TWI457133B - 新穎組合物 - Google Patents

新穎組合物

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TWI457133B
TWI457133B TW095146300A TW95146300A TWI457133B TW I457133 B TWI457133 B TW I457133B TW 095146300 A TW095146300 A TW 095146300A TW 95146300 A TW95146300 A TW 95146300A TW I457133 B TWI457133 B TW I457133B
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influenza
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Description

新穎組合物

本發明係關於改良之疫苗組合物、其製造方法及其醫學用途。詳言之,本發明係關於含佐劑疫苗組合物,其中佐劑為脂質調配物,其包含皂素及脂多醣。本發明進一步係關於流行性感冒疫苗調配物及免疫流行性感冒疾病之接種療法。

一直需要具有改良之免疫原性的新穎組合物或疫苗。作為一種策略,已嘗試使用佐劑來改良對任何給定抗原所產生之免疫反應。

脂多醣(LPS)為革蘭氏陰性菌外膜之外層之主要表面分子且專門出現在革蘭氏陰性菌外膜之外層中。LPS藉由血清補體及吞噬細胞阻止細菌破壞,且與集群現象之黏著性有關。LPS為約10,000道爾頓大小之結構相關複合分子之群且由三個共價連接之區域組成:(i)位於外部區域之O-特異性多醣鏈(O-抗原)(ii)核心寡醣中心區(iii)脂質A-用作疏水性錨形體之最內部區域,其包含具有長鏈脂肪酸之葡糖胺雙醣單元。

已證明LPS之生物活性(諸如致命毒性、致熱性及輔佐性)與脂質A部分相關。相反,免疫原性與O-特異性多醣組份(O-抗原)相關。LPS及脂質A長期以來以其強佐劑作用而為人所知,但此等分子之高毒性已阻止其在疫苗調配物中之使用。因此已為在維持LPS或脂質A之佐劑性的同時降低其毒性作出重要努力。

1966年自親本(平滑)菌株之培養物中分離明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota)突變體R595(Luderitz等人,1966Ann.N.Y.Acad.Sci .133:349-374)。藉由一組噬菌體對所需之純系篩檢其對溶菌之感受性且僅選擇顯示窄範圍敏感性(僅易受一或兩種噬菌體感染)之彼等純系用於進一步研究。此努力導致分離深粗糙突變菌株,其在LPS生物合成方面有缺陷且稱為明尼蘇達沙門氏菌(S.minnesota)R595。

與其他LPS相比,突變明尼蘇達沙門氏菌R595所產生者具有相對簡單之結構。

(i)其不含O-特異性區域-負責將自野生型平滑表型轉移至突變粗糙表型且導致失去毒性之特徵(ii)核心區極短-此特徵增加菌株對各種化學物之感受性(iii)脂質A部分經高達7個脂肪酸高度醯化。

可藉由酸性水解自格蘭氏陰性菌之深粗糙突變菌株萃取之LPS獲得之4'-單磷醯基脂質A(MPL)在顯示降低大於1000之因數(如在小雞胚胎卵中藉由致命劑量所量測)之毒性的同時保留LPS之佐劑性質(Johnson等人1987Rev.Infect.Dis. 增刊9:S512-S516)。一般使LPS在中等濃度之無機酸溶液(例如0.1 M HCl)中回流約30分鐘之時間。此過程導致1位上脫磷酸及6'位上去醣基化,產生MPL。

可藉由溫和鹼性水解MPL獲得之3-O-脫醯基之單磷醯基脂質A(3D-MPL)在再次維持佐劑性的同時進一步降低毒性,參見US4,912,094(Ribi Immunochemicals)。鹼性水解一般在經弱鹼水溶液(諸如pH值10.5之0.5 M碳酸鈉)飽和之有機溶劑(諸如氯仿/甲醇之混合物)中進行。

在(例如)US 4,912,094及WO 02/078637(Corixa Corporation)中可得到關於製備3D-MPL之更多資訊。

Quillaja皂素為自表皂樹(Quillaja saponaria )之樹皮提取之三萜糖苷混合物。粗皂素已廣泛用作獸醫佐劑。Quil-A為Quillaja皂素物質之部分純化水性萃取物。QS21為Quil A之HPLC純化之無毒溶離份且其製造方法在美國專利第5,057,540號中(作為QA21)揭示。

藉助於實例,已用佐劑發展流行性感冒疫苗及對抗人類乳頭狀瘤病毒(HPV)之疫苗。

流行性感冒病毒為世界上存在的最普遍存在之病毒之一,其影響人類及家畜。流行性感冒導致重大經濟負擔、發病率及甚至死亡率。

流行性感冒病毒為具有約125 nm直徑之粒度的RNA包膜病毒。其基本上由經具有脂質雙層結構之病毒包膜包圍的與核蛋白相關之核糖核酸(RNA)的內部核鞘或核心及外部糖蛋白組成。病毒包膜之內層主要包含基質蛋白且外層主要包含宿主源脂質物質。流行性感冒病毒包含兩個表面抗原:糖蛋白神經胺酸酶(NA)及血球凝集素(HA),其作為10至12 nm長之刺突出現於顆粒表面上。此等表面蛋白、尤其血球凝集素決定流行性感冒亞型之抗原特異性。

此等表面抗原逐漸地(有時迅速地)經歷一些導致流行性感冒抗原變異之變化。稱為"漂移"及"轉移"之此等抗原變化為不可預知的且自免疫學觀點可具有驚人的影響,因為其最終導致出現新穎流行性感冒菌株,該等新穎流行性感冒菌株使病毒可逃脫免疫系統,導致熟知的、幾乎每年一次的流行病。

世界衛生組織(World Health Organisation)與國家衛生管理局(national health authorities)及疫苗製造商合作確定每季併入流行性感冒疫苗中之流行性感冒病毒株。

HA為確定不同流行性感冒病毒株之血清特異性的最重要抗原。此75-80 kD蛋白含有眾多抗原決定子,其中若干者在經歷不同病毒株之序列變化的區域中(病毒株-特異決定子)且其他者在與許多HA分子共有之區域中(共有決定子)。

流行性感冒病毒幾乎每個冬季引起流行病,其中A型或B型病毒六週之感染率高達40%。流行性感冒感染引起各種疾病狀況(自亞臨床感染至輕微上呼吸道感染直到嚴重病毒性肺炎)。如藉由增加之住院率或死亡率所證明,典型流行性感冒導致肺炎及下呼吸道疾病發病率增加。疾病之嚴重性主要由宿主年齡、其免疫狀況及感染部位決定。

老年人(65歲及65歲以上)特別易受感染,在發達國家中其占所有流行性感冒相關死亡之80-90%。患有潛伏慢性疾病之個體亦最可能經歷該等併發症。嬰幼兒亦可罹患嚴重疾病。因此此等人群需要保護。除了此等"有危險"人群之外,衛生管理局亦勸告與老年人接觸之健康成人接種疫苗。

接種在控制年度流行性感冒中起關鍵性作用。目前可用到之流行性感冒疫苗為滅活的或活的經減毒流行性感冒疫苗。經滅活之流行性感冒疫苗包含三種可能形式之抗原製劑:經滅活之全病毒、其中經純化之病毒顆粒經清潔劑或溶解脂質包膜之其他試劑破壞之亞病毒粒子(所謂"裂解"疫苗)或經純化之HA及NA(亞單位疫苗)。肌肉內(i.m.)或鼻內(i.n.)給與此等經滅活之疫苗。

所有種類之流行性感冒疫苗通常為三價疫苗。其一般含有源自兩種流行性感冒A病毒株及一種流行性感冒B病毒株之抗原。如藉由單向放射性免疫擴散法(SRD)所量測,在大多數狀況下標準0.5 ml可注射劑量含有15 μg來自各病毒株之血球凝集素(J.M.Wood等人:An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen:adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247;J.M.Wood等人,International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus.J.Biol.Stand.9(1981)317-330)。

認為目前可得之流行性感冒疫苗在所有年齡組中為安全的(De Donato等人,1999,Vaccine,17,3094-3101)。然而,幾乎不存在當前流行性感冒疫苗在兩歲以下幼兒中起作用之證據。此外,預防典型確認之流行性感冒疾病之經報導疫苗功效比對於老年人為23-72%,其顯著低於對於較年輕成人所報導之功效比60-90%(Govaert,1994,J.Am.Med.Assoc.,21,166-1665;Gross,1995,Ann Intern.Med.123,523-527)。已證明流行性感冒疫苗之效力與病毒株之血球凝集抑制(HI)抗體的血清效價相關,且若干研究已發現較年長之成人在流行性感冒免疫後比較年輕成人顯示較低之HI效價(Murasko,2002,Experimental gerontology,37,427-439)。

因此仍需要具有改良免疫原性之新穎疫苗。調配疫苗抗原與有效佐劑為增強對亞病毒粒子抗原之免疫反應的可能方法。

水中油乳液形式之經佐劑MF59輔佐之亞單位流行性感冒疫苗為市售的,且已顯示其誘發比用不含佐劑亞單位疫苗所獲得之抗體效價高之抗效價的能力(De Donato等人,1999,Vaccine,17,3094-3101)。然而,在隨後出版物中,與不含佐劑裂解疫苗相比相同疫苗未顯示其改良之概況(Puig-Barbera等人,2004,Vaccine 23,283-289)。

作為背景,在兩次流行病之間的時期中,與來自前次流行病之彼等病毒相關的流行性感冒病毒傳播。病毒在對早期感染具有不同程度免疫性之人群中傳佈。該通常經2-3年之傳播促進選擇新穎之病毒株,其已充分變化以再次在一般人群中引起流行病;此過程稱為"抗原漂移"。"漂移變異體"可在任一年對不同群落、區域、國家或洲具有不同影響,雖然其若干年之總影響通常為類似的。換言之,流行性感冒泛流行病在人群對其無免疫性之新穎流行性感冒病毒出現時發生。如藉由增加之住院率及死亡率所證明,典型流行性感冒導致肺炎及下呼吸道疾病發病率增加。雖然老年人及患有潛伏慢性疾病之彼等人最可能經歷該等併發症,但嬰幼兒亦可罹患嚴重疾病。

每隔一段不可預知之時間,新穎流行性感冒病毒隨關鍵性表面抗原(與先前季節傳播之病毒株完全不同之血球凝集素)一起出現。此處,所得抗原可與先前在人類中傳播之病毒株的相應蛋白20%至50%不同。此可導致逃脫"族群免疫性"且形成泛流行病之病毒。此現象稱為"抗原轉移"。認為至少在過去當來自不同物種之流行性感冒病毒(諸如鳥或豬之流行性感冒病毒)已超越物種障壁時發生泛流行病。若該等病毒具有在人與人之間傳播的潛力,則其可在數月至一年內在世界範圍散佈,從而導致泛流行病。舉例而言,在1957年(亞洲Flu泛流行)時,H2N2亞型病毒替代H1N1病毒,後者自至少1918年該病毒首次分離時一直在人群中傳播。H2 HA及N2 NA在1957年與1968年間經歷抗原漂移,直至HA在1968年(香港Flu泛流行)時由於出現H3N2流行性感冒亞型而經替代,其後N2 NA繼續與H3 HA一起漂移(Nakajima等人,1991,Epidemiol.Infect.106,383-395)。

賦予流行性感冒病毒株導致泛流行病爆發之潛力的流行性感冒病毒株特徵為:與當前傳播之病毒株中之血球凝集素相比其含有新穎血球凝集素,其可伴隨或不伴隨神經胺酸酶亞型變化;其可在人群中水平傳染;且其對人類為病原性的。新穎血球凝集素可經較長時期(可能為數十年)在人群中不明顯者,諸如H2。或其可為以前未在人群中傳播之血球凝集素,例如在鳥體內發現之H5、H9、H7或H6。在任一狀況下,大多數或至少大部分或甚至整個群體以前未遇到該抗原且對其無免疫性的。

乳頭狀瘤病毒為小DNA腫瘤病毒,其可為高度物種特異性的。迄今已描述超過100個單獨之人類乳頭狀瘤病毒(HPV)基因型。HPV一般對皮膚(例如HPV-1及-2)或黏膜表面(例如HPV-6及-11)為特異性的且通常導致持續數月或數年之良性腫瘤(疣)。對於相關個體而言,該等良性腫瘤可為令人痛苦的,但往往為無生命威脅(少數例外)。

一些HPV亦與癌症相關。HPV與人類癌症之間的最強陽性聯繫為其在HPV-16與HPV-18之間及子宮頸癌中存在。在發展中國家,子宮頸癌為最常見之惡性腫瘤,其中世界上每年出現約500,000新病例。現在使用疫苗來活性抗擊初級HPV-16感染及甚至經確定之含HPV-16癌症為技術上可行。對於關於預防性及治療性接種對抗HPV-16之調查的綜述,參見Cason J.,Clin.Immunother.1994;1(4)293-306 and Hagenesee M.E.,Infections in Medicine 1997 14(7)555-556,559-564。

雖然的確出現較少變異,但所有描述之HPV基因組具有至少八個早期基因(E1至E8)及至少兩個晚期基因(L1及L2)。此外,上游調節區具有調節序列,其似乎控制HPV基因組之大多數轉錄事件。

在WO 94/00152、WO 94/20137、WO 93/02184及WO 94/05792中揭示HPV L1基疫苗。該疫苗可包含作為單體、衣殼體或病毒樣顆粒之L1抗原。製備VLP之方法在此項技術中為熟知的且包括如WO 9913056及US 6245568中所述之提供增強均質性之VLP拆分-重裝方法。該等顆粒可額外包含L2蛋白。例如在WO 93/00436中描述L2基疫苗。其他HPV疫苗方法基於早期蛋白(諸如E7)或融合蛋白(諸如L2-E7)。

特別在流行性感冒及尤其為流行性感冒泛流行之狀況下及對於老年人群而言或在HPV疫苗之狀況下仍存在對於改良疫苗之需要。

先前(例如)在EP 0671948中已揭示含有脂多醣與Quillaja皂素之組合的佐劑。本專利在將脂多醣(3D-MPL)與Quillaja皂素(QS21)組合時顯示強協同作用。現已發現使用脂多醣與quillaja皂素之組合作為佐劑組合物中之免疫刺激劑即使在免疫刺激劑以少量存在於人類劑量中時亦可達成良好佐劑性質。

在本發明之第一態樣中,提供一種免疫原性組合物,其包含與佐劑組合物組合之抗原或其抗原製劑,該佐劑組合物包含得自石鹼木(Quillaja Saponaria Molina)樹皮、以脂質體形式存在之免疫活性皂素餾分及脂多醣。

在本發明之第二態樣中,提供一種免疫原性組合物,其包含與以脂質體形式存在之皂素佐劑組合之流行性感冒病毒或其抗原製劑。在此態樣之特定實施例中,免疫原性組合物進一步包含脂質A衍生物(諸如3D-MPL)。

合適地,本發明之脂質體形式之皂素佐劑包含得自石鹼木樹皮之皂素的活性部分(諸如QS21)及固醇(諸如膽固醇),中皂素:固醇之比為1:1至1:100重量/重量。

詳言之,該免疫原性組合物包含具有CD4 T細胞抗原決定基之抗原。或者,該免疫原性組合物包含具有B細胞抗原決定基之抗原。

本發明亦係關於流行性感冒病毒或其抗原製劑及佐劑在製造用於預防流行性感冒病毒感染及/或疾病之免疫原性組合物中之用途,該佐劑包含得自石鹼木樹皮之以脂質體形式存在之免疫活性皂素餾分及脂多醣。

本發明亦係關於人類乳頭狀瘤病毒抗原或其抗原製劑及佐劑在製造用於人類乳頭狀瘤病毒感染及/或疾病之免疫原性組合物中之用途,該佐劑包含得自石鹼木樹皮以脂質體形式存在之免疫活性皂素餾分及脂多醣。

本發明亦係關於細胞巨大病毒抗原或其抗原製劑及佐劑在製造用於預防細胞巨大病毒感染及/或疾病之免疫原性組合物中之用途,該佐劑包含得自石鹼木樹皮之以脂質體形式存在之免疫活性皂素餾分及脂多醣。

本發明亦係關於肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoanie )抗原或其抗原製劑及所定義之佐劑在製造用於預防肺炎鏈球菌感染及/或疾病之免疫原性組合物中之用途,該佐劑包含得自石鹼木樹皮以脂質體形式存在之免疫活性皂素餾分及脂多醣。

本發明亦係關於惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum )抗原或其抗原製劑及佐劑在製造用於預防惡性瘧原蟲感染及/或瘧疾疾病之免疫原性組合物中之用途,該佐劑包含得自石鹼木樹皮之以脂質體形式存在之免疫活性皂素餾分及脂多醣。

本發明亦係關於水痘帶狀疱疹病毒抗原或其抗原製劑及佐劑在製造用於預防水痘帶狀疱疹病毒感染及/或疾病之免疫原性組合物中之用途,該佐劑包含得自石鹼木樹皮之以脂質體形式存在之免疫活性皂素餾分及脂多醣。

在另一態樣中,提供(a)抗原或其抗原製劑及(b)如上文所定義之佐劑之用途,其係用於製造在人體內誘發以下反應之至少一者或至少二者之免疫原性組合物:(i)對抗該抗原或其抗原製劑之改良CD4 T細胞免疫反應、(ii)對抗該抗原或其抗原製劑之改良體液免疫反應、(iii)對抗該抗原或其抗原製劑之改良B記憶細胞反應。

詳言之,該抗原為流行性感冒病毒、HPV、細胞巨大病毒(CMV)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)或惡性瘧原蟲抗原或其抗原性製劑,且該人類為免疫功能不全個體或人群,諸如高風險成人、老年人或嬰兒。在一特定實施例中,提供一種如本文所定義之抗原或其抗原製劑及佐劑之用途,其係用於製造供人類(尤其為老年人)接種對抗自其中獲得免疫原性組合物之抗原之病原體的免疫原性組合物。特定言之,該抗原為流行性感冒病毒、人類乳頭狀瘤病毒、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹病毒、肺炎鏈球菌病毒、瘧原蟲(Plasmodium parasite )、抗原或其抗原製劑。

亦提供一種接種方法,其包含將尤其為流行性感冒病毒或HPV、細胞巨大病毒、水痘帶狀疱疹病毒、肺炎鏈球菌病毒、瘧原蟲或其抗原製劑之抗原或抗原組合物及如上文所述之佐劑傳遞至有需要之個體或人群。

在特定實施例中,相較於以不含佐劑抗原或抗原組合物獲得者,免疫原性組合物可誘發對抗該抗原或其抗原製劑之改良CD4 T細胞免疫反應且詳言之此外其可引發體液免疫反應或改良之B記憶細胞反應或二者。特定言之,該CD4 T細胞免疫反應包含引發交叉反應之CD4 T輔助細胞反應。特定言之,該體液免疫反應包含引發交叉反應之體液免疫反應。

在另一實施例中,提供一種如上文所定義之保護免遭病原體所導致之感染或疾病的方法或用途,該病原體為自其中獲得免疫原性組合物中之抗原之病原體的變異體。在另一實施例中,提供一種如上文所定義之保護免遭病原體所導致之感染或疾病的方法或用途,該病原體包含係免疫原性組合物中之抗原之變異體的抗原。在一特定實施例中,提供一種抗原、尤其為流行性感冒或HPV或其抗原製劑之用途,其係用於製造一種用於使先前經免疫原性組合物接種之人類再接種之免疫原性組合物,該免疫原性組合物包含與如本文所述之佐劑組合之抗原、尤其為流行性感冒病毒或HPV或其抗原製劑。

在一特定實施例中,用於再接種之組合物可額外含有佐劑。在另一特定實施例中,用於再接種之免疫原性組合物含有與用於先前接種之抗原或抗原組合物共享共同之CD4 T細胞抗原決定基的抗原。特定言之,再接種之免疫原性組合物含有流行性感冒病毒或其抗原製劑,其與用於初次接種之流行性感冒病毒或其病毒抗原製劑共享共同之CD4 T細胞抗原決定基。

在一態樣中,在前一季已接種對抗流行性感冒之受檢者體內進行再接種。一般地,在初次接種後至少6個月、較佳為8至14個月、更佳為約10至12個月進行再接種。在另一態樣中,在已用包含流行性感冒病毒或其抗原製劑之組合物接種之受檢者體內進行再接種,其中至少一個病毒株與泛流行病爆發相關或具有與泛流行病爆發相關之潛力。

在本發明之另一態樣中,提供一種來自第一流行性感冒病毒株之流行性感冒病毒或其抗原製劑之用途,其係用於製造如本文中所定義之免疫原性組合物以保護免遭由變異之流行性感冒病毒株導致之流行性感冒感染。

本發明亦係關於一種接種方法,其包含傳遞流行性感冒病毒或其抗原製劑及如本文所定義之佐劑。

在另一態樣中,提供一種接種免疫功能不全之人類個體或人群(諸如高風險成人或老年人)之方法,其包含投與流行性感冒免疫原性組合物,該組合物包含與如本文中所定義之佐劑組合之流行性感冒病毒或其抗原製劑。

在另一實施例中,本發明提供一種再接種先前經流行性感冒免疫原性組合物接種之人類的方法,該組合物包含與如本文所定義之佐劑組合之來自至少一個流行性感冒病毒株之流行性感冒抗原或其抗原製劑,該方法包含對該人類投與包含含佐劑或不含佐劑之流行性感冒病毒或其抗原製劑之免疫原性組合物。

本發明亦係關於一種製備免疫原性組合物之方法,其包含使脂質體形式之皂素佐劑與流行性感冒病毒或其抗原製劑及視情況之3D-MPL組合。

本發明之其他態樣及優點在其較佳實施例之以下實施方式中經進一步描述。

本發明已發現包含以脂質體形式存在之皂素及脂多醣之佐劑組合物(其中各免疫刺激劑以每人劑量30 μg或30 μg以下之濃度存在)可改良對抗原製劑之免疫反應,雖然同時其具有比先前技術調配物低之反應原性,其中免疫刺激以較高濃度之每人劑量存在。

本發明者已進一步發現包含流行性感冒病毒或其抗原製劑連同包含以脂質體形式存在之皂素的佐劑及視情況額外連同脂質A衍生物(諸如3D-MPL)之流行性感冒調配物與由不含佐劑病毒或其抗原製劑所獲得之調配物相比可改良對抗該抗原或抗原組合物之CD4 T細胞免疫反應。將用以脂質體形式存在之皂素輔佐之調配物有利地用於誘發可偵測由MHC第II類分子所表示之流行性感冒抗原決定基的抗流行性感冒CD4-T細胞反應。本申請案已發現靶向細胞介導之免疫系統以增加對抗異源及漂移流行性感冒病毒株為有效的(在接種及感染後)。

如藉由符合流行性感冒相關保護之人類受檢者的數目所評定,本發明之一特定實施例為適用於本發明之組合物在再接種後可在人體內提供對抗流行性感冒之較佳血清保護。此外,另一特定實施例為與不含佐劑組合物相比,適用於本發明之組合物亦將可在人類受檢者第一次接種後誘發較高之B細胞記憶反應及再接種後較高之體液反應。

本發明之含佐劑流行性感冒組合物具有若干優點:1)經改良之免疫原性:其將使老年人(超過50歲、一般超過65歲)體內之弱免疫反應恢復至年輕人體內所見之程度(抗體及/或T細胞反應);2)經改良之交叉保護概況:對抗變異(漂移)流行性感冒病毒株的增加之交叉保護;3)其亦將允許對類似反應使用降低之抗原劑量,因此在緊急狀況(例如泛流行)下確保增加之容量。

在本發明之另一態樣中,發明者已發現如本文所定義之佐劑組合物證明抗體產生及接種後流行性感冒特異性CD4之頻率的免疫原性結果,其等於或有時大於用不含佐劑疫苗產生之彼等者。此作用在老年人群中尤其有價值且可用如本文所定義之含有較低免疫刺激劑劑量的佐劑實現。此外,與接受其中免疫刺激劑處於較低濃度之含佐劑疫苗之組相比,在接受經最高免疫刺激劑濃度輔佐之疫苗之組中反應原性症狀顯示較高趨勢。

此等發現可適用於其他形式之相同抗原及其他抗原。

皂素佐劑

本發明之佐劑組合物包含以脂質體形式存在之皂素佐劑。

尤其適用於本發明之皂素為Quil A及其衍生物。Quil A為自南美皂皮樹中分離之皂素製劑且由Dalsgaard等人在1974年("Saponin adjuvants",Archiv.fr die gesamte Virusforschung,第44卷,Springer Verlag,Berlin,第243-254頁)首次描述為具有佐劑活性。已藉由HPLC分離Quil A之純化片段,其保留佐劑活性而無與Quil A相關之毒性(EP 0 362 278),例如QS7及QS21(亦稱為QA7及QA21)。QS-21為得自皂皮樹樹皮之天然皂素,其誘發CD8+細胞毒素T細胞(CTL)、Th1細胞及主要之IgG2a抗體反應且在本發明之上下文中為較佳之皂素。

在本發明之合適形式中,免疫原性組合物中之皂素佐劑為皂皮樹quil A之衍生物、較佳為Quil A之免疫活性部份(諸如QS-17或QS-21,合適地為QS-21)。在一實施例中,本發明之組合物含有實質上純形式之免疫活性皂素餾分。較佳地,本發明之組合物含有實質上純形式之QS21,亦即QS21為至少90%純,例如至少95%純或至少98%純。

在一特定實施例中,QS21在其次反應原性組合物中提供,其中其經諸如膽固醇之外源性固醇抑止。存在若干特定形式之次反應源性組合物,其中QS21經外源性膽固醇抑止。在一特定實施例中,皂素/膽固醇為脂質體結構形式(WO 96/33739,實例1)。在此實施例中,脂質體合適地含有例如磷脂醯膽鹼之中性脂質,其在室溫下合適地為非結晶的,例如蛋黃磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)或二月桂基磷脂醯膽鹼。脂質體亦可含有帶電脂質,其增加由飽和脂質構成之脂質體的微脂囊-QS21結構的穩定性。在此等狀況下,帶電脂質之量合適地為1-20%重量/重量,較佳為5-10%。固醇與磷脂之比為1-50%(mol/mol),合適地為20-25%。

合適固醇包括β植固醇、豆固醇、麥角固醇、麥角鈣化醇及膽固醇。在一特定實施例中,佐劑組合物包含膽固醇作為固醇。此等固醇在此項技術中為熟知的,例如膽固醇作為動物脂肪中所發現之天然存在的固醇在Merck索引,第11版,第341頁中經揭示。

包含QS21及固醇(尤其為膽固醇)之本發明之佐劑組合物與其中不存在固醇之組合物相比顯示降低之反應原性,同時維持佐劑作用。根據WO 96/33739中所揭示之方法可評價反應原性研究。認為本發明之固醇意謂異源性固醇,亦即固醇對自其中獲得抗原製劑之有機體為非內源性的但經添加至抗原製劑中或在隨後調配時添加至抗原製劑中。一般而言,固醇可在隨後藉由使用(例如)經固醇抑止形式之皂素與皂素佐劑一起在調配抗原製劑期間添加。如在WO 96/33739中所述,合適外源性固醇與皂素佐劑相關。

當活性皂素餾分為QS21時,QS21:固醇之比一般將為約1:100至1:1(重量/重量)、合適地介於1:10至1:1(重量/重量)之間且較佳為1:5至1:1(重量/重量)。合適地,存在過量固醇,QS21:固醇之比為至少1:2(重量/重量)。在一實施例中,QS21:固醇之比為1:5(重量/重量)。固醇合適地為膽固醇。

其他可用皂素得自植物七葉樹(Aesculus hippocastanum )或絲石竹(Gyophilla struthium)。文獻中已描述之其他皂素包括七葉素(Escin),其已在Merck索引(第12版:條目3737)中作為存在於七葉樹(拉丁名:Aesculus hippocastanum )種籽中之皂素混合物經描述。藉由層析及純化(Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953))及藉由離子交換樹脂(Erbring等人,US 3,238,190)描述其分離。已純化七葉素部分且證明其為生物活性的(Yoshikawa M等人(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996 Aug;44(8):1454-1464))。例如,亦已關於ISCOM製造描述來自絲石竹(Gypsophilla struthium )之Sapoalbin (R.Vochten等人,1968,J.Pharm.Belg.,42,213-226)。

本發明之一關鍵態樣為較佳為QS21之免疫活性皂素可以比先前認為可用較之量、合適地為以免疫原性組合物之每人劑量低於30 μg(例如1與30 μg之間)之量使用。

因此本發明提供30 μg或30 μg以下(例如1與30 μg之間)量之包含免疫活性皂素(較佳為QS21)之免疫原性組合物的人類劑量。

在一實施例中,免疫原性組合物之人類劑量包含QS21為約25 μg之量,例如介於20-30 μg之間、合適地介於21-29 μg之間或介於22與28 μg之間或介於23與27 μg之間或介於24與26 μg之間或25 μg。

在另一實施例中,每一免疫原性組合物之人類劑量包含約10 μg之量,例如介於5與15 μg之間、合適地介於6與14 μg之間、例如介於7與13 μg之間或介於8與12 μg之間或介於9與11 μg之間或10 μg的QS21。

在另一實施例中,免疫原性組合物之人類劑量包含以約5 μg之量(例如介於1與9 μg之間或介於2與8 μg之間或合適地為介於3與7 μg或4與6 μg之間或5 μg)存在的QS21。

合適之QS21量為每免疫原性組合物之人類劑量(例如)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 μg(重量/體積)之任一者。

在一實施例中,人類劑量為0.5 ml。在另一實施例中,人類劑量高於0.5 ml,例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在另一實施例中,人類劑量係介於1 ml與1.5 ml之間。本發明特徵為各人類劑量含有30 μg或30 μg以下(例如介於1與30 μg之間)的QS21。

本發明進一步提供一種佐劑組合物,其包含30 μg或30 μg以下(例如介於1與30 μg之間)之QS21。一般地,該佐劑組合物將為250 μl之合適體積的人類劑量。在另一實施例中,佐劑組合物將為人類劑量合適體積,其大致為人類劑量預期最終體積的一半,例如對於預期0.7 ml之人類劑量而言為360 μl體積。佐劑組合物在與抗原組合物合併時經稀釋以提供疫苗之最終人類劑量。該劑量之最終體積當然將視佐劑組合物之初始體積及添加至佐劑組合物中之抗原組合物的體積而變化,但可在0.5與1.5 ml之間變化。在一特定實施例中人類劑量為0.5 ml,在此實施例中本發明之疫苗組合物將包含每0.5 ml人類劑量30 μg或30 μg以下(例如介於1與30 μg之間)量之QS21,此外在此實施例中本發明之佐劑組合物將包含每250 μl佐劑組合物30 μg或30 μg以下(例如介於1與30 μg之間)量之QS21。

特定言之,當與流行性感冒抗原組合時,QS21之量可以(例如)每組合物劑量1至100 μg(重量/體積)之量、較佳為每組合物劑量10至50 μg(重量/體積)之量使用。合適量之QS21為每組合物劑量(例如)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 μg(重量/體積)之任一者。更佳地,QS21量範圍為每組合物劑量25至75 μg(重量/體積)。通常組合物劑量範圍將為約0.5 ml至約1 ml。典型疫苗劑量為0.5 ml、0.6 ml、0.7 ml、0.8 ml、0.9 ml或1 ml。在一較佳實施例中,每毫升疫苗組合物含有50 μg最終濃度之QS21或每0.5 ml疫苗劑量含有25 μg最終濃度之QS21。在其他較佳實施例中,每毫升疫苗組合物含有35.7 μg或71.4 μg最終濃度之QS21。特定言之,0.5 ml疫苗劑量體積含有每劑量25 μg或50 μg之QS21。

QS21劑量合適地可增強人體內對抗原之免疫反應。詳言之,合適QS21量為與不含佐劑組合物相比或與經另一QS21量輔佐之組合物相比改良組合物之免疫潛能者,其同時為自反應原性概況可接受的。

3D-MPL佐劑

該組合物進一步包含額外佐劑,其為脂多醣,合適地為脂質A之無毒衍生物、尤其為單磷醯基脂質A或更特定言之為3-脫醯基之單磷醯基脂質A(3D-MPL)。

3D-MPL以名稱MPL由GlaxoSmithKline Biologicals N.A.出售且在文獻中自始至終稱為MPL或3D-MPL。參見(例如)美國專利第4,436,727、4,877,611、4,866,034及4,912,094號。3D-MPL主要促進CD4+T細胞關於IFN-g(Th1)顯型之反應。可根據GB 2 220 211A中所揭示之方法製造3D-MPL。在化學上其為具有3、4、5或6條經醯化鏈之3-脫醯基單磷醯基脂質A之混合物。較佳地,在本發明之組合物中使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有使得其可經由0.22 μm過濾器無菌過濾之粒度。該等製劑在WO 94/21292中經描述。

本發明之一關鍵態樣為較佳為3D-MPL之脂多醣可以比先前認為可用低之量、合適地為以每免疫原性組合物之人類劑量30 μg或30 μg以下(例如1與30 μg之間)之量使用。

因此本發明提供30 μg或30 μg以下(例如1與30 μg之間)量之包含脂多醣(較佳為3D-MPL)之免疫原性組合物的人類劑量。

在一實施例中,免疫原性組合物之人類劑量包含3D-MPL,其為約25 μg之量,例如介於20-30 μg之間、合適地介於21-29 μg之間或介於22與28 μg之間或介於23與27 μg之間或介於24與26 μg之間或25 μg。

在另一實施例中,免疫原性組合物之人類劑量包含3D-MPL,其為約10 μg之量,例如介於5與15 μg之間、合適地介於6與14 μg之間、例如介於7與13 μg之間或介於8與12 μg之間或介於9與11 μg之間或10 μg。

在另一實施例中,免疫原性組合物之人類劑量包含3D-MPL,其為約5 μg之量,例如介於1與9 μg之間或介於2與8 μg之間或合適地為介於3與7 μg或4與6 μg之間或5 μg。

合適之3D-MPL量為每免疫原性組合物之人類劑量(例如)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 μg(重量/體積)之任一者。

在一實施例中,人類劑量為0.5 ml。在另一實施例中,人類劑量高於0.5 ml,例如0.6、0.7、0.8、0.9或1 ml。在另一實施例中,人類劑量係介於1 ml與1.5 ml之間。本發明特徵為各人類劑量含有30 μg或30 μg以下(例如介於1與30 μg之間)之3D-MPL。

本發明進一步提供一種佐劑組合物,其包含30 μg或30 μg以下(例如介於1與30 μg之間)之3D-MPL。一般地該佐劑組合物將為250 μl之合適體積的人類劑量。在另一實施例中,佐劑組合物將為人類劑量合適體積,其大致為人類劑量預期最終體積的一半,例如對於預期0.7 ml之人類劑量而言為360 μl體積。佐劑組合物在與抗原組合物合併時經稀釋以提供疫苗之最終人類劑量。該劑量之最終體積當然將視佐劑組合物之初始體積及添加至佐劑組合物中之抗原組合物的體積而變化,但一般可在0.5與1.5 ml之間變化。在一特定實施例中人類劑量為0.5 ml,在此實施例中本發明之疫苗組合物將包含每0.5 ml人類劑量30 μg或30 μg以下(例如介於1與30 μg之間)量之3D-MPL,此外在此實施例中本發明之佐劑組合物將包含每250 μl佐劑組合物30 μg或30 μg以下(例如介於1與30 μg之間)量之3D-MPL。

當免疫原性組合物含有流行性感冒病毒或其抗原製劑時,包含脂質體形式之皂素的佐劑組合物視情況額外含有脂質A衍生物、尤其為單磷醯基脂質A或更尤其為3D-MPL。在此實施例中,3D-MPL可以(例如)每組合物劑量1至100 μg(重量/體積)之量、較佳為每組合物劑量10至50 μg(重量/體積)之量使用。合適量之3D-MPL為每組合物劑量(例如)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 μg(重量/體積)之任一者。更佳地,3D-MPL量範圍為每組合物劑量25至75 μg(重量/體積)。通常組合物劑量範圍將為約0.5 ml至約1 ml。典型疫苗劑量為0.5 ml、0.6 ml、0.7 ml、0.8 ml、0.9 ml或1 ml。在一實施例中,每毫升疫苗組合物含有50 μg最終濃度之3D-MPL或每0.5 ml疫苗劑量含有25 μg最終濃度之3D-MPL。在另一實施例中,每毫升疫苗組合物含有35.7 μg或71.4 μg最終濃度之3D-MPL。特定言之,0.5 ml疫苗劑量體積含有每劑量25 μg或50 μg之3D-MPL。

3D-MPL劑量合適地可增強人體內對抗原之免疫反應。詳言之,合適之3D-MPL量為與不含佐劑組合物相比或與經另一MPL量輔佐之組合物相比改良組合物之免疫潛能者,其同時為自反應原性概況可接受的。

本發明之合適組合物為其中最初不用MPL製備脂質體且接著添加合適地作為100 nm以下顆粒之小顆粒MPL之彼等組合物(如WO 96/33739中所述),該等小顆粒易於經0.22 μm膜無菌過濾。因此囊膜中不含MPL(稱為MPL在外)。其中囊膜中含有MPL(稱為MPL在內)之組合物亦形成本發明之一態樣。抗原可含在囊膜內或含在囊膜外。合適地,可溶抗原在外面且疏水性或經脂化之抗原含在膜內或外。

在一實施例中,本發明之佐劑組合物包含脂多醣及免疫活性皂素。在本發明之一特定實施例中,脂多醣為3D-MPL且免疫活性皂素為QS21。在本發明之另一實施例中,佐劑組合物基本上由脂質調配物中之脂多醣及免疫活性皂素組成。合適地,在本實施例之一形式中,佐劑組合物基本上由3D-MPL及QS21及視情況之較佳為膽固醇之固醇組成。

在本發明之另一實施例中,佐劑組合物在脂質調配物中包含脂多醣及免疫活性皂素與一或多種其他免疫刺激劑或佐劑之組合。合適地,在本發明之一形式中,脂多醣為3D-MPL且免疫活性皂素為QS21。

在一特定實施例中,QS21及3D-MPL以每免疫原性組合物之人類劑量相同最終濃度存在。在此實施例之一態樣中,免疫原性組合物之人類劑量為25 μg 3D-MPL及25 μg QS21之最終量。在另一實施例中,免疫原性組合物之人類劑量包含各10 μg MPL及QS21之最終含量。在本發明之另一特定實施例中提供一種佐劑組合物,其具有250 μl之體積且包含25 μg 3D-MPL及25 μg QS21或各10 μg MPL及QS21之量。

可在本發明之佐劑組合物情況下使用之抗原包括:根據本發明使用之流行性感冒病毒或其抗原製劑,其可為裂解流行性感冒病毒或其裂解病毒抗原製劑。在一替代實施例中,流行性感冒製劑可含有另一類型之經滅活流行性感冒抗原,諸如經滅活之全病毒或經純化之HA及NA(亞單位疫苗)或流行性感冒病毒體。在另一實施例中,流行性感冒病毒可為活的經減毒流行性感冒製劑。

根據本發明使用之裂解流行性感冒病毒或其裂解病毒抗原製劑合適地為經滅活之病毒製劑,其中病毒顆粒經清潔劑活其他試劑破壞以溶解脂質包膜。裂解病毒或其裂解病毒抗原製劑合適地藉由用溶解濃度之有機溶劑或清潔劑使傳染性或經滅活之泛流行性感冒病毒斷裂及隨後移除全部或大多數溶解劑及一些或大多數病毒脂質物質來製備。藉由其裂解病毒抗原製劑意謂裂解病毒製劑,與裂解病毒相比其可經歷一些程度之純化同時保留裂解病毒組份之大部分抗原性質。舉例而言,當於卵中製造時裂解病毒可自卵污染蛋白中耗盡或當於細胞培養物中製造時裂解病毒可自宿主細胞污染物中耗盡。裂解病毒抗原製劑可包含一個以上病毒株之裂解病毒抗原組份。含裂解病毒或裂解病毒抗原製劑之疫苗(稱為"流行性感冒裂解疫苗")一般含有殘餘基質蛋白及核蛋白及有時含有脂質以及膜包膜蛋白。該等裂解病毒疫苗通常將含有大多數或全部病毒結構蛋白,雖然當其出現在全病毒中時不必為相同比例。

或者,流行性感冒病毒可為全病毒疫苗形式。對於泛流行病狀況而言此可證明為超過裂解病毒疫苗之優點,因為對於新穎之流行性感冒病毒株而言其避免是否可成功地製造裂解病毒疫苗之不確定性。對於一些病毒株而言,用於製造裂解病毒之習知清潔劑可損壞病毒且致使其不穩定。雖然一直存在使用不同清潔劑及/或發展製造裂解疫苗之不同方法的可能性,但此將花費時間,其在泛流行病狀況下可能不可用。在全病毒法情況下除了較大程度確定性之外,亦存在比裂解病毒大之疫苗生產容量,因為大量抗原在製備合適裂解疫苗必需之額外純化步驟中損失。

在另一實施例中,流行性感冒病毒製劑為經純化之亞單位流行性感冒疫苗形式。亞單位流行性感冒疫苗一般含有兩種主要包膜蛋白(HA及NA)且可具有超過全病毒粒子疫苗之額外優點,因為其(尤其在初期疫苗中)一般為較少反應原性的。亞單位疫苗可重組製造或自受損病毒顆粒中純化。

在另一實施例中,流行性感冒病毒製劑為病毒體形式。病毒體為球形、單層微脂粒,其在可靠構型中保留病毒體之磷脂雙層膜中所插入之功能病毒包膜糖蛋白HA及NA。該流行性感冒病毒或其抗原製劑可為得自卵的或得自細胞培養物的。

舉例而言,本發明之流行性感冒病毒或其抗原製劑可藉由使流行性感冒病毒在卵中生長及純化採集之尿囊液自習知孵化卵法得到。可在短時間內大量積聚卵。或者,其可使用生長病毒或表現重組流行性感冒病毒表面抗原之細胞或細胞培養物自新穎產生方法中之任一者得到。用於生長病毒之合適細胞基質包括(例如)狗腎細胞(諸如MDCK或來自MDCK、類MDCK細胞之純系的細胞)、猴腎細胞(諸如包括Vero細胞之AGMK細胞)、合適之豬細胞株或供製造用於疫苗目的之流行性感冒病毒的任何其他哺乳動物細胞類型。合適細胞基質亦包括人類細胞,例如MRC-5細胞。合適細胞基質不限於細胞株;舉例而言,亦包括原代細胞(諸如雞胚胎纖維母細胞)及鳥細胞株。

流行性感冒病毒抗原或其抗原製劑可藉由大量商業上可應用方法之任一者製造,例如以引用方式併入本文之專利第DD 300 833及DD 211 444號中所述之裂解flu法。慣常使用溶劑/清潔劑處理(諸如磷酸三正丁酯或與TweenT M 組合之乙醚(稱為"Tween-醚"裂解))製造裂解flu且一些製造工廠仍使用此方法。目前所用之其他裂解劑包括清潔劑或蛋白水解酶或膽鹽,例如以引用方式併入本文之專利第DD 155 875號中所述之去氧膽酸鈉。可用作裂解劑之清潔劑包括陽離子清潔劑(例如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB))、其他離子清潔劑(例如月桂基硫酸酯、牛黃脫氧膽酸鹽)或諸如上文所述者之非離子清潔劑(其包括Triton X-100(例如在Lina等人,2000,Biologicals 28,95-103中所述之方法中)及Triton N-101)或任何兩種或兩種以上清潔劑之組合。

裂解疫苗之製備方法可包括各種組合之若干不同過濾及/或其他分離步驟(諸如超速離心、超濾、區帶離心及層析(例如離子交換)步驟)及視情況之(例如)用熱、甲醛或β-丙內酯或U.V.之活化步驟,該活化步驟可在裂解之前或之後進行。裂解法可作為分批、連續或半連續過程進行。WO 02/097072中描述用於裂解免疫原性組合物之較佳裂解及純化方法。

本發明之較佳裂解flu疫苗抗原製劑包含自製造過程中留下之殘餘量Tween 80及/或Triton X-100,雖然可在製備裂解抗原之後添加此等物質或調節其濃度。較佳地Tween 80及Triton X-100均存在。疫苗劑量中此等非離子界面活性劑之較佳範圍為:Tween 80:0.01至1%,更佳為約0.1%(體積/體積)Triton X-100:0.001至0.1%(重量/體積),更佳為0.005至0.02%(重量/體積)。

在一特定實施例中,Tween 80之最終濃度範圍為0.025%-0.09%重量/體積。在另一特定實施例中,抗原以混合物之2倍濃度提供,其中Tween 80濃度範圍為0.025%-0.2%(重量/體積)且必須在最後調配時用佐劑(或對照調配物中之緩衝液)稀釋兩倍。

在另一特定實施例中,Triton X-100之最終濃度範圍為0.004%-0.017%重量/體積。在另一特定實施例中,抗原以混合物之2倍濃度提供,其中Triton X-100濃度範圍為0.005%-0.034%(重量/體積)且必須在最後調配時用佐劑(或對照調配物中之緩衝液)稀釋兩倍。

較佳地,在低含量硫柳汞存在下或較佳在無硫柳汞存在下製備流行性感冒製劑。較佳地,所得流行性感冒製劑在無有機汞製劑防腐劑存在下為穩定的,詳言之製劑不含殘餘硫柳汞。詳言之,流行性感冒病毒製劑包含在無硫柳汞存在下或在低含量硫柳汞(一般為5 μg/ml或5 μg/ml以下)下穩定化之血球凝集素抗原。特定言之,B流行性感冒病毒株之穩定化係藉由諸如α生育酚琥珀酸酯(亦稱為維生素E琥珀酸酯,亦即VES)之α生育酚衍生物進行。該等製劑及其製備方法揭示於WO 02/097072中。

較佳之組合物含有由WHO推薦之適當流行性感冒季節之病毒株所製備的三種經滅活裂解病毒粒子抗原。

較佳地,本發明之流行性感冒病毒或其抗原製劑及佐劑係容納於同一容器中。將其稱為"一瓶法"。較佳地,小瓶為預填充之注射器。在一替代實施例中,本發明之流行性感冒病毒或其抗原製劑及佐劑容納於單獨容器或小瓶中且在即將投與受檢者體內之前或之時混雜。將其稱為"兩瓶法"。舉例而言,當疫苗為總劑量體積0.7 ml之2組份疫苗時,經濃縮之抗原(例如經濃縮之三價經滅活裂解病毒粒子抗原)存在於一個小瓶(335 μl)(抗原容器)中且預填充之注射器含有佐劑(360 μl)(佐劑容器)。注射時,藉由使用含有佐劑之注射器來自含有經濃縮之三價經滅活裂解病毒粒子抗原之小瓶中移除小瓶內含物,接著溫和混合注射器。注射前,用肌肉內針替代所用針且將體積校正至530 μl。在此實例中,經復水之含佐劑流行性感冒疫苗候選物之一劑量等於530 μl。

在本發明之一態樣中,當存在多價組合物時,則如本文所定義之該多價免疫原性組合物中至少一個流行性感冒病毒株與泛流行病爆發有關或具有與泛流行病爆發相關之潛力。該病毒株亦可在下文中稱為"泛流行病病毒株"。詳言之,當疫苗為多價疫苗(諸如二價或三價或四價疫苗)時,至少一個病毒株與泛流行病爆發有關或具有與泛流行病爆發有關之潛力。合適病毒株為(但不限於):H5N1、H9N2、H7N7及H2N2。

合適地,該等流行性感冒病毒或其抗原製劑為多價的,諸如二價或三價或四價的。較佳地,流行性感冒病毒或其抗原製劑為三價或四價的,其具有來自三個不同流行性感冒病毒株之抗原,至少一個病毒株係與泛流行病爆發有關或具有與泛流行病爆發有關之潛力。

賦予流行性感冒病毒株導致泛流行病爆發之潛力的流行性感冒病毒株特徵為:與當前傳播之病毒株中之血球凝集素相比其含有新穎血球凝集素;其可在人群中水平傳染;且其對人類為病原性的。新穎血球凝集素可為較長時期(可能為數十年)在人群中不明顯者,諸如H2。或其可為先前未在人群中傳播之血球凝集素,例如在鳥體內發現之H5、H9、H7或H6。在任一狀況下,大多數或至少大部分或甚至整個群體先前未遇到該抗原且對其無免疫力。

某些群體一般在泛流行病狀況下處於感染流行性感冒之較高風險中。老年人、慢性病患者及年幼兒童為尤其易患病的但許多年輕人及看上去健康的人亦處於風險中。對於H2流行性感冒而言,1968年後出生之部分群體處於較高風險中。對於此等人群而言儘快地及以簡單方式有效保護很重要。

處於較高風險之另一群人為旅行者。現今人們旅行多於以前且其中大多數新病毒出現之地區(中國及東南亞)在近年來已成為受歡迎之旅行目的地。此旅行方式之變化使得新病毒在大概數週而非數月或數年內到世界各地。

因此對於此等人群而言,在泛流行病狀況或在可能之泛流行病狀況下尤其需要疫苗以防止遭受流行性感冒。合適病毒株為(但不限於):H5N1、H9N2、H7N7及H2N2。

視情況之組合物可含有三個以上價,例如三種非泛流行病病毒株加泛流行病病毒株。或者,組合物可含有三種泛流行病病毒株。較佳地,組合物含有三種泛流行病病毒株。

此外本發明之免疫原性組合物之抗原的實例為諸如來自A群鏈球菌(Streptococcus)或B群鏈球菌但最佳為來自肺炎鏈球菌之鏈球菌抗原。最佳使用至少一種蛋白質及/或至少一種醣類抗原。最佳地,至少一種肺炎鏈球菌蛋白抗原選自由以下蛋白組成之群:肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin)、PspA或其跨膜缺失變異體、PspC或其跨膜缺失變異體、PsaA或其跨膜缺失變異體、甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶、CbpA或其跨膜缺失變異體、PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130及Sp133,或其免疫功能均等物(例如上述蛋白之結構域融合,例如WO01/98334及WO 03/54007中所述之PhtDE融合蛋白)。

在WO 00/56359及WO 02/22167及WO 02/22168(以引用方式併入本文)中描述某些組合物。

抗原可包含莢膜醣抗原(較佳與載體蛋白結合),其中醣類(最佳為多醣)係得自至少四種血清型之肺炎球菌。在一實施例中,四種血清型包括6B、14、19F及23F。在另一實施例中,組合物中包括至少7種血清型,例如得自血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之彼等血清型。在另一實施例種,組合物中包括至少10種血清型,例如一實施例中之組合物包括得自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F之莢膜醣類(較佳與載體蛋白結合)。在另一實施例中,免疫原性組合物包含得自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F之莢膜醣類。雖然本發明亦涵蓋例如23價(諸如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F)之更多醣類抗原,但在本發明之一較佳實施例中包括至少13種醣抗原(較佳與載體蛋白結合)。

雖然上述醣有利地為其全長、天然多醣形式,但應理解亦可使用尺寸減少之多醣,其(若必要)在與蛋白載體偶聯時仍為免疫原性的(參見例如EP 497524及497525)。

為了預防/改善老年人(55歲以上)群體內之肺炎及嬰兒(至多18個月)及幼童(一般為18個月至5歲)之中耳炎,本發明之較佳實施例為使本文所述之多價肺炎鏈球菌醣與較佳地選自由上文所列出之蛋白之群的肺炎鏈球菌蛋白組合。如下文所述亦可有利地使用肺炎球菌蛋白之組合。

肺炎球菌蛋白

肺炎鏈球菌抗原較佳係選自由以下蛋白組成之群:來自聚組胺酸三聚體家族(Pht)之蛋白、來自Lyt家族之蛋白、膽鹼結合蛋白、具有LPXTG基元(其中X為任何胺基酸)之蛋白、具有II型信號序列基元LXXC(其中X為任何胺基酸)之蛋白及具有I型信號序列基元之蛋白。此等類型(或基元)內之較佳實例為以下蛋白(或其截斷物或免疫功能均等物):Pht(聚組胺酸三聚體)家族包含蛋白PhtA、PhtB、PhtD及PhtE。該家族特徵為脂化序列、兩個由脯胺酸富集區隔離之結構域及若干涉及金屬或核苷結合或酶活性之組胺酸三聚體、(3-5個)螺旋-螺旋區、保守N末端及異源C末端。其存在於所測試之所有肺炎雙球菌菌株中。在其他鏈球菌及中奈瑟菌(Neisseria )中亦已發現異源蛋白。家族之較佳成員包含PhtA、PhtB及PhtD。更佳地,其包含PhtA或PhtD。然而,應理解術語PhtA、B、D及E係指具有下面引文中所揭示之序列的蛋白以及其天然存在(及人造)變異體,該等變異體具有與所提及之蛋白至少90%相同之序列同源性。較佳地,其至少95%相同且最佳地其至少97%相同。

關於Pht蛋白,PhtA在WO 98/18930中揭示且亦稱為Sp36。如上文所述,其為來自聚組胺酸三聚體家族之蛋白且具有II型信號基元LXXC。

PhtD在WO 00/37105中經揭示且亦稱為Sp036D。如上文所述,其亦為來自聚組胺酸三聚體家族之蛋白且具有II型LXXC信號基元。PhtB在WO 00/37105中經揭示且亦稱為Sp036B。如WO 00/17370中所揭示,PhtB家族之另一成員為C3降解多狀。此蛋白亦來自聚組胺酸三聚體家族且具有II型LXXC信號基元。較佳之免疫功能均等物為WO 98/18930中所揭示之蛋白Sp42。PhtB截斷物(約79 kD)在WO99/15675中經揭示,亦認為其係PhtX家族之成員。

PhtE在WO00/30299中經揭示且稱為BVH-3。

SpsA為WO 98/39450中所揭示之膽鹼結合蛋白(Cbp)。

Lyt家族為與細胞溶解相關之膜相關蛋白。N末端結構域包含膽鹼結合域,然而Lyt家族不具有下文所述之膽鹼結合蛋白家族(Cbp)家族中所發現之全部特徵且因此對於本發明而言,認為Lyt家族與Cbp家族不同。與Cbp家族相比,C末端結構域含有Lyt蛋白家族之催化結構域。該家族包含LytA、B及C。關於Lyt家族,LytA在Ronda等人,Eur J Biochem,164:621-624(1987)中經揭示。LytB在WO 98/18930中經揭示且亦稱為Sp46。LytC在WO 98/18930中經揭示且亦稱為Sp91。彼家族之較佳成員為LytC。

另一較佳實施例為Lyt家族(尤其為LytA)截斷物,其中"Lyt"在上文中經定義且"截斷物"係指缺乏50%或50%以上膽鹼結合區之蛋白。較佳地,該等蛋白缺乏整個膽鹼結合區。

Sp125為具有LPXTG(其中X為任何胺基酸)細胞壁錨定(Cell Wall Anchored)基元之肺炎球菌表面蛋白之實例。已發現此類具有此基元之肺炎球菌表面蛋白中之任何蛋白在本發明之範圍內為可用的,且因此將其認為係本發明之另一蛋白。Sp125本身在WO 98/18930中經揭示且亦稱為ZmpB(鋅金屬蛋白酶)。

Sp101在WO 98/06734中經揭示,其中其具有參考號# y85993。其特徵為I型信號序列。

Sp133在WO 98/06734中經揭示,其中其具有參考號# y85992。其亦特徵為I型信號序列。

Sp128及Sp130在WO 00/76540中經揭示。

本發明中所用之蛋白較佳係選自PhtD、PhtA及PhtE或此等蛋白之2者或所有3者之組合(亦即PhtA+D、A+E、D+E或A+D+E)之群。

此外可包括之肺炎球菌蛋白抗原為由以下蛋白組成之群之一或多者:肺炎球菌溶血素(亦稱為Ply;較佳為藉由化學處理或突變經解毒)[WO 96/05859、WO 90/06951、WO 99/03884]、PsaA及其跨膜缺失變異體(Berry及Paton,Infect Immun 1996年12月;64(12):5255-62)、PspA及其跨膜缺失變異體(US 5804193、WO 92/14488、WO 99/53940)、PspC及其跨膜缺失變異體(WO 97/09994、WO 99/53940)、膽鹼結合蛋白(Cbp)家族之成員[例如CbpA及其跨膜缺失變異體(WO 97/41151、WO 99/51266)]、甘油醛-3-磷酸酯-脫氫酶(Infect.Immun.1996 64:3544)、HSP70(WO 96/40928)、PcpA(Sanchez-Beato等人FEMS Microbiol Lett 1998,164:207-14)、M類蛋白(SB專利申請案第EP 0837130號)及黏附素18627(SB專利申請案第EP 0834568號)。本發明亦包含該等蛋白之免疫功能均等物或截斷物(如上文所定義)。

關於膽鹼結合蛋白家族,彼家族之成員最初經鑑定為肺炎球菌蛋白,其可藉由膽鹼親和層析純化。膽鹼結合蛋白全部與細胞壁磷壁酸及膜相關脂磷壁酸之磷醯基膽鹼部分非共價鍵結合。雖然該等蛋白之確切性質(胺基酸序列、長度等)可變化,但在結構上其具有若干整個家族共有之區域。一般而言,膽鹼結合蛋白包含N末端區(N)、保守重複區(R1及/或R2)、脯胺酸富集區(P)及由多次重複組成之保守膽鹼結合區(C),其包含約一半蛋白。如此申請案中所用,術語"膽鹼結合蛋白家族(Cbp)"係選自由如WO 97/41151中所鑑定之膽鹼結合蛋白(PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD及CbpG)組成之群。CbpA在WO 97/41151中經揭示。CbpD及CbpG在WO 00/29434中經揭示。PspC在WO 97/09994中經揭示。PbcA在WO 98/21337中經揭示。較佳地,膽鹼結合蛋白係選自由CbpA、PbcA、SpsA及PspC組成之群。

若Cbp為所用之其他蛋白,則其可為Cbp截斷物,其中"Cbp"在上文中經定義且"截斷物"係指缺乏50%或50%以上膽鹼結合區(C)之蛋白。較佳地,該等蛋白缺乏整個膽鹼結合區。更佳地,該等蛋白截斷物缺乏(i)膽鹼結合區以及(ii)蛋白之N末端半部分,然而保留至少一個重複區(R1或R2)。更佳地,截斷物具有2個重複區(R1及R2)。該等較佳實施例之實例為如WO99/51266或WO99/51188中所述之NR1xR2、R1xR2、NR1xR2P及R1xR2P,然而缺乏類似膽鹼結合區之其他膽鹼結合蛋白亦涵蓋在本發明之範疇內。

Cbp截斷物-Lyt截斷物嵌合蛋白(或融合蛋白)亦可用在本發明之組合物中。較佳地,此蛋白包含Cbp之NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)及Lyt之C末端部分(Cterm,亦即缺乏膽鹼結合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更佳地,Cbp係選自由CbpA、PbcA、SpsA及PspC組成之群。更佳地,其為CbpA。較佳地,Lyt為LytC(亦稱為Sp91)。

亦可使用缺乏膽鹼結合域(C)且作為具有Lyt之融合蛋白表現之PspA或PsaA截斷物。較佳地,Lyt為LytC。

在肺炎球菌組合物中可組合本發明之不同肺炎球菌蛋白。較佳地,本發明之蛋白組合選自2個或2個以上(3個或4個)不同類型,諸如具有II型信號序列基元LXXC(其中X為任何胺基酸,例如聚組胺酸三聚體家族(Pht))之蛋白、膽鹼結合蛋白(Cbp)、具有I型信號序列基元之蛋白(例如Sp101)、具有LPXTG基元之蛋白(其中X為任何胺基酸,例如Sp128、Sp130)、毒素(例如Ply)等。此等類型(或基元)中之較佳實例為上文所述之蛋白或其免疫功能均等物。毒素+Pht、毒素+Cbp、Pht+Cbp及毒素+Pht+Cbp為較佳之類型組合。

較佳有益組合包括(但不限於)PhtD+NR1xR2、PhtD+NR1xR2-Sp91 Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NR1xR2、PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NR1xR2+LytC、NR1xR2+PspA、NR1xR2+PsaA、NR1xR2+Sp128、R1xR2+LytC、R1xR2+PspA、R1xR2+PsaA、R1xR2+Sp128、R1xR2+PhtD、R1xR2+PhtA。較佳地,NR1xR2(或R1xR2)來自CbpA或PspC。更佳地,其係來自CbpA。

肺炎球菌蛋白之尤其較佳組合包含Ply(或截斷物或其免疫功能均等物)+PhtD(或截斷物或其免疫功能均等物)視情況連同NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)。較佳地,NR1xR2(或R1xR2或NR1xR2P或R1xR2P)係來自CbpA或PspC。更佳地,其係來自CbpA。

抗原可為肺炎球菌醣結合物,其包含來自至少四個血清型、較佳為至少七個血清型、更佳為至少十個血清型及至少一個、但較佳為2、3或4個較佳為選自上文所述蛋白之群之肺炎鏈球菌蛋白的多醣抗原。較佳地,蛋白之一為PhtD(或其免疫功能均等物)及/或Ply(或其免疫功能均等物)。

與多醣方法接種相關之問題為多醣本身為不良免疫原。為克服此問題,可使醣類與提供旁觀者T細胞幫助之蛋白載體結合。因此較佳為本發明中所用之醣類與該蛋白載體相連。當前通常用於製造醣免疫原之該等載劑之實例包括Diphtheria及Tetanus類毒素(分別為DT、DT CRM197及TT)、匙孔血藍蛋白(KLH)、來自腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis )之OMPC及結核菌素(Tuberculin)之經純化蛋白衍生物(PPD)。

肺炎球菌醣基免疫原性組合物(或疫苗)之較佳載體為來自嗜血性流行性感冒桿菌(Haemophilus influenzae )(EP 594610-B)或其片段之蛋白D。適用之片段包括包含T輔助細胞抗原決定基之片段。詳言之,蛋白D片段將較佳含有蛋白之N末端1/3。蛋白D載體可用作其中多個肺炎球菌醣抗原結合之組合物中的載體。可有利地使組合中之一或多種肺炎球菌醣類結合至蛋白D上。

肺炎球菌醣之另一較佳載體為肺炎球菌蛋白本身(如上文在部分"本發明之肺炎球菌蛋白"中所定義)。

醣類可藉由任何已知方法與載體蛋白相連(例如由Likhite,美國專利第4,372,945號及由Armor等人,美國專利第4,474,757號)。較佳地,進行CDAP結合(WO 95/08348)。

較佳地,結合物之蛋白:醣(重量:重量)比為0.3:1至1:1、更佳為0.6:1至0.8:1且最佳為約0.7:1。

本發明之尤其較佳組合物包含一或多種結合型肺炎球菌醣類及一或多種本發明之肺炎球菌蛋白。

此外,肺炎球菌醣類及蛋白可作為以液體形式吸附至磷酸鋁上之本體組份穩定地儲存。

在本發明之另一態樣中,疫苗組合物可包含人類細胞巨大病毒(HCMV)抗原。HCMV為屬於疱疹病毒家族之人類DNA病毒且為新生兒先天缺陷之主要原因且亦在免疫功能不全之患者體內導致嚴重健康狀況(medical condition)。臨床疾病導致各種症狀,其包括發燒、肝炎、肺炎及傳染性單核細胞增多症(infectious mononucleosis)。

在一實施例中,HCMV抗原為嵌合融合蛋白或其免疫原性衍生物,其包含與部分HSV糖蛋白融合之部分HCMV糖蛋白。HCMV糖蛋白一般為gB,且HSV糖蛋白一般為gD、尤其為HSV 2型gD(gD2)。融合一般係在HCMV gB蛋白之一部分的N末端部分中之胺基酸與HSV gD蛋白之一部分的C末端處之胺基酸之間。融合蛋白之HCMV gB蛋白與HSV gD蛋白組份均可缺乏膜錨定域。

HCMV gB蛋白部分可包含非可分裂形式之HCMV gB。合適地,此蛋白可藉由改變蛋白分裂位點處之一或多個胺基酸(例如藉由分別用Arg458及Arg459交換Glu及Thr)來完成。HSV蛋白部分可包含gD2之信號序列(胺基酸1至25)及視情況gD2之胺基酸26至52及/或係PEDSALLEDPED或其功能均等物之來自gD2的序列,其可為較短或較長的。此外可(例如)在HCMV gB蛋白之C末端將來自HSV gD之序列添加至融合蛋白中。

在一實施例中,融合蛋白包含與HCMV gB蛋白之殘基28至685融合之HSV gD2蛋白之胺基酸1至52。該融合蛋白命名為HCMV gB685 。在另一實施例中,得自內部gD2序列之胺基酸序列PEDSALLEDPED可包括在蛋白HCMV gB685 之C末端以產生命名為HCMV gB685 之蛋白。WO 95/31555中更詳細地描述此等特異性融合蛋白。

適用作HCMV疫苗之另一免疫原為pp65,如WO 94/00150(City of Hope)中所述之HCMV基質蛋白。

在本發明之另一實施例中,免疫原性組合物含有得自被認為係造成人類生殖器疣之原因的人類乳頭狀瘤病毒(HPV)(HPV 6或HPV 11及其他HPV病毒)及/或造成子宮頸癌之HPV病毒(HPV16、HPV18及其他HPV病毒)的抗原或抗原製劑。

在一實施例中,預防或治療生殖器疣形式之組合物包含L1顆粒或衣殼體及包含一或多種選自HPV蛋白E1、E2、E5、E6、E7、L1及L2之抗原的融合蛋白。

在一實施例中,融合蛋白之形式為:如WO 96/26277中所揭示之L2E7及GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)中所揭示之蛋白D(1/3)-E7。

較佳之HPV子宮頸感染或癌症預防或治療組合物可包含HPV 16或18抗原。舉例而言,L1或L2抗原單體或L1或L2抗原一起作為病毒樣顆粒(VLP)存在或L1蛋白單獨存在於VLP或衣殼體結構中。該等抗原、病毒樣顆粒及衣殼體為本身已知的。參見(例如)WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792及WO93/02184。

可單獨或作為諸如E7、E2或較佳地例如E5之融合蛋白包括額外之早期蛋白;此情形之尤其較佳實施例包括一包含L1E7融合蛋白之VLP(WO 96/11272)。

在一實施例中,HPV 16抗原包含與蛋白D載體融合以形成來自HPV 16之蛋白D-E6或E7融合之早期蛋白E6或E7或其組合;或E6或E7與L2之組合(WO 96/26277)。

或者HPV 16或18早期蛋白E6及E7可存在於單分子、較佳為蛋白D-E6/E7融合中。該組合物可視情況含有來自HPV 18之E6及E7蛋白中之任一者或二者,其較佳為蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白形式。

本發明之組合物可額外包含來自其他HPV類型、較佳為來自HPV 31或33之抗原。

致癌HPV類型包括HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68。因此除了HPV 16及/或HPV 18之外,本發明之組合物可包含來自一或多種此等HPV類型之抗原。

可用於本發明中之HPV L1 VLP或衣殼體可包含全長L1或L1之免疫原性片段或由其組成。當VLP或衣殼體包含L1之免疫原性片段或由其組成時,則HPV L1之合適免疫原性片段包括L1之截斷、缺失、取代或插入變異體。合適地,該等免疫原性片段可產生免疫反應,該等免疫反應可識別來自自其中得到L1蛋白之HPV類型之L1蛋白(諸如病毒樣顆粒)。

合適免疫原性L1片段包括經截斷之L1蛋白。在一態樣中,截斷移除核定位信號。在另一態樣中截斷為C末端截斷。在另一態樣中,C末端截斷移除不到50個胺基酸,諸如不到40個胺基酸。當L1來自HPV 16時,則在另一態樣中C末端截斷自HPV 16 L1移除34個胺基酸。當L1來自HPV 18時,則在另一態樣中C末端截斷自HPV 18 L1移除35個胺基酸。

WO 06/114312中給出合適之經截斷HPV 16及18 L1序列。

HPV 16序列亦可為WO 9405792或US6649167中所揭示之(例如)經適當截斷之序列。如藉由序列比對所評價,合適截斷物在相當於上文所述之位置的位置處截斷。

替代之HPV 18序列在WO 9629413中經揭示,其可經適當截斷。如藉由序列比對所評價,合適截斷物在相當於上文所述之位置的位置處截斷。

其他HPV 16及HPV 18序列為此項技術中熟知的且可適於用在本發明中。

當存在來自另一HPV類型之L1蛋白時,則基於DNA或蛋白序列比對可使用對應於對HPV 16及HPV 18所進行之彼等C末端截斷者。WO 06/114312中給出HPV 31及45 L1蛋白之合適截斷。

如藉由序列比對所評價,在一將與上文所述之彼等相當之L1蛋白之C末端部分移除之態樣中,亦可進行(例如)HPV 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68之合適截斷。

本發明之L1蛋白或免疫原性片段可視情況為融合蛋白形式,諸如L1蛋白與L2或早期蛋白之融合。

HPV L1蛋白合適地為衣殼體或病毒樣顆粒(VLP)形式。在一態樣中HPV VLP可用在本發明中。HPV VLP及製造VLP之方法在此項技術中為熟知的。VLP一般係自病毒之L1及視情況L2結構蛋白建構,參見例如WO 9420137、US 5985610、WO 9611272、US 6599508B1、US 6361778B1、EP 595935。提供交叉保護之任何合適HPV VLP(諸如L1或L1+L2 VLP)可用在本發明中。

合適VLP為僅L1之VLP。

本發明之組合物可含有HPV 16L1 VLP及HPV 18 L1 VLP組合或來自HPV 16、18、31及45之HPV L1 VLP組合或較大之組合且包括HPV 16及18或HPV 16、18、31及45L1 VLP或較大組合,其中如本文所述L1視情況經截斷。

在本發明之一特定實施例中,一或多種來自致癌HPV類型之額外抗原與HPV 16及/或18抗原一起使用,該等抗原係選自以下HPV類型:HPV 31、45、33、58及52。如本文所述,在各狀況下抗原可為(例如)L1 VLP或衣殼體形式之L1。因此適用於本文所述之組合物、方法及用途中之HPV抗原可包含來自HPV 16、18、31、45、33、58及52之L1 VLP或衣殼體或由其組成。L1 VLP可為僅L1之VLP或為與另一抗原(諸如L1+L2 VLP中之L2)組合者。如本文所述L1蛋白可合適地經截斷。

VLP之形成可藉由標準技術(諸如電子顯微鏡及動態雷射光散射)來評價。

VLP可包含全長L1蛋白。如上文所述,在一態樣中用於形成VLP之L1蛋白為經截斷之L1蛋白。

VLP可在諸如酵母細胞或昆蟲細胞之任何合適細胞基質(例如)在桿狀病毒表現系統中製造,且製備VLP之技術在此項技術中為熟知的,諸如全部內容藉此以引用方式併入之WO 9913056、US 6416945B1、US 6261765B1及US 6245568及其中的參考文獻。

VLP可藉由拆分及重裝技術製造,其可提供多個穩定及/或均一之乳頭狀瘤VLP。舉例而言,McCarthy等人1998"Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Virus like Particles in Vitro"J.Virology 72(1):33-41描述自昆蟲細胞中純化之重組L1 HPV11 VLP之拆分及重裝以獲得VLP之均一製劑。WO 9913056及US 6245568亦描述製造HPV VLP之拆分/重裝法。

在一態樣中,如WO 9913056或US 6245568所述製造HPV VLP。

本發明之組合物可包含得自導致瘧疾(Malaria)之寄生蟲(諸如惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲(Plasmodium vivax))之抗原或抗原製劑。舉例而言,來自惡性瘧原蟲之可能抗原包括環子孢子蛋白(CS蛋白)、RTS,S MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1及TRAP。RTS為實質上包含惡性瘧原蟲(P.falciparum )之環子孢子(CS)蛋白之所有C末端部分的雜交蛋白,其經由B型肝炎表面抗原之preS2部分與B型肝炎病毒之表面(S)抗原相連。其完整結構在以編號WO 93/10152公佈之國際專利申請案第PCT/EP92/02591號中經揭示,該申請案主張英國專利申請案第9124390.7號之優先權。當RTS在酵母中表現時其以脂蛋白顆粒形式製造,且當其與HBV之S抗原共同表現時其產生稱為RTS,S之混合顆粒。TRAP抗原在以WO 90/01496所公開之國際專利申請案第PCT/GB 89/00895號中經描述。本發明之較佳實施例為瘧疾疫苗,其中抗原製劑包含RTS,S及TRAP抗原之組合。可能為多級瘧疾疫苗之組份之候選物的其他瘧原蟲抗原為惡性瘧原蟲MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白(Sequestrin)、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230及其瘧原蟲類似物。本發明之一實施例為包含RTS,S或CS蛋白或其片段(諸如與一或多種可選自由MSP1、MSP3、AMA1、LSA1或LSA3組成之群之其他瘧疾抗原組合之RTS,S之CS部分)之組合物。來自間日瘧原蟲之可能抗原包括環子孢子蛋白(CS蛋白)及Duffy抗原結合蛋白及其片段,諸如PvRII(參見例如WO 02/12292)。

可用於本發明之免疫原性組合物之其他可能抗原包括:諸如來自A群鏈球菌或B群鏈球菌之鏈球菌抗原,抗原合適地係得自HIV-1(諸如gag或其諸如p24、tat、nef、gp120或gp160之片段或此等片段之任一者之片段)、人類疱疹病毒(諸如gD或其衍生物)或迅早期蛋白(Immediate Early protein)(諸如來自HSV1或HSV2之ICP27)、細胞巨大病毒((尤其為人類)(諸如gB或其衍生物)、輪狀病毒(Rotavirus)(包括活的經減毒之病毒)、伊波病毒(Epstein Barr virus)(諸如gp350或其衍生物)、水痘帶狀疱疹病毒(諸如gpI、II及IE63))或肝炎病毒(諸如B型肝炎病毒(例如B型肝炎表面抗原或其衍生物)、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒及E型肝炎病毒)或其他病毒性病原體(諸如副黏病毒(paramyxoviruses):呼吸道融合病毒(Respiratory Syncytial virus)(諸如F、N及G蛋白或其衍生物)、副流行性感冒病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類乳頭狀瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)、黃病毒(例如黃熱病病毒、登革病毒、蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、日本腦炎病毒)或流行性感冒病毒(完整之活的或經滅活病毒、在卵或MDCK細胞中生長之裂解流行性感冒病毒或完整流行性感冒病毒顆粒(如R.Gluck,Vaccine,1992,10,915-920所述)或其經純化或重組之蛋白,諸如HA、NP、NA或M蛋白或其組合))或得自細菌性病原體,諸如奈瑟菌種(Neisseria spp),其包括淋病菌(N.gonorrhea)及腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)(例如莢膜醣類及其結合物、轉鐵蛋白結合蛋白、乳鐵傳遞蛋白結合蛋白、PilC、黏附素);化膿性鏈球菌(S.pyogenes )(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、無乳鏈球菌(S.agalactiae )、變形鏈球菌(S.mutans );杜克雷嗜血桿菌(H.ducreyi );莫拉菌種(Moraxella spp ),其包括亦稱為黏膜布蘭漢菌(Branhamella catarrhalis )之黏膜莫拉菌(M catarrhalis )(例如高及低分子量黏附素及侵襲素);博德特菌種(Bordetella spp),包括百日咳博德特菌(例如百日咳桿菌黏附素(pertactin)、百日咳毒素或其衍生物、纖維性血球凝集素、腺苷酸環化酶、菌毛)、副百日咳博德特菌及支氣管炎博德特菌;分枝桿菌種(Mycobacterium spp ),包括結核分歧桿菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝桿菌(M.bovis )、麻風分枝桿菌(M.leprae )、M.avium、副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis )、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis );軍團桿菌種(Legionella spp ),包括嗜肺性軍團桿菌(L.pneumophila );埃希菌(Escherichia spp ),包括產腸毒素大腸埃希菌菌(enterotoxic E.coli )(例如定居因子、熱不穩定毒素或其衍生物、熱穩定毒素或其衍生物)、腸出血性大腸埃希菌(enterohemorragicE.coli )、腸致病性大腸埃希菌(enteropathogenicE.coli )(例如shiga類毒素毒素或其衍生物);弧菌種(Vibrio spp ),包括霍亂弧菌(V.cholera )(例如霍亂毒素或其衍生物);志賀氏菌種(Shigella spp),包括宋內氏志賀菌(S.sonnei )、痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae )、福氏志賀氏菌(S.flexnerii );耶爾森菌種(Yersinia spp ),包括小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis )、結核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis );彎曲桿菌種(Campylobacter spp ),包括空腸彎麴菌(C.jejuni )(例如毒素、黏附素及侵襲素)及大腸彎麴菌(C.coli) ;沙門氏菌種(Salmonella spp ),包括傷寒沙門氏菌(S.typhi )、副傷寒沙門菌(S.paratyphi )、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis )、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis );李斯特菌種(Listeria spp. ),包括單核增生李斯特菌(L.monocytogenes );螺桿菌種(Helicobacter spp ),包括幽門螺桿菌(H.pylori )(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素);假單胞菌(Pseudomonas spp ),包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa );葡萄球菌種(Staphylococcus spp. ),包括金黃色葡萄球菌(S.aureus )、表皮葡萄球菌(S.epidermidis );腸球菌種(Enterococcus spp. ),包括糞腸球菌(E.faecalis )、尿腸球菌(E.faecium );梭菌種(Clostridium spp. ),包括破傷風梭菌(C.tetani)(例如破傷風毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum )(例如肉毒梭菌毒素及其衍生物)、艱難梭菌(C.difficile )(例如梭菌毒素A或B及其衍生物);芽胞桿菌種(Bacillus spp. ),包括炭疽芽胞桿菌(B.anthracis )(例如肉毒毒素及其衍生物);棒狀桿菌種(Corynebacterium spp. ),包括白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae )(例如白喉毒素及其衍生物);疏螺旋體菌(Borrelia spp. ),包括伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi )(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、伽氏疏螺旋體(B.garinii )(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、萊姆病螺旋體(B.afzelii )(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、安氏螺旋體(B.andersonii )(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫姆斯疏螺旋體(B.hermsii );艾利希體種(Ehrlichia spp. ),包括馬埃立克體(E.equi )及人粒細胞埃立克體病之試劑;立克次體種(Rickettsia spp ),包括立氏立克次體(R.rickettsii);披衣菌種(Chlamydia spp.),包括沙眼衣原體(C.trachomatis )(例如MOMP,肝素結合蛋白)、肺炎披衣菌(C.pneumoniae )(例如MOMP、肝素結合蛋白)、鸚鵡熱披衣菌(C.psittaci );鉤端螺旋菌種(Leptospira spp. ),包括問號狀鉤端螺旋菌(L.interrogans );密螺旋體種(Treponema spp. ),包括梅毒螺旋體(T.pallidum )(例如稀有外膜蛋白)、齲垢密螺旋體(T.denticola )、豬痢疾密螺旋體(T.hyodysenteriae );或得自寄生蟲,諸如:瘧原蟲種,包括惡性瘧原蟲;弓形蟲種(Toxoplasma spp ),包括龔地弓形蟲(T.gondii )(例如SAG2、SAG3、Tg34 );內阿米巴種(Entamoeba spp. ),包括痢疾阿米巴(E.histolytica );焦蟲種(Babesia spp. ),包括田鼠焦蟲(B.microti );錐蟲種(TrypanoSoma spp. ),包括克氏錐蟲(T.cruzi );梨形蟲種(Giardia spp. ),包括藍氏梨形蟲(G.lamblia );利什曼原蟲種(Leshmania spp. ),包括碩大利什曼原蟲(L.major );肺囊蟲種(Pneumocystis spp. ),包括卡氏肺囊蟲(P.carinii );滴蟲種(Trichomonas spp. ),包括陰道滴蟲(T.vaginalis );血吸蟲種(Schisostoma spp. ),包括曼氏血吸蟲(S.mansoni )或得自酵母,諸如:假絲酵母菌種(Candida spp. ),包括白色假絲酵母菌(C.albicans );隱球菌種(Cryptococcus spp. ),包括新生隱球菌(C.neoformans )。

結核分歧桿菌之其他較佳特異性抗原為(例如)Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2及hTCC1(WO 99/51748)。結核分歧桿菌之蛋白亦包括其中至少兩個、較佳為三個結核分歧桿菌多肽融合至較大蛋白中之融合蛋白及其變異體。較佳融合包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748)。可提及之特定Ra12-Tbh9-Ra35序列可藉由WO 2006/117240之SEQ ID No 6連同其中該序列之Ser 704經突變成除絲胺酸之外(例如)Ala之變異體及其結合適當長度之N末端His標籤之衍生物(例如WO 2006/117240之SEQ ID No 2或4)定義。批衣菌種(例如沙眼衣原體)之例示性抗原係選自CT858、CT089、CT875、MOMP、CT622、PmpD、PmpG及其片段、SWIB及其任一者之免疫原性片段(諸如PmpDpd及PmpGpd)及其組合。抗原之較佳組合包括CT858、CT089及CT875。可使用之特定序列及組合在WO 2006/104890中經描述。較佳之細菌組合物包含得自嗜血桿菌種(Haemophilus spp.)(包括B型流行性感冒嗜血桿菌(例如PRP及其結合物)、非分型流行性感冒嗜血桿菌(例如OMP26、高分子量黏附素)、P5、P6、蛋白D及脂蛋白D)之抗原及絲束蛋白及絲束蛋白產生之肽(US 5,843,464)或其多複本變異體或融合蛋白。

B型肝炎表面抗原之衍生物在此項技術中為熟知的且包括尤其為歐洲專利申請案EP-A-414 374、EP-A-0304 578及EP 198-474中所述之彼等PreS1、PreS2 S抗原。在一較佳態樣中,本發明之疫苗調配物在CHO細胞中表現時尤其包含HIV-1抗原(gp120)。在另一實施例中,本發明之組合物包含如上文所定義之gD2t。

組合物亦可含有抗腫瘤抗原且可用於免疫治療性治療癌症。舉例而言,抗原可為腫瘤排斥抗原,諸如用於前列腺癌(prostrate)、乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌或黑素瘤癌。例示性抗原包括MAGE 1、3及MAGE 4或諸如WO 99/40188中所揭示之其他MAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(亦稱為NY Eos 1)SAGE及HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins及Kawakami,1996,Current Opinions in Immunology 8,第628-636頁;Van den Eynde等人,International Journal of Clinical & Laboratory Research(submitted 1997);Correale等人(1997),Journal of the National Cancer Institute 89,第293頁)。此等抗原的確在廣範圍腫瘤類型(諸如黑素瘤、肺癌、肉瘤及膀胱癌)中表現。

用於本發明中之MAGE抗原可作為具有表現強化子或免疫融合搭配物之融合蛋白表現。詳言之,Mage蛋白可與來自B型流行性感冒嗜血桿菌或其脂質化衍生物之蛋白D融合。詳言之,融合搭配物可包含蛋白D之最初1/3。該等結構在WO 99/40188中經揭示。

其他腫瘤特異性抗原包括(但不限於)KSA(GA733)腫瘤特異性神經結醣脂(諸如GM 2及GM3)或其與載體蛋白之結合物;或該抗原可為自肽激素,諸如全長促腺激素激素釋放激素(GnRH,WO 95/20600),其為可用於治療許多癌症或免疫去勢中之短的10個胺基酸長之肽。

在一較佳實施例中,利用前列腺抗原,諸如前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS 95(4)1735-1740 1998)、PSMA或稱為前列腺酶(Prostase)之抗原。

前列腺酶為前列腺特異性絲胺酸蛋白酶(類胰蛋白酶),其為254個胺基酸長,具有保守絲胺酸蛋白酶催化三聚體H-D-S及胺基末端先前肽序列,顯示潛在之分泌功能(P.Nelson,Lu Gan,C.Ferguson,P.Moss,R.Gelinas,L.Hood及K.Wand,"Molecular cloning and characterisation of prostase,an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression,In Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96,3114-3119)。已描述假定之醣基化位點。所預測之結構與其他已知絲胺酸蛋白酶極類似,表明成熟多肽折疊成單域。成熟蛋白為224個胺基酸長,其具有一個經證實為經天然處理之A2抗原決定基。

前列腺酶核苷酸序列及推斷之多肽序列及同系物在以下文獻中經揭示:Ferguson,等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,3114-3119)及國際專利申請案第WO 98/12302號(及此外相應之經授權專利US 5,955,306)、WO 98/20117(及此外相應之經授權專利US 5,840,871及US 5,786,148)(前列腺特異性胰舒血管素)及WO 00/04149(P703P)。

本發明提供包含基於前列腺酶蛋白之前列腺酶蛋白融合物及其片段及同系物("衍生物")之組合物。該等衍生物適用於適合治療前列腺腫瘤之治療性疫苗調配物中。如上述所參考之專利及專利申請案中所揭示,片段一般將含有至少20個、較佳為50個、更佳為100個鄰接之胺基酸。

另一較佳之前列腺抗原稱為P501S(WO 98/37814之序列ID號113)。如上述所參考之專利申請案中所揭示,其免疫原性片段及部分包含至少20個、較佳為50個、更佳為100個鄰接之胺基酸。參見(例如)PS108(WO 98/50567)。

其他前列腺特異性抗原自WO 98/37418及WO/004149已知。另一前列腺特異性抗原為STEAP PNAS 96 14523 145287-121999。

可用於本發明之範圍中之其他腫瘤相關抗原包括:Plu-1(J Biol.Chem 274(22)15633-15645,1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto(Salomon等人Bioessays 199,21 61-70、美國專利第5654140號)、Criptin(美國專利第5 981 215號)。此外,與治療癌症尤其有關之抗原亦包含酪胺酸酶及生存蛋白(survivin)。

黏蛋白產生之肽(諸如Muc1),參見(例如)US 5,744,144、US 5,827,666、WO 8805054、US 4,963,484。特定言之,涵蓋Muc 1產生之肽,其包含至少一個Muc 1肽之重複單元、較佳為至少兩個該等重複且其由SM3抗體識別(US 6 054 438)。其他黏蛋白產生之肽包括得自Muc 5之肽。

本發明之抗原可為諸如her 2/Neu之乳癌抗原、乳腺球蛋白(美國專利第5668267號)或WO/00 52165、WO 99/33869、WO 99/19479、WO 98/45328中所揭示之彼等抗原。Her 2 neu抗原尤其在美國專利第5,801,005號中經揭示。較佳地,Her 2 neu包含整個胞外域(包含約1-645個胺基酸)或其片段及至少一部分或整個胞內域(約為C末端580個胺基酸)。詳言之,胞內部分應包含磷酸化結構域或其片段。該等結構在WO 00/44899中經揭示。尤其較佳之結構稱為ECD PD,第二者稱為ECD PD,參見WO/00/44899。如本文所用之her 2 neu可得自大鼠、小鼠或人類。

組合物可含有與腫瘤維持機制(例如血管生成、腫瘤入侵)相關之抗原,例如tie 2、vEGF。

預見本發明之組合物可使用得自疏螺旋體菌種之抗原。舉例而言,抗原可包括核酸、得自抗原或抗原製劑之病原體、重組製造之蛋白或肽及嵌合之融合蛋白。詳言之,抗原為OspA。OspA可為具有所述宿主細胞(E.Coli)優點之脂質化形式的完全成熟蛋白(Lipo-OspA)或非脂質化衍生物。該等非脂質化衍生物包括非脂質化NS1-OspA融合蛋白,其具有流行性感冒病毒之非結構蛋白(NS1)之最初81個N末端胺基酸及完整之OspA蛋白,及另一者(MDP-OspA),其為攜帶3個額外N末端胺基酸之非脂質化形式OspA。

本發明之組合物可用於預防或治療過敏症。該等疫苗將包含過敏原特異性(例如Der p1)及過敏原非特異性抗原(例如得自人類IgE之肽,其包括(但不限於)史坦沃斯(stanworth)十肽(EP 0 477 231 B1))。

本發明之組合物亦可用於預防或治療除了過敏症、癌症或傳染性疾病之外的慢性病症。該等慢性病症為諸如動脈粥樣硬化及阿茲海默症(Alzheimer)之疾病。

本發明之組合物尤其適於免疫治療性治療諸如慢性病況及癌症之疾病,但亦適於治療持續感染。因此,本發明之組合物尤其適於免疫治療傳染性疾病,諸如肺結核(TB)、AIDS及B型肝炎(HepB)病毒感染。

同樣,在AIDS範圍中提供一種治療易感染或正罹患AIDS之個體的方法。該方法包含對該個體投與本發明之疫苗,藉此降低由隨後之HIV感染所引起之CD4+ T細胞減少之量或減緩或防止已感染HIV之個體體內CD4+ T細胞減少。

除了上文所述之肺炎球菌抗原之外,其他抗原包括細菌(較佳為莢膜)醣。多醣抗原便利地儲存在吸附至磷酸鋁上之液體本體中-因此藉由將該液體本體與本發明之佐劑即時混雜直接產生本發明之疫苗組合物。較佳地,其他細菌醣係選自由以下醣組成之群:腦膜炎奈瑟菌血清群A莢膜醣(MenA)、腦膜炎奈瑟菌血清群C莢膜醣(MenC)、腦膜炎奈瑟菌血清群Y莢膜醣(MenY)、腦膜炎奈瑟菌血清群W-135莢膜醣(MenW)、B群鏈球菌I群莢膜醣、B群鏈球菌II群莢膜醣、B群鏈球菌III群莢膜醣、B群鏈球菌IV群莢膜醣、B群鏈球菌V群莢膜醣、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )5型莢膜醣、金黃色葡萄球菌8型莢膜醣、來自傷寒沙門菌(Salmonella typhi )之Vi醣、腦膜炎奈瑟菌LPS、黏膜莫拉菌(M.catarrhalis )LPS及流行性感冒嗜血桿菌LPS。藉由LPS意謂天然脂多醣(或脂寡醣)或其中脂質A部分已藉由大量已知方法之任一者解毒之脂多醣(參見(例如)WO 97/18837或WO 98/33923),或包含得自該LPS之O-多醣之任何分子。藉由腦膜炎奈瑟菌LPS意謂12種已知免疫型(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11或L12)之一或多者。

尤其較佳之組合物為包含以下組份之組合物:1)結合型Hib、結合型MenA及結合型MenC;2)結合型Hib、結合型MenY及結合型MenC;3)結合型Hib及結合型MenC;及4)結合型MenA、結合型MenC、結合型MenY及結合型MenW-135。上述結合物各自中之PS量可為每0.5 mL人類劑量5或10 g。較佳地,Hib、MenA、MenC、MenW-135及MenY為TT結合物。

與多醣方法接種相關之問題為多醣本身為不良免疫原。為克服此問題,可使本發明之醣類與提供旁觀者T細胞幫助之蛋白載體結合。因此較佳的為本發明中所用之醣類係與該蛋白載體相連。當前通常用於製造醣免疫原之該等載體之實例包括Diphtheria及Tetanus類毒素(分別為DT、DT CRM197及TT)、匙孔血藍蛋白(KLH)、來自流行性感冒嗜血桿菌(EP 594610-B)蛋白D、來自腦膜炎奈瑟菌之OMPC及結核菌素之經純化蛋白衍生物(PPD)。

醣類可藉由任何已知方法與載體蛋白相連(例如由Likhite,美國專利第4,372,945號及由Armor等人,美國專利第4,474,757號)。較佳地,進行CDAP結合(WO 95/08348)。

較佳地,結合物之蛋白:醣(重量:重量)比為0.3:1至1:1、更佳為0.6:1至0.8:1且最佳為約0.7:1。

本發明中包括提供保護以防止肺炎球菌及不同病原體之抗原的組合。現在許多兒科疫苗係作為組合疫苗給出以減少兒童必需接受之注射數。因此對於兒科疫苗而言,可將來自其他病原體之其他抗原與本發明之肺炎鏈球菌疫苗一起調配。舉例而言,本發明之疫苗可與熟知之"三價"組合疫苗或與例如由SmithKlineBeecham Biologicals s.a.銷售之全細胞百日咳組份(如TritanrixT M )一起調配(或可在相同時間單獨投與),該組合疫苗包含白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)及百日咳組份[一般為具有可選之百日咳桿菌黏附素(pertactin)(PRN)及/或凝集素1+2之經解毒百日咳類毒素(PT)及纖維性血球凝集素(FHA)],例如所銷售之疫苗INFANRIX-DTPaT M (SmithKlineBeecham Biologicals),其含有DT、TT、PT、FHA及PRN抗原。組合疫苗亦可包含其他抗原,諸如B型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰質炎病毒抗原(例如經滅活之三價脊髓灰質炎病毒-IPV)、黏膜炎莫拉氏菌外膜蛋白、非分型流行性感冒嗜血桿菌蛋白、腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白。

組合疫苗(尤其為用於預防中耳炎之疫苗)中可包括之較佳黏膜炎莫拉氏菌蛋白抗原之實例為:OMP106[WO 97/41731(Antex)及WO 96/34960(PMC)]、OMP21、LbpA及/或LbpB[WO 98/55606(PMC)]、TbpA及/或TbpB[WO 97/13785及WO 97/32980(PMC)]、CopB[Helminen ME等人(1993)Infect.Immun.61:2003-2010]、UspA1及/或UspA2[WO 93/03761(University of Texas)]、OmpCD、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ(PCT/EP99/03823)、OMP85(PCT/EP00/01468)、lipo06(GB 9917977.2)、lipo10(GB 9918208.1)、lipo11(GB 9918302.2)、lipo18(GB 9918038.2)、P6(PCT/EP99/03038)、D15(PCT/EP99/03822)、OmplA1(PCT/EP99/06781)、Hly3(PCT/EP99/03257)及OmpE。組合疫苗(尤其為用於預防中耳炎之疫苗)中可包括之不可分類之流行性感冒嗜血桿菌抗原之實例包括:絲束蛋白[(US 5766608-Ohio State Research Foundation)]及融合物,該融合物包含其肽[例如LB1(f)肽融合物;US 5843464(OSU)或WO 99/64067]、OMP26[WO 97/01638(Cortecs)]、P6[EP 281673(State University of New York)]、TbpA及/或TbpB、Hia、Hsf、Hin47、Hif、Hmw1、Hmw2、Hmw3、Hmw4、Hap、D15(WO 94/12641)、蛋白D(EP 594610)、P2及P5(WO 94/26304)。

所涵蓋之其他組合為本發明之肺炎球菌及蛋白與來自以下疾病之病毒抗原的組合:(例如)流行性感冒(經減毒、裂解或亞單位[例如表面醣蛋白神經胺酸酶(NA)及血球凝集素(HA),參見(例如)Chaloupka I.等人,Eur.Journal Clin.Microbiol.Infect.Dis.1996,15:121-127])、RSV(例如F及G抗原或F/G融合物,參見(例如)Schmidt A.C.等人,J Virol,2001年5月,第4594-4603頁)、PIV3(例如HN及F蛋白,參見Schmidt等人,上述)、水痘(例如經減毒者,醣蛋白I-V等)及MMR(麻疹、腮腺炎、風疹)之任何(或所有)組份。

用於全球治療或預防中耳炎之本文所涵蓋之較佳兒科組合疫苗包含:一或多種肺炎鏈球菌醣抗原(較佳為與蛋白D結合)、一或多種肺炎球菌蛋白(較佳為上文所述之彼等肺炎球菌蛋白)及一或多種來自黏膜炎莫拉氏菌及/或非分型流行性感冒嗜血桿菌之表面暴露抗原。蛋白D可有利地用作肺炎球菌醣類(如上文所述)之蛋白載體,且因為其本身為可產生B細胞介導之保護免於抗非分型流行性感冒嗜血桿菌(ntHi)侵襲的抗原。黏膜炎莫拉氏菌或非分型流行性感冒嗜血桿菌抗原可以亞單位形式包括在疫苗中或可作為存在於自細菌製成之外膜囊(泡)之表面上的抗原添加。

本發明之用於接種之免疫原性組合物之免疫性質在本發明中,與用不含佐劑(亦即不含有任何外源佐劑)之相應組合物(本文中亦稱為"普通組合物")所獲得之CD4 T細胞免疫反應相比,免疫原性組合物較佳可誘發對抗組份抗原或抗原組合物之至少一者之改良CD4 T細胞免疫反應。在一特定實施例中,當免疫原性組合物為流行性感冒組合物且流行性感冒疫苗製劑來自若干流行性感冒病毒株(其中之一為泛流行病病毒株)時,該改良之CD4 T細胞免疫反應對抗泛流行流行性感冒病毒株。

藉由"改良之CD4 T細胞免疫反應"意謂在哺乳動物體內與投與不含佐劑之相同組合物後所獲得之反應相比,投與含佐劑免疫原性組合物之後獲得較高CD4反應。舉例而言,在人類患者體內與投與包含不含佐劑流行性感冒病毒或其抗原製劑之免疫原性組合物之後所誘發之反應相比,投與包含流行性感冒病毒或其抗原製劑連同本發明之佐劑的免疫原性組合物後獲得較高CD4 T細胞反應。該調配物將有利地用於誘發可偵測由MHC II類分子所表示之流行性感冒抗原決定基的抗流行性感冒CD4-T細胞反應。

詳言之(但不排他地),該"改良之CD4 T細胞免疫反應"在免疫學上未預致敏之患者(亦即對該流行性感冒病毒或抗原為血清反應陰性之患者)體內獲得。此血清反應陰性可為從未遇到該病毒或抗原之患者(所謂的"未感染"患者)或曾經遇到該抗原時未能對其起反應之患者的結果。在一特定態樣中,在諸如老年人(一般為65歲或65歲以上)或具有高風險健康狀況比65歲年輕之成人("高風險"成人)或兩歲以下兒童之免疫功能不全受檢者體內獲得該CD4 T細胞免疫反應。

改良之CD4 T細胞免疫反應可藉由量測製造任何以下細胞因子之細胞的數量來評價:.製造至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)之細胞.製造至少CD40L及另一細胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)之細胞.製造至少IL-2及另一細胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)之細胞.製造至少IFNγ及另一細胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)之細胞.製造至少TNFα及另一細胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)之細胞

當與投與不含佐劑組合物相比投與含佐劑組合物之後製造上述細胞因子之任一者之細胞將為較大量時,則將存在改良之CD4 T細胞免疫反應。一般地,將滿足上文所述五個條件中至少一個、較佳為兩個。在一特定實施例中,與不含佐劑組相比,含佐劑組中製造全部四種細胞因子之細胞將以較高量存在。

由本發明之含佐劑流行性感冒組合物所賦予之經改良CD4 T細胞免疫反應可理想地在一單獨投藥後獲得。在(例如)迅速發展之疾病爆發狀況中單獨劑量法將極其恰當。在某些情況下、尤其對於老年人群而言或在初次對抗流行性感冒接種之幼童(低於9歲)之狀況下或在泛流行病之狀況下,因此投與兩劑量相同組合物為有益的。第二劑量該相同組合物(仍將其視作"用於初次接種之組合物")可在進行之初次免疫反應期間投與且經充足間隔投與。一般地,在第一劑量後數週或約一個月(例如2週、3週、4週、5週或6週)給予第二劑量組合物以幫助預致敏無反應或不良反應之個體體內的免疫系統。

在另一實施例中,與用不含佐劑組合物免疫之個體內所誘發之B記憶細胞反應相比,投與該免疫原性組合物在投與含佐劑免疫原性組合物之患者體內誘發改良之B記憶細胞反應。如藉由刺激活體外分化所量測,改良之B記憶細胞反應意欲意謂遇到抗體時周邊血液B淋巴細胞可分化成分泌抗體之血漿細胞的較高頻率。

在另一實施例中,與用不含佐劑組合物免疫之個體體內所誘發之體液反應相比,投與該免疫原性組合物在投與含佐劑免疫原性組合物之患者體內誘發改良之體液反應。該體液免疫反應可根據實例I中及尤其為部分I.1(I.1.1)、I.2(I.2.1)及I.3(I.3.5.2)中所詳述之程序之任一者量測。當免疫原性組合物為流行性感冒組合物時,特別地獲得對抗同源及異源病毒株之該體液反應。詳言之,該異源體液免疫反應意謂流行性感冒病毒株之間的體液反應且稱為"交叉反應性"體液免疫反應。該"交叉反應性"體液免疫反應包含誘發對抗係用於接種之流行性感冒病毒株之變異體(漂移物)之流行性感冒病毒株的反應。該反應之實例在實例III.3.1及圖2中經說明。

在一特定實施例中,與用不含佐劑(亦即不含任何外源性佐劑)相應組合物(本文中亦稱為"普通組合物")所獲得之免疫反應相比,投與該含佐劑免疫原性組合物誘發以下反應中之至少二者:對抗組份抗原或抗原製劑之至少一者的(i)改良CD4 T細胞免疫反應、(ii)改良B記憶細胞反應、(iii)改良體液反應。

在另一特定實施例中,以用於初次接種、含佐劑組合物接種對CD8反應無可量測之影響。

本發明之一特定實施例為包含流行性感冒病毒或與以脂質體形式存在之皂素佐劑、尤其為其經膽固醇抑止形式之QS21皂素一起調配之其抗原製劑的組合物有效於促進免疫功能不全人群體內的T細胞反應。在一實施例中,該佐劑進一步包含3D-MPL。詳言之,如藉由人類老年群體體內對抗流行性感冒再接種後流行性感冒疫苗保護之相關物所評價,投與單獨劑量之如本發明中所述之用於初次接種之免疫原性組合物可提供比經不含佐劑流行性感冒疫苗接種好的血清保護。與不含佐劑調配物所獲得之CD4 T細胞免疫反應相比,所主張之含佐劑調配物亦已可誘發對抗流行性感冒病毒之改良CD4 T細胞免疫反應。與流行性感冒抗原暴露相比,此發現可與接種或感染時增加之反應相關。此外,此亦可與交叉反應相關,亦即對抗變異流行性感冒病毒株反應之能力。此改良之反應在諸如老年群體(65歲或65歲以上)之免疫功能不全人群體內及尤其為高風險老年群體體內可尤其有益。此可導致總發病率及死亡率降低且預防由於肺炎及其他流行性感冒類疾病之緊急入院。此亦可有益於嬰兒群體(5歲以下、較佳為2歲以下)。此外,其可誘發CD4 T細胞反應,其與用不含佐劑調配物誘發之反應相比在時間上更持久,例如在初次接種後一年仍然存在。

在一特定態樣中,CD4 T細胞免疫反應(諸如未預致敏之受檢者體內所獲得之改良CD4 T細胞免疫反應)包含誘發交叉反應性之CD4 T輔助細胞反應。詳言之,交叉反應性之CD4 T細胞的量增加。藉由"交叉反應性之"CD4反應意謂靶向流行性感冒病毒株之間的共享抗原決定基之CD4 T細胞。

通常,可用之流行性感冒疫苗僅有效於對抗感染具有類似抗原特徵之血球凝集素的流行性感冒病毒株。當感染(傳播)中之流行性感冒病毒已經歷表面醣蛋白、尤其為血球凝集素之微小變化(諸如導致胺基酸變化之點突變或點突變積聚)時(抗原漂移變異體病毒株),疫苗仍可提供一些保護,雖然其因為新產生之變異體可逃避先前流行性感冒感染或接種所誘發之免疫性而僅可提供有限之保護。抗原漂移係造成在兩次流行病爆發之間的時期出現之年度泛流行病的原因(Wiley及Skehel,1987,Ann.Rev.Biochem.56,365-394)。誘發交叉反應性CD4 T細胞對本發明之組合物提供額外優點,因為其亦可提供交叉保護,換言之提供對抗異源感染(亦即由係免疫原性組合物中所含之流行性感冒病毒株變異體(例如漂移物)之傳播中流行性感冒病毒株所引起的感染)之保護。當傳播中之病毒株難以在卵中繁殖或在細胞培養物中製造時此可為有利的,因而將漂移病毒株用作起作用之替代物。此在受檢者隔數月或一年接受第一及第二次接種時亦可為有利的,且用於第二次接種之免疫原性組合物中之流行性感冒病毒株為用於第一次接種之組合物中所用之病毒株之漂移變異病毒株。

因此如本文所定義之含佐劑流行性感冒免疫原性組合物在經接種之老年受檢者體內具有較高之誘發血清保護及交叉反應性CD4 T細胞的能力。此特徵可與反應對抗存在於免疫原性組合物中病毒株之變異病毒株的能力相關。在泛流行病狀況下此可證明為一重要優點。舉例而言,包含H5、H2、H9、H7或H6病毒株中任一者或數者之多價流行性感冒免疫原性組合物可在隨後用該漂移病毒株接種或經該漂移病毒株感染後提供較高之反應對抗泛流行病變異體(亦即該(等)泛流行病病毒株之漂移病毒株)的能力。

用流行性感冒疫苗接種後偵測交叉反應性CD4 T細胞

在本文獻中已將可識別同源及漂移流行性感冒病毒株之CD4 T細胞稱為"交叉反應性的"。如本文所述之含佐劑流行性感冒組合物已可展示異源亞型交叉反應性,因為存在可觀測之對抗漂移流行性感冒病毒株之交叉反應性。如上文所述,可證明泛流行病疫苗調配物有效對抗漂移泛流行病病毒株之能力為泛流行病之狀況下的重要特徵。

與上述觀測結果一致,已在人體內識別由不同流行性感冒病毒株共享之CD4 T細胞抗原決定基(Gelder C等人1998,Int Immunol.10(2):211-22;Gelder CM等人1996 J Virol.70(7):4787-90;Gelder CM等人1995 J Virol.1995 69(12):7497-506)。

在一特定實施例中,含佐劑組合物可呈現提供對抗傳播中病毒株之較佳保護之額外益處,該等傳播中之病毒株已經歷血球凝集素之主要變化(諸如兩個不同物種之間的基因重組)(抗原漂移),當前可用之疫苗對該等傳播中之病毒株無功效。

再接種及用於再接種之組合物(輔助組合物)

在一實施例中,本發明提供流行性感冒病毒或其抗原製劑供製造用於再接種先前經如本文所主張之免疫原性組合物接種之人類之免疫原性組合物的用途。

在本發明之一態樣中,提供來自第一泛流行流行性感冒病毒株之流行性感冒病毒或其抗原製劑之用途,其係用於製造如本文中所定義之含佐劑免疫原性組合物以防由該第一流行性感冒病毒株之變異體之流行性感冒病毒株所導致的流行性感冒感染。

在另一態樣中,本發明提供流行性感冒病毒或其抗原製劑之用途,其係用於製造供再接種先前經如本文所主張之含佐劑流行性感冒組合物或經包含變異流行性感冒病毒株之含佐劑流行性感冒組合物接種之人類的流行性感冒免疫原性組合物,該佐劑如本文中所定義。

在另一態樣中,本發明提供一種接種人群或個體對抗一種流行性感冒病毒菌株接著再接種該人或群體對抗變異流行性感冒病毒株之方法,該方法包含對該人投與(i)包含流行性感冒病毒或來自第一流行性感冒病毒株之其抗原製劑及如本文所定義之佐劑的第一組合物及(ii)包含該第一流行性感冒病毒株之流行性感冒病毒株變異體的第二免疫原性組合物。在一特定實施例中,該第一病毒株與泛流行病爆發有關或具有與泛流行病爆發有關之潛力。在另一特定實施例中,該變異病毒株與泛流行病爆發有關或具有與泛流行病爆發有關之潛力。詳言之,用包含至少一種作為傳播中之泛流行病病毒株之病毒株的流行性感冒組合物進行再接種。預致敏組合物及輔助組合物均可為多價的,亦即可含有至少兩種流行性感冒病毒株。當組合物為多價時,至少一種病毒株與泛流行病爆發有關或具有與泛流行病爆發有關之潛力。

一般地,在初次接種後至少6個月、較佳為8至14個月、更佳為約10至12個月進行再接種。

用於再接種之免疫原性組合物(輔助組合物)可含有任何類型(經滅活或活的經減毒)之抗原製劑。其可含有相同類型之抗原製劑,例如裂解之流行性感冒病毒或其抗原製劑、全病毒粒子或經純化之HA及NA(亞單位)疫苗作為用於初次接種之免疫原性組合物。或者除了用於初次接種之流行性感冒抗原之外,輔助組合物可含有另一類型之流行性感冒抗原。較佳使用裂解病毒。輔助組合物可為含佐劑的或不含佐劑的。不含佐劑之輔助組合物可為肌肉內給藥之FluarixT M /α-Rix/Influsplit。調配物含有自WHO推薦之適當流行性感冒季節之病毒株所製備的三種經滅活裂解病毒粒子抗原。

輔助組合物可含佐劑或不含佐劑。在一特定實施例中,輔助組合物包含如本文所定義之皂素佐劑。

在一特定實施例中,用於再接種之免疫原性組合物(下文中亦稱為"輔助組合物")含有流行性感冒病毒或其抗原製劑,其與用於初次接種之流行性感冒病毒或其抗原製劑共享共同之CD4 T細胞抗原決定基。共同CD4 T細胞抗原決定基意欲意謂來自不同抗原之肽/序列/抗原決定基,其可由相同CD4細胞識別(參見所述抗原決定基之實例:Gelder C等人1998,Int Immunol.10(2):211-22;Gelder CM等人1996 J Virol.70(7):4787-90;Gelder CM等人1995 J Virol.1995 69(12):7497-506)。

在本發明之一實施例中,輔助組合物為單價流行性感冒組合物,其包含與泛流行病爆發相關或具有與泛流行病爆發相關之潛力的流行性感冒病毒株。詳言之,輔助組合物中之該病毒株為傳播中之泛流行病病毒株。合適病毒株為(但不限於):H5N1、H9N2、H7N7及H2N2。該病毒株可與存在於用於初次接種之組合物中的病毒株或彼等病毒株之一相同。在一替代實施例中,該病毒株可為存在於用於初次接種之組合物中之病毒株的變異病毒株(亦即漂移病毒株)。

在另一特定實施例中,輔助組合物為多價流行性感冒疫苗。詳言之,當輔助組合物為多價疫苗(諸如二價或三價或四價疫苗)時,至少一種病毒株與泛流行病爆發有關或具有與泛流行病爆發有關之潛力。在一特定實施例中,輔助組合物中兩種或兩種以上病毒株為泛流行病病毒株。在另一特定實施例中,輔助組合物中至少一種泛流行病病毒株為與存在於用於初次接種之組合物中之病毒株或彼等病毒株之一相同的類型。在一替代實施例中,至少一種病毒株可為存在於用於初次接種之組合物中之至少一種泛流行病病毒株的變異病毒株(亦即漂移病毒株)。詳言之,輔助組合物中至少一種病毒株為傳播中之泛流行病病毒株。輔助組合物可含佐劑或不含佐劑。

一般而言,輔助組合物在使用時在下一個流行性感冒季節(例如第一免疫原性組合物後約一年)時給藥。輔助組合物亦可每隔一年給藥(第三、第四、第五次接種等)。輔助組合物可與用於初次接種之組合物相同。合適地,輔助組合物含有流行性感冒病毒或其抗原製劑,其可為用於初次接種之流行性感冒病毒之變異病毒株。詳言之,根據世界衛生組織所分發之參考材料選擇流行性感冒病毒株或其抗原製劑以使得其適應在再接種當年傳播之流行性感冒病毒株。

用於再接種之流行性感冒抗原或抗原組合物較佳包含合適地如上文所述之佐劑。如上文所述,佐劑可為以脂質體形式存在之皂素(此為較佳的),視情況含有諸如3D-MPL之額外佐劑。

在一態樣中,與初次用不含佐劑流行性感冒病毒或其抗原製劑接種後所誘發之均等反應相比,再接種誘發以下反應之任一者、較佳為二者或全部:(i)對抗流行性感冒病毒或其抗原製劑之改良CD4反應,或(ii)改良之B細胞記憶反應或(iii)改良之體液反應。較佳地,用如本文所定義之含佐劑流行性感冒病毒或其抗原製劑再接種後所誘發之免疫反應高於用不含佐劑組合物再接種後所誘發之相應反應。較佳地,在初次用含佐劑、較佳為裂解之流行性感冒組合物接種之群體體內用不含佐劑、較佳為裂解之流行性感冒病毒再接種後所誘發之免疫反應高於初次用不含佐劑、較佳為裂解之流行性感冒組合物接種之群體體內的相應反應。

在一特定實施例中,用如上文所定義包含流行性感冒病毒及脂質體形式之皂素佐劑的輔助組合物再接種受檢者展示比初次經不含佐劑組合物接種且經不含佐劑組合物輔助之人群體內相應值高之抗體效價。佐劑增強抗體對再接種反應的作用在已知對流行性感冒病毒接種或感染具有低反應之老年群體中尤其重要。就改良再接種後CD4 T細胞反應而言,亦標誌佐劑組合物相關益處。

特定言之,與對照疫苗所賦予之保護相比,本發明之含佐劑組合物可誘發對抗漂移病毒株(下一流行性感冒季節之流行性感冒病毒株)之較好交叉反應。與用不含佐劑調配物所獲得之反應相比,該交叉反應已顯示較高之持續性。佐劑增強對抗漂移病毒株之交叉反應的作用在泛流行病狀況下很重要。

在另一實施例中,本發明係關於一種接種療法,其中用流行性感冒組合物,較佳為裂解之流行性感冒組合物進行初次接種,該組合物含有至少一種可潛在導致泛流行病爆發之流行性感冒病毒株,且用傳播中之病毒株(泛流行病病毒株或傳統病毒株)進行再接種。

HA中之CD4抗原決定基

此抗原漂移主要存在於病毒表面蛋白血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(NA)之抗原決定基區中。已知不同流行性感冒病毒株之間的CD4及B細胞抗原決定基(其由避開宿主免疫系統之適應反應的病毒使用)之任何差異將在流行性感冒接種中起主要作用且為。

已在人體內識別由不同流行性感冒病毒株共享之CD4 T細胞抗原決定基(參見例如:GelderC等人1998,Int Immunol.10(2):211-22;Gelder CM等人1996 J Virol.70(7):4787-90;及Gelder CM等人1995 J Virol.1995 69(12):7497-506)。

在一特定實施例中,藉由使用含有流行性感冒病毒或其抗原製劑之輔助組合物進行再接種,該流行性感冒病毒或其抗原製劑與用於初次接種之流行性感冒病毒抗原或其抗原製劑共享共同之CD4 T細胞抗原決定基。因此,本發明係關於包含泛流行之流行性感冒病毒或其抗原製劑及脂質體形式之皂素(尤其為經膽固醇、視情況經3D-MPL解毒形式之QS21)之免疫原性組合物的用途,其係用於製造多劑量疫苗之初次接種組份,該多劑量疫苗進一步包含與初次接種時所給予之劑量之泛流行流行性感冒病毒抗原或其病毒抗原製劑共享共同CD4 T細胞抗原決定基的流行性感冒病毒或其抗原製劑作為輔助藥劑。

接種方式

本發明之免疫原性組合物可藉由任何合適傳遞途徑(諸如皮內、黏膜(例如鼻內)、口服、肌肉內或皮下)投藥。其他傳遞途徑在此項技術中為熟知的。

對於含佐劑免疫原性組合物而言肌肉內傳遞途徑為較佳。

皮內傳遞為另一合適途徑。例如短針裝置之任何合適裝置可用於皮內傳遞,諸如US 4,886,499、US5,190,521、US 5,328,483、US 5,527,288、US 4,270,537、US 5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662中所述之彼等短針裝置。皮內疫苗亦可藉由限制針進入皮膚之有效穿透長度的裝置(諸如以引用方式併入本文之WO 99/34850及EP 1092444中所述之彼等裝置)及其功能均等物投藥。經由液體噴射注射器或經由刺穿角質層且產生到達真皮之射流之針將液體疫苗傳遞至真皮的噴射注射裝置亦為合適的。噴射注射裝置在(例如)US 5,480,381、US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、WO 97/37705及WO 97/13537中經描述。使用壓縮空氣以加速粉末形式疫苗經皮膚外層到達真皮之彈道粉末/顆粒傳遞裝置亦為合適的。此外,習知注射器可用於皮內投藥之傳統結核菌素孟陀式法(mantoux method)。

另一合適投藥途徑為皮下途徑。任何合適裝置可用於皮下傳遞,例如傳統針。較佳地,使用無針噴射注射器服務(service),諸如WO 01/05453、WO 01/05452、WO 01/05451、WO 01/32243、WO 01/41840、WO 01/41839、WO 01/47585、WO 01/56637、WO 01/58512、WO 01/64269、WO 01/78810、WO 01/91835、WO 01/97884、WO 02/09796、WO 02/34317中所公開者。更佳地,該裝置經液體疫苗調配物預填充。

或者,經鼻內投與疫苗。一般地,將疫苗局部投與鼻咽區,較佳不將疫苗吸入至肺中。希望使用鼻內傳遞裝置,其將疫苗調配物傳遞至鼻咽區而不或實質上不使疫苗調配物進入肺。

適合鼻內投與本發明之疫苗的較佳裝置為噴霧裝置。合適之市售鼻噴霧裝置包括AccusprayT M (Becton Dickinson)。噴霧器產生極細之噴霧,其可容易地吸入至肺中且因此未有效地到達鼻黏膜。因此噴霧器並非較佳。

適合鼻內使用之較佳噴霧裝置為裝置效能不取決於使用者所施加之壓力的裝置。此等裝置稱為壓力臨限裝置。僅在施加臨限壓力時液體自噴嘴中釋放。此等裝置使得其易於實現具有規則液滴大小之噴霧。適用於本發明之壓力臨限裝置在此項技術中為已知的且在(例如)以引用方式併入本文之WO 91/13281及EP 311 863 B及EP 516 636中經描述。該等裝置購自Pfeiffer GmbH且亦在Bommer,R.Pharmaceutical Technology Europe,1999年9月中經描述。

較佳之鼻內裝置製造1至200 μm、較佳為10至120 μm之範圍中的液滴(使用水作為液體所量測)。低於10 μm存在吸入風險,因此希望具有不超過約5%之液滴低於10 μm。120 μm以上之液滴散佈不如較小之液滴良好,因此希望具有不超過約5%之液滴超過120 μm。

雙劑量傳遞為適合使用本發明之疫苗之鼻內傳遞系統的另一較佳特徵。雙劑量裝置含有單獨疫苗劑量之兩個亞劑量,一亞劑量係用於各鼻孔投藥。一般而言,兩個亞劑量存在於單獨腔室內且裝置之構造允許一次有效的傳遞單獨亞劑量。或者,單劑量裝置可用於投與本發明之疫苗。

或者,本發明中亦涵蓋表皮接種或經皮接種途徑。

在本發明之一特定態樣中,用於初次投藥之含佐劑免疫原性組合物可肌肉內給藥且含佐劑或不含佐劑輔助組合物可經由不同途徑(例如皮內、皮下或鼻內)投藥。在另一特定實施例中,適合初次投藥之尤其包含流行性感冒病毒抗原或其抗原製劑之免疫原性組合物可含有每流行性感冒病毒株15 μg之標準HA含量,且輔助流行性感冒組合物可含有低劑量(亦即低於15 μg)之HA且視投藥途徑而定可以較小體積給藥。

接種之群體

接種之目標群體可為免疫功能不全之人類。與健康成人相比,免疫功能不全之人類一般對抗原、尤其為流行性感冒抗原較不能夠反應。

較佳地,目標群體為對流行性感冒未致敏之群體,其為未經感染的(諸如與泛流行病病毒株相比)或先前未能對流行性感冒感染或接種起反應。較佳地,目標群體為合適地年齡為65歲或65歲以上之老年人、較年輕之高風險成人(亦即介於18與64歲之間)(諸如在醫療機構工作的人)或具有諸如心血管疾病及肺病或糖尿病之風險因素的彼等年輕成人。另一目標群體為所有6個月或6個月以上年齡之兒童、尤其為經歷相對高流行性感冒相關住院率之6-23個月年齡的兒童。較佳地,目標群體為65歲以上之老年人。

接種療法、給藥及其他功效標準

如藉由單向免疫擴散(single radial immunodiffusion)(SRD)所量測,當流行性感冒組合物含有15 μg來自各流行性感冒病毒株之血球凝集素抗原組份或各流行性感冒病毒株時,合適地在大多數狀況下本發明之免疫原性組合物為標準0.5 ml可注射劑量(J.M.Wood等人:J.Biol.Stand.5(1977)237-247;J.M.Wood等人,J.Biol.Stand.9(1981)317-330)。合適地,疫苗劑量體積將在0.5 ml與1 ml之間、尤其為標準0.5 ml或0.7 ml疫苗劑量體積。對於流行性感冒疫苗而言,視最初本體樣本中HA濃度而定將按照慣例進行劑量體積的略微改變。

合適地,該免疫原性組合物含有低劑量HA抗原-例如每流行性感冒病毒株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14 μg HA之任一者。

有利地,可以此習知注射裂解flu疫苗小之體積提供本發明之疫苗劑量、尤其為低劑量疫苗,其一般為每劑量約0.5、0.7或1 ml。本發明之低體積劑量較佳為每劑量低於500 μl、更佳低於300 μl及最佳為不超過約200 μl或200 μl以下。

因此,本發明之一態樣的較佳低體積疫苗劑量為具有低體積中之低抗原劑量的劑量,例如約200 μl體積中約15 μg或約7.5 μg HA或約3.0 μg HA(每病毒株)。

本發明之流行性感冒藥物較佳滿足疫苗之某些國際規範。

在國際上應用標準以量測流行性感冒疫苗之功效。對抗流行性感冒之有效疫苗的歐盟正式標準在下表1中陳述。對於疫苗中所包括之所有流行性感冒病毒株而言,為了滿足歐盟要求,流行性感冒疫苗理論上必須滿足表中標準中之僅一條。本發明之組合物合適地滿足至少一條該標準。

然而實際上,對於所有病毒株而言、尤其對於諸如經由不同途徑傳遞之新疫苗的新疫苗而言,將需要滿足規範中至少兩條或全部三條。在某些狀況下,兩條規範可為足夠的。舉例而言,對於所有病毒株將滿足之三條規範中之兩條而言當一些但非所有病毒株(例如三種病毒株中之兩種)滿足第三條規範時為可接受的。成人群體(18-60歲)及老年人群體(>60歲)的要求不同。

在另一態樣中,本發明提供一種設計已知經由CD4+T細胞活化治癒或治療之疾病之疫苗的方法,其包含:1)選擇含有CD4+抗原決定基之抗原,及2)將該抗原與如上文所定義之脂質體形式之皂素佐劑合併,其中在該哺乳動物體內投藥後該疫苗可在該哺乳動物體內誘發增強之CD4T細胞反應。

本申請案中所有參考文獻之教示(包括專利申請案及經授權之專利)以引用方式全部併入本文。

為了避免疑問,發明者意欲本文中術語"包含(comprising、comprise及comprises)"在每一情況下可用術語"由......組成(consisting of、consist of及consists of)"視情況替代。

將藉由參考以下非限制實例進一步描述本發明:實例I 描述小鼠、雪貂及人類研究中所用之免疫讀出法。

實例II 描述MPL/QS21脂質佐劑之製備。

實例III 描述雪貂體內含佐劑及不含佐劑流行性感冒疫苗之臨床前評價。

實例IV 展示C57Bl/6未經感染及經預致敏小鼠體內含佐劑及不含佐劑流行性感冒疫苗之臨床前評價。

實例V 描述小鼠體內具有不同濃度3D-MPL之含佐劑流行性感冒疫苗的比較。

實例VI 描述老年人體內具有不同濃度3D-MPL之含佐劑流行性感冒疫苗的比較。

實例VII 描述小鼠體內含佐劑HPV疫苗之臨床前評價。

實例VIII 描述含佐劑及不含佐劑細胞巨大病毒(cytomegaolovirus)免疫原性組合物之臨床前評價。

實例IX 描述具有兩種不同濃度3D-MPL之含佐劑RTS,S疫苗組合物之臨床前評價。

實例X 描述具有兩種不同濃度3D-MPL之含佐劑RTS,S疫苗之臨床評價。

實例I-免疫讀出法

I.1.小鼠法I.1.1.血球凝集抑制測試 測試程序 使用血球凝集抑制測試(HI)測定三種流行性感冒病毒株之抗血球凝集素抗體效價。HI測試之原理係以特異性抗流行性感冒抗體藉由流行性感冒病毒血球凝集素(HA)抑制雞紅血球(RBC)之血球凝集的能力為基礎。熱滅活血清藉由高嶺土及雞RBC預先處理以移除非特異性抑制劑。預處理後,用每流行性感冒病毒株4血球凝集單位培養血清之兩倍稀釋物。接著添加雞紅血球且對凝集之抑制評分。將效價表示為完全抑制血球凝集之血清最高稀釋度的倒數。因為血清之第一稀釋度為1:20,所以將不可偵測之含量評為等於10之效價。

統計分析 使用UNISTAT對接種後HI效價進行統計分析。用於分析變異數之實驗方案可如下簡要地描述:.對數轉換數據.為了驗證組分佈之正態性對各群體(組)進行之Shapiro-Wilk測試.為了驗證不同群體(組)之間的變異數同源性之Cochran測試.對組進行的兩因子變異數分析.用於多重比較之Tukey HSD測試

I.1.2.胞內細胞因子染色 此技術在下述細胞因子製造基礎上允許定量抗原特異性T淋巴細胞:效應T細胞及/或效應記憶T細胞製造IFN-γ且/或中樞記憶T細胞製造IL-2。在免疫後第7天採集PBMC。在分泌抑制劑(Brefeldine)存在下活體外再刺激淋巴細胞:接著使用螢光抗體(CD4、CD8、IFN-γ及IL-2)藉由習知免疫螢光程序處理此等細胞。將結果表示為CD4/CD8 T細胞內細胞因子陽性細胞的頻率。在第二次免疫後7天對PBMC進行T細胞之細胞因子的胞內染色。自小鼠收集血液且將其彙集在肝素化培養基RPMI+Add中。對於血液而言,根據推薦之實驗方案(在2500 rpm及室溫下離心20 min)使RPMI+Add經稀釋PBL懸浮液分層堆積至Lympholyte-Mammal梯度上。移除界面處之單核細胞,使其在RPMI+Add中洗滌兩次且將PBMC懸浮液調節為RPMI 5%胎牛血清中每毫升2×106 個細胞。

在微珠(μbead)上裂解之三價Flu(每病毒株5 μg HA)或完整F1(每病毒株1 μg HA)之最終濃度每毫升1×106 個細胞(試管FACS)下進行PBMC之活體外抗原刺激且接著在添加抗CD28及抗CD49d(二者均為1 μg/ml)下於37℃下培養2小時。

兩種抗體之添加藉由經活化之T及NK細胞增加增殖及細胞因子製造且可對CTL誘發提供輔助刺激信號。

此外,亦用Flu三價裂解(每病毒株30 μg HA)脈衝或完整FI(每病毒株5 μg HA)脈衝之BMDC(每毫升1×105 個細胞)(其藉由於37℃下用Flu裂解(每菌株60 μg/HA)或完整Flu三價F1(每菌株10 μg HA))脈衝BMDC 6小時製備)刺激PBMC隔夜。抗原再刺激步驟後,於37℃下在37℃之Brefeldin(1 μg/ml)存在下O.N.培養PBMC以抑制細胞因子分泌。

如下進行IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色:洗滌細胞懸浮液,將其再懸浮於50 μl含有2% Fc阻斷劑之PBS 1% FCS中(1/50;2.4G2)。於4℃下培養10 min後,添加50 μl抗-CD4-PE(2/50)與抗-CD8 perCp(3/50)之混合物且將其於4℃下培養30 min。在PBS 1% FCS中洗滌後,細胞藉由再懸浮於200 μl Cytofix-Cytoperm(Kit BD)中透化且於4℃下培養20 min。接著用Perm Wash(Kit BD)洗滌細胞且用50 μl於Perm Wash中稀釋之抗-IFN-γ APC(1/50)+抗-IL-2F ITC(1/50)的混合物將其再懸浮。於4℃下培養至少2 h至多隔夜後,用Perm Wash洗滌細胞且將其再懸浮於PBS 1% FCS+1%聚甲醛中。藉由FACS進行樣本分析。活細胞經門控(FSC/SSC)且對CD4+T細胞之約50,000個事件(淋巴細胞)或35,000個事件進行探測。對CD4+及CD8+門控群體計算IFN-γ+或IL2+之百分比。

I.2.雪貂法I.2.1.血球凝集抑制測試(HI) 測試程序 使用血球凝集抑制測試(HI)測定三種流行性感冒病毒株之抗血球凝集素抗體效價。HI測試之原理係以特異性抗流行性感冒抗體藉由流行性感冒病毒血球凝集素(HA)抑制雞紅血球(RBC)之血球凝集的能力為基礎。血清首先經25%神經胺酸酶溶液(RDE)處理且經熱滅活以移除非特異性抑制劑。預處理後,用每流行性感冒病毒株4血球凝集單位培養血清之兩倍稀釋物。接著添加雞紅血球且使用供讀數之液滴(tear)對凝集抑制評分。將效價表示為完全抑制血球凝集之血清最高稀釋度的倒數。因為血清之第一稀釋度為1:10,所以將不可偵測之含量評為等於5之效價。

統計分析 .使用UNISTAT對HI效價(攻毒前第41天)進行統計分析。用於分析變異數之方案可如下簡要地描述:.對數轉換數據。

.為了驗證組分佈之常態對各群體(組)之Shapiro-Wilk測試。

.為了驗證不同群體(組)之間差異之變異數同源性的Cochran測試。

.用於單因子ANOVA之相互作用的測試。

.用於多重比較之Tuckey-HSD測試。

I.2.2.鼻洗滌 藉由在蘇醒動物的兩個鼻孔中投與5 ml PBS進行鼻洗滌。在皮氏培養皿中收集接種物且將其置於乾冰上之樣本容器中。

鼻洗滌液中之病毒滴定所有鼻樣本首先經Spin X過濾器(Costar)無菌過濾以移除任何細菌污染物。將50 μl鼻洗滌液之連續10倍稀釋物轉移至含有50 μl培養基之微量滴定板上(每稀釋物10個孔)。接著將100 μl MDCK細胞(每毫升2.4×105 個細胞)添加至各孔中且在35℃下培養5-7天。培養6-7天後,溫和移除培養基且添加100 μl含有1/20 WST-1之培養基且再培養18小時。

減少WST-1後由活細胞所產生之黃甲臢染料的強度與病毒滴定檢定結束時存在於孔中之活細胞的數目成比例且藉由在合適波長(450奈米)下量測各孔之吸光度來定量。將臨界值(cut-off)定義為未感染之對照細胞的OD平均數-0.3 OD(0.3 OD相當於未感染之對照細胞之OD+/-3 StDev)。當OD<臨界值時定義正分值且相反當OD>臨界值時定義負分值。病毒排出效價藉由"Reed and Muench"法測定且表示為Log TCID50/ml。

I.3.評價人體內免疫反應之檢定I.3.1.血球凝集抑制檢定 使用WHO流行性感冒合作中心(疾病控制中心,Atlanta,USA)(1991)所描述之方法藉由量測HI抗體測定免疫反應。

使用4血球凝集-抑制單位(4 HIU)之適當抗原及0.5%家禽紅血球懸浮液用標準化及廣泛有效之微量法對解凍之冷凍血清樣本進行抗體效價量測。藉由熱處理及受體破壞酶移除非特異性血清抑制劑。

評價所得血清之HI抗體含量。以1:10之初始稀釋物開始製備稀釋物系列(藉由因子2)直至1:20480之最終稀釋物。將滴定終點理解為顯示完全抑制(100%)血球凝集之最高稀釋步驟。所有檢定重複兩次進行。

I.3.2.神經胺酸酶抑制檢定 在胎球蛋白塗覆之微量滴定板中進行檢定。製備抗血清之2倍稀釋物系列且使其與標準量之A型流行性感冒H3N2、H1N1或B型流行性感冒病毒混合。測試係基於自胎球蛋白中酶釋放神經胺酸之神經胺酸酶的生物活性。末端神經胺酸分裂後,使β-D-半乳糖-N-乙醯基-胺基半乳糖暴露。向孔中添加來自花生之辣根過氧化物酶(HRP)標記之花生凝集素,其與半乳糖結構特異性結合。結合之凝集素的量可在基質反應中用四甲基聯苯胺(TMB)偵測且定量。仍至少50%抑制病毒神經胺酸酶活性之最高抗體稀釋度表示NI效價。

I.3.3.中和抗體檢定 對解凍之冷凍血清樣本進行中和抗體量測。以微量中和檢定測定血清中所含之抗體中和病毒。在檢定中無需進一步處理而使用血清。各血清測試三次。將標準量之病毒與血清連續稀釋物混合且將其培養以允許抗體與病毒結合。接著將含有規定量之MDCK細胞的細胞懸浮液添加至病毒與抗血清之混合物中且於33℃下培養。培養期結束後,藉由雞紅血球之血球凝集觀察病毒複製。藉由Reed and Muench法計算血清之50%中和效價。

I.3.4.藉由細胞因子流式細胞術(CFC)評價細胞介導之免疫性 周邊血抗原特異性CD4及CD8 T細胞若用其相應抗原培養時可經活體外再刺激以產生IL-2、CD40L、TNF-α及IFN。因此,可根據習知免疫螢光標記細胞顯型以及胞內細胞因子產生藉由流式細胞術計算抗原特異性CD4及CD8 T細胞。在本研究中,將流行性感冒疫苗抗原以及得自特異性流行性感冒蛋白之肽用作抗原以再刺激流行性感冒特異性T細胞。將結果表示為CD4或CD8 T細胞亞群內細胞因子-陽性CD4或CD8 T細胞之頻率。

I.3.5.統計學方法 I.3.5.1.主要終點 百分比、強度及所請求之局部及全身信號接種與接種後7天隨訪期期間(亦即接種日及隨後6天)及全部症狀的關係。

百分比、強度及未請求之局部及全身信號接種與接種後21天隨訪期期間(亦即接種日及隨後20天)及全部症狀的關係。

整個研究期間嚴重不良事件之發生率。

I.3.5.2次要終點 對於體液免疫反應而言: 所觀察之變量: .在第0天及第21天:對疫苗中所表現之三種流行性感冒病毒株(抗-H1N1、抗-H3N2及抗-B-抗體)中每一者單獨測試之血清血球凝集-抑制(HI)及NI抗體效價。

.在第0天及第21天:對疫苗中所表現之三種流行性感冒病毒株中每一者單獨所測試之中和抗體效價

衍生之變量(具有95%信賴區間): .接種前及接種後具有95%信賴區間(95% CI)之血清HI抗體的幾何平均效價(GMT).第21天之具有95% CI之血清轉化率 .第21天之具有95% CI之轉化因子 .第21天之具有95% CI之血清保護率 .所有時間點之血清NI抗體GMT(具有95%信賴區間)。

血清轉化率定義為對各疫苗病毒株而言與第0天相比在第21天具有至少4倍血清HI效價增加之疫苗的百分比。

轉化因子定義為各疫苗病毒株與第0天相比第21天血清HI GMT之增加倍數。

保護率定義為接種後在血清HI效價=40情況下已接種疫苗者之百分比(對各疫苗病毒株而言),其一般公認為表示保護。

對於細胞介導之免疫(CMI)反應而言 所觀察之變量: 在第0天及第21天:不同測試中每106 中細胞因子陽性CD4/CD8細胞的頻率。各測試定量CD4/CD8 T細胞對以下抗原之反應:.肽流行性感冒(pf)抗原(此等抗原之準確性質及來源需要給定/解釋).裂解之流行性感冒(sf)抗原.完整流行性感冒(wf)抗原。

衍生之變量: .產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFNα、TNFγ)之細胞.產生至少CD40L及另一細胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)之細胞.產生至少IL-2及另一細胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)之細胞.產生至少IFNγ及另一細胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)之細胞.產生至少TNFα及另一細胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)之細胞。

I.3.5.3.免疫原性分析 免疫原性分析係基於總接種同齡群。對於各治療組而言,計算以下參數(具有95%信賴區間):.第0天及第21天之HI及NI抗體幾何平均效價(GMT)。

.第0天及第21天之中和抗體幾何平均效價(GMT)。

.第21天之轉化因子。

.第21天之血清轉化率(SC),其定義為與第0天相比在第21天具有至少4倍血清HI效價增加之已接種者的百分比。

.第21天之保護率,其定義為具有血清HI效價=1:40之已接種者的百分比。

.對各接種組在各時間點(第0天、第21天)及對各抗原(肽流行性感冒(pf)、裂解之流行性感冒(sf)及完整流行性感冒(wf))合計反應中CD4/CD8 T淋巴細胞分泌的頻率。

.在各自5個不同測試中,各接種組及各抗原(pf、sf及wf)時間點(後-前)反應之間的個體差異之描述性統計。

.將非參數測試(Kruskall-Wallis測試)用於比較3組之間的位置差異且對各抗原在各自5個不同測試中計算統計學p值。所有顯著性測試為雙尾的。將小於或等於0.05之p值視為統計學上顯著的。

實例II-MPL/QS21脂質佐劑之製備

II.3 MPL液體懸浮液之製備 自3D-MPL凍乾粉中製備MPL(如貫穿文獻中所用,其為3D-MPL(亦即3-O-脫醯基化單磷醯基脂質A)之縮略語)液體本體。MPL液體本體為原材料之穩定經濃縮(約1 mg/ml)水性分散液,其為即用型疫苗或佐劑調配物。製備方法之圖示在圖1中給出。

對於12 g之最大批次大小,在無菌玻璃容器中進行液體本體製備。MPL之分散由以下步驟組成:-將MPL粉末懸浮在用於注射之水中-藉由加熱(熱處理)使任何大聚集體除聚集-藉由微流化使介於100 nm與200 nm之間的粒度減小-在Sartoclean預濾器單元上預過濾製劑,0.8/0.65 μm-在室溫下無菌過濾製劑(Sartobran P單元,0.22 μm)

藉由微流化凍乾MPL粉末,產生穩定膠狀水性分散液(易於無菌過濾之大小的MPL顆粒)。將MPL凍乾粉分散在用於注射之水中以獲得近似10 mg/ml之懸浮液。接著使懸浮液在攪拌下經歷熱處理。冷卻至室溫後,開始微流化過程以降低粒度。使用Microfluidics裝置M110EH在適合最小通過量之規定壓力下藉由使分散液經微流化相互作用室連續環流進行微流化(循環數:nm i n )。基於所量測之流動速率及分散液體積計算表示循環數之微流化持續時間。於給定壓力下在給定設備上所得之流動速率可在相互作用室彼此之間及特定相互作用室之生命週期中不同。在本實例中所用之相互作用室為F20Y型Microfluidics。因為微流化效率與偶合壓力-流動速率有關,所以處理時間可在批次間彼此不同。基於流動速率計算1個循環所需之時間。待考慮之流動速率為僅在將MPL引入至裝置中之前以用於注射之水所量測之流動速率。將一個循環定義為MPL總體積通過裝置一次所需之時間(以分鐘為單位)。獲得n個循環所需之時間計算如下:n×處理之MPL的量(ml)/流動速率(ml/min)。

因此相應地修改循環數。對於之所用之較佳設備及相互作用室描述進行循環之最小量(nm i n )。藉由nm i n 個循環後所進行之粒度量測的結果確定進行循環之總量。基於歷史數據定義粒度範圍(dl i m )。藉由光子相關光譜(PCS)技術實現量測且將dl i m 表示為單峰結果(Z )。在此範圍下,微流化可在nm i n 個循環後停止。超過此範圍,微流化最多再繼續50個循環直至獲得滿意之尺寸減少。

若不在微流化後立即進行過濾,則將分散之MPL儲存於+2至+8℃下等待轉移至過濾區域中。

微流化後,以用於注射之水將分散液稀釋且在層流下經0.22 μm過濾器無菌過濾。最終之MPL濃度為1 mg/ml(0.80-1.20 mg/ml)。

II.2. MPL/QS21脂質佐劑之製備 稱為AS01之此佐劑包含經膽固醇抑止形式之3D-MPL及QS21且如以引用方式併入本文之WO 96/33739中所描述製造。詳言之,大體上如WO 96/33739之實例1.1製備AS01佐劑。AS01B佐劑包含:脂質體,其又包含二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、膽固醇及3D MPL[量為1000 μg DOPC、250 μg膽固醇及50 μg 3D-MPL,各值以每疫苗劑量大致給出];QS21[每劑量50 μg];磷酸鹽NaCl緩衝液;及達到0.5 ml體積之水。

AS01E佐劑包含與AS01B相同但為500 μg DOPC、125 μg膽固醇、25 μg 3D-MPL及25 μg QS21之量之較低濃度的成份、磷酸鹽NaCl緩衝液及達到0.5 ml體積之水。

在製造含有MPL之脂質體的過程中,將DOPC(二油醯基磷脂醯膽鹼)、膽固醇及MPL溶解於乙醇。在真空下藉由溶劑蒸發形成脂質膜。添加pH值6.1之磷酸鹽緩衝鹽水(9 mM Na2 HPO4 、41 mM KH2 PO4 、100 mM NaCl)且使混合物經歷預均化接著在15,000 psi下高壓均化(約15至20個循環)。此導致產生脂質體,其在無菌(等級100)區域中經0.22 μm膜無菌過濾。接著將無菌產物分佈在無菌玻璃容器中且將其儲存在冷房間中(+2至+8℃)。

如此製造之脂質體在膜中含有MPL(WO 96/33739實施例中之"MPL")。

以水溶液添加QS21至所需之濃度。

實例III-雪貂體內含佐劑及不含佐劑流行性感冒疫苗之臨床前評價

III.1.基本原理及目標 雪貂模型中之流行性感冒感染的感染敏感性及臨床反應極類似人類流行性感冒。

在先前未適應病毒株時雪貂對A型及B型流行性感冒病毒感染極敏感。因此,其提供卓越之模型系統用於研究藉由投與流行性感冒疫苗所賦予的保護。

此研究探究各種三價裂解疫苗(含佐劑或不含佐劑)以減輕疾病症狀(體溫)之功效及經同源病毒株刺激之雪貂的鼻分泌物中的病毒排出。

此實驗之目標為證實與普通(不含佐劑)疫苗相比含佐劑流行性感冒疫苗的功效。

終點為:1)主要終點:減少同源攻毒後鼻洗滌液中之病毒排出;2)次要終點:藉由HI效價分析體液反應。

III.2.實驗設計 III.2.1.處理/分組(表1)14-20週齡之雌性雪貂(地中海雪貂(Mustela putorius furo ))得自MISAY Consultancy(Hampshire,UK)。在第0天使雪貂經雜型病毒株H1N1 A/Stockholm/24/90(4 Log TCID5 0 /ml)預致敏。在第21天,將雪貂用完全人類劑量(500 μg疫苗劑量、15 μg HA/病毒株)之H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/Panama/2007/99及B/Shangdong/7/97之組合肌肉內注射。接著在第42天藉由鼻內途徑用雜型病毒株H3N2 A/Wyoming/3/2003(4.5 Log TCID5 0 /ml)攻毒雪貂。

每組6隻雪貂。In/Po=個體/池

III.2.2.疫苗調配物之製備(表2)調配物1:三價裂解普通(不含佐劑)調配物: 將10倍濃度之PBS(當1倍濃度時pH值7.4)以及含有Tween 80、Triton X-100及VES之混合物(考慮存在於病毒株中之清潔劑的量)添加至用於注射之水中。攪拌5 min後,在各次添加之間攪拌10 min下添加各15 μg病毒株H1N1、H3N2及17.5 μg B型病毒株。將調配物最少攪拌15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃下。

調配物2:經脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價裂解流行性感冒: 將10倍濃度之PBS(當1倍濃度時pH值7.4)以及含有Tween 80、Triton X-100及VES之混合物(考慮存在於病毒株中之清潔劑的量)添加至用於注射之水中。攪拌5 min後,在各次添加之間攪拌10 min下各添加15 μg病毒株H1N1、H3N2及17.5 μgB型病毒株。攪拌調配物15分鐘。將所謂"DQS21-MPLin"之預混合物添加至調配物中,接著將其最少攪拌15分鐘。DQS21-MPLin預混合物為脂質體(由DOPC 40 mg/ml、膽固醇10 mg/ml、MPL 2 mg/ml製成)與免疫刺激劑QS21之混合物。將此預混合物培養最少15分鐘接著添加至三價裂解混合物中。最終調配物中MPL及QS21之濃度為每500微升50 μg。若不直接投藥則將調配物儲存於4℃下。

備註:在各調配物中,添加10倍濃度之PBS以達到等滲性且在最終體積中為1倍濃度。計算達到目標體積之H2 O體積。

III.2.3.讀出(表3)

III.3.結果 結果之圖示在圖1及圖2中給出。

III.3.1.體液免疫性(圖1)。 在鼻內異源預致敏後第17天及免疫後第21天及攻毒後第13天在來自每組6個動物之血清中偵測對抗H3N2疫苗病毒株(疫苗病毒株A/Panama/2007/99及攻毒病毒株A/Wyoming/3/2003)之血球凝集抑制活性。

如實例I.2.1所詳述使用血球凝集抑制試驗(HI)測定三種流行性感冒病毒株之抗血球凝集素抗體效價。結論如下:對於兩種A/H3N2病毒株而言及對於所有組而言,免疫後在所有經接種之組內觀察到HI效價之上升。

用A/Panama/2007/99免疫後,與三價裂解普通疫苗相比當三價裂解疫苗經脂質體中之MPL/QS21輔佐時觀察到統計學顯著較高之抗-A/Panama/2007/99 HI效價。

用A/Panama/2007/99免疫後,僅經脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價裂解疫苗可顯著增加異源病毒株A/Wyoming/3/2003之HI效價(用此漂移病毒株攻毒前之交叉反應性)。

用A/Wyoming3/2003攻毒後,對於三價裂解普通疫苗及經脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價裂解疫苗均觀察到抗-A/Wyoming/3/2003 HI效價之增加。

對於A/New Caledonia/20/99及B/Shangdong/7/97病毒株而言,與三價裂解普通疫苗相比當三價裂解疫苗經脂質體中之MPL/QS21輔佐時觀察到統計學上顯著較高之HI效價。

III.3.2.病毒排出(圖3)。 如實例I.2.3所詳述對每組6個動物進行鼻洗滌液之病毒滴定。藉由蘇醒動物的兩個鼻孔中投與5 ml PBS進行鼻洗滌。在皮氏培養皿中收集接種物且於-80℃下將其置於樣本容器中。

攻毒後兩天,與三價裂解普通疫苗相比在經脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價裂解疫苗下觀察到統計學上顯著較低之病毒排出。

在第49天(攻毒後7天),在鼻洗滌液中未偵測到病毒。

III.3.3.實驗結論 對於全部4種病毒株而言,與三價裂解普通疫苗相比在經脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價裂解疫苗情況下觀察到較高之體液反應(HI效價)。

用A/Panama/2007/99免疫後,僅經脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價裂解疫苗可顯著增加異源病毒株A/Wyoming/3/2003之HI效價(用此病毒株攻毒前之交叉反應性)。

就雪貂之保護功效而言脂質體調配物中之MPL/QS21顯示附加益處(異源攻毒後較低之病毒排出)。用脂質體中之三價裂解MPL/QS21免疫後所觀察之對抗攻毒所用之漂移病毒株的交叉反應似乎與此等雪貂體內所觀察到之保護作用相關。

實例IV-C57B1/6預致敏小鼠體內含佐劑及不含佐劑流行性感冒疫苗之臨床前評價

IV.1.實驗設計及目標 將經異源病毒株預致敏之C57B1/6小鼠用於此實驗。

目的為比較GlaxoSmithKline市售三價裂解疫苗(FluarixT M )與三價亞單位疫苗(Chiron之疫苗AgrippalT M )所誘發之體液(HI效價)及CMI(ICS,胞內細胞因子染色)免疫反應以及用此等經含有單獨之3D-MPL、單獨之DQS21(脂質體中之QS21,亦即經解毒之QS21)之脂質體或脂質體中之MPL/QS21輔佐之疫苗所獲得之CMI反應。在下文實例中,調配物自裂解之單本體(monobulk)開始製備以達到與Fluarix疫苗中相同之組成且不自市售之Fluarix劑量開始。所獲得之調配物稱為"Fluarix類(Fluarix like)"。

IV.1.1.處理/分組 6-8週齡雌性C57B1/6小鼠自Harlan Horst,Netherland獲得。在第0天用雜型病毒株(5 μg HA完整經滅活H1N1 A/Beijing/262/95、H3N2 A/Panama/2007/99、B/Shangdong/7/97)使小鼠預致敏。在第28天,用1.5 μg普通或含佐劑HA三價裂解疫苗(A/New Caledonia/20/99、A/Wyoming/3/2003、B/Jiangsu/10/2003)肌肉內注射小鼠(參見下文表4至6中之組)。

IV.1.2.疫苗調配物之製備1組之調配物: 將10倍濃度之PBS(當1倍濃度時pH值7.4)以及含有Tween 80、Triton X-100及VES之混合物(考慮存在於病毒株中之清潔劑的量)添加至用於注射之水中。攪拌5 min後,在各次添加之間攪拌10 min下各添加15 μg病毒株H1N1、H3N2及15 μg B型病毒株。攪拌調配物最少15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃下。

2組之調配物: 將10倍濃度之PBS(當1倍濃度時pH值7.4)以及含有Tween 80、Triton X-100及VES之混合物(考慮存在於病毒株中之清潔劑的量)添加至用於注射之水中。攪拌5 min後,在各次添加之間攪拌10 min下各添加15 μg病毒株H1N1、H3N2及15 μg B型病毒株。攪拌調配物15分鐘。添加含有3D-MPL之濃縮脂質體(由DOPC 40 mg/ml、膽固醇10 mg/ml、3D-MPL 2 mg/ml製成)以達到每劑量50 μg之最終MPL濃度。接著攪拌調配物最少15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃下。

3組之調配物: 將10倍濃度之PBS(當1倍濃度時pH值7.4)以及含有Tween 80、Triton X-100及VES之混合物(考慮存在於病毒株中之清潔劑的量)添加至用於注射之水中。攪拌5 min後,在各次添加之間攪拌10 min下各添加15 μg病毒株H1N1、H3N2及15 μg B型病毒株。攪拌調配物15分鐘。接著添加由脂質體(由DOPC 40 mg/ml、膽固醇10 mg/ml製成)及稱為"DQS21"之QS21製成之預混合物以達到每劑量50 μg之QS21濃度。將此預混合物培養至少15分鐘且隨後添加至三價裂解混合物中。攪拌調配物最少15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃下。

4組之調配物: 將10倍濃度之PBS(當1倍濃度時pH值7.4)以及含有Tween 80、Triton X-100及VES之混合物(考慮存在於病毒株中之清潔劑的量)添加至用於注射之水中。攪拌5 min後,在各次添加之間攪拌10 min下各添加15 μg病毒株H1N1、H3N2及15 μg B型病毒株。攪拌調配物15分鐘。接著添加由含有3D-MPL之脂質體(由DOPC 40 mg/ml、膽固醇10 mg/ml、3D-MPL 2 mg/ml製成)及QS21製成之混合物以達到每劑量50 μg之QS21及MPL濃度。將此混合物培養至少15分鐘,隨後添加至三價裂解混合物中。攪拌所謂之"脂質體中之三價裂解MPL/QS21"調配物最少15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃。

備註:在1至4組中,添加10倍濃度之PBS以達到等滲性且在最終體積中為1倍濃度。計算達到目標體積之H2 O體積。

5組之調配物: 將一AggripalT M 劑量與等體積之pH值為7.4之PBS mod混合。攪拌調配物最少15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃下。

6組之調配物: 使pH值7.4之PBS與一AggripalT M 劑量混合。接著在攪拌下添加含有3D-MPL之脂質體(由DOPC 40mg/ml、膽固醇10 mg/ml、3D-MPL 2 mg/ml製成)以達到每劑量50 μg MPL之均等物。攪拌調配物最少15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃下。

備註:添加PBS以在最終體積中達到等滲性。Aggripal為調配物體積之一半。

7組之調配物: 使pH值7.4之PBS與一AggripalT M 劑量混合。接著在攪拌下添加由脂質體(由DOPC 40 mg/ml、膽固醇10 mg/ml製成)及所謂"DQS21"之QS21之預混合物以達到每劑量50 μg QS21之均等物。在添加之前培養此預混合物至少15分鐘。攪拌調配物最少15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃下。

備註:添加PBS以在最終體積中達到等滲性。AggripalT M 為調配物體積之一半。

8組之調配物: 使pH值7.4之PBS與一AggripalT M 劑量混合。在攪拌下將所謂之"DQS21-MPLin"預混合物添加至調配物中。DQS21-MPLin預混合物為脂質體(由DOPC 40 mg/ml、膽固醇10 mg/ml、MPL 2 mg/ml)與免疫刺激劑QS21之混合物。此預混合物在添加至Aggripal/PBS混合物中之前培養至少15分鐘。調配物中MPL及QS21之量各為50 μg。攪拌調配物最少15分鐘且若不直接投藥則將其儲存於4℃下。

備註:添加PBS以在最終體積中達到等滲性。Aggripal為調配物體積之一半。

表6 :用AggripalT M 疫苗(1 ml)製備之調配物5至8的最終組成

IV.1.3.讀出(表7) In=個體/Po=池

IV.2.結果IV.2.1.體液反應(免疫後21天HI效價)

藉由HI效價之體液反應-圖4。

在免疫後第21天在來自每組8個動物之血清中偵測對抗疫苗病毒株(A/New Caledonia/20/99、A/Wyoming/3/2003、B/Jiangsu/10/2003)之血球凝集抑制活性。

與經PBS免疫之小鼠相比,對於全部三種病毒株而言(三價裂解或三價亞單位疫苗)用所測試之所有Flu疫苗候選物免疫後觀察到HI效價增加。

對於全部三種病毒株而言,與用普通或經含有單獨之3D-MPL之脂質體輔佐的三價裂解Flu免疫的小鼠相比在經單獨之DQS21或脂質體中MPL/QS21輔佐之三價裂解疫苗免疫的小鼠體內觀察到統計學上顯著較高之HI效價。對體液反應之分級如下:(脂質體中之MPL/QS21=單獨之DQS21)>(含有單獨之3D-MPL之脂質體=普通疫苗)>PBS。

對於全部三種病毒株而言,與經三價裂解普通疫苗免疫之小鼠相比在用經單獨之DQS21、含有單獨之3D-MPL之脂質體或脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價亞單位免疫的小鼠體內觀察到統計學上顯著較高之HI效價。對體液反應之分級如下:(脂質體中之MPL/QS21=單獨之DQS21=含有單獨之3D-MPL之脂質體)>普通疫苗>PBS。

當調配物不含佐劑或經單獨之DQS21或脂質體中之MPL/QS21輔佐時,三價裂解及三價亞單位疫苗誘發類似之HI效價。

IV.2.2.細胞介導之免疫反應(免疫後第7天之ICS) CD4 T細胞反應-圖5 在免疫後第7天採集來自每組8隻小鼠之PBMC且在每組2隻小鼠之4個池中測試。

就Flu完整病毒特異性總CD4+T細胞(表現IL-2、IFN-γ及兩種細胞因子)而言:無論哪一種調配物,在三價裂解及三價亞單位疫苗之間觀察到相同之CD4+T細胞反應。

當與普通或經含有單獨之3D-MPL或單獨之DQS21之脂質體輔佐的三價調配物(裂解或亞單位)相比時,對經脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價調配物(裂解或亞單位)而言觀察到較高之CD4+T細胞反應。

對於由三價調配物(裂解或亞單位)誘發之細胞反應而言,與單獨之DQS21或含有單獨之3D-MPL之脂質體相比存在含有3D-MPL+DQS21之脂質體的協同作用。

對細胞反應之分級如下:脂質體中之MPL/QS21>(含有單獨之3D-MPL之脂質體=僅有DQS21=普通=PBS)。

IV.3.結果及結論匯總 對於全部三種病毒株而言,與經普通三價調配物(裂解或亞單位)免疫之小鼠相比在用經單獨之DQS21或脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價調配物(裂解或亞單位)免疫的小鼠體內觀察到統計學上顯著較高之HI效價。含有單獨3D-MPL之脂質體在與三價亞單位一起調配時似乎誘發比與三價裂解調配高之體液反應。

無論哪一種調配物,對於三價裂解(Fluarix)及三價亞單位(Agrippal)而言獲得類似之CD4+T細胞反應。

在與普通或經含有單獨之3D-MPL或單獨之脂質體中之QS21(DQS21)輔佐之三價調配物(裂解或亞單位)相比,經脂質體中之MPL/QS21輔佐之三價調配物(裂解或亞單位)誘發較高之CD4+T細胞反應。

實例V-含有經脂質調配物中之3D-MPL/QS21輔佐之裂解流行性感冒抗原製劑之疫苗的臨床前比較(兩種不同濃度之3D-MPL)

V.1-小鼠 V.1.1.-實驗設計及目標 將經異源病毒株預致敏之C57B1/6小鼠用於此實驗。目的為分析由不含佐劑形式及經含有兩種不同濃度之3D-MPL及QS21之脂質體輔佐之GlaxoSmithKline市售三價裂解疫苗(FluarixT M )誘發的體液(HI效價)及CMI(ICS,胞內細胞因子染色)免疫反應。

V.1.2.處理/分組8週齡雌性C57B1/6小鼠係自Harlan Horst,Netherland獲得。在第0天用雜型病毒株(完整經滅活之A/Beijing/262/95、H3N2 A/Panama/2007/99、B/Shandong/7/97)經鼻內使小鼠預致敏。在第28天,用普通或經脂質調配物中兩種不同濃度之免疫刺激劑輔佐之三價裂解(A/New Caledonia、A/Wyoming、B/Jiangsu)肌肉內注射小鼠(參見下文表8中之分組)。

如實例IV製備調配物。

V.1.3.-結果藉由HI效價之體液反應-圖24。

免疫後第21天在來自每組9個動物之血清中偵測對抗3種疫苗病毒株之血球凝集抑制活性。

與經PBS免疫之小鼠相比,對於全部三種病毒株而言用所測試之所有Flu疫苗候選物免疫後觀察到HI效價增加。

對於全部三種病毒株而言,與經普通三價Flu裂解免疫之小鼠相比在經任一濃度之MPL及QS21輔佐之三價裂解免疫之小鼠體內觀察到統計學上顯著較高之HI效價(p最大值=0.03)。

在兩個脂質佐劑組-佐劑組之間未觀察到統計學上顯著之差異。

細胞介導之免疫反應(免疫後第7天之ICS)-圖25。 免疫後7天採集來自每組9隻小鼠之PBMC且在每組3隻小鼠之三個池中測試。就表現IL-2、IFN-γ及兩種細胞因子之完整Flu病毒特異性CD4+T細胞而言:如自圖25中可見,用經最高濃度之免疫刺激劑輔佐之三價裂解免疫後獲得最高之IFN-γ CD4+T細胞特異性反應。然而,IL2及IL2+IFN-γ T細胞反應在兩種濃度之免疫刺激劑之間為類似的。

實例VI-在含有經脂質調配物中之MPL/QS21輔佐之裂解流行性感冒抗原製劑之疫苗情況下超過65歲之老年群體中的臨床試驗(兩種不同濃度之3D-MPL)

VI.1.研究設計及目標

證明在老年人群體(年齡為65歲及65歲以上)體內投與含有各種佐劑之GlaxoSmithKline Biologicals流行性感冒候選疫苗與成人(18-40歲)體內投與FluarixT M (在Belgium稱為α-RixT M )相比細胞介導免疫反應之非劣效性的開放、隨機化I/II期研究指定四個平行組:在接受一劑FluarixT M (Fluarix組)之對照組中75個成人(年齡為18-40歲).將200名老年受檢者(年齡為65歲或65歲以上)3:3:2隨機分成三組:-具有75名接受經AS01B輔佐之流行性感冒疫苗之受檢者的一組-具有75名接受經AS01E輔佐之流行性感冒疫苗之受檢者的一組-具有50名接受一劑FluarixT M 之受檢者的參考Flu組。

第一目標 第一目標為就製造至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、TNF-α、IFN-γ)之流行性感冒特異性CD4 T淋巴細胞之頻率而言,與成人(年齡為18-40歲)體內投與FluarixT M 相比證明老年受檢者(年齡為65歲或65歲以上)體內投與流行性感冒佐劑疫苗之接種後21天之非劣效性。

第二目標 第二目標為:1)評價在老年受檢者(年齡為65歲及65歲以上)體內肌肉內投與疫苗後在21天期間用含佐劑候選流行性感冒疫苗接種之安全性及反應原性。將FluarixT M 用作參考。

2)評價用含佐劑流行性感冒候選疫苗接種後21、90及180天之體液免疫反應(抗血球凝集素效價)。將FluarixT M 用作參考。

第三目標 第三目標為評價用含佐劑流行性感冒疫苗接種後21、90及180天之細胞介導免疫反應(產生IFN-γ、IL-2、CD40L及TNF-α及記憶B細胞反應)。將FluarixT M 用作參考。

VI.2.疫苗組合物及投藥 已使用兩種不同佐劑:1. AS01B-含有50 μg MPL及QS21之脂質體基佐劑2. AS01E-AS01B之兩倍稀釋調配物

對照:藉由IM投與之完全劑量之FluarixT M

意欲所有疫苗用於肌肉內投藥。五種疫苗中所用之病毒株為WHO對2005-2006北半球季推薦者,亦即A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/New California/7/2004(H3N2)及B/Jiangsu/10/2003。

含佐劑流行性感冒候選疫苗之調配物中所用之三種經滅活之裂解病毒粒子抗原(單價本體)與市售FluarixT M /α-RixT M -GSK Bio之裂解病毒粒子經滅活流行性感冒疫苗之調配物中所用的活性成份完全相同。其得自孵化(egg-grown)病毒。流行性感冒病毒株為2005/2006季之推薦者,如市售FluarixT M /α-RixT M 2005/2006之調配物中所用者。

三種疫苗中所用之病毒株為WHO對2005-2006北半球季推薦者,亦即.A/New Caledonia/20/99(H1 N1 )IVR-116.A/New York/55/2004(H3N2)NYMC X-157.B/Jiangsu/10/2003

如同FluarixT M /α-RixT M ,含佐劑疫苗含有每劑量15 μg各流行性感冒病毒株之血球凝集素(HA)。

VI.2.1. AS01B含佐劑疫苗組之描述 含AS01B佐劑之流行性感冒候選疫苗為2組份疫苗,其由存在於I型玻璃瓶中之經濃縮三價經滅活裂解病毒粒子抗原及含有AS01B佐劑之I型玻璃瓶組成。注射時,抽取佐劑瓶之內含物且將其注射至含有經濃縮之三價經滅活裂解病毒粒子抗原的瓶中。混合後,將內含物抽取至注射器中且用肌肉內針替代針。用肌肉內針替代所用之針且將體積校正為1 ml。一劑復水含AS01B佐劑之流行性感冒候選疫苗等於1 ml。

含AS01B佐劑之流行性感冒候選疫苗為無防腐劑疫苗。

VI.2.2.含AS01B佐劑臨床組之組合物 一劑復水含AS01B佐劑之流行性感冒疫苗等於1 ml。其組成於表8中給出。其如註冊之FluarixT M /α-Rix疫苗含有15 μg各流行性感冒病毒株之HA。

VI.2.3.含AS01B佐劑之疫苗組之製造方法 含AS01B佐劑之流行性感冒疫苗之製造由以下三個主要步驟組成:.調配不含佐劑之三價最終本體(2倍濃度)及在抗原容器中填充.製備AS01B佐劑.臨時復水含AS01B佐劑之裂解病毒疫苗。

調配不含佐劑之三價最終本體及在以其填充抗原容器 三種單價本體之體積係基於調配前各單價本體中所量測之HA含量及1320 ml之目標體積。

在用於注射之水中稀釋濃磷酸鹽緩衝之鹽水PO4 Na/K2 (每劑量80 μl)及Tween 80、Triton X-100及琥珀酸氫α-生育酚酯之預混合物。接著將三種濃單本體(A/New Caledonia/20/99 IVR-116、A/New York/55/2004 NYMC X-157、B/Jiangsu/10/2003)相繼稀釋於所得之磷酸鹽緩衝之鹽水/Tween 80-Triton X-100-琥珀酸氫α-生育酚酯溶液(pH值7.8,81 mM NaCl、1.56 mM KCl、4.79 mM Na2 HPO4 、0.87 mM KH2 PO4 、7.2 mM NaH2 PO4 、72.8 mM K2 HPO4 、750 μg/ml Tween 80、110 μg/ml Triton X-100及100 μg/ml琥珀酸氫α-生育酚酯)中以具有每毫升三價最終本體30 μg A(H1N1及H3N2)病毒株之HA(15 μg HA/A病毒株/500 μl三價最終本體)及35 μg B型病毒株(17.5 μg HA/B型病毒株/500 μl三價最終本體)之HA的最終濃度。在各單價本體的添加之間在室溫下攪拌混合物10-30分鐘。添加最後之單價本體及15-30分鐘攪拌之後,檢查pH值且用HCl或NaOH將其調節為7.65±0.25。

將抗原之三價最終本體無菌填充至3-ml無菌I型(Ph.Eur.)玻璃瓶中。各瓶含有600 μl(500 μl+100 μl過滿)之體積。

AS01B佐劑本體之製備及以其填充佐劑容器 藉由混合以下兩種組份製備佐劑AS01B:QS21及含有MPL之脂質體。下文概述此等組份中各者之製備。

QS21為自表皂樹之樹皮中獲得之三萜醣苷且由Aquila Worchester,MA,USA(現在為Antigenics)製造。

QS21作為凍乾粉提供給GSK Bio。QS21在GSK Bio之製備由以下步驟組成:以約5 mg/mL之濃度將QS21粉末懸浮於用於注射之水中、將pH值調節為pH值6.0±0.2及無菌過濾。於-20℃下在聚乙烯容器中儲存液體本體QS21。

MPL為藉由相繼酸及鹼水解來自明尼蘇達沙門氏菌之Re595菌株的脂多醣所獲得之3-O-脫醯基-4'-單磷醯基脂質A。其由Corixa(formerly Ribi Inc.),Hamilton,Montana製造。本體MPL作為三乙胺(TEA)之凍乾鹽供應給GSK Bio。

在製造含有MPL之脂質體之過程中,將DOPC(二油醯基磷脂醯膽鹼)、膽固醇及MPL溶解於乙醇中。在真空下藉由溶劑蒸發形成脂質膜。添加pH值為6.1的由9 mM Na2 HPO4 、41 mM KH2 PO4 、100 mM NaCl製成之磷酸鹽緩衝鹽水且使混合物經歷預均化接著在15,000 psi下高壓均化(+/-20個循環)。此導致產生脂質體,其在無菌(等級100)區域中經0.22 μm膜無菌過濾。接著將無菌產物分佈在無菌玻璃容器中且將其儲存在冷房間中(+2至+8℃)。

使脂質體之無菌本體製劑與無菌QS21本體溶液混合。30 min攪拌後,將此混合物添加至用於注射之水與在稀釋10倍時pH值6.1之磷酸鹽500 mM、NaCl 1M之混合物中。計算稀釋10倍時pH值6.1之磷酸鹽500 mM、NaCl 1 M的數量以在最終體積中達到等滲性。檢查pH值。接著將佐劑無菌過濾(0.22 μm)且無菌分佈至瓶中。將瓶儲存於+2至+8℃下。

AS01B稀釋物為不含外來顆粒、裝在無菌I型玻璃瓶中之乳光無色液體。各瓶之目標填充為0.7 ml以符合規格(0.5 ml)。

臨時復水含AS01B佐劑之裂解病毒疫苗 注射時,抽取含有佐劑之瓶的內含物且將其注射至含有濃三價經滅活裂解病毒粒子抗原的瓶中。混合後,將內含物抽取至注射器中且用肌肉內針替代針,且將體積校正為1 ml。一劑量之復水含AS01B佐劑之流行性感冒候選疫苗等於1 ml。

VI.2.4.含AS01E佐劑之疫苗組之描述 含AS01E佐劑之流行性感冒候選疫苗為3組份疫苗,其由存在於I型玻璃瓶中之濃三價經滅活裂解病毒粒子抗原、含有AS01B佐劑之I型玻璃瓶及含有AS01B之兩倍稀釋物之稀釋物(用於注射之氯化鈉溶液)的I型玻璃瓶組成。

為了製備AS01E佐劑,用注射器抽取稀釋物瓶中之內含物且將其注射至含有AS01B佐劑之瓶中,接著混合。在注射時,用注射器自AS01E瓶中抽取600 μl AS01E佐劑且將其注射至含有濃三價經滅活裂解病毒粒子抗原之瓶中。混合後,將內含物抽取至注射器中且用肌肉內針替代針。一劑量復水含AS01B佐劑之流行性感冒候選疫苗等於1 ml。

含AS01E佐劑之流行性感冒候選疫苗為無防腐劑之疫苗。

VI.2.5.含AS01E佐劑之臨床組之組合物 一劑量復水含AS01E佐劑之流行性感冒疫苗等於1 ml。其組成於表9中給出。其如註冊之FluarixT M /α-Rix疫苗含有15 μg各流行性感冒病毒株之HA。

VI.2.6.含AS01E佐劑之疫苗組之製造方法 含AS01B佐劑之流行性感冒疫苗之製造由以下三個主要步驟組成:.調配不含佐劑三價最終本體(2倍濃度)及以其填充抗原容器.製備AS01B佐劑.製備AS01E佐劑接著臨時復水含AS01E佐劑之裂解病毒疫苗

調配不含佐劑三價最終本體及以其填充抗原容器 對於含AS01B佐劑之流行性感冒疫苗而言參考部分V.2.3。

AS01B佐劑本體之製備及以其填充佐劑容器 對於含AS01B佐劑之流行性感冒疫苗而言參考部分V.2.3。

臨時復水含AS01E佐劑之裂解病毒疫苗 為了製備AS01E佐劑,用注射器抽取稀釋瓶中之內含物且將其注射至含有AS01B佐劑之瓶中,接著混合。在注射時,用注射器自AS01E瓶中抽取600 μl AS01E佐劑且將其注射至含有濃三價經滅活裂解病毒粒子抗原之瓶中。混合後,將內含物抽取至注射器中且用肌肉內針替代針。一劑量復水含AS01E佐劑之流行性感冒候選疫苗等於1 ml。

每位受檢者四次預定之隨訪在第0、21、90及180天,在每次隨訪時收集血液樣本以評價免疫原性。

接種時程:在第0天一次注射流行性感冒疫苗

VI.3.免疫原性結果VI.3.1. CMI終點及結果 為了表徵用含佐劑之流行性感冒疫苗接種後之CMI反應,使用來自三種疫苗病毒株之抗原(單獨使用或彙集)活體外再刺激CD4及CD8 T淋巴細胞。根據習知免疫螢光標記胞內細胞因子產生(IL-2、IFN-γ、TNF-α及CD40L)藉由流式細胞術計算流行性感冒特異性CD4/CD8 T淋巴細胞。

主要終點之評價 在第21天:在產生至少兩種不同細胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α及CD40L)之測試中就每106 個流行性感冒特異性CD4 T淋巴細胞之頻率而言所有受檢者體內之CMI反應。

為了評價CMI反應,如下分析流行性感冒特異性CD4之頻率:使用ANCOVA模型根據對數轉換之效價獲得就流行性感冒特異性CD4頻率而言用含佐劑疫苗及Flu YNG接種之組間的GM比。ANCOVA模型包括作為固定作用之疫苗組及作為回歸量之預接種對數轉換效價。以模型中相應組對比之指數轉換形式獲得GM比及其98.75% CI。經調節之GM的98.75% CI藉由指數轉換上述ANCOVA模型之該組最小均方之98.75% CI獲得。

結果-推論性分析(表10) 在用"彙集抗原II"活體外再刺激後在第21天產生至少兩種細胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α及CD40L)之流行性感冒特異性CD4 T淋巴細胞之經調節GM及GM比(在其98.75% CI情況下)在表8中經描述。對於各含佐劑流行性感冒疫苗而言,GM比之兩側98.75% CI的上限遠低於臨床界限2.0。此表明就接種後流行性感冒特異性CD4之頻率而言,與年齡在18與40歲間之成人體內投與之FluarixT M 疫苗相比對老年受檢者所投與的兩種佐劑流行性感冒疫苗非劣效性。

表10在第21天產生至少兩種細胞因子之流行性感冒特異性CD4之經調節GM比(免疫原性之ATP組)

經調節之GM=基線效價之經調節幾何平均抗體;N=具有可用之接種前及接種後結果之受檢者的數目;98.8% CI=經調節之GM比的98.8%信賴區間(Ancova模型:適合基線調節);LL=下限,UL=上限;數據來源=附表IIIA

結果-描述性分析(表6) 主要發現為:1)接種前CMI反應在年輕成人體內比在老年人體內高2)接種後:-關於年輕成人(18-40歲)體內之CMI反應存在流行性感冒疫苗之輔助劑作用-在已接受含佐劑流行性感冒疫苗之老年人體內CMI反應可與年輕成人之CMI反應相當。

對於所有測試而言與FluarixT M (18-40歲)相比,對研究之所有細胞因子(IL-2、CD40L、TNF-α及IFN-γ)之CD4 T淋巴細胞反應之接種前後的差異顯著高於在佐劑疫苗情況下。

第三目標之分析: 為了評價第三終點,在第0、21、90及180天量測流行性感冒特異性CD4/CD8 T淋巴細胞及記憶B細胞之頻率。

.對各抗原在第0及21天對各接種組概述(描述性統計)流行性感冒特異性細胞因子陽性CD4/CD8 T淋巴細胞之頻率。

.將非參數測試(Wilcoxon測試)用於比較兩組(流行性感冒含佐劑之疫苗對Fluarix T M )之間的位置差異且在各不同測試中對各抗原計算統計學p值。

.在各不同測試中對各接種組及各抗原計算第21天/第0天(接種後/前)之間的個體差異之描述性統計。

.將非參數測試(Wilcoxon測試)用於比較接種後/前之個體差異且將在各不同測試中對各抗原計算統計學p值。

在表11中描述來自用於比較流行性感冒特異性CD4 T淋巴細胞之頻率差異之Wilcoxon測試的p值。

結果-評價第三終點(表11)

主要結論為:.接種前流行性感冒特異性CD4之GM頻率在所有老年受檢者組中為類似的但在18與40歲之間的成人中較好。

.接種後(第21天)流行性感冒特異性CD4 T淋巴細胞之頻率在佐劑疫苗接種之老年受檢者體內及在經FluarixT M 接種之18與40歲之間年齡的成人體內為類似的。

.在老年受檢者體內,接種後(第21天)流行性感冒特異性CD4 T淋巴細胞之頻率在佐劑疫苗接種後顯著高於在FluarixT M 情況下。

接種前及接種後流行性感冒特異性CD8 T細胞之GM頻率在所有組中大體上類似。

表11 推論性統計:各時間點CD4 T細胞之Kruskal-Wallis測試的p值(免疫原性之ATP組)

結果-體液免疫反應終點之評價 所觀察之變量: 在第0、21、90及180天:對疫苗中所表現之三種流行性感冒病毒株(抗-H1N1、抗-H3N2及抗-B-抗體)中每一者單獨所測試之血清血球凝集-抑制(HI)抗體效價。

對抗所有疫苗抗原之HI抗體的截斷值在分析前藉由實驗室來確定(且等於1:10)。血清陰性受檢者為其抗體效價低於截斷值之受檢者。血清陽性受檢者為其抗體效價大於或等於截斷值之受檢者。對低於檢定臨界值之抗體效價給出臨界值一半之任意值。

基於HI抗體效價,計算以下參數:.藉由取效價對數轉換之平均值之反對數所計算之第0天及第21天之HI抗體的幾何平均效價(GMT)。

.第21天之血清轉化因子(SF)定義為與第0天相比第21天血清HIGMT增加的倍數。

.第21天之血清轉化率(SC)定義為在接種前HI效價<1:10及接種後效價1:40或接種前效價1:10及接種後效價增加最少4倍情況下已接種者之百分比。

.第21天之血清保護率(SPR)定義為在血清HI效價1:40情況下已接種者之百分比。

在各組內分別獲得GM之95% CI。首先假定對數轉換之效價一般在未知變異數情況下正態分佈獲得經對數轉換之效價之平均值的95% CI。接著藉由經對數轉換之效價之平均值之95% CI的指數轉換獲得GM之95% CI。

特定抗體量測之丟失血清結果未經替代。因此在給定時間點無血清結果之受檢者不有助於對該時間點之檢定分析。

體液免疫反應結果(圖7及表12) 在4個處理組中接種前全部3種疫苗病毒株之HI抗體的GMT在相同範圍內。接種後,與相同群體中之標準Fluarix相比存在增加老年人體內體液反應之2種佐劑的清楚作用(圖7)。

GMT .對於AS01E之H1N1而言顯著較高.對於兩種佐劑之H3N2而言顯著較高。

接種後二十一天,對於New Caledonia及B/Jangsu病毒株而言Fluarix之受檢者(18-40歲)具有較高之HI反應。

如表12中所示,在超過60歲之受檢者體內含佐劑流行性感冒疫苗超出歐洲官方對裂解病毒粒子流行性感冒疫苗之每年一次註冊的要求["Note for Guidance on Harmonization of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes"(CPMP/BWP/214/96)]。

接種後,Fluarix(65歲)組與A/H1N1/New Caledonia病毒株之Flu/AS01B及Flu/AS01E之間存在血清保護率的統計學差異。

對於各疫苗病毒株而言,與Fluarix(18-40歲)組相比2種流行性感冒含佐劑疫苗組之血清保護率在相同範圍中。

對於各疫苗病毒株而言,與Fluarix(18-40歲)組相比除了New Caledonia病毒株之外2種流行性感冒含佐劑疫苗組之血清保護率在相同範圍中。

N=受檢者之總數;%=在第21天效價在指定範圍內之受檢者的百分比;CI=信賴區間

VI.3.2.免疫原性結論 .與年齡在18與40歲之間的成人相比,接種前流行性感冒特異性CD4之頻率顯著較低。用FluarixT M 接種後,與年輕成人相比接種後頻率(第21天)在老年成人體內仍然較低。相反,就接種後流行性感冒特異性CD4之頻率而言證明在佐劑疫苗情況下老年受檢者與年齡在18與40歲之間的成人體內用FluarixT M 接種相比非劣效性。

.就HI抗體反應而言關於體液免疫反應,所有流行性感冒疫苗滿足歐洲官方對流行性感冒滅活疫苗之每年一次註冊的要求["Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes"(CPMP/BWP/214/96)]。在老年成人體內,含佐劑疫苗介導至少比FluarixT M 高之對流行性感冒血球凝集素之體液免疫反應的趨勢。在表13中概述與FluarixT M 相比老年受檢者體內由含佐劑疫苗所介導之對抗各疫苗病毒株之體液免疫反應之間的顯著差異。與經FluarixT M 接種之年齡在18與40歲之間的成人相比,經含佐劑疫苗接種之老年受檢者顯示較高之第21天對抗A/New York病毒株之接種後GMT及血清轉化因子的趨勢。

接種後GMT=接種後幾何平均效價

VI.4.反應原性結論VI.4.1.不良事件(AE)記錄 記錄7天隨訪期(接種日及隨後6天)期間出現的請求症狀(參見表14)。亦記錄21天隨訪期(接種日及隨後20+3天)期間出現的非請求症狀。如表15中所描述評價以下AE之強度。

注意:在晚間記錄溫度。應在日間其他時間進行額外溫度量測,記錄最高溫度。

局部注射位點發紅/腫脹之最大強度如下評分:0為0 mm;1為>0-20 mm;2為>20-50 mm;3為>50 mm。發熱之最大強度如下評分:1為>37.5-38.0℃;2為>38.0-39.0℃;3為>39.0℃。

研究者對所有其他AE(亦即未請求之症狀,包括研究期間所報導之SAE)的強度進行評價。評價以研究者之臨床判斷為基礎。將所記錄之各AZ的強度指定為以下類型之一:1(輕度)=受檢者容易忍受之AE,其導致輕微不適且不干擾日常活動;2(中度)=十分令人不適以干擾正常日常活動之AE;3(重度)=妨礙正常、日常活動之AE(在成人/青少年體內,該AE將(例如)妨礙上班/上學且將需要投與正確療法)。

VI.4.2.不良事件(AE)記錄 在老年受檢者體內,就局部及全身症狀而言在含佐劑疫苗下所觀察之反應原性高於FluarixT M 情況下。用含佐劑疫苗接種後發病率及症狀強度均增加(圖8)。與接受其中免疫刺激劑為較低濃度之含佐劑疫苗組相比,在接受經最高免疫刺激劑(MPL、QS21)濃度輔佐之疫苗組中3級症狀顯示較高之趨勢。然而在所有狀況下症狀迅速消失。

實例VII:小鼠體內含佐劑HPV疫苗之臨床前評價

本研究使用結合自HPV 16之L1及HPV 18之L1所形成之病毒樣顆粒(VLP)作為抗原之來自人類乳頭狀瘤病毒(HPV)的二價抗原組合物。研究目標為比較當以AS01B及AS01B之1/5稀釋物調配時抗原製劑的效力,其係以GSK之子宮頸癌疫苗中發現之當前佐劑AS04(明礬上之MPL)為基準。

VII.1-接種 在第0天及第28天用由得自Hi-5 80/80L法之HPV16/18 L1(各2 μg或0.5 μg)構成且與AS04(與明礬一起調配之50 μg MPL)或AS01B(0.5 ml中之50 μg QS21-50 μg MPL)1/10及1/50人類劑量一起調配之疫苗調配物注射小鼠(每組n=12)。在小鼠體內進行研究時,可認為1/10人類劑量等於AS01B人類調配物,亦即0.5 ml中50 μg QS21及50 μg MPL且可將1/50認為係AS01B人類調配物之1/5稀釋物,亦即0.5 ml中10 μg QS21及10 μg MPL。在劑量II後14及45天採集血液樣本以對個體血清中之總抗-L1型特異性抗體檢定。在II後第7及14天用PBMC及在第45天使用脾細胞量測胞內細胞因子染色。在II後第45天使用脾細胞量測VLP特異性記憶B細胞之頻率。

VII.2-抗-HPV 16/18 L1 ELISA 使用HPV-16及HPV-18 L1作為塗層藉由ELISA進行抗-HPV-16及HPV-18 L1抗體之定量。抗原以PBS中0.5 μg/ml之最終濃度稀釋且在4℃下隔夜吸附至96孔微量滴定板(Maxisorp Immuno板,Nunc,Denmark)之孔中。接著在37℃下用含有1%牛血清白蛋白之PBS(飽和緩衝液)培養板1小時。將含有PBS+0.1% Tween20+1% BSA之緩衝液中稀釋之血清添加至HPV L1塗覆之板中且在37℃下培養1小時30分鐘。用PBS 0.1% Tween20洗滌板四次且將飽和緩衝溶液中以1/1000倍稀釋之生物素結合之抗小鼠Ig(Dako,UK)添加至各孔中且在37℃下培養1小時30分鐘。洗滌步驟後,在37℃下再歷時30 min添加飽和緩衝液中1/3000倍稀釋之抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶(Dako,UK)。如上文所述洗滌板且在室溫下用pH值4.5之0.1% Tween20、0.05 M檸檬酸鹽緩衝液中之0.04%鄰苯二胺(Sigma)、0.03% H2 O2 之溶液將其培養20 min。用2N H2 SO4 中止反應且在492/620 nm讀數。藉由SoftMaxPro自參考計算ELISA效價(使用四參數等式)且以EU/ml為單位表示。

VII.3-胞內細胞因子染色(ICS) 在II後第7及14天用PBL及第二次免疫後第45天用脾細胞進行T細胞之細胞因子胞內染色。自小鼠收集PBMC(1池/組)或脾細胞(每組4池3個器官)。用VLP 16、18、31或45(5 μg/ml)+CD49d CD28抗體(1 μg/ml)在每毫升5×106 個細胞(96孔微板)之最終濃度下進行脾細胞之活體外抗原刺激且接著在37℃下培養3 h。抗原再刺激步驟後,在37℃下在Brefeldin(1 μg/ml)存在下培養細胞隔夜以抑制細胞因子分泌。如下進行細胞染色:洗滌細胞懸浮液,將其再懸浮於50 μl含有2% Fc阻斷劑之PBS 1% FCS中(1/50;2.4G2)。於4℃下培養10 min後,添加50 μl抗-CD4-APC(1/50)與抗-CD8 perCp(1/50)之混合物且將其於4℃下培養30 min。在PBS 1% FCS中洗滌後,將細胞藉由再懸浮於200 μl Cytofix-Cytoperm(Kit BD)中經透化且於4℃下培養20 min。接著用Perm Wash(Kit BD)洗滌細胞且用50 μl於Perm Wash中稀釋之抗-IFγ APC(1/50)+抗-IL-2 FITC(1/50)的混合物將其再懸浮。於4℃下培養2 h後,用Perm Wash洗滌細胞且將其再懸浮於PBS 1% FCS+1%聚甲醛中。藉由FACS進行樣本分析。活細胞經門控(FSC/SSC)且對約20,000個事件(淋巴細胞)進行探測。對CD4+及CD8+門控群體計算IFγ+或IL2+之百分比。

VII.4-B細胞記憶 第二次免疫後四十五天,使小鼠犧牲,藉由lymphoprep梯度(Cedarlane)分離脾細胞。接著將B細胞再懸浮於含有添加劑(丙酮酸鈉1 mM、MEM非必需胺基酸、Pen/Strep、麩醯胺酸及β-2巰基乙醇)、5%胎牛血清、50U/ml rhIL-2(eBioscience)及3 μg/ml CpG之RPMI 1640培養基(Gibco)中。以每平底6孔5 ml以每毫升106 個細胞之最終濃度將細胞培養五天。在使用乙醇之活化步驟後,用10 μg/ml VLP或用1/200倍稀釋於PBS中之山羊抗小鼠Ig(GAM;Sigma)塗覆硝化纖維板(Multiscreen-IP;Millipore)。在使用完全培養基之飽和步驟後,將100 μl每毫升2×106 個細胞添加至VLP塗覆之板中且將每毫升106 個及5×105 個細胞添加至GAM板中。在37℃下培養2小時後,將板儲存於4℃下隔夜。用PBS 0.1% Tween20將板洗滌四次且將1/200倍稀釋於PBS 1% BSA 5% FCS(稀釋緩衝液)中之抗小鼠Ig Biot分佈至板中且於37℃下培養2小時。洗滌步驟後,於37℃下再歷時1小時添加1/550倍稀釋於稀釋緩衝液中之Extravidin HRP(Sigma)。如上文所述洗滌板且在室溫下用AEC溶液(Sigma)培養10 min。在自來水下藉由溫和地清洗板來中止反應。當板乾燥時,用KS400讀數。

VII.5-統計分析 使用單因子變異數分析(ANOVA 1)比較調配方式。為標準化之目的對經log10轉換之數據進行分析。當偵測到處理方式之間的顯著差異時(p值0.05),在0.05顯著水準下進行方式之成對比較(Student-Newman-Keuls多重比較測試)。

VII.6-結果 如上文VII.1使小鼠免疫。使用以下組:

VII.6.1-體液反應 未觀察到用於抗HPV 16-L1抗體效價或抗HPV 18-L1抗體效價之具有任一佐劑稀釋物之兩種所測試抗原劑量的顯著劑量範圍(圖9)。

無論抗HPV 16-L1抗體效價之抗原為何,均未觀察到各佐劑之兩種所測試劑量的顯著劑量範圍。

當考慮抗HPV 18-L1抗體效價時,如II後第14天所量測與AS01B(1/50 HD)相比對於AS01B(1/10 HD)觀察到效價之略微增加(2.5倍劑量範圍,p值=0.0035),然而僅對2 μg抗原而不對0.5 μg抗原觀察到此範圍(p值=0.0867)。在II後第45天之前,無論抗原劑量為何均未觀察到各佐劑之兩種所測試劑量的顯著劑量範圍。

VII.6.2-細胞反應胞內細胞因子染色 無論HPV 18-L1佐劑劑量為何均未觀察到兩種所測試抗原劑量的抗原劑量範圍作用。以具有不同佐劑劑量之兩種所測試抗原劑量獲得類似之VLP16特異性CD4+T細胞頻率(圖10)。

與AS01B(1/50 HD)相比對AS01B(1/10 HD)觀察到微小劑量作用(2.6倍,HPV 18-L1之p值=0.0009,2倍,HPV 16-L1之p值=0.0187),然而僅對2μg抗原而不對0.5 μg抗原觀察到此範圍。

特異性B記憶細胞 無論HPV 16或18 L1之佐劑劑量為何均未觀察到兩種所測試抗原劑量的劑量範圍作用(圖11)。

無論HPV 17或18 L1之抗原劑量為何均未觀察到兩種所測試佐劑劑量的佐劑劑量範圍作用。

如自上述結果中可見,AS01B之1/5倍稀釋物製造在免疫原性組合物中具有與AS01B本身均等功效之調配物。

實例VIII:小鼠體內含佐劑肺炎鏈球菌疫苗之臨床前評價。

本研究中所用之肺炎球菌疫苗為11價含佐劑肺炎球菌結合疫苗(11PCV/AS),其由經AS01B或AS01E輔佐之11種肺炎球菌多醣結合物之混合物組成。結合物由肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F純化多醣組成,其各自與載體蛋白(白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)或來自流行性感冒嗜血桿菌之蛋白D(PD))個別結合。疫苗作為用液體佐劑之一復水的凍乾粉存在。

如下製造11PCV/AS:活化及偶合條件對各多醣具有特異性。此等條件在下表中給出。將經分級之多醣(除了PS5、6B及23F之外)溶解於2 M NaCl或用於注射之水(WFI)中。評價所有血清型之最佳多醣濃度。如下文所詳述,使除了血清型18C之外的所有血清型與載體蛋白直接結合。

將CDAP(CDAP/PS比0.75 mg/mg PS)自乙腈或乙腈/水50%/50%溶液中之100 mg/ml儲備液中添加至多醣溶液中。1.5分鐘後,添加0.2 M-0.3 M NaOH以獲得特定活化pH值。在25℃下在3分鐘期間在此pH值下進行多醣活化。將經純化之蛋白(蛋白D或DT)(數量取決於初始PS/載體蛋白比)添加至經活化之多醣中且在pH值調節下在特定pH值下進行偶合反應多達2小時(視血清型而定)。為了抑止未反應之氰酸鹽酯基,接著將2 M甘胺酸溶液添加至混合物中。將pH值調節至抑止pH值(pH值9.0)。在25℃下攪拌溶液30分鐘且接著在2-8℃下繼續緩慢攪拌隔夜。

18C之製備:18C係經由連接子(脂肪酸二醯肼(ADH))與載體蛋白相連。

結合前使多醣血清型18C經微流化。

用EDAC使破傷風類毒素衍生化 為了使破傷風類毒素衍生化,以0.2 M NaCl中25 mg/ml之濃度稀釋經純化之TT且添加ADH間隔劑以達到0.2 M之最終濃度。當間隔劑溶解完成時,將pH值調節至6.2。接著添加EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-胺基丙基)碳化二醯亞胺)以達到0.02 M之最終濃度且在pH值調節下將混合物攪拌1小時。藉由在25℃下歷時至少30分鐘將pH值增加至9.0來中止縮合反應。

接著使經衍生之TT(10 kDa CO膜)透濾(diafiltrate)以移除殘餘之ADH及EDAC試劑。

在偶合步驟之前最後無菌過濾TTA H 本體且將其儲存於-70℃。

使TT AH 與PS 18C化學偶合 結合參數之詳細描述存在於表1中。

以規定濃度將2 g經微流化之PS溶解於水中且藉由添加NaCl粉末將其調節為2 M NaCl。

添加CDAP溶液(在50/50體積/體積丙酮/WFI中新鮮製備100 mg/ml)以達到適當之CDAP/PS比。

藉由添加0.3 M NaOH將pH值增加至活化pH值9.0且使其穩定於此pH值下直至添加TTA H

3分鐘後,添加經衍生之TTA H (0.2 M NaCl中20 mg/ml)以使TTA H /PS比達到2;將pH值調節至偶合pH值9.0。在pH值調節下將溶放置液一小時。

為抑止之目的,將2 M甘胺酸溶液添加至混合物PS/TTA H /CDAP中。

將pH值調節至抑止pH值(pH值9.0)。

在25℃下攪拌溶液30 min且接著在2-8℃下在繼續緩慢攪拌下放置隔夜。

純化結合物:使用經0.15 M NaCl平衡之Sephacryl 500HR凝膠過濾管柱藉由凝膠過濾來純化結合物(對於18C為S500HR)以移除小分子(包括DMAP)及未結合之PS及蛋白。基於反應組份之不同分子大小,首先溶離PS-PD、PS-TT或PS-DT結合物,接著釋放PS,接著釋放PD或釋放DT及最後釋放DMAP及其他鹽(NaCl、甘胺酸)。

藉由UV2 8 0 n m 偵測含有結合物之溶離份。將溶離份根據其Kd彙集,無菌過濾(0.22μm)且儲存於+2-8℃下。測定結合物製劑中之PS/蛋白質比。

PS肺炎鏈球菌-蛋白D/TT/DT結合物之特定活化/偶合/抑制條件

接著使11種結合物混合在一起,且使最終抗原製劑與適當佐劑混合隨後免疫。

在第0、14及28天用0.1 μg以AS01B或AS01E調配之11-價PS結合物使40隻雌性4週齡Balb/c小鼠IM免疫。第42天在所收集之血清中藉由ELISA給藥抗-PS IgG抗體。

如自圖12中可見,與AS01B調配物相比經稀釋之AS01E調配物之間觀察到可比較之反應,除了其中在AS01B下觀察到較高反應之PS 14及其中在AS01E下觀察到較高反應之PS 19F外。

實例IX:含佐劑及不含佐劑細胞巨大病毒免疫原性組合物之臨床前評價

IX.1:豚鼠IX.1.1 Elisa抗-gB 使用gB作為包被抗原藉由ELISA進行抗-gB抗體之定量。以4 μg/ml之最終濃度將抗原稀釋於PBS中且於4℃下在96孔微量滴定板中培養100 μl隔夜。接著在37℃下用200 μl含有1%牛血清白蛋白之PBS使板飽和1小時。添加血清之兩倍連續稀釋物(每孔100 μl)且在37℃下培養1小時30分鐘。用PBS 0.1% Tween 20洗滌板4次且將100 μl辣根過氧化物酶抗豚鼠IgG(Dako,UK)添加至各孔中且在37℃下培養1小時30分鐘。用PBS 0.1% Tween 20洗滌板4次且用水洗滌1次。接著於22℃下用pH值4.2之0.1 M檸檬酸鹽緩衝液中之鄰苯二胺(Sigma)溶液100 μl將其培養20 min。用100 μl 2 N H2 SO4 中止此反應且在490/620 nm下研究。藉由插入來自SoftMaxPro製造之樣本參考的OD值確定Elisa效價。效價以EU/ml為單位表示。

在2後第14天使用UNISTAT對Elisa數據進行統計分析。用於分析變異數之實驗方案可如下簡要地描述:1)對數轉換數據2)為了驗證正態性對各群體(組)進行之Shapiro-Wilk測試3)為了驗證不同群體(組)之間的變異數同源性進行Cochran試驗。4)對所選數據進行變異數分析(單因子)5)用於多重比較之Tuckey-HSD測試。

IX.1.2-中和檢定 檢定之前,將MRC5細胞(每200 μl MEM培養基10000個細胞)分佈在96孔微板中且在37℃下用CO2 培養3天。獲得經滅活血清之兩倍稀釋物(56℃下30 min)且將其在37℃下用100 μl病毒溶液(800/ml)培養1小時。培養後,在含有MRC5單層(monoloayer)之96孔微板中使100 μl血清/病毒混合物接種。於35℃下使板在2000 RPM下離心1小時。在37℃下培養隔夜後,用丙酮80%溶液固定板(在-20℃下20分鐘)。棄去丙酮溶液且在37℃下使用特異性單株抗-立即早期抗原偵測CMV陽性細胞1小時。用PBS洗滌板3次且將生物素結合之抗小鼠Ig添加至各孔中且在37℃下培養1小時。洗滌步驟後,在37℃下再歷時30分鐘添加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶。洗滌板4次且用真藍(True-blue)溶液培養10分鐘。藉由在顯微鏡下檢查記錄特定顏色之信號。將中和效價表示為血清最高稀釋度之倒數,其與病毒對照(CMV如無血清之細胞)相比產生CMV陽性細胞之50%減少。

IX.1.3-免疫實驗方案 使4組免疫。除了僅含4個受檢者之對照組(第4組)外,各組含有8隻5-8週齡之雌性Hartley Crl:(ha)豚鼠。在第0及28天使受檢者IM免疫。初次免疫28天後及第二次免疫14天後收集血清樣本。如上文所述對I後28天及II後14天所採集之血清進行Elisa。如上文所述在II後第14天進行中和檢定。分組如下:

對於前面三組,肌肉內注射溶解於500 μl PBS、AS01B或AS01E(如上文實例II.2中所製備)中之15 μg gB(如WO95/31555中所揭示製備)。在4組中,僅肌肉內投與PBS。

IX.1.4-結果 如圖13可見,與普通gB相比兩個含佐劑組觀察到顯著較高之抗-gB ELISA效價(對於gB與AS01B及gb/AS01E而言分別高8及5.5倍)。與gB/AS01E組相比在gB/AS01B組中劑量II後抗體效價極略微地較高(1.5倍)。

多重比較:Tuckey-HSD 不含佐劑<AS01E=AS01B

關於中和效價(圖14):.在普通gB組中未觀察到特異性中和抗體。

.在兩個含佐劑組中偵測到特異性中和抗體。

.在兩個含佐劑組中觀察到類似含量之中和抗體。

IX.2-小鼠IX.2.1-ELISA抗gB 使用gB作為包被抗原藉由ELISA進行抗-gB抗體之定量。以PBS中1 μg/ml之最終濃度稀釋抗原且於4℃下在96孔微量滴定板中培養100 μl隔夜。接著在37℃下用200 μl含有1%牛血清白蛋白之PBS使板飽和1小時。添加血清之兩倍連續稀釋物(每孔100 μl)且在37℃下培養1小時30分鐘。用PBS 0.1% Tween 20將板洗滌4次且於37℃下再歷時30分鐘將100 μl抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶添加至各孔中。用PBS 0.1% Tween 20將板洗滌4次且用水洗滌1次。接著於22℃下用pH值5.8之0.1 M檸檬酸鹽緩衝液中之75%四-甲基-聯苯胺100 μl將其培養10 min。用100 μl 0.4 N H2 SO4 中止此反應且在450/620 nm下讀數。藉由插入來自SoftMaxPro製造之樣本參考的OD值確定Elisa效價。效價以EU/ml為單位表示。

在2後第14天使用UNISTAT對Elisa數據進行統計分析。用於分析變異數之實驗方案可如下簡要地描述:1)對數轉換數據2)為了驗證正態性對各群體(組)進行Shapiro-Wilk測試3)為了驗證不同群體(組)之間的變異數同源性進行Cochran測試4)對所選數據進行變異數分析(單因子)5)用於多重比較之Tuckey-HSD測試。

IX.2.2-中和檢定 檢定之前,將MRC5細胞(每200 μl MEM培養基10000個細胞)分佈在96孔微板中且在37℃下用5% CO2 培養3天。將經滅活血清(56℃下30 min)之兩倍稀釋物(60 μl)在37℃下用60 μl病毒溶液(800 IPU/ml)培養1小時。培養後,在含有MRC5細胞之96孔微板中使100 μl血清-病毒混合物接種。於35℃下使板在2000 RPM下離心1小時。在37℃下培養隔夜後,用丙酮80%溶液固定板(在-20℃下20分鐘)。棄去丙酮溶液且在37℃下使用特異性單株抗-立即早期I(IE-I)抗原偵測CMV陽性細胞1小時。用PBS洗滌板3次且將生物素結合抗小鼠Ig添加至各孔中且在37℃下培養1小時。洗滌步驟後,在37℃下再歷時30分鐘添加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶。將板洗滌4次且用真藍(True-blue)溶液培養10分鐘。藉由在顯微鏡下檢查來記錄特定顏色之信號。將中和效價表示為與病毒對照(CMV加無血清之細胞)相比產生CMV陽性細胞50%減少之最高稀釋度的倒數。

IX.2.3-胞內細胞因子染色 在第二次免疫後第7及21天進行T細胞細胞因子之胞內偵測。自小鼠體內收集PBL且將其彙集(每組1池)。用一池包含CMV序列之肽或用gB蛋白進行活體外淋巴細胞抗原刺激(每毫升107 個細胞之最終濃度)。在37℃下培養PBL/抗原混合物2 h。接著於37℃下在Brefelding(1 μg/ml)存在下培養細胞隔夜。

如下進行細胞染色:洗滌細胞懸浮液,將其再懸浮於50 μl含有2% Fc阻斷劑之PBS 1及FCS中。於4℃下培養10 min後,添加50 μl抗-CD4 PE及抗-CD8 perCp之混合物且將其於4℃下培養30 min。在PBS 1% FCS中之洗滌步驟後,細胞膜藉由再懸浮於200 μl Cytofix=Cytoperm(套組Beckton Dickinson)中經滲透且在4℃下培養20 min。接著用Perm Wash(kit BD)洗滌細胞且用50 μl於PermWash中稀釋之抗-IFNγAPC+抗-IL-2 FITC將其再懸浮。在4℃下培養2小時後,將細胞再懸浮於PBS 1% FCS+1%聚甲醛中。

藉由FACS進行樣本分析。活細胞經門控且對+/-20000個事件進行探測。對CD4+及CD8+門控群體計算IFNg+或IL2+之百分比。

IX.2.4-免疫實驗方案 使4個組免疫。各組含有12隻4-10週齡之雌性C57B1/6小鼠。

對於各組而言,將抗原(如WO95/31555中所揭示製備)(30 μg/ml)溶解於625 μl PBS或佐劑AS01B或AS01E(如上文實例II.2中所製備,其分別具有每毫升100 μl免疫刺激劑或每毫升50 μl免疫刺激劑之濃度)中。肌肉內注射50 μl(亦即0.5 ml人類劑量之1/10)。在第0及28天進行注射。對於ELISA及中和檢定在第二次注射後14天收集血清樣本。在第二次注射ICS後7天及21天收集PBL。

IX.2.5-結果 抗-gB ELISA效價(圖15)。

在不含佐劑gB組中觀察到不可偵測含量之極稀抗-gB抗體。然而,在兩個佐劑組中觀察到高抗體反應。AS01B與AS01E組之間無統計學顯著差異。

多重比較:Tuckey-HSD 普通<AS01E=AS01B

抗-CMV中和效價(圖16)與gB普通組相比觀察到兩個含佐劑組之顯著較高之抗-gB中和效價。AS01B與AS01E調配物之間未觀察到中和抗體效價之顯著差異。

細胞介導之免疫性。

由於再刺激7個II後樣本所觀察之極低反應程度,組間不可進行區分且不可見到CD4及CD8刺激之明確反應(圖17)。在樣本製備期間此等低至不可偵測之反應可能係由於技術問題。然而,反應可在第二次注射後21天見到。CD4數據(圖18)顯示用gB(5 μg/ml)或肽(2 μg/ml或4 μg/ml)再刺激後無差異。對於AS01E及AS01B可見類似細胞因子概況。對於CD8刺激不可見明確反應(圖19)。

此等實驗顯示對於另一抗原組合物及在兩種不同有機體中,具有低含量免疫刺激劑之佐劑與具有較高含量者一樣免疫有效。

X:含佐劑RTS,S疫苗之臨床前評價X.1-調配物 抗原組合物(RTS,S)在酵母菌(Saccharomyces cervisiae)中製造且由兩種蛋白(RTS及S)組成,該等蛋白胞內及自發地裝配至各自估計含有平均100個多肽之混合聚合顆粒結構中。RTS為424個胺基酸之51 kDa雜交多肽鏈,其由得自惡性瘧原蟲病毒株NF53之子孢子表面抗原(CSP抗原,a.a.207至395)之189aa組成,其與B型肝炎病毒S蛋白之胺基末端融合。S為對應於B型肝炎病毒之表面抗原之24 kDa多肽(226個胺基酸長)。凍乾之抗原小球含有約50 μg(當設計為以0.5 ml與AS01B一起調配時)或25 μg(當設計為以0.5 ml與AS01E一起調配時)抗原。

藉由在貯槽中混合各種組份(PBS、脂質體、MPL及QS21)及在無菌條件下攪拌製備AS01B及AS01E。接著使產物經無菌過濾接著填充至瓶或注射器中。將液體佐劑儲存於+2℃至+8℃下接著將其用於復水凍乾之抗原小球。

X.2-小鼠實驗 為了比較與以AS01E調配之RTS,S相比由RTS,S/AS01B誘發之對RTS,S特異之免疫反應進行兩組小鼠體內之實驗。在各組實驗中,用10、5或2.5 μg以AS01B或AS01E佐劑調配之RTS,S分別兩週三次使C57B1/6小鼠(每組10隻小鼠)肌肉內免疫。作為對照,兩組單獨經AS01B或AS01E免疫。第三次免疫後15天藉由ELISA評價各小鼠對HB及CS特異之抗體反應。對在兩組實驗中接受相同處理之所有小鼠計算幾何平均抗體效價及其95%信賴區間。對來自兩組實驗之彙集數據進行評價佐劑作用及抗原劑量作用的統計分析。第二及第三次免疫後7天藉由流式細胞術量測來自每組5隻小鼠之血細胞池的CD4及CD8特異性T細胞反應。因此在各組實驗中對各組產生兩個值。

體液免疫反應 如圖20及21中所示,AS01B及AS01E佐劑誘發對抗CSP及HB之強的可比較之抗體反應。

對於抗-CSP GMT之三因子ANOVA分析顯示對於5或2.5 μg劑量之RTS,S而言AS01B與AS01E之間不存在顯著差異。

對於10 μg劑量而言,發現AS01B佐劑誘發比AS01E高之抗-CS效價且GMT比"AS01B組/AS01E組"為1.93(95% CI:1.33-2.79;p=0.001)。

細胞介導之特異性免疫反應 圖22及23展示對表現IL-2及/或IFNγ之CSP及HB特異之CD4及CD8 T細胞的含量。

三次免疫後對CSP特異之CD4反應在AS01B情況下傾向於比AS01E高,然而在AS01E情況下CD8 T細胞反應等於或優於在AS01B。

除了其中CD4 T細胞之含量在兩種佐劑之間為可比較之較低劑量RTS,S之外,三次免疫後對HB特異之CD4反應在AS01B情況下高於AS01E。由以AS01E調配之RTS,S誘發之HB特異性CD8 T細胞反應等於或優於由以AS01B調配之RTS,S所誘發之反應。

認為此等差異在所預期之細胞免疫學檢定之變異性內。

小鼠體內RTS,S/AS01E疫苗之臨床前評價揭示類似於RTS,S/AS01B者之可接受的安全概況。

XI:RTS,S/AS01B及RTS,S/AS01E之臨床評價 如上文實例IX製備調配物。將蔗糖用作凍乾抗原小球中的防腐劑。如實例IX,將液體佐劑用於復水凍乾抗原。AS01B及AS01E如實例II.2中所描述製備且儲存於+2至+8℃下直至需要用於復水。

當前在生活於Gabon之18個月至4歲的兒童體內進行經AS01E輔佐之RTS,S之安全性及免疫原性的II期隨機雙盲橋式研究。接種時程為0、1、2個月接種時程。對於RTS,S/AS01E而言當作為3個劑量按照0、1、2個月時程對生活在瘧疾流行區中之18個月至4歲兒童肌肉內投與時目標如下:第一目標-評價劑量3後一個月之前的安全性。-就抗-CS抗體反應而言證明劑量3後一個月RTS,S/AS02D之非劣效性。

第二目標-評價劑量3後一個月之前的反應原性-就抗HB抗體反應而言證明劑量3後一個月RTS,S/AS02D之非劣效性。-描述劑量3後最多一個月對抗B型肝炎之血清保護-描述劑量3後最多一個月之抗-CS反應

第三目標-劑量3後一個月至劑量3後12個月之間的安全性-劑量3後12個月時對CS抗原之體液免疫反應-劑量3後12個月時對HB抗原之體液免疫反應探測性目標-評價劑量3後最多12個月對CS抗原之T細胞介導之免疫反應-評價劑量3後最多12個月對CS抗原之B細胞記憶免疫反應-根據篩檢時文獻記錄之HBV免疫狀況描述劑量3後最多一個月之抗-CS反應。

180位受檢者將入選。估計在研究結束時約150位受檢者將為可評價的。將篩選年齡為18個月至4歲之健康男性及女性兒童。藉由IM途徑將疫苗投與至左三角肌中。

圖1 -MPL製劑之圖示。

圖2 -用實驗調配物使雪貂免疫後對抗各種流行性感冒病毒株之體液反應:異源預致敏(H1N1 A/Stockholm/24/90)之前及之後、免疫(H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/Panama/2007/99及B/Shangdong/7/97)後及異源攻毒(H3N2 A/Wyoming/3/2003)後紅血球凝集抑制測試(GMT +/-IC95)。

圖3 -雪貂研究:攻毒後(第42天)鼻腔沖洗液中之病毒效價。

圖4 -小鼠研究:用實驗調配物免疫小鼠後對抗三種流行性感冒疫苗菌株之體液反應:免疫(H1N1 A/New Caledonia/20/99、H3N2 A/Wyoming/3/2003及B/Jiangsu/10/2003)免疫後21天血球凝集抑制測試(GMT +/-IC95)。

圖5 -小鼠研究:細胞介導之免疫反應:免疫後第7天之Flu特異性CD4+T細胞反應。

圖6 -小鼠研究:CD4之CMI-彙集之菌株(全部兩倍)-第0天及第21天。

圖7-HI抗體在第0及21天之GMT。

圖8 :用含佐劑流行性感冒病毒調配物免疫後在7天隨訪期期間所報導之人體內局部及全身症狀(總共及相關之第3級)的發病率,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖9 :用含佐劑HPV調配物免疫後小鼠體內對HPV 16及18 L1之體液反應,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖10 :小鼠體內細胞介導之免疫反應:胞內細胞因子染色-用含佐劑HPV調配物免疫後-VLP16及18 CD4+T細胞,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖11 :用含佐劑HPV調配物免疫後產生特異性B記憶細胞,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖12 :小鼠體內含佐劑肺炎鏈球菌(S.pneumonaie)疫苗之臨床前比較,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖13 :用含佐劑Gb疫苗免疫後豚鼠抗-gB ELISA效價,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖14 :用含佐劑Gb疫苗免疫後豚鼠抗CMV中和效價,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖15 :用佐劑gB疫苗免疫後小鼠抗-gB ELISA效價。

圖16 :用含佐劑gB疫苗免疫後小鼠抗CMV中和效價。

圖17 :小鼠研究:細胞介導之免疫作用-用一池gB肽再刺激後(第二次免疫後7天)CMV特異性CD4+及CD8+細胞。

圖18 :小鼠研究:細胞介導之免疫性-用兩種不同劑量之一池gB肽再刺激後(第二次免疫後21天)CMV特異性CD4+細胞。

圖19 :小鼠研究:細胞介導之免疫性-用兩種不同劑量之一池gB肽再刺激後(第二次免疫後21天)CMV特異性CD8+細胞。

圖20 :小鼠體內用含佐劑RTS,S疫苗免疫後對抗環子孢子蛋白(circumsporozoite protein)CSP之幾何平均抗體效價(GMT);具有兩種不同濃度之免疫刺激劑之佐劑的比較。

圖21 :小鼠體內用含佐劑RTS,S疫苗免疫後對抗B型肝炎表面抗原(HB)之幾何平均抗體效價(GMT);具有兩種不同濃度之免疫刺激劑之佐劑的比較。

圖22 :用含佐劑RTS,S免疫原性組合物免疫後IL-2及/或IFN γ藉由CSP-特異性CD4及CD8 T細胞之離體表現,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖23 :用含佐劑RTS,S免疫原性組合物免疫後IL-2及/或IFN γ藉由HB-特異性CD4及CD8 T細胞之離體表現,具有兩種不同免疫刺激劑濃度之佐劑的比較。

圖24 :用含佐劑三價裂解流行性感冒疫苗(A/New Caledonia、A/Wyoming、B/Jiangsu)免疫後小鼠體內之體液反應(兩種不同濃度之免疫刺激劑)。

圖25 :用含佐劑三價流行性感冒疫苗(A/New Caledonia、A/Wyoming、B/Jiangsu)免疫後小鼠體內細胞介導之免疫反應(兩種不同濃度之免疫刺激劑)。

Claims (8)

  1. 一種與佐劑組合之抗原或抗原製劑之用途,其係用於製備供人類疫苗接種之免疫原性組合物,該佐劑包含以脂質體形式存在之QS21及3D-MPL,其中該QS21及該3D-MPL均以介於24至26μg之含量存在於人類劑量中。
  2. 如請求項1之用途,其中該佐劑組合物進一步包含固醇,其中QS21:固醇之比為1:1至1:100重量/重量。
  3. 如請求項2之用途,其中該固醇為膽固醇。
  4. 如請求項1至3中任一項之用途,其中QS21:3D-MPL比率為1:1。
  5. 如請求項1至3中任一項之用途,其中該抗原或抗原製劑係衍生自水痘帶狀疱疹病毒(VZV)。
  6. 如請求項1至3中任一項之用途,其中該抗原或抗原製劑係衍生自結核分歧桿菌(M.tuberculosis)。
  7. 如請求項1至3中任一項之用途,其中該抗原或抗原製劑係衍生自細胞巨大病毒(CMV)。
  8. 如請求項1至3中任一項之用途,其中該抗原或抗原製劑係衍生自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)。
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