JP2022508713A - ワクチンポリペプチド組成物および方法 - Google Patents
ワクチンポリペプチド組成物および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022508713A JP2022508713A JP2021545284A JP2021545284A JP2022508713A JP 2022508713 A JP2022508713 A JP 2022508713A JP 2021545284 A JP2021545284 A JP 2021545284A JP 2021545284 A JP2021545284 A JP 2021545284A JP 2022508713 A JP2022508713 A JP 2022508713A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptides
- poly
- vaccine
- peptide
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 269
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 194
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 62
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 44
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 109
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 30
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 claims description 15
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 9
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 claims description 7
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 claims description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 claims 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 57
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 abstract description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 93
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 89
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 51
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 32
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 29
- 241000894007 species Species 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 24
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 22
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 18
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 14
- 241000700114 Chinchillidae Species 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 12
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 12
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 12
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 12
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 210000003454 tympanic membrane Anatomy 0.000 description 11
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 10
- 238000002578 otoscopy Methods 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 9
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 9
- 238000012074 hearing test Methods 0.000 description 9
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical class 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 4
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 4
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 4
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 3
- 101100048413 Escherichia coli (strain K12) ulaC gene Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 3
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 101150112048 apxIIIA gene Proteins 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 101150103042 ptxA gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 2
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 102000005583 Pyrin Human genes 0.000 description 2
- 108010059278 Pyrin Proteins 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 2
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 2
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001098 polystyrene-block-poly(ethylene/propylene) Polymers 0.000 description 2
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 2
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004008 5'-Nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000197194 Bulla Species 0.000 description 1
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710105045 Lipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 101710112059 Lipoprotein NlpI Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001092142 Molina Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- GUVMFDICMFQHSZ-UHFFFAOYSA-N N-(1-aminoethenyl)-1-[4-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(4-amino-5-methyl-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[hydroxy-[[3-[hydroxy-[[3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphinothioyl]oxy-5-[[[2-[[[2-[[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-2-[[[5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-2-[[hydroxy-[2-(hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-3-yl]oxy-hydroxyphosphinothioyl]oxymethyl]oxolan-2-yl]-5-methylimidazole-4-carboxamide Chemical compound CC1=C(C(=O)NC(N)=C)N=CN1C1OC(COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=S)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)C(OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=S)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O)C1 GUVMFDICMFQHSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 description 1
- 101100476308 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) hel-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000288935 Platyrrhini Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002560 Polyethylene Glycol 3000 Polymers 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 101800001357 Potential peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000745 Potential peptide Human genes 0.000 description 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000024035 chronic otitis media Diseases 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- BUACSMWVFUNQET-UHFFFAOYSA-H dialuminum;trisulfate;hydrate Chemical compound O.[Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O BUACSMWVFUNQET-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940056913 eftilagimod alfa Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 101150032210 hel-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 229940031689 heterologous vaccine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008088 immune pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000022760 infectious otitis media Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229960005037 meningococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229940124733 pneumococcal vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 102000007739 porin activity proteins Human genes 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000025301 tympanitis Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/099—Bordetella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K2039/10—Brucella; Bordetella, e.g. Bordetella pertussis; Not used, see subgroups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、および免疫原性ペプチドを含む担体分子、ならびに、これらの免疫原性ペプチド、融合異種ポリペプチド、および/またはペプチドを保有している担体分子を含む免疫原性組成物であって、感染性生物に対する抗体産生を誘発することが可能なものが開示される。作製方法およびB.pertussis(Bp)のような感染性生物の1つまたは複数の株に対する抗体応答を引き起こすためのそれらの使用も開示される。【選択図】 図1
Description
[関連出願の相互参照]
本出願は、2018年10月15日に出願された米国仮出願番号62/745,878の優先権を主張するものであり、それは、その全体において示されたかのように参照により本明細書中に援用される。
本出願は、2018年10月15日に出願された米国仮出願番号62/745,878の優先権を主張するものであり、それは、その全体において示されたかのように参照により本明細書中に援用される。
[参照による援用の陳述]
本明細書に挙げられる全ての参考文献の内容全体は、参照により本明細書中に明白に援用される。
本明細書に挙げられる全ての参考文献の内容全体は、参照により本明細書中に明白に援用される。
非毒性で広範な交差反応性の免疫防御性抗原は、多くの疾患についてまだ同定されていない。さらに、効果的なワクチンが存在する疾患は、疾患の原因である生物(単数または複数)によるワクチン構成要素に対する適応に起因して、経時的に流行が増大し得る。
例えば、百日咳菌は、グラム陰性の好気性病原性の、ボルデテラ属の被包性球桿菌である。その病原性因子は、百日咳毒素、線維状ヘマグルチニン、パータクチン、線毛、および気管細胞毒を含む。4,086,186塩基対の完全なB.pertussisゲノムが2003年に公開された。百日咳菌は、ヒト特有の細菌病原体であり、ゼーゼーした咳、すなわち百日咳の、最も一般的な原因物質である。百日咳は、初期のカタル期の後、重症で長引く咳によって特徴付けられる。咳の重症度は未免疫の幼児で最も悪く、したがって、最も高い入院率および死亡率になる(Gabuttiら)。
死滅化全細胞ワクチンは、20世紀の大部分にわたって百日咳を予防するために用いられた。全細胞ワクチンは、1990年代に無細胞百日咳ワクチンによって置き換えられた。無細胞百日咳ワクチンは、3~5個のタンパク質構成要素、すなわち、百日咳毒素サブユニットA(PtxA)、線毛血清型2(fim2)、線毛血清型3(fim3)、パータクチン(Prn)、および線維状ヘマグルチニン(FHA)からなる(Plotkin,2014)。
最近になって、米国で報告される百日咳の事例数が、高レベルのワクチン接種率にもかかわらず増加している[Burns]。1934年の265,269報告事例から、百日咳の報告事例は、1976年における最低数の1010まで減少した。しかしながら、報告事例数は最近になって、2012年の48,277事例をピークに、17,972事例が2016年には報告された(CDC,Pertussis[Whooping Cough])。
意識の高さ、診断方法の改善、および、無細胞百日咳ワクチンの実施後の漸減する免疫を含む複数の因子が、百日咳の発生率の増大に寄与している。米国において単離されたB.pertussis株は、もはやパータクチンおよびFHAを一様に発現しないので、B.pertussisの遺伝学的ワクチン・エスケープも寄与しているかもしれない[Marieke,Schmidtke]。ワクチン有効性の低下およびその結果として集団免疫の減少のため、百日咳の免疫付与のための現在の推奨は、新生児に一時的に防御を与えるために全妊婦の全妊娠中の免疫付与を含む(CDC、PregnancyandWhoopingCough)。
したがって、疾患を予防するための代替ワクチンの開発が(百日咳が唯一の最近の例である)、重要な公衆衛生の需要となっている。
本明細書中の実施態様は、疾患のためのワクチン組成物および治療に関する。一部の実施態様では、細胞外および表面露出エピトープから細菌異種ポリペプチドワクチンを構築するための方法論が開示される。
特定の実施態様では、リバース・ワクチン工学(reverse vaccinology)およびインシリコ・タンパク質構造解析のような手法の組み合わせが用いられる。リバース・ワクチン工学は、ゲノムの生物情報を用いて、全ての(シーケンシングされた)株に存在するタンパク質であって細胞外または表面露出領域を有する可能性のあるタンパク質を同定する。インシリコ・タンパク質構造解析は、免疫系にアクセス可能であり得るタンパク質の領域を同定する。
リバース・ワクチン工学をインシリコ・タンパク質構造解析と統合することによって、アミノ酸配列が保存された(すなわち、種内の全ての株に対する標的として有用な)、免疫系に曝露される可能性のある領域のサブセットを同定することができる。それから、細胞外/表面露出配列が保存されたペプチドを用いて融合ポリペプチドが設計され、そして、クローニング、発現、および精製される。
これらおよび他の態様が以下にさらに説明される。しかしながら、本明細書中に記載される実施態様および実施例は限定を意図しない。
本開示のいくつかの実施態様が添付の図面において例示される。しかしながら、添付の図面は、いくつかの典型的な実施態様を例示するだけであり、したがって、本開示の範囲の限定と考えられることを意図しないことに注意されたい。
本開示は、特定の実施態様では、疾患を引き起こす生物(1つの例では百日咳菌(Bp))に対する抗体産生を誘発することが可能な免疫原性ペプチドに関する。本開示はまた、特定の実施態様では、免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドおよび担体分子、ならびに、これらの免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、および/またはペプチドを保有している担体分子を含む免疫原性組成物に関する。
本開示はまた、特定の実施態様では、疾患を引き起こす生物の1つまたは複数の株に対する抗体応答を生じさせる、上記免疫原性ペプチド/ポリペプチド/担体分子/免疫原性組成物の使用方法に関する(Bp、例えば(限定としてではないが)、ワクチンとして、または、対象の能動もしくは受動免疫付与のための抗血清を産生するため)。
本開示のペプチド、融合ポリペプチド、および担体分子組成物、ならびにそれらの使用方法の様々な実施態様をより詳細にさらに説明する前に、本開示は、以下の説明に記載される方法および組成物の詳細に対する適用に制限されないことが理解されるべきである。本明細書中に提供される説明は、例示目的のみを意図しており、限定する意味で解釈されることを意図しない。本開示は、他の実施態様が可能であり、または、様々な方法で実施もしくは実行されることが可能である。したがって、本明細書中で用いられる言語は、できるだけ幅広い範囲および意味が与えられることが意図されており、実施態様は例示的であることを意味し、網羅的ではない。また、本明細書中で用いられる語法および専門用語は説明目的のためであり、別段の指示がない限り限定としてみなされるべきでないと理解される。さらに、以下の詳細な説明において、非常に多くの具体的な詳細が、本開示のより徹底的な理解を提供するために示されている。しかしながら、本開示の様々な実施態様がこれらの具体的な詳細を用いずに実施され得ることが当業者に明らかである。
他の例では、当業者によく知られた特徴は、説明の不必要な複雑化を避けるために、詳細には説明されていない。当業者に明らかな全ての代替、置換、改変、および等価物は、本明細書中で定義されるように本開示の範囲内に含まれることが意図される。したがって、以下に説明される実施例(特定の実施態様を含む)は、本開示の実施を例示するのに役立ち、示される詳細(particulars)は、例としてのものであり、特定の実施態様の例示的な考察目的のみのためであり、手順ならびに本開示の原理および概念的態様の有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されることが理解される。
本明細書中に開示される組成物ならびにそれらの生産および適用および使用の方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をせずに作製および実施され得る。したがって、本開示の組成物および方法は、特定の実施態様の観点から説明されているが、組成物および/または方法に対して、ならびに、本明細書中に記載の方法のステップまたはステップの順番において、バリエーションが、本開示の概念、主旨、および範囲を逸脱せずに適用され得ることが当業者に明らかである。
本明細書中で言及される全ての特許、公開された特許出願、および非特許文献は、本開示が属する当業者のレベルを示すものである。
本明細書において別段の定義がない限り、本開示との関連で用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別段の要求がされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
本開示の方法および組成物に従って使用されるように、以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解される:
語「a」または「an」の使用は、特許請求の範囲および/または明細書において用語「含む(comprising)」とともに用いられる場合、「1つの(one)」を意味し得るが、「1つまたは複数の」、「少なくとも1つの」および「1つまたは1つよりも多くの」という意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替のみを指すことを明確に指示または代替が相互排他的である場合でない限り、「および/または」を意味するために用いられるが、その開示は、代替のみと、「および/または」を指す定義をサポートする。「少なくとも1つの」という用語の使用は、1つおよび1を超える(制限されないが、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100、またはその中に含まれる任意の整数を含む)任意の量を含むことが理解される。用語「少なくとも1つ」は、それが付けられる用語に応じて、100まで、または1000まで、またはそれよりも多くまでに及んでよく;さらに、100/1000という量は、より高い限界もまた満足する結果を生じさせ得るので、限定と考えるべきでない。さらに、「X、Y、およびZの少なくとも1つ」という用語の使用は、Xのみ、Yのみ、およびZのみ、ならびに、X、Y、およびZの任意の組み合わせを含むと理解される。
本明細書および特許請求の範囲において用いられるように、単語「含む(comprising)」(および、comprisingの任意の形態、例えば、「comprise」および「comprises」)、「有する(having)」(および、havingの任意の形態、例えば、「have」および「has」)、「含む(including)」(および、includingの任意の形態、例えば、「includes」および「include」)、または、「含む(containing)」(および、containingの任意の形態、例えば、「contains」および「contain」)は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されないエレメントまたは方法ステップを排除しない。
本明細書において用いられる用語「またはそれらの組み合わせ」は、その用語に先行する列挙されたアイテムの全ての並べ替えおよび組み合わせを指す。例えば、「A、B、C、またはそれらの組み合わせ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCの少なくとも1つ、および、特定の文脈において順番が重要ならば、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも含むことが意図される。この例で続けると、1つまたは複数のアイテムまたは用語の繰り返しを含む組み合わせ、例えば、BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどが明白に含まれる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、典型的に、任意の組み合わせにおけるアイテムまたは用語の数に制限はないことを当業者は理解している。
本出願全体を通して、用語「約」は、値が、組成物、組成物を投与するために用いられる方法に関する本来備わっている誤差変動、または、試験対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。本明細書において用いられる修飾語句「約」または「およそ」は、正確な値、量、程度、方向、または、他の認定された(qualified)特徴または値を含むことが意図されるだけでなく、測定誤差、製造の許容誤差、様々な部分または構成要素に対するストレス、観察者誤差、摩耗、およびそれらの組み合わせなどに起因するいくつかのわずかな変動も含むことが意図される。用語「約」または「およそ」は、量、時間的な持続などの測定可能な値に対して言及ときに本明細書において用いられる場合、例えば、規定の値から±10%の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示される方法を実施するのに適切であり、当業者によって理解されるとおりである。本明細書において用いられる用語「実質的に」は、続いて記載されるイベントまたは状況が完全に生じること、または、続いて記載されるイベントまたは状況がかなりの程度または度合いまで生じることを意味する。例えば、用語「実質的に」は、続いて記載されるイベントまたは状況が、時間の少なくとも90%、または時間の少なくとも95%、または時間の少なくとも98%、生じることを意味する。
本明細書において用いられる、「一実施態様(one embodiment)」または「実施態様(an embodiment)」という言及はいずれも、その実施態様に関して記載される特定のエレメント、特色、組成物、構造、または特徴が、少なくとも1つの実施態様に含まれることを意味する。本明細書中の様々な場所における「一実施態様では」という語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施態様を指しているわけではない。
用語「突然変異体」または「変異体」は、タンパク質、ペプチド、または核酸の野生型バージョンとは異なるアミノ酸またはヌクレオチドを少なくとも1つ有するタンパク質、ペプチド、または核酸を指すことを意図し、制限されないが、点置換、複数の連続または非連続の置換、キメラ、または融合タンパク質、およびそれらをコードする核酸を含む。保存的アミノ酸置換の例は、限定されないが、同一のグループ内、例えば、塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン、リジン、およびヒスチジン)、酸性アミノ酸(例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸)、極性アミノ酸(例えば、グルタミンおよびアスパラギン)、疎水性アミノ酸(例えば、ロイシン、イソロイシン、およびバリン)、芳香族アミノ酸(例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン)および小さなアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、およびメチオニン)のグループ内になされる置換を含む。あり得る置換の他の例は以下に記載される。
「薬学的に許容できる」という用語は、合理的な利益/リスク比に見合った、過度の有害な副作用(例えば、毒性、炎症、および/またはアレルギー反応)を伴わずにヒトおよび/または動物へ投与するのに適切な、化合物および組成物を指す。
「生物学的に活性」とは、活性薬剤がどのようにその生理学的効果を有するのか言及せずに、生物の生理系を改変する能力を意味する。
本明細書において用いられる、「純粋」または「実質的に純粋」は、対象種が、存在する優勢種である(すなわち、モル基準で、その組成物内の任意の他の対象種よりも大量である)ことを意味し、特に、実質的に精製された画分は、対象種が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約50%(モル基準)を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物内に存在する全ての巨大分子種の約80%よりも多く、より具体的には、約85%よりも多く、約90%よりも多く、約95%よりも多く、または、約99%よりも多くを含む。用語「純粋」または「実質的に純粋」は、対象種(例えば、ペプチド化合物)が、少なくとも60%(w/w)純粋、または少なくとも70%(w/w)純粋、または少なくとも75%(w/w)純粋、または少なくとも80%(w/w)純粋、または少なくとも85%(w/w)純粋、または少なくとも90%(w/w)純粋、または少なくとも92%(w/w)純粋、または少なくとも95%(w/w)純粋、または少なくとも96%(w/w)純粋、または少なくとも97%(w/w)純粋、または少なくとも98%(w/w)純粋、または少なくとも99%(w/w)純粋、または100%(w/w)純粋である製剤も指す。
用語「対象」および「患者」は、本明細書において相互交換可能に用いられ、温血動物、特に哺乳類を指すことが理解される。この用語の範囲および意味内の動物の非限定的な例は、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、チンチラ、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物園の動物、旧世界ザルおよび新世界ザル、非ヒト霊長類、ならびにヒトを含む。
「処置」は、治療的な処置を指す。「予防」は、予防的(prophylactic)または予防の(preventative)処置手順を指す。用語「処置」は、治療的目的のために患者へ組成物を投与することを指す。
用語「治療的組成物」および「医薬組成物」は、当技術分野で知られている、または本明細書において他の方法で検討される、任意の方法によって対象へ投与され得る活性薬剤を含んでいる組成物を指し、ここで、組成物の投与は、本明細書中の他のどこかに記載される治療的効果をもたらす。さらに、本開示の組成物は、当技術分野でよく知られている製剤化技術を用いて、遅延された、制御された、延長された、および/または、持続した放出を提供するように設計されてよい。
用語「有効量」は、本開示の様式で用いられる場合、合理的な利益/リスク比に見合った、過剰な有害な副作用(例えば、毒性、炎症、およびアレルギー反応)を伴わずに検出可能な治療的効果を示すのに十分な活性薬剤の量を指す。患者のための有効量は、患者のタイプ、患者のサイズおよび健康、治療される症状の性質および重症度、投与方法、治療の持続時間、同時的な療法の性質(あるならば)、用いられる特定の製剤などに依存する。したがって、正確な有効量を前もって明示することは不可能である。しかしながら、特定の状況に関する有効量は、本明細書において提供される情報に基づいてルーチン実験を用いて当業者によって決定され得る。
用語「ペプチド」は、本明細書において、典型的に隣接アミノ酸のα-アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに結合されてアミノ酸配列を形成する一連のアミノ酸残基を指すために用いられる。単語「ペプチド」は、長さを定義することを意図しないが、タンパク質の一部であることのみ意図する。特に、表面露出ペプチドは、抗体結合に曝露されるタンパク質の任意の領域である。特定の実施態様では、免疫原性ペプチドは、8から15まで25まで40まで60まで75まで100まで、またはより多くのアミノ酸、例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、または60個のアミノ酸の長さの範囲であってよい。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書において、典型的に隣接アミノ酸のα-アミノ基とカルボニル基の間でペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を指すために用いられて、ここで、長さは、単一ペプチドよりも長い。「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は(相互交換に用いられてよく)、連続的な立体配置でペプチドを結合するために組み換えまたは合成方法によって作製されたタンパク質またはポリペプチドを指す。
本明細書において用いられる「免疫原性組成物」は、宿主細胞または宿主生物において抗体産生などの免疫応答を誘発する、例えば、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、または、ペプチドもしくはポリペプチドがコンジュゲートされた担体分子を含んでいる組成物を指す。免疫原性組成物は、アジュバントを含んでもよい。特定の実施態様では、免疫原性組成物はワクチンである。
本明細書において用いられる場合、用語「抗原性フラグメント」は、免疫原性応答を誘発することも可能な本明細書において記載される抗原性ペプチドのフラグメントを指す。
本明細書において用いられる用語「相同」または「同一性%」は、対応する参照(例えば、野生型)の核酸、ペプチド、またはタンパク質に対してある程度の相同性を有する核酸(またはそのフラグメント)またはアミノ酸配列(ペプチドまたはタンパク質)を意味し、70%以上、または80%以上、または85%以上、または86%以上、または87%以上、または88%以上、または89%以上、または90%以上、または91%以上、または92%以上、または93%以上、または94%以上、または95%以上、または96%以上、または97%以上、または98%以上、または99%以上であってよい。例えば、ペプチドまたはポリペプチドに関しては、本明細書において記載される相同性または同一性のパーセンテージは典型的に、100アミノ酸の長さに4つのギャップがそのアライメント内に補助のために導入されてよい場合に、比べられる配列内の同一のアミノ酸残基で並べられた2つの配列の短い方に見られるアミノ酸残基のパーセンテージとして計算される(Dayhoffによって、Atlas of Protein Sequence and Structure,Vol.5,p.124,National Biochemical Research Foundation,Washington,D.C.(1972)に記載される)。一実施態様では、上述の相同性パーセンテージは、2つの配列の短い方に見られて2つの配列の長い方にも見ることのできる(ギャップの導入を伴う)、構成要素のパーセンテージとして計算されて、構成要素は、4つの連続するアミノ酸の配列として定義される。実質的に相同であるものとして、天然のタンパク質産物に対する抗体との交差反応性のおかげで単離され得る任意のタンパク質産物も含まれる。配列同一性または相同性は、配列ギャップを最小限にしながらオーバーラップおよび同一性を最大限にするように並べた場合の配列を比較することによって決定することができる。特に、配列同一性は、複数の数学的アルゴリズムのいずれかを用いて決定され得る。2つの配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin&Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:2264-2268;Karlin&Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-5877)において改変)のアルゴリズムである。少なくとも1つの実施態様では、「同一性%」は、同一の活性を有するタンパク質または同様のタンパク質をコードする、2つの配列内の対応する位置において同一である、アミノ酸またはヌクレオチドの数を指す。例えば、それぞれ100個の残基を有する2つのアミノ酸配列は、対応する位置におけるアミノ酸の95個が同一である場合、95%同一性を有する。同様に、それぞれ100個の残基を有する2つのアミノ酸配列は、対応する位置におけるアミノ酸の少なくとも90個が同一である場合、少なくとも90%の同一性を有する。同様に、それぞれ20個の残基を有する2つのアミノ酸配列は、対応する位置におけるアミノ酸の19個が同一である場合は95%同一性を有し、または、対応する位置におけるアミノ酸の少なくとも18個が同一である場合は90%同一性を有し、または、対応する位置におけるアミノ酸の少なくとも17個が同一である場合は85%同一性を有し、または、対応する位置におけるアミノ酸の少なくとも16個が同一である場合は80%同一性を有する。
さらに、本明細書において、配列が参照配列「と少なくともX%同一性」を有すると説明される場合、別段の指示がない限り、例えば、(X+1)%、(X+2)%、(X+3)%、(X+4)%など、X%よりも大きい100%までの全てのパーセンテージを含むことを意図する。
配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの別の例は、Myers&Miller(CABIOS(1988)4:11-17)のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、GCG配列アライメント・ソフトウェア・パッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)内に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを用いることができる。局所配列類似性およびアライメントの領域を同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、Pearson&Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85:2444-2448)において記載されるFASTAアルゴリズムである。
別のアルゴリズムは、WU-BLAST(Washington University BLAST)バージョン2.0ソフトウェア(いくつかのUNIXプラットフォームのためのWU-BLASTバージョン2.0実行可能プログラム)である。このプログラムは、WU-BLASTバージョン1.4に基づいており、それはパブリックドメインNCBI-BLASTバージョン1.4に基づいている(Altschul&Gish,1996,Local alignment statistics,Doolittle ed.,Methods in Enzymology 266,460-480;Altschul et al.,Journal of Molecular Biology 1990,215,403-410;Gish&States,Nature Genetics,1993、3:266-272;Karlin&Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5877;全て、参照により本明細書中に援用される)。
本明細書において他に言及されるものに加えて、BLAST、gapped BLAST、BLASTN、BLASTP、およびPSI-BLAST(国立生物工学情報センター(Bethesda,MD)によって提供される)のプログラムも参照される。これらのプログラムは、この目的のために当該分野において広く用いられ、2つのアミノ酸配列の相同領域を並べることができる。スイート内の全ての検索プログラムにおいて、ギャップ付きアライメントのルーチンは、データベース検索自体に統合される。ギャップ付けは必要に応じてオフにすることができる。長さ1のギャップに関するデフォルトのペナルティ(Q)は、タンパク質およびBLASTPについてはQ=9であり、BLASTNについてはQ=10であるが、任意の整数に変更してよい。デフォルトの、ギャップ伸長のための残基あたりのペナルティー(R)は、タンパク質およびBLASTPについてはR=2であり、BLASTNについてはR=10であるが、任意の整数に変更してよい。配列ギャップを最小限にしながらオーバーラップおよび同一性を最大限にするように配列を並べるために、QおよびRに関する値の任意の組み合わせを用いることができる。デフォルトのアミノ酸比較マトリックスはBLOSUM62であるが、PAMなどの他のアミノ酸比較マトリックスを使用することができる。
本明細書において用いられる用語「ポリヌクレオチド配列」または「核酸」は、ペプチドまたは融合タンパク質(またはポリペプチド)をコードする任意のポリヌクレオチド配列を含み、mRNAなどのRNAの形態、または、クローニングによって得られる、または化学合成技術によって生産される、またはそれらの組み合わせによる、例えばcDNAおよびゲノムDNAを含むDNAの形態のポリヌクレオチドを含む。DNAは、二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖DNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)であってよく、または、非コード鎖(アンチセンス鎖とも呼ばれる)であってよい。ペプチドまたは融合タンパク質をコードする、または治療的に効果的なそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド配列は、免疫原性が活性のペプチドまたは融合タンパク質をコードする限り、内因性コード配列のコード配列と実質的に同一であってよい。さらに、ペプチドまたは融合タンパク質は、遺伝子コードの縮退または対立遺伝子変異に起因してコドン使用頻度が異なるポリヌクレオチド配列(単数または複数)を用いて発現されてよい。さらに、本開示のペプチドおよび融合タンパク質およびそれらをコードする核酸は、さらなる置換(保存的または非保存的)を含むペプチド/タンパク質および核酸の変異体を含む。
例えば、免疫原性ペプチド変異体は、限定されないが、本明細書に開示される配列と全く同じではないが、本明細書中に挙げられる様々な配列に関して明確に記載される置換に加えて、本明細書において記載される変異体の活性または特性を実質的に損なわないアミノ酸残基のさらなる置換(保存的または非保存的)を有する変異体を含む。そのような保存的アミノ酸置換の例は、限定されないが:alaからgly、ser、またはthr;argからgln、his、またはlys;asnからasp、gln、his、lys、ser、またはthr;aspからasnまたはglu;cysからser;glnからarg、asn、glu、his、lys、またはmet;gluからasp、gln、またはlys;glyからproまたはala;hisからarg、asn、gln、またはtyr;ileからleu、met、またはval;leuからile、met、phe、またはval;lysからarg、asn、gln、またはglu;metからgln、ile、leu、またはval;pheからleu、met、trp、またはtyr;serからala、asn、met、またはthr;thrからala、asn、ser、またはmet;trpからpheまたはtyr;tyrからhis、pheまたはtrp;および、valからile、leu、またはmetを含んでよい。当業者は、そのような変異体を、作製し、同定し、選択し、または、1つまたは複数の疾患を引き起こす生物に対する免疫原性活性に関して試験する方法を容易に知っている。
用語「感染」、「形質導入」および「トランスフェクション」は本明細書において相互交換可能に用いられ、コードされるタンパク質産物が発現されるように細胞内に遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチド配列を導入することを指す。本開示のポリヌクレオチドは、さらなる配列、例えば、同一転写ユニット内のさらなるコード配列、制御エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、ポリアデニル化部位、同一または異なるプロモーターの制御下のさらなる転写ユニット、クローニング、発現、相同組み換え、および宿主細胞の形質転換を可能にする配列、および、本開示の実施態様を提供するのに望ましくあり得る任意のそのような構築物を含んでよい。
特定の実施態様では、本開示は、本明細書中に記載の1つまたは複数の融合ポリペプチドを発現することが可能な発現ベクターを含む。異なる細胞型のための発現ベクターは当技術分野でよく知られており、過度の実験を伴わずに選択することができる。一般に、融合ポリペプチドをコードするDNAは、発現ベクター、例えば(制限されないが)プラスミド内に、発現のために適切な方向および正しいリーディングフレームで挿入される。必要であれば、DNAは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてよいが、そのような制御は発現ベクターにおいて一般に利用可能である。それから、ベクターは、標準的な技術によって宿主内に導入される。ガイダンスは、例えば、Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY 2001))に見ることができる。
ワクチン内に含まれる各ペプチドの最適量および最適投与レジメンは、当業者によって過度の実験を伴わずに決定され得る。例えば(限定としてではないが)、ペプチドまたはその変異体は、静脈内(i.v.)注入、皮下(s.c.)注入、皮内(i.d.)注入、腹腔内(i.p.)注入、または筋肉内(i.m.)注入のために調製されてよい。DNA注入の特定の非限定的な経路は、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、および静脈内である。ペプチドは、実質的に純粋であってよく、または1つまたは複数の免疫刺激アジュバント(本明細書中の他のどこかに議論される)と組み合わせてよく、または、免疫刺激サイトカインと組み合わせて用いてよく、または、適切な送達システム、例えば(制限されないが)リポソームによって投与されてよい。アジュバントは、免疫応答(例えば、抗原に対してCTLおよびヘルパーT(TH)細胞によって仲介される免疫応答)を非特異的に強化または増強する物質であり、したがって、ワクチンとして用いた場合に本開示の組成物において有用であると考えられる。適切なアジュバントは、限定されないが:1018 ISS、アルミニウム塩、例えば、制限されないが、ミョウバン(硫酸アルミニウムカリウム)、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、または硫酸アルミニウム、Amplivax、AS15、BCG、CP-870、893、CpG7909、CyaA、Mologen’s dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、イミキモド、ImuFact IMP321、インターフェロン-αまたは-β、IS Patch、ISS、ISCOMs、Juvlmmune、LipoVac、MF59、モノホスホリル・リピドA、および他の非毒性LPS誘導体、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50/1、Montanide ISA-51、OK-432、およびOM-174を含む。
他の薬学的に適切なアジュバントの非限定的な例は、非毒性リピドA関連のアジュバント、例えば、非限定的な例として、非毒性モノホスホリル・リピドA(例えば、Persing et al.,Trends Microbial.10:s32-s37(2002)を参照)、例えば、3 De-0-アシル化モノホスホリル・リピドA(MPL)(例えば、イギリス特許出願番号GB2220211を参照)を含む。他の有用なアジュバントは、QS21およびQuilAを含み、それは、トリテルペングリコシドまたは南米に見られるQuillaja saponaria Molina treeの樹皮から単離されるサポニンを含む(例えば、Kensil et al.,in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell and Newman,Plenum Press,NY,1995);および米国特許番号5,057,540を参照)。他の適切なアジュバントの非限定的な例は、多量体または単量体アミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸またはポリリジン、リポソーム、およびCpGを含む(例えば、Klinman(Int.Rev.Immunol.(2006)25(3-4):135-54)、および米国特許番号7,402,572を参照)。本明細書中に開示される組成物において用いられ得るアジュバントの他の例は、限定されないが、米国特許番号8,8955,14に開示されるものを含む。
細胞傷害性T細胞(CTL)は、無傷の外来抗原自体よりむしろ、MHC分子(例えば、クラスIまたはII)に結合したペプチドの形態での抗原を認識する。MHC分子自体は、抗原提示細胞(APC)の細胞表面に位置する。したがって、CTLの活性化は、ペプチド抗原、MHC分子、およびAPCの三量体複合体が存在する場合にのみ可能である。それに相応して、本開示の特定の実施態様は、MHC分子を介して提示されたペプチドを有するAPCを含んでいる組成物を含む。
他の実施態様では、組成物は、糖類、糖アルコール類、アミノ酸、例えば、グリシン、アルギニン、グルタミン酸およびその他を、フレームワーク・フォーマーとして含んでよい。糖類は、単糖類、二糖類、または三糖類であってよい。これらの糖類は、単独および糖アルコール類と組み合わせて用いてよい。糖類の非限定的な例は、単糖類として、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトースまたはソルボース;二糖類として、ショ糖、ラクトース、マルトースまたはトレハロース;および、三糖類としてラフィノースを含む。糖アルコールは、例えば(限定としてではないが)、マンニトールおよび/またはソルビトールであってよい。さらに、組成物は、生理学的に十分許容性のある賦形剤、例えば、(制限されないが)アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤;フェノール、m-クレゾール、メチル-もしくはプロピルパラベン、クロロブタノール、チオメルサール(チメロサール)、または塩化ベンザルコニウムのような保存剤;および、可溶化剤、例えば、PEG3000、3350、4000もしくは6000などのポリエチレングリコール(PEG)、または、シクロデキストリン、例えば、ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン、スルホブチルエチル-シクロデキストリンまたはy-シクロデキストリン、または、デキストラン類またはポロキシマー類、例えば、ポロキシマー407、ポロキシマー188、Tween20またはTween80を含んでよい。
他の実施態様では、本開示は、(a)本明細書中に記載の1つまたは複数の医薬組成物を、溶液または凍結乾燥された形態で含むコンテナー;(b)凍結乾燥された製剤のための希釈剤または再構成溶液を含んでいる第2のコンテナー(任意選択);および(c)(i)溶液の使用または(ii)凍結乾燥された製剤の再構成および/または使用に関する説明書を含んでいてもよい、キットを含む。キットは、(iii)バッファー、(iv)希釈剤、(v)フィルター、(vi)針、または(vii)シリンジのうちの1つまたは複数をさらに含んでよい。コンテナーは(特定の、非限定的な実施態様では)、ボトル、バイアル、シリンジ、または試験管であり;多数回使用のコンテナーであってよい。コンテナーは、(制限されないが)ガラスまたはプラスチックのような様々な材料で形成されてよい。キットおよび/またはコンテナーは、再構成および/または使用のための指導を示すコンテナーに対するまたは関する説明書を含んでよい。例えば、ラベルは、凍結乾燥された製剤が上述のペプチド濃度に再構成されるべきであることを示してよい。ラベルは、製剤が皮下または筋肉内投与に有用であること、またはそれを意図することをさらに示してよい。製剤を保持しているコンテナーは、多数回使用のバイアルであってよく、再構成された製剤の繰り返しの投与(例えば、2~6回の投与)を可能にする。キットは、適切な希釈剤(例えば、炭酸水素ナトリウム溶液)を含んでいる第2のコンテナーをさらに備えてよい。キットは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書付きの添付文書を含む、工業上およびユーザの立場から望ましい他の材料をさらに含んでよい。
免疫原性ペプチド(および、融合ポリペプチド、二量体ペプチド、全長もしくは成熟タンパク質、または、タンパク質を発現している細菌)に特異的に結合する抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例えばIgG、IgE、IgM、IgD、またはIgAに属していてよい。本明細書中に記載の免疫原性ペプチドおよび融合ポリペプチドを特徴付けるために、ポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗体の使用が所望され得る。抗体は、動物、例えば、鳥類(例えば、ニワトリ)および哺乳類(限定されないが、マウス、ラット、チンチラ、ハムスター、ウサギ、他の齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、または他の霊長類を含む)から取得されてよく、またはそれらに由来してよい。本明細書中に記載されるように、ポリクローナル抗血清は、免疫原性ペプチド(単数または複数)、融合ポリペプチド(単数または複数)を含んでいる免疫原性組成物を用いて動物に免疫付与することによって、動物から取得される。
本明細書中に記載の免疫原性ペプチドまたは融合ポリペプチドに対して抗体が結合するレベルは、当業者によって日常的に実施される任意の1つまたは複数の免疫測定法を用いて容易に決定することができる。非限定的な例として、免疫測定法は、ELISA、イムノブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、および蛍光活性化セルソーティング(FACS)を含む。
任意の1つまたは複数の免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、またはそれらを含む免疫原性組成物を用いて免疫付与され得る非ヒト動物は、非限定的な例として:マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、フェレット、イヌ、ネコ、ラクダ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ニワトリ、ラマ、および非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル・マカク、チンパンジー、アカゲザル、オラウータン、およびヒヒ)を含む。非ヒト動物の免疫付与のために典型的に用いられるアジュバントは、限定されないが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、montanide ISA、Ribiアジュバント・システム(RAS)(GlaxoSmithKline,Hamilton,Mont.)、およびニトロセルロース吸着抗原を含む。一般に、最初の注入後、対象は、とりわけ、免疫原、アジュバント(あるならば)、および/または特定の対象種によって異なってよい特定の(制限されない)スケジュールに従って、1つまたは複数のブースター免疫付与を受ける。
動物対象において、免疫応答は、動物を定期的に出血させて、回収した血液から血清を分離して、免疫測定法、例えば(制限されないが)ELISAアッセイにおいて血清を分析して、特定の抗体力価を決定することによってモニターされ得る。十分な抗体力価が実証されたら、動物対象を定期的に出血させてポリクローナル抗血清を蓄積させてよい。それから、免疫原に特異的に結合するポリクローナル抗体が、当業者によって理解されるように、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって、適切な固体支持体上に固定化されたプロテインAまたはプロテインGを用いて、免疫の抗血清から精製され得る。アフィニティークロマトグラフィーが行なわれてよく、ここで特定の免疫付与された動物対象のIg定常領域に特異的な抗体が、適切な固体支持体上に固定化されている。アフィニティークロマトグラフィーは、1つまたは複数の免疫原性ペプチド、または融合タンパク質の使用を組み込んでもよく、そのことは、ポリクローナル抗体を、特定の免疫原性ペプチドに対するそれらの結合活性によって分けるのに有用であり得る。免疫原性ペプチドおよび/または融合タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、および所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生する不死の真核生物細胞株(例えば、ハイブリドーマ)はまた、例えば、Kohler and Milstein((Nature,256:495-97(1976);および、Eur.J.Immunol.6:511-19(1975))の技術およびそれに対する改良を用いて調製され得る。
本明細書中に記載の免疫原性組成物は、複数の免疫原性ペプチドおよび/または複数の融合ポリペプチドおよび/または担体分子に連結された免疫原性ペプチドを、少なくとも1つの薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせることによって製剤化されてよい。本明細書中に記載されるように、免疫原性組成物は、薬学的に適切なアジュバントをさらに含んでよい。典型的に、対象へ投与されることが意図される全ての免疫原性ペプチドまたは全ての融合ポリペプチドは、単一の免疫原性組成物において組み合わされ、それは、少なくとも1つの薬学的に許容できる賦形剤を含んでよく、少なくとも1つの薬学的に適切なアジュバントをさらに含んでよい。あるいは、例えば、複数の免疫原性組成物は、別個の投与のために別々に製剤化されてよく、それは、本明細書中に記載またはその他の当技術分野で知られている任意の経路によるものであってよく、連続的または同時的であってよい。
本明細書中に記載の免疫原性組成物は、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液、またはエマルションとして製剤化されてよく、それらは、本明細書中に記載のように、生理的に許容できる賦形剤(担体と呼んでもよい)および/または希釈剤を追加で含んでもよい。免疫原性組成物は、固体、液体、または気体(エアロゾル)の形態であってよい。あるいは、本明細書中に記載の免疫原性組成物は、凍結乾燥物(すなわち、凍結乾燥された組成物)として製剤化されてよく、または、当技術分野でよく知られている技術を用いてリポソーム内に封入されてよい。本明細書中の他のどこかに記載されるように、免疫原性組成物は、他の構成要素を含んでもよく、それは生物学的に活性または不活性であってよい。かかる構成要素は、限定されないが、バッファー(例えば、中性緩衝塩類またはリン酸緩衝塩類)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン)、マンニトール、タンパク質(例えばアルブミン)、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン、抗酸化剤、キレート剤、例えば、EDTAまたはグルタチオン、安定剤、色素、香料、懸濁剤、および/または防腐剤を含む。一般に、本明細書において議論されるように、賦形剤のタイプは、投与モードに基づき選択される。本明細書中に記載の組成物および製剤は、例えば(限定としてではなく):局所、口腔、舌、経口、鼻腔内、髄腔内、直腸、膣、眼球内、結膜下、経皮、舌下、または非経口投与を含む任意の適切な投与様式のために製剤化されてよい。
用量サイズは一般に、当該分野の慣例に従って決定されてよい。用量は、処置される対象の体重、重量、または血液容量に依存し得る。一般に、用量中に存在する本明細書中に記載の免疫原性ペプチド(単数または複数)、融合ポリペプチド(単数または複数)、および/または担体分子組成物(単数または複数)の量は、例えば(制限されないが)、約1μg~約100mg、約10μg~約50mg、約50μg~約10mgの範囲であり、5~50kgの対象に適切な用量を含む。ブースター免疫付与は、複数回(例えば、2回、3回、4回、またはそれよりも多く)、例えば、約2週~約26週の範囲の所望の時間間隔、例えば、約2、4、8、12、16、または26週の間隔で投与されてよい。異なる用量の間(例えば、一次用量と二次用量の間、または、二次用量と三次用量の間)の時間間隔は、同一でなくてよく、2つの用量の間の時間間隔は、独立に決定されてよい。治療的に有効量の本開示のペプチドまたは融合ポリペプチドの非限定的な実施態様は、一般に、約0.1μg/kg~約100mg/kg(活性物質の重量/対象の体重)を送達するのに十分な活性物質を含む。特に、組成物は、約0.5μg/kg~約50mg/kg、より具体的には約1μg/kg~約10mg/kgを送達する。
特定の実施態様では、本開示は、表1、表3、または表4に示されるペプチド群に記載されるアミノ酸配列、および/または、与えられた群内の前記ペプチド(単数または複数)と少なくとも80%、または少なくとも81%、または少なくとも82%、または少なくとも83%、または少なくとも84%、または少なくとも85%、または少なくとも86%、または少なくとも87%、または少なくとも88%、または少なくとも89%、または少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%同一性を有するそれらの変異アミノ酸配列または変異アミノ酸配列を有する、少なくとも1または2または3または4または5またはそれよりも多い(例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれよりも多い)異なるペプチド、および薬学的に許容できる担体を含んでいる、ペプチド組成物に関する。
ペプチドは、以下にさらに詳細に記載されるように、鎖状につながれ(concantenated)(ペプチド間のリンカー配列を用いてまたは用いずに連続してコンジュゲートされて1つまたは複数の融合ポリペプチドを形成する)、または、1つまたは複数の担体分子にコンジュゲートされてよい。例えば、ペプチドは、適切な担体分子、例えば、制限されないが、破傷風トキソイドタンパク質、ジフテリアトキソイドタンパク質、CRM197タンパク質、髄膜炎菌の外膜複合体、インフルエンザ菌プロテインD、百日咳毒素突然変異体、キーホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH)、オボアルブミン、および/またはウシ血清アルブミン(BSA)に、コンジュゲートまたは他の方法で連結されてよい。用いられ得る担体タンパク質の他の例は、限定されないが、米国特許出願公開2013/0072881、2013/0209503、および2013/0337006に開示されるものを含む。
特定の実施態様では、1つまたは複数の免疫原性ペプチドは、単一の融合ポリペプチドを含み、またはその中に含まれ、または、1つまたは複数の担体分子に連結される。さらなるペプチドは、第1の融合ポリペプチドを含んでいる組成物とは別個の融合ポリペプチドまたは担体分子内に提供されてもよい。特定の一実施態様では、融合ポリペプチドまたは担体分子は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11個の免疫原性ペプチドを含み、それらの少なくとも5個は互いに異なる。免疫原性ペプチドが融合ポリペプチド上に連結される順番は、本明細書中に記載および当該分野において日常的に実施される方法および技術を用いて当業者によって容易に決定され得て、したがって、順番は、それぞれの融合ポリペプチドの免疫原性の最適化を確実にするために過度の経験的な試行錯誤分析を必要としない。特定の実施態様では、融合ポリペプチドのアミノ末端における免疫原性ペプチドは、融合ポリペプチドのカルボキシ末端において繰り返される(すなわち、重複される)。かかる融合ポリペプチド(融合タンパク質)の形成の方法は、当業者に知られており;したがって、本明細書においてそれについて詳細な議論を含む必要はないと考えられる。しかしながら、融合ポリペプチドの形成のための非限定の例示的な方法は、米国特許番号8,697,085に示され、その全体は本明細書中に参照により明確に援用される。
さらに他の実施態様では、性質が異種である免疫原性ポリペプチドが開示される。異種とは、同一タンパク質上の異なる遺伝子座におけるペプチド領域の配列に由来する配列および/または、同一の株、種または生物内の異なるタンパク質に由来する配列を有するペプチドからなることを意味する。
本開示の実施態様は、以下の実施例および説明を参照することによってより容易に理解され、それらは上記のとおり、本開示の特定の態様および実施態様の単なる例示目的のために含まれており、限定を意図しない。以下の詳細な実施例および方法は、本開示の様々なペプチド、融合タンパク質、およびペプチドに連結された免疫原性担体分子の作製および使用方法を説明し、上記のとおり、単なる例示であり、どのような方法であっても本開示の限定ではないと解釈されるべきである。当業者は、本明細書中に記載の材料および手順から、適切なバリエーションを即座に認識する。
本明細書中に記載のように、細胞外/表面に露出した、配列が保存されたペプチドを融合ポリペプチドとして送達する手法は、他のワクチン手法に対していくつかの利点がある。第1に、ワクチンは、防御に寄与し得ない多くの領域からなる全体タンパク質の代わりに、防御に有用であるエピトープのみを含む。第2に、これらのワクチンは、実践的な送達システムを同時に用いながら、多くのタンパク質を標的化する。例えば、B.pertussisに対して本明細書中に記載されるように試験された2つのポリペプチド、Bp Poly 1およびBp Poly 3は、21個のエピトープ(13個のタンパク質由来)および30個のエピトープ(12個のタンパク質)をそれぞれ標的化する。このことは、防御有効性(標的の数が大きいこと)、および、ワクチンを遺伝学的にエスケープする突然変異体の選択の防止の両方に重要であり得る。
ペプチド単独では、信頼性のある免疫原性であるためには小さすぎる。対照的に、ポリペプチドは免疫原性である。このことは、自己担体として機能する融合ペプチドを除きペプチドを担体タンパク質に付着させることに機能的に似ている。さらに、線形ポリペプチドの製造は単純かつ安価である。
実施例1:抗原の設計
標的となる生物の全ての単離株にわたる推定のワクチン構成要素の存在および保存は、成功的なワクチンの開発にとって必要条件である。したがって、百日咳菌感染のような疾患の予防のための、保存された抗原性標的を探す。はじめに、複数の生物情報学解析ツールを用いて、B.pertussis Tohama株の推定の表面露出タンパク質(SEP)の補体を同定してよく、本質的に、インフルエンザ菌に関して以前に記載されたとおりである(Whitby et al 2015,PLoS One e0136867)。Tohama株のSEP補体が同定されているので、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST;blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいて利用可能)を用いて、公共データベースにおいて利用可能な全ての完全にシーケンシングされたB.pertussis単離株におけるそれぞれのSEPの存在または不存在を決定することができる。この様式で、B.pertussisの全ての株にわたって保存された全てのSEPが同定された。
標的となる生物の全ての単離株にわたる推定のワクチン構成要素の存在および保存は、成功的なワクチンの開発にとって必要条件である。したがって、百日咳菌感染のような疾患の予防のための、保存された抗原性標的を探す。はじめに、複数の生物情報学解析ツールを用いて、B.pertussis Tohama株の推定の表面露出タンパク質(SEP)の補体を同定してよく、本質的に、インフルエンザ菌に関して以前に記載されたとおりである(Whitby et al 2015,PLoS One e0136867)。Tohama株のSEP補体が同定されているので、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST;blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいて利用可能)を用いて、公共データベースにおいて利用可能な全ての完全にシーケンシングされたB.pertussis単離株におけるそれぞれのSEPの存在または不存在を決定することができる。この様式で、B.pertussisの全ての株にわたって保存された全てのSEPが同定された。
同定されたB.pertussisの保存されたSEPを個々に試験して、TheProtein Model Portal(www.proteinmodelportal.org/)によって利用可能なモデリング・アルゴリズムを用いて他の公知の構造的に定義されたタンパク質に対する相同性を決定した。生じた構造を、Chimeraを用いて比較および可視化して、潜在的に表面が露出した領域を同定した。
生産されたタンパク質モデルから、25アミノ酸長よりも大きな予測表面露出領域を選択した。多数の配列アライメントを、それぞれのコアタンパク質について行なった。それぞれの個々のSEPに関する全ての利用可能なB.pertussisタンパク質配列を用いて、これらのアライメントを行なった;アライメントを用いて、それぞれの予測表面露出領域の配列保存を確認した。種にわたってアミノ酸レベルで100%保存を有する表面露出領域を、さらなる試験のための潜在的なペプチド抗原として選択した。
これらの保存された表面露出ペプチドのサブセットを連続して連結して、3つの個々のポリペプチドを生産した。連結は、選択されたペプチドのそれぞれを順にコードして第1のペプチドが末端で繰り返されている人工DNAフラグメントを合成することによって達成された(Thermo Fisher Scientific)。人工DNAフラグメントを、発現ベクターpET100内に挿入して、コードされたポリペプチドの誘導型の発現を可能にし、発現ポリペプチドの金属アフィニティー精製を容易にするためにポリヒスチジン-タグを追加で組み込んだ。
本明細書において用いられるポリペプチド「BpPoly1」は、13個のB.pertussisタンパク質由来の21個の固有のペプチドを含み、99kDaの理論分子量を有する。また、本明細書において用いられるポリペプチド「BpPoly3」は、12個のタンパク質由来の30個の固有のペプチドを含み、99kDaの分子量である。
[ポリペプチドの精製]
ポリペプチドをコードするプラスミド構築物を、E.coli BL21 Star(DE3)内に形質転換した。E.coli培養物を、振とうしながら600nmでOD=0.5~0.7まで増殖させて、そのODにおいて、1mM IPTGの添加によって誘導した。IPTGの添加の後に、培養物を振とうしながら4時間インキュベートして、その時点で、細胞を遠心分離によって回収して、その後の精製手順のために凍結させた。
ポリペプチドをコードするプラスミド構築物を、E.coli BL21 Star(DE3)内に形質転換した。E.coli培養物を、振とうしながら600nmでOD=0.5~0.7まで増殖させて、そのODにおいて、1mM IPTGの添加によって誘導した。IPTGの添加の後に、培養物を振とうしながら4時間インキュベートして、その時点で、細胞を遠心分離によって回収して、その後の精製手順のために凍結させた。
解凍された細胞ペレットを、200μg/mlのリゾチームおよび50ユニット/mlのbenzonaseを含んでいるCelLyticB(10ml/細胞のグラム)中に再懸濁して、1時間室温でインキュベートした。16,000gで15分間遠心分離した後に、ペレットを、グアニジン溶解バッファー中に、振動させながら1時間室温で再懸濁させた。2回目の同一の遠心分離後、上清を、平衡化されたNi精製カラムに対する適用のために保存した。3回の洗浄後、Niカラムに結合したポリペプチドを標準的なプロトコルによって溶出させて、1mlの画分を回収した。精製されたポリペプチドの純度をSDS-PAGEによって評価して、>90%の純度を有する画分を、その後(downstream)の使用のために選択した。
[マウスの免疫付与]
12匹または24匹のナイーブ雌BALB/cマウス(4~6週齢)のグループを、0、14、および28日目に、ミョウバンアジュバント(AdjuPhos;Invivogen)に結合された10μgの精製ポリペプチドおよび2μgのモノホスホリルリピドA(MPLA;Sigma)で筋肉内に免疫付与した。コントロール群は、AdjuPhosおよびMPLAのみで免疫付与された。それぞれの免疫付与の前および最終の免疫付与の20日後に、マウスを出血させて、ELISAによる抗体力価の決定のために血清を得た。
12匹または24匹のナイーブ雌BALB/cマウス(4~6週齢)のグループを、0、14、および28日目に、ミョウバンアジュバント(AdjuPhos;Invivogen)に結合された10μgの精製ポリペプチドおよび2μgのモノホスホリルリピドA(MPLA;Sigma)で筋肉内に免疫付与した。コントロール群は、AdjuPhosおよびMPLAのみで免疫付与された。それぞれの免疫付与の前および最終の免疫付与の20日後に、マウスを出血させて、ELISAによる抗体力価の決定のために血清を得た。
[マウスの感染]
49日目に、軽く麻酔したマウスに、20μlのPBS中およそ3,000CFUのB.pertussis Tohama株を鼻腔内に曝露した。12匹のマウスのコホートから6匹のマウスを、感染後3日目および7日目にそれぞれ安楽死させた。24匹のマウスのコホートについては、6匹のマウスを、感染後3日目、7日目、10日目および14日目にそれぞれ安楽死させた。肺および気管を、全ての安楽死マウスから無菌的に摘出して、PBS中でホモジナイズし、プレーティングして、存在する合計細菌を数え上げた。
49日目に、軽く麻酔したマウスに、20μlのPBS中およそ3,000CFUのB.pertussis Tohama株を鼻腔内に曝露した。12匹のマウスのコホートから6匹のマウスを、感染後3日目および7日目にそれぞれ安楽死させた。24匹のマウスのコホートについては、6匹のマウスを、感染後3日目、7日目、10日目および14日目にそれぞれ安楽死させた。肺および気管を、全ての安楽死マウスから無菌的に摘出して、PBS中でホモジナイズし、プレーティングして、存在する合計細菌を数え上げた。
[統計]
肺内の合計細菌カウントを、ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定を用いてグループ間で比較した。図1~図3を参照。それぞれのBpポリペプチドの免疫原性を12匹のマウスにおいて分析して、精製されたポリペプチドに結合する抗体の血清力価を定量化した。抗-Bpポリペプチド抗体力価は、それぞれのBpポリペプチドに対して全てのマウスにおいて増大し、それぞれのBpが全てのマウスにおいて免疫原性であることが示された(以下の表1および表2を参照)。免疫付与後の抗体力価は、Bp Poly1について1/200~1/51,200の範囲であり、Bp Poly3について1/12,800~1/204,800であった。免疫前の血清のELISAシグナルはバックグラウンドと同様であった。
肺内の合計細菌カウントを、ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定を用いてグループ間で比較した。図1~図3を参照。それぞれのBpポリペプチドの免疫原性を12匹のマウスにおいて分析して、精製されたポリペプチドに結合する抗体の血清力価を定量化した。抗-Bpポリペプチド抗体力価は、それぞれのBpポリペプチドに対して全てのマウスにおいて増大し、それぞれのBpが全てのマウスにおいて免疫原性であることが示された(以下の表1および表2を参照)。免疫付与後の抗体力価は、Bp Poly1について1/200~1/51,200の範囲であり、Bp Poly3について1/12,800~1/204,800であった。免疫前の血清のELISAシグナルはバックグラウンドと同様であった。
実施例2:B.pertussisのための細菌ワクチンポリペプチド(BVP)に関するペプチド選択基準としての転写レベル(mRNA)。
我々の初期の研究において、B.pertussisを標的化する推定のワクチンペプチドは、以下の基準に基づいて選択された:1)利用可能なB.pertussisゲノムを用いた表面露出タンパク質(SEP)の種で保存されたコアの同定。これらは、外膜内に埋め込まれた分泌および表面露出タンパク質ならびにペリプラズム間隙内に位置するタンパク質を含む(後者は、表面上およびペリプラズム内の両方に可変的に発現されるので);2)配列保存(各タンパク質の多配列アライメントの分析に基づく);3)コアタンパク質の表面露出(三次元構造および潜在的に表面露出した残基を決定するためのインシリコ・モデリングに基づく)。これらの基準を用いて、≧20アミノ酸残基長である、およそ150個のペプチドのプールを、B.pertussisに関して同定した。これらから、単一の細菌ワクチンポリペプチド(BVP)が、ペプチドの無作為の類別によって以前に設計された。このBVP(Bp Poly 1)は、マウス肺モデルにおいて有意に防御的であることが示された(データ示さず)。
我々の初期の研究において、B.pertussisを標的化する推定のワクチンペプチドは、以下の基準に基づいて選択された:1)利用可能なB.pertussisゲノムを用いた表面露出タンパク質(SEP)の種で保存されたコアの同定。これらは、外膜内に埋め込まれた分泌および表面露出タンパク質ならびにペリプラズム間隙内に位置するタンパク質を含む(後者は、表面上およびペリプラズム内の両方に可変的に発現されるので);2)配列保存(各タンパク質の多配列アライメントの分析に基づく);3)コアタンパク質の表面露出(三次元構造および潜在的に表面露出した残基を決定するためのインシリコ・モデリングに基づく)。これらの基準を用いて、≧20アミノ酸残基長である、およそ150個のペプチドのプールを、B.pertussisに関して同定した。これらから、単一の細菌ワクチンポリペプチド(BVP)が、ペプチドの無作為の類別によって以前に設計された。このBVP(Bp Poly 1)は、マウス肺モデルにおいて有意に防御的であることが示された(データ示さず)。
ペプチドの選択をさらに改良するために、我々は、全RNAトランスクリプトーム試験において遺伝子特異的なmRNAの相対存在量を試験して、高レベルの転写(一般に、細菌内で生産されるタンパク質の量と相関する)が、防御的な標的を同定するための有用な基準であり得るかどうかを決定した。かかる手法はいくつかの利点がある。公共データベースは、多くの病原体に関する多くのトランスクリプトーム試験を含む。RNA-seqの出現によって、データは高品質であり、全RNAプロファイルを正確に反映する。RNA-seqはまた、より多くの量のスタート細菌を必要とする昔のミクロアレイデータとは異なり、小さなサンプルサイズを可能にする。したがって、今では、定量的な転写データに関する複数のソースが存在し、場合により重要なワクチンペプチド基準のアベイラビリティを高める。この基準を調べるために、我々は、上記基準を有し低レベル転写を有する遺伝子に由来するペプチドを用いてポリペプチド(Bp Poly 100)を設計した。我々はまた、上記基準を有し高レベル転写を有する遺伝子に由来するペプチドを用いてポリペプチド(Bp Poly 101)を設計した。それぞれのポリペプチドを精製して、それらの防御能力を百日咳のマウスモデルにおいて比較した。
[Bp Poly 100およびBp Poly 101の設計]
転写レベルが防御的ペプチドの選択に有用であり得るかどうか試験するために、Bp Poly 100およびBp Poly 101を、定量的mRNAによって示されるトランスクリプトームデータに基づくワクチンペプチドの選択の優先順位付けの最終ステップを用いて設計した。我々は、de Gouwら1による公に利用可能なデータを、B.pertussisトランスクリプトームの相対的mRNA存在量とともに用いて、同定されたそれぞれのタンパク質の個々の相対存在量を分析した。SEP遺伝子の我々が定義したコアを用いて、それぞれの個々の相対存在量(RA)を、de Gouwら1のデータに基づいて決定した。市販されるB.pertussisワクチン中のタンパク質は除外した。mRNAのRAが最も低い(29~374の範囲の値)タンパク質由来のペプチドを、Bp Poly 100内に取り込んだ。mRNAのRAが最も高い(11,819~47,656の範囲の値)タンパク質由来のペプチドを、Bp101内に取り込んだ(図6および図7を参照)。de Gouwらによって決定されるmRNAのRAの全体的な範囲は、最大限に発現される分泌タンパク質、ptxAに関して0~52,549である。Bp Poly 100およびBp Poly 101をコードするDNAを、精製を容易にするためにHisタグの下流に、pET100発現ベクター内へ独立に組み込んだ。それぞれのポリペプチドを、標準的なニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
転写レベルが防御的ペプチドの選択に有用であり得るかどうか試験するために、Bp Poly 100およびBp Poly 101を、定量的mRNAによって示されるトランスクリプトームデータに基づくワクチンペプチドの選択の優先順位付けの最終ステップを用いて設計した。我々は、de Gouwら1による公に利用可能なデータを、B.pertussisトランスクリプトームの相対的mRNA存在量とともに用いて、同定されたそれぞれのタンパク質の個々の相対存在量を分析した。SEP遺伝子の我々が定義したコアを用いて、それぞれの個々の相対存在量(RA)を、de Gouwら1のデータに基づいて決定した。市販されるB.pertussisワクチン中のタンパク質は除外した。mRNAのRAが最も低い(29~374の範囲の値)タンパク質由来のペプチドを、Bp Poly 100内に取り込んだ。mRNAのRAが最も高い(11,819~47,656の範囲の値)タンパク質由来のペプチドを、Bp101内に取り込んだ(図6および図7を参照)。de Gouwらによって決定されるmRNAのRAの全体的な範囲は、最大限に発現される分泌タンパク質、ptxAに関して0~52,549である。Bp Poly 100およびBp Poly 101をコードするDNAを、精製を容易にするためにHisタグの下流に、pET100発現ベクター内へ独立に組み込んだ。それぞれのポリペプチドを、標準的なニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
[Bp Poly 100対Bp Poly 101の防御]
百日咳のマウスモデルにおける防御に関するBp Poly 100対Bp Poly 101の試験を、当該分野において以前に確立されたとおり2に行なった。3つのグループ内のそれぞれのマウスは、アジュバント(ミョウバン+mPLA)単独、アジュバントと10μgのBp Poly 100、または、アジュバントと10μgのBp Poly 101を、免疫付与あたり受け取った。免疫付与は、T-0、T-2週、およびT-4週において行われた。3週後、20uL PBS中7.9E+03 CFUのB.pertussis Tohama I株を経鼻吸引によって動物に感染させた。感染後、3、7、および10日目に、動物のサブグループを屠殺して、ホモジナイズした肺を定量的に培養した。
百日咳のマウスモデルにおける防御に関するBp Poly 100対Bp Poly 101の試験を、当該分野において以前に確立されたとおり2に行なった。3つのグループ内のそれぞれのマウスは、アジュバント(ミョウバン+mPLA)単独、アジュバントと10μgのBp Poly 100、または、アジュバントと10μgのBp Poly 101を、免疫付与あたり受け取った。免疫付与は、T-0、T-2週、およびT-4週において行われた。3週後、20uL PBS中7.9E+03 CFUのB.pertussis Tohama I株を経鼻吸引によって動物に感染させた。感染後、3、7、および10日目に、動物のサブグループを屠殺して、ホモジナイズした肺を定量的に培養した。
[結果]
[Bp Poly 101(高レベル転写)は、Bp Poly 100(低レベル転写)よりも防御的であった。]
mRNA転写量が、BVP内に含めるためのペプチド間の選択において有用であり得るかどうかを試験するために、2つのBVPを設計して比較した。Bp Poly 100は、低レベルmRNAを有する遺伝子によってコードされるタンパク質内のペプチドから構成され、Bp Poly 101は、高レベルmRNAを有する遺伝子によってコードされるタンパク質内のペプチドから構成された。防御を、百日咳のマウスモデルにおいて比較した。図7は、感染後3、7、および10日目の、ホモジナイズしたマウス肺の定量的培養の結果を示す。表は、データの統計分析から得たp値を示す。
[Bp Poly 101(高レベル転写)は、Bp Poly 100(低レベル転写)よりも防御的であった。]
mRNA転写量が、BVP内に含めるためのペプチド間の選択において有用であり得るかどうかを試験するために、2つのBVPを設計して比較した。Bp Poly 100は、低レベルmRNAを有する遺伝子によってコードされるタンパク質内のペプチドから構成され、Bp Poly 101は、高レベルmRNAを有する遺伝子によってコードされるタンパク質内のペプチドから構成された。防御を、百日咳のマウスモデルにおいて比較した。図7は、感染後3、7、および10日目の、ホモジナイズしたマウス肺の定量的培養の結果を示す。表は、データの統計分析から得たp値を示す。
どの日においても、コントロール群と比較したBp Poly 100を受け取った群由来の細菌量の間に有意差はなかった。対照的に、Bp Poly 101を受け取った群から単離された細菌数は、10日目および14日目において、コントロール群よりも有意に少なかった。同様に、Bp Poly 101を受け取った群から単離された細菌数は、3、10、および14日目において、Bp Poly 100を受け取った群よりも有意に少なかった。
[結論]
データは、高レベル転写を有する遺伝子によってコードされるタンパク質由来のペプチドからなるBp Poly 101は、それぞれの時点で、コントロール群(アジュバントのみ)または低レベル転写を有する遺伝子によってコードされるタンパク質由来のペプチドからなるHi Poly 100よりも有意に良い防御を示したことを示している。以前の研究により、種全体にわたって存在するタンパク質内のペプチド、保存された配列、およびインシリコに基づく表面露出が示された。
データは、高レベル転写を有する遺伝子によってコードされるタンパク質由来のペプチドからなるBp Poly 101は、それぞれの時点で、コントロール群(アジュバントのみ)または低レベル転写を有する遺伝子によってコードされるタンパク質由来のペプチドからなるHi Poly 100よりも有意に良い防御を示したことを示している。以前の研究により、種全体にわたって存在するタンパク質内のペプチド、保存された配列、およびインシリコに基づく表面露出が示された。
実施例3:Hi Poly 1に対する抗血清は、種の代表的なインフルエンザ株に結合する。
我々は、種内の全ての株に存在するペプチド、保存された配列、および、インシリコ・タンパク質構造解析に基づく表面露出の選択に基づく、細菌ワクチンポリペプチド(BVP)方法論を提案した。インフルエンザ菌を用いて、我々は、菌血症の幼ラットモデルにおいて個々に防御的であるペプチドのサブグループを選択した。免疫原性を高めるために、ペプチドはポリペプチド内に連結して提供される。
我々は、種内の全ての株に存在するペプチド、保存された配列、および、インシリコ・タンパク質構造解析に基づく表面露出の選択に基づく、細菌ワクチンポリペプチド(BVP)方法論を提案した。インフルエンザ菌を用いて、我々は、菌血症の幼ラットモデルにおいて個々に防御的であるペプチドのサブグループを選択した。免疫原性を高めるために、ペプチドはポリペプチド内に連結して提供される。
多重標的化設計のため、ポリペプチドは、種内の全ての株に結合する抗体を刺激することが期待される。抗体の結合範囲を経験的に分析するために、我々は、生細胞ELISAにおいて、種の幅を表わすことが以前に特徴付けられた株を用いた。
[材料および方法]
[インフルエンザ菌株。]Musserらは、数多くのインフルエンザ菌株の遺伝子を多遺伝子座酵素電気泳動によって以前に特徴付けた。我々は、種の遺伝的な幅が代表的であるMusser株の9つを試験した。OMを有する子どもから単離された無莢膜型の株は、HI1371、HI1375、HI1380、HI1387、HI1392、HI1397、HI1403、HI1417、およびHI1425であった。我々は、2つの被包性のb型株、E1AおよびHI0693も試験した。
[インフルエンザ菌株。]Musserらは、数多くのインフルエンザ菌株の遺伝子を多遺伝子座酵素電気泳動によって以前に特徴付けた。我々は、種の遺伝的な幅が代表的であるMusser株の9つを試験した。OMを有する子どもから単離された無莢膜型の株は、HI1371、HI1375、HI1380、HI1387、HI1392、HI1397、HI1403、HI1417、およびHI1425であった。我々は、2つの被包性のb型株、E1AおよびHI0693も試験した。
[細菌増殖。]単離株を、バシトラシンを含むチョコレート寒天上で37℃にて慣例的に維持した。インフルエンザ菌のブロス培養物を、10μg/mlのヘムおよび10μg/mlのβ-NADで補充されたブレインハートインフュージョン(BHI)寒天(補充BHI;sBHI)中で増殖させた。
[抗-Hi Poly 1抗血清の産生。]Hi Poly 1を、ニッケルクロマトグラフィーによって精製して、ミョウバンに吸着させて(1:1)、ラットにおいて抗-血清を産生させるための免疫原として用いた。免疫付与の前に、それぞれの動物から血液を採取した(免疫前血清、PIS)。3用量のHi Poly 1を2週間隔で投与して、抗BVP Hi Poly 1免疫後血清(BVPS)を最終の免疫付与の3週後に回収した。血清サンプルを熱不活化させて、-80℃で保管した。
[生細胞ELISA。]インフルエンザ菌の生培養物を全細胞ELISAにおいて用いた。一晩の細菌懸濁液を希釈してOD600=0.05を得て、100μlを、コーニングの高結合96ウェルプレートのウェルに添加した。プレートを穏やかに遠心分離して、4℃で4時間、細胞を付着させた。インキュベーション後、上清を吸引して、付着した細菌を洗浄して、一次抗体としてラット免疫前血清(PIS)または免疫後血清(BVPS)のいずれかとともにインキュベートした。一次抗体の付着を、製造元によって指導されるとおりにHRP-コンジュゲートヤギ-抗-ラット抗血清を用いて検出した。結合した二次抗体を、100μlのTMBの添加によって定量化して、プレートをA450で読み取った。それぞれのアッセイを三重で行ない、値を平均した。
[統計。]それぞれの単離株に関する、対応する(matched)免疫前および免疫後の血清に由来する平均吸光度の値を、スチューデントのT検定を用いて比較した。
[結果]
結果(図8)は、免疫前血清において、抗体の結合に由来する吸光度が、0.20~0.75の範囲であったことを示す。免疫後抗血清における、抗体の結合に由来する吸光度は、0.375~1.658であった。試験された12個のHI単離株のそれぞれについて、免疫後抗血清(BVPS)を用いた結果は、対応する(matched)免疫前血清(PIS)を用いた結果よりも高かった。それぞれの株で、PISとBVPSの吸光度の間の違いは、統計的に有意であった(p<0.05)。
結果(図8)は、免疫前血清において、抗体の結合に由来する吸光度が、0.20~0.75の範囲であったことを示す。免疫後抗血清における、抗体の結合に由来する吸光度は、0.375~1.658であった。試験された12個のHI単離株のそれぞれについて、免疫後抗血清(BVPS)を用いた結果は、対応する(matched)免疫前血清(PIS)を用いた結果よりも高かった。それぞれの株で、PISとBVPSの吸光度の間の違いは、統計的に有意であった(p<0.05)。
[結論]
BVP方法論は、連結されたペプチドが、種にわたる存在、配列保存、および、インシリコ・タンパク質構造解析に基づく表面露出を含む重要なワクチンの特徴によって明確に同定されたペプチドを送達するのに有用であり得ることを提案する。受動的な(抗体)防御を誘導するペプチドの同定は、連結されたペプチドが、種の代表的な株に結合する抗体を誘導するという仮説を経験的に試験する機会を提供した。免疫後の抗Hi Poly 1抗血清において有意により高い結合を示している我々のデータは、この仮説を支持する。被包性のb型株に対する免疫後抗血清の有意により高い結合の存在は、b型株および無莢膜型の両方のインフルエンザ菌に対して防御するワクチンとしてのHi Poly 1の興味深い可能性を高める。これらのデータは、細菌ワクチンポリペプチド方法論の有用性を支持し、Hi Poly 1をワクチン候補として支持する。
BVP方法論は、連結されたペプチドが、種にわたる存在、配列保存、および、インシリコ・タンパク質構造解析に基づく表面露出を含む重要なワクチンの特徴によって明確に同定されたペプチドを送達するのに有用であり得ることを提案する。受動的な(抗体)防御を誘導するペプチドの同定は、連結されたペプチドが、種の代表的な株に結合する抗体を誘導するという仮説を経験的に試験する機会を提供した。免疫後の抗Hi Poly 1抗血清において有意により高い結合を示している我々のデータは、この仮説を支持する。被包性のb型株に対する免疫後抗血清の有意により高い結合の存在は、b型株および無莢膜型の両方のインフルエンザ菌に対して防御するワクチンとしてのHi Poly 1の興味深い可能性を高める。これらのデータは、細菌ワクチンポリペプチド方法論の有用性を支持し、Hi Poly 1をワクチン候補として支持する。
実施例3:無莢膜型インフルエンザ菌に対して防御的な細菌ワクチンポリペプチドの作製方法
NTHiは、重大な公衆衛生負荷およびワクチン開発のための適切な標的のままである。
様々なNTHi表面タンパク質が、ワクチン候補として提案されている。これらのタンパク質の1つであるプロテインDは、臨床試験において試験されて、NTHi OMの予防においておよそ35%効果的であることが分かり、ヨーロッパで市販されている。その相対的に低い有効性に加えて、プロテインDはまた、NTHiの全ての臨床単離株において存在するものではない。したがって、複数の標的を用いた手法を含む、NTHiワクチンに対する他の手法を検討すべきである。
NTHiは、重大な公衆衛生負荷およびワクチン開発のための適切な標的のままである。
様々なNTHi表面タンパク質が、ワクチン候補として提案されている。これらのタンパク質の1つであるプロテインDは、臨床試験において試験されて、NTHi OMの予防においておよそ35%効果的であることが分かり、ヨーロッパで市販されている。その相対的に低い有効性に加えて、プロテインDはまた、NTHiの全ての臨床単離株において存在するものではない。したがって、複数の標的を用いた手法を含む、NTHiワクチンに対する他の手法を検討すべきである。
ワクチンとしての全長タンパク質の代替として、我々は、ゲノムの生物情報学とインシリコ・構造予測を統合してNTHiの表面をマッピングして、配列が保存された、複数のゲノム遺伝子座によってコードされたタンパク質の表面露出領域(ペプチド)を同定する、新規の方法を提案する。受動的な防御の証拠を、表面の露出および抗体のアクセス可能性を確認するさらなる選択基準として用いた。
残念なことに、ペプチドを細菌ワクチンとして使用する以前の試みは成功していない。ワクチンにおけるペプチドの使用に対する1つの一般的な壁は、配列の保存がないことである(例えば線毛ワクチン)。したがって、線毛ペプチドワクチンは、相同株に対して効果的であり、非相同の線毛を有する同一種の別の株に対しては効果的でない。提案されるペプチドワクチンにおける配列保存の不存在に加えて、ペプチドの小さなサイズは、より低い免疫原性と相関する。最も小さな市販ワクチンは、24KDaの肝炎B表面抗原(HBsAG)であり、より小さなペプチドは通常、前臨床試験において免疫原性のために担体に連結される。
これらの問題を対処するために、我々は、複数のゲノム遺伝子座由来の、連結された、配列が保存された、表面露出ペプチドからなるBVPが、免疫原性であり、中耳炎の確立された動物モデルにおいて生物学的に効果的であるという仮説を立てた。したがって、我々は、個々に生物学的に効果的であることが示されたペプチドからNTHiワクチンポリペプチドHi Poly 1を設計し、免疫原性、菌血症の幼ラットモデルにおける防御、および、OMのチンチラ(Chinchilla lanigera)モデルにおける有効性についてHi Poly 1を試験した。
[材料および方法。]
[細菌株および増殖条件]
NTHi株R2866は、OMの後に髄膜炎の臨床徴候を有する免疫適格性の子どもの血液から単離されて特徴付けられた(Arnold Smith[21])。我々は、侵襲性のインフルエンザ菌疾患の幼ラットモデルにおいて、この株を以前に使用している。中耳炎のチンチラ(Chinchilla lanigera)モデルにおいて用いられたNTHi株86-028NPは、Columbus小児病院において慢性中耳炎のために鼓膜切開術および挿入管を受けた小児科患者由来の最小限に継代培養された臨床単離株である。86-028NP株は、OMのチンチラ・モデルにおいて広く特徴付けられている。我々および他の研究者らは、チンチラにおけるNTHiの病原性に関する非常に多くの研究において、この単離株を以前に用いている。インフルエンザ菌の単離株は、バシトラシンを含むチョコレート寒天上で37℃にて慣例的に維持された。インフルエンザ菌のブロス培養を、10μg/mlのヘムおよび10μg/mlのβ-NADで補充されたブレインハートインフュージョン(BHI)寒天(補充BHI;sBHI)中で増殖させた。
[細菌株および増殖条件]
NTHi株R2866は、OMの後に髄膜炎の臨床徴候を有する免疫適格性の子どもの血液から単離されて特徴付けられた(Arnold Smith[21])。我々は、侵襲性のインフルエンザ菌疾患の幼ラットモデルにおいて、この株を以前に使用している。中耳炎のチンチラ(Chinchilla lanigera)モデルにおいて用いられたNTHi株86-028NPは、Columbus小児病院において慢性中耳炎のために鼓膜切開術および挿入管を受けた小児科患者由来の最小限に継代培養された臨床単離株である。86-028NP株は、OMのチンチラ・モデルにおいて広く特徴付けられている。我々および他の研究者らは、チンチラにおけるNTHiの病原性に関する非常に多くの研究において、この単離株を以前に用いている。インフルエンザ菌の単離株は、バシトラシンを含むチョコレート寒天上で37℃にて慣例的に維持された。インフルエンザ菌のブロス培養を、10μg/mlのヘムおよび10μg/mlのβ-NADで補充されたブレインハートインフュージョン(BHI)寒天(補充BHI;sBHI)中で増殖させた。
大腸菌単離株BL21(De3)をLB寒天上で慣例的に維持して、プラスミドpHiPoly1によって形質転換された単離株を、50μg/mlのカルベニシリンで補充されたLB寒天上で維持した。
[Hi Poly 1の設計]
我々は以前に、Hel1、HxuC1、HxuC2、およびHel2を含む特定のNTHi候補ワクチンペプチドについて、それらの、1)それぞれの試験されたゲノムにおける存在;2)構造解析に基づく表面露出;3)配列保存;および4)菌血症の幼ラットモデルにおける抗体防御の誘導に基づいた選択に関する方法論を報告した[17]。同じ方法論に従って、我々は、菌血症の幼ラットモデルにおいて防御を示す(データ示さず)、NucA-1、BamA-3、Lpte-2、Lpte-4およびNlpI-2を含む他のペプチド候補を同定した。細菌ワクチンポリペプチド、Hi Poly 1を、両末端に免疫プロセスを高めるためのペプチドBamA-3およびN末端の6Hisタグを有する9個のペプチドの連続したアセンブリとして設計した(図9)。
我々は以前に、Hel1、HxuC1、HxuC2、およびHel2を含む特定のNTHi候補ワクチンペプチドについて、それらの、1)それぞれの試験されたゲノムにおける存在;2)構造解析に基づく表面露出;3)配列保存;および4)菌血症の幼ラットモデルにおける抗体防御の誘導に基づいた選択に関する方法論を報告した[17]。同じ方法論に従って、我々は、菌血症の幼ラットモデルにおいて防御を示す(データ示さず)、NucA-1、BamA-3、Lpte-2、Lpte-4およびNlpI-2を含む他のペプチド候補を同定した。細菌ワクチンポリペプチド、Hi Poly 1を、両末端に免疫プロセスを高めるためのペプチドBamA-3およびN末端の6Hisタグを有する9個のペプチドの連続したアセンブリとして設計した(図9)。
[Hi Poly 1の精製]
発現ベクターを、Invitrogenによって商業的に製造して、Hi Poly 1ポリペプチドを発現させた。構築物をコードするDNAを、E.coliに関して最適化して、合成して、pET100発現ベクターのHisタグの下流への挿入の前に正しい配列を確認した。プラスミド構築物(pHiPoly1)を、E.coli BL21(De3)内に形質転換して、形質転換体を50μg/mlのカルベニシリンで補充されたLB寒天上で選択して、形質転換された株を-80℃で保管した。選択形質転換体をさらに試験して、正しいDNA配列の挿入を確認した。pHiPoly1を含んでいるE.coliを、カルベニシリンに加えて1%グルコースで補充されたLBブロス中に接種して、A600でおよそ0.5-0の光学濃度まで37℃にて増殖させた。pHiPoly1の発現を1mMまでのIPTGの添加によって4時間誘導した。細菌ペレットを、4500rpmで15分間遠心分離によって調製して、ペレットを、誘導されていないネガティブ・コントロールに対して細菌ワクチンポリペプチドの発現に関して試験した。細胞画分のSDS-PAGEは、Hi Poly 1が封入体として発現されることを示した。Hi Poly 1封入体を含んでいる細菌ペレットを、Benzonase(50ユニット/ml最終)およびリゾチーム(0.2mg/ml最終)(Sigma)で補充された10mlの細胞溶解TM Bバッファー(Sigma)中に溶解させた。穏やかに振とうしながら室温で1時間インキュベーションした後、16,000xgで4℃にて20分間遠心分離によって封入体をペレット化させた。Hi Poly 1ポリペプチドを含んでいるペレットを、6M塩酸グアニジン、20mM、リン酸ナトリウムpH7.8および0.5M NaCl中に溶解させて、その後に16,000xgでさらに遠心分離して、不溶性の不純物を除去した。Hi Poly 1ワクチンポリペプチドの精製を、ProBond(商標)精製システム(Life technologies)のプロトコルによって指導されるとおりに変性状態下で、事前に平衡化されたNi+2アフィニティーカラムを通してHisタグの親和性を用いて達成した。Hi Poly 1を、結合バッファー中300mMイミダゾールを用いてNi+2カラムから溶出させて、溶出画分を、タンパク質の含有量および純度の分析のために回収した。精製されたHi Poly 1を、AdjuPhosに(1:1)、混合物を穏やかに混合しながら室温で2時間インキュベートすることによって吸着させた。吸着した混合物を、PBSに対して4℃で透析した。AdjuPhosに対するHi Poly 1の相対的な吸着を、遠心分離された調製物の上清のタンパク質濃度を測定することによって決定した。ミョウバンに吸着したHi Poly 1を、使用するまで4℃で保管した。
発現ベクターを、Invitrogenによって商業的に製造して、Hi Poly 1ポリペプチドを発現させた。構築物をコードするDNAを、E.coliに関して最適化して、合成して、pET100発現ベクターのHisタグの下流への挿入の前に正しい配列を確認した。プラスミド構築物(pHiPoly1)を、E.coli BL21(De3)内に形質転換して、形質転換体を50μg/mlのカルベニシリンで補充されたLB寒天上で選択して、形質転換された株を-80℃で保管した。選択形質転換体をさらに試験して、正しいDNA配列の挿入を確認した。pHiPoly1を含んでいるE.coliを、カルベニシリンに加えて1%グルコースで補充されたLBブロス中に接種して、A600でおよそ0.5-0の光学濃度まで37℃にて増殖させた。pHiPoly1の発現を1mMまでのIPTGの添加によって4時間誘導した。細菌ペレットを、4500rpmで15分間遠心分離によって調製して、ペレットを、誘導されていないネガティブ・コントロールに対して細菌ワクチンポリペプチドの発現に関して試験した。細胞画分のSDS-PAGEは、Hi Poly 1が封入体として発現されることを示した。Hi Poly 1封入体を含んでいる細菌ペレットを、Benzonase(50ユニット/ml最終)およびリゾチーム(0.2mg/ml最終)(Sigma)で補充された10mlの細胞溶解TM Bバッファー(Sigma)中に溶解させた。穏やかに振とうしながら室温で1時間インキュベーションした後、16,000xgで4℃にて20分間遠心分離によって封入体をペレット化させた。Hi Poly 1ポリペプチドを含んでいるペレットを、6M塩酸グアニジン、20mM、リン酸ナトリウムpH7.8および0.5M NaCl中に溶解させて、その後に16,000xgでさらに遠心分離して、不溶性の不純物を除去した。Hi Poly 1ワクチンポリペプチドの精製を、ProBond(商標)精製システム(Life technologies)のプロトコルによって指導されるとおりに変性状態下で、事前に平衡化されたNi+2アフィニティーカラムを通してHisタグの親和性を用いて達成した。Hi Poly 1を、結合バッファー中300mMイミダゾールを用いてNi+2カラムから溶出させて、溶出画分を、タンパク質の含有量および純度の分析のために回収した。精製されたHi Poly 1を、AdjuPhosに(1:1)、混合物を穏やかに混合しながら室温で2時間インキュベートすることによって吸着させた。吸着した混合物を、PBSに対して4℃で透析した。AdjuPhosに対するHi Poly 1の相対的な吸着を、遠心分離された調製物の上清のタンパク質濃度を測定することによって決定した。ミョウバンに吸着したHi Poly 1を、使用するまで4℃で保管した。
[ELISA]
ELISAを、それぞれの製造元の特定のプロトコルに従って行なった。N末端Cys残基で合成されたペプチドを利用するペプチドELISAを、マレイミドで活性化されたプレート(Pierce)において行なった。特定のペプチドを、結合バッファー中、20%ジメチルホルムアミド、10%TCEP中に1mg/mlで溶解させて、その後に、結合バッファーを用いて5μg/mlの濃度に希釈した。100マイクロリットルのペプチド溶液を各ウェル内に添加して、プレートを穏やかに振とうしながら4℃で一晩インキュベートすることによってペプチドを固定化した。200μlのシステイン溶液(10μg/ml)の添加によって、プレートを室温で1.5時間ブロッキングした。hisタグを付けたHi Poly 1に対するELISAを、コーニングの高結合プレートにおいて行なった。ワクチンポリペプチド、Hi Poly 1を、20μg/mlの濃度で、4M尿素、0.05Mカーボネートバッファー、pH9.6中に可溶化させた。各ウェルに、100μlを添加して、プレートを4℃で一晩インキュベートしてポリペプチドを固定化した。それぞれのELISAにおいて、チンチラ血清を一次抗体として用いて、ヤギ抗-ラットHRP-コンジュゲートIgGを二次として用いた。結合した二次抗体を、100μlのTMBの添加によって検出して、プレートをA370で読み取った。決定された力価は、免疫前血清と比べて免疫後の抗血清の吸光度が0.1よりも高い、最終の抗体希釈であった。
ELISAを、それぞれの製造元の特定のプロトコルに従って行なった。N末端Cys残基で合成されたペプチドを利用するペプチドELISAを、マレイミドで活性化されたプレート(Pierce)において行なった。特定のペプチドを、結合バッファー中、20%ジメチルホルムアミド、10%TCEP中に1mg/mlで溶解させて、その後に、結合バッファーを用いて5μg/mlの濃度に希釈した。100マイクロリットルのペプチド溶液を各ウェル内に添加して、プレートを穏やかに振とうしながら4℃で一晩インキュベートすることによってペプチドを固定化した。200μlのシステイン溶液(10μg/ml)の添加によって、プレートを室温で1.5時間ブロッキングした。hisタグを付けたHi Poly 1に対するELISAを、コーニングの高結合プレートにおいて行なった。ワクチンポリペプチド、Hi Poly 1を、20μg/mlの濃度で、4M尿素、0.05Mカーボネートバッファー、pH9.6中に可溶化させた。各ウェルに、100μlを添加して、プレートを4℃で一晩インキュベートしてポリペプチドを固定化した。それぞれのELISAにおいて、チンチラ血清を一次抗体として用いて、ヤギ抗-ラットHRP-コンジュゲートIgGを二次として用いた。結合した二次抗体を、100μlのTMBの添加によって検出して、プレートをA370で読み取った。決定された力価は、免疫前血清と比べて免疫後の抗血清の吸光度が0.1よりも高い、最終の抗体希釈であった。
[動物]
動物試験は、国立衛生研究所の動物実験の注意および使用に関するガイドにおける推奨に従って行われ、アリゾナ州立大学(チンチラ研究)およびアリゾナ大学(幼ラット研究)の動物実験委員会によって承認された。
動物試験は、国立衛生研究所の動物実験の注意および使用に関するガイドにおける推奨に従って行われ、アリゾナ州立大学(チンチラ研究)およびアリゾナ大学(幼ラット研究)の動物実験委員会によって承認された。
[菌血症の幼ラットモデル]
受動防御の幼ラットモデルにおけるHi Poly 1による防御を、以前に述べられたとおりに試験した。免疫付与されたチンチラに由来する免疫付与前および免疫付与後の血清サンプルを用いて、幼ラットを受動的に免疫付与した。2日齢の幼ラット(pup)を雌親(dams)に無作為に再度割り当てて、それぞれ10匹の幼ラットの3つのコホートを得た。4日齢において、各コホート内の幼ラットは、免疫前チンチラ血清、免疫後血清またはPBS(コントロールとして)のいずれかの100μlのIP注入を様々に受け取った。5日齢において、それぞれの幼ラットを、50μlのPBS中およそ1.5×105 CFU NTHi株R2866のIP注入によって曝露させた。曝露の24時間後、定量的なプレーティングのために各動物から血液を回収した。
受動防御の幼ラットモデルにおけるHi Poly 1による防御を、以前に述べられたとおりに試験した。免疫付与されたチンチラに由来する免疫付与前および免疫付与後の血清サンプルを用いて、幼ラットを受動的に免疫付与した。2日齢の幼ラット(pup)を雌親(dams)に無作為に再度割り当てて、それぞれ10匹の幼ラットの3つのコホートを得た。4日齢において、各コホート内の幼ラットは、免疫前チンチラ血清、免疫後血清またはPBS(コントロールとして)のいずれかの100μlのIP注入を様々に受け取った。5日齢において、それぞれの幼ラットを、50μlのPBS中およそ1.5×105 CFU NTHi株R2866のIP注入によって曝露させた。曝露の24時間後、定量的なプレーティングのために各動物から血液を回収した。
[中耳炎のチンチラ・モデル]
OMにおけるHi Poly 1の防御的有効性を試験するために、3~5月齢のチンチラ(Chinchilla lanigera)をMoulton Chinchilla Ranchから購入した。動物を、到着時に少なくとも7日間休ませて試験開始前に順応させた。試験開始時に耳鏡検査または鼓膜聴力検査によって中耳感染の所見がない動物を以前に述べられたとおりに用いた。予備実験を行なって、Hi Poly 1でチンチラに免疫付与するための最適用量を決定した。ミョウバンアジュバントと1:1で混合された精製Hi Poly 1タンパク質を用いて、10、50、100、200および400μgの用量でチンチラのコホートを免疫付与した(3動物/コホート)。動物は、2週間隔で3回免疫付与されて、血清サンプルを最終ブーストの3週後に採取した。血清を回収して、抗原としてのHi Poly 1または個々のペプチドとともにELISAにおいて用いた。Hi Poly 1は免疫原性であり、200μgの用量は、免疫前血清と比較して、ポリペプチドおよび全ての個々のペプチドに対するIgGの明白な増加を誘導した(データ示さず)。免疫付与あたり200μgの用量を防御試験において用いた。
OMにおけるHi Poly 1の防御的有効性を試験するために、3~5月齢のチンチラ(Chinchilla lanigera)をMoulton Chinchilla Ranchから購入した。動物を、到着時に少なくとも7日間休ませて試験開始前に順応させた。試験開始時に耳鏡検査または鼓膜聴力検査によって中耳感染の所見がない動物を以前に述べられたとおりに用いた。予備実験を行なって、Hi Poly 1でチンチラに免疫付与するための最適用量を決定した。ミョウバンアジュバントと1:1で混合された精製Hi Poly 1タンパク質を用いて、10、50、100、200および400μgの用量でチンチラのコホートを免疫付与した(3動物/コホート)。動物は、2週間隔で3回免疫付与されて、血清サンプルを最終ブーストの3週後に採取した。血清を回収して、抗原としてのHi Poly 1または個々のペプチドとともにELISAにおいて用いた。Hi Poly 1は免疫原性であり、200μgの用量は、免疫前血清と比較して、ポリペプチドおよび全ての個々のペプチドに対するIgGの明白な増加を誘導した(データ示さず)。免疫付与あたり200μgの用量を防御試験において用いた。
2つの免疫付与/防御のチンチラ実験を行なった。1つめの実験では、コホートは、テスト群およびコントロール群において18匹の動物で構成された;反復試験は、コントロール群において23匹の動物およびワクチン群において22匹で構成された(ワクチンのコホートは、元々は23匹の動物を含んでいたが;1匹の動物は、プロトコルと関連しない健康上の問題のせいで免疫付与の段階中に試験から除外した)。免疫付与、感染曝露、およびOMに関する試験は2つの実験に関して同一であり、データを分析のためにプールした。
[細菌曝露]
チンチラのコホートを、2週間隔で、ミョウバンを含む200μgのHi Poly 1またはPBS-ミョウバンを用いて3回免疫付与した。各動物の免疫付与前および最終免疫付与の2週後に採取したサンプル由来の抗血清を、熱不活化して、ELISAによる抗体力価の試験および受動防御の幼ラットモデルにおける使用まで、-80℃で保管した。最終免疫付与の3週後、それぞれのチンチラに、上部胞(superior bullae)への細菌懸濁液の直接注入によって、300μl PBS-ゼラチン(0.1%w/v)中およそ1500CFUのNTHi株86-028NPを両耳に曝露した。曝露用量をプレートのカウントによって確認した。
チンチラのコホートを、2週間隔で、ミョウバンを含む200μgのHi Poly 1またはPBS-ミョウバンを用いて3回免疫付与した。各動物の免疫付与前および最終免疫付与の2週後に採取したサンプル由来の抗血清を、熱不活化して、ELISAによる抗体力価の試験および受動防御の幼ラットモデルにおける使用まで、-80℃で保管した。最終免疫付与の3週後、それぞれのチンチラに、上部胞(superior bullae)への細菌懸濁液の直接注入によって、300μl PBS-ゼラチン(0.1%w/v)中およそ1500CFUのNTHi株86-028NPを両耳に曝露した。曝露用量をプレートのカウントによって確認した。
[中耳炎の証拠に関する実験]
直接感染の前および曝露後3、7、10、および14日目に、それぞれのチンチラを、OMの証拠に関してビデオ耳鏡検査および鼓膜聴力検査によって試験した;各コホートのサブセットを、中耳滲出液(MEE)について試験して、試験から除外した。ビデオ耳鏡検査(Video VetScope System,MedRx,Seminole,FL,USA)による鼓膜炎症の徴候を、以前に説明されたとおりに、0 to 4+スケールで評価した(rated on)。それぞれの耳を試験するときに、ビデオ耳鏡検査を記録して、目に見える紅斑、膨れ、鼓膜の不透明性の変化、および、鼓膜の後ろの滲出液の可視化に基づいて0~4にグレード分けした。≧2でスコア化された個々の耳は、OMに関してポジティブであると考えた。記録されたビデオ耳鏡検査は、第2の盲検観察者によって評価された。第1および第2の評価の間の違いを盲検的に解明した(第3の盲検観察者を含む)。鼓膜聴力検査(EarScan,South Daytona,FL,USA)を用いて、以前に説明されたとおりに、鼓膜幅および鼓膜コンプライアンスの両方における変化をモニターした。鼓膜聴力検査を用いて、ティンパノグラムのコンプライアンスまたは高さによって、鼓膜のインピーダンスが測定されて、同等容量のミリリットルで表される。0.75~1.5の範囲外の異常なコンプライアンスは、OMの証拠と考えた。同様に、ティンパノグラムの幅および全体的な形状はOMの有用な指標であり、150daPaよりも大きな鼓膜聴力検査の幅(TW)は、OMの証拠と考えた。MEEを、胞経由の(trans-bullar)のタップによって回収して、1.5インチ25-ゲージの皮下針を用いて中耳腔から流体を引き抜いた。MEEが検出されない場合は、同じ耳をさらに2回タップしてMEEが存在しないことを確かめた。そのような耳は「ドライ」とスコア化した。MEEにおける細菌力価を、以前に説明されたとおりにトラック希釈(track dilution)方法を用いて決定した。
直接感染の前および曝露後3、7、10、および14日目に、それぞれのチンチラを、OMの証拠に関してビデオ耳鏡検査および鼓膜聴力検査によって試験した;各コホートのサブセットを、中耳滲出液(MEE)について試験して、試験から除外した。ビデオ耳鏡検査(Video VetScope System,MedRx,Seminole,FL,USA)による鼓膜炎症の徴候を、以前に説明されたとおりに、0 to 4+スケールで評価した(rated on)。それぞれの耳を試験するときに、ビデオ耳鏡検査を記録して、目に見える紅斑、膨れ、鼓膜の不透明性の変化、および、鼓膜の後ろの滲出液の可視化に基づいて0~4にグレード分けした。≧2でスコア化された個々の耳は、OMに関してポジティブであると考えた。記録されたビデオ耳鏡検査は、第2の盲検観察者によって評価された。第1および第2の評価の間の違いを盲検的に解明した(第3の盲検観察者を含む)。鼓膜聴力検査(EarScan,South Daytona,FL,USA)を用いて、以前に説明されたとおりに、鼓膜幅および鼓膜コンプライアンスの両方における変化をモニターした。鼓膜聴力検査を用いて、ティンパノグラムのコンプライアンスまたは高さによって、鼓膜のインピーダンスが測定されて、同等容量のミリリットルで表される。0.75~1.5の範囲外の異常なコンプライアンスは、OMの証拠と考えた。同様に、ティンパノグラムの幅および全体的な形状はOMの有用な指標であり、150daPaよりも大きな鼓膜聴力検査の幅(TW)は、OMの証拠と考えた。MEEを、胞経由の(trans-bullar)のタップによって回収して、1.5インチ25-ゲージの皮下針を用いて中耳腔から流体を引き抜いた。MEEが検出されない場合は、同じ耳をさらに2回タップしてMEEが存在しないことを確かめた。そのような耳は「ドライ」とスコア化した。MEEにおける細菌力価を、以前に説明されたとおりにトラック希釈(track dilution)方法を用いて決定した。
[統計分析。]
チンチラの実験1および2によるデータを、測定されたそれぞれの時点(感染後の日)におけるそれぞれの結果についてプールした。それぞれの日における、耳鏡検査、鼓膜聴力検査、およびMEEの存在の、割合(proportion)を、フィッシャー直接検定を用いてワクチン接種群とコントロール群の間で比較した。チンチラにおけるMEEのCFU/mlおよび幼ラットモデルにおける血液を含む定量的な測定を、クラスカル・ワリス検定を用いてワクチン接種群とコントロール群の間で比較した。感度分析によって試験されたドライの耳のMEEを、0CFU/mlとした。MEEにおける細菌力価を、ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定を用いて分析した。統計分析は、SASソフトウェア、バージョン9.2(SAS Institute Inc.,Cary,North Carolina)を用いて行なった。全ての統計的検定は、両側の5%有意水準で評価した。
チンチラの実験1および2によるデータを、測定されたそれぞれの時点(感染後の日)におけるそれぞれの結果についてプールした。それぞれの日における、耳鏡検査、鼓膜聴力検査、およびMEEの存在の、割合(proportion)を、フィッシャー直接検定を用いてワクチン接種群とコントロール群の間で比較した。チンチラにおけるMEEのCFU/mlおよび幼ラットモデルにおける血液を含む定量的な測定を、クラスカル・ワリス検定を用いてワクチン接種群とコントロール群の間で比較した。感度分析によって試験されたドライの耳のMEEを、0CFU/mlとした。MEEにおける細菌力価を、ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定を用いて分析した。統計分析は、SASソフトウェア、バージョン9.2(SAS Institute Inc.,Cary,North Carolina)を用いて行なった。全ての統計的検定は、両側の5%有意水準で評価した。
[結果:]
[Hi Poly 1]
6個のタンパク質由来の9個の固有のペプチドの連続的なアライメントを図1に示す。生じる249アミノ酸構築物は、27,724Daの理論分子量(Hisタグによって31,844)および9.57のpI(Hisタグによって9.71)を有すると計算された。
[Hi Poly 1]
6個のタンパク質由来の9個の固有のペプチドの連続的なアライメントを図1に示す。生じる249アミノ酸構築物は、27,724Daの理論分子量(Hisタグによって31,844)および9.57のpI(Hisタグによって9.71)を有すると計算された。
親和性精製後、Hi Poly 1の純度をSDS-PAGEによって分析して(図10);単一のタンパク質バンドは、32KDaの理論MWと相関した。このHi Poly 1の調製物を、Adju-Phosに1:1で吸着させた。
[Hi Poly 1ワクチンポリペプチドの免疫原性。]
コントロール、免疫付与前および免疫付与後の血清を、ELISAによって、抗原特異的IgGについて試験した。抗体力価は、Hi Poly 1を用いた免疫付与が、40匹の動物のそれぞれにおいて、ポリペプチドに対する強力かつ再現性のある免疫応答(log2力価平均17.04)をもたらし、一方で、免疫付与前およびコントロールの動物由来の抗血清は、バックグラウンドレベルである(log2力価≦1.0)ことを示唆した(図11)。Hi Poly 1を免疫原として用いると、構成要素ペプチドのそれぞれに対する免疫応答は有意であり、≧4(4.03~15.27)のlog2力価平均の増加を有した。それぞれの実験的ワクチン群において、最も低い応答は、HxuC由来の2つのペプチドに対するものであった。数匹の動物が、一方および/または他方のHxuCペプチドに対して測定可能な免疫応答を誘発することができなかった。Hi Poly 1を受け取った40匹の動物のうち、13匹および18匹が、それぞれ、HxuC-1およびHxuC-2に対する抗体力価の有意な増加を示さなかった。さらに、10匹の動物は、LptE-4に対する抗体力価において有意な増加はなかった。対照的に、他の構成要素に対する力価は高かった(11~15の範囲)。
コントロール、免疫付与前および免疫付与後の血清を、ELISAによって、抗原特異的IgGについて試験した。抗体力価は、Hi Poly 1を用いた免疫付与が、40匹の動物のそれぞれにおいて、ポリペプチドに対する強力かつ再現性のある免疫応答(log2力価平均17.04)をもたらし、一方で、免疫付与前およびコントロールの動物由来の抗血清は、バックグラウンドレベルである(log2力価≦1.0)ことを示唆した(図11)。Hi Poly 1を免疫原として用いると、構成要素ペプチドのそれぞれに対する免疫応答は有意であり、≧4(4.03~15.27)のlog2力価平均の増加を有した。それぞれの実験的ワクチン群において、最も低い応答は、HxuC由来の2つのペプチドに対するものであった。数匹の動物が、一方および/または他方のHxuCペプチドに対して測定可能な免疫応答を誘発することができなかった。Hi Poly 1を受け取った40匹の動物のうち、13匹および18匹が、それぞれ、HxuC-1およびHxuC-2に対する抗体力価の有意な増加を示さなかった。さらに、10匹の動物は、LptE-4に対する抗体力価において有意な増加はなかった。対照的に、他の構成要素に対する力価は高かった(11~15の範囲)。
[菌血症に対する防御]
菌血症におけるHi Poly 1の防御能力を試験するために、NTHi 2866株に対する幼ラットの受動防御に関して、チンチラの免疫付与後の抗血清を、PBSおよび免疫付与前のチンチラ血清と比較した(図12)。PBSと免疫前血清の間に、検出可能な防御の違いはなかった。免疫後の抗血清は、PBSまたは免疫前血清と比較して菌血症を有意に減少させた(それぞれ、p=0.018および0.0098)。
菌血症におけるHi Poly 1の防御能力を試験するために、NTHi 2866株に対する幼ラットの受動防御に関して、チンチラの免疫付与後の抗血清を、PBSおよび免疫付与前のチンチラ血清と比較した(図12)。PBSと免疫前血清の間に、検出可能な防御の違いはなかった。免疫後の抗血清は、PBSまたは免疫前血清と比較して菌血症を有意に減少させた(それぞれ、p=0.018および0.0098)。
[中耳炎における防御]
最終の免疫付与の21日後、チンチラに、300μlのPBS中NTHi 86-028NPを胞経由で(transbullarly)接種した。接種の定量的なカウントにより、両方の実験において、それぞれの胞(bulla)内に、およそ1.4×103 CFUの滴下を確認した。
最終の免疫付与の21日後、チンチラに、300μlのPBS中NTHi 86-028NPを胞経由で(transbullarly)接種した。接種の定量的なカウントにより、両方の実験において、それぞれの胞(bulla)内に、およそ1.4×103 CFUの滴下を確認した。
ティンパノグラム測定によって、14日の実験にわたって、コントロール群と比較してHi Poly 1処置群において、OMポジティブの耳の有意な低減が明らかになった(図13)。曝露後初期(接種後3日目)には、コントロール動物の耳の96%(82のうち79)がOMの臨床徴候を有し、Hi Poly 1免疫付与動物の89%(80のうち71)がOMを有した。7日目までに、2つのコホート間に統計的な有意差があり;Hi Poly 1群の70%(66のうち46)がOMを有し、一方で、コントロール群の94%(68のうち64)はOMについてポジティブであった(p=0.0002)。この差は10日目にも続いており、ワクチン群の52%(48のうち25)およびコントロール群の86%(50のうち43)がOMの証拠を有した(p=0.0004)。接種後14日目には、コントロール群は感染をクリアし始めていて;ワクチン・コホートの50%がOMを有し、コントロール群の66%がOMを有した。
鼓膜聴力検査データと同様に、3日目のビデオ耳鏡検査は、全ての耳が、OMと一致する証拠を有することを示した(図14)。7日目には、コントロール群の99%(68のうち67)がOMに関してポジティブと定義されたが、ワクチン群の74%(66のうち49)がOMポジティブであった(p=0.0001)。10日目には、コントロール群内の動物の耳の100%(50のうち50)がOMに関してポジティブであり;ワクチン群内の動物の耳のたった50%(48のうち24)がOMポジティブであった(p=0.0001)。14日目までには、コントロール群は疾患のクリアランスを示し始めていて、耳の66%(32のうち24)がOMの徴候を示したが、ワクチン・コホートは、43%(30のうち13)のOMポジティブまで低減した(p=0.019)。鼓膜聴力検査およびビデオ耳鏡検査のデータは両方とも、ワクチン処置された動物が、コントロールと比べて疾患のより迅速なクリアランスを示したことを示す。
OMの外部試験に加えて、鼓室上部(epitympanic)のタップを、各コホート由来の動物のサブグループに対して行なった。サンプリングの時点において、それぞれの耳を、滲出液があるウェットまたは滲出液のないドライとしてグレード分けした。ドライの耳は、別々に3回サンプリングして、滲出液が存在しないことを確認した。滲出液を定量的に培養して、細菌力価を決定した。図15は、それぞれの時点におけるドライの耳のパーセントを示す。3日目には、試験した全ての耳において滲出液が存在した。7日目には、ワクチン処置群とコントロール群の間に傾向の違いがあった。10日目および14日目には、これらの2つの群の間の違いは非常に有意であり(それぞれ、p=0.001および0.0028)、ワクチン感染の(vaccine infected)耳の70%よりも多くが、中耳流体のクリアランスを示した。
図16は、MEEに関する平均CFU/mlを示す。3日目には、MEE中の細菌密度は、ワクチン群とコントロール群の間で同様であった。しかしながら、ワクチン群がMEEをクリアすると、ワクチン群の中耳における細菌密度は有意に少なかった(10日目および14日目、それぞれp=0.001および0.0028)。コントロール動物におけるMEE細菌密度は、感染の最初の数日にかけて増加して、残りの実験にわたって平均106cfu/mlであり、このモデルを用いた以前の実験と一致した。Hi Poly 1免疫付与群の大部分の耳は、14日の期間にわたって滲出液をクリアしたが、僅かに残っているMEEにおける細菌密度は、コントロール群におけるMEEと統計的な差はなく、すなわち、およそ106cfu/mlであった。
[検討]
NTHiに起因する重大な粘膜および侵襲性の感染が持続していて非常に流行しているにもかかわらず、非常に効果的な市販ワクチンは利用可能でない。主要およびマイナーの外膜タンパク質、アドヘシン、およびリポオリゴ糖を含むいくつかの病原性因子の免疫防御が研究されている。ピリン系のペプチド・モチーフは防御が示された。しかしながら、防御は相同株に制限された(おそらくピリン系タンパク質の公知の配列不均質性の結果)。さらに、担体分子としてHiプロテインDを用いた11価の肺炎球菌ワクチンは、臨床試験において、NTHi OMに対して35%の防御を与えた。
NTHiに起因する重大な粘膜および侵襲性の感染が持続していて非常に流行しているにもかかわらず、非常に効果的な市販ワクチンは利用可能でない。主要およびマイナーの外膜タンパク質、アドヘシン、およびリポオリゴ糖を含むいくつかの病原性因子の免疫防御が研究されている。ピリン系のペプチド・モチーフは防御が示された。しかしながら、防御は相同株に制限された(おそらくピリン系タンパク質の公知の配列不均質性の結果)。さらに、担体分子としてHiプロテインDを用いた11価の肺炎球菌ワクチンは、臨床試験において、NTHi OMに対して35%の防御を与えた。
生物情報学およびタンパク質構造解析を用いて、我々は、種全体にわたって存在し、配列が保存されていて、幼ラットモデルにおいて受動防御を個々に仲介する、複数のNTHi表面タンパク質のペプチド領域を以前に同定した。防御的ペプチドを同定するプロセスは、生物学的機能に関して先入観がなく、ペプチドが、様々な機能および構造を有するタンパク質に由来することは注目に値する。Hi Poly 1内に取り込まれたペプチドは、βバレルおよびリポタンパク質由来である。HxuCは、ヘムの取り込みに関与する、TonB-依存性の外膜貫通のゲート付きポリン(gated porin)である。タンパク質BamAもβバレルであり、アセンブリおよびOMへの他のタンパク質の取り込みに関与する。リポタンパク質LptEは、バレル構造をしたLptDに対するアクセサリータンパク質であり、OMへのリポオリゴ糖の取り込みに寄与する。NucAは、膜に固定された、表面が露出した5’-ヌクレオチダーゼであり、Hel(リポタンパク質e:P4)は、ヘムとNADの両方の獲得に関与するホスホモノエステラーゼである。新規のリポタンパク質NlpI(Novel Lipoprotein)の生物学的機能は、まだ決定されていない。したがって、28kDaのポリペプチドHi Poly 1は、複数の生物学的に様々なタンパク質を標的化する。
ペプチドを細菌ワクチンとして用いる以前の試みは成功していない。小さいサイズに起因して免疫原性がないこと、表面露出を同定することができないこと、および、配列保存がないことは、細菌ワクチンにおけるペプチドの利用を制限している。現在の研究の中心的な仮説は、これらの障害を、順に(in sequence)送達されるNTHi防御的ペプチドを用いたBVPの方法論によって克服することができるというものである。Hi Poly 1は、免疫原性であることが分かり、17.04(1/134,756)のLog2力価を有していた。Hi Poly 1は、4.03(1/16.3)~15.27(1/39,500)のLog2力価の範囲のペプチド特異的な抗体も誘導した。全体的に、Hi Poly 1は、ワクチンとして用いられる他のタンパク質と同様に免疫原性であった。特定のタンパク質領域の免疫原性および防御有効性は通常特徴付けられないので、現行のワクチンとの詳細な比較は困難である。免疫原性に加えて、我々は、Hi Poly 1を標的化する抗体が、感染の2つの別個のモデルにおいて、2つの別個のNTHi単離株に対して防御的であることを示した。
ワクチンアジュバントは、免疫原性の重要な決定因子である。我々は、幼年ワクチンを模倣するために、現在の研究に関してミョウバンをアジュバントとして用いた。Hi Poly 1の免疫原性および免疫原性プロファイルは、広範なリストの市販アジュバント(例えば、新規のShingrixワクチンにおいて用いられるASO1)によってさらに改善され得る可能性がある。したがって、新規に開発されるアジュバントは、未来のBVPの免疫原性および免疫プロファイルを改善し得る可能性がある。受動防御による有効性を含む以前の研究によって、OMに対する防御が主に血清抗体によって仲介されることが示されているので、我々は、OMにおける防御の尺度として抗体に着目した。しかしながら、百日咳のような他の細菌に対して防御するためには代替の免疫のパスウェイが必要であり得る。
細菌ワクチンは、歴史的に、1)全細胞(例えば、1990年代よりも前の百日咳ワクチン)、2)タンパク質病原性因子(例えば、破傷風毒素および線毛)、または3)表面炭水化物(単独または免疫原性を改善するために担体タンパク質にコンジュゲートされる)を使用している。最近では、リバース・ワクチン工学によるゲノムデータの体系的なマイニング(mining)によって、髄膜炎菌ワクチンにおいて有用な防御的リポタンパク質が生み出されている。これらの手法は、流行性の感染の制御において非常に成功している。それらには、特定の制限もある。例えば、莢膜型ワクチンは、特定の莢膜型を有する種のメンバーを標的化して、無莢膜型株(インフルエンザ菌の場合)または異なる莢膜型を有する株(肺炎連鎖球菌の場合)は、残存病変を生じる。百日咳の場合は、現行のワクチンは3~5個のタンパク質を有しており、そのうちの1つはパータクチンであり;パータクチンを生産しない株が最近出現していて、ワクチン有効性の低下に寄与し得る。BVP手法においては、標的は免疫がアクセス可能なタンパク質領域であり、複数のタンパク質領域が効率的に送達されるので、これらの制限は減少する。
その他は、防御的タンパク質の配列可変領域由来の複数のペプチドを用いて配列不均質性を克服している。しかしながら、複数のタンパク質の配列保存領域を標的化するBVPには大きな利点がある。表面露出タンパク質の配列保存領域が種にわたって存在することは、これらの領域がタンパク質機能に必要とされ得ることを示唆しており;したがって、タンパク質機能の抗体阻害は、毒素のような病原性因子による干渉と同様に、ワクチンの有効性を高め得る。複数の部位の効果的な標的化は、露出を回避するためには複数の同時の突然変異が必要なので、遺伝学的エスケープの機会を減少させる。最後に、BVPにおいて複数の異なるタンパク質ターゲットを標的化することは、非常に費用効果的な製造アプローチを提供する。
BVPに対する1つの現在の制限は、免疫攻撃のために利用可能な特定のタンパク質領域を同定するための基礎的なツールがないことである。この制限は、細菌の表面構造の複雑性および調節された発現によって複雑化される。例えば、HxuCは、鉄/ヘムによって調節されていて、広範囲の動物スクリーニングによって現在の研究において検出された。また、異なる細菌種を死滅させるために必要な特定の免疫メカニズムは、ペプチドの選択に影響し得て、あまり研究されていない。同様に、線形および二次エピトープの防御的役割を同定および識別する方法は、あまり特徴付けられていない。これらの領域における研究が、BVPのさらなる進歩に重要である。
ポリペプチドは、酵素的および治療的ポリペプチドのような様々な機能を発揮するようにインシリコで設計されている。我々は、BVPが、細菌表面上の複数のタンパク質を標的化する防御免疫を誘導するように特異的に設計されることを提案する。我々のデータは、関連のあるヒト病原体NTHiに注目している。しかしながら、生物学的機能の理解はBVP方法論において重要なステップではないので、手法を他の細菌種に直接適用することができる。例えば、我々は、BVPが百日咳の前臨床モデルにおいて効果的であるという証拠を有している(データ示さず)。
[結論。]Hi Poly 1(細菌ワクチンポリペプチド)を、インフルエンザ菌の全ての株に存在する表面露出タンパク質由来の配列が保存されたペプチドからなる多重標的化ポリペプチドとして設計した。Hi Poly 1は、チンチラにおいて免疫原性であり、構成要素ペプチドのそれぞれに対して抗体が誘導された。免疫付与後のチンチラ抗血清は、PBSまたは免疫前血清と比べて、幼ラットモデルにおいてNTHi R2866菌血症を減少させた。同様に、無莢膜型インフルエンザ菌(NTHi)中耳炎の十分に確立されたチンチラ・モデルにおいて、ワクチン群は、コントロール群よりも有意に迅速に、NTHi株86-028による感染をクリアした。データは、NTHiワクチンとしてのHi Poly 1のさらなる研究を支持し、他の病原体に関する細菌ワクチンポリペプチドの開発のためのモデルを提供する。
上述または本明細書において他の方法で検討される任意のペプチド組成物は、薬学的に許容できる担体、ビヒクル、希釈剤、および/またはアジュバントをさらに含んでよい。
本開示の特定の実施態様は、感染性生物に対する抗体応答を誘導することが可能な少なくとも1つの融合異種ポリペプチド(融合タンパク質)を含んでいるペプチド組成物に関する。融合ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも多くの異なるペプチドを、連続して連結して含んでよく、ここで、1つまたは複数のペプチドのそれぞれは、10~60アミノ酸の長さである。
特定の他の実施態様では、本開示は、B.pertussisに対する抗体応答を誘導することが可能なペプチド組成物に関し、ここで、ペプチド組成物は、担体分子に連結された少なくとも1つのペプチドを含んでいる担体分子組成物である。
上述または本明細書において他の方法で検討される任意の担体分子組成物は、薬学的に許容できる担体、ビヒクル、希釈剤、および/またはアジュバントも含む組成物内に存在してよい。
特定の実施態様では、本開示は、感染性生物に対する能動または受動の免疫原性応答を対象において誘導する方法に関する。当該方法は、免疫原性として有効量の、上述または本明細書において他の方法で検討される任意のペプチド組成物、融合ポリペプチド、および/または担体分子組成物を、対象に投与するステップを含む。
特定の実施態様では、本開示は、B.pertussisに対する対象における能動または受動の免疫防御を提供する方法に関する。当該方法は、上述または本明細書において他の方法で検討される任意の免疫原性ペプチド組成物、融合ポリペプチド、および/または担体分子組成物に対して産生される有効量の抗体組成物を、対象へ投与するステップを含む。
さらに、一部の実施態様では、直接送達されるにしても、またはウイルスベクターを介するにしても、異種ポリペプチドをコードするDNAをワクチン組成物として用いることができる。
本開示は、特定の実施態様との関連で、その態様がより完全に理解および認識され得るように、本明細書において記載されているが、本開示がこれらの特定の実施態様に限定されることを意図しない。それとは対照的に、全ての代替、改変および等価物は、本明細書中で定義されるように本開示の範囲内に含まれることが意図される。したがって、上述の実施例(特定の実施態様を含む)は、本開示の実施を例示するのに役立ち、示される詳細(particulars)は、例としてのものであり、特定の実施態様の例示的な考察目的のみのためであり、手順ならびに本開示の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されることが理解される。本明細書中に記載の様々な組成物の製剤、本明細書中に記載の方法、または本明細書中に記載の方法のステップもしくはステップの順番は、本開示の主旨および範囲を逸脱せずに変更されてよい。さらに、本開示の様々な実施態様が、本明細書中の以下の特許請求の範囲に記載されているが、本開示がこれらの特定の特許請求の範囲に制限されることを意図しない。出願人らは、後の特許出願において、本明細書中の以下に示される特許請求の範囲を補正し、追加し、または置き換える権利を留保している。
Claims (12)
- 細菌物質からワクチン組成物を作製する方法であって、
以下のステップ:
(a)高い相対存在量のmRNA発現を有する1つまたは複数の細菌遺伝子を選択するステップ;
(b)ステップ(a)において選択された1つまたは複数の遺伝子のペプチドを、防御アッセイによって、免疫原性効果について試験するステップ;および
(c)ステップ(b)において防御を示す1つまたは複数の遺伝子のペプチドを用いて、細菌ワクチンポリペプチドを構築するステップ、
を含む、
方法。 - 請求項1の方法であって、
前記の高い相対存在量のmRNAは、約11,819~約47,656である、
方法。 - 請求項1の方法であって、
目的の細菌種全体にわたる発現に基づいて、ステップ(a)に使用される1つまたは複数の細菌遺伝子を選択するステップをさらに含む、
方法。 - 請求項1または3の方法であって、
インシリコ構造解析に基づいて、ステップ(a)に使用される1つまたは複数の細菌遺伝子を選択するステップをさらに含み、前記1つまたは複数の細菌遺伝子は、細胞表面に露出される、
方法。 - 対象における免疫原性応答を誘導する方法であって、
前記対象に、感染性生物に対する免疫原性応答を刺激するのに効果的な量の異種融合ポリペプチド組成物を投与するステップを含む、
方法。 - 請求項5の方法であって、
前記感染性生物はB.pertussis(Bp)であり、
ここで、前記異種融合ポリペプチドは、BpPoly1およびBpPoly3からなる群より選択される、
方法。 - 請求項5または6の方法であって、
前記異種融合ポリペプチドは、担体分子に連結されて担体分子組成物を形成する、
方法。 - 請求項5の方法であって、
前記異種融合ポリペプチドは、薬学的に許容できる担体、ビヒクル、希釈剤、および/またはアジュバントをさらに含む、
方法。 - 請求項5の方法であって、
前記異種融合ポリペプチド組成物は、請求項1に従って作製される、
方法。 - 対象におけるB.pertussisに対する免疫原性応答を誘導する方法であって、
前記対象に、BpPoly1またはBpPoly3を含む、ある量の異種融合ポリペプチド組成物を投与するステップを含み、
ここで、異種融合ポリペプチドの前記量は、前記対象におけるB.pertussisに対する免疫原性応答を刺激するのに効果的である、
方法。 - 請求項10の方法であって、
前記異種融合ポリペプチドは、担体分子に連結されて担体分子組成物を形成する、
方法。 - 請求項10の方法であって、
前記異種融合ポリペプチドは、薬学的に許容できる担体、ビヒクル、希釈剤、および/またはアジュバントをさらに含む、
方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862745878P | 2018-10-15 | 2018-10-15 | |
US62/745,878 | 2018-10-15 | ||
PCT/US2019/056298 WO2020081548A1 (en) | 2018-10-15 | 2019-10-15 | Vaccine polypeptide compositions and methods |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022508713A true JP2022508713A (ja) | 2022-01-19 |
Family
ID=70283010
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021545284A Pending JP2022508713A (ja) | 2018-10-15 | 2019-10-15 | ワクチンポリペプチド組成物および方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220047690A1 (ja) |
EP (1) | EP3866830A4 (ja) |
JP (1) | JP2022508713A (ja) |
CN (1) | CN113226361A (ja) |
AU (1) | AU2019360106A1 (ja) |
CA (1) | CA3115085A1 (ja) |
IL (1) | IL282245A (ja) |
WO (1) | WO2020081548A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024006842A2 (en) * | 2022-06-28 | 2024-01-04 | La Jolla Institute For Immunology | Bordetella t cell epitopes, megapools and uses thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0723784A (ja) * | 1992-01-08 | 1995-01-27 | Staat Der Nerder Vertegenwoordigd Door Minister Welzijn Gesund Cultur | 百日咳ワクチン |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR0168039B1 (ko) * | 1987-09-04 | 1999-01-15 | 로버트 디. 웨스트 | 재조합 dna에서 유도한 보르데텔라 외독소 소단위체의 유사체 및 그를 포함하는 백신 |
GB9224584D0 (en) * | 1992-11-23 | 1993-01-13 | Connaught Lab | Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases |
GB9828217D0 (en) * | 1998-12-21 | 1999-02-17 | Universitu Libre De Bruxelles | Vacine |
JP2005532789A (ja) * | 2002-03-15 | 2005-11-04 | ワイス・ホールデイングス・コーポレーシヨン | 減少した酵素活性を有する型別不能なインフルエンザ菌(Haemophilusinfluenza)のP4タンパク質の変異体 |
MX2013006255A (es) * | 2010-12-03 | 2015-08-05 | Sanofi Pasteur Ltd | Composicion para inmunizacion contra streptococcus pneumoniae. |
JP6158796B2 (ja) * | 2011-06-17 | 2017-07-05 | ユニバーシティ オブ テネシー リサーチ ファウンデーション | A群連鎖球菌多価ワクチン |
AU2016248452B2 (en) * | 2015-04-16 | 2018-05-31 | Inventprise, Inc. | Bordetella pertussis immunogenic vaccine compositions |
-
2019
- 2019-10-15 AU AU2019360106A patent/AU2019360106A1/en active Pending
- 2019-10-15 CN CN201980083023.4A patent/CN113226361A/zh active Pending
- 2019-10-15 CA CA3115085A patent/CA3115085A1/en active Pending
- 2019-10-15 US US17/279,277 patent/US20220047690A1/en active Pending
- 2019-10-15 WO PCT/US2019/056298 patent/WO2020081548A1/en unknown
- 2019-10-15 JP JP2021545284A patent/JP2022508713A/ja active Pending
- 2019-10-15 EP EP19873436.0A patent/EP3866830A4/en active Pending
-
2021
- 2021-04-11 IL IL282245A patent/IL282245A/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0723784A (ja) * | 1992-01-08 | 1995-01-27 | Staat Der Nerder Vertegenwoordigd Door Minister Welzijn Gesund Cultur | 百日咳ワクチン |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, vol. 22, no. 5, JPN6023035086, 2015, pages 459 - 466, ISSN: 0005136736 * |
INFECTION AND IMMUNITY, vol. 78, no. 8, JPN6023035087, 2010, pages 3432 - 3442, ISSN: 0005136735 * |
PLOS ONE, vol. Vol.10, No.9, Article No.e0136867, JPN6023035088, 2015, pages 1 - 16, ISSN: 0005136734 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113226361A (zh) | 2021-08-06 |
CA3115085A1 (en) | 2020-04-23 |
WO2020081548A1 (en) | 2020-04-23 |
EP3866830A1 (en) | 2021-08-25 |
US20220047690A1 (en) | 2022-02-17 |
AU2019360106A1 (en) | 2021-05-13 |
EP3866830A4 (en) | 2022-11-02 |
IL282245A (en) | 2021-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6909268B2 (ja) | ストレプトコッカス・スイス感染に対するワクチン組成物 | |
US11466058B2 (en) | Mutant fragments of OspA and methods and uses relating thereto | |
KR101191591B1 (ko) | 돌연변이 뉴몰리신 단백질 | |
ES2360296T3 (es) | Vacunas y proteínas de setreptococcus pneumoniae. | |
US20230322869A1 (en) | Mutant fragments of ospa and methods and uses relating thereto | |
JP2010057501A (ja) | 肺炎球菌感染を治療または予防するための組成物および方法 | |
JP2009515831A (ja) | ペスト菌(Yersiniapestis)抗原を含む組成物 | |
ES2367128T3 (es) | Procedimiento para preparar una variante del antígeno protector de superficie de erysipelothrix rhusiopathiae en e. coli. | |
JP2009500037A5 (ja) | ||
JP2013520487A (ja) | 免疫原性タンパク質および組成物 | |
US20110236470A1 (en) | GLUTAMYL tRNA SYNTHETASE (GtS) FRAGMENTS | |
JP2011506433A (ja) | 改変された免疫組成物 | |
JP2015509713A (ja) | 線毛タンパク質および組成物 | |
JP2022508713A (ja) | ワクチンポリペプチド組成物および方法 | |
JP6401148B2 (ja) | 抗原および抗原の組み合わせ | |
US20220202924A1 (en) | Compositions and treatments for haemophilus influenzae | |
US6887480B1 (en) | Streptococcus pneumoniae proteins and vaccines | |
US10933126B2 (en) | Clostridium difficile immunogenic compositions and methods of use | |
JP2002538169A (ja) | インフルエンザ菌に起因する疾患を防御するための、少なくとも3つの抗原を含む多成分系ワクチン | |
KR101922414B1 (ko) | 클로스트리디움 퍼프린젠스의 알파 독소를 표면 발현하는 재조합 독소원성 대장균 | |
US12048743B2 (en) | Glyconjugate vaccines | |
EA046886B1 (ru) | МУТАНТНЫЕ ФРАГМЕНТЫ OspA И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ СПОСОБЫ И ПРИМЕНЕНИЕ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220914 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230828 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20231110 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20240423 |