JP2002534960A - ワクチン - Google Patents

ワクチン

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JP2002534960A
JP2002534960A JP2000589562A JP2000589562A JP2002534960A JP 2002534960 A JP2002534960 A JP 2002534960A JP 2000589562 A JP2000589562 A JP 2000589562A JP 2000589562 A JP2000589562 A JP 2000589562A JP 2002534960 A JP2002534960 A JP 2002534960A
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ボーラン，アレックス
ホーコニエ，アレン
ゴドフロワ，エドモン
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Universite Libre de Bruxelles ULB
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＩＩＩ型分泌系を宿す病原性バクテリア株を検出するための一般的方法に関する。より特に、本発明は、病原体ボルデテラ・ペルタシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に適用されるような方法に関する。さらに、本発明は、上記領域内に新たに同定されたポリヌクレオチド、それらによりコードされた有害ポリペプチド、並びに上記ポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用に関する。より特に、本発明に係るポリヌクレオチド及びポリペプチドは、ワクチン目的に特に好適である、百日咳菌のＩＩＩ型分泌系に関連する有害なエフェクター・タンパク質に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、III型分泌系を有する細菌の病原性菌株を検出し、ビルレンス遺伝
子が存在する当該菌株の染色体の領域を特性決定するための一般法に関するもの
である。より詳細には、本発明は、病原体Bordetella pertussisに適用される当
該方法に関するものである。さらに、本発明は、これらの領域内で新たに同定さ
れたポリヌクレオチド、それらによりコードされているビルレントポリペプチド
および係るポリヌクレオチドおよびポリペプチドの用途、ならびにそれらの産生
に関するものである。
【０００２】 発明の背景 III型分泌系： 病原性細菌は、幅広い宿主範囲で数多くの異なる生態学的地位を侵し、多岐に
わたる症候群を惹起する。かつて、各々の疾病が別個の分子機序によって誘発さ
れると考えられていたことは、この事実によるものである。しかしながら、この
ような機序のスペクトルは当初想像されていたほど広くはなく、むしろ細菌は、
幾つかの共通する分子的手段を活用して或る範囲の目的を達成している。これら
の手段の中に、細菌が宿主細胞を直接ビルレンス因子の標的とする手段を提供す
る、III型分泌系がある。次いでこれらの因子は当該病原体の利益になるよう宿
主細胞の機能に干渉する。
【０００３】 III型運搬系は、SalmonellaおよびShigella侵入およびビルレンス因子、腸管
病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）シグナル伝達分子、幾つかの植物病原体中のビルレン
ス因子（例えば、Xanthomonas campestris pv. vesicatoria［Fenselau等、1992
］）およびYersinia中のYops蛋白の分泌を担っている。Yops運搬機序は、最も詳
細に研究されているIII型分泌機構である（例えば、Allaoui等、1994；Bergman
等、1994を参照されたい）。この系では、全てビルレンスプラスミドｐＹＶによ
りコードされている２０以上の異なるＹｓｃ／Ｌｃｒ蛋白が、Yersinia細胞エン
ベロープをつなぐ分泌チャンネルを構成していると推定されている。分泌機構に
含まれているこれらの要素の外に、ｐＹＶプラスミドは、分泌された基質であっ
てビルレンスの実際のエフェクターとして出現するＹｏｐｓ蛋白をコードしてい
る。
【０００４】 異なる種に起源を有するIII型分泌系の比較研究は、この分泌機構の構成成分
が保存されていることを示している（Gygi等、1995；Bogdanove等、1996）。加
えて、鞭毛の組み立てに参加する決定因子中に相同体が発見され、この事は、こ
の分泌経路が表面小器官の生合成に関わっているかも知れないことを示している
（Ramakrishnan等、1991）。
【０００５】 ところが、これに対して、分泌された基質は少数の例を除いて類似性を持たな
い。故に、棄却されたそれぞれの疾病に対応する別個の分子機序の概念が、エフ
ェクター蛋白のレベルで再浮上してくる。
【０００６】 病原性島 細菌のビルレンスの分野で、病原性島が新規なテーマとして浮上してきた。こ
れらはIII型分泌系を含み得るが、これのみという訳ではない。
【０００７】 ビルレンス遺伝子探索の初期において、これらの遺伝子の多くがプラスミド上
に存在するということが観察された。ところが、多数のビルレンス遺伝子が染色
体上にも見出された。驚くべき事に、染色体ビルレンス遺伝子もまた、しばしば
密集して機能的に関連した群となっている。このようなビルレンス遺伝子の群は
、ビルレンス遺伝子を有する稠密で明瞭な遺伝的単位として定義できる、病原性
島（Ｐａｉ）の概念を生じさせた。しばしば直列反復が隣接しているこれらの単
位は、大きな染色体領域（しばしば＞３０kb）を占有しており、病原性菌株には
存在しているが、或る細菌種の、より病原性の低い（または非病原性の）菌株に
は存在しないか、または散発的に分布している。これらのＤＮＡセグメントは、
頻繁に、それらの境界にあるｔＲＮＡ遺伝子および／または挿入配列（ＩＳ）要
素に付随している。さらに、それらのＧ＋Ｃ含有量は宿主細菌ＤＮＡのそれとは
しばしば相違しており、外来起源であることを示唆している。
【０００８】 病原性島は、E.coli、Salmonella typhimurium、Yersinia spp、Helicobacter
pylori、Vibrio cholera等の異なる範疇を包含する細菌病原体で発見されてお
り、その数は増加しつつある。
【０００９】 最初に詳細に研究された病原性島は、尿路病原性E.coliの溶血素決定因子をコ
ードしているＰａｉ ＩおよびＰａｉ IIであった。これら二つのＰａｉは、直列
反復が隣接しており、１０-4の頻度で染色体から除去され、その結果、非毒性突
然変異菌株が生ずる。もう一つの３５kbの病原性島は腸管病原性E.coli（ＥＰＥ
Ｃ）の染色体上に最近同定され、いわゆる「付着および消去」（ＡＥ）病変の形
成に関与する既知の全決定因子をコードしていることが見出された。よってこの
領域は「腸細胞消去の座」（ＬＥＥ）と呼ばれた。尿路病原性および腸管病原性
E.coliが全く異なった感染性疾患を惹起するという事実にも拘わらず、尿路病原
性菌株のＰａｉおよびＥＰＥＣのＬＥＥ座は、E.coli染色体中の厳密に同一の位
置に挿入される。
【００１０】 染色体上の位置を必ず含んでいる病原性島の定義を支持している著者もあれば
、染色体、プラスミドまたはファージ内におけるそれらの位置に関わりなく、そ
の概念をビルレンス遺伝子のまとまりへと拡張している著者もある。一方でファ
ージおよびプラスミドは容易に染色体中に挿入でき且つそこから切り取ることが
でき、他方ではプラスミドの隠れた複製起点、またはファージ関連配列がＰａｉ
で検出されたという事実は、後者の、そしてより限定性の低い定義を推し進めた
。
【００１１】 III型分泌系をコードしている病原性島（ＰＡＩ）は、二つのクラス、Ｉおよ
びIIに分けられる遺伝子を包含している。クラスＩは、分泌機構構成成分および
それらの発現調節因子をコードしている遺伝子を包含し、クラスIIは、分泌され
るエフェクター蛋白をコードしている遺伝子を包含している。Yersinia lcrDお
よびyscUは共にクラスＩに属している。クラスＩ決定因子の正確な機能はよくわ
かっていない。クラスＩおよびクラスII成分を明確に識別するのは時に容易では
ないが、クラスＩの遺伝子は多くの異なる種に存在するものとして同定でき、こ
れら各々の遺伝子配列の比較は、等価の遺伝子がかなりの（yscI、yscO）または
高レベルの（lcrD、yscU、yscN）配列類似性を有することを示している（Hueck
、1998）。 二番目のクラスの遺伝子（クラスII）は、transloconにより分泌される基質を構
成する蛋白をコードしている。これらの蛋白はビルレンスの実際のエフェクター
として出現し、標的蛋白、ビルレンスエフェクター蛋白、または単にエフェクタ
ーと呼ばれる。クラスＩ遺伝子産物で一般的な状況とは対照的に、このエフェク
ターは種間の類似性が全く無いか、極めて弱い。エフェクター蛋白は、最良の生
物学的ワクチンおよび診断可能性を示すものである。 本発明者等は、１個の病原性島内部のクラスＩおよびクラスII遺伝子の集合体は
、数多くのオーソロガス遺伝子のうち１個のわかっている配列を用いて同定でき
るクラスＩ遺伝子を標的化することにより、未知のクラスII遺伝子を簡便に発見
しそして特性決定する機会を提供することを発見した。
【００１２】 Bordetella pertussis 百日咳はBordetella pertussisによる感染によって引き起こされる疾病であり
、特に幼い子供にとって重大且つ消耗性の疾病である。この疾病に有効な全細胞
および無細胞ワクチンが入手できるものの、より有効な百日咳ワクチンに使用で
きる、さらに高度精製された百日咳蛋白の同定の必要性が依然として存在する。
【００１３】 百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、pertactin、といった多くの百日咳ビルレ
ンス関連因子が知られており、それらは様々な無細胞ワクチンに含まれているが
、百日咳ゲノムを使用するさらなるビルレンス因子同定のための簡便な遺伝学的
方法は無い（全ゲノムを苦労して配列決定せずに）。クラスＩのIII型分泌系ビ
ルレンス遺伝子がB.bronchisepticaおよびB.pertussisに存在していることが最
近示された（Yuk等、1998）が、Bordetellaの病原性島の完全な分析はなされて
おらず、係る病原性島内部のエフェクター遺伝子の実体および特性決定は、本発
明に至るまで知られていなかった。
【００１４】 発明の要約 一つの態様において、本発明は、III型分泌系を含む細菌菌株中の新たなビル
レンス遺伝子を同定する方法に関するものである。特に本発明は、III型分泌系
のための遺伝子を含む病原性島内部に付随しているエフェクタービルレンス遺伝
子の同定を可能にする。本発明の別の態様は、III型分泌系を含む病原性細菌菌
株の同定のための方法である。本発明のもう一つの態様は、Bordetella pertuss
is ＢｏｐＮ、Ｏｒｆ１、Ｏｒｆ２、Ｏｒｆ３、Ｏｒｆ４、Ｏｒｆ５、Ｏｒｆ６
、Ｏｒｆ７、Ｏｒｆ８、Ｏｒｆ９、Ｏｒｆ１０、Ｏｒｆ１１、Ｏｒｆ１２、Ｏｒ
ｆ１３、Ｏｒｆ１４、Ｏｒｆ１５エフェクター蛋白、およびこれらをコードして
いるそれぞれのポリヌクレオチド配列に関するものである。
【００１５】 III型分泌系および病原性島の総体的概念は報告されているが、与えられた生
物が係る細胞機構を持っているかどうかを如何に簡単且つ確かに同定するかとい
う問題は、現在まで達成されていなかった。このような方法は、与えられた菌株
が病原性島内部にIII型分泌系を持っているかどうかを立証し、病原性島内部の
未知のビルレンス遺伝子を特性決定し、そして培養されたIII型分泌系を含む細
菌菌株が病原性であるかどうかを決定するための迅速診断法への使用に、極めて
有用である。
【００１６】 本発明において、上記の目的を達成するための新規な一般法を記載する。より
詳細には、本発明は、標的配列としてのビルレントなYersinia enterocolitica
lcrD遺伝子の配列から特異的に設計された、理想的に適合したプライマーを使用
する方法を利用するものである。Bordetella pertussisの病原性島内部のIII型
分泌系の存在が発見され、この病原性島内部の全遺伝子が特性決定された。
【００１７】 発明の説明 現在までに同定されているIII型分泌系は、染色体またはプラスミドいずれか
の病原性島遺伝子によってコードされている。しかしながら、III型分泌系のク
ラスＩ構成成分をコードしている遺伝子の保存と、エフェクター蛋白コード化配
列を伴うこれらの遺伝子の集団とが、宿主集落に含まれる未同定の標的蛋白を検
出する機会を提供するという事は、いかなる先行技術においても理解されていな
かった。このような蛋白は、ワクチンおよび診断分野の両方において価値がある
可能性がある。
【００１８】 任意の保存された（クラスＩ）III型分泌機構蛋白をコードしている遺伝子の
既知の配列を本発明の実施に使用することができるが、ｌｃｒＤ遺伝子が好まし
い。選択された遺伝子は関連細菌種中の未同定の病原性島を検出するための標的
として挙動するであろう。Yersinia由来のｌｃｒＤ遺伝子は、最近同定されたＬ
ｃｒＤ／ＦｌｂＦファミリーの蛋白の原型をコードしていることから、これが好
ましい。このファミリーの成員は、宿主細胞侵入、幾つかの植物病原性細菌にお
けるビルレンスまたは鞭毛の組み立てに関与している。ＬｃｒＤ蛋白と、したが
ってそれをコードしている遺伝子とが、分泌機構のうち最もよく保存されている
決定因子の一つであるため、ｌｃｒＤが好ましい。さらに、複数のアミノ酸を比
較したところ、ＬｃｒＤファミリー成員の分類は二つの主要なサブファミリーに
分けることができ、興味深いことにこれは、各サブファミリー中のこれら蛋白に
割り当てられた機能と相関し得る。或るサブファミリーは運動性に関与する蛋白
を全て包含し、別のサブファミリーはビルレンス関連決定因子の全てを包含して
いる。この知見は図２に例示する（そしてGyri等(1995)およびBogdanove等(1996
)に記載されている）。したがって、未知のｌｃｒＤホモローガス遺伝子が同定
されたならば、これを常套的に配列決定した後、ビルレンスまたは鞭毛遺伝子と
して分類することができる。故に、いったん病原性島が同定されたならば、この
簡単な試験が、この病原性島での別のビルレンス遺伝子の探索を開始すべきかど
うかを決定するであろう。
【００１９】 III型分泌系を含む未知の病原性島を同定するための好ましい方法は、以下に
よるものである。
【００２０】 ｉ）（好ましくはＬｃｒＤの）標的蛋白配列の高度に保存された領域を２個同
定する。好ましくは、いずれの領域も、最もコドン可能性が低いコドンによりコ
ードされている保存アミノ酸、例えばメチオニン（ＡＴＧが唯一の可能性である
）またはトリプトファン（ＴＧＧが唯一の可能性である）を含んでいなければな
らない。この事により、プロセスの次の段階で設計される両方の縮重プライマー
組での順列の数を最小とすることができ、したがって各プライマーの組が未知の
ｌｃｒＤ相当遺伝子と特異的にアニーリングする可能性を確実に高めることがで
きる（それによりバックグラウンドの非特異的相互作用を最小にすることができ
る）。最も好ましくは、さらに、鞭毛を有する全ての細菌種に存在するパラロー
グｆｌｈＡ鞭毛遺伝子と明確に識別可能な領域を選択すべきである。
【００２１】 ii) 選択された両方の領域のための縮重したプライマー組を設計し、その結果
、ａ）このプライマーが少なくとも１５塩基長、好ましくは２０−３０塩基長、
さらに好ましくは２１−２３塩基長であり、ｂ）それらは１以上の型のヌクレオ
チドであり得る塩基位置で縮重しており［但し、依然として同一アミノ酸をコー
ドしている（アミノ酸に対するコドン使用の縮重のため）］、それでいて、選択
されたアミノ酸領域に対する全順列を包含するのに必要であるほどには縮重して
おらず、そして、ｃ）選択された蛋白のより多くのＮ末端領域をコードしている
プライマー組は、対応する二本鎖ＤＮＡ配列のコード化鎖に対応し、より多くの
Ｃ末端領域をコードしている組は、対応する二本鎖ＤＮＡ配列の相補鎖に対応し
ている、ようにする。
【００２２】 iii) 当分野でよく知られる常套的ＤＮＡ合成法を用いて、工程ii）の縮重プ
ライマーの組を合成する。
【００２３】 iv) 工程iii)のプライマー組を精製する。
【００２４】 v) ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するため、当該プライマー組およ
び細菌菌株由来の核酸を含有する試料（好ましくはその細菌種自身の細胞試料）
を共に適当な量で適当な緩衝液に加える。
【００２５】 vi) 二つのプライマー間の遺伝子領域を増幅するため、ＰＣＲ反応を実施する
（このＰＣＲ反応を実施する条件は当分野で周知の技術を用いて最適化すること
ができる）。
【００２６】 vii) 予想される大きさの増幅生成物についてゲル上で反応生成物を観察し；
係る生成物が存在しない場合は、その細菌菌株はIII型分泌系を使用していない
と思われ；係る生成物が存在する場合は、その細菌菌株はIII型分泌系を有し、
病原性であると思われる。
【００２７】 増幅された生成物が実際にビルレンス遺伝子に対応することを確認するための
好ましい方法は、上記ｉ)−vii)の工程を実施し（ここで、標的蛋白はＬｃｒＤ
である）、次いで viii) 所望により、ゲルから正しいバンドを取ることにより、正しい大きさの
生成物を誤った大きさのバックグラウンド生成物から分離し、該生成物を常套手
段により精製し、そして該生成物を再度別のＰＣＲ反応（好ましくは、より緊縮
したＰＣＲ条件下で）で２個の縮重プライマー組を用いて増幅し（万一工程vii
）の生成物が直接クローニングできるほど純粋でないならば、この工程が必要と
なる）、 ix) このＤＮＡフラグメントを常套手段により、配列決定可能なベクター内に
挿入し、このフラグメントを配列決定し、 x) ix)の推定アミノ酸配列をＬｃｒＤ／ＦｌｂＦファミリーの蛋白の既知の成
員と比較して、増幅された生成物をビルレンスまたは鞭毛遺伝子のいずれかの一
部であると関連づける、 ことによる。
【００２８】 そして所望により、 xi) 該フラグメントの内部配列を使用して、未知のｌｃｒＤ相当遺伝子の正確
な配列であり、且つこれに特異的なプライマーを設計し、 xii) xi)のプライマーを最初に使用して、その生物のゲノムライブラリーを陽
性クローンについてスクリーニングし、 xiii) xii)のクローンを単離し、１またはそれ以上の該クローンを配列決定し
、 xiv) １個のクローンの配列（および他のクローンの一部重複配列）をスキャ
ンして、ｌｃｒＤ（およそ２１００bp）とほぼ同じ大きさであり、且つＬｃｒＤ
とホモローガスな蛋白をコードしているオープンリーディングフレームを探索し
、 xv) ＬｃｒＤ相当蛋白がｆｌｂＦ（鞭毛蛋白分泌）遺伝子ファミリーまたはｌ
ｃｒＤ（III型分泌系の病原性島）遺伝子ファミリーに、よりホモローガスであ
るかどうかを確認する、 ことによる。
【００２９】 病原性島全体を特性決定し、未同定のビルレンスエフェクター遺伝子を定義す
る好ましい方法は、上記ｉ)−xv)の工程を実施し（ここで、標的蛋白はＬｃｒＤ
である）、次いで、 xvi) 該配列がｌｃｒＤ遺伝子ファミリーについて、よりホモローガスである
場合は、既に確定したこの遺伝子配列の両端のプライマーを設計し、そしてゲノ
ムライブラリーをスキャンおよび配列決定し（標準的染色体歩行法を使用 − こ
こで、元のクローンの挿入物境界が、隣接領域のスクリーニングおよびクローニ
ングのためのプローブとしての役割を有する）、最終的に病原性島全体を配列決
定し（その両方の境界は、直列反復もしくは逆方向反復、または挿入配列の存在
、またはハウスキーピング遺伝子の存在によって規定されるであろう）、 xvii) 配列決定した病原性島内部の未同定ビルレンスエフェクター遺伝子を規
定し、 xviii) 当該生物のビルレンスエフェクター蛋白をコードしている xvii)のビルレンス遺伝子をクローニングし、発現させ、そして特性決定する、
ことによる。
【００３０】 定義 「Bordetella病原性蛋白」とは、一般に、第２表および第３表に定義される遺
伝子、またはそのアレレ変異体によってコードされているアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを指す。これらの蛋白は、ＢｃｒＤ、ＢｃｒＨ、ＢｓｃＣ、Ｂｓｃ
Ｄ、ＢｓｃＥ、ＢｓｃＦ、ＢｓｃＩ、ＢｓｃＪ、ＢｓｃＫ、ＢｓｃＬ、ＢｓｃＮ
、ＢｓｃＯ、ＢｓｃＰ、ＢｓｃＱ、ＢｓｃＲ、ＢｓｃＳ、ＢｓｃＴ、ＢｓｃＵ、
ＢｓｃＶ、ＢｒｐＬ、ＢｏｐＮ、Ｏｒｆ１、Ｏｒｆ２、Ｏｒｆ３、Ｏｒｆ４、Ｏ
ｒｆ５、Ｏｒｆ６、Ｏｒｆ７、Ｏｒｆ８、Ｏｒｆ９、Ｏｒｆ１０、Ｏｒｆ１１、
Ｏｒｆ１２、Ｏｒｆ１３、Ｏｒｆ１４、Ｏｒｆ１５である。
【００３１】 「Bordetella病原性遺伝子」とは、第２表および第３表に定義されるヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチド、またはそのアレレ変異体および／またはそ
れらの相補物を指す。これらの遺伝子は、ｂｃｒＤ、ｂｃｒＨ、ｂｓｃＣ、ｂｓ
ｃＤ、ｂｓｃＥ、ｂｓｃＦ、ｂｓｃＩ、ｂｓｃＪ、ｂｓｃＫ、ｂｓｃＬ、ｂｓｃ
Ｎ、ｂｓｃＯ、ｂｓｃＰ、ｂｓｃＱ、ｂｓｃＲ、ｂｓｃＳ、ｂｓｃＴ、ｂｓｃＵ
、ｂｓｃＶ、ｂｒｐＬ、ｂｏｐＮ、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、
ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１
、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５である。
【００３２】 「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって
互いに結合した２またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋白、
即ちペプチドアイソスターを指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチドと呼
称される短鎖、オリゴペプチドまたはオリゴマー、および一般に蛋白と呼称され
る、より長い鎖を指す。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされる２０のアミ
ノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシ
ングのような天然のプロセスによって、または当分野でよく知られる化学的修飾
技術によって修飾されたアミノ酸配列を包含する。このような修飾は、基礎的教
科書に、そしてより詳細なモノグラフに、そして大部の研究文献に詳細に記載さ
れている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカ
ルボキシ末端を包含するポリペプチドの任意の場所に起こり得る。同じ型の修飾
が、与えられたポリペプチドの幾つかの部位に、同一または異なる程度で存在す
るかも知れない。さらに、与えられたポリペプチドは多くの型の修飾を含むかも
知れない。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果分枝しているかも知れず、そし
て分枝してまたは分枝せずに環状であるかも知れない。環状、分枝および分枝環
状ポリペプチドは翻訳後の天然プロセスによって生じ、または合成法によって製
造され得る。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フ
ラビンの共有結合、ヘム基の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体
の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共
有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架
橋の形成、シスチンの形成、ピログルタマートの形成、ホルミル化、ガンマカル
ボキシ化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシ化、沃素化、メチ
ル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解プロセシング、燐酸化、プレニル化、ラ
セミ化、セレノイル化、硫酸化、蛋白へのトランスファーＲＮＡにより仲介され
るアミノ酸付加、例えばアルギニル化およびユビキチン化を包含する。例えば、
「蛋白 − 構造および分子の性質」、第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and
Company、ニューヨーク、1993および「蛋白の翻訳後共有結合的修飾」、B.C.Jo
hnson編、Academic Press、ニューヨーク、1983の1-12頁、Wold,F.、翻訳後蛋白
修飾：展望および予想；Seifter等、「蛋白修飾および非蛋白補助因子の分析」
、Meth Enzymol(1990)182:626-646およびRattan等、「蛋白合成：翻訳後修飾お
よび加齢」、Ann.NY Acad Sci(1992)663:48-62を参照されたい。
【００３３】 「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドを指し、それは非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾
されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖お
よび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖およ
び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本
鎖、または、より典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物で
あってよいRＮＡおよびDＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、これらに限
定される訳ではない。加えて、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮ
ＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両者を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチド
という語はまた、１またはそれ以上の修飾された塩基を含むＤＮＡもしくはＲＮ
Ａ、および、安定性またはその他の理由でバックボーンが修飾されたＤＮＡまた
はＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基とは、例えばトリチル化された塩基お
よび普通でないイノシンのような塩基を包含する。様々な修飾がＤＮＡおよびＲ
ＮＡに施され、したがって「ポリヌクレオチド」は、自然界に典型的に見出され
るようなポリヌクレオチドの、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された型、
ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な型を包含
する。さらに「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼称され
る、比較的短いポリヌクレオチドをも包含する。
【００３４】 本明細書中使用する「変異体」とは、レファレンスポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの各々と相違してはいるが、本質的な性質を保持しているポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドである。或るポリヌクレオチドの典型的な変異体は、
別の、レファレンスポリペプチドとヌクレオチド配列が異なっている。変異体の
ヌクレオチド配列の変化は、レファレンスポリヌクレオチドによりコードされて
いるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることもあるし変化させないことも
ある。以下に記載するように、ヌクレオチドの変化は、レファレンス配列により
コードされているポリペプチドに、アミノ酸の置換、付加、除去、融合および末
端切除を招き得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、別のレファレンスポリペ
プチドとアミノ酸配列が異なっている。一般に、相違は限定されており、その結
果、レファレンスポリペプチドおよび変異体の配列は全体として極めて似通って
おり、多くの領域で一致している。変異体およびレファレンスポリペプチドは、
１またはそれ以上の置換（好ましくは同類の）、付加、除去の任意の組み合わせ
によってアミノ酸配列が相違しているかも知れない。置換されたまたは挿入され
たアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされているものであるかも知れない
し、そうでないかも知れない。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は
、アレレ変異体のような自然界に存在し得るものであるかも知れず、または自然
に起こることが知られていないものであるかも知れない。ポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドの自然界に存在しない変異体は、突然変異誘発技術または直接合
成によって製造できる。変異体は、レファレンスポリペプチドの１またはそれ以
上の生物活性を保持していなければならない。例えば、それらはレファレンスポ
リペプチドと類似の（好ましくは同一の）抗原活性または免疫原活性を持ってい
なければならない。抗原性は、好ましくはレファレンスポリペプチドに対するポ
リクローナル血清を使用して、標準的免疫ブロット実験を用いて試験することが
できる。免疫原性は、標準ＥＬＩＳＡ試験で精製レファレンスポリペプチドに対
する抗体反応を測定（変異体ポリペプチドに対して作製されたポリクローナル血
清を使用する）することによって最も良好に試験できる。好ましくは、変異体は
上記の生物活性を全て保持している。
【００３５】 「一致」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の一致の尺度である。一
般に、配列は、最高度の合致が得られるように並べる。「一致」自体は当分野で
認められた意義を有し、公表されている技術を用いて算出することができる。例
えば、（コンピューターによる分子生物学、Lesk,A.M.編、Oxford University P
ress、ニューヨーク、1988；生物学的コンピューター計算：情報科学およびゲノ
ムプロジェクト、Smith,D.W.編、Academic Press、ニューヨーク、1993；配列デ
ータのコンピューター分析、第１部、Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Huma
na Press、ニュージャージー、1994；分子生物学における配列分析、von Heijne
.G.、Academic Press、1987；および配列分析プライマー、Gribskov,M.およびDe
vereux,J.編、M.Stockton Press、ニューヨーク、1991）を参照されたい。二つ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一致を測定するための方法は幾つ
か存在するが、「一致」という語は当業者によく知られている（Carillo,H.およ
びLipton,D.、SIAM J Applied Math(1988)48:1073）。二つの配列の一致または
類似性を決定するために一般的に使用される方法は、Guide to Huge Computers
、Martin J.Bishop編、Academic Press、サンディエゴ、1994、およびCarillo,H
およびLipton,D.、SIAM J Applied Math(1988)48:1073に開示されているが、こ
れらに限定される訳ではない。一致および類似性を決定する方法はコンピュータ
ープログラムに体系化されている。二つの配列の一致および類似性を決定するた
めの好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（De
vereux,J.等、Nucleic Acids Research(1984)12(1):387）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬ
ＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul,S.F.等、J Molec Biol(1990)215:403）を包含
するが、これらに限定されない。最も好ましくは、一致のレベルを決定するため
に用いられるプログラムは、以下の実施例に使用されたＧＣＧ９パッケージであ
った。
【００３６】 例として、レファレンスヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば９５％
の「一致」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、当該ポリ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列が、そのポリヌクレオチド配列がレファレンス
ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり平均５個までの点突然変異を含ん
でいる以外は、レファレンス配列と一致していることを意図している。換言する
と、レファレンスヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％一致のヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、レファレンス配列のヌクレオ
チドの５％までを除去または別のヌクレオチドに置換し、またはレファレンス配
列の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドをそのレファレンス配列中に
挿入すればよい。レファレンス配列のこれらの突然変異は、レファレンスヌクレ
オチド配列の５’または３’末端位置に、またはこれら末端位置の間の任意の場
所に、レファレンス配列のヌクレオチド間に１個１個散在して、またはレファレ
ンス配列内での１またはそれ以上の連続した群で存在していてよい。 本発明のポリペプチド 一態様において本発明は、百日咳病原性タンパク質（またはポリペプチド）に
関する。この百日咳病原性ポリペプチドには、表２および３において定義した遺
伝子により符号化されたポリペプチドならびに表２および３において定義した遺
伝子により符号化されたアミノ酸配列を具備するポリペプチド、およびそれらの
長さ全体にわたって表２および３において定義した遺伝子により符号化されたア
ミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する、好ましくは少なくとも８０％
の同一性を有する、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸
配列を具備するポリペプチドが含まれる。高度に好ましくは９５〜９９％の同一
性を有するものである。
【００３７】 百日咳病原性ポリペプチド（またはその断片）は「成熟」タンパク質の形態で
あってもよく、融合タンパク質などの大きなタンパク質の一部であってもよい。
分泌もしくは先導配列、副配列、多重ヒスチジン残基など精製の助けとなる配列
、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＴ）を含む追加のアミノ酸配列、ある
いは組換え産生の間安定であるための追加の配列を具備することが有利である。
さらに最終分子の免疫原性潜在能力を向上させるために、外因性のポリペプチド
もしくは脂質の尾部、またはポリヌクレオチド配列を付加することもまた考えら
れる。
【００３８】 百日咳病原性ポリペプチドの断片もまた本発明に含まれる。断片は前述の百日
咳病原性ポリペプチドのアミノ酸配列と全体ではなく一部が同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドである。百日咳病原性ポリペプチドと同様に、断片は「そ
れ自体の自律構造で成り立って」いてもよく、あるいは断片がその部分または領
域を形成するより大きなポリペプチド内に、最も好ましくは単一の連続領域とし
て含まれていてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例には、例えば百
日咳病原性ポリペプチドのアミノ酸数が約１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、
６１〜８０、８１〜１００、および１０１〜端部までの断片が含まれる。この文
脈において「約」には、片側末端または両末端で数個、５個、４個、３個、２個
、または１個だけ多いかまたは少ない個別に再度引用される範囲が含まれる。断
片は、その配列由来の少なくとも７個（例えば８、１０、１２、１４、１８、２
０、もしくはそれ以上であり個別の配列に左右される）の連続したアミノ酸を含
むべきである。好ましくは、断片はその配列由来のエピトープを含んでいる。
【００３９】 好ましい断片には、例えばアミノ末端を含む連続した直列の残基またはカルボ
キシル末端および／またはトランスメンブレン領域を含む連続した直列の残基の
欠失、あるいは一方がアミノ末端を含み一方がカルボキシル末端を含む二つの連
続した直列の残基の欠失があることを除いて百日咳病原性ポリペプチドのアミノ
酸配列を有する端を切り取ったポリペプチドがある。また好ましくは断片は、α
ヘリックスおよびαヘリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、回
転および回転形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域
、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可動領域、表面形成領域、基質結合領域、
および高抗原性指標領域を具備する断片などの構造的または機能的属性により特
徴づけられる。他の好ましい断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活
性な断片は百日咳病原性タンパク質の活性を仲介する断片であり、類似の活性も
しくは改良された活性をもつもの、または望ましくない活性を低減したものが含
まれる。また動物、特にヒト中で抗原性もしくは免疫原性をもつものが含まれる
。
【００４０】 好ましくはこれらポリペプチド断片は全て、抗原活性を含む百日咳病原性タン
パク質の生物学的活性（例えば抗原性もしくは免疫原性）を保持している。定義
された配列および断片の変異型もまた本発明の一部を形成する。好ましい変異型
は、保存的アミノ酸置換による指示物とは異なるもの、すなわち残基を似た特性
をもつ別の残基で置換するものである。典型的なこのような置換物は、Ａｌａ、
Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中の１つ；ＳｅｒおよびＴｈｒの中の１つ；酸
性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの中の１つ；ＡｓｎおよびＧｌｎの中の１つ；ならび
に塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの中の１つ；あるいは芳香族残基Ｐｈｅおよび
Ｔｙｒの中の１つである。特に好ましくは数個、５〜１０個、１〜５個、または
１〜２個のアミノ酸が、任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されている
変異型である。最も好ましい変異型は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓの株中に存在する百日咳病原性ポリペプチドの天然に産出する対立変異型で
ある。
【００４１】 このタンパク質は化学的にコンジュゲートされてもよく、あるいは非融合タン
パク質と比べて発現系中に産生される量を増加させる組換え融合タンパク質とし
て発現されてもよい。この融合の相手は、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒ
トにより認識されるＴヘルパーエピトープの供給を助ける（免疫学的融合パート
ナー）、または天然の組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質の発現を助
ける（発現エンハンサー）ことができる。好ましくはこの融合の相手は、免疫学
的融合パートナーと発現増進パートナーの両者であることになる。
【００４２】 本発明の百日咳病原性ポリペプチドは任意の適切な方法で調製することができ
る。このようなポリペプチドには単離した天然に産出するポリペプチド、組換え
により産生したポリペプチド、合成により産生したポリペプチド、またはこれら
の方法の組み合わせにより産生したポリペプチドが含まれる。このようなポリペ
プチドの調製手段は当業界でよく知られている。
【００４３】 本発明のポリペプチドは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓから誘
導するのが最も好ましいが、同じ系統の属の他の生物体から得ることもできる。
本発明のポリペプチドはまた、例えばＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓまたはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａなどの
同じ系統の科または目の生物体から得ることもできる。
【００４４】 本発明の更なる態様は、ほぼ純化された本発明の百日咳病原性ポリペプチドで
ある。タンパク質またはペプチドに関して用いられる場合の「ほぼ純化された」
とは、分子が他の細胞または非細胞成分から必ずしも全部ではなないとしても大
部分分離され、精製されたことを意味する。一般にタンパク質は、それが他の天
然に産出する有機分子を少なくとも約６０重量％含まない場合にほぼ純粋である
。純度は好ましくは少なくとも約７５重量％、より好ましくは少なくとも約９０
重量％、最も好ましくは少なくとも約９９重量％である。 本発明のポリヌクレオチド： 本発明の別の態様は、百日咳病原性ポリヌクレオチドに関する。百日咳病原性
ポリヌクレオチドには百日咳病原性ポリペプチドおよび断片をそれぞれ符号化す
る単離されたポリヌクレオチド、ならびにそれと密接に関連するポリヌクレオチ
ドまたはその変異型が含まれる。より詳細には本発明の百日咳病原性ポリヌクレ
オチドには、百日咳病原性ポリペプチドを符号化する、表２または３において定
義した遺伝子のヌクレオチド配列を具備するポリヌクレオチドが含まれる。百日
咳病原性ポリヌクレオチドにはさらに、表２および３において定義した遺伝子に
より符号化された百日咳病原性ポリペプチドを符号化するヌクレオチド配列とそ
の長さ全体にわたって少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を具
備するポリヌクレオチド、ならびに表２または３において定義した遺伝子の配列
と少なくとも７５％同一のヌクレオチド配列を具備するポリヌクレオチドが含ま
れる。この点に関しては具体的には少なくとも８０％同一のポリヌクレオチドが
好ましく、少なくとも９０％のものが特に好ましい。さらに少なくとも９５％同
一のものが高度に好ましく、少なくとも９８〜９９％同一のものが最も高度に好
ましく、少なくとも９９％同一のものが最も好ましい。また、増幅に使用できる
条件下で雑種形成するために、あるいはプローブまたはマーカーとして使用する
ために、百日咳病原性ポリヌクレオチドの下には表２および３において定義した
遺伝子のヌクレオチド配列と十分な同一性を有するヌクレオチド配列が含まれる
。本発明はまた、このような百日咳病原性ポリヌクレオチドと相補的なポリヌク
レオチドを提供する。
【００４５】 特定の百日咳病原性遺伝子およびポリペプチドの配列などの本明細書で提供さ
れた情報を用いるならば、出発原料としてＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ細胞を使用して細菌から染色体ＤＮＡの断片をクローニングおよびシーク
エンシングするための方法など標準のクローニングおよびスクリーニング法を用
いて百日咳病原性ポリペプチドを符号化する本発明のポリヌクレオチドを得、続
いて普通長さのクローンを得ることができる。例えば本発明のポリヌクレオチド
配列を得るには、一般にＥ．ｃｏｌｉまたは幾つかの他の適切な宿主中で、Ｂｏ
ｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの染色体ＤＮＡのクローンのライブラリ
ーを部分配列由来の好ましくは１７−ｍｅｒ以上の放射能標識したオリゴヌクレ
オチドを用いて探査する。次いでプローブのＤＮＡと同一のＤＮＡを輸送するク
ローンを、ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件を用いて識別するこ
とができる。次いで、こうしてハイブリダイゼーションにより同定された個々の
クローンを、元のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列から設計されたシー
クエンシングプライマーを用いて配列決定することによって、両方向にポリヌク
レオチド配列を延長して普通長さの遺伝子配列を決定することができる。このよ
うなシークエンシングは、例えばプラスミドのクローンから調製された変性二重
鎖ＤＮＡを用いて行なうのが便利である。好適な手法がＭａｎｉａｔｉｓ．Ｔ．
、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ等によりＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ Ｅｄ
．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に
記載されている（具体的にはＳｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｂｙ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ １．９０およびＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ Ｄｏｕｂ
ｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ １３．７０を参照）。
直接ゲノムＤＮＡシークエンシングもまた普通長さの遺伝子配列を得るために実
施することができる。
【００４６】 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとは別の種由来の同族体およびオ
ルト体を含む、本発明のポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドは、緊縮雑
種形成条件下（例えば温度範囲４５〜６５℃およびＳＤＳ濃度０．１〜１％を用
いて）で適切なライブラリーを、表２または３において定義した配列またはその
断片からなるもしくは含む標識したまたは検出可能なプローブによりスクリーニ
ングするステップと、前記ポリヌクレオチド配列を包含する普通長さの遺伝子お
よび／またはゲノムクローンを単離するステップとを含むプロセスにより得るこ
とができる。
【００４７】 本発明はまた、表２および３において定義したポリヌクレオチド配列に対する
完全遺伝子を包含する適切なライブラリーを、緊縮雑種形成条件下で表２または
３において定義した前記ポリヌクレオチド配列またはその断片の配列を有するプ
ローブによりスクリーニングし、前記ポリヌクレオチド配列を単離することによ
り得られたポリヌクレオチド配列からなるもしくは含むポリヌクレオチドを提供
する。このようなポリヌクレオチドを得るのに役立つ断片には、例えば本明細書
の他の個所に記載されているプローブおよびプライマーがある。
【００４８】 表２および３において定義した遺伝子により符号化された百日咳病原性ポリペ
プチドを符号化するヌクレオチド配列は、表２または３において定義した遺伝子
中に包含された配列を符号化するポリペプチドと同一であってもよく、あるいは
また遺伝暗号の重複性（縮重）の結果として表２および３中でにおいてそれぞれ
定義される遺伝子により符号化されたポリペプチドを符号化する配列であっても
よい。
【００４９】 本発明のポリヌクレオチドを百日咳病原性ポリペプチドの組換え産生に用いる
場合、ポリヌクレオチドは単独で成熟ポリペプチドまたはその断片の解読配列を
含んでいてもよく、リーダーもしくは分泌配列、プレもしくはプロタンパク質ま
たはプレプロタンパク質、あるいは他の融合ペプチド部分を符号化するものなど
、解読配列をもつリーディングフレーム中の成熟ポリペプチドまたは断片の解読
配列を含んでいてもよい。例えば、融合したポリペプチドの精製を容易にするマ
ーカー配列を符号化することができる。本発明のこの態様の或る好ましい実施形
態において、マーカー配列はｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で提
供され、Ｇｅｎｔｚ等の論文、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
８６：８２１〜８２４（１９８９）に記載されているヘキサ‐ヒスチジンペプチ
ドであり、またはＨＡ標識であり、またはグルタチオン−ｓ−トランスフェラー
ゼであり、またはＭＢＰである。ポリヌクレオチドはまた、転写された非翻訳配
列などの非解読５′および３′配列、切り継ぎおよびポリアデニル化シグナル、
リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡを安定化する配列を含有してもよい。
【００５０】 また本発明の配列の断片を具備する核酸が提供される。これらはその配列（例
えば１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、もしくはそれ以
上で個々の配列に左右される）由来の少なくとも１０個の連続するヌクレオチド
を具備しなければならない。このような断片は好ましくは緊縮条件下で上述の配
列へ雑種形成することができる。
【００５１】 さらに好ましい実施形態は、数個、１０〜２５個、５〜１０個、１〜５個、１
〜３個、１〜２個、もしくは１個のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換され
、欠失され、または付加される、表２および３によりそれぞれ定義される遺伝子
により符号化された百日咳病原性ポリペプチドのアミノ酸配列を具備する百日咳
病原性タンパク質変異型を符号化するポリヌクレオチドである。最も好ましい変
異型ポリヌクレオチドは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ株、好ましくはＢ．Ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ中で百日咳病原性タンパク質の対立変異型を符号化する、これら天然に
産出するＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ配列である。
【００５２】 本発明はさらに、本明細書にさきに記載した配列へ雑種形成するポリヌクレオ
チドに関する。この点に関して本発明は、特に本明細書にさきに記載したポリヌ
クレオチドへ緊縮条件下で雑種形成するポリヌクレオチドに関する。本明細書で
用いる用語「緊縮条件」とは、雑種形成が配列の間で少なくとも８０％、好まし
くは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに一層好ましく
は少なくとも９７〜９９％の同一性を有する場合にのみ起こることを意味する。
【００５３】 表２および３の中で定義された任意の遺伝子のヌクレオチド配列またはその断
片と同一もしくは十分同一の本発明のポリヌクレオチドは、それぞれ百日咳病原
性ポリペプチドを符号化する普通長さのｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し
、百日咳病原性遺伝子と高度な配列類似性を有する他の遺伝子（Ｂｏｒｄｅｔｅ
ｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとは別の種由来の同族体およびオルト体を符号化す
る遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するためにｃＤＮＡお
よびゲノムＤＮＡ用の雑種形成プローブとして用いることができる。このような
雑種形成の手法は当業技術者には周知である。一般にこれらのヌクレオチド配列
は指示物の配列と８０％同一であり、好ましくは９０％同一であり、より好まし
くは９５％同一である。通常プローブは少なくとも１５個のヌクレオチドを具備
する。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３０個のヌクレオチドを有す
ることになり、少なくとも５０個のヌクレオチドを有してもよい。特に好ましい
プローブは、３０個と５０個の間の範囲のヌクレオチドである。一実施形態にお
いて、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓとは別の種由来の同族体およ
びオルト体を含む百日咳病原性ポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドを得
ることには、表２および３により定義された遺伝子配列の一つに包含されたヌク
レオチド配列またはその断片を有する標識したプローブにより緊縮雑種形成条件
下で適切なライブラリーをスクリーニングするステップと、前記ポリヌクレオチ
ド配列を包含する普通長さのｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するステップ
とが含まれる。したがって別の態様において、本発明の百日咳病原性ポリヌクレ
オチドはさらに、表２および３により定義された遺伝子中に包含されたヌクレオ
チド配列またはその断片を有するヌクレオチド配列へ緊縮条件下で雑種形成する
ヌクレオチド配列を具備するヌクレオチド配列を含む。また百日咳病原性ポリペ
プチドには、上記雑種形成条件により得られたヌクレオチド配列により符号化さ
れたアミノ酸配列を具備するポリペプチドが含まれる。このような雑種形成の手
法は当業技術者にはよく知られている。緊縮雑種形成条件は上記のように規定す
るか、あるいは別法の条件は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａ
Ｃｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および変性し、せん断を
与えたサケの精液のＤＮＡ２０μｇ／ｍｌを含む溶液中で４２℃で夜通しインキ
ュベーションを行ない、続いて約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でフィルターの洗浄
を行なう。
【００５４】 百日咳病原性遺伝子の解読領域を表２または３において定義したＤＮＡ配列を
用いてスクリーニングすることにより単離し、オリゴヌクレオチドのプローブを
合成することができる。次いで本発明の遺伝子の配列と相補的な配列を有する標
識したオリゴヌクレオチドは、そのプローブがライブラリーのどのメンバーへ雑
種形成するかを決定するためにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡのライ
ブラリーをスクリーニングするのに用いられる。
【００５５】 普通長さのＤＮＡを得るためには、または短尺のＤＮＡを延長するためには幾
つかの利用可能な方法があって当業技術者によく知られており、例えばｃＤＮＡ
末端の急速増幅法（ＲＡＣＥ）に基づくものがある（例えばＦｒｏｈｍａｎ等の
論文、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８〜９００２，１９８８を参照）。例え
ばＭａｒａｔｈｏｎ（登録商標）の技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって例示されるこの手法の最近の改良は、より長尺の
ｃＤＮＡの探索を著しく容易にした。Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）の技術にお
いてｃＤＮＡは、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡおよび各末端に結合し
た「アダプター」配列から調製される。次いで核酸の増幅（ＰＣＲ）が、ＤＮＡ
の「欠けている」５′末端を増幅するために遺伝子特異的およびアダプター特異
的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて行なわれる。次いでＰＣ
Ｒの反応が「入れ子型」プライマー、すなわち増幅された生成物（一般にはアダ
プター配列中でさらに３′をアニールするアダプター特異的プライマーおよび選
択された遺伝子配列中でさらに５′をアニールする遺伝子特異的プライマー）の
中でアニールするように設計されたプライマーを用いて繰り返される。次いでこ
の反応の生成物はＤＮＡシークエンシングにより分析することができ、普通長さ
のＤＮＡが生成物を存在しているＤＮＡに直接結合して完全な配列を得るか、ま
たは５′プライマー設計用の新しい配列情報を用いて別個の普通長さのＰＣＲを
遂行するかのいずれかにより構築される。
【００５６】 表２または３において定義した配列から引き出されたオリゴヌクレオチドであ
る本発明のポリヌクレオチドは、記述したように本明細書のプロセスで用いるこ
とができるが、好ましくは本明細書で全体または一部が同定されているポリヌク
レオチドが感染した組織中で細菌に転写されたかどうかを判定するためにＰＣＲ
用に使用される。このような配列はまた、病原体が達した感染の段階および感染
の種類の診断に有益であることが認められる。
【００５７】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒトの病の治療
法および診断法を発見するための研究試薬および材料として使用することができ
る。 診断検定法： 本発明はまた、診断用試薬として用いられる百日咳病原性ポリペプチドおよび
百日咳病原性ポリヌクレオチドの使用法に関する。百日咳病原性ポリペプチドの
検出は、なかでもＢ．Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによる病の診断に加えることができる
、またはそれを特定することができる診断のツールを提供するはずである。
【００５８】 診断用材料は血液、尿、唾液、生検材料由来のものなど被験者の細胞から得る
ことができる。
【００５９】 したがって別の態様において本発明は、病または病の疑い、特にＢ．Ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓによる病の診断用キットに関するもので、 （ａ）百日咳病原性ポリヌクレオチド、好ましくは表２および３により定義され
た遺伝子配列の一つまたはその断片のヌクレオチド配列、 （ｂ）（ａ）の配列と相補的なヌクレオチド配列、 （ｃ）百日咳病原性ポリペプチド、好ましくは表２および３において定義した遺
伝子配列の一つまたはその断片により符号化されたポリペプチド、 （ｄ）百日咳病原性ポリペプチドに対する抗体、好ましくは表２および３におい
て定義した遺伝子配列の一つにより符号化されたポリペプチドに対する抗体、ま
たは （ｅ）百日咳病原性ポリペプチドに対する抗体を表示するファージ、好ましくは
表２および３において定義した遺伝子配列の一つにより符号化されたポリペプチ
ドに対する抗体を表示するファージ、を含む。
【００６０】 任意のこのようなキットにおいて（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（
ｅ）が実質的な成分を構成することが理解されよう。
【００６１】 予後、診断、または他の分析用のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、感
染したと思われるおよび／または感染した個体の肉体物質から得ることができる
。任意のこれら供給源由来のポリヌクレオチド、特にＤＮＡまたはＲＮＡは検出
用に直接使用してもよく、あるいは分析に先だってＰＣＲまたは任意の他の増幅
技術を用いて酵素により増幅してもよい。ＲＮＡ，特にｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、お
よびゲノムＤＮＡもまた同様の方法で使用することができる。増幅を用いて個体
中に存在する感染性または残留性生物体の種および株の特徴の描写を生物体の選
択されたポリヌクレオチドの遺伝子型の分析により行なうことができる。欠失お
よび挿入は、同族の生物体、好ましくは同じ属の別の種または同じ種の別の株か
ら選択された参照用配列の遺伝子型と比較して増幅生成物のサイズの変化により
検出することができる。点変異は、増幅したＤＮＡを標識した百日咳病原性ポリ
ヌクレオチド配列へハイブリダイズすることにより同定することができる。完全
にまたは顕著に一致している配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡをそれぞれＤＮアーゼ
またはＲＮアーゼで消化することにより、あるいは溶融温度または復元動性の違
いを検出することにより不完全な一致のまたはより顕著に不一致の二本鎖ＤＮＡ
と区別することができる。ポリヌクレオチド配列の違いもまた、参照用配列と比
較したゲル中のポリヌクレオチド断片の電気泳動易動度の変化により検出するこ
とができる。これは変性剤はあってもなくても行なうことができる。ポリヌクレ
オチドの違いもまた、ＤＮＡまたはＲＮＡの直接シークエンシングにより検出す
ることができる。例えばＭｙｅｒｓ等の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４
２（１９８５）を参照されたい。特定の位置における配列の変化もまた、ＲＮア
ーゼなどの核酸分解酵素保護検定、Ｖ１およびＳ１保護検定、または化学的開裂
法により明らかにすることができる。例えばＣｏｔｔｏｎ等の論文、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：４３９７〜４４０１（１９８５
）を参照されたい。
【００６２】 本発明はまた、診断用試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用法に関す
る。病または病原性と関連する本発明のポリヌクレオチドの突然変異形の検出は
、ポリヌクレオチドの過少発現、過剰発現、または発現の変化に起因する病の診
断、病の経過の予後、病の段階の判定、または病の疑いの診断に加えることがで
きる、またはそれを特定することができる診断のツールを提供することになる。
このようなポリヌクレオチドに突然変異を媒介する生物体、特に感染性の生物体
は、本明細書の別の場所に記載のものなどのさまざまな技術によりポリヌクレオ
チドのレベルで検出することができる。
【００６３】 本発明はさらに表２または３において定義した配列を有するポリヌクレオチド
の発現レベルの増加を肉体物質など個体由来の試料から判定することを含む、病
、好ましくは細菌（具体的にはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ）の感染、より好ましくは
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓにより引き起こされる感染を診断す
るためのプロセスを提供する。ポリヌクレオチドの発現増加または減少は、例え
ば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロット、分光測定
、およびその他の雑種形成法などポリヌクレオチドの計量のために当業界でよく
知られている方法のいずれかを用いて測定することができる。 ベクター、宿主細胞、発現系： 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類を具備す
るベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に改良される宿主細胞およ
び組換え技術により本発明のポリペプチドを産生することを含むベクターに関す
る。細胞なしの翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてタン
パク質などを生成するために使用することができる。
【００６４】 本発明の組換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子工学的に改良された宿主
細胞から当業技術者によく知られているプロセスにより調製することができる。
したがってさらに進んだ態様において本発明は、本発明のポリヌクレオチドまた
はポリヌクレオチド類を具備する発現系、このような発現系により遺伝子工学的
に改良される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に
関する。
【００６５】 本発明のポリペプチドの組換え生成の場合、発現系もしくはそのタンパク質、
または本発明のポリヌクレオチドを組み込むために宿主細胞を遺伝子工学的に改
良することができる。宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシ
ウム移入、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介による移入、病原体伝染、微注入、陽イ
オン脂質の仲介による移入、電気穿孔、形質導入、スクレイプ・ローディング（
ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道衝撃（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）による導入
、および感染など、Ｄａｖｉｓ等の共著、ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ等
の共著、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ Ｍ
ＡＮＵＡＬ，２ｎｄ Ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ
．（１９８９）など多くの標準的な実験マニュアルに記載されている方法により
行なうことができる。
【００６６】 適切な宿主の代表的な例には、連鎖球菌、ブドー状球菌、腸球菌、大腸菌、ス
トレプトマイセス、ラン色細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｍｏｒ
ａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの細胞など
の細菌細胞；酵母菌、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
、担子菌、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
の細胞などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２、およびＳｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ Ｓｆ９の細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３
Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１およびボーエス黒色腫（Ｂｏｗｅｓ ｍｅｌａ
ｎｏｍａ）細胞などの動物細胞；および裸子植物または被子植物の細胞などの植
物細胞がある。
【００６７】 本発明のポリペプチドを産生するにはきわめてさまざまな発現系を用いること
ができる。このようなベクターにはなかでも染色体、エピソーム、およびウィル
ス由来のベクター、例えば細菌性プラスミド由来のもの；バクテリオファージ由
来のもの；トランスポゾン由来のもの；酵母菌エピソーム由来のもの；挿入因子
由来のもの；酵母菌染色体因子由来のもの；バキュロウィルス、ＳＶ４０などの
パポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂
犬病ウィルス、ピコルナウィルス、レトロウィルス、およびアルファウィルスな
どのウィルス由来のもの；ならびにコスミドおよびファージミドなどのプラスミ
ドとバクテリオファージ遺伝子因子とに由来するものなどその組み合わせ由来の
ベクターがある。発現系構築物は、発現を発生させるだけでなく調節する制御領
域を含有してもよい。この点に関しては、ポリヌクレオチドを維持し、増殖し、
または発現するために、および／または宿主中でポリペプチドを発現するために
好適な任意の系またはベクターを一般に発現に用いることができる。適切なＤＮ
Ａ配列は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等の共著、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩ
ＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（上記）に示されたものなど任
意のさまざまな周知の定型化された技術により発現系の中に挿入することができ
る。
【００６８】 真核生物中の組換え発現系においては小胞体の内腔中に、細胞周辺腔中に、ま
たは細胞外環境中に翻訳されたタンパク質を分泌するために、適切な分泌シグナ
ルを発現されるポリペプチド中に組み込むことができる。これらシグナルはポリ
ペプチドにとって内因性のものであってもよく、あるいは異質のシグナルであっ
てもよい。
【００６９】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノールによる沈殿、酸
による抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロース
クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティークロマト
グラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマト
グラフィを含む周知の方法により組換え細胞培養物から回収し、精製することが
できる。最も好ましくはイオン金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ
）が精製用に使用される。ポリペプチドが細胞内合成、単離、および／または精
製の間に変性する場合には、タンパク質を再生するための周知の技術を使用して
活性な高次構造を再生することができる。
【００７０】 発現系はまた、ウィルスまたは細菌などの組換え型の生の微生物であってもよ
い。関心のある遺伝子を生きている組換えウィルスまたは細菌のゲノム中に挿入
することができる。この生きているベクターによる接種およびインビボ感染は、
抗原のインビボ発現および免疫応答の誘発を招くことになる。この目的に使用さ
れるウィルスおよび細菌は、例えば天然痘ウィルス（例えば種痘、鶏痘、カナリ
ア痘）、アルファウィルス（シンドビスウィルス、セムリキ森林ウィルス、ベネ
ズエラウマ脳炎ウィルス）、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ピコルナウ
ィルス（ポリオウィルス、ライノウィルス）、ヘルペスウィルス（水痘帯状疱疹
ウィルスなど）、リステリア、サルモネラ、シガエラ、ナイセリア、ＢＣＧであ
る。これらのウィルスおよび細菌は毒性をもつ可能性があり、すなわち生ワクチ
ンを得るためにはさまざまな方法で弱毒化される。このような生ワクチンもまた
本発明の一部を形成する。 抗体： 更なる態様によれば本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体
を提供する。これらは多クローン性または単クローン性であってもよく、当業技
術者には周知の任意の適切な手段により生成することができる。
【００７１】 一般にマウスまたはラットをタンパク質（好ましくはフロイントの完全アジュ
バントで補助された）で免疫し、注射する（用量は一般には注射１回当たり５０
〜２００μｇで十分である）。多クローン抗体は、血清を抽出するために動物を
放血させることにより単離することができる。別法では単クローン抗体は、脾臓
（または大リンパ節）を取り出し、それを単細胞中に解離させることにより生成
することができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの論文、Ｎａｔｕｒｅ
，２５６：４９５〜４９７（１９７５））。次いでこれらは、骨髄腫細胞と融合
してハイブリドーマを形成するように誘導され、選択培地（例えばヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジンからなる培地「ＨＡＴ」）中で培養される。得ら
れるハイブリドーマを限界希釈により培養し、免疫化する抗原と特異的に結合す
る（関連のない抗原とは結合しない）抗体を生成させるために検定する。次いで
選択された単クローン分泌ハイブリドーマを、インビトロ（例えば組織培養ビン
または中空ファイバー反応器の中で）かインビボ（マウスの腹水など）のいずれ
かで培養する。
【００７２】 単鎖抗体を生成するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する単鎖抗体を産生させるために
適応させることができる。また、トランスジェニックマウス、またはその他の生
物もしくは他の哺乳類などの動物を、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオ
チドに対して免疫特異的なヒト化した抗体を発現させるために用いることができ
る。
【００７３】 別法では、抗百日咳病原性ポリペプチドを処理するためにスクリーニングされ
たヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅ｖ遺伝子のレパートリーから、または素朴な
そのままのライブラリーのいずれかから、本発明のポリペプチドに対して結合活
性を有する抗体遺伝子を選択するためにファージ表示技術を利用することができ
る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等の論文、Ｎａｕｒｅ，３４８，５５２〜５５４（１
９９０）；Ｍａｒｋｓ等の論文、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９〜
７８３（１９９２））。これら抗体のアフィニティもまた、例えば鎖シャフリン
グにより改良することができる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ等の論文、Ｎａｕｒｅ，３５
２：６２８（１９９１））。
【００７４】 上述の抗体は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するクロ
ーンを単離または同定して、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを例えばアフ
ィニティクロマトグラフィにより精製するために使用することができる。
【００７５】 百日咳病原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する抗体は感染、特に
細菌感染の治療に使用することができる。
【００７６】 ポリペプチド変異型には本発明の個々の態様を形成する、抗原的に、エピトー
プ的に、または免疫的に等価な変異型が含まれる。
【００７７】 好ましくは抗体またはその変異型は、個体中の免疫原性をより少なくするよう
に修飾される。例えば個体がヒトの場合、最も好ましくは抗体はハイブリドーマ
由来の抗体の相補性決定領域がヒトの単クローン抗体に移植されるところで、例
えばＪｏｎｅｓ等の論文、Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２〜５２５（１９８６）
、またはＴｅｍｐｅｓｔ等の論文、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，２６６〜
２７３（１９９１）に記載のように「ヒト化」される。 ワクチン： 本発明の別の態様は、なかんずく百日咳（特にＢ．Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の病
から哺乳類を守るために抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに適した
百日咳病原性ポリペプチドもしくはエピトープを含む断片、相似形質、外層膜の
小胞、または細胞（弱毒化されていてもいなくてもよい）を前記動物に接種する
ことを含む、哺乳類中に免疫応答を誘発させる方法に関する。このような物質は
単独で用いても、あるいはその免疫力を改良する別の分子に接合してもよい。特
に本発明は、表３のエフェクタータンパク質で定義された遺伝子により符号化さ
れた百日咳病原性ポリペプチドの使用法に関する。本発明のさらに別の態様は、
病から哺乳類を守るために免疫応答を誘発して抗体を産生させるようにインビボ
で百日咳病原性ポリペプチドの発現を誘導するベクターを介して百日咳病原性ポ
リペプチドを送達することを含む、前記動物中でそのような免疫応答を誘発する
方法に関する。
【００７８】 本発明の更なる態様は、哺乳類の宿主中に導入した場合にその哺乳類中に百日
咳病原性ポリペプチド（特に表３において定義した遺伝子により符号化されたも
の）に対する免疫応答を誘発する免疫学的組成物またはワクチン製剤に関するも
のであって、前記組成物は百日咳病原性遺伝子、あるいは百日咳病原性ポリペプ
チドもしくはエピトープを含む断片、相似形質、外層膜の小胞、または細胞（弱
毒化されていてもいなくてもよい）を含む。ワクチン製剤はさらに適切なキャリ
ヤを含んでいてもよい。百日咳病原性ポリペプチドのワクチン組成物は、好まし
くは経口的または非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内等の注射を含む）に投
与される。非経口的投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および
受容体の血液と等浸透圧の製剤にする溶質を含有することもできる水性および非
水性の無菌の注射液；および沈殿防止剤または増粘剤を含むことができる水性お
よび非水性の無菌の懸濁液が含まれる。製剤は１回の用量または複数回の用量の
容器、例えばシールしたアンプルおよびガラス瓶で与えられてもよく、また使用
する直前に無菌の液体キャリヤの添加のみが必要な凍結乾燥状態で保管してもよ
い。ワクチン製剤もまた、製剤の免疫原性を高めるために当業界で周知の水中油
系およびその他の系などのアジュバント系を含んでもよい。用量はワクチンの比
活性に左右され、定型化された実験法により容易に決めることができる。
【００７９】 本発明のワクチン製剤はまた、適切なワクチン物質であることが知られている
他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ抗原、例えば百日咳類毒素、ペルタクチン、アグルチ
ノゲン１および２、ＦＨＡ（繊維状血球凝集素）、およびアデニル酸シクラーゼ
／溶血素（ＡＣ／ＨＬＹ）、またはその免疫原性断片を含んでいてもよい（Ｌｏ
ｃｈｔ等の論文、ＮＡＲ，１４：３２５１〜３２６１（１９８６）；Ｒｅｌｍａ
ｎ等の論文、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８６：２６３７〜２６４１（１９８９）；Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ等の論文、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５；１３９３〜１４０４（
１９９１）；Ｍｏｏｉ等の論文、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｇ．１２：１２７〜１
３５（１９９２）；ＨｅｗｌｅｔｔおよびＧｏｒｄｏｎ共著のＩｎ Ｐａｔｈｏ
ｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＰＰ．１９３〜２０９（１９８８）
）。
【００８０】 本発明のさらに別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む免疫／ワクチン
製剤に関する。このような技術は当業界でよく知られており、例えばＷｏｌｆｆ
等の論文、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５〜８（１９９０）を参照されたい
。
【００８１】 ワクチン組成物は本発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドを含
むことができる。医薬品組成物は、治療に有効な量の特許請求された本発明のポ
リペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含むことになる。
【００８２】 本明細書で用いられる用語「治療に有効な量」とは、所望の病または状態（こ
の場合はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ、特にＢ．Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓによる病）の治療
、改善、または予防のための、あるいは検出可能な治療または予防効果を示すた
めの治療物質の量を意味する。この効果は、例えば抗原のレベルにより検出する
ことができる。治療効果にはまた、体温の低下などの理学的症状の軽減が含まれ
る。ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原性
または免疫原性ポリペプチドを含む。「免疫学的に有効な量」とは、１回の用量
または一連の用量の一部として個体に対するその量の投与が治療または予防に有
効なことを意味する。
【００８３】 実施例 下記の実施例は、特別に詳細な記述のあるところを除けば当業技術者に周知の
定型的な標準的技術を用いて行なわれる。この実施例は本発明を例示するもので
あり、限定するものではない。 実施例１：ＩＩＩ型分泌系はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ中の病
原性の島に存在する。
【００８４】 Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのゲノム中のｌｃｒＤ相同遺伝子
の存在をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調べた。使用したプライマー（
表１に示すオリゴヌクレオチド９５０８０および９５０８１）は、タンパク質の
ＬｃｒＤ／ＦｌｂＦ科のアミノ酸配列の高度保存領域に対応する縮重オリゴヌク
レオチドである。これらプライマーはまた、鞭毛を有する細菌株中に存在する、
パラローグｆｌｈＡまたはｆｌｂＦ鞭毛遺伝子の代わりのビルレンス遺伝子の増
幅を助けるように設計された。オリゴヌクレオチド９５０８１中の３′三重項Ｃ
ＡＴの存在が決定因子であり、確かに多重配列の分析を周知の相同配列を用いて
行なうとき（データベースの検索はＧＣＧ９パッケージのＦＡＳＴＡおよびＴＦ
ＡＳＴＡプログラム、またはＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＢＬＡＳＴＸ
プログラムのいずれかを用いて行ない、アライメントはＧＣＧ９パッケージのＰ
ＩＬＥＵＰプログラムを用いて行なった）、鞭毛の配列中には存在しないがビル
レンスの配列中に限って存在するメチオニンに対するＣＡＴ三文字コドンが見ら
れる。
【００８５】 アガロースゲル上で分析する場合、ＰＣＲ生成物は断片の異種混合物として出
現し、その一つは予想したサイズ（約１５０ｂｐ）を示していた。鋳型として約
１５０ｂｐのＤＮＡを用いる２回目の増幅の結果、更なる特色づけのためにｐＣ
ＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる）中でクローン化された単一アンプ
リコンを生じた。そのヌクレオチド配列（図１）は、全てのｌｃｒＤ／ｆｌｂＦ
相同遺伝子と似ているがビルレンス（ｌｃｒＤ様の）遺伝子とより高レベルの同
一性を共有する１５２ｂｐの断片として出現した。
【００８６】
【表１】
【００８７】1 ＩＵＢ（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，１５０：１〜５（１９８５））により提案されたヌクレオチドの
アンビギュイティに対する文字コードを使用した。2 この実験に使用したＹｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ由来の
ｌｃｒＤ遺伝子のＤＮＡ配列はＰｌａｎｏ等により出版物に発表された。
【００８８】 クローン化された断片が実際にＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの配列であったことを
保証するために、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のＤＮＡの連続１０倍希釈物を用
いた緊縮条件下でＰＣＲを行なった。緊縮ＰＣＲ条件の最適化は、鋳型とプライ
マーの間の完全な一致を必要とする。しかしながら元のプライマーの退行変性に
よって最初に得られた１５２ｂｐの配列がその境界で実際のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓ
ｉｓ ｌｃｒＤ様の配列（以後ｂｃｒＤと呼ぶ）との少数の塩基対の違いを示す
可能性が高い。したがって正しいＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ配列であることが知ら
れているプライマーを用いるときには、内部プライマー（表１のオリゴヌクレオ
チド９５３６３および９５３６４）を用いる入れ子型ＰＣＲの手法が好ましい。
用量−応答関係をＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの鋳型ＤＮＡの１０倍希釈物と入れ子
型ＰＣＲの生成物との間で観察した結果、１５２ｂｐのアンプリコンが実際にＢ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａのゲノムに由来することが示唆された。
【００８９】 １５２ｂｐの配列とｌｃｒＤ／ｆｌｂＦ遺伝子の比較は、プラスミドベクター
ｐＢＲ３２７中で構築されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのゲノムライブラリーのス
クリーニング用プローブとして使用された特定のＤＮＡの広がり（表１のオリゴ
ヌクレオチド９６１１０）を画定することを可能にした（Ｄｅｌｉｓｓｅ−Ｇａ
ｔｈｏｙｅ等の論文、Ｉｎｆｅｃｔ−Ｉｍｍｕｎ．５８：２８９５〜９０５（１
９９０））。幾つかのポジティブクローンを単離し、それらの常在性プラスミド
の制限分析を行なった結果、それらが重複挿入断片を内部にもつこと示した。一
つの挿入断片のヌクレオチド配列全体を決定し結果、大きなオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）が露呈された。この２１００ｂｐのＯＲＦは、ペスト菌タ
ンパク質ＬｃｒＤおよびＦｌｈＡとそれぞれ５９％および４７％同一の７５ｋＤ
ａのポリペプチドを符号化した。アミノ酸配列が演繹されているＢ．ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ ＢｃｒＤを含む、全てのメンバーが既知のタンパク質のＬｃｒＤ／Ｆ
ｌｂＦ科の多数のアミノ酸を比較した結果、この配列が明らかにビルレンス関連
決定因子内にランクすることが示された（図２）。これらのデータは、Ｂ．ｐｅ
ｒｔｕｓｓｉｓがビルレンスエフェクターの分泌と関係したＩＩＩ型エキスポー
ト系を所有することを強く示唆している。
【００９０】 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｌｃｒＤ様のヌクレオチド配列（ｂｃｒＤ）はＥＭ
ＢＬに付託され、受け入れ番号Ｙ１３３８３を割り当てられた。
【００９１】 この総合技術は、他の細菌株中のＩＩＩ型分泌系の存在／不在を決定するのに
役立った。この技術を用いてヒトの病原体Ｂｏｒｒｅｌｉａ Ｂｕｒｇｄｏｒｆ
ｅｒｉおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉを、そのような系に対し
て徹底的にスクリーニングを行なった。ＩＩＩ型分泌系に対する何の形跡も発見
できなかった。これらの微生物のゲノム配列に関するその後の発表により、これ
らの種の中に類似の系が存在しないことが裏付けられた。一方この方法は、ビル
レンス配列内に明らかにランクする植物病原体Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒ
ｒｕｇａｔａ由来のＤＮＡ断片の増幅を可能にした。この技術は、Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ ｓｐｐ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔｈａｒａｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ、任意の腸内細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｆ
ｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐ
ｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａなどの医学的または作物
栽培学的に重要な任意のグラム陰性菌に適用することができる。完全に配列した
株においてさえ、この技術は同一種の代わりの型または株を調べる簡単な方法と
して用いることができる。例えば病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの幾
つかの型はＩＩＩ型分泌系を内部にもつが、他はもたない。 実施例２：病原性の島およびその中で符号化されたビルレンス関連タンパク質を
特徴づけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｂｃｒＤのフランキング配列の分析。
【００９２】 病原性の島の内側で遺伝子を符号化するＩＩＩ型の系統的な菌株群形成の傾向
がＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｂｃｒＤのフランキング配列の分析に駆り立てた。
病原性の島を包含する全領域を、キメラＤＮＡの挿入断片により起こり得る人為
結果を避けるために病原性の島領域の各々が少なくとも２つの独立のクローン中
で表現されなければならないという事実に注意を払うことに気を付けながら染色
体歩行により配列した。これは３つのカテゴリー、すなわちクラスＩ型ＯＲＦ（
表２）と、最もすぐれたワクチンおよび診断特性を有するエフェクタータンパク
質であるクラスＩＩ型ＯＲＦ（表３）と、挿入断片配列、および別の種のハウス
キーピング遺伝子と相同のＯＲＦ（表４）とに分類することができる一かたまり
になったＯＲＦを現した。病原性の島の境界を画定する一般法則はないがそれら
は、たとえ境界の絶対的画定が配列の末端においてハウスキーピング遺伝子を検
出することによってのみ本当に行なうことができるとしても、どちらかの境界に
おける同方向または逆方向反復によりはっきり区別することができる。この場合
、挿入断片の配列（図３のＩＳ）は島（ハウスキーピング遺伝子とビルレンスＯ
ＲＦを分ける）の５′末端に存在し、３′末端には存在しない。加えて、配列デ
ータにより多数のビルレンス配列が包囲されている遺伝子座を取り囲むハウスキ
ーピング遺伝子（ｇｒｅＡおよびＩＣＦＧ様の）が存在することは島の境界の良
い指標である。病原体の島の完全な遺伝子構成を概略図で図３に示す。ＰＡＩ境
界の正確な画定には、ＩＩＩ型分泌系の全くないＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ株の対応
する染色体領域の特徴描写などの更なる実験データが必要である。
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】 ｂｃｒＤ遺伝子の次には、その推定アミノ酸配列がエルジニア種のＹｓｃＵタ
ンパク質（同一性39％、類似性51％）と、ならびにその他の既知のＹｓｃＵ相同
体と有意の類似性を共有する開放読取枠（ＯＲＦ）が存在する（図４）。Ｙｓｃ
Ｕは、ＬｃｒＤと同様、ボルデテラ属の百日咳菌Bordetella pertussisのビルレ
ンスメカニズムに関与するエルジニアＩＩＩ型分泌機構の一構成成分であり、し
たがって、病原性に最も関与する可能性がある古典的ＩＩＩ型分泌系を保有する
。この後者の点は、突然変異体の表現型分析により調査され得る（下記参照）。
【００９７】 Ｐａｉの全長は、約30〜40 kbである。全領域のＤＮＡ配列は、図５に示され
ており、表２、３および４に言及されている。パルスフィールドゲル電気泳動で
の制限分析は、ＩＩＩ型遺伝子座を、TohamaＩ株染色体上の等位位置1,590 kbに
マッピングさせた。
【００９８】 相同性は、百日咳菌Bordetella pertussisクラスＩＩＰａｉＤＮＡ配列と、Ge
nEMBLデータベースで報告された配列との間には見出されなかった（表３に記載
したものは除く）。ビルレンスに関与するＰａｉ内のこれらの未知の遺伝子の発
現生成物は、病原性百日咳菌に対するワクチン処方物の開発に有用である。
【００９９】 Ｐａｉの明確な機能を取り扱うために、対立遺伝子交換により、ｂｃｒＤ突然
変異体を工学処理した。結果的に生じた突然変異体において、カナマイシン耐性
を付与するａｐｈＡ−３カセットにより、ｂｃｒＤ遺伝子を崩壊させた。翻訳が
妨害されず、推定下流シストロンの発現にいかなる極性作用も及ぼさないような
方向に、このカセットを挿入した。突然変異体を単離したが、その関連表現型は
現在分析中である。
【０１００】 実施例３：病原性島の遺伝子のin-situ発現の分析 遺伝子構築 ＩＩＩ型分泌を欠く突然変異体を産生するために、255 bp断片（コドン363〜4
45）をｂｃｒＤコード配列から欠失させて、カナマイシン耐性を付与するａｐｈ
Ａ−３遺伝子を含有するカセットに置き換えた（Menard et al., J. Bacteriol.
（1993）175:5899-5906）。ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ消化によりａｐｈＡ−３カセ
ットをｐＵＣ１８Ｋから切り取って、ｂｃｒＤ ＥｃｏＲＩ−Ｓｓｅ8387Ｉ部位
に導入した。この構築物は、ｂｃｒＤ翻訳の初期停止を生じて、突然変異化遺伝
子の残りの３‘末端の枠内翻訳を可能にして、下流シストロンの発現に及ぼす可
能性のある極性作用を回避した。ＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ切断により、フランキン
グ配列を伴う突然変異化ｂｃｒＤ遺伝子を切り取り、その後、ＤＮＡアダプタに
より、自殺プラスミドｐＳＳ1129（Stibitz, Methods Enzymol.（1994）235:458
-465）のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。その結果生じた構築物をｐＡＦ
214と命名した。ｐＡＦ248は、２つの付加的な独自のＳｐｅＩおよびＰａｃＩ部
位を含有したｐＡＦ214の誘導体である。一対の相補的オリゴヌクレオチド中に
含まれるこれらの部位を、ｐＡＦ214のＢａｍＨＩ部位に導入した。その他の構
築物は、ｐＡＦ245およびｐＡＦ246を含んだ。５’領域およびｂｃｒＤの最初の
４つのコドンを網羅する831 bp断片のＰＣＲ増幅を生成した。このアプリコンを
さらに、ｂｃｒＤ開始コドンが、レポーター遺伝子として用いられるｌａｃＺを
有する枠内におかれるような方向で、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎＤＩＩＩ線状化ｐＮＭ
480（Minton, Gene（1984）31:269-273）に導入した。その結果生じた構築物を
、ｐＡＦ245と命名した。同様に、その最初の３つのコドンを含む上流ｂｓｃＮ
配列を包含する849 bp断片の下流にｌａｃＺを配置するために、プライマーを設
計した。ｐＮＭ480中でこの断片をクローニングすることにより、ｐＡＦ246を得
た。
【０１０１】 形質転換および対立遺伝子交換 10 mlのＳＳ培地中の新たに充填した培養からの百日咳菌細胞を洗浄し、100μ
lの冷10％（v/v）グリセロール溶液中に再懸濁させた。最大20μlの水中の10μg
までの超らせん化精製ＤＮＡを、100μlの細菌懸濁液に付加した。細胞およびＤ
ＮＡを予冷0.2 cm電子穿孔キュベット（Bio-Rad）に移して、Gene Pulser装置（
Bio-Rad）中に置いた。パルスは、25μF、2.5 Kvおよび600Ωの設定で成し遂げ
、11〜14 msの範囲の時定数を得た。
【０１０２】 ＢＧ＋ゲンタマイシンに関するそれらの初期単離後、二次組換え工程を経たｐ
ＡＦ214およびｐＡＦ248形質転換体を、前記と同様に、ストレプトマイシンに関
して選択した（Stibitz、前記）。最後に、カナマイシンに対するそれらの獲得
耐性により、ヌルｂｃｒＤ突然変異体を復帰細胞と区別した。サザーンブロット
分析により、ａｐｈＡ−３の適正な組込みを査定した。これに対比して、ｐＡＦ
245およびｐＡＦ246の導入は、ＢＧ＋アンピシリンに関して選択される単一交差
を要しただけであった。この組換え工程は、それぞれｂｃｒＤおよびｂｓｃＮの
転写を支配するシグナルの制御下でのｌａｃＺコード配列の配置をもたらした。
【０１０３】 マウスモデル ＢＧ寒天平板上で２日間増殖させた後、野生型および突然変異体細菌を回収し
、108 PFU ml-1の濃度でＰＢＳ中に再懸濁した。25μlの懸濁液をペントバルビ
タール麻酔マウスの各外鼻腔に注入した。Ultraturaxグラインダーで各マウスの
両肺を処理し、再懸濁化細菌をＢＧ寒天平板上で滴定することにより、4時間、3
、7、14、26、39および45日後に、肺コロニー形成を検定した。
【０１０４】 β−ガラクトシダーゼ検定 対数期に増殖させた液体培養から得られる細菌懸濁液（ＯＤ＝0.2）0.5 mlを
、前記（Miller, （1972）"Experiments in molecular genetics," Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）と同様に検定した。Sigmaの
色素形成基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を我々は
用いた。
【０１０５】 ｂｃｒＤおよびｂｓｃＮ転写体の両方の転写は、ｂｖｇ遺伝子座により制御さ
れると思われる ほとんどのボルデテラ属ビルレンス機能は、ｂｖｇ遺伝子座により制御される
。Ｂｖｇ+相はビルレンス因子の発現により特性化され、動物モデルのコロニー
形成を必要とする。これに対比して、細菌は、ニコチン酸またはＭｇＳＯ4によ
り誘導され得るＢｖｇ-相では無毒性である。ｌａｃＺのこれらの遺伝子との転
写的融合を用いることにより、転写の異なる単位に属する２つの遺伝子、即ちｂ
ｃｒＤとｂｓｃＮの発現のレベルを我々は調べた。このために、それぞれｐＡＦ
245およびｐＡＦ246を組込んだ突然変異体ＮＩＶｈ86およびＮＩＶｈ87を我々は
単離した。前者の突然変異体では、単一組換え工程はｂｃｒＤコード配列の変わ
りに調整ｌａｃＺをもたらし、一方、後者においては、ｌａｃＺはｂｓｃＮに取
って代わった。ｂｃｒＤとｂｓｃＮの両方の発現のレベルを、Ｂｖｇ+相で、ま
たはＢｖｇ-相で査定した。両百日咳菌遺伝子とも、in vitroでは弱発現された
。しかしながら、さらに発現のこれらのレベルは、Ｂｖｇ系により明らかに変調
されると思われた。実際、β−ガラクトシダーゼはＢｖｇ-条件で査定され得た
が、酵素活性はＢｖｇ-条件では検出されなかった（表５）。
【０１０６】
【表５】
【０１０７】 実施例４：エフェクタータンパク質ワクチン候補の組換え発現 発見された配列において、７つのＯＲＦ（ｏｒｆ２〜８）は特に、エフェクタ
ータンパク質およびワクチン候補としてそれらを良好な候補たらしめる一定の判
定基準を満たす。第一に、それらは典型的ＩＩＩ型分泌（クラスＩ）遺伝子に取
り囲まれると思われ、したがって、疑いの余地なく、ＩＩＩ型分泌遺伝子座に属
する。さらに、それらは、他の生物体からの関連ＩＩＩ型系中に存在する遺伝子
との有意の類似性を示さず、したがって、ボルデテラ属に特異的なエフェクター
タンパク質であると思われる。これらのＯＲＦの他に、ｂｏｐＮ、ｏｒｆ９およ
びｏｒｆ10も、ワクチン候補として特に興味深い。これらの配列は前記の第二判
定基準を満たさない（それらはシュードモナス属のPseudomonas aeruginosaのｐ
ｏｐＮ、ｐｃｒＨおよびｐｃｒ４と何らかの類似性を有する）という事実にもか
かわらず、これらの生成物も特殊トランスロコンにより輸出され得る。これらの
理由のために、１０個のＯＲＦ、即ちｏｒｆ２〜10およびｂｏｐＮをさらなる分
析のために選択した。このために、10対のプライマー（表６）を、それらの対応
するＯＲＦを増幅するために設計した。次に、増幅ＯＲＦをｐＣＲ−ＴＯＰＯ（
商標）Ｔ／Ａクローニング系（Invitrogen）中でクローン化して、それらの配列
を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより誘導されると推定されるエラーに関して検
査した。ＥｃｏＲおよびＢａｍＨＩ（またはＢｇｌＩＩ−表６参照）切断により
正しい挿入物を回収して、ｐＭＡＬ（商標）ベクター（New England Biolabs; M
aina et al., Gene（1988）74:365-373）中に移し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉ制限により開裂した。これらのベクターでは、クローン化挿入物の発現は、大
腸菌のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合した組換えタンパク質を産生
した。融合タンパク質のＭＢＰドメインは、発現生成物を検出し、アフィニティ
ークロマトグラフィーによりそれを精製するための手段を提供する。
【０１０８】 ４つのＯＲＦ、即ち、一方ではｏｒｆ２〜４および−１０、そして他方ではｏ
ｒｆ６は、それぞれｐＭＡＬ−ｃ２Ｅ（商標）およびｐＭＡＬ−ｐ２Ｅ（商標）
中にクローン化された。300 mlの培地中で増殖させた形質転換細菌を、ＩＰＴＧ
（300μM）で誘導し、フレンチプレスセルで溶解した。不溶性物質を超遠心分離
によりペレット化し、廃棄する一方、その結果生じた上清をアミロース樹脂に適
用した。それらのＭＢＰドメインを介してアミロースと特異的に結合する融合タ
ンパク質をさらに、マルトース10 mMの適用により溶離した。個の方法により、1
0〜50 mgの各融合タンパク質を回収できた（図６）。ボルデテラ属ポリペプチド
とＭＢＰとの間のエンテロキナーゼ切断部位を利用することにより、発現ボルデ
テラ属生成物はＭＢＰから分離され得る。その他のＯＲＦは、同様のアプローチ
を用いて発現可能であるべきである。
【０１０９】 標準技法を用いて分泌タンパク質を分析して、それらの機能および免疫学的特
性を確証する。先ず、感染患者の血清中のこれらのタンパク質に対して向けられ
る抗体の存在を調べることにより、分泌タンパク質の免疫原性を査定する。さら
に、保護抗原としてのそれらの推定上の認識は、マウスモデルで実現された誘発
実験に基づいている。第二に、エフェクタータンパク質の生物学的特性を、それ
らの触媒活性を分析することにより、査定する。例えば、分泌タンパク質の１つ
はチロシンホスファターゼ活性を示す、と予測される。最後に、真核生物細胞の
細胞質中にタンパク質をマイクロインジェクトすることにより、エフェクタータ
ンパク質の機能を検査する。これにより、アクチン重合の阻害、細胞傷害性また
はアポトーシスの誘導についての推定上の活性、即ち、その他の種で発見された
ＩＩＩ型分泌系により分泌されるエフェクタータンパク質に割り当てられた種類
の活性を示すことができる。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
【表７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 クローニングされた１５２bpのアンプリコンのヌクレオチドおよび推定アミノ
酸配列。元の増幅に含まれるプライマー、その後の入れ子状に収められたＰＣＲ
、および遺伝子ライブラリースクリーニングは全てこの配列から誘導され、個別
的に第１表に列挙する。
【図２】 Yersinia LcrDに対しホモローガスな推定アミノ酸配列からのPileUp図。略語
：BbuFlhA=Borrelia burgdorferi FlhA；TpaFlhA=Treponema pallidum FlhA；Bs
uFlhA=Bacillus subtilis FlhA；CjeFlbA=Campylobacter jejuni FlbA；HpyFlhA
=Helicobacter pylori FlhA；EcoFlhA - Escherichia coli FlhA；StyFlhA=Salm
onella typhimurium FlhA；YenFlhA=Yersinia enterocolitica FlhA；PmiFlhA=P
roteus mirabilis FlhA；CcrFlbF=Caulobacter crescentus FlbF；EcoFhiA=Esch
erichia coli FhiA；EamHrpI=Erwinia amylovora HrpI；PsyHrpI=Pseudomonas s
yringae HrpI；ECEPSepA=Enteropathogenic Escherichia coli SepA；StySsaV=S
almonella typhimurium SsaV；RsoHrpO=Ralstonia solanacearum HrpO；XcaHrpC
2=Xanthomonas campestris HrpC2；SflMxiA=Shigella Flexneri MxiA；StyInvA=
Salmonella typhimurium InvA；PaePcrD=Pseudomonas aeruginosa PcrD；YenLcr
D=Yersinia enterocolitica LcrD；BpeBcrD=Bordetella pertussis BcrD；CpsTt
sB=Chlamydia psittaci TtsB。
【図３】 Bordetella pertussisの病原性島（Ｐａｉ）の構成。４個のハウスキーピング
遺伝子（影を付した囲み）およびトランスポザーゼ遺伝子ＩＳ４８１（黒色の囲
み）がＰａｉを取り囲んでいる。Ｐａｉは、分泌装置およびその調節に関与する
決定因子をコードしている遺伝子（クラスＩ遺伝子、灰色の囲み）、ならびにエ
フェクター蛋白をコードしていると推定されるＯＲＦ（クラスII遺伝子、白色の
囲み）で構成されている。文字はそれぞれのクラスＩbsc遺伝子を示し、数字は
第３表に列挙するクラスII ＯＲＦに対応している。
【図４】 Yersinia YscUに対しホモローガスな推定アミノ酸配列からのPileUp図。略語
：BbuFlhA=Borrelia burgdorferi FlhB；TpaFlhB=Treponema pallidum FlhB；Ec
oFlhB - Escherichia coli FlhB；StyFlhB=Salmonella typhimurium FlhB；PmiF
lhBpart=部分的Proteus mirabilis FlhB；YenFlhB=Yersinia enterocolitica Fl
hB；BsuFlhB=Bacillus subtilis FlhB；HpyFlhB=Helicobacter pylori FlhB； A
tuFlhB=Agrobacterium tumefaciens FlhB；CcrPodW=Caulobacter crescentus Po
dW；SflSpa40=Shigella flexneri Spa40；StySpaS=Salmonella typhimurium Spa
S；EcoEscU=Escherichia coli EscU；StySsaU=Salmonella typhimurium SsaU；B
peBscU=Bordetella pertussis BscU；YenYscU=Yersinia enterocolitica YscU；
RsoHrpN=Ralstonia solanacearum HrpN；XcaOrf0part=部分的Xanthomonas campe
stris Orf0；EamHrcU=Erwinia amylovora HrcU；EheHrcUpart=部分的Erwinia he
rbicola HrcU； PsyHrpY=Pseudomonas syringae HrpY；CpsOrf1=Chlamydia psit
taci Orf1。
【図５】 III型分泌系病原性島を含むBordetella pertussisゲノムのＤＮＡ配列。オー
プンリーディングフレームに関する情報については第２、３および４表ならびに
図３を参照されたい。
【図６】 親和クロマトグラフィーによるＭＢＰ−Ｏｒｆ２、−４、−６および−１０の
精製。各溶解液の限外濾過上清（図の左部分）および親和カラムから溶出した生
成物（図の右部分）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブルー染色によ
って視覚化した。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年３月２３日（２００１．３．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２９】 特定の細菌株が病原性に関与するＩＩＩ型分泌系を保有す
るか否かの確定方法であって、以下の： エルジニア属ＹｅｒｓｉｎｉａのＬｃｒＤポリペプチドに特異的な良好保存領
域と相補的な変性ＰＣＲプライマーを設計し、 前記細菌株中のあらゆるｌｃｒＤ様遺伝子の存在を確定するためにプライマー
間に（そのＤＮＡ配列を含めて）ＤＮＡ配列を含有するポリヌクレオチドを増幅
し、 首尾よく増幅された場合には、ｌｃｒＤ様遺伝子をシーケンシングし、そして ＤＮＡ配列が、ｌｃｒＤ様遺伝子のビルレンス−関連族、あるいはｌｃｒＤ様
遺伝子の鞭毛関連族のどちらとより相同であるかを確定する ことを包含する方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年７月６日（２００１．７．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/235 ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 14/235 16/12 ４Ｃ０８５ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 33/569 Ｆ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ホーコニエ，アレン ベルギー国，ベ−1050 ブリュッセル， 50，アブニュ エフ．ルーズベルト，ファ キュルテ デ シャーンス，ユニベルシテ リブル ドゥ ブリュッセル (72)発明者 ゴドフロワ，エドモン ベルギー国，ベ−1050 ブリュッセル， 50，アブニュ エフ．ルーズベルト，ファ キュルテ デ シャーンス，ユニベルシテ リブル ドゥ ブリュッセル Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA13 BA31 CA04 CA09 HA14 4B063 QA18 QA19 QQ02 QQ43 QR08 QR39 QR55 QR62 QS25 QS32 4B064 AG31 CA19 CC24 DA01 4B065 AB01 BA02 CA24 CA45 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA02 BA22 CA03 ZB09 ZB35 4C085 AA03 AA13 BA17 BB11 CC07 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA11 DA86 EA31 FA74

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64
    、66、68、70および72から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75％
    の同一性を有するアミノ酸配列を包含する単離ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64
    、66、68、70および72から成る群から選択されるアミノ酸配列を包含する請求項
    １記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64
    、66、68、70または72の単離ポリペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドの断片を包含
    する単離ポリペプチド。
  5. 【請求項５】 断片が免疫原性である請求項４のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64
    、66、68、70または72のそれぞれの全長にわたって、配列番号42、44、46、48、
    50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70または72のアミノ酸配列と少なく
    とも75％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含す
    る単離ポリヌクレオチド、あるいは前記単離ポリヌクレオチドと相補的なヌクレ
    オチド配列。
  7. 【請求項７】 配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64
    、66、68、70または72のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくと
    も75％の同一性を有するヌクレオチド配列を包含する単離ポリヌクレオチド、あ
    るいは前記単離ポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列。
  8. 【請求項８】 配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63
    、65、67、69または71のそれぞれの全長にわたって、配列番号41、43、45、47、
    49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69または71のものと少なくとも75％
    の同一性を有するヌクレオチド配列を包含する単離ポリヌクレオチド、あるいは
    前記単離ポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列。
  9. 【請求項９】 配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63
    、65、67、69または71との同一性が少なくとも95％である請求項６〜８のいずれ
    かに記載の単離ポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、
    64、66、68、70または72のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含す
    る単離ポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
    63、65、67、69または71のポリヌクレオチドを包含する単離ポリヌクレオチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、
    63、65、67、69または71の配列またはその断片を有する標識化プローブを用いて
    緊縮ハイブリダイゼーション条件下で適切なライブラリーをスクリーニングする
    ことにより得られる配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64
    、66、68、70または72のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する
    単離ポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 請求項６〜１２のいずれかの単離ポリヌクレオチドを包含
    する発現ベクターまたは組換え体生微生物。
  14. 【請求項１４】 請求項１３の発現ベクターを包含する宿主細胞、あるいは
    配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70および
    72から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75％の同一性を有するア
    ミノ酸配列を包含する単離ポリペプチドを発現する前記宿主細胞の亜細胞分画ま
    たは膜。
  15. 【請求項１５】 配列番号42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、
    64、66、68、70および72から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも75
    ％の同一性を有するアミノ酸配列を包含するポリペプチドの製造方法であって、
    前記ポリペプチドの生成に十分な条件下で請求項１４の宿主細胞を培養し、そし
    て培地からポリペプチドを回収することを包含する方法。
  16. 【請求項１６】 請求項６〜１２のいずれかのポリヌクレオチドの発現方法
    であって、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つを包含する発現ベクターで宿
    主細胞を形質転換し、そして前記ポリヌクレオチドのいずれかの発現に十分な条
    件下で前記宿主細胞を培養することを包含する方法。
  17. 【請求項１７】 有効量の請求項１〜５のいずれかのポリペプチドおよび製
    薬上許容可能な担体を包含するワクチン組成物。
  18. 【請求項１８】 ポリペプチドが配列番号42、46、48、50、52、54、56、58
    、60および62から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１７のワク
    チン組成物。
  19. 【請求項１９】 有効量の請求項６〜１２のいずれかのポリヌクレオチドお
    よび製薬上許容可能な担体を包含するワクチン組成物。
  20. 【請求項２０】 前記組成物が少なくとも１つのその他の百日咳菌Bordetel
    la pertussis抗原を包含する請求項１７〜１９のいずれかのワクチン組成物。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片
    に対して免疫特異的な抗体。
  22. 【請求項２２】 百日咳菌Bordetella pertussis感染の診断方法であって、
    このような感染を有する疑いのある動物からの生物学的試料内に存在する請求項
    １〜５のいずれかに記載のポリペプチド、あるいは前記のポリペプチドに対して
    免疫特異的である抗体を同定することを包含する方法。
  23. 【請求項２３】 動物における免疫応答の発生に用いるための薬剤の調製に
    おける請求項１〜５のいずれかに記載の免疫学的有効量のポリペプチドを包含す
    る組成物の使用。
  24. 【請求項２４】 動物における免疫応答の発生に用いるための薬剤の調製に
    おける請求項６〜１２のいずれかに記載の免疫学的有効量のポリヌクレオチドを
    包含する組成物の使用。
  25. 【請求項２５】 百日咳に罹患したヒトを治療するのに有用な治療組成物で
    あって、請求項１〜５のポリペプチドに対して向けられる少なくとも１つの抗体
    および適切な製剤担体を包含する組成物。
  26. 【請求項２６】 請求項３〜１８のポリヌクレオチドまたは請求項１９のポ
    リペプチドを包含するヒトにおける百日咳菌による感染を診断するためのキット
    。
  27. 【請求項２７】 細菌の病原性株からのＩＩＩ型分泌系を含有する病原性島
    からのビルレンス遺伝子の同定方法であって、以下の： エルジニア属YersiniaのＬｃｒＤポリペプチドに特異的な良好保存領域と相補
    的な変性ＰＣＲプライマーを設計し、 前記細菌病原性株中に存在するｌｃｒＤ様遺伝子のプライマー間に（そのＤＮ
    Ａ配列を含めて）ＤＮＡ配列を含有するポリヌクレオチドを増幅し、 ｌｃｒＤ様遺伝子をシーケンシングし、 ＤＮＡ配列が、ｌｃｒＤ様遺伝子のビルレンス−関連族、あるいはｌｃｒＤ様
    遺伝子の鞭毛関連族のどちらとより相同であるかを確定し、そして ビルレンス関連成員である場合には、全病原性島をシーケンシングし、そして この配列内の遺伝子を同定する ことを包含する方法。
  28. 【請求項２８】 特定の細菌株が病原性に関与するＩＩＩ型分泌系を保有す
    るか否かの確定方法であって、以下の： エルジニア属YersiniaのＬｃｒＤポリペプチドに特異的な良好保存領域と相補
    的な変性ＰＣＲプライマーを設計し、 前記細菌株中のあらゆるｌｃｒＤ様遺伝子の存在を確定するためにプライマー
    間に（そのＤＮＡ配列を含めて）ＤＮＡ配列を含有するポリヌクレオチドを増幅
    し、 首尾よく増幅された場合には、ｌｃｒＤ様遺伝子をシーケンシングし、そして ＤＮＡ配列が、ｌｃｒＤ様遺伝子のビルレンス−関連族、あるいはｌｃｒＤ様
    遺伝子の鞭毛関連族のどちらとより相同であるかを確定する ことを包含する方法。
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