JP2002505106A

JP2002505106A - 乳酸菌によるマイコバクテリアのポリペプチドの製造

Info

Publication number: JP2002505106A
Application number: JP2000534650A
Authority: JP
Inventors: ジャンセン，カーステン，ラフストラップ; フォルカーセン，ジョルゲン
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 1998-03-06
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2002-02-19
Also published as: EP1058731A2; WO1999045119A3; WO1999045119A2; CA2322505A1; AU749672B2; NZ507278A; AU2611999A

Abstract

(57)【要約】エム・ツベルクローシス複合体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アフリカヌムおよびマイコバクテリウム・ボビス）又はいずれかの他のマイコバクテリア種に属するマイコバクテリア由来の生物反応性ポリペプチドを、ラクトコッカス・ラクチスのような組換え乳酸菌中で製造する方法。乳酸菌の産生するポリペプチドは1以上のポリペプチドのモノマー又はポリマー形態で、動物ならびにヒトでの遅延型過敏性（DTH）皮膚試験の診断剤及びワクチンとして有用である。生物反応性のESAT-6ホモダイマーポリペプチドも記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野この発明は、結核および他のマイコバクテリア感染症に対する診断試験、およ
び抗マイコバクテリアワクチンの分野、特に、遅延型過敏性（DTH）反応を含むインビボ試験およびインビトロ試験における診断試薬またはワクチンとして有用
なポリペプチドの提供に関する。この発明のひとつの具体例では、ポリペプチド
は組換え乳酸菌宿主微生物で産生され、DTH反応および/またはIFN-γ試験におい
て高い生物反応性（bioreactivity）を有する。この発明の別の具体例では、ESA
T-6ホモポリマーが、いずれの宿主微生物においても産生され、DTH反応および/ またはIFN-γ試験において高い生物反応性を有する。

【０００２】技術背景および先行技術結核は、開発途上国と産業国の両方で増加しており、相変わらず主な世界の健
康問題として残っている。疾患を抑制する方法には、危険性のある集団における
予防接種と組み合わされる早期診断および治療が含まれる。現在入手可能な抗結
核ワクチンは、今世紀の始めにカルメット（Calmette）とゲラン（Guerin）によ
って開発され、しばしば「カルメット・ゲランの桿菌（BCG）（Bacille Calmett
e et Guerin）ワクチン」と呼ばれている。ワクチン株は、胆汁含有増殖培地でマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）の毒性分離体を連続継代することによって弱毒化された。得られた株は、ヒトに対して無毒なようであっ
た。BCGワクチンは広く用いられているけれども、アメリカを含むいくつかの国では、一般的な集団予防接種プログラムに用いるためにそれを取り入れることは
決してしなかった。そのひとつの理由は、BCGの予防接種が、結核を診断し、かつ集団検査に用いられるツベルクリン皮膚試験の使用を妨げるためである。

【０００３】感受性の強いヒトまたは動物におけるマイコバクテリウム・ツベルクローシス
（Mycobacterium tuberculosis）または他のマイコバクテリア種による感染（あ
るいはBCGによる予防接種）は、細胞免疫系を活性化させるであろう。従って、個々の動物またはヒトの免疫状態は、マイコバクテリア抗原に対して感作された
リンパ球様細胞のレベルを測定すること、例えばマイコバクテリア抗原の皮内注
射後24から96時間に生じる「遅延型過敏性（DTH）反応」をインビボで測定することによってモニターすることができる。現在DTH反応試験に用いられている製品は、ツベルクリン、すなわち細菌を5〜
6週間培養した合成培地から回収されるエム・ツベルクローシスタンパク質の粗混合物からなる精製されたタンパク質誘導体（PPD）である。しかしながら、エム・ツベルクローシス複合体｛すなわちエム・ツベルクローシス、エム・ボビス
およびエム・アフリカヌム（M. africanum）｝に属する毒性マイコバクテリアの
構造組成物および弱毒化BCG株は、現在入手可能なPPDが交差反応性のために予防
接種した集団のかなりの割合において陽性反応を引き起こすことに非常に密接に
関係している。従って、BCGワクチンを予防接種した集団において、現在用いられているツベルクリン試験では結核と予防接種による免疫反応とを区別すること
ができない。いくつかの地域では環境中の非病原性マイコバクテリアの存在のた
めに、たとえ人間が病原性マイコバクテリウムに感染されていないとしてもPPD による偽陽性反応が観察される可能性がある。

【０００４】他の抗原が、結核を診断するための皮膚試験において可能な試薬として示唆さ
れている。WO 92/21697号からは、エム・ツベルクローシス由来の38kDaのリポタ
ンパク質または19kDaのタンパク質からなる診断のための皮膚試験が知られている。皮膚試験は、エム・ツベルクローシス感染に対して特異性を有しているが、
この皮膚試験もまた、BCGで免疫された患者と結核をわずらっている患者とを区別することができない。さらに、いくつかのマイコバクテリアタンパク質、例えばエム・ボビス由来の
MPB64と同様にエム・ツベルクローシス由来のMPT70およびMPT80が、エム・ツベルクローシス複合体に属するマイコバクテリアで感作されたモルモットにおいて
DTH反応を引き起こすことが知られている。MPB64をエンコードする遺伝子はエム
・ボビスBCG Tokyoからクローン化され、配列決定されている（Yamaguchiら、19
89）。

【０００５】 WO 95/01440号には、エム・ツベルクローシス複合体に属するマイコバクテリアで感作されたリンパ球様細胞は反応するが、BCGの予防接種をした個体においては陽性反応を引き起こさない、マイコバクテリウム由来のポリペプチドMPT64 が開示されている。WO 95/01441号は、6kDaの早期分泌抗原性標的（ESAT-6）抗原（early secretory antigenic target antigen）（それもまた、毒性マイコバ
クテリウムで感作された被検者のDTH試験においては反応性であることが示されたが、BCGの予防接種をした個体においては示されなかった）を含む、エム・ツベルクローシスの短期培養ろ液（ST-CF）から分離されるいくつかのポリペプチドを開示している。 MPT64およびESAT-6ポリペプチドの両方のコーディング配列が、大腸菌で発現されている（Oettingerら、1994; Sorensenら、1995）。一般に、何世紀ものあいだ食品の製造に用いられている乳酸菌群は安全な生物としてみなされており、
より最近では、医薬的および免疫学的に活性な化合物のような生物学的に機能的
な遺伝子産物を製造するために乳酸菌株を使用する試みが報告されている。

【０００６】誘導可能または調節可能な遺伝子発現系は、(i)宿主生物に対して有毒であるか、(ii)大量に必要とされるか、(iii)細胞の代謝または調節に関する特定の遺伝子機能の効果を研究するために用いられるか、あるいは(iv)ちょうどよいとき
の特定の時点または特定の環境条件下で産生されるか、のいずれかであるタンパ
ク質をエンコードする遺伝子の発現に非常に重要である。誘導可能な発現系は大
腸菌で用いるために開発されているが、乳酸菌で用いられる誘導可能な発現系は
ほんの少し記載されているだけである。誘導可能な乳酸菌発現系のひとつの例は、ラクトコッカス・ラクチス（Lactoc
occus lactis）のlac遺伝子を転写するlacプロモーターに基づく系である。lac プロモーターはLacRリプレッサーによって抑制することができ、増殖培地におけ
るグルコースをラクトースに置き換えることによって6倍の転写を誘導することができる（van Rooijenら、1992）。この自然発生発現系は、大腸菌由来のT7 RN
Aポリメラーゼ/T7プロモーター系と組み合わされている（Wellsら、1993a,b; St
eidlerら、1995）。lacプロモーターは、T7プロモーターを認識するT7 RNAポリメラーゼの発現を制御し、T7 プロモーターの下流にクローン化される遺伝子発現を誘導させる。この系は、破傷風毒素フラグメントCおよびマウスインターロイキン−2を産生するために用いられている。

【０００７】乳酸菌の誘導可能な発現系の他の例には、約4倍の遺伝子転写の誘導を生じる熱ショック誘導（van Asseldonkら、1993）の後に異種タンパク質の誘導可能な発現を引き起こすために用いられたエル・ラクチスのdnaJ遺伝子を転写するdnaJ
プロモーターの使用、およびファージ感染によって異種遺伝子を発現するために
適用することができるエル・ラクチスの溶菌性バクテリオファージ由来のファー
ジ特異的発現シグナルの使用（O'Sullivanら、1996）が含まれる。さらなる乳酸菌発現系は、有毒な抗腫瘍性抗生物質マイトマイシンCのような誘導物質（Nautaら、1996）またはナイシンのようなバクテリオシン（Ruyterら、1996、EP 0712 935 A2号）を細菌性増殖培地に補うことによる遺伝子発現の誘
導に基づく系である。

【０００８】最近、pH、増殖温度、イオン強度/NaCl含有量を含む増殖培地の組成、プリンヌクレオチド前駆体の存在/欠如および/または細菌の発育相/成長速度のような従来の乳酸菌の工業的製法と関連する1以上の環境因子の存在/欠如あるいは濃度
によって誘導可能または調節可能な乳酸菌プロモーターを分離できることが発見
された（WO 94/16086号、Israelsenら、1995）。通常、最初または培養工程中のいずれかで乳酸菌の工業培地に存在している、
そのような環境または増殖条件因子に基づく調節可能な発現系が、乳酸菌におけ
るマイコバクテリア由来のポリペプチドを含む異種の遺伝子産物の産生を調節す
ることに関して非常に魅力的なアプローチを示すことは明白である。これらの調節可能な発現系をうまく適用するためには、選択されるプロモータ
ーは、有効で、かつ経済的に実行可能な製法または大規模製法を容易にする工業
条件下で十分に多い量で所望のタンパク質を産生しなければならない。これに関
連して、別の有用な自然発生の調節可能な乳酸菌プロモーターは比較的に弱いプ
ロモーター活性を有するのみであることが見出された。

【０００９】しかしながら、そのような自然発生の誘導可能または調節可能な乳酸菌プロモ
ーターの活性は、プロモーターが位置するヌクレオチド領域を修飾することによ
って増加させることができ、最も重要なことには、上述の増殖条件因子によって
誘導可能性を減少あるいは除去することなく、そのような増加したプロモーター
活性を得ることができることが発明者らによって発見された。加えて、プロモー
ター領域配列の修飾によって、対応する非修飾プロモーター領域による調節と比
べて誘導条件下で調節された発現レベルを有する菌株が生じることも見出された
。このように、乳酸菌中で異種のポリペプチドを製造するために利用できるいく
つかの遺伝子発現系がある。現在では、誘導剤の添加あるいは増殖条件の変更を
必要としない乳酸菌の調節可能な遺伝子発現系を利用することが好ましいけれど
も、この発明によれば、そのような系はいずれもマイコバクテリアポリペプチド
の製造に用いることができる。特に、マイコバクテリアのポリペプチドに関する
コーディング配列に操作可能に連結される自然発生調節配列の修飾に基づき、そ
れによって遺伝子の発現を有意に増強できるような発現系が好ましい。驚くべきことに、そのような乳酸菌の発現系がマイコバクテリアのポリペプチ
ドの比較的高い収率が得られる点で有効であるのみならず、得られるポリペプチ
ドが、高い、一般的には大腸菌中で産生されるときのポリペプチドの反応性より
も高い、実質的には現在用いられているPPDツベルクリンと同じレベルで、結核に対するDTH皮膚試験において反応性を有することが見出された。

【００１０】 TBの脅威を減少させようと努力して、弱毒化されたバチルスカルメット-ゲラン（BCG）が生弱毒化ワクチンとして用いられている。BCGは、毒性マイコバクテ
リウム・ボビスの弱毒化誘導体である。フランスのパリにおけるパスツール・イ
ンスティテュート（Pasteur Institute）由来の最初のBCGは、液体培養での231 回の継代によって1908年から1921年に開発され、動物に対して毒性のあるものに
逆戻りすることは一度も示されなかった。このことは、BCGにおける弱毒化突然変異が、容易に復元しない安定な欠失および/または多突然変異（multiple muta
tions）であることを示している。BCGとエム・ツベルクローシスとエム・ボビス
との間の生理学的な相違は注目されてきたが、最初のBCG株の連続継代の間に起こる弱毒化突然変異は最近まで知られていなかった。記載された最初の突然変異
は、いくつかのBCG株におけるMPB64をエンコードする遺伝子（Liら、1993, Oett
ingerおよびAndersen,1994）と試験されたすべてのBCG株におけるESAT-6をエンコードする遺伝子（Harboeら、1996）の喪失であり、後にBCGにおける3つの大き
な欠失が同定されている（Mahairasら、1996）。RD1と呼ばれる領域はESAT-6をエンコードする遺伝子を含み、RD2と呼ばれる別の領域はMPT64をエンコードする
遺伝子を含む。両方の抗原が診断における可能性を有することが示され、ESAT-6
はワクチン候補としての特性を有することが示されている（WO95/01441号および
WO95/01440号参照）。マイコバクテリアゲノム中のesat-6遺伝子と同様にマイコ
バクテリア由来の短期培養ろ液中に存在するタンパク質ESAT-6は、他のマイコバ
クテリア株での分布が非常に限らており、エム・ツベルクローシスの例えばesat
-6は、BCGとエム・アビウム（M. avium）およびエム・テレエ（M. terrae）のよ
うな環境から分離される大部分のマイコバクテリア種の両方で欠如していること
が論証された。

【００１１】発明の要約従って、ひとつの見地においてこの発明は、結核複合体（マイコバクテリウム
・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アフリカヌムおよびマイコバクテリ
ウム・ボビス）に属するマイコバクテリアで予め感作されたリンパ球様細胞が反
応できる生物反応性ポリペプチド、または免疫学的にそのポリペプチドに等しい
類似体を製造する方法に関し、その方法は、(i)上記ポリペプチドをコードするD
NA配列を準備し、(ii)上記コーディング配列を乳酸菌中で複製できるベクターに
挿入し、(iii)上記ベクターで乳酸菌を形質転換し、(iv)こうして形質転換された細菌をポリペプチドが発現される条件下で培地で培養し、(v)マイコバクテリアのポリペプチドを収集する工程からなり、こうして得られるポリペプチドは、エム・ツベルクローシス複合体に属する毒
性マイコバクテリアに予め感染されたモルモットの少なくとも10％において陽性
の遅延型過敏性（DTH）反応を引き出すことができ、そのDTH反応は、本質的に以
下のプロトコール、即ち：（i）少なくとも部分的に精製されたポリペプチドの製品を、0.005％のポリソ
ルベートと0.01％のチニソール（chinisol）を含有するPBSで希釈して、ポリペプチド濃度を約20μg/mlとし、（ii）希釈されたポリペプチド製品の100μlを、DTH反応試験の4週間前に約0.
5x10⁵CFUの用量でマイコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvを静脈注射することによって感染させたダンキン・ハートレイ（Dunkin Hartley）モルモット
の群に皮内注射し、そして（iii）注射部位での炎症反応の大きさを定規によって２日目に測定し、5mm以
上の大きさの反応を陽性反応として記録するプロトコールを用いて行われる。

【００１２】この発明の更なる見地においては、エム・ツベルクローシス複合体に属するマ
イコバクテリアで予め感作されたリンパ球様細胞が反応できるポリペプチド、ま
たは免疫学的にそのポリペプチドに等しい類似体が提供され、そのポリペプチド
は上記のこの発明の方法によって得ることができ、かつエム・ツベルクローシス
複合体に属する毒性マイコバクテリアに予め感染されたモルモットの少なくとも
10％において陽性の遅延型過敏性（DTH）反応を引き出すことができ、そのDTH反
応は、本質的に以下のプロトコール、即ち：（i）少なくとも部分的に精製されたポリペプチドの製品を、0.005％のポリソ
ルベートと0.01％のチニソールを含有するPBSで希釈して、ポリペプチド濃度を約20μg/mlとし、（ii）希釈されたポリペプチド製品の100μlを、DTH反応試験の４週間前に約0
.5x10⁵CFUの用量でマイコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvを静脈注射す
ることによって感染させたダンキン・ハートレイモルモットの群に皮内注射し、（iii）注射部位での炎症反応の大きさを定規によって2日目に測定し、5mm以上の大きさの反応を陽性反応として記録するプロトコールを用いて行われる。

【００１３】現在好ましい見地において、この発明は特異的なポリペプチド、ESAT-6ホモポ
リマーに関する。ESAT-6ホモポリマーはこの発明に記載の方法によって製造する
ことができるが、この発明によるESAT-6ホモポリマー製品は、他の方法のいずれ
によっても製造することができる。

【００１４】別の見地においては、乳酸菌細胞中で複製できるベクターが提供され、そのベ
クターは、（i）プロモーター領域、およびそれに操作可能に連結される（ii）エム・ツベルクローシス複合体に属するマイコバクテリアで予め感作さ
れたリンパ球様細胞が反応できる生物反応性ポリペプチド、または免疫学的にそ
のポリペプチドに等しい類似体をコードするDNA配列からなり、そのポリペプチドは、エム・ツベルクローシス複合体に属する毒性
マイコバクテリアに予め感染されたモルモットの少なくとも10％において陽性の
遅延型過敏性（DTH）反応を引き出すことができ、そのDTH反応は、本質的に以下
のプロトコール、即ち：（i）少なくとも部分的に精製されたポリペプチドの製品を、0.005％のポリソ
ルベートと0.01％のチニソールを含有するPBSで希釈して、ポリペプチド濃度を約20μg/mlとし、（ii）希釈されたポリペプチド製品の100μlを、DTH反応試験の4週間前に約0.
5x10⁵CFUの用量でマイコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvを静脈注射することによって感染させたダンキン・ハートレイモルモットの群に皮内注射し、（iii）注射部位での炎症反応の大きさを定規によって2日目に測定し、5mm以上の大きさの反応を陽性反応として記録するプロトコールを用いて行われる。

【００１５】なおいっそうさらなる見地において、この発明は、発明によるベクターで形質
転換される乳酸菌に関する。さらなる見地においてこの発明は、エム・ツベルクローシス複合体に属さない
マイコバクテリウム由来の生物反応性ポリペプチドを製造する方法を提供し、そ
の方法は、(i)上記ポリペプチドをコードするDNA配列を準備し、(ii)上記コーデ
ィング配列を乳酸菌中で複製できるベクターに挿入し、(iii)上記ベクターで乳酸菌を形質転換し、(iv)こうして形質転換された細菌をポリペプチドが発現され
る条件下で培地で培養し、(v)マイコバクテリアのポリペプチドを収集する工程からなり、上記ポリペプチドは、マイコバクテリアで予め感作されたリンパ球様
細胞が反応できるポリペプチドおよび免疫学的にそのポリペプチドに等しい類似
体、上記の方法によって得ることができるポリペプチド、この発明によるポリペ
プチドからなる診断用組成物およびワクチンからなる群から選択される。

【００１６】発明の詳細な開示この発明の主な目的は、結核に対する遅延型過敏性皮膚試験において現在用い
られているPPDツベルクリン試薬の反応性と同じオーダーの反応性を有し、PPDよ
りも多数の真の陽性反応を引き起こし、高い収率でかつポリペプチドの生物反応
性を損なわない構造上の立体配座を有してGRAS組換え宿主生物中で産生される、
生物反応性ポリペプチドまたは免疫学的に等しいそれらの類似体を提供すること
である。

【００１７】この明細書において、用語「生物反応性」は、とりわけエム・ツベルクローシ
ス複合体の毒性マイコバクテリアまたは他のマイコバクテリア種に予め暴露され
たヒトまたは動物においてDTH皮膚反応を引き出すポリペプチドの能力のことを示す。標準DTH皮膚試験においては、試験試薬の有効量がヒトまたは動物の部位に投与され、一般には試験試薬の暴露から24〜96時間後にDTH反応が測定される。投与様式は変えることができ、皮内注射、皮下注射、高圧空気による導入、お
よび鋭くとがった器具またはそのような器具のセット（マルチ穿刺）による投与
が含まれる。陽性反応は、投与部位での紅斑性皮膚反応の直径として定義される
。陽性反応は、例えば5mm以上の紅斑直径として定義されるであろう。好ましくは、ポリペプチドの生物反応性は、エム・ツベルクローシス複合体の
マイコバクテリアまたは他のマイコバクテリアで予め感作されたリンパ球様細胞
は反応することができ、BCGワクチンで予め感作されたリンパ球様細胞は反応できないポリペプチドであるという意味において、結核に対して特異的である。現
在用いられているBCGワクチンの例には、「BCG株：ダニッシュ（Danish）1331」
とも呼ばれるマイコバクテリウム・ボビスBCGコペンハーゲン、エム・ボビスBCG
グラクソ（Glaxo）、エム・ボビスBCGパスツール（Pasteur）、エム・ボビスBCG
カナディアン（Canadian）、およびエム・ボビスBCGが含まれる。

【００１８】この発明によれば、ポリペプチドは、上記のような結核に対して特異的である
のに加えて、エム・ツベルクローシス複合体に属さないマイコバクテリアを含む
他の生物によって感作されているリンパ球様細胞とはほとんどめったに反応しな
いという意味において特異的であるのも有利であろう。そのようなエム・ツベル
クローシス複合体に属さないマイコバクテリアには、エム・アビウム、エム・イ
ントラセルラーレ（M. intracellulare）、エム・カンサシイ（M. kansasii）、
エム・スクロフラセウム（M. scrufolaceum）、エム・マリヌム（M. marinum）、エム・ウルセランス（M. ulcerans）、エム・フォルチュイツム（M. fortuitu
m）、エム・ケロネイ（M. chelonei）、エム・フレイ（M. phlei）、エム・ゴル
ドネ（M. gordanae）、エム・スメグマティス（M. smegmatis）、エム・パラツベルクローシス（M. paratuberculosis）、およびエム・レプラエ（M. leprae）
からなる群が含まれる。

【００１９】この発明によるポリペプチドの生物反応性はまた、ポリペプチドがリンパ球様
細胞または血液サンプルのような体液、あるいはそのような細胞を含む別のタイ
プのサンプルと反応するインビトロ試験によって決定されるであろう。このよう
に、生物反応性は、リンパ球様細胞を刺激してINF-γを放出させるポリペプチド
の能力として表すことができる。換言すれば、生物反応性ポリペプチドは、一次
感染の2週間以内かあるいはマウスが結核複合体に属するマイコバクテリアで再び感染を受けた後4日以内にマウスから回収される感作されたTメモリーリンパ球
からのIFN-γの放出を誘導し、その誘導は、ml当たりおよそ200,000個の脾臓細胞を含む懸濁液にポリペプチドを添加することによって行われ、そのポリペプチ
ドの添加によって懸濁液ml当たり1〜4μgのポリペプチド濃度が生じ、INF-γの放出は、懸濁液にポリペプチドを添加した後2日目に収集される上清中のINF-γ を測定することによって評価することができる。好ましい具体例では、生物反応性ポリペプチドは特異的である。特異的な生物
活性ポリペプチドを定義するひとつの方法は、感染の第1相におけるTB患者、あるいは健康なBCGの予防接種をしたドナー、あるいはTB患者に対する健康な接触者から分離されるml当たりおよそ1,000,000個のヒトPBMC（末梢血液単核細胞）から少なくとも1,500pg/mlの上記バックグランドレベルのIFN-γの放出を誘導す
るポリペプチドである。その誘導は、ml当たりおよそ1,000,000個のPBMCを含む懸濁液にポリペプチドを添加することによって行われ、そのポリペプチドの添加
によって懸濁液ml当たり1〜4μgのポリペプチド濃度が生じ、INF-γの放出は、懸濁液にポリペプチドを添加した後2日目に収集される上清中のINF-γを決定することによって評価することができる。

【００２０】好ましくは、2つのIFN-γのアッセイにおいて、生物反応性ポリペプチドによってもたらされる放出は上清中に少なくとも1,500pg/mlのIFN-γを生じるが、よ
り高い濃度、例えば上清中に少なくとも2,000pg/ml、さらには少なくとも3,000p
g/mlのIFN-γが好ましい。ウシPBMCからのIFN-γの放出は、例えば標準サイトカ
インエリザ法（ELISA）でバックグラウンドに対する光学濃度（OD）指数として測定することができ、少なくとも2であるべきであるが、少なくとも3、5、8およ
び10のようなより高い数値が好ましい。この出願がIFN-γの放出を生物反応性の尺度として言及するとき、IL-12、TNF
-α、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-βのような他のサイトカインが関連するこ
とが現在考えられている。通常、1以上のサイトカインが、例えばPCR技術または
エリザ法を利用して測定されるであろう。これらのサイトカインのいずれかにお
ける有意な増加もしくは減少により生物反応性ポリペプチドまたはポリペプチド
フラグメントが示されることは、当業者によって評価されるであろう。

【００２１】加えて、生物反応性は、ポリペプチドが導入される生物において抗体の形成を
引き出すポリペプチドの能力と関連づけることができる。このような能力は、抗
体を検出する従来の方法のいずれかを用いて、特定のポリペプチドと反応する抗
体の存在に関して生物由来のサンプルを試験することによって決定することがで
きる。ここで用いられるように、用語「ポリペプチド」は、少なくとも2アミノ酸残基でかつ多くてもせいぜい10アミノ酸残基の長さを有する短いペプチド、オリゴ
ペプチド（多くてもせいぜい15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70
、75、80、85、90個または多くてもせいぜい95アミノ酸残基のような11〜100アミノ酸残基）と、より長いペプチド（「ポリペプチド」の通常の解釈、すなわち
110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、32
5、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625個より長いまたは650アミノ酸残基より長いような、長さにおいて100アミノ酸残基より長い
もの）の双方、ならびにタンパク質（少なくともひとつのペプチド、オリゴペプ
チド、またはグリコシル化、アシル化されるか、または補欠分子族を含むことに
よって化学的に修飾されてもよいポリペプチドからなる機能的独立体）を示すた
めに用いられる。ポリペプチドの定義にはまた、いずれかの種類の乳酸菌宿主細
胞を形質転換するいずれかの型の発現ベクターにおける組換えタンパク質または
ペプチド、および化学的に合成されたペプチドと同様にマイコバクテリア中で自
然に生じる天然形態のペプチド/タンパク質も包含される。

【００２２】この発明のひとつの具体例において、CFP7、CFP7A、CFP7B、CFP8A、CFP8B、CF
P9、CFP10A、CFP11、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、CF
P23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP27、CFP28、CFP29、CFP30A、CFP50、
MPT51、CWP32、RD1-ORF8、RD1-ORF2、RD1-ORF9B、RD1-ORF3、RD1-ORF9A、RD1-OR
F4、RD1-ORF5、MPT59-ESAT6、および/またはESAT6-MPT59のような抗原が製造される。抗原はWO98/44119号に記載され、ここに参照として取り入れる。用語「免疫学的に等しい類似体」は、DTH皮膚反応の直径として測定されるDTH
反応が、同条件下でポリペプチドによって引き出されるDTH反応と同じオーダーかまたは少なくとも10％の程度まで｛例えば少なくとも20％（例えば少なくとも
50％を含む少なくとも30％）｝であるという条件で、DTH反応を引き出す能力またはIFN-γアッセイにおける反応性に関して自然発生マイコバクテリアのポリペ
プチドと機能的に等しいこの発明のポリペプチドの変異体、類似体またはサブ配
列を示すためにここに用いられる。DTH皮膚反応の直径として測定される、少なくとも75％（例えば少なくとも90％）を含む少なくとも60％のようなより高いDT
Hを引き出す能力も考えられる。同様に、IFN-γアッセイにおける免疫学的に等しい類似体の反応性は、同条件下でポリペプチドによって引き出される反応性と
同じオーダーかまたは少なくとも10％の程度まで｛例えば少なくとも20％（例え
ば少なくとも50％を含む少なくとも30％）｝である。

【００２３】この明細書中において、別な方法で要求しないかぎり、言葉「からなる」また
は「を含む」あるいは「を包含する」のようなそれらの変形は、他の因子または
整数あるいは因子または整数の群のいずれも除外することなく、述べられている
因子または整数あるいは因子または整数の群の包含を意味するものと理解される
であろう。結核複合体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・
アフリカヌムおよびマイコバクテリウム・ボビス）に属するマイコバクテリアで
予め感作されたリンパ球様細胞が反応できる生物反応性ポリペプチドを製造する
この発明の方法は、第一工程としてポリペプチドまたはこれらの免疫学的に等し
い類似体、変異体あるいはサブ配列をコードするDNA配列の提供からなる。そのD
NA配列は、一般的に当該分野で公知の方法(その例は以下の実施例に記載されている)を用いて上記のようなポリペプチドを産生するあらゆるマイコバクテリア種から得ることができる。このように、DNA配列は、エム・ツベルクローシス複合体種あるいは上記のものを含むいずれかの他のマイコバクテリア種から分離す
ることができる。

【００２４】 DNA配列はまた、自然発生DNA配列のサブ配列、類似体または変異体からなるDN
Aフラグメントであってもよく、そのサブ配列、類似体または変異体は、マイコバクテリア起源の自然発生ポリペプチドと免疫学的に等しいポリペプチドをエン
コードする。この発明のDNA配列に関して、用語「類似体」または「変異体」によって、自然発生マイコバクテリアのポリペプチドと同一かあるいは実質的に同一の免疫学
的特性を示すポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列が理解される。同じアミノ酸が異なるコドンによってエンコードされてもよく、とりわけコド
ンの用法がヌクレオチド配列を発現する問題の生物の好みに関連していることは
周知である。このように、この発明によるDNA配列の１以上のヌクレオチドまたはコドンは、発現するときに問題のDNAフラグメントによってエンコードされるポリペプチドと同一かあるいは実質的に同一のポリペプチドを生じる他のものに
よって交換されてもよい。

【００２５】従って、この明細書において用語「類似体」および「変異体」は、マイナーな
変化が自然発生ポリペプチドと比べてリガンド結合特性および/または生物学的機能および/または免疫原性に関して有害な作用を有しないか、あるいは自然発生ポリペプチドと比べて興味がありかつ有用な新しい結合特性または生物学的機
能および免疫原性を生じることを考慮に入れて、自然発生ポリペプチドのアミノ
酸配列をエンコードするDNA配列と同様なヌクレオチド組成または配列からなるD
NA配列を示すために用いられる。類似のDNAフラグメントまたはDNA配列は動物ま
たはヒトに由来してもよく、あるいは部分的にまたは完全に上記の合成由来であ
ってもよい。類似体はまた、組換えDNA技術の使用に由来してもよい。さらに、用語「類似体」および「サブ配列」は、DNA配列またはそれらのサブ配列によってエンコードされるポリペプチドに対して全く実質的な効果も持たな
い、1以上のヌクレオチドの置換、挿入（イントロンを含む）、付加、欠失および転位のような配列における変化を考慮にいれることを意図するものである。用
語「置換」は、1以上の異なるヌクレオチドによる完全なヌクレオチド配列における１以上のヌクレオチドの交換を意味するものであり、「付加」は、完全なヌ
クレオチド配列のどちらかの末端における1以上のヌクレオチドの付加を意味するものと理解され、「挿入」は、完全なヌクレオチド配列内への1以上のヌクレオチドの導入を意味するものであり、「欠失」は、1以上のヌクレオチドが配列のどちらかの末端かあるいはその中のいずれか適当な点のいずれで完全なヌクレ
オチド配列から欠失していることを示すものであり、かつ「転移」は、2以上のヌクレオチド残基が互いに交換されていることを意味するものである。

【００２６】この明細書において、DNA配列の変異体または類似体は、ストリンジェントなハイブリッド形成条件（すなわち、従来の意味においてハイブリッド形成は2xSS
C中65℃で行われ、最終洗浄は1xSSC中65℃で行われると理解される）下でハイブ
リッド形成するものが好ましい。この発明によれば、DNA配列は上記のようにcDNA又はゲノム起源のものであってもよいが、合成起源であることもできる。さらに、DNA配列は、上述のような混合cDNAおよびゲノム、混合cDNAおよび合成またはゲノムおよび合成起源のもの
であってもよい。DNA配列は、所望のポリペプチドをエンコードする所望のDNAフ
ラグメントを生じるために、例えば部位特異的突然変異誘発によって修飾されて
いてもよい。ポリペプチドをエンコードするDNAの修飾に焦点をあてている以下の論考は、所望のDNAフラグメントを得るための2以上のDNAフラグメントの連結反応によってDNA配列を構成する可能性と同様に、そのような可能性と上述の原理の組み合わせも包含するものと理解されるべきである。

【００２７】 DNA配列は、この発明のポリペプチドをエンコードするDNAフラグメントを産生
するいずれかの適切な技術を用いて修飾されてもよい。しかしながら、この発明
のポリペプチドのアミノ酸配列をエンコードするDNA配列のいずれの修飾も、生じるポリペプチドの免疫学的な機能を損なわないものであるべきである。この発明のひとつの方法によれば、上記定義のコーディングDNA配列は乳酸菌中で複製できるベクターに挿入され、乳酸菌はその発現ベクターで形質転換され
る。ベクターは組換えDNA手順に付すことができるいずれのベクターであってもよく、ベクターの選択は導入される特定の乳酸菌宿主細胞に依存するであっても
よい。従って、ベクターは自律複製ベクター、すなわちその複製が宿主細胞染色
体の複製に依存しない染色体外独立体として存在するベクターであろう。このよ
うなベクターの例は、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体またはウイ
ルスである。代わりに、ベクターは、宿主細胞に導入されるときに宿主細胞ゲノ
ムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製されるものであっても
よい。ベクターを構築して宿主細胞中への導入をもたらすために用いられる方法
は、これらの目的のための組換えDNA技術の分野で公知のいずれの方法でもよい。

【００２８】この発明のポリペプチドは、ワクチン成分または免疫診断剤の成分としての優
れた候補である。従って、この発明の別の部分は、この発明によるポリペプチド
またはポリペプチドのホモポリマーからなる免疫組成物に関する。このような免
疫組成物の最適性能を保証するために、それは免疫学的かつ医薬的に受容な担体
、ビヒクルまたはアジュバントを含むのが好ましい。そのような免疫組成物は、
ワクチンの形態または診断剤の形態（例えば皮膚試験試薬またはインビトロ診断
試薬）であるのが好ましい。適切な担体は、プラスチック（例えばポリスチレン）のようなポリペプチドが
疎水性の非共有相互作用によって結合されるポリマー、または多糖のようなポリ
ペプチドが共有結合されるポリマー、またはポリペプチド｛例えばウシ血清アル
ブミン、オボアルブミンまたはキーホール・リンペット・ヘモシアニン｝からな
る群から選択される。適切なビヒクルは、希釈剤および懸濁化剤からなる群から
選択される。アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド
（DDA）、キルA（Quil A）、ポリI:C、フロイント不完全アジュバント、IFN-γ 、IL-2、IL-12、モノホスホリルリピドA（MPL）およびムラミルジペプチド（MDP
）からなる群から選択するのが好ましい。

【００２９】上記に従って、この発明はまた、この発明による免疫組成物を製造する方法に
関し、その方法は、この発明のポリペプチドを調製、合成または分離し、そのポ
リペプチドをワクチン用の培地に溶解または分散し、任意に他のエム・ツベルク
ローシス抗原および/または担体、ビヒクルおよび/またはアジュバント物質を加
えることからなる。一般的に、活性成分としてペプチド配列を含むワクチンのような免疫組成物の
製品は、すべてここに参照として取り入れる米国特許第4,608,251号、第4,601,9
03号、第4,599,231号、第4,599,230号、第4,596,792号および第4,578,770号によ
って例示されるように、当該分野において十分に理解されている。典型的に、そ
のような免疫組成物、例えばワクチンは、液体溶液または懸濁液のいずれかのよ
うな注射可能なもの；注射の前に液体が調製されてもよい、溶液または懸濁液に
適切な固体の形態として調製される。製剤はまた、乳化されてもよい。活性免疫
原成分は、医薬的に受容でかつ活性成分と適合する賦形剤としばしば混合される
。例えば、適切な賦形剤は、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノ
ールなどと、それらの組み合わせである。加えて、所望により、ワクチンは浸潤
剤または乳化剤、pH緩衝剤、またはワクチンのような免疫組成物の有効性を増強
するアジュバントのような補助物質を少量含んでもよい。

【００３０】ワクチンのような免疫組成物は、従来、非経口的に、例えば皮下または筋肉内
のいずれかで注射によって投与され、あるいはまさに直接的に皮膚に適用されて
もよい。他の投与形態に適切な別の製剤には、坐剤およびある場合には経口もし
くは経鼻製剤が含まれる。坐剤に関して、従来の結合剤および担体、例えばポリ
アルカレングリコールまたはトリグリセライドが含まれてもよく、そのような坐
剤は、活性成分を0.5％〜10％、好ましくは1〜2％の範囲で含む混合物から形成することができる。経口製剤には、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクト
ース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロー
ス、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの
組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、放出持続製剤または散剤の
形態をとり、活性成分を10〜95％、好ましくは25〜70％含む。ポリペプチドは、中性または塩形態としてワクチンのような免疫組成物中に製
剤化されてもよい。医薬的に受容な塩には、例えば塩酸またはリン酸のような無
機酸あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成さ
れる酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボ
キシル基と形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水
酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基、お
よびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒス
チジン、プロカインなどのような有機塩基に由来していてもよい。

【００３１】ワクチンのような免疫組成物は、用量製剤（dosage formulation）と適合する
方法でかつ治療上および/または診断上有効かつ免疫原性であるような量で投与される。投与される量は、治療される被験者、例えば免疫応答に達する個体の免
疫系の能力や望まれる保護の程度に依存する。適切な用量範囲は、予防接種当た
りの活性成分が数百μgのオーダーであり、約1〜300μgの範囲、特に約10〜50μ
gの範囲のような約0.1〜1000μgの範囲が好ましい範囲である。最初の投与とブースターショット（booster shots）に適切な方式は変更することもできるが、最初の投与が典型となり、引き続いて次の接種または他の投与が行われる。適用方法は、広範囲に変えることができる。従来のワクチンの投与方法のいず
れでも適用することができる。これらには、固体の生理学的に受容な基材に基づ
くかあるいは生理学的に受容な分散液での経口または経鼻用、非経口的な注射な
どによるものが含まれると考えられる。ワクチンの用量は投与経路に依存し、予
防接種される人間の年齢およびより低い程度で予防接種および/または試験される人間の大きさによって変化するであろう。

【００３２】ワクチンにおけるアジュバント効果を達成する種々の方法には、それぞれ一般
にリン酸緩衝溶液中に0.05〜0.1％溶液として用いられる水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム(alum)のような剤、0.25％溶液として用いられる糖｛カ
ーボポル（Carbopol）｝の合成ポリマーとの混合物、70〜101℃の温度範囲で30 秒〜2分間の熱処理によるワクチン中のタンパク質凝集物の使用が含まれる。ペプシン処理した（Fab）抗体をアルブミンに対して再活性化することによる凝集物、グラム陰性細菌の内毒素もしくはリポ多糖成分のシー・パルブム（C. parvu
m）のような細菌細胞との混合物、マンニド（mannide）モノオレエート（アラセ
ルA）のような生理学的に受容なオイルビヒクルの乳濁液あるいはブロック置換体として用いられるパーフルオロカーボン（フローソル-DA）の20％溶液の乳濁液が用いられてもよい。この発明によれば、DDA（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド）は興味のあるアジュバント候補であるが、キルAおよびRIB
Iと同様にフロイントの完全および不完全アジュバントもまた興味をひく可能性がある。さらなる可能性は、モノホスホリルリピドA（MPL）およびムラミルジペ
プチド（MDP）である。他の可能性は、上述のアジュバントとの組み合わせによる、リンホカイン（例えばIFN-γ、IL-2およびIL-12）のような免疫調節物質またはポリI:Cのような合成IFN-γ誘導物質の使用を包含する。

【００３３】多くの場合、ワクチンの多回投与、通常6回の予防接種を超えず、より通常では4回の予防接種を超えず、好ましくは1回以上、通常少なくとも約3回の予防接種をすることが必要であろう。通常、予防接種は2〜12週間の間隔、より通常では3〜5週間の間隔でなされるであろう。防御免疫の所望のレベルを維持するため
には、1〜5年、通常3年の間隔での周期的な追加免疫が望まれるであろう。免疫感作の過程では、ESAT-6またはST-CFと共培養されるPBL（末梢血液リンパ細胞）
のインビトロ増殖アッセイ、特に感作されたリンパ細胞から放出されるIFN-γの
レベル測定を続けてもよい。アッセイは、放射性核種、酵素、蛍光剤などのよう
な従来のラベルを用いて行うことができる。これらの技術は周知であり、これら
のタイプのアッセイを例証する米国特許第3,791,932号、第4,174,384号および第
3,949,064号のような種々様々な特許でみられるであろう。遺伝的な変化のために、異なる個体は同じポリペプチドに対する強度を変えた
免疫応答で反応する可能性がある。従って、この発明のワクチンは、免疫応答を
増加させるためにいくつかの異なるポリペプチドからなってもよい。ワクチンは
、2以上のポリペプチド（全てのポリペプチドが上記定義のものである）からなってもよく、ペプチドの全てではなくいくつかは、エム・ツベルクローシス複合
体に属する細菌に由来してもよい。後者の例では、ポリペプチドに関して上記で
述べた基準を必ずしも満たさないポリペプチドが、それら自体の免疫原性によっ
て作用するかあるいは単にアジュバントとして作用しうる。そのような興味ある
ポリペプチドの例は、MPB64、MPT64、およびMPB59であるが、マイコバクテリアから分離できる他の物質のいずれもが候補として可能である。

【００３４】この発明のポリペプチドをアジュバントと混合するひとつの理由は、細胞性免
疫応答を効果的に活性化させるめである。しかしながら、この効果は、他の方法
、例えばワクチン中の有効な抗原を非病原性微生物中で発現させることによって
も達せられる。このような微生物の周知の例は、マイコバクテリウム・ボビスBC
Gである。従って、この発明の別の見地は、現在入手可能な生BCGワクチンの改良であり、それは、上記定義のポリペプチドをエンコードするDNA配列の1以上のコピーが
、微生物にポリペプチドを発現および分泌させるように微生物ゲノム中に導入さ
れている微生物を有効成分として含む、結核複合体に属するマイコバクテリアに
よって引き起こされるTBに対してヒトを含む動物を免疫するためのワクチンであ
る。

【００３５】この発明のさらに別の見地は、ESAT-6ホモポリマーのような上記定義のポリペ
プチドをエンコードするDNA配列のようなヌクレオチド配列の１以上のコピーを有効成分として含む、結核複合体に属するマイコバクテリアによって引き起こさ
れる結核に対してヒトを含む動物を免疫するためのワクチンである。ヌクレオチ
ド配列の1以上のコピーからなるワクチンは、例えば筋肉内注射または経口投与(
いわゆる「遺伝子銃」法)によって哺乳類細胞に導入されるであろう。ヌクレオチド配列は例えば筋肉細胞によって開始され、関心のあるポリペプチドが哺乳類
細胞中で機能するプロモーター、例えばウイルスプロモーターによって発現され
る。その後、ポリペプチド産物は免疫系を刺激し、ポリペプチドに対する免疫応
答を生じる。結核の皮膚試験試薬を含む生物反応性マイコバクテリアのポリペプチドを製造
するためのグラム陰性細菌である大腸菌の使用は、安全性の理由のために反対す
べきであろう。従って、GRAS（一般的に安全と認識されている）状態を有する代
わりの産生生物が必要である。加えて、大腸菌発現系においては、マイコバクテ
リアのポリペプチドは細胞内に位置し、宿主細胞からそれらを分離する方法によ
って立体配座または構造上の変化が生じ、生物反応性が低下する恐れがある。し
かしながら、K12株のような大腸菌ファミリー内のGRAS生物および酵母｛例えばピチア・パストリス（Pischia pastoris）およびサッカロミセス・セレビシエ（
Saccharomyces cerevisiae）｝のようなGRAS宿主生物は、精製に適切な方法でES
AT-6ホモポリマーを発現することが予測される。

【００３６】ここで用いられるように、用語「乳酸菌」は、優勢に産生される酸としての乳
酸、酢酸およびプロピオン酸を含む酸の産生とともに糖を発酵させる、グラム陽
性、微好気性または嫌気性の細菌を示す。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクト
コッカス種（Lactococcus spp.）、ストレプトコッカス種（Streptococcus spp.
）、ラクトバチルス種（Lactobacillus spp.）、ロイコノストック種（Leuconos
toc spp.）、ペジオコッカス種（Pediococcus spp.）、ブレビバクテリウム種（
Brevibacterium spp.）およびプロピオニバクテリウム種（Propionibacterium s
pp.）のなかにみられる。加えて、食品のスターター培養として単独あるいは乳酸菌と組み合わせて頻繁に用いられる絶対嫌気性細菌、ビフィドバクテリア、す
なわちビフィドバクテリウム種（Bifidobacterium spp.）の群に属する乳酸産生
細菌は、一般的に乳酸菌の群に含まれる。現在好ましい宿主細胞種は、ラクトコ
ッカス・ラクチスである。選択される乳酸菌宿主種の形質転換に続いて、形質転換された細菌は、ポリペ
プチドが発現される条件下で培養培地で培養される。組換え乳酸菌宿主細胞を培
養するために用いられる培地は、例えばその栄養素の組成およびpHに関して目的
に適切な従来の培地のいずれでもよい。有用な具体例では、宿主細胞は、嫌気性
条件下工業的な製造規模で培養される。この明細書において、「工業的な製造規
模」は、発酵容器中の培養培地の容量が少なくとも5L（例えば少なくとも10L）のような少なくとも1Lであることを示す。その容量は、少なくとも250Lを含む少
なくとも100Lのようにより多いこともありうると予想される。

【００３７】発酵時間および温度のような特定の発酵条件の選択は、選択される乳酸菌宿主
細胞の要求に依存する。一般的に、発酵時間は、20〜30時間の範囲のような10〜
30時間の範囲である。好ましくは、乳酸菌の発酵過程が完了した後、培地中に分泌されるポリペプチ
ドの量は、少なくとも50mg/L、好ましくは少なくとも100mg/L（例えば少なくとも500mg/Lを含む少なくとも250mg/L）のような少なくとも20mg/Lである。この発明の方法の最終工程において、ポリペプチドが収集される。コーディン
グ配列が細胞膜を通り抜けて培地中にポリペプチドの分泌をもたらすシグナル配
列と結合しているかどうかに依存して、収集の工程には、宿主細胞からのポリペ
プチドの分離（シグナル配列がない）かまたは培地から直接に分離されるかのい
ずれかが含まれる。これらの工程は、ポリペプチドを分離する従来の方法のいず
れかを用いて行うことができる。従って、ポリペプチドが培地に分泌されるとき
には、最初の収集工程は、例えば遠心分離もしくはろ過してその後上清またはろ
液からポリペプチドを分離することによる宿主細胞の分離である。ポリペプチド
が、上清またはろ液の総タンパク質含量の少なくとも40％（例えば少なくとも50
％）を含む少なくとも30％のような少なくとも25％に達するのが好ましい。

【００３８】一般的に、上清またはろ液は、例えばクロス-フロー（cross-flow）ろ過、塩析、免疫親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クラマトグラフィーおよび
/またはイオン交換クロマトグラフィーのようなその目的に適した従来の方法のいずれかを用いて濃縮および/または少なくとも部分的な精製工程に付される。好ましい具体例では、濃縮および少なくとも部分的に精製されたポリペプチドの
製品は、少なくとも1.5mg/ml（例えば少なくとも2.0mg/ml）を含む少なくとも1.
0mg/mlのような少なくとも0.5mg/mlのポリペプチドを含有する。一般的に、宿主細胞からの抽出に付されないポリペプチドが細胞抽出由来のポ
リペプチドより高い生物反応性を有するようにおもわれるので、ポリペプチドは
、細胞内に蓄積されるよりもむしろ培地に分泌されるのが好ましい。

【００３９】上記定義の収集工程によって得られる粗製もしくは任意に部分的に精製された
ポリペプチド製品は、そのまま用いられてもよく、貯蔵安定でかつ便利な皮膚試
験診断用組成物を提供するために製剤化されてもよい。従って、そのようなすぐ
に使用できる組成物は、例えば保存剤、ポリペプチド安定化剤またはポリペプチ
ドの生物安定性を増強する物質を含んでいてもよい。加えて、粗製ポリペプチド
製品は、すぐに使用できる診断用組成物の予め決定された量または活性を得るた
めに、さらなる濃縮もしくは希釈に付されてもよい。製造されるポリペプチドに比べて、DTH皮膚試験、IFN-γ試験における増強された生物反応性または増強された免疫原性能を有する診断試薬またはワクチン成
分を得るために、この発明の方法によって製造されるポリペプチドを修飾するこ
ともできる。陽性の皮膚試験応答は、ポリペプチドの十分量が注射部位に残存す
るときにのみ生じる。しかし、いくつかのポリペプチドの大きさは非常に小さい
ので、ポリペプチドは注射部位で細胞外コンパートメントに迅速に拡散し、有効
な皮膚応答はより少なくなるであろう。その結果として、ポリペプチドは、ポリ
ペプチドのホモポリマーもしくはヘテロポリマーを構築する基材として用いられ
てもよく、それによってポリペプチドは細胞外コンパートメントに自由に拡散せ
ず、注射部位で抗原提示細胞によって有効に吸収される。

【００４０】ポリペプチドの「ホモポリマー」は、通常の意味で、すなわち2以上の同一のポリペプチドによって形成されるポリマーであると理解され、一方「ヘテロポリ
マー」は、少なくとも2つの異なるポリペプチドから形成されてもよく、あるいはポリペプチドと異種の担体分子とから形成されてもよい。ホモポリマーは、例
えば3、4または5コピーのような2〜6コピーを含む2〜20コピーまたは2〜10コピーのような2以上のポリペプチドのコピーからなってもよい。ホモポリマーの合成例は、ポリペプチドにおける１以上のN末端システイン残基の導入であり、それによって分子間ジスルフィド架橋の結果としてホモポリマ
ーが形成される。ヘテロポリマーの合成は、ポリペプチドをマイコバクテリアのタンパク質MPT5
9（Nagaiら、1991）またはその一部分のような異なるマイコバクテリアのポリペ
プチドにカップリングすることによって行うことができる。ポリペプチドのポリマー合成によって、ポリペプチドが細胞外コンパートメン
トに自由に拡散しないので比活性または効力が増し、それによって観察可能なDT
H反応もしくはIFN-γの放出を引き出すのに必要なポリペプチドの用量はより少なくなるであろう。

【００４１】ホモポリマーの詳細な例は、ESAT-6ホモダイマー（SEQ ID NO:２）での実施例
に例証される。この発明のひとつの具体例では、二量体は、ESAT-6の2つのコピーとは別に、ふたつの特徴:リンカー配列とN末端リーダー配列を含む。 ESAT-6のコピーを架橋する化学的な独立体であるリンカー配列は、ポリペプチ
ドの少なくとも2つのコピーを共に保持できるいずれかの物質である。ひとつの具体例では、リンカー配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15または20アミノ酸のようなアミノ酸からなる。好ましい具体例では、リンカー配列は、Arg-
Ser（SEQ ID NO:３）のような2アミノ酸からなる。別の具体例では、ESAT-6タン
パク質は、直接的に互いに隣り合って位置する。さらに別の具体例では、ESAT-6
タンパク質は、例えばリジン樹状構造（lysine tree）または他の化学的な骨格で化学的に集合され、ESAT-6タンパク質は、ポリペプチドにシステイン残基を加
えることによる分子内ジスルフィド架橋の結果として共に保持されるか、あるい
はESAT-6タンパク質は、ESAT-6タンパク質とビオチンにおけるリジン残基間の分
子間結合の結果として共に保持される。

【００４２】 ESAT-6ホモダイマーからなる医療製品の認定を目的として、製品における可能
性のある人工エピトープの数は限定されるべきである。一般的に、T細胞エピトープは6アミノ酸より多いことが認められている。従って、リンカー配列が免疫学的に関係するのを避けるために、リンカー配列は6アミノ酸より少ないのが好ましい。 ESAT-6に先行するN末端リーダー配列の含量は、それが最終製品におけるホモポリマーを干渉しないように選択すべきである。すなわち、物理的にエピトープ
を被覆したり、あるいは製品の構造に干渉すべきではない。さらに、N末端リーダー配列は、実質的極性であるならば、分泌を阻害する。従って、この発明のひ
とつの具体例では、N末端リーダー配列は省かれるか、または6、5、4、3、2、1 個のアミノ酸のような少数のアミノ酸に限定される。好ましい具体例では、N末端リーダー配列は、Asp-Thr-Arg-Ser配列（SEQ ID NO:４）のような配列である。N末端リーダー配列がハンドル、例えば抗体と反応しうるアミノ酸配列を構成するならば、製品の精製は容易になりうることが予測される。

【００４３】 ESAT-6ホモダイマーの生物反応性は、高い感受性によって特徴づけられる。そ
れは真の陽性応答物である。それは、明らかに結核に感染された動物のサンプル
から計算される。この発明のポリペプチドと反応するそのサンプルからの動物の
数が、ポリペプチドの感受性を決定する。例えば、100匹の動物が結核の診断で陽性であり、その動物のうちの89匹がポリペプチドと反応するならば、ポリペプ
チドの感受性は89％である。 ESAT-6ホモダイマーの生物反応性はまた、高い特異性によっても特徴づけられ
る。特異性は、真の陰性応答物の数に関係する。それは、マイコバクテリウムの
非毒性株｛例えばBCGダニッシュ｝を予防接種した動物のサンプルから計算される。この発明のポリペプチドと反応しないそのサンプルからの動物の数が、ポリ
ペプチドの特異性を決定する。例えば、100匹の動物が結核に対する予防接種をして、その動物のうちの8匹がポリペプチドと反応するならば、ポリペプチドの特異性は92％である。

【００４４】この明細書において、用語「カットオフ値（cut-off value）」とは、陽性のシグナルとみなされる試験からの最小のシグナルのことをいう。従って、試験に
用いられるポリペプチドの免疫学的性質とは別に、試験に用いられるカットオフ
値も、アッセイの感受性および特異性に影響を有する。例えばカットオフ値が測
定されるパラメーター（例えば皮膚試験反応における直径）の非常に低い値にセ
ットされるならば、アッセイの感受性は100に近づくが、特異性に関しては、誘導される反応がほんのわずかであれば試験において真の陰性が陽性とみなされる
ので、減少するであろう。従って、所定の試験の効果はカットオフ値に非常に依存し、さらにカットオフ
値の測定は試験の意図される用途に依存することが理解されるであろう。もちろ
ん、通常の状態では、試験は感受性が強くかつ特異的であるべきであるが、ある
状況下ではこれは必ずしも必要ではない。このことは、例えば感受性スクリーニ
ング試験が「調査分野」を制限するために用いられ、1以上の特異的な確認試験がスクリーニング試験の結果を確かめるために用いられるという状態においてあ
りうる。この状態では、最初のスクリーニング試験は非常に特異的である必要は
なく、従って全体的にみて確認工程がスクリーニング試験と同じ感受性を有する
ならば、確認試験は非常に強い感受性を必要としない。

【００４５】この出願において用語ESAT-6は、特異的なアミノ酸（SEQ ID NO:６）および核
酸配列（SEQ ID NO:５）によって特徴づけられる。この発明が、組換え法によっ
て産生されるこれらの配列の類似体と変異体を包含し、ここでESAT-6核酸配列は
該核酸配列における1以上のヌクレオチドの置換、挿入、付加および/または欠失
によって修飾され、ESAT-6組換えポリペプチドにおいて１以上のアミノ酸残基の
置換、挿入、付加または欠失を引き起こすことが理解されるであろう。免疫診断
薬およびワクチン製品の両方において、公知の免疫原性タンパク質またはポリペ
プチドのセグメントから抗原を調製することが、しばしば可能でありかつ実用的
である。あるエピトープ領域が、完全な抗原性ポリペプチドによって産生される
ものと類似の応答を生じるために用いられてもよい。可能性のある抗原性または
免疫原性領域は、いくつかのアプローチ、例えばジャムソン-ウルフ（Jameson-W
olf）またはカイト-ドゥーリトル（Kyte-Doolittle）抗原性分析またはホップ（
Hopp）およびウッズ（Woods）（1981）の疎水性分析（例えばJameson 及び Wolf
, 1988; Kyte 及び Doolittle, 1982; または米国特許第4,554,101号参照）のい
ずれかによって同定することができる。さらに、免疫応答の間に認識される関連
するT細胞エピトープを同定するために、「ブルートフォース（brute force）」
法を用いることもできる。T細胞エピトープは線状であるので、ESAT-6の欠失突然変異体により、例えばこれらの欠失突然変異体をここに記載のIFN-γアッセイ
に付すことによって、ポリペプチドのどの領域が免疫認識に必須であるかが示さ
れる。別の方法は、ESAT-6由来の重複オリゴマー（好ましくは例えば20アミノ酸
残基の長さを有する合成オリゴマー）を利用する。少なくともこれらのいくつか
はIFN-γアッセイにおいて陽性の反応を生じるが、他のものはおそらく生じない
であろう。

【００４６】ポリペプチドの別の種類の修飾が、その活性を増加させるために関連していて
もよい。そのような修飾は、アシル化のような翻訳後修飾、すなわち脂質分子の
付加および/またはグリコシル化であってもよい。 DTH反応を引き出すポリペプチドの能力に関して、ポリペプチドの関連する機能的な部分は、リンパ球様細胞エピトープ、すなわちリンパ球様細胞によって認
識されるアミノ酸配列の部分である。これらのエピトープは、線状または構造的
のいずれであってもよい。ここに記載されるポリペプチドの注射は、同じ個体が1回以上または極端な状態では2回以上の皮膚試験に付されるならば、結核について診断した個体に望ましくない感作を生じる可能性がある。従って、ポリペプチドは、DTH反応またはIFN-γ試験に関して関連するエピトープを無効にすることなく、感作エピトープを無効または除去するために修飾さ
れているのが望ましい。これは、当業者に周知のいくつかの方法によって行うこ
とができる。ひとつの方法は、ポリペプチドを熱処理またはホルムアルデヒド処
理のような変性手順によって修飾することである。

【００４７】代わりに、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列は、翻訳されるア
ミノ酸配列が感作エピトープの全てあるいは幾つかを欠くような方法で修飾する
ことができる。この明細書において、表現「感作エピトープ」は、皮膚試験が診
断目的で用いられたときに人間に対して感作を引き起こすエピトープを意味する
。これらのエピトープは、B細胞エピトープまたはT細胞エピトープのいずれであ
ってもよい。上記定義のポリペプチドは、ヒトまたは動物において上記定義の程度まで陽性
の遅延型過敏性（DTH）反応を引き出すことができるか、または上記定義のIFN- γ放出を引き出すことができる。一般的に、皮膚DTH反応は、ポリペプチドが注射された皮膚の視覚観察および定規の使用によって測定される。一般的に、皮膚
試験の陽性は5、6、7、8、9、10、11、12、15、20または25mmのような、直径5〜
40mm、最も多くは10〜30mmである。特に、ここに提供されるポリペプチドは、DT
H反応がここに定義されかつ以下の実施例で詳細に記載されるようなプロトコールを用いて行われるとき、エム・ツベルクローシス複合体に属する毒性マイコバ
クテリアに予め感染されたモルモットの少なくとも10％においてそのような反応
を引き出すことができる。

【００４８】この発明の有用な具体例では、ポリペプチドは、マイコバクテリウム・ツベル
クローシス由来のものである。自然発生エム・ツベルクローシスのポリペプチド
の例は、ここに参照として取り入れる例えばWO 95/01440号およびWO 95/01441号
に記載されている。上述の理由のために、そのようなポリペプチドのコーディン
グ配列は、ポリペプチドが細胞膜を通り抜けて分泌されるようにシグナル配列に
操作可能に連結するのが好ましい。別の有用な具体例では、その方法は、エピトープまたは抗原決定基を保持する
免疫学的に活性なポリペプチドであるエム・ツベルクローシス由来ポリペプチド
を提供する。このポリペプチドは、免疫学的に有効な量でヒトを含む動物に投与
されるとき、エム・ツベルクローシス複合体の細菌による感染に対して免疫を与
えることができる。従って、この発明によって提供されるポリペプチドはまた、
ワクチンとしても非常に有用である。用語「免疫」が、個体が感染に対して完全に保護されるかまたは予防接種した
集団の100％が免疫を獲得するという意味において、感染に対する100％の免疫が
得られるという要求を包含しないことは評価されるであろう。一般的に、ワクチ
ンが100％の免疫を与えることができないことは当該分野で周知である。

【００４９】上記のとおり、ホモポリマーまたはヘテロポリマーの形態でポリペプチドを提
供するのが有利であると考えられる。従って、有用な具体例では、ポリペプチド
をコードするDNA配列は、例えば本質的に同じアミノ酸配列を有していてもよいマイコバクテリア起源の少なくとも2つのポリペプチドからなる融合タンパク質をコードする配列を含むハイブリッドコーディング配列の一部分であり、それに
よってポリペプチドは融合タンパク質の一部分として発現される。一例として、
そのような融合タンパク質は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス起源の少
なくとも2つのポリペプチド、例えば本質的に同じアミノ酸配列を有するマイコバクテリウム・ツベルクローシス起源の少なくとも2つのポリペプチドからなる。そのような融合タンパク質のコーディング配列は、細胞膜を通り抜けて融合タ
ンパク質が分泌されるように、シグナルペプチドをコードする配列に操作可能に
連結するのが好ましい。ここで提供されるポリペプチドの効力は、それが天然ではポリペプチドと結合
していない「無関係な」アミノ酸の有意な割合を含む形態であるならば減少する
と予測される。従って、収集されるポリペプチド分子は、天然ではポリペプチド
と結合していないアミノ酸を10％より少なく（例えばそのような「無関係な」ア
ミノ酸が5％より少ない場合を含む8％より少なく）含む形態であるのが有利であ
ると考えられる。

【００５０】この発明のさらなる見地では、上記の方法によって得られ、上記定義のような
抗原特性を有するポリペプチドまたはポリペプチドと免疫学的に等しい類似体が
提供される。好ましい具体例では、そのようなポリペプチドは、DTH試験および/またはIFN-
γアッセイにおける陽性反応に関して、非乳酸菌宿主微生物中で発現されるとき
の同じポリペプチドの生物反応性より高い生物反応性を有する。そのより高い生
物反応性は、ポリペプチドと非乳酸菌宿主微生物中で発現されるポリペプチドを
、各々のプロトコールにおいて試験の個体群を用い、陽性反応の数を記録する同
一のDTH反応またはIFN-γアッセイプロトコールに付すことによって測定される。この明細書において、表現「非乳酸菌宿主細胞」には、大腸菌およびマイコバ
クテリウム種のような前述の乳酸菌群に属さない細菌種のいずれもと、植物また
は動物細胞および菌類細胞を含む真核細胞のような他の非細菌宿主細胞のいずれ
もが包含される。

【００５１】特に、試験の被験体または試験動物の群を含む同一のDTH反応プロトコールを用いて非乳酸菌宿主微生物中で発現されるポリペプチドに対して試験されるとき
、ポリペプチドが非乳酸菌宿主微生物中で発現されるポリペプチドに比べて少な
くとも1多い陽性反応、例えば少なくとも２多い陽性反応、さらには少なくとも3
多い陽性反応を引き出すような、望ましくてより高い生物反応性が好ましい。こ
のより高い生物反応性はまた、非乳酸菌的に産生されるポリペプチドと比べた陽
性反応の増加割合として示すことができる。従って、より高い生物反応性は、少
なくとも10％または少なくとも20％のような少なくとも5％の陽性反応の増加（例えば少なくとも50％増加またはさらには少なくとも100％増加を含む少なくとも30％の増加）であることが好ましい。この発明の重要な目的は、結核および予防接種それぞれによって感作されたリ
ンパ球様細胞間を識別できることに関して、現在用いられているPPDツベルクリン皮膚試験試薬に対して有利な特性（すなわち高度に特異的なポリペプチド）を
有するのみならず、PPDツベルクリンに匹敵する感受性も有するポリペプチドを提供することである。従って、この発明の有利な具体例では、ポリペプチドはDT
H試験における陽性反応の数に関して、実質的にPPDツベルクリン試薬の感受性に
等しい診断上の感受性を有する。この感受性は、ポリペプチドとPPDツベルクリンを各々のプロトコールにおいて試験の被験体の群を用い、陽性反応の数を記録
する同一のDTH反応プロトコールに付すことによって測定される。この明細書において、表現「実質的に等しい」は、PPDツベルクリンとこの発明のポリペプチドをDTH皮膚試験のための12の試験動物またはヒトを含む同一のプロトコールを用いて比較するとき、ポリペプチドによって引き出される陽性反応の数が多くて
4より少なく、好ましくは多くて3より少なく、最も好ましくは多くて2より少ないことを意味する。

【００５２】この発明のひとつの目的は、少なくともひとつの調節配列またはシグナルを含
むプロモーター領域の制御下でこの発明のマイコバクテリアポリペプチドの発現
が、１以上の環境または増殖条件因子によって誘導可能および/または調節可能であり、その調節配列またはシグナルが変更または修飾されている乳酸菌を提供
することである。従って、さらなる見地では、この発明は乳酸菌細胞中で複製できる発現ベクタ
ーに関し、そのベクターは、プロモーター領域とそれに操作可能に連結される上
記定義の生物反応性ポリペプチドまたはその類似体をコードするDNA配列からなり、上記定義の抗原特性を有する。この発明のひとつの好ましい具体例では、この発明の発現ベクターはそのプロ
モーター領域においてプロモーター配列因子を含む。その活性または機能は、従
来の乳酸菌工業製法と関連する１以上の環境または増殖条件因子の存在/欠如あるいは濃度によって誘導可能および/または調節可能である。この明細書において、表現「プロモーター配列」は、従来の意味においてRNAポリメラーゼが結合できる部位を示すために用いられる。

【００５３】この発明によれば、プロモーター領域は細菌細胞のいずれから由来してもよい
が、好ましい具体例では、上述の種を含む乳酸菌種およびビフィドバクテリウム
種に由来する。有用な具体例では、プロモーター領域は、ラクトコッカス・ラク
チス亜種ラクチス｛例えばMG1363で示される株[この株はまた、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（cremoris）としても文献に言及されている（Nauta ら、1996）]｝、およびラクトコッカス・ラクチス亜種ラクチス・ビオバ、ジアセチルアクチス（lactis biovar. diacetylactis）を含むラクトコッカス・ラク
チスのプロモーター領域に由来する。この発明に従って修飾することができる自
然発生の誘導可能なプロモーター領域は、プロモーター配列とプロモーター活性
に効果を有する配列を含むヌクレオチド配列を同定し、分離する従来の方法のい
ずれかによって分離することができる。この発明に従って開始物質として有用で
あるそのようなプロモーター領域の例は、プロモーターP170からなる領域を含む
WO 94/16086号に記載されている。典型的に、そのようなプロモーター領域開始物質は、50〜200塩基対の範囲を含む50〜2000塩基対の範囲のような50〜10,000 塩基対の範囲の大きさを有する。

【００５４】好ましくは、上記環境または増殖条件因子は、pH、増殖温度、酸素含量、熱シ
ョック遺伝子の発現を引き出す温度シフト、イオン強度/NaCl含量を含む増殖培地の組成、必須の細胞構成成分またはその前駆体の存在/欠如、細菌の発育相または細菌の成長速度から選択される。プロモーターがひとつのとき、その誘導と調節は従来の増殖培地に存在する１
以上の物質によって制御され、この発明によれば、抗生物質またはバクテリオシ
ンのような通常そのような培地の成分ではない物質は一般的に環境または増殖条
件因子として含まないことが理解されるであろう。この発明のベクターのプロモーター領域は、上述のように、少なくともひとつ
のさらなるヌクレオチド配列因子を含み、その因子の位置、配向、存在および/ または配列は、プロモーター領域に操作可能に連結される遺伝子の発現に調節効
果を有する。ここで用いられるように、表現「さらなるヌクレオチド配列」には
、リボソーム結合部位、転写因子結合部位、リプレッサー結合部位、弱毒化また
は自動制御遺伝子発現を仲介する部位をエンコードする配列、リボソームに対す
る変更された親和性またはヌクレアーゼに対する変更された親和性を有するmRNA
に転写できるDNA配列、転写末端を含むDNA配列、または遺伝子発現を転調および
/または増強できるいずれか他の配列が含まれるであろう。この明細書において、この用語はまた、例えば-10から-35プロモーター配列の間またはその隣接に位
置する配列のような特異的に認識される機能を持たないプロモーター領域におけ
るDNA配列、および他の共通配列も含むであろう。

【００５５】この発明によれば、他の有用な具体例では、発現ベクターにおける少なくとも
ひとつの上記プロモーター配列およびさらなるヌクレオチド配列因子の位置、配
向、存在および/または配列は、対応する非修飾因子の位置、配向、存在および/
または配列と比べて修飾されていてもよい。従って、プロモーター領域配列の考えられる修飾には、転写開始の頻度に影響
を及ぼすこれらの修飾のいずれもが含まれる。これは、例えばPCRまたは転移因子を用いることによって例えば点突然変異を生じるランダムまたは部位特異的突
然変異誘発を含むその目的に関するいずれかの従来技術を用いて、1以上のヌクレオチドを置換、欠失、付加および/または挿入することによって得られる。この発明によれば、プロモーター領域のさらなるは修飾は、以下の実施例で詳
細に説明されるように、上記技術のいずれかを用いて上記のさらなるヌクレオチ
ド配列の１以上になされてもよい。プロモーター配列とさらなるヌクレオチド配列の両方が修飾されるこの発明の
発現ベクターを提供できることが理解されるであろう。

【００５６】ひとつの好ましい具体例では、この発明のベクターは、上記因子の少なくとも
ひとつの修飾によって、プロモーター領域に操作可能に連結される遺伝子の発現
が非修飾プロモーター領域の制御下での同じ遺伝子の発現に比べて変更されてい
るものである。この明細書において、表現「変更される発現」は、産生される遺
伝子産物量が、本質的に同一の環境または増殖条件下で、修飾されたプロモータ
ー領域が由来する対応非修飾プロモーター領域の制御下で同じ遺伝子を含む細菌
を用いるときに産生される遺伝子産物の量と異なっていることを示すために用い
られる。ひとつの好ましい具体例では、プロモーター配列因子および/またはさらなるヌクレオチド配列因子における上記修飾によって、修飾プロモーター領域の制御
下で増強される遺伝子の発現が生じ、それによって同じ遺伝子が修飾プロモータ
ー領域が由来する非修飾プロモーター領域の制御下にある細菌によって産生され
る量と比べて、産生される遺伝子産物の量が増加する。好ましくは、遺伝子産物
の産生は、少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、まさにより好ましく
は少なくとも4倍増加される。少なくとも4倍、より好ましくは少なくとも10倍、
まさにより好ましくは少なくとも200倍のような少なくとも100倍を含む少なくと
も50倍増加のようなまさに実質的により高い増加を生じることができる。

【００５７】この発明の発現ベクターは、修飾プロモーター領域の制御下でコーディング配
列の発現を有するようにマイコバクテリアのポリペプチドをコードするDNA配列を挿入するための少なくともひとつの制限部位を含む。即ち、遺伝子は、プロモ
ーター領域に操作可能に連結されるように挿入される。挿入遺伝子によって発現
される遺伝子産物が細胞膜外に輸送されるか、あるいはまさに培地中に放出され
るのが有利である。このことは、遺伝子がシグナルペプチドの機能性をエンコー
ドするヌクレオチド配列によって先行されるか、または遺伝子が、融合パートナ
ーがリーダー配列とともに提供される結果として分泌可能となる融合タンパク質
をコードするハイブリッド配列の一部分であることを必要とする。従って、所望
により、この発明のベクターに挿入されるコーディング配列は、シグナルペプチ
ドをコードするそのようなヌクレオチド配列、すなわちシグナル配列を含んでい
てもよい。シグナルペプチドは、プロペプチドに機能的に連結させることができ
る。

【００５８】さらなる有用な具体例では、ベクターは、プロモーター領域が（a）その機能が少なくともpH、増殖温度、酸素含量、熱ショック遺伝子の発現を引き出す温度
シフト、イオン強度/NaCl含量を含む増殖培地の組成、必須の細胞構成成分またはその前駆体の存在/欠如、および細菌の発育相、細菌の成長速度からなる群から選択される因子によって調節可能なプロモーター配列因子、および（b）少なくともひとつのさらなるヌクレオチド配列因子（その因子の位置、配向、存在お
よび/または配列はプロモーター領域に操作可能に連結される遺伝子の発現に調節効果を有する）からなり、上記因子（a）または（b）の少なくともひとつの位置、配向、存在および/または配列が、対応する非修飾因子の位置、配向、存在および/または配列と比べて修飾されているものである。さらなる見地では、この発明は、上記定義のベクターで形質転換される上述の
種のいずれかから選択される組換え乳酸菌を提供する。

【００５９】上記のように、結核複合体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコ
バクテリウム・アフリカヌムおよびマイコバクテリウム・ボビス）に属するマイ
コバクテリアで予め感作されたリンパ球様細胞が反応できるポリペプチドは、結
核を検出するための診断試薬として有用である。従って、この発明はインビボお
よびインビトロ試験に適用できるポリペプチドからなる診断用組成物を提供する
。そのような組成物はこの発明のポリペプチドをひとつだけ含むことができるが
、少なくとも2つの異なる診断上活性なポリペプチドを含む診断用組成物を提供するのが有利であろう。この発明の生物反応性ポリペプチドは、結核または他の
マイコバクテリア感染症にかかっている集団で個体を同定することに関して100 ％の効力を発揮しないかもしれないが、ひとつの特定の生物反応性ポリペプチド
によって検出される感染集団の割合は、異なるポリペプチドに関して異なること
が認識されている。従って、この発明の診断用組成物において、それぞれ集団における感染した個
体の異なる割合を同定する多数の生物反応性ポリペプチドを組み合わせることに
よって偽陰性反応の数を減少させ、少なくとも50％の検出効力（例えば少なくと
も90％を含む少なくとも75％を含む少なくとも60％の効力）のような100％に近い効力を得ることができることは評価されるであろう。

【００６０】有用な具体例では、そのような多ポリペプチド診断用組成物は、単量体ポリペ
プチドの混合物、少なくともひとつの単量体ポリペプチドと少なくともひとつの
多量体ポリペプチドの混合物、あるいは3、4、5、6、7、8、9または10多量体ポリペプチドのような少なくとも2つの異なる多量体ポリペプチドの混合物を含有する。エム・ツベルクローシス複合体のマイコバクテリアの他にも、ヒトおよび動物
における感染症が他のマイコバクテリアによって引き起こされるであろう。従っ
て、例として、エム・レプラエはヒトにおける周知の病原体であり、エム・アビ
ウムは家禽および他の動物、場合によってはヒトに感染するであろう。加えて、
上述のものを含むいくつかの他のマイコバクテリア種は、通常健康な個体には感
染症を引き起こさないが、HIV患者や免疫抑制治療あるいは癌治療をうけているヒトを含む免疫防御が低下している個体のような「弱い」個体に感染するという
意味において、「日和見的な」病原体でありうる。

【００６１】従って、この発明の別の目的は、エム・ツベルクローシス複合体に属さないマ
イコバクテリウム種由来の生物反応性ポリペプチド、および免疫学的に等しいそ
れらの類似体、変異体または修飾体を提供することである。そのようなポリペプ
チドは、上記マイコバクテリア種による感染症の診断に有用である。従って、さらなる見地においてこの発明は、そのようなポリペプチドを製造す
る上記定義の方法を提供する。その方法は、必要な変更を加えて、エム・ツベル
クローシス複合体に属するマイコバクテリアで予め感作されたリンパ球様細胞が
反応できる生物反応性ポリペプチドに関してここに記載のようにして行われる。

【００６２】エム・ツベルクローシス複合体のマイコバクテリウムに感染されている個体で
診断反応を生じないポリペプチドを提供するのが有利であろう。従って、ひとつ
の有用な具体例では、得られるポリペプチドは、エム・ツベルクローシス複合体
に属するマイコバクテリアで予め感作されたリンパ球様細胞が反応できないポリ
ペプチドである。エム・ツベルクローシス複合体に属するもの以外のマイコバクテリア種由来の
ポリペプチドは、上記定義のようなモノマー、マルチマー、ホモポリマーまたは
ヘテロポリマーのようなエム・ツベルクローシス複合体由来のポリペプチドにつ
いてここに記載するいずれの形態であってもよい。それらは、DTH皮膚試験において陽性の遅延型過敏性（DTH）反応を引き出す能力およびリンパ細胞からインビトロでIFN-γの放出を刺激する能力を含む上記定義の生物反応性を有しうる。エム・ツベルクローシス複合体に属する微生物由来のポリペプチドのように、
非エム・ツベルクローシス複合体由来ポリペプチドは、任意に安定剤、保存剤、
アジュバントおよび/または塩のような従来の添加剤を任意に含む診断用組成物に有用である。他の有用な添加剤には、例えばジメチルスルホキシド（DMSO）の
ような生物反応性ポリペプチドの浸透を促進する剤が含まれる。興味のある見地において、この発明の非エム・ツベルクローシス複合体由来ポ
リペプチドは、所望によりアジュバント化合物を含むワクチン組成物に用いられ
る。この発明を、以下の非限定的な実施例および図面でさらに例証する。

【００６３】図面の説明図１は、MPT64を発現する株AMJ715から得られるSDS-PAGE（左）と対応するウエスタンブロット（右）を示す。SDS-PAGEは、およそ30kDaの主要な明確なバンドを示し、ウエスタンブロット分析において同じ位置でハイブリッド形成するタ
ンパク質バンドによりMPT64の同一性が確認されている。MPT64は、24kDaに対応する位置に泳動することが記載されている（Oettingerら、1995）。この矛盾は、エム・ツベルクローシスの短期ろ液からの天然のMPT64が同じ位置に泳動するので、この研究に用いた16％トリシンゲルによって生じた可能性がある（データ
は示されていない）。短期ろ液中に見られるMPT64抗原の量（約5％）に基づいて
、エル・ラクチス株AMJ715におけるMPT64抗原の分泌量は10〜15mg/lと評価される。

【００６４】図２は、ESAT-6のシグナルコピーを発現する株AMJ700から得られるSDS-PAGE（
左）と対応するウエスタンブロット（右）を示す。明らかでないタンパク質バン
ドは、モノクローナルESAT-6抗体を用いる以外はクーマシー染色ゲル上で同定す
ることができた。6kDaにおける2つの主要な産物が、認識できた。同じパターンが、ESAT-6を発現するエム・ツベルクローシスからの短期培養ろ液において観察
された（Sorensenら、1995）。分泌されるESAT-6抗原の量を定量するために、ス
タテンス・セーラムインスティテュート・デンマーク（Statens Seruminstitut
Denmark）で大腸菌において産生された既知濃度の組換えESAT-6タンパク質（データは公表されていない）を標準として用いた。大腸菌によって産生されるタン
パク質は、ヒスチジン標識およびマルチクローニング部位のために、N末端に24 個の人工アミノ酸を含む。従って、計算は半定量的にすぎない。ウエスタンブロ
ットをスキャンして評価すると、AMJ700株からのESAT-6抗原の分泌レベルは5mg/
lより少なかった。

【００６５】図３は、2つのESAT-6遺伝子コピーをタンデムに発現するAMJ717株からの上清のSDS-PAGE（左）とウエスタンブロット（右）を示す。SDS-PAGEに関して、およ
そ30kDaの分子量を有する主要なバンドが同定された。ウエスタンブロット分析により、ESAT-6エピトープを有するこのバンドの同一性が確認された。標準とし
てESAT-6タンパク質を産生する組換え大腸菌を用いることにより、AMJ717株から
分泌されたESAT-6-ESAT-6タンパク質の量は30mg/lより多いと評価された。

【００６６】図４は、PPDツベルクリン（陽性対照）、大腸菌で産生されるESAT-6およびラクトコッカス・ラクチスで産生されるESAT-6ホモダイマーそれぞれに感染した純
粋なダンキン・ハートレイモルモットにおけるDTH反応を例証する。図５は、PPDツベルクリン（陽性対照）、大腸菌で産生されるESAT-6およびラクトコッカス・ラクチスで産生されるESAT-6ホモダイマーそれぞれを注射したマ
イコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvで予め感作されたダンキン・ハートレイモルモットにおけるDTH反応を例証する。

【００６７】実施例実施例１：ラクトコッカス・ラクチスP170プロモーターを含むDNAフラグメントの最小化ラクトコッカス・ラクチスMG1363由来のpH調節プロモーターP170は、9.7kb DN
Aフラグメント上に位置し（Israelsenら、1995）、エル・ラクチスMG1363染色体
由来のP170のレスキュー（rescue）から始まるTn917DNAの小さいフラグメントも
含む。Tn917DNAフラグメントは、P170に指向された転写を干渉することが見出さ
れ、その後P170のサブクローニングによって除去した。 P170を含むDNAフラグメントを、170 BamHIおよび170p3Rで示されるプライマー
を用いてエル・ラクチスMG1363染色体からPCR増幅した。これらは、それぞれTn9
17挿入点のすぐ上流に位置するDNA配列とこの点のさらに623bp上流に位置する配列に相補的である。この増幅DNAフラグメントは、Tn917挿入点の205bp上流に位置するEcoRV部位とプライマー170 BamHIの5'末端に位置するBamHI部位を含む。PCRフラグメントをEcoRVおよびBamHIで消化し、205bpフラグメントをEcoRVおよびBamHIで消化したpKS Bluescript IIに挿入し、それによってpSMA470を得た。次いで、pSMA470をXhol（マルチクローニング部位）およびBamHIで消化し、P1
70 DNA配列を含む205bpフラグメントをプロモータークローニングベクターpAK80
（Israelsenら、1995）中にクローン化し、それによってプラスミドpAMJ547を得
た。

【００６８】次いで、この株から発現されるβ-ガラクトシダーゼ活性を、GM17培地またはA
rgM17培地のいずれかで一晩増殖させた培養物の対応するセットから得られたサンプルで測定した（Miller 1972）。酵素活性（表１.１）は、プロモーター活性とpH調節の双方が要素PA170を由来
とする205bp DNAフラグメント上に含まれることを示している。 pAMJ538は、エキソヌクレアーゼBAL31欠失によって構築され、必須の株PA170 においてTn917挿入点のすぐ上流に位置する150bpのDNAフラグメントを含む。プロモーター活性は、この150bpのDNAフラグメントとは関係がない。プロモーター領域の5'境界をさらに定義するために、PCRを用いて、挿入点の1
50bp（プライマー170-150）、160bp（プライマー170-160）、170bp（プライマー
170-170）、180bp（プライマー170-180）および190bp（プライマー170-190）上流を保護するエル・ラクチスMG1363染色体DNAフラグメントをそれぞれ増幅した。これらの5つの遺伝子特異的プライマー（その全てが5'末端にXhol制限部位を含む）は、プライマー170 BamHIと組み合わせて用いた。次いで、増幅DNAフラグ
メントを、XholおよびBamHIで消化し、pAK80にクローン化し、それによってpAMJ
551、pAMJ552、pAMJ553、pAMJ554およびpAMJ561それぞれを得た。プラスミドをエル・ラクチスMG1363に導入し、β-ガラクトシダーゼ活性アッセイ（Miller, 1
972）を、GM17培地およびArgM17培地それぞれで一晩増殖させた培養物のセットに関して行った。酵素活性データに基づけば（表１.１）、プロモーター領域の5
'末端は、Tn917挿入点の上流のbp番号160〜bp番号170の間に位置する。pH調節は
、170bpの P170 DNAフラグメントを含むクローンにおいて完全であった。

【００６９】次いで、P170プロモーター領域を、上記と同様のアプローチを用いることによ
って3'末端から最小化した。Tn917挿入点の20bp（プライマー170 p1 BamHI）、4
0bp（プライマー170 p2 BamHI）、60bp（プライマー170 p3 BamHI）、80bp（プライマー170 p4 BamHI）、100bp（プライマー170 p5 BamHI）、110bp（プライマ
ー170 p6 BamHI）、120bp（プライマー170 p7 BamHI）および130bp（プライマー
170 p8 BamHI）上流にそれぞれ位置するDNA配列に相補的なプライマーを、プライマー170-170とともにPCR反応に用いた（図３）。PCR増幅エル・ラクチスMG136
3染色体DNAフラグメントをXholとBamHIで消化し、pAK80に挿入し、それによって
各プラスミドpAMJ569、pAMJ568、pAMJ567、pAMJ566、pAMJ565、pAMJ577、pAMJ57
8、およびpAMJ579を得た。プラスミドをエル・ラクチスMG1363中に導入し、β- ガラクトシダーゼ活性アッセイ（Miller, 1972）をGM17培地およびArgM17培地そ
れぞれで一晩増殖させた培養物のセットに関して行った（表１.１）。酵素活性は、プロモーター領域の3'末端がTn917挿入点の上流のbp番号120〜bp番号130の間に位置することを示す。データは、遺伝子発現を指示することができる最小のプロモーター領域が、Tn
917挿入点の上流のbp番号120からbp番号170にわたっているDNAフラグメントから
なることを示している。この最小のプロモーター領域もまた、pHによって調節可
能である。

【００７０】

【表１．１】 GM17（増殖後pH約5.5）またはArgM17（増殖後pH約7.0）で一晩増殖させたエル
・ラクチス株におけるβ-ガラクトシダーゼ活性｛ミラー（Miller）単位｝ β-ガラクトシダーゼ活性ラクトコッカス・ラクチス株 GM17 ArgM17 AMJ547 4.3 0.9 AMJ561 3.5 0.2 AMJ554 3.1 0.2 AMJ553 3.2 0.1 AMJ552 0.5 0.3 AMJ551 0.4 0.1 AMJ569 3.1 0.6 AMJ568 1.3 0.1 AMJ567 30 1.4 AMJ566 18 1.1 AMJ565 205 3 AMJ577 48 3 AMJ578 7 0.9 AMJ579 0.6 0.8 AMJ586 700 13

【００７１】実施例２： pAMJ553、pAMJ567およびpAMJ586に含まれるP170プロモーター領域に
基づくエル・ラクチスのための一連のpH調節可能遺伝子発現/分泌ベクターの構築 pH調節可能発現/分泌ベクターのセットを、異なるP170誘導体を、プラスミドp
NZ1020に含まれるUsp輸送シグナルペプチドをエンコードするDNAと組み合わせて
構築した（van Asseldonkら、1990、GenBank M35374）。本質的に、lacLMカセッ
トのオープンリーディングフレームはベクターpAMJ553、pAMJ567およびpAMJ586 から除き、Uspシグナルペプチドをエンコードし、シグナルペプチダーゼのための切断部位とそれにつづくマルチクローニング部位を含むDNAフラグメントを含む新規なPCR発生遺伝子カセットで置換した。Uspシグナル配列は、Uspプライマー1およびUspプライマー2で示されるプライマーを用いるPCR反応で鋳型としてpN
Z1020を用いることによって生じた。Uspプライマー1は、ユニークなBamHI部位、
およびpAK80上のlacLMのATG開始コドン、およびUsp45シグナル配列の最初の23bp
までを含むDNA配列に相補的である。Uspプライマー2は、シグナルぺプチダーゼ切断部位のすぐ上流に位置する4つのコドンおよびシグナルぺプチダーゼ切断部位のすぐ下流に位置する2つのコドンとそれにつづくBglII、PstIおよびSalI部位
を含むマルチクローニング部位に相補的である。PCR発生DNAフラグメントは、la
cLMのリボソーム結合部位とそれにつづくUspシグナル配列の5'末端の最初の29コ
ドンおよびマルチクローニング部位からなる。生じた158bp のPCR産物をBamHIお
よびSalIで消化し、各々BamHIおよびSalIで消化したpAMJ553、pAMJ567およびpAM
J586に連結した。大腸菌に形質転換後、プラスミドDNAを精製し、各構成物をDNA
シーケンシングによって確かめた。得られたベクターは、関心ある遺伝子のpH調
節可能な発現とそれにつづく培地への遺伝子産物の分泌を促進するもので、それ
ぞれpSMA607、pSMA609およびpSMA610と命名した。

【００７２】実施例３：分泌ベクターpSMA610における2つのマイコバクテリウム・ツベルクロ
ーシス抗原MPT64およびESAT-6のクローニングおよび発現この実施例においては、pH調節分泌ベクターpSMA610を用いる2つのマイコバク
テリウム・ツベルクローシス抗原のクローニングと発現を記載する。2つの抗原は、エム・ツベルクローシスの短期培養ろ液中に見られるタンパク質である。抗
原は、診断用皮膚試験試薬として、および結核に対するサブユニットワクチンの
成分として用いることができる。

【００７３】１. MPT64抗原のクローニングエム・ツベルクローシスH37Rv（ATCC27294）株由来の成熟した分泌抗原MPT64 （205アミノ酸、22.4kDa）（OettingerおよびAndersen、1994）をエンコードするDNA配列を、PCR技術を用いて増幅した。プライマーmpt64 p3（5' TTTCTGCTGCA G CCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTGCGCCCAAGACCTACTGCGAG 3'）（SEQ ID NO:７）および
mpt64 p2（5' ACGCGTCGACCTAGGCCAGCATCGAGTC 3'）（SEQ ID NO:８）を、鋳型と
してエム・ツベルクローシスH37Rv由来の染色体DNAを用いるPCR反応に用いた（プライマーのPstIおよびSalI制限部位には下線を付している）。PstIおよびSalI
での消化後に、増幅DNAフラグメントを分泌ベクターpSMA610のPstIおよびSalI部
位に連結し、プラスミドpAMJ715を得た。このクローニングは、シグナルペプチドをエンコードするUsp45の27個のN末端アミノ酸を成熟したMPT64抗原のN末端へ
融合させるために設計した。プラスミドpAMJ715を含むエル・ラクチスMG1363から分泌されるMPT64抗原の一
次タンパク質構造は、エム・ツベルクローシス株H37Rvの短期培養ろ液中に見られるMPT64の一次タンパク質構造と同一であるべきである。プラスミドpAMJ715を
エル・ラクチスに導入し、得られた株をAMJ715と命名した。

【００７４】２. ESAT-6のクローニング上記と同じアプローチを用いて、別の分泌抗原、エム・ツベルクローシス株H3
7Rv由来のESAT-6（95アミノ酸、6kDa）（Sorensenら、1995）をPCR増幅し、分泌
ベクターpSMA610に挿入した。2つのプライマーMT ESAT-6-3（5' GGAAGATCTATGAC
AGAGCAGCAGTGG 3'）（SEQ ID NO:９）およびMT ESAT-6-2（5' ACGCGTCGACCTATGC
GAACATCCC 3'）（SEQ ID NO:１０）を、鋳型としてエム・ツベルクローシスH37R
v由来の染色体DNAを用いるPCR反応において用いた（プライマー中のBglIIおよび
SalI制限部位には下線を付している）。得られたPCRフラグメントをBglIIとSalI
で消化し、予めBglIIおよびSalIで消化したpSMA610に連結し、それによってプラ
スミドpAMJ700を得た。プラスミドpAMJ700をエル・ラクチスに導入し、株AMJ700を得た。株AMJ700は、pSMA610のマルチクローニング部位に由来する抗原のN末端において4つの人工アミノ酸を含むESAT-6抗原を分泌するように設計した。

【００７５】別の構築物では、ESAT-6遺伝子の2つのコピーを分泌ベクターpSMA610中にタン
デムに挿入した。これは、すでにESAT-6遺伝子の１つのコピーを含んだベクター
pAMJ700中にESAT-6の別のコピーを挿入することによってなされた。二番目ESAT-
6遺伝子コピーは、プライマーMT ESAT-6-3およびMT ESAT-6-4（5' GGAAGATCTTGC
GAACATCCCAGTG 3'）（SEQ ID NO:１１）を用いて製造した。MT ESAT-6-4はBglII
制限部位を含み（下線）、停止コドンが欠如している以外は、ESAT-6のC末端に相補的である。PCR増幅後、DNAフラグメントをBglIIで消化し、BglIIで予め消化
したpAMJ700に挿入した。正しい配向で挿入された2つのESAT-6遺伝子コピーを含
むプラスミドが得られ、pAMJ717と命名された。プラスミドpAMJ717は、2つのESA
T-6コピー間のマルチクローニング部位に由来する、4つの人工N末端アミノ酸および2つの人工のリンカーアミノ酸で構成される分泌ポリペプチドをエンコードするように設計した。pAMJ717をエル・ラクチスに導入し、株AMJ717を得た。従って、ESAT-6ホモダイマーが他の制限酵素部位を利用して集合されるならば、リ
ンカー配列およびN末端リーダー配列は他のアミノ酸からなるであろう。

【００７６】３. マイコバクテリア抗原を発現するエル・ラクチス株AMJ700、AMJ715およびA MJ717の発酵株AMJ700、AMJ715およびAMJ717を、1μg/mlのエリスロマイシンを補足したGM1
7培地で予め増殖した。それぞれの株の一晩の培養物10mlを、それぞれ1μg/mlの
エリスロマイシンを補足した1リットルのSAIV培地（JensenおよびHammer、1993 ）を含む別々の発酵槽に接種した。培養温度は、300rpmで一定に攪拌しながら30
℃に維持した。pH値をモニターし、1M NaOHで滴定して5.2のセットポイントを維
持した。pHセットポイントが増殖の6〜8時間後およびさらに培養から4時間後に到達し、それぞれの株における抗原の産生を分析するためにサンプルを回収した
。細胞ペレットを、3000xgで10分間培養物を遠心分離して除去した。上清を、ア
ミコン（Amicon）およびミリポア（Millipore）から入手可能なマイクロろ過システムを用いて40回濃縮して、さらなる分析のために調製した。

【００７７】４. SDS-PAGEおよびウエスタンブロットによるエル・ラクチスにおいて産生されるマイコバクテリア抗原の検出および定量 AMJ700、AMJ715およびAMJ717株からの濃縮した培養上清を、16％トリシンポリ
アクリルアミドSDSゲル（Novex）上にローディングする前に、5％DTTを含むサン
プル緩衝液（Novex）中で煮沸した。サンプルを電気泳動に付し、ゲルをノベックス（Novex）推奨のプロトコールを用いてコロイドのクーマシーブルーで染色した（図１〜３）。タンパク質を、50ボルトの一定の力で1.5時間ノベックスのミニ-タンクブロッ
ターを用いてニトロセルロース膜（Novex）上でエレクトロブロットした。膜を、5％BSA含有TBS緩衝液（50mMトリス塩基 pH10.2、500mM NaCl）で5分間ブロックし、0.05％ツイーン20および0.1％BSAを含むTBS緩衝液で一回洗浄した。次いで、膜は各抗原に対応する一次抗体とともに一晩インキュベートした。 ESAT-6に対するモノクローナル抗体HYB76-8（Klausenら、1994）およびMPT64 い対するC24b1（Andersenら、1991）を、0.05％ツイーン20および0.1％BSAを含むTBS緩衝液で1:500倍希釈して用いた。膜を、一次抗体のインキュベーションに
用いたのと同じ緩衝液で5分間3回洗浄した。二次ウサギ-抗マウスAP結合抗体（D
AKO）を1:2000倍希釈し、一次抗体の場合と同じ条件で２時間、膜とともにインキュベートした。先の洗浄条件を導入し、最終的に、ニトロセルロース膜を、製
造者（Boehringer Mannheim）推奨のNBT/BCIPのすぐに使用できるタブレットを用いて展開した。

【００７８】実施例４：10L製造スケールにおけるESAT-6の2つのコピーを含むポリペプチドの
製造ラクトコッカス・ラクチス株AMJ717を、pH約6.5で10L のSAIV培地を含む発酵槽中で嫌気的に培養した。発酵は、およそ15時間およそ30℃で行った。発酵につ
づいて、乳酸菌細胞を培地から分離し、得られた上清を、クロスフローろ過によ
って約50倍に濃縮した。ツイーン20を、0.01％（v/v）の最終濃度まで培養上清に加える。培養上清を、10kDaの分子量カットオフを有するプレップ-スケールフ
ィルターを用いて容量でおよそ1/50に濃縮する。次いで、濃縮上清をダイアフィルトレーションを用いて20mMビス-トリスpH5.5
; 0.01％（v/v）ツイーン20に対して大量に透析し、50mLを含むバイアル中にアリコートする。濃縮され、ダイアフィルトレーションされた上清を、使用まで80
℃で保存する。濃縮され、ダイアフィルトレーションされた上清を溶解し、ESAT6-ESAT6を以下のプロトコールを用いて精製することができる。サイズ排除クロマトグラフィーを、20mMビス-トリスpH5.5; 150mM NaClで平衡
化したS200（5x100cm）カラムを用いて行う。特定のタンパク質を含むフラクションをプールし、5mS/cmより低い伝導率になるまで20mMビス-トリスpH5.5で希釈
する。

【００７９】次いで、希釈されたサンプルを、Q-セファロース（2.6x5cm）を詰めたアニオン交換カラムに充填する。使用後、カラムを20mMビス-トリスpH5.5; 50mM NaCl を用いて洗浄し、特定のタンパク質を塩のグラジエント（洗浄緩衝液で希釈され
た50〜500mM NaCl）を用いて溶出する。次いで、特定のタンパク質を含むフラクションを、以下のプロトコール用いて
アニオン交換クロマトグラフィーを用いて濃縮する。：プールされたフラクションを、2.5mS/cmより低い伝導率になるまで20mMビス- トリスpH5.5で希釈する。サンプルを、20mMビス-トリスpH5.5で平衡化したアニオン交換カラム（Q-セフ
ァロース1x2cm）に充填する。使用後、カラムを20mMビス-トリスpH5.5; 50mM Na
Clで洗浄する。特定のタンパク質を、20mMビス-トリスpH5.5; 500mM NaClを用いて溶出するこ
とによって得る。記載された精製方法は、他のタンパク質産物の精製から公知であるので、例え
ば尿素による変性とそれにつづく透析を含まない。タンパク質は、記載の精製方
法で変性されず、次いで再生されないであろう。このことにより、それらの天然
の立体配座、従ってはより天然のエピトープを維持するタンパク質が生じる。こ
のことによって、生成物はバッチごとに再生可能とされている。記載された精製方法はまた、大腸菌Esat-6の精製において用いられ、他の精製
方法から公知のhis標識配列を不必要にする。ポリペプチド産物における実質的なN末端リーダー配列の欠如が、エピトープがN末端リーダー配列によって保護さ
れないことを保証しているものと予測される。

【００８０】実施例５：ESAT-6ポリペプチドの生物反応性マイコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvに感染したモルモットのDTH反
応皮膚試験における効力について、実施例４において得られた部分的に精製およ
び濃縮されたポリペプチドを試験した。PPDツベルクリンを実験において陽性対照として用い、陰性対照として純粋な動物を含めた。比較目的として、大腸菌で
発現されたESAT-6ポリペプチドを含めた。皮膚試験の実験の4週間前に、12匹のダンキン・ハートレイモルモットを静脈経路で感染させた。動物あたりの感染用量は、2.5x10⁵CFU/mlを含む細菌懸濁液0
.2mlであった。皮膚試験に用いた抗原製品は以下のようであった。（i）0.005％ポリソルベート80および0.01％チニソール（PBSTC）を含むPBS中の
タンパク質（100ツベルクリン単位/ml）溶液である市販のPPD製品、（ii）実施例４からの精製および濃縮されたポリペプチド製品を2xPBSTCおよびP
BSで希釈し、0.005％ポリソルベート80および0.01％チニソールおよび20μg/ml のESAT-6タンデムタンパク質を含む溶液とした、（iii）PBSTC中の大腸菌で産生され、20μg/mlのポリペプチドを含むESAT-6ポリ
ペプチドの製品。

【００８１】一日目に、各抗原製品を、無作為なスキーム（randomization scheme）に従っ
て、それぞれ12匹の感染モルモットおよび6匹の純粋モルモットに皮内注射した。動物あたりの用量は、各製品の100μlであった。二日目に、炎症性皮膚反応（紅斑）の直径を定規によって測定した。直径の測
定は、二人の人間によって独立的になされたふたつの読みに基づき、結果は、4 つの読みの平均として算出した。陽性反応は、反応の直径が5mm以上のときに記録された。結果は、図４（純粋動物）および図５（感染動物）に要約している。3つの抗原製品のすべてに関して、純粋動物では反応は観察されなかったようである。感
染動物では、PPD製品で12/12のモルモットにおいて陽性反応がみられた。大腸菌
発現ESAT-6製品では、6/12のモルモットにのみ陽性反応がみられた。一方、ラク
トコッカス・ラクチス発現ESAT-6融合タンパク質は、12/12のモルモットに陽性反応を生じた。

【００８２】上記の実施例から、分泌ベクターpSMA610が異種遺伝子を発現でき、次いで外部の培地に遺伝子産物を指向していることが明らかに立証されている。分泌タン
パク質の量は、5mg/lより低いレベルから30mg/lを超えるレベルの範囲にわたって変化することができる。これらの相違は、個々の異種タンパク質の異なる化学
的または物理的な特徴によって引き起こされている可能性がある。化学的に定義
された培地SAIVにおけるP170プロモーターの活性もまた、立証された。この活性
は、多くの医薬のタンパク質が動物タンパク質を含む複合培地で産生されないと
いう事実のために重要である。さらに、試験された乳酸菌で産生されるマイコバクテリアのポリペプチドが、
大腸菌で産生されるポリペプチドよりも実質的に高く、かつPPDツベルクリンの生物反応性に等しい生物反応性を有することが立証された。

【００８３】実施例６：ESAT-6ホモダイマーの感受性および特異性 ESAT-6の生物学的活性を、モルモットモデルで試験した。エル・ラクチスで産
生されるESAT6-ESAT6がマイコバクテリウム・ツベルクローシス感染モルモットにおいてDTH様反応を引き出す効力を研究した。比較目的として、大腸菌で発現されるESAT-6ポリペプチド（Harboeら、1998に記載のようにして製造）を含めた
。試験は、以下のプロトコールに従って行った。皮膚試験の実験4週間前に、ダンキン・ハートレイモルモットにマイコバクテリウム・ツベルクローシスを感染させた。モルモットは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv株を用いる静脈注射感染（0.2ml 2.5x10⁵CFU/ml）、あるいは1x10⁵CFU/mlの用量でマイコバクテ
リウム・ツベルクローシスエルドマン（Erdman）株を用いるエアロゾール感染に
よって感染させた。

【００８４】疾患の臨床上の開始は、感染期間中、動物を観察して追跡した。通常、動物に
は病的な立毛がみられ、感染の2週間後には週当たり約10％の体重減少が臨床的に観察された。動物には、PPD陽性を試験することができるか、または実験後に肺における肉芽腫の出現に関して試験することができる。 BCGで免疫化したモルモットの群を対照として用いた。モルモットは、皮膚試験の実験4週間前に0.1ml のBCGダニッシュ1331で免疫化した。感染の4週間後に、実施例５に記載するのと同じプロトコールを用いて皮膚試験を行った。データは、61匹のモルモット（36匹がマイコバクテリウム・ツベルクローシス
に感染し、25匹のモルモットがBCGダニッシュ株1331を用いて免疫化された）を用いて行った実験を表している。 7mmより大きいDTH反応を陽性と考えて、以下の結果を得た。

【００８５】ツベルクリン coli-ESAT6 ESAT6-ESAT6 感受性 83％ 74％ 94％特異性 2％ 95％ 94％

【００８６】 10mmより大きいDTH反応を陽性と考えて、以下の結果を得た。

【００８７】ツベルクリン coli-ESAT6 ESAT6-ESAT6 感受性 56％ 44％ 84％特異性 10％ 100％ 100％

【００８８】従って、陽性のDTH応答に関するカットオフの選択に依存して、ESAT6-ESAT6は
、大腸菌で産生されるESAT6ポリペプチドより20〜40％良好な感受性を有する。この新しい抗原で陽性を推測するための真の値は、臨床使用を通してのみ決定
することができる。感受性を損なわずに高い特異性を保証するカットオフ値を考
慮することが、最も重要である。

【００８９】参考文献のリスト Andersen, A. B., L. Ljungquist, K. Haaslov 及び M. W. Bentzon. 1991. S
cand. J. Immunol. 34:365-372. de Ruyter, P.G.G.A., O.P. Kuipers, M.M. Beerthuyzen, I. van Alen-Boerr
igter, 及びW.M. de Vos. 1996. J. Bacteriol. 178:3434-3439. Harboe ら、Infection and Immunity, Feb. 1998, p 717-723 Israelsen, H., S.M. Madsen, A. Vrang, E.B. Hansen, 及びE. Johansen. 19
95. Appl. Environ. Microbiol. 61: 2540-2547. Jensen, P. 及び K. Hammer. 1993. Appl. Environ. Microbiol. 59:4363-436
6. Klausen, J., M. Magnusson, A. B. Andersen, 及び C. Koch. 1994. Scand. J
.Immunol. 40:345-349. Miller, J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harb
or Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Nagai, S., H.G. Wiker, M. Harboe, M. Kinomoto. 1991. Infection and Imm
unity 59:372-382. Nauta, A., D. van Sinderen, H. Karsens, E. Smit, G. Venema, 及び J. Ko
k. 1996. Mol. Microbiol. 19:1331-1341. Oettinger, T. 及び A.B. Andersen. 1994. Infection and Immunity. 62:205
8-2064. O'Sullivan, D.J., S.A. Walker, S.G. West, 及び T.R. Klaenhammer. 1996.
Biotechnology 14:82-87. Steidler, L., J.M. Wells, A. Raeymaekers, J. Vandekerckhove, W. Fiers,
及び E. Remaut. 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61:1627-1629. Sorensen, A.L., S. Nagai, G. Houen, P. Andersen 及び A.B. Sorensen A.B
. 1995. Infection and Immunity 63:1710-1717. van Asseldonk, M., A. Simons, H. Visser, W.M. de Vos, 及び G. Simons.
1993. J. Bacteriol. 175:1637-1644. van Rooijen, R.J., M.J. Gasson, 及び W.M. de Vos. 1992. J. Bacteriol.
174:2273-2280. Wells, J.M., P.W. Wilson, P.M. Norton, M.J. Gasson, 及び R.W.F. Le Pag
e. 1993a. Mol. Microbiol. 8:1155-1162. Wells, J.M., P.W. Wilson, P.M. Norton, M.J. Gasson, 及び R.W.F. Le Pag
e. 1993b. Appl. Environ. Microbiol. 59:3954-3959. Yamaguchi, R., K. Matsuo, A. Yamazaki, C. Abe, S. Nagai, K. Terasaka 及び T. Yamada. 1989. Infection and Immunity 57: 283-288.

【００９０】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

図１は、MPT64を発現する株AMJ715から得られるSDS-PAGE（左）と対応するウエスタンブロット（右）を示す。SDS-PAGEは、およそ30kDaの主要な明確なバンドを示し、ウエスタンブロット分析において同じ位置でハイブリッド形成するタ
ンパク質バンドによりMPT64の同一性が確認されている。MPT64は、24kDaに対応する位置に泳動することが記載されている（Oettingerら、1995）。この矛盾は、エム・ツベルクローシスの短期ろ液からの天然のMPT64が同じ位置に泳動するので、この研究に用いた16％トリシンゲルによって生じた可能性がある（データ
は示されていない）。短期ろ液中に見られるMPT64抗原の量（約5％）に基づいて
、エル・ラクチス株AMJ715におけるMPT64抗原の分泌量は10〜15mg/lと評価される。

【００９１】図２は、ESAT-6のシグナルコピーを発現する株AMJ700から得られるSDS-PAGE（
左）と対応するウエスタンブロット（右）を示す。明らかでないタンパク質バン
ドは、モノクローナルESAT-6抗体を用いる以外はクーマシー染色ゲル上で同定す
ることができた。6kDaにおける2つの主要な産物が、認識できた。同じパターンが、ESAT-6を発現するエム・ツベルクローシスからの短期培養ろ液において観察
された（Sorensenら、1995）。分泌されるESAT-6抗原の量を定量するために、ス
タテンス・セーラムインスティテュート・デンマーク（Statens Seruminstitut
Denmark）で大腸菌において産生された既知濃度の組換えESAT-6タンパク質（データは公表されていない）を標準として用いた。大腸菌によって産生されるタン
パク質は、ヒスチジン標識およびマルチクローニング部位のために、N末端に24 個の人工アミノ酸を含む。従って、計算は半定量的にすぎない。ウエスタンブロ
ットをスキャンして評価すると、AMJ700株からのESAT-6抗原の分泌レベルは5mg/
lより少なかった。

【００９２】図３は、2つのESAT-6遺伝子コピーをタンデムに発現するAMJ717株からの上清のSDS-PAGE（左）とウエスタンブロット（右）を示す。SDS-PAGEに関して、およ
そ30kDaの分子量を有する主要なバンドが同定された。ウエスタンブロット分析により、ESAT-6エピトープを有するこのバンドの同一性が確認された。標準とし
てESAT-6タンパク質を産生する組換え大腸菌を用いることにより、AMJ717株から
分泌されたESAT-6-ESAT-6タンパク質の量は30mg/lより多いと評価された。

【００９３】図４は、PPDツベルクリン（陽性対照）、大腸菌で産生されるESAT-6およびラクトコッカス・ラクチスで産生されるESAT-6ホモダイマーそれぞれに感染した純
粋なダンキン・ハートレイモルモットにおけるDTH反応を例証する。図５は、PPDツベルクリン（陽性対照）、大腸菌で産生されるESAT-6およびラクトコッカス・ラクチスで産生されるESAT-6ホモダイマーそれぞれを注射したマ
イコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvで予め感作されたダンキン・ハートレイモルモットにおけるDTH反応を例証する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人Ａｒｔｉｌｌｅｒｉｖｅｊ５，ＤＫ− 2300 ＣｏｐｅｎｈａｇｅｎＳＤＥＮＭＡＲＫ (72)発明者フォルカーセン，ジョルゲンデンマーク、ファーラムディーケー− 3520、リッターヴァンゲット 31 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 CA03 DA05 EA04 FA02 FA18 GA11 GA19 4B064 AG31 CA02 CA19 CC24 CE06 CE07 CE11 DA01 DA15 4C085 AA03 BA09 DD22 DD61 DD86 FF24 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA11 DA86 EA31 EA52 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (i) ポリペプチドをコードするDNA配列を準備し、(ii) 上記
コーディング配列を乳酸菌中で複製できるベクターに挿入し、(iii)上記ベクターで乳酸菌を形質転換し、(iv) こうして形質転換された細菌をポリペプチドが発現される条件下で培地で培養し、(v) マイコバクテリアのポリペプチドを収集
する工程からなり、こうして得られるポリペプチドが、エム・ツベルクローシス複合体に属する毒
性マイコバクテリアに予め感染されたモルモットの少なくとも10％において陽性
の遅延型過敏性（DTH）反応を引き出すことができ、そのDTH反応が、本質的に以下：（i）少なくとも部分的に精製されたポリペプチドの製品を0.005％のポリソルベ
ートと0.01％のチニソールを含有するPBSで希釈して、約20μg/mlのポリペプチド濃度とし、（ii）希釈されたポリペプチド製品の100μlを、DTH反応試験の4週間前に約0.5x
10⁵CFUの用量でマイコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvを静脈注射することによって感染させたダンキン・ハートレイモルモットの群に皮内注射し、か
つ（iii）注射部位での炎症反応の大きさを定規によって2日目に測定し、5mm以上の大きさの反応を陽性反応として記録するプロトコールを用いて行われる、エム・ツベルクローシス複合体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マ
イコバクテリウム・アフリカヌムおよびマイコバクテリウム・ボビス）に属する
マイコバクテリアで予め感作されたリンパ球様細胞が反応できる生物反応性ポリ
ペプチド、または免疫学的にそのポリペプチドに等しい類似体を製造する方法。
【請求項２】ベクターが、コーディング配列に操作可能に連結されるシグ
ナル配列を含み、それによってポリペプチドが細胞膜を通り抜けて分泌される請
求項１による方法。
【請求項３】ポリペプチドのコーディング配列が、マイコバクテリウム・
ツベルクローシスに由来する請求項１による方法。
【請求項４】コーディング配列がシグナル配列に操作可能に連結され、そ
れによってポリペプチドが細胞膜を通り抜けて分泌される請求項３による方法。
【請求項５】ポリペプチドがエピトープまたは抗原決定基を保持する免疫
学的に活性なポリペプチドであり、上記ポリペプチドが、ヒトを含む動物に投与
されるときにエム・ツベルクローシス複合体の細菌による感染症に対して免疫を
与えることができる請求項３による方法。
【請求項６】ポリペプチドが、少なくとも20mg/Lの量で培地に分泌される
請求項２または４による方法。
【請求項７】コーディング配列がハイブリッドコーディング配列の一部分
であり、それによってポリペプチドが融合タンパク質の一部分として発現される
請求項１による方法。
【請求項８】融合タンパク質が、マイコバクテリア起源の少なくとも2つのポリペプチドからなる請求項７による方法。
【請求項９】融合タンパク質が、本質的に同じアミノ酸配列を有するマイ
コバクテリア起源の少なくとも2つのポリペプチドからなる請求項８による方法。
【請求項10】融合タンパク質が、マイコバクテリウム・ツベルクローシス
起源の少なくとも2つのポリペプチドからなる請求項７による方法。
【請求項11】融合タンパク質が、本質的に同じアミノ酸配列を有するマイ
コバクテリウム・ツベルクローシス起源の少なくとも2つのポリペプチドからなる請求項10による方法。
【請求項12】ハイブリッドコーディング配列が、細胞膜を通り抜けて融合
タンパク質が分泌されるようにシグナルペプチドをコードする配列に操作可能に
連結される請求項６による方法。
【請求項13】乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクチスである請求項１による
方法。
【請求項14】収集されるポリペプチド分子が、天然ではポリペプチドと結
合していないアミノ酸を10％より少なく含む形態である請求項１〜13のいずれか
による方法。
【請求項15】請求項１〜13のいずれかの方法によって得ることができ、エ
ム・ツベルクローシス複合体に属する毒性マイコバクテリアに予め感染されたモ
ルモットの少なくとも10％において陽性の遅延型過敏性（DTH）反応を引き出すことができ、そのDTH反応が、本質的に以下：（i）少なくとも部分的に精製されたポリペプチドの製品を0.005％のポリソルベ
ートと0.01％のチニソールを含有するPBSで希釈して、約20μg/mlのポリペプチド濃度とし、（ii）希釈されたポリペプチド製品の100μlを、DTH反応試験の4週間前に約0.5x
10⁵CFUの用量でマイコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvを静脈注射して感染させたダンキン・ハートレイモルモットの群に皮内注射し、（iii）注射部位での炎症反応の大きさを定規によって2日目に測定し、5mm以上の大きさの反応を陽性反応として記録するプロトコールを用いて行われる、エム・ツベルクローシス複合体に属するマイコバクテリアで予め感作されたリ
ンパ球様細胞が反応できるポリペプチド、または免疫学的にそのポリペプチドに
等しい類似体。
【請求項16】 DTH試験における陽性反応に関して、非乳酸菌宿主微生物中で発現されるときの同じポリペプチドの生物反応性より高い生物反応性を有し、
そのより高い生物反応性が、ポリペプチドと非乳酸菌宿主微生物中で発現される
ポリペプチドを各々のプロトコールに試験個体群を用いて同一のDTH反応プロトコールに付し、陽性反応の数を記録することによって測定される請求項15による
ポリペプチド。
【請求項17】同一のDTH反応プロトコールを用いて非乳酸菌宿主微生物中で発現されるポリペプチドに対して試験する際に、非乳酸菌宿主微生物中で発現
されるポリペプチドと比べて少なくともひとつ多い陽性反応を引き出す請求項16
によるポリペプチド。
【請求項18】 (i) ポリペプチドをコードするDNA配列を準備し、(ii) 上記
コーディング配列を乳酸菌中で複製できるベクターに挿入し、(iii) 上記ベクタ
ーで乳酸菌を形質転換し、(iv) こうして形質転換した細菌をポリペプチドが発現される条件下で培地で培養し、かつ(v) マイコバクテリアのポリペプチドを収
集する工程からなり、上記ポリペプチドが、マイコバクテリアで予め感作された
リンパ球様細胞が反応できるポリペプチドからなる群から選択される、エム・ツ
ベルクローシス複合体に属さないマイコバクテリウム由来の生物反応性ポリペプ
チド、および免疫学的にそのポリペプチドに等しい上記ポリペプチドの類似体を
製造する方法。
【請求項19】得られるポリペプチドが、エム・ツベルクローシス複合体に
属するマイコバクテリアで予め感作されたリンパ球様細胞が反応できないポリペ
プチドである請求項18による方法。
【請求項20】エム・ツベルクローシス複合体に属さないマイコバクテリウ
ムが、エム・アビウム、エム・イントラセルラーレ、エム・カンサシイ、エム・
スクロフラセウム、エム・マリヌム、エム・ウルセランス、エム・フォルチュイ
ツム、エム・ケロネイ、エム・フレイ、エム・ゴルドネ、エム・スメグマティス
、エム・パラツベルクローシスおよびエム・レプラエからなる群から選択される
請求項18または19による方法。
【請求項21】請求項18〜20のいずれかの方法によって得ることができるポ
リペプチド。
【請求項22】 DTH皮膚試験において陽性の遅延型過敏性（DTH）反応を引き
出すことができる請求項21によるポリペプチド。
【請求項23】インビトロでリンパ細胞からのIFN-γ放出を刺激することが
できる請求項15または21によるポリペプチド。
【請求項24】請求項15〜17または21〜23のいずれかによるポリペプチドか
らなる診断用組成物。
【請求項25】請求項15または21によるポリペプチドからなるワクチン。
【請求項26】さらにアジュバントを含む請求項25によるワクチン。
【請求項27】リンカー配列および任意にN末端リーダー配列と任意に連結される、ESAT-6の少なくとも2つのコピーからなるESAT-6ホモポリマーポリペプチド。
【請求項28】 ESAT-6の少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15または20 コピーからなる請求項27によるESAT-6ホモポリマーポリペプチド。
【請求項29】 ESAT-6の2つのコピーからなる請求項27によるESAT-6ホモダイマーポリペプチド。
【請求項30】 1アミノ酸を有するリンカー配列を含む請求項27によるESAT-
6ホモポリマーポリペプチド。
【請求項31】 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15または20アミノ酸を有する
リンカー配列を含む請求項27によるESAT-6ホモポリマーポリペプチド。
【請求項32】 2アミノ酸を有するリンカー配列を含む請求項31によるESAT-
6ホモポリマーポリペプチド。
【請求項33】リンカー配列がArg-Serである請求項32によるESAT-6ホモポリマーポリペプチド。
【請求項34】 N末端リーダー配列がAsp-Thr-Arg-Serである請求項27〜33の
いずれかによるESAT-6ホモポリマーポリペプチド。
【請求項35】ポリペプチドが、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98
％、99％、99.5％、99.9％または100％のような70％より高い特異性を有する請求項27〜34のいずれかによるESAT-6ホモポリマーポリペプチド。
【請求項36】ポリペプチドが、エム・ツベルクローシス複合体に属する毒
性マイコバクテリアに予め感染されたモルモットの少なくとも10％において陽性
の遅延型過敏性（DTH）反応を引き出すことができ、そのDTH反応が、本質的に以下：（i）少なくとも部分的に精製されたポリペプチドの製品を0.005％のポリソルベ
ートと0.01％のチニソールを含有するPBSで希釈して、約20μg/mlのポリペプチド濃度とし、（ii）希釈されたポリペプチド製品の100μlを、DTH反応試験の4週間前に約0.5x
10⁵CFUの用量でマイコバクテリウム・ツベルクローシス株H37Rvを静脈注射することによって感染させたダンキン・ハートレイモルモットの群に皮内注射し、（iii）注射部位での炎症反応の大きさを定規によって2日目に測定し、5mmより大きい大きさの反応を陽性反応として記録するプロトコールを用いて行われる、請求項27〜35のいずれかによるESAT-6ホモポリ
マーポリペプチド。
【請求項37】ポリペプチドが、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85
％、90％または94％のような20％より高い感受性を有する請求項36によるESAT-6
ホモポリマーポリペプチド。
【請求項38】 (i) ホモポリマーをコードするDNA配列を準備し、(ii) 上記
コーディング配列を細胞中で複製できるベクターに挿入し、(iii) 上記ベクター
で細胞を形質転換し、(iv) こうして形質転換した細胞をホモポリマーが発現される条件下で培地で培養し、(v) ホモポリマーを収集する工程からなる請求項27
〜37のいずれかによるホモポリマーを製造する方法。
【請求項39】細胞が乳酸菌である請求項38による方法。
【請求項40】請求項27〜37のいずれかによるESAT-6ホモポリマーポリペプ
チドからなる診断用組成物。
【請求項41】請求項27〜37のいずれかによるESAT-6ホモポリマーポリペプ
チドからなる免疫剤。
【請求項42】さらにアジュバントを含む請求項41による免疫剤。
【請求項43】ワクチンの形態における請求項41または42による免疫剤。
【請求項44】皮膚試験試薬の形態である請求項41または42による免疫組成
物。
【請求項45】マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウ
ム・アフリカヌムまたはマイコバクテリウム・ボビスによって引き起こされる結
核の診断用医薬組成物の調製、または結核に対する予防接種における請求項27〜
37または40〜44のいずれかによるESAT-6ホモポリマーの使用。
【請求項46】有効成分としてESAT-6ホモダイマーのようなESAT-6ホモポリ
マーをエンコードするDNA配列の１以上のコピーを含み、哺乳類細胞中でESAT-6 ホモポリマーの発現が促進されるように製剤化される、結核に対してヒトを含む
動物を免疫化するためのワクチン。
【請求項47】有効成分として、ESAT-6ホモポリマーをエンコードするDNA 配列からなるDNAフラグメントの少なくとも１コピーが、微生物にポリペプチドを発現させ、任意に分泌させるように微生物のゲノムに導入されている非病原性
微生物を含む、結核に対してヒトを含む動物を免疫化するためのワクチン。
【請求項48】微生物が細菌である請求項47によるワクチン。
【請求項49】微生物が、マイコバクテリウム・ボビスBCG株：ダニッシュ1
331のようなマイコバクテリウム・ボビスBCGである請求項48によるワクチン。
【請求項50】動物またはヒトからの血液サンプルを準備し、動物からのサ
ンプルを請求項27〜37または40〜44のいずれかによるESAT-6ホモダイマーと接触
させることからなり、血液サンプル中の単核細胞による少なくともひとつのサイ
トカインの細胞外層への有意な放出によって動物が感作されていることが示され
る、動物またはヒトにおける結核複合体に属する細菌に対する進行中もしくは以
前の感作を診断する方法。