺炎球菌プロモータを用い）
と、同じPspAフラグメントがE. coliの周縁細胞質中に
分泌される。PspAは、低張性細胞溶解により、周縁細胞
質から容易に抽出される。
を欠失するS. pneumoniae の変異株は、化学的に限定し
た培地で生育が可能であり、培地中にPspAタンパクのN
―末端部分を分泌する。PspAのN―末端領域は、培地に
対する溶解性が高く、完全な分子に比較して単離がはる
かに容易である。可溶性のトランケート分子は、図４に
示したクローン化PspA DNAフラグメントを用いた挿入重
複突然変異によって製造した。E. coliに同じトランケ
ート状構造を発現させる（肺炎球菌プロモータを用い）
と、同じPspAフラグメントがE. coliの周縁細胞質中に
分泌される。PspAは、低張性細胞溶解により、周縁細胞
質から容易に抽出される。
【００２９】トランケート状PspAは、横流濾過等従来の
方法を用い、突然変異肺炎球菌の培養液から単離するこ
とができる。次いで、陰イオン交換樹脂を用いてイオン
交換クロマトグラフィーを行い、タンパクを精製する。
この手順においては、PspAを含む溶液を０.０２Mの塩溶
液中でpH６まで透析した後、樹脂に通す。イオン強度
０.０８から２.０MまでのグラジェントでPspAを溶出
し、使用するカラムの性質により、０.３４から０.８７
Mイオン強度の画分を集める。
方法を用い、突然変異肺炎球菌の培養液から単離するこ
とができる。次いで、陰イオン交換樹脂を用いてイオン
交換クロマトグラフィーを行い、タンパクを精製する。
この手順においては、PspAを含む溶液を０.０２Mの塩溶
液中でpH６まで透析した後、樹脂に通す。イオン強度
０.０８から２.０MまでのグラジェントでPspAを溶出
し、使用するカラムの性質により、０.３４から０.８７
Mイオン強度の画分を集める。
【００３０】PspAは、ドデシル硫酸ポリアクリルアミド
ナトリウムゲル（SDS―PAGE）電気泳動によって、さら
に精製することができる。ゲルのPspA含有部分は、ゲル
を染色することによって確認し、この部分からPspAを電
気溶出する。
ナトリウムゲル（SDS―PAGE）電気泳動によって、さら
に精製することができる。ゲルのPspA含有部分は、ゲル
を染色することによって確認し、この部分からPspAを電
気溶出する。
【００３１】電気泳動による精製は、少量のPspAを取り
扱う場合に便利である。大量生産に適した方法として、
pH７のリン酸緩衝液中でサイズ・クロマトグラフィーを
行うことにより精製することができる。
扱う場合に便利である。大量生産に適した方法として、
pH７のリン酸緩衝液中でサイズ・クロマトグラフィーを
行うことにより精製することができる。
【００３２】培地中にトランケート状のPspAを発現させ
ることができるので、細胞膜内にトラップされている場
合のように複雑な精製工程を必要とせず、PspAとその他
のタンパクの間でタンパクを融合させることにより、ト
ランケートpspA遺伝子中にクローン化された別のタンパ
クを単離することもできる。このような手法は、免疫性
を増強したり、遺伝子産物の免疫性構造または提示の保
存に利用することができ、融合タンパクを全身的または
粘膜的に免疫投与することを可能にする。
ることができるので、細胞膜内にトラップされている場
合のように複雑な精製工程を必要とせず、PspAとその他
のタンパクの間でタンパクを融合させることにより、ト
ランケートpspA遺伝子中にクローン化された別のタンパ
クを単離することもできる。このような手法は、免疫性
を増強したり、遺伝子産物の免疫性構造または提示の保
存に利用することができ、融合タンパクを全身的または
粘膜的に免疫投与することを可能にする。
【００３３】このような融合タンパクの１例は、PspAの
可溶性N―末端領域とコレラ毒のB―サブユニットの融合
である。また、融合タンパクは、トランケート状PspAタ
ンパクを別のタンパクに化学的に付加することによって
も形成することができる。
可溶性N―末端領域とコレラ毒のB―サブユニットの融合
である。また、融合タンパクは、トランケート状PspAタ
ンパクを別のタンパクに化学的に付加することによって
も形成することができる。
【００３４】本発明の別の側面は、PspAタンパクのトラ
ンケート型をコード化したpspA遺伝子と別のタンパクを
コード化した遺伝子を融合させて融合タンパクのクロー
ンを形成し、融合タンパククローンでS. pneumoniae、
E. coliまたはその他の細菌を形質変換させ、形質変換
した細菌を培養してトランケート状PspAとその他のタン
パクを培養液中に発現させ、融合タンパクを単離するこ
とから成るクローン化タンパクの製造法を提供するもの
である。
ンケート型をコード化したpspA遺伝子と別のタンパクを
コード化した遺伝子を融合させて融合タンパクのクロー
ンを形成し、融合タンパククローンでS. pneumoniae、
E. coliまたはその他の細菌を形質変換させ、形質変換
した細菌を培養してトランケート状PspAとその他のタン
パクを培養液中に発現させ、融合タンパクを単離するこ
とから成るクローン化タンパクの製造法を提供するもの
である。
【００３５】この手法を利用することにより、例えばS.
pneumoniae 等肺炎球菌、例えばBacille Calmette-Gue
rin (BCG) 等のミコバクテリア等のグラム陽性細菌中に
クーロン化したタンパクを生産させることができる。こ
の方法は、通常クローン化に使用されるE. coli等のグ
ラム陰性細菌に本質的な問題、特に組換えタンパクをエ
ンドトキシンから分離、精製する必要性、及びグラム陰
性細菌における多くのグラム陽性DNA配列の毒性等を克
服することができる。
pneumoniae 等肺炎球菌、例えばBacille Calmette-Gue
rin (BCG) 等のミコバクテリア等のグラム陽性細菌中に
クーロン化したタンパクを生産させることができる。こ
の方法は、通常クローン化に使用されるE. coli等のグ
ラム陰性細菌に本質的な問題、特に組換えタンパクをエ
ンドトキシンから分離、精製する必要性、及びグラム陰
性細菌における多くのグラム陽性DNA配列の毒性等を克
服することができる。
【００３６】PspAの可溶性N―末端領域及びコレラ毒素
のB―サブユニット（CTB）からなる融合タンパクを発現
させるためには、PspAタンパクのトランケート型をコー
ド化したpspA遺伝子とコレラ毒素のB―サブユニットを
コード化したctxB遺伝子の遺伝子融合が効果的である。
融合タンパクを発現させた後、PspAとCTBを、希薄酸に
より、希薄酸に不安定であることが知られているので、
両タンパクの融合部位として設計されたアスパラギン―
プロリン配列の部位で相互に解裂させることができる。
のB―サブユニット（CTB）からなる融合タンパクを発現
させるためには、PspAタンパクのトランケート型をコー
ド化したpspA遺伝子とコレラ毒素のB―サブユニットを
コード化したctxB遺伝子の遺伝子融合が効果的である。
融合タンパクを発現させた後、PspAとCTBを、希薄酸に
より、希薄酸に不安定であることが知られているので、
両タンパクの融合部位として設計されたアスパラギン―
プロリン配列の部位で相互に解裂させることができる。
【００３７】CTBは、モノシンロガングリオシド（GM1)
に対する特異性が高いことが知られている。したがって
融合PspA―CTBタンパクは、GM1アフィニティーカラムに
吸着させ、低pHで融合タンパクを溶出させることによ
り、培地から単離することができる。
に対する特異性が高いことが知られている。したがって
融合PspA―CTBタンパクは、GM1アフィニティーカラムに
吸着させ、低pHで融合タンパクを溶出させることによ
り、培地から単離することができる。
【００３８】PspA―CTB融合タンパクは、固相の特異的
抗体吸着体検定に極めて有用である。融合タンパクを使
用することにより、あらかじめPspAフラグメントを単離
することなく、マイクロ滴定板等の固体担体をPspAフラ
グメントでコートすることができる。これは、融合タン
パクを含む細菌抽出をGM1でコートしたプレートに添加
することにより行うことができる。次いで、PspA―CTB
融合タンパクを、CTB部分でGM1に結合させることによ
り、固体担体をPspAでコートする。次いで、得られたコ
ート産物を固相特異的抗体吸着体検定に利用し、試験試
料中のPspA抗体または抗原を検出することができる。こ
のような特異的抗体吸着体検定は、本発明の別の側面を
構成する。
抗体吸着体検定に極めて有用である。融合タンパクを使
用することにより、あらかじめPspAフラグメントを単離
することなく、マイクロ滴定板等の固体担体をPspAフラ
グメントでコートすることができる。これは、融合タン
パクを含む細菌抽出をGM1でコートしたプレートに添加
することにより行うことができる。次いで、PspA―CTB
融合タンパクを、CTB部分でGM1に結合させることによ
り、固体担体をPspAでコートする。次いで、得られたコ
ート産物を固相特異的抗体吸着体検定に利用し、試験試
料中のPspA抗体または抗原を検出することができる。こ
のような特異的抗体吸着体検定は、本発明の別の側面を
構成する。
【００３９】また、プロリン・リッチ領域、繰り返し領
域またはPspAのC―終点を含むPspA付加／アンカー領域
は、肺炎球菌、または機能的に付加／アンカー領域を有
するその他のグラム陽性またはグラム陰性細菌に非相同
タンパクを発現させるために使用することができる。
域またはPspAのC―終点を含むPspA付加／アンカー領域
は、肺炎球菌、または機能的に付加／アンカー領域を有
するその他のグラム陽性またはグラム陰性細菌に非相同
タンパクを発現させるために使用することができる。
【００４０】一般に、発現は、グラム陽性細菌の場合は
細菌の膜、細胞壁、または細胞表面に行い、グラム陰性
細菌の場合には周縁細胞質内に行う。このような非相同
タンパク例は、コレラ毒素のB―サブユニットである。
細菌の膜、細胞壁、または細胞表面に行い、グラム陰性
細菌の場合には周縁細胞質内に行う。このような非相同
タンパク例は、コレラ毒素のB―サブユニットである。
【００４１】上記のように、ここで得られたPspAのトラ
ンケート型はタンパクの免疫防御エピトープを含むた
め、肺炎球菌の感染に対するワクチンとして有用であ
る。したがって、本発明のさらに別の側面は、免疫学的
活性成分として、ここで提供された精製免疫防御性肺炎
球菌表面タンパクからなる肺炎球菌の感染に対するワク
チンを提供するものである。PspAタンパクは、各種の感
染症に有効な混合ワクチンとしても使用することができ
る。
ンケート型はタンパクの免疫防御エピトープを含むた
め、肺炎球菌の感染に対するワクチンとして有用であ
る。したがって、本発明のさらに別の側面は、免疫学的
活性成分として、ここで提供された精製免疫防御性肺炎
球菌表面タンパクからなる肺炎球菌の感染に対するワク
チンを提供するものである。PspAタンパクは、各種の感
染症に有効な混合ワクチンとしても使用することができ
る。
【００４２】さらに、トランケート状可溶性PspAタンパ
クをコード化したpspA遺伝子を発現するように形質変換
されたグラム陽性細菌は、弱毒化ワクチンまたは死菌ワ
クチンの形で、肺炎球菌感染に対するワクチンの免疫活
性成分として利用することができる。形質変換細菌にお
いては、このようなpspA遺伝子を、別のタンパクをコー
ド化した遺伝子に融合させることができる。したがっ
て、本発明の別の側面は、免疫活性成分として、PspAの
トランケート型をコード化した遺伝子を含む弱毒化また
は死菌ワクチンからなる肺炎球菌感染に対するワクチン
を提供するものである。
クをコード化したpspA遺伝子を発現するように形質変換
されたグラム陽性細菌は、弱毒化ワクチンまたは死菌ワ
クチンの形で、肺炎球菌感染に対するワクチンの免疫活
性成分として利用することができる。形質変換細菌にお
いては、このようなpspA遺伝子を、別のタンパクをコー
ド化した遺伝子に融合させることができる。したがっ
て、本発明の別の側面は、免疫活性成分として、PspAの
トランケート型をコード化した遺伝子を含む弱毒化また
は死菌ワクチンからなる肺炎球菌感染に対するワクチン
を提供するものである。
【００４３】また、PspAのトランケート型は、各種の多
糖類等の通常弱免疫性または非免疫性防御を誘導する分
子を共役させ、免疫活性を増強するために使用すること
ができる。したがって、本発明の別の側面は、免疫活性
成分として精製免疫防御性肺炎球菌表面タンパクと、通
常弱免疫性または非免疫性防御誘導分子の共役体からな
るワクチンを提供するものである。
糖類等の通常弱免疫性または非免疫性防御を誘導する分
子を共役させ、免疫活性を増強するために使用すること
ができる。したがって、本発明の別の側面は、免疫活性
成分として精製免疫防御性肺炎球菌表面タンパクと、通
常弱免疫性または非免疫性防御誘導分子の共役体からな
るワクチンを提供するものである。
【００４４】pspAの保存配列、特に遺伝子のプロリン・
リッチまたは反復領域の配列は、組織、体液または分泌
物中の肺炎球菌DNAを検出することにより、肺炎球菌の
各種の系統の有無を検出するプローブとして利用するこ
とができる。同様に、pspA遺伝子の一部は、肺炎球菌感
染の検出用診断キットに利用することができる。
リッチまたは反復領域の配列は、組織、体液または分泌
物中の肺炎球菌DNAを検出することにより、肺炎球菌の
各種の系統の有無を検出するプローブとして利用するこ
とができる。同様に、pspA遺伝子の一部は、肺炎球菌感
染の検出用診断キットに利用することができる。
【００４５】さらに、pspAの保存配列、特にプロリン・
リッチまたは反復領域の配列に基づいて作製したプライ
マーは、肺炎球菌DNAの増幅を利用して、組織、体液ま
たは分泌物中の肺炎球菌の有無の検定に使用することが
できる。この場合、ポリメラーゼ・チェイン反応（PC
R）を利用して、S. pneumoniaeのpspA遺伝子のヌクレオ
チド配列に由来する単一プライマー対をS. pneumoniae
の選択的検出に利用することができる。
リッチまたは反復領域の配列に基づいて作製したプライ
マーは、肺炎球菌DNAの増幅を利用して、組織、体液ま
たは分泌物中の肺炎球菌の有無の検定に使用することが
できる。この場合、ポリメラーゼ・チェイン反応（PC
R）を利用して、S. pneumoniaeのpspA遺伝子のヌクレオ
チド配列に由来する単一プライマー対をS. pneumoniae
の選択的検出に利用することができる。
【００４６】特異的増幅は、S. pneumoniaeのＲＸ１株
からの６７８塩基対DNAフラグメントで達成された。３
０サイクル増幅させた後、アガロースゲル電気泳動でア
ンプライマーを検出することができる。試験した３２株
のS. pneumoniae全てで、フラグメントの満足のいく増
幅が得られた。PCR DNA増幅は、推定２０フィコグラム
以下の肺炎球菌総ゲノムDNAを検出することができた。
からの６７８塩基対DNAフラグメントで達成された。３
０サイクル増幅させた後、アガロースゲル電気泳動でア
ンプライマーを検出することができる。試験した３２株
のS. pneumoniae全てで、フラグメントの満足のいく増
幅が得られた。PCR DNA増幅は、推定２０フィコグラム
以下の肺炎球菌総ゲノムDNAを検出することができた。
【００４７】以下のヌクレオチド配列を有するプライマ
ーLSM1及びLSM2が、pspAからの６７８塩基対産物をヌク
レオチド１３１２からＲＸ1 pspA配列の１９９０に増幅
した（図３）。LSM１ ５’―CCGGATCCAGCTCCTGCACCAAAAC―３’LSM２ ５’―GCGCTGCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG―３’ ここに記載したプライマーを用いたPCR分析は、文献に
記載されている従来のPCR法、例えばArnhemら、C&EN Sp
ecial Report, 36、１９９０年１０月１日にしたがって
行った。検出のため、プライマーを標識するか、標識し
たヌクレオチドトリホスフェートをPCR反応に添加し、P
CR増幅生成物を標識してもよい。
ーLSM1及びLSM2が、pspAからの６７８塩基対産物をヌク
レオチド１３１２からＲＸ1 pspA配列の１９９０に増幅
した（図３）。LSM１ ５’―CCGGATCCAGCTCCTGCACCAAAAC―３’LSM２ ５’―GCGCTGCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG―３’ ここに記載したプライマーを用いたPCR分析は、文献に
記載されている従来のPCR法、例えばArnhemら、C&EN Sp
ecial Report, 36、１９９０年１０月１日にしたがって
行った。検出のため、プライマーを標識するか、標識し
たヌクレオチドトリホスフェートをPCR反応に添加し、P
CR増幅生成物を標識してもよい。
【００４８】PCRプライマーは、従来の方法、例えばオ
リゴヌクレオチド合成または適当な制限酵素を用いて大
きなヌクレオチド配列のフラグメント化によって調製す
ることができる。
リゴヌクレオチド合成または適当な制限酵素を用いて大
きなヌクレオチド配列のフラグメント化によって調製す
ることができる。
【００４９】多数のS. pneumoniae 株を単一のプライマ
ーで検出することができるので、病気の原因となる菌株
には関係なく、人間を含め哺乳動物における肺炎球菌感
染の診断に使用できる普遍的なPCR検出キットを提供す
ることができる。（菌株、プラスミッド及びプローブ）
以下の実施例ならびに添付図面では、ある種のプラスミ
ッド及びこれらのプラスミッドならびにベクターDNAセ
グメントで形質変換を行った細菌株を参考例として含め
た。これらのうち、いくつかのものはATCCに寄託されて
いるが、ここでは全てを完全に記載した。以下の表１は
これらの材料の要約である。
ーで検出することができるので、病気の原因となる菌株
には関係なく、人間を含め哺乳動物における肺炎球菌感
染の診断に使用できる普遍的なPCR検出キットを提供す
ることができる。（菌株、プラスミッド及びプローブ）
以下の実施例ならびに添付図面では、ある種のプラスミ
ッド及びこれらのプラスミッドならびにベクターDNAセ
グメントで形質変換を行った細菌株を参考例として含め
た。これらのうち、いくつかのものはATCCに寄託されて
いるが、ここでは全てを完全に記載した。以下の表１は
これらの材料の要約である。
【００５０】
【表１】
【００５１】
【実施例】実施例１ この実施例ではS. pneumoniae 新種の成長及び調製法を
示す。
示す。
【００５２】S. pneumoniae 株のＲＸ１（これはカプセ
ル２型株D３９（国立標準株保存期間、ロンドン、NCTC
#7455）の非カプセル型誘導型であるが）をマクダニエ
ル等III、１９８７年、クレイン等１９９０年、タルキ
ングトン等１９９１年により示されているようにPspAの
１０ヶの異なるクローン化フラグメントと共にinsertio
nal不活性化処理をした（第４図参照）。
ル２型株D３９（国立標準株保存期間、ロンドン、NCTC
#7455）の非カプセル型誘導型であるが）をマクダニエ
ル等III、１９８７年、クレイン等１９９０年、タルキ
ングトン等１９９１年により示されているようにPspAの
１０ヶの異なるクローン化フラグメントと共にinsertio
nal不活性化処理をした（第４図参照）。
【００５３】これらのフラグメントは全てクローン化さ
れたE. coli JY株４３１３株（ATCCにアクセス番号６
８５２９で１９９１年１月３１日に寄託されている。）
のプラスミドPspA DNAを制限酵素で消化して得られたも
のである。
れたE. coli JY株４３１３株（ATCCにアクセス番号６
８５２９で１９９１年１月３１日に寄託されている。）
のプラスミドPspA DNAを制限酵素で消化して得られたも
のである。
【００５４】このinsertional重複突然変異（第４図参
照）はクローン化断片の３’端末近くで遺伝子発現を終
結させる。
照）はクローン化断片の３’端末近くで遺伝子発現を終
結させる。
【００５５】結果物の一株、JY２００８、（ATCCに５５
１４３番として１９９１年１月２４日寄託した）は、pK
SD３００とコードされた（１９８７年マクダニエル等II
I）DNAの断片から導かれたものであり、２７kDa（見か
け上の分子量は４３kDa）のPspA断片をつくる。この断
片は生来の蛋白質（見かけ上の分子量は８４kDa）のお
およそ、４０％の大きさで、６４kDaである。
１４３番として１９９１年１月２４日寄託した）は、pK
SD３００とコードされた（１９８７年マクダニエル等II
I）DNAの断片から導かれたものであり、２７kDa（見か
け上の分子量は４３kDa）のPspA断片をつくる。この断
片は生来の蛋白質（見かけ上の分子量は８４kDa）のお
およそ、４０％の大きさで、６４kDaである。
【００５６】予想された分子サイズは、アミノ酸配列に
デデュースしたものに基づくものであり、見かけの分子
サイズはSDS―PAGE電気泳動に基づくものである。これ
らのサイズの違いはPspA断片のコンフォーメーションに
基づく。
デデュースしたものに基づくものであり、見かけの分子
サイズはSDS―PAGE電気泳動に基づくものである。これ
らのサイズの違いはPspA断片のコンフォーメーションに
基づく。
【００５７】プロリン及び反復／アンカー領域（図１参
照）を切除した。得られたタンパクは、これらの領域を
欠失するため、細胞に付着することができない。次い
で、下記のごとく、未付着タンパクを培養液上清から単
離した。
照）を切除した。得られたタンパクは、これらの領域を
欠失するため、細胞に付着することができない。次い
で、下記のごとく、未付着タンパクを培養液上清から単
離した。
【００５８】PspA遺伝子中の異なる点に挿入を行うこと
により、図７に示すように、長さの異なるトランケート
状の非吸着性PspAタンパク誘導体が得られる。肺炎球菌
JY２００８株は、０.１０％の塩化コリン、０.０７５％
のL―システインHCl及び、０.２５％NaHCO3を添加した
６１の化学的制限培地（Infect.、Immun、２７：４４４
参照）中で培養した。
により、図７に示すように、長さの異なるトランケート
状の非吸着性PspAタンパク誘導体が得られる。肺炎球菌
JY２００８株は、０.１０％の塩化コリン、０.０７５％
のL―システインHCl及び、０.２５％NaHCO3を添加した
６１の化学的制限培地（Infect.、Immun、２７：４４４
参照）中で培養した。
【００５９】JY２００８の増殖中期の培養液上清を０.
２２μの横型メンブランフィルターで濾過し、６０倍に
濃縮した。
２２μの横型メンブランフィルターで濾過し、６０倍に
濃縮した。
【００６０】非修飾D３９株にpkSD300プラスミッドを導
入すると、同様に４３kDのトランケート状PspAタンパク
が得られた。S. pneumoniae ３型WU２株（PspAタンパク
約９２kD）にpkSD３００プラスミットを導入すると、細
菌が増殖するにつれ、分子量約４６kDの非吸着性のトラ
ンケート状PspAタンパクが得られた。実施例２ 本実施例はPspAの精製を説明するものである。
入すると、同様に４３kDのトランケート状PspAタンパク
が得られた。S. pneumoniae ３型WU２株（PspAタンパク
約９２kD）にpkSD３００プラスミットを導入すると、細
菌が増殖するにつれ、分子量約４６kDの非吸着性のトラ
ンケート状PspAタンパクが得られた。実施例２ 本実施例はPspAの精製を説明するものである。
【００６１】実施例１の記載にしたがって製造した培養
液上清濃縮物を、０.１M PBS、ｐＨ７.２で洗浄し、１
９６,０００×gで超遠心を行った。上清を２０mMのL―
ヒスチジン緩衝液―NaClで１：５に稀釈し、pHを６.０
に調整し、DEAE―Isonet D2イオン交換カラムに注入し
た。
液上清濃縮物を、０.１M PBS、ｐＨ７.２で洗浄し、１
９６,０００×gで超遠心を行った。上清を２０mMのL―
ヒスチジン緩衝液―NaClで１：５に稀釈し、pHを６.０
に調整し、DEAE―Isonet D2イオン交換カラムに注入し
た。
【００６２】８０mMから２Mまでの段階的NaClグラジェ
ントでカラムを溶出し、PspAを含むフラクション（イオ
ン強度０.３２〜０.６４M）を集め、SDAポリアクリルア
ミドゲル上で分離した。ゲルの代表的切片上のタンパク
をコマシェブル―R―２５０で染色してPspAを同定し
た。残りのSDSゲルからPspAを含む画分を切り取り、ゲ
ルから電気溶出した。溶出したタンパクはメタノール：
アセトン（５０：５０）溶媒中で沈澱させ、再度PBSに
懸濁させた。製品の純度は、銀染色及びmAb Xil２６を
用いたウェスタンブロット（IgG, 2b, k, McDanielら、
前記参照）で確認した。実施例３ 本実施例は、Escherichia coliの周縁細胞質空間からの
PspAの単離を説明するものである。
ントでカラムを溶出し、PspAを含むフラクション（イオ
ン強度０.３２〜０.６４M）を集め、SDAポリアクリルア
ミドゲル上で分離した。ゲルの代表的切片上のタンパク
をコマシェブル―R―２５０で染色してPspAを同定し
た。残りのSDSゲルからPspAを含む画分を切り取り、ゲ
ルから電気溶出した。溶出したタンパクはメタノール：
アセトン（５０：５０）溶媒中で沈澱させ、再度PBSに
懸濁させた。製品の純度は、銀染色及びmAb Xil２６を
用いたウェスタンブロット（IgG, 2b, k, McDanielら、
前記参照）で確認した。実施例３ 本実施例は、Escherichia coliの周縁細胞質空間からの
PspAの単離を説明するものである。
【００６３】E. coliの周縁細胞質空間からの単離は、
標準的手法を用いて行った。E. coliJY４３０６ 株（本
株はPspAの４３kDa N―末端フラグメントを生産し、そ
のアミノ酸配列は図３に示す。本株は１９９１年１月３
１日にATCCに寄託した。寄託番号６８５２２）を緩衝生
理食塩水で洗い、２０％蔗糖、１０mM EDTA及び２５mM
トリス（pH7.７）を用いて０℃で１０分間インキュベー
ションした。次いで細胞を０℃、４００×gで１０分間
遠心分離した。上清を捨て、ペレットを直ちに約１００
倍量の水（４℃）に懸濁した。１０分後に４℃、４,０
００×gで１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、Psp
Aを含む上清を保存した。上清の濃縮は、固体蔗糖を用
いた濃縮または限外濾過等の標準的手法で行った。E. c
oliから単離したタンパクの精製は、肺炎球菌の培養液
から４３kDa（トランケート状）PspAを単離する場合に
用いたと同じクロマトグラフィー法で行った。実施例４ 本実施例は、PspAタンパクの免疫特性を説明するもので
ある。Xid突然変異遺伝子を有するCBA／N系マウス（７
週齢）（Jackson Laboratories, Bar Harber,ME）１６
匹の眼窩静脈洞から採血し、免疫投与前のPspA抗体レベ
ルを測定した。実施例２に記載したように調製した精製
PspAをフロイントの完全アジュバントで乳化させ、マウ
スあたり約５μgのタンパクを鼠径腋窩部に皮下注射し
た。さらに１４日後、実施例２に記載したように調製し
たPspAを５μg皮内注射した。対照群のマウスには、殺
菌SDS緩衝液を同様に免疫投与した。最後の免疫投与か
ら７日後に、全動物の眼窩静脈洞から採血した後、実施
例１に記載したように培養した３００CFUの３型WU２株
を静脈内に抗原投与した。
標準的手法を用いて行った。E. coliJY４３０６ 株（本
株はPspAの４３kDa N―末端フラグメントを生産し、そ
のアミノ酸配列は図３に示す。本株は１９９１年１月３
１日にATCCに寄託した。寄託番号６８５２２）を緩衝生
理食塩水で洗い、２０％蔗糖、１０mM EDTA及び２５mM
トリス（pH7.７）を用いて０℃で１０分間インキュベー
ションした。次いで細胞を０℃、４００×gで１０分間
遠心分離した。上清を捨て、ペレットを直ちに約１００
倍量の水（４℃）に懸濁した。１０分後に４℃、４,０
００×gで１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、Psp
Aを含む上清を保存した。上清の濃縮は、固体蔗糖を用
いた濃縮または限外濾過等の標準的手法で行った。E. c
oliから単離したタンパクの精製は、肺炎球菌の培養液
から４３kDa（トランケート状）PspAを単離する場合に
用いたと同じクロマトグラフィー法で行った。実施例４ 本実施例は、PspAタンパクの免疫特性を説明するもので
ある。Xid突然変異遺伝子を有するCBA／N系マウス（７
週齢）（Jackson Laboratories, Bar Harber,ME）１６
匹の眼窩静脈洞から採血し、免疫投与前のPspA抗体レベ
ルを測定した。実施例２に記載したように調製した精製
PspAをフロイントの完全アジュバントで乳化させ、マウ
スあたり約５μgのタンパクを鼠径腋窩部に皮下注射し
た。さらに１４日後、実施例２に記載したように調製し
たPspAを５μg皮内注射した。対照群のマウスには、殺
菌SDS緩衝液を同様に免疫投与した。最後の免疫投与か
ら７日後に、全動物の眼窩静脈洞から採血した後、実施
例１に記載したように培養した３００CFUの３型WU２株
を静脈内に抗原投与した。
【００６４】免疫投与前及び抗原投与前の血清をウェス
タンプロット法で分析してトランケート状タンパクに対
する免疫反応のベースラインを求めた。WU２株のPspAは
電気泳動を行った後、ニトロセルロースメンブランに移
した。このメンブランを帯状に切り、１：５０に希釈し
た所定のマウス抗血清で２時間プローブし、ビオチン添
加ヤギ抗マウス免疫グロブリンで１時間インキュベーシ
ョンし、ストレパビジン共役ホスファターゼで洗浄し、
インキュベーションした。０.０１％の５―ブロモ―４
―クロロ―３―インドイルホスフェートトルイジン塩を
メンブランに噴霧シ、テトラゾリウムの青色を発色させ
た。
タンプロット法で分析してトランケート状タンパクに対
する免疫反応のベースラインを求めた。WU２株のPspAは
電気泳動を行った後、ニトロセルロースメンブランに移
した。このメンブランを帯状に切り、１：５０に希釈し
た所定のマウス抗血清で２時間プローブし、ビオチン添
加ヤギ抗マウス免疫グロブリンで１時間インキュベーシ
ョンし、ストレパビジン共役ホスファターゼで洗浄し、
インキュベーションした。０.０１％の５―ブロモ―４
―クロロ―３―インドイルホスフェートトルイジン塩を
メンブランに噴霧シ、テトラゾリウムの青色を発色させ
た。
【００６５】精製PspAフラグメントを免疫投与した８匹
のCBA／Nマウスは、WU２株を抗原投与１４日後でも全て
生残し、発病症状は全く認められなかった。対照の緩衝
液を免疫投与したマウスでは、抗原投与２日後に８匹中
６匹が死亡し、残りの２匹は抗原投与２〜３日後に、毛
が波打ち、背を丸め、活動が減少し、重度の発病が認め
られたが、生残した。x2解析で、免疫投与群と対照投与
群の間の生存率に有意差（P＜０.００３）が認められ
た。
のCBA／Nマウスは、WU２株を抗原投与１４日後でも全て
生残し、発病症状は全く認められなかった。対照の緩衝
液を免疫投与したマウスでは、抗原投与２日後に８匹中
６匹が死亡し、残りの２匹は抗原投与２〜３日後に、毛
が波打ち、背を丸め、活動が減少し、重度の発病が認め
られたが、生残した。x2解析で、免疫投与群と対照投与
群の間の生存率に有意差（P＜０.００３）が認められ
た。
【００６６】免疫投与前及び抗原投与前の血清をウェス
タンプロット法で分析した。免疫投与前の血清からは、
トランケート状PspAに対する抗体は検出されなかった。
免疫投与後の血清からは、８匹中８匹でPspA抗体が検出
され、特に６匹では極めて強い抗PspA反応が認められ
た。抗原株WU２を抗血清でプローブすると、免疫投与し
たマウス全例で、WU２PspAエピトープと極めて高い交叉
反応を示す抗体が認められた。対照群のマウスではPspA
に対する抗体は検出されなかった。
タンプロット法で分析した。免疫投与前の血清からは、
トランケート状PspAに対する抗体は検出されなかった。
免疫投与後の血清からは、８匹中８匹でPspA抗体が検出
され、特に６匹では極めて強い抗PspA反応が認められ
た。抗原株WU２を抗血清でプローブすると、免疫投与し
たマウス全例で、WU２PspAエピトープと極めて高い交叉
反応を示す抗体が認められた。対照群のマウスではPspA
に対する抗体は検出されなかった。
【００６７】免疫データを表２に要約する。
【００６８】
【表２】
【００６９】表２のデータから明らかなように、精製Ps
pA分子５μgを２回免疫投与すると、CBA／Nマウスで致
命的な感染に対する防御が誘発され、抗原株のPspAに反
応する抗体が誘発された。実施例５ 本実施例はPspAタンパクの配列決定を説明するものであ
る。再結晶したSDSを含むゲルをレムリー緩衝液系（Nat
ure ２２７：６８０）で９％展開することによって、実
施例２に記載したように調製した精製PspAの電気泳動を
行った。１０％のメタノールを含む１０mMの３―（シク
ロヘキシルアミノ）―１―プロパンスルホン酸、pH１
１.０に１０分間２回ゲルを浸漬した。ポリビニリデン
ジフルオライドメンブラン（PVDF）を１００％メタノ
ールに数秒間浸漬して完全に湿らせた後、CAPS緩衝液で
１０分間洗った。０.５Aを１時間流し、CAPS緩衝液中の
PVDFメンブランにPspAを電気的に移した。移動後、メン
ブランを脱イオン水中で５分間、２回洗浄し、５０％メ
タノールに溶解した０.１％コマシ―青R―２５０で２０
分間染色した。PspAを含むメンブランを切り取り、４０
％メタノール及び１０％酢酸中で５分間脱色した。メン
ブランを細切りし、配列決定まで、殺菌したエペンドル
フ管に保存した。
pA分子５μgを２回免疫投与すると、CBA／Nマウスで致
命的な感染に対する防御が誘発され、抗原株のPspAに反
応する抗体が誘発された。実施例５ 本実施例はPspAタンパクの配列決定を説明するものであ
る。再結晶したSDSを含むゲルをレムリー緩衝液系（Nat
ure ２２７：６８０）で９％展開することによって、実
施例２に記載したように調製した精製PspAの電気泳動を
行った。１０％のメタノールを含む１０mMの３―（シク
ロヘキシルアミノ）―１―プロパンスルホン酸、pH１
１.０に１０分間２回ゲルを浸漬した。ポリビニリデン
ジフルオライドメンブラン（PVDF）を１００％メタノ
ールに数秒間浸漬して完全に湿らせた後、CAPS緩衝液で
１０分間洗った。０.５Aを１時間流し、CAPS緩衝液中の
PVDFメンブランにPspAを電気的に移した。移動後、メン
ブランを脱イオン水中で５分間、２回洗浄し、５０％メ
タノールに溶解した０.１％コマシ―青R―２５０で２０
分間染色した。PspAを含むメンブランを切り取り、４０
％メタノール及び１０％酢酸中で５分間脱色した。メン
ブランを細切りし、配列決定まで、殺菌したエペンドル
フ管に保存した。
【００７０】単離したPspAは、PVDFメンブランから直接
配列決定を行った。図２はN―末端４５残基アミノ酸配
列を示し、図５はα―螺旋状領域全体のアミノ酸配列を
示す。 pspA遺伝子全体のDNA配列及びPspAタンパクの推
定アミノ酸配列は図３に示す。実施例６ 本実施例は、S. pneumoniae及びE. coliから発現または
排泄／分泌される非相同タンパクの発現及びリーダー配
列として、pspA５’―配列またはPspA N―末端領域の利
用を説明するものである。本実施例では、遺伝子融合に
よりコレラ毒素B―サブユニット（CTB）に融合させたPs
pAタンパクのN―末端の発現、肺炎球菌からの融合タン
パクの排泄及びそのE. coli周縁細胞室空間中への分泌
について記載する。
配列決定を行った。図２はN―末端４５残基アミノ酸配
列を示し、図５はα―螺旋状領域全体のアミノ酸配列を
示す。 pspA遺伝子全体のDNA配列及びPspAタンパクの推
定アミノ酸配列は図３に示す。実施例６ 本実施例は、S. pneumoniae及びE. coliから発現または
排泄／分泌される非相同タンパクの発現及びリーダー配
列として、pspA５’―配列またはPspA N―末端領域の利
用を説明するものである。本実施例では、遺伝子融合に
よりコレラ毒素B―サブユニット（CTB）に融合させたPs
pAタンパクのN―末端の発現、肺炎球菌からの融合タン
パクの排泄及びそのE. coli周縁細胞室空間中への分泌
について記載する。
【００７１】CTB及びPspAの半分のN―末端からなる融合
タンパクはE. coli 中に構成し、発現させた。用いたHi
nd III／DraI pspA遺伝子フラグメントは、pspA複写及
び翻訳開始シグナル及び細胞膜に移行させるためのPspA
シグナルペプチドリーダー配列の全てを含んでいる。こ
のフラグメントによりコード化された成熟PspAは、α―
螺旋状高次コイルドメインの９０％以上からなる２９kD
a（実測分子量４２kDa）の産物であると推定される。用
いたCTBフラグメントは、複写及び翻訳開始シグナルを
欠失している。PspAを介してpspAプロモーターから発現
させ、CTBをコード化した遺伝子ctxBにフレーム内翻訳
解読させることにより、上流PspA産物に融合させた１２
kDaのCTB産物が得られた。PspA―CTB融合タンパクは、
E. coliの高及び低複写数プラスミッド（pUC１８では１
００複写／細胞以上、pJY４１６３では１５〜３０複写
／細胞）安定的に発現された。
タンパクはE. coli 中に構成し、発現させた。用いたHi
nd III／DraI pspA遺伝子フラグメントは、pspA複写及
び翻訳開始シグナル及び細胞膜に移行させるためのPspA
シグナルペプチドリーダー配列の全てを含んでいる。こ
のフラグメントによりコード化された成熟PspAは、α―
螺旋状高次コイルドメインの９０％以上からなる２９kD
a（実測分子量４２kDa）の産物であると推定される。用
いたCTBフラグメントは、複写及び翻訳開始シグナルを
欠失している。PspAを介してpspAプロモーターから発現
させ、CTBをコード化した遺伝子ctxBにフレーム内翻訳
解読させることにより、上流PspA産物に融合させた１２
kDaのCTB産物が得られた。PspA―CTB融合タンパクは、
E. coliの高及び低複写数プラスミッド（pUC１８では１
００複写／細胞以上、pJY４１６３では１５〜３０複写
／細胞）安定的に発現された。
【００７２】融合産物は期待した分子量（約５４kDa）
を有し、抗体と反応してPspAとCTBを生成した。CTB産物
がその機能を保有していることは、CTBの特性であるガ
ングリオシドGM1に対する融合タンパクの結合能力によ
って確認することができた。
を有し、抗体と反応してPspAとCTBを生成した。CTB産物
がその機能を保有していることは、CTBの特性であるガ
ングリオシドGM1に対する融合タンパクの結合能力によ
って確認することができた。
【００７３】融合産物の発現レベルが高くなると、タン
パクの周縁細胞質への完全な移行を阻害するプロセシン
グまたは立体配産変化の割合が明らかに減少した。しか
し、複写数が少ない構成では、融合タンパクの約６０％
が周縁細胞質中に局在し、多量のタンパクが浸透圧衝撃
でE. coliから容易に放出される。
パクの周縁細胞質への完全な移行を阻害するプロセシン
グまたは立体配産変化の割合が明らかに減少した。しか
し、複写数が少ない構成では、融合タンパクの約６０％
が周縁細胞質中に局在し、多量のタンパクが浸透圧衝撃
でE. coliから容易に放出される。
【００７４】E. coli における発現に加えて、融合タン
パクは無毒生のS. pneumoniae ＲＸ１中に低複写数構成
が形質転換され、挿入複製変異株としてS. pneumoniae
に発現される。このようにして、融合タンパクをコード
化した遺伝子は、S. pneumoniae の染色体中に取り込ま
れ、その染色体により安定的に発現される。実施例１の
場合はトランケートPspA分子が付加／アンカー領域を欠
いているが、この場合にはPspA―CTB融合タンパクとし
て培養液上清中に分泌された。融合タンパク産物は期待
通りの分子量（５４kDa）を有し、抗体と反応してPsp
A、CTB及び結合GM 1を生成した。実施例７ 本実施例は、特に肺炎球菌の表面に発現されたPspA―CT
B（コレラ毒素Bサブユニット）の発現において機能的な
付加／アンカー配列を有するS. pneumoniaeまたはその
他の細菌の表面に非相同タンパクを発現させるPspA付加
またはアンカー領域の使用について説明するものであ
る。
パクは無毒生のS. pneumoniae ＲＸ１中に低複写数構成
が形質転換され、挿入複製変異株としてS. pneumoniae
に発現される。このようにして、融合タンパクをコード
化した遺伝子は、S. pneumoniae の染色体中に取り込ま
れ、その染色体により安定的に発現される。実施例１の
場合はトランケートPspA分子が付加／アンカー領域を欠
いているが、この場合にはPspA―CTB融合タンパクとし
て培養液上清中に分泌された。融合タンパク産物は期待
通りの分子量（５４kDa）を有し、抗体と反応してPsp
A、CTB及び結合GM 1を生成した。実施例７ 本実施例は、特に肺炎球菌の表面に発現されたPspA―CT
B（コレラ毒素Bサブユニット）の発現において機能的な
付加／アンカー配列を有するS. pneumoniaeまたはその
他の細菌の表面に非相同タンパクを発現させるPspA付加
またはアンカー領域の使用について説明するものであ
る。
【００７５】N―末端をコード化しているPspAの領域
は、その複写及び翻訳開始シグナル及びそのシグナルペ
プチドリーダー配列を含み、翻訳されたフレーム内遺伝
子融合を介して、複写及び翻訳開始及び終了シグナルを
欠失するCTBコード化ctxBフラグメントに結合してい
る。この配列は、フレーム内でPspA付加／アンカードメ
インに続き、プロリンの反復及びC―末端ドメインの一
部または全てを含んでいる。得られる融合タンパクはPs
pAリーダー配列を介して細胞外に指向し、膜を通して移
行することにより清浄化され、PspA付加／アンカー配列
によって細胞に付加される。２つのPspAフラグメントの
間に位置する非相同タンパクは、膜の外側の表面、S. p
neumoniaeの場合には細胞表面上に発現される。実施例８ 本実施例は、Mycobcterium tuberculosis のBacille Ca
lmette-Guerin (BCG)株によるトランケート状の完全な
長さを有するPspAの発現を説明するものである。
は、その複写及び翻訳開始シグナル及びそのシグナルペ
プチドリーダー配列を含み、翻訳されたフレーム内遺伝
子融合を介して、複写及び翻訳開始及び終了シグナルを
欠失するCTBコード化ctxBフラグメントに結合してい
る。この配列は、フレーム内でPspA付加／アンカードメ
インに続き、プロリンの反復及びC―末端ドメインの一
部または全てを含んでいる。得られる融合タンパクはPs
pAリーダー配列を介して細胞外に指向し、膜を通して移
行することにより清浄化され、PspA付加／アンカー配列
によって細胞に付加される。２つのPspAフラグメントの
間に位置する非相同タンパクは、膜の外側の表面、S. p
neumoniaeの場合には細胞表面上に発現される。実施例８ 本実施例は、Mycobcterium tuberculosis のBacille Ca
lmette-Guerin (BCG)株によるトランケート状の完全な
長さを有するPspAの発現を説明するものである。
【００７６】BCGは、トランケート状PspAタンパクをコ
ード化するpspA遺伝子に取り込まれるように染色体を修
飾した。４３kDaのトランケート状pspAタンパクは、修
飾BCGから総BCGタンパクの約１５％に発現させた。その
結果、５’―分泌シグナルを欠く４３kDa領域をコード
化したpspA遺伝子セグメントを有する発現ベクター構成
が得られた。発現は、pspA またはミコバクテリアシグ
ナル配列を含めてもBCGタンパクの約１％にすぎなかっ
た。いずれの場合にも、発現されたPspAのほとんど大部
分は培地中に分泌された。ミコバクテリアのリポタンパ
クシグナル配列と融合した４３kDa PspAタンパクを発現
させると、BCGのメンブラン画分中に組換えpspAの発現
が得られた。
ード化するpspA遺伝子に取り込まれるように染色体を修
飾した。４３kDaのトランケート状pspAタンパクは、修
飾BCGから総BCGタンパクの約１５％に発現させた。その
結果、５’―分泌シグナルを欠く４３kDa領域をコード
化したpspA遺伝子セグメントを有する発現ベクター構成
が得られた。発現は、pspA またはミコバクテリアシグ
ナル配列を含めてもBCGタンパクの約１％にすぎなかっ
た。いずれの場合にも、発現されたPspAのほとんど大部
分は培地中に分泌された。ミコバクテリアのリポタンパ
クシグナル配列と融合した４３kDa PspAタンパクを発現
させると、BCGのメンブラン画分中に組換えpspAの発現
が得られた。
【００７７】この後者の結果は、リポタンパクシグナル
配列の融合により組換えPspAがアクリル化されることを
暗示している。フルオロクロム共役単一クローンPspA抗
体を用いたフルオレセント活性化細胞ソートを行い、こ
れらのバクテリアの表面にPspAが発現されていることを
実証した。実施例９ 本実施例は、肺炎球菌の各種系統間でpspA遺伝子の一部
が相同性を有し、そのため分子（DNA）的方法として、
組織、体液または分泌物中の肺炎球菌の検出及び患者か
ら採取した試料から培養した肺炎球菌の同定に利用でき
ることを説明するものである。
配列の融合により組換えPspAがアクリル化されることを
暗示している。フルオロクロム共役単一クローンPspA抗
体を用いたフルオレセント活性化細胞ソートを行い、こ
れらのバクテリアの表面にPspAが発現されていることを
実証した。実施例９ 本実施例は、肺炎球菌の各種系統間でpspA遺伝子の一部
が相同性を有し、そのため分子（DNA）的方法として、
組織、体液または分泌物中の肺炎球菌の検出及び患者か
ら採取した試料から培養した肺炎球菌の同定に利用でき
ることを説明するものである。
【００７８】３種類のDNAプローブ、すなわち完全な長
さのpspA、JY４３２３（N―末端HindIIIからC―末端Kpn
Iまで）、N―末端を含むpspAの半分、JY４３０６（N―
末端Hind IIIから９９６位のDraI（図３参照）まで）及
びプロリン及び反復領域の大部分、JY４２６２（１２２
１位のBcl Iから１８３２位のBstN Iまで）を用いた。
９５％同一性を要求するストリンジェント条件下で、プ
ローブJY４３２３及びJY４２６２を、サザーンブロット
法で分離した２００系統以上のS. pneumoniaeの細胞と
反応させた。
さのpspA、JY４３２３（N―末端HindIIIからC―末端Kpn
Iまで）、N―末端を含むpspAの半分、JY４３０６（N―
末端Hind IIIから９９６位のDraI（図３参照）まで）及
びプロリン及び反復領域の大部分、JY４２６２（１２２
１位のBcl Iから１８３２位のBstN Iまで）を用いた。
９５％同一性を要求するストリンジェント条件下で、プ
ローブJY４３２３及びJY４２６２を、サザーンブロット
法で分離した２００系統以上のS. pneumoniaeの細胞と
反応させた。
【００７９】染色体DNAをHind IIIで切断すると、一般
にこれらのプローブは、いずれも２つの明瞭なバンドを
検出することができ、各バンドの大きさは検査した系統
によって異なっていた。肺炎球菌ＲＸ１株の場合、各バ
ンドの大きさは４.０及び９.１kbであった。４.０kbの
バンドはpspAに相当し、PspA変異株では変性または欠失
していた。一方、、別のバンドはN―末端またはC―末端
を含むPspAの半分をコード化した領域とある程度の相同
性を有し、pspA突然変異によって影響を受けない。JY４
３２３及びJY４２６２は、その他のグラム陽性細菌、St
reptococcus pyogenes 及びグラム陰性細菌Salmonella
typhimurium とは反応しなかった。N―末端プローブのJ
Y４３０６は、検査した肺炎球菌の約１／３を識別する
ことができた。
にこれらのプローブは、いずれも２つの明瞭なバンドを
検出することができ、各バンドの大きさは検査した系統
によって異なっていた。肺炎球菌ＲＸ１株の場合、各バ
ンドの大きさは４.０及び９.１kbであった。４.０kbの
バンドはpspAに相当し、PspA変異株では変性または欠失
していた。一方、、別のバンドはN―末端またはC―末端
を含むPspAの半分をコード化した領域とある程度の相同
性を有し、pspA突然変異によって影響を受けない。JY４
３２３及びJY４２６２は、その他のグラム陽性細菌、St
reptococcus pyogenes 及びグラム陰性細菌Salmonella
typhimurium とは反応しなかった。N―末端プローブのJ
Y４３０６は、検査した肺炎球菌の約１／３を識別する
ことができた。
【００８０】これらの結果は、プロリン／反復領域に含
まれる配列は肺炎球菌の全ての系統で同じであり、その
他の細菌には存在しない。分子のN―末端を含む半分は
変化が大きいように思われる。実施例１０ 本実施例は、PspAのα―螺旋状N―末端領域におけるエ
ピトープの検出及びその位置の決定について説明するも
のである。
まれる配列は肺炎球菌の全ての系統で同じであり、その
他の細菌には存在しない。分子のN―末端を含む半分は
変化が大きいように思われる。実施例１０ 本実施例は、PspAのα―螺旋状N―末端領域におけるエ
ピトープの検出及びその位置の決定について説明するも
のである。
【００８１】図５、６及び７に＊印で表示したマウスモ
デルにおける肺炎球菌感染防御単一クローン抗体を用い
て、PspAのα―螺旋状のN―末端領域における各抗体の
エピトープの位置を決定した。その位置は、PspAのフラ
グメントにマップした。結果は図５〜７に示す。図５は
PspAのN―末端領域の推定アミノ配列及び単一クローン
抗体によって識別されるエピトープの一般的な位置を示
し、図６は各種のpspAを遺伝子セグメントによって生産
されるPspAフラグメントと抗体の反応性を示す。図７は
各種のpspA遺伝子セグメントによって生産されるPspAフ
ラグメントにおけるエピトープ地図を示す。
デルにおける肺炎球菌感染防御単一クローン抗体を用い
て、PspAのα―螺旋状のN―末端領域における各抗体の
エピトープの位置を決定した。その位置は、PspAのフラ
グメントにマップした。結果は図５〜７に示す。図５は
PspAのN―末端領域の推定アミノ配列及び単一クローン
抗体によって識別されるエピトープの一般的な位置を示
し、図６は各種のpspAを遺伝子セグメントによって生産
されるPspAフラグメントと抗体の反応性を示す。図７は
各種のpspA遺伝子セグメントによって生産されるPspAフ
ラグメントにおけるエピトープ地図を示す。
【００８２】図５の数字１３８、１９３及び２６１は、
単一クローン抗体Xi１５２６、Xi１２６、XiR３５、XiR
３８、XiR１２２４、XiR１６、Xi６４、XiR２７８、Xi
１３２５及びXi１３２３によって検出されたエピトープ
の位置をマップするために用いたPspAフラグメントにお
けるブレークポイントを示す。＊印に示したいくつかの
抗体は、肺炎球菌WU２株による致命的肺炎球菌感染を防
護することのできるものである。
単一クローン抗体Xi１５２６、Xi１２６、XiR３５、XiR
３８、XiR１２２４、XiR１６、Xi６４、XiR２７８、Xi
１３２５及びXi１３２３によって検出されたエピトープ
の位置をマップするために用いたPspAフラグメントにお
けるブレークポイントを示す。＊印に示したいくつかの
抗体は、肺炎球菌WU２株による致命的肺炎球菌感染を防
護することのできるものである。
【００８３】さらに、図の右側の垂直な線は、高コイル
α―螺旋構造を有すると予想される領域を示す。図の左
側は各抗体のエピトープの地図を示す。
α―螺旋構造を有すると予想される領域を示す。図の左
側は各抗体のエピトープの地図を示す。
【００８４】本開示を要約すると、本発明はPspAタンパ
クの防御エピトープを含むため免疫防御反応を誘発する
ことのできるトランケート状PspA分子に関する、本発明
の範囲内で改良が可能である。
クの防御エピトープを含むため免疫防御反応を誘発する
ことのできるトランケート状PspA分子に関する、本発明
の範囲内で改良が可能である。
【００８５】
【発明の効果】本発明によれば、肺炎球菌に対する免疫
防御のための防御エピトープを含むトランケート状のPs
pAを提供することができる。
防御のための防御エピトープを含むトランケート状のPs
pAを提供することができる。
【図１】成熟PspAのドメインを模式的に示したものであ
る。
る。
【図２】PspAのN―末端アミノ酸配列を示し、ここで太
い大文字は荷電した親水性アミノ酸を示し、小文字は非
極性の疎水性残基を示し、下線を引いた太い小文字は非
荷電の極性親水性残基を示す。
い大文字は荷電した親水性アミノ酸を示し、小文字は非
極性の疎水性残基を示し、下線を引いた太い小文字は非
荷電の極性親水性残基を示す。
【図３】PspAタンパクの推測アミノ酸配列を有するpspA
遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【図４】PspAタンパクの推測アミノ酸配列を有するpspA
遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【図５】PspAタンパクの推測アミノ酸配列を有するpspA
遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【図６】pspAの制限マップ（A）及びpspA遺伝子におけ
る突然変異株を構成するために挿入複製突然変異の利用
（B）を示す。
る突然変異株を構成するために挿入複製突然変異の利用
（B）を示す。
【図７】PspAのN―末端部位における推測アミノ酸配列
及び単一クローン性抗体により識別されるエピトープの
一般的位置を示す。
及び単一クローン性抗体により識別されるエピトープの
一般的位置を示す。
【図８】各種のpspA遺伝子セグメントにより生産された
PspAフラグメントと抗体との反応性を示す。
PspAフラグメントと抗体との反応性を示す。
【図９】各種のpspA遺伝子セグメントにより生産された
PspAフラグメントにおけるエピトープの地図上の位置を
示す。
PspAフラグメントにおけるエピトープの地図上の位置を
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ０７Ｋ 14/315 Ｃ０７Ｋ 14/315 14/35 14/35 Ｃ１２Ｒ 1:46） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 1:32） Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:46） Ｃ１２Ｒ 1:32） 1:32） (72)発明者 ヨーザー、 ジャネット、 エル. アメリカ合衆国 35242 アラバマ州 バ ーミンガム ハザーブロック ロード 2208 (72)発明者 マックダニエル、 ラリー、 エス. アメリカ合衆国 35210 アラバマ州 バ ーミンガム コルネル ドライヴ 5354
Claims (16)
- 【請求項１】 タンパクの免疫防御エピトープを含み、
機能的細胞膜アンカー領域を欠失し、かつ全ＰｓｐＡタ
ンパクの約９０％までに、トランケートされた肺炎球菌
表面タンパク（ＰｓｐＡ）から成る精製肺炎球菌表面タ
ンパク。 - 【請求項２】 全ＰｓｐＡタンパクの約５０％を含む
が、そこからは細胞膜アンカー領域、反復領域及びプロ
リン領域を欠失していることを特徴とする請求項1に記
載のタンパク。 - 【請求項３】 ＰｓｐＡタンパクの少なくともＮ−末端
の防御エピトープを含む領域から成ることを特徴とする
請求項１に記載のいタンパク。 - 【請求項４】 図１に示したドメインを有するＰｓｐＡ
タンパクの少なくともＮ−末端防御エピトープを含む領
域から成ることを特徴とする請求項１に記載のタンパ
ク。 - 【請求項５】 全ＰｓｐＡタンパクのＮ−末端α−螺旋
状コイル領域から成ることを特徴とする請求項１に記載
のタンパク。 - 【請求項６】 前記α−螺旋状コイル領域が７残基周期
性を有することを特徴とする請求項５に記載のタンパ
ク。 - 【請求項７】 ８４ｋＤ ＰｓｐＡタンパクの４３ｋＤ
（見かけ上の分子量）Ｎ−末端領域からなることを特徴
とする請求項１に記載のタンパク。 - 【請求項８】 タンパクの免疫防御エピトープを含み、
機能的細胞膜アンカー領域を欠失し、かつ全ＰｓｐＡタ
ンパクの約９０％までに、トランケートされたＰｓｐＡ
タンパクをコードする組換えＤＮＡ分子であって、前記
のＤＮＡ分子が、図３に規定した配列を含むコード化配
列を有するか、またはそれに実質的に相同な配列を有す
ることを特徴とする生物学的に純粋な組換えＤＮＡ分
子。 - 【請求項９】 全ＰｓｐＡタンパクの約５０％を含む
が、そこからは細胞膜アンカー領域、反復領域及びプロ
リン領域を欠失しているＰｓｐＡタンパクにトランケー
トされたＰｓｐＡタンパクをコード化する請求項８に記
載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１０】 翻訳されたフレーム内遺伝子融合によ
って、別のタンパクをコード化する遺伝子に結合してい
る請求項８に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１１】 前記の別のタンパクをコード化する遺
伝子がｃｔｘＢ遺伝子であることを特徴とする請求項１
０に記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１２】 免疫学的活性成分として請求項１に記
載のタンパクから成る肺炎球菌感染に対するワクチン。 - 【請求項１３】 前記のタンパクが、通常弱い免疫防御
を誘発するか、全く免疫防御を誘発しない分子と共役
（conjugate）していることを特徴とする請求項１２に
記載のワクチン。 - 【請求項１４】 免疫学的活性成分として請求項１に記
載のタンパクをコードする遺伝子を含む弱毒性または死
滅グラム陽性細菌から成る肺炎球菌感染に対するワクチ
ン。 - 【請求項１５】 前記のグラム陽性細菌がStreptococcu
s pneumoniaeであることを特徴とする請求項１４に記載
のワクチン。 - 【請求項１６】 前記のグラム陽性細菌がMycobacteriu
m tuberculosisであることを特徴とする請求項１４に記
載のワクチン。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JP8172110A Pending JPH09224680A (ja) | 1991-02-15 | 1996-07-02 | 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50675592A Expired - Fee Related JP3215109B2 (ja) | 1991-02-15 | 1992-02-12 | 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子 |
| JP8172110A Pending JPH09224680A (ja) | 1991-02-15 | 1996-07-02 | 肺炎球菌タンパクの構造遺伝子 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6027734A (en) * | 1991-02-15 | 2000-02-22 | Uab Research Foundation | Mucosal administration of pneumococcal antigens |
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| CA2116261A1 (en) * | 1993-04-20 | 1994-10-21 | David E. Briles | Epitopic regions of pneumococcal surface protein a |
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