JP2022508713A - ワクチンポリペプチド組成物および方法 - Google Patents

Abstract

免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、および免疫原性ペプチドを含む担体分子、ならびに、これらの免疫原性ペプチド、融合異種ポリペプチド、および／またはペプチドを保有している担体分子を含む免疫原性組成物であって、感染性生物に対する抗体産生を誘発することが可能なものが開示される。作製方法およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（Ｂｐ）のような感染性生物の１つまたは複数の株に対する抗体応答を引き起こすためのそれらの使用も開示される。【選択図】 図１

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年１０月１５日に出願された米国仮出願番号６２／７４５，８７８の優先権を主張するものであり、それは、その全体において示されたかのように参照により本明細書中に援用される。

［参照による援用の陳述］
本明細書に挙げられる全ての参考文献の内容全体は、参照により本明細書中に明白に援用される。

非毒性で広範な交差反応性の免疫防御性抗原は、多くの疾患についてまだ同定されていない。さらに、効果的なワクチンが存在する疾患は、疾患の原因である生物（単数または複数）によるワクチン構成要素に対する適応に起因して、経時的に流行が増大し得る。

例えば、百日咳菌は、グラム陰性の好気性病原性の、ボルデテラ属の被包性球桿菌である。その病原性因子は、百日咳毒素、線維状ヘマグルチニン、パータクチン、線毛、および気管細胞毒を含む。４，０８６，１８６塩基対の完全なＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓゲノムが２００３年に公開された。百日咳菌は、ヒト特有の細菌病原体であり、ゼーゼーした咳、すなわち百日咳の、最も一般的な原因物質である。百日咳は、初期のカタル期の後、重症で長引く咳によって特徴付けられる。咳の重症度は未免疫の幼児で最も悪く、したがって、最も高い入院率および死亡率になる（Ｇａｂｕｔｔｉら）。

死滅化全細胞ワクチンは、２０世紀の大部分にわたって百日咳を予防するために用いられた。全細胞ワクチンは、１９９０年代に無細胞百日咳ワクチンによって置き換えられた。無細胞百日咳ワクチンは、３～５個のタンパク質構成要素、すなわち、百日咳毒素サブユニットＡ（ＰｔｘＡ）、線毛血清型２（ｆｉｍ２）、線毛血清型３（ｆｉｍ３）、パータクチン（Ｐｒｎ）、および線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）からなる（Ｐｌｏｔｋｉｎ，２０１４）。

最近になって、米国で報告される百日咳の事例数が、高レベルのワクチン接種率にもかかわらず増加している［Ｂｕｒｎｓ］。１９３４年の２６５，２６９報告事例から、百日咳の報告事例は、１９７６年における最低数の１０１０まで減少した。しかしながら、報告事例数は最近になって、２０１２年の４８，２７７事例をピークに、１７，９７２事例が２０１６年には報告された（ＣＤＣ，Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ［Ｗｈｏｏｐｉｎｇ Ｃｏｕｇｈ］）。

意識の高さ、診断方法の改善、および、無細胞百日咳ワクチンの実施後の漸減する免疫を含む複数の因子が、百日咳の発生率の増大に寄与している。米国において単離されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ株は、もはやパータクチンおよびＦＨＡを一様に発現しないので、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの遺伝学的ワクチン・エスケープも寄与しているかもしれない［Ｍａｒｉｅｋｅ，Ｓｃｈｍｉｄｔｋｅ］。ワクチン有効性の低下およびその結果として集団免疫の減少のため、百日咳の免疫付与のための現在の推奨は、新生児に一時的に防御を与えるために全妊婦の全妊娠中の免疫付与を含む（ＣＤＣ、ＰｒｅｇｎａｎｃｙａｎｄＷｈｏｏｐｉｎｇＣｏｕｇｈ）。

したがって、疾患を予防するための代替ワクチンの開発が（百日咳が唯一の最近の例である）、重要な公衆衛生の需要となっている。

本明細書中の実施態様は、疾患のためのワクチン組成物および治療に関する。一部の実施態様では、細胞外および表面露出エピトープから細菌異種ポリペプチドワクチンを構築するための方法論が開示される。

特定の実施態様では、リバース・ワクチン工学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ）およびインシリコ・タンパク質構造解析のような手法の組み合わせが用いられる。リバース・ワクチン工学は、ゲノムの生物情報を用いて、全ての（シーケンシングされた）株に存在するタンパク質であって細胞外または表面露出領域を有する可能性のあるタンパク質を同定する。インシリコ・タンパク質構造解析は、免疫系にアクセス可能であり得るタンパク質の領域を同定する。

リバース・ワクチン工学をインシリコ・タンパク質構造解析と統合することによって、アミノ酸配列が保存された（すなわち、種内の全ての株に対する標的として有用な）、免疫系に曝露される可能性のある領域のサブセットを同定することができる。それから、細胞外／表面露出配列が保存されたペプチドを用いて融合ポリペプチドが設計され、そして、クローニング、発現、および精製される。

これらおよび他の態様が以下にさらに説明される。しかしながら、本明細書中に記載される実施態様および実施例は限定を意図しない。

本開示のいくつかの実施態様が添付の図面において例示される。しかしながら、添付の図面は、いくつかの典型的な実施態様を例示するだけであり、したがって、本開示の範囲の限定と考えられることを意図しないことに注意されたい。

１２匹のマウスをＢｐＰｏｌｙ１で免疫付与した実験を示し；最終の免疫付与後出血の幾何平均力価は１１．２２である。示されるように、肺に見られた合計コロニー形成単位は、３日目および７日目に、コントロール・マウスに対して免疫付与マウスにおいて少ない。 ２４匹のマウスをＢｐＰｏｌｙ１で免疫付与した実験を示し；最終の免疫付与後出血の幾何平均力価１５．４３。示されるように、肺に見られた合計コロニー形成単位は、３日目、１０日目および１４日目に、コントロール・マウスに対して免疫付与マウスにおいて少ない。 １２匹のマウスをＢｐＰｏｌｙ３で免疫付与した実験を示し；最終の免疫付与後出血の幾何平均力価１６．３９。示されるように、肺に見られた合計コロニー形成単位は、３日目および７日目に、コントロール・マウスに対して免疫付与マウスにおいて少ない。 同一タンパク質上の異なる遺伝子座におけるペプチド領域の配列に由来するペプチド、および／または、同一の株、種または生物内の異なるタンパク質に由来するペプチドを用いた、異種ワクチンポリペプチドの略図を示す。 Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００の設計を示す。この例では、個々のタンパク質および特定のペプチドが、ｄｅ Ｇｏｕｗらによるそのタンパク質の相対的発現の値とともに挙げられている。連結されたペプチドの線形配列が、それぞれのＢｐ Ｐｏｌｙに組み込まれた実際のペプチド配列とともに示される。交互の赤／黒（赤は、白黒表示中、イタリック体である）は、個々のペプチド間の区分を表わす。さらに、それぞれのＢｐ Ｐｏｌｙに関する計算された分子量およびｐＩが示される。ａ）Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ株におけるタンパク質のＮＣＢＩアクセッションナンバー。添え字は我々の所定のペプチド番号である。ｂ）精選されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＢＰ）タンパク質の名称。ｃ）遺伝子の名称または機能（公知の場合）。Ｃｏｎ．Ｈｙｐ＝保存された仮設。ｄ）ｄｅ Ｇｏｕｗら^１のデータに基づくｍＲＮＡの相対存在量。トランスクリプトーム解析によって決定された遺伝子の相対的発現。値は、０から５２，５４９（最大に発現される分泌タンパク質，ｐｔｘＡ）までの範囲である。 Ｂｐ Ｐｏｌｙ １０１の設計を示す。この例では、個々のタンパク質および特定のペプチドが、ｄｅ Ｇｏｕｗらによるそのタンパク質の相対的発現の値とともに挙げられている。連結されたペプチドの線形配列が、それぞれのＢｐ Ｐｏｌｙに組み込まれた実際のペプチド配列とともに示される。交互の赤／黒（赤は、白黒表示中、イタリック体である）は、個々のペプチド間の区分を表わす。さらに、それぞれのＢｐ Ｐｏｌｙに関する計算された分子量およびｐＩが示される。ａ）Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ株におけるタンパク質のＮＣＢＩアクセッションナンバー。添え字は我々の所定のペプチド番号である。ｂ）精選されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＢＰ）タンパク質の名称。ｃ）遺伝子の名称または機能（公知の場合）。Ｃｏｎ．Ｈｙｐ＝保存された仮設。ｄ）ｄｅ Ｇｏｕｗら^１のデータに基づくｍＲＮＡの相対存在量。トランスクリプトーム解析によって決定された遺伝子の相対的発現。値は、０から５２，５４９（最大に発現される分泌タンパク質，ｐｔｘＡ）までの範囲である。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ株を感染させたマウスの肺における細菌力価を示す。コントロール。バー内の数字は、それぞれの時点における各コホート内の動物の数を示す。 ＢＶＰ Ｈｉ Ｐｏｌｙ １で免疫付与されたラット由来の免疫前および免疫後血清を用いた１２個のインフルエンザ株の生細胞ＥＬＩＳＡを示す。 細菌ワクチンポリペプチドＨｉ Ｐｏｌｙ １の組成物を示す。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １は、示されるように各末端にＢａｍＡ－３を有し、Ｎ末端にＨｉｓタグを有しており、インフルエンザ菌ペプチドの線形配列として設計された。組み合わせられたインフルエンザ菌ペプチドのアミノ酸の長さおよび全体サイズを示す。 精製されたＨｉ Ｐｏｌｙ １のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １をニッケル・アフィニティーカラムから溶出して、溶出液の画分を変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって試験した。分子量マーカー（レーンＡ）を用いてポリペプチド（レーンＢ）のサイズを概算した。 Ｈｉ Ｐｏｌｙ １で免疫付与されたチンチラ由来の抗血清のＥＬＩＳＡを示す。抗血清を、全ポリペプチドおよび個々の構成要素ペプチドに対して試験した（データは、ＨｉＰｏｌｙ１におけるペプチドと同じ桁で示される）。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １による最終免疫付与の１４日後に回収された４０個のチンチラ抗血清サンプルの平均ｌｏｇ２変換力価。 Ｈｉ Ｐｏｌｙ １に対して産生された抗血清によって防御が与えられることを示す。防御は、菌血症の幼ラットモデルにおいて判定された。幼ラットを、チンチラ抗－ＨｉＰｏｌｙ１ ＢＶＰ抗血清（ＢＶＰ）の対応する（ｍａｔｃｈｅｄ）免疫前血清（ＰＩＳ）またはＰＢＳを用いて処置した。２４時間後、全てのラットにＮＴＨｉ株Ｒ２８６６を曝露して、さらに２４時間後、菌血症力価を決定するために血液を回収した。ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定を用いて菌血症力価を比較（平均±ＳＤ）ｐ＝０．０１８（ＰＢＳ対ＢＶＰ）およびｐ＝０．００９８（ＰＩＳ対ＢＶＰ）。 ＮＴＨｉ ８６－０２８ＮＰを曝露されたチンチラにおけるＯＭの鼓膜聴力検査の評価を示す。鼓膜の幅およびコンプライアンスに基づいて中耳炎に関してポジティブであると鼓室造影法によって判定された耳のパーセンテージを示す。コントロール・チンチラ（アジュバントのみで免疫付与）を青で示し、ＢＶＰ Ｈｉ Ｐｏｌｙ １で免疫付与したチンチラを緑で示す。鼓膜聴力検査は、３、７、１０、および１４日目に行なわれた。フィッシャー直接検定を用いて、コントロールとＢＶＰ動物の間には、７日目および１０日目に統計的有意差があった（それぞれｐ＝０．０００２および０．０００４）。バー内の数字は、ポジティブの耳の数および試験された全コホートのサイズを示す）。 ＮＴＨｉ ８６－０２８ＮＰを曝露されたチンチラにおける中耳炎の盲検ビデオ耳鏡検査の評価を示す。中耳炎に関してポジティブであると盲検耳鏡検査によって判定された耳のパーセンテージを示す。コントロール・チンチラ（アジュバントのみで免疫付与）を青で示し、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １で免疫付与したチンチラを緑で示す。耳鏡検査は、３、７、１０、および１４日目に行なわれた。フィッシャー直接検定を用いて、コントロールとＢＶＰ動物の間には、７、１０および１４日目に統計的有意差があった（それぞれ、ｐ＝０．０００１、０．０００１および０．０１９）。バー内の数字は、ポジティブの耳の数および試験された全コホートのサイズを示す。 検出可能な滲出液を有する中耳（ＭＥＥ）のパーセンテージを示す。コントロール群（青）およびＢＶＰ ＨｉＰｏｌｙ １免疫付与（緑）チンチラ群における、検出可能な中耳滲出液があった耳の数を示す。耳は、３回の別個のタップ後に流体が観察されない場合にドライと判定した。サンプリングは、３、７、１０、および１４日目に行なわれた。フィッシャー直接検定を用いて、コントロールとＢＶＰ動物の間には、１０日目および１４日目に統計的有意差があった（それぞれ、ｐ＝０．０００１および０．０００２８）。バー内の数字は、ポジティブの耳の数および試験された全コホートのサイズを示す。 中耳滲出液（ＭＥＥ）における細菌力価を示す。コントロール動物（青）およびＢＶＰ Ｈｉ Ｐｏｌｙ １で免疫付与した動物（緑）に関する細菌力価（ｃｆｕ／ｍｌ）を示す。検出可能な中耳流体がない動物由来のデータを、０ ｃｆｕ／ｍｌとした（ｉｍｐｕｔｅｄ ａｓ）。コントロール群とＨｉ Ｐｏｌｙ １群の間の差は、１０日目および１４日目に有意であった（それぞれ、ｐ＝０．００４および０．０００７４；ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定）。バー内の数字は、それぞれの群における動物の合計数である。

本開示は、特定の実施態様では、疾患を引き起こす生物（１つの例では百日咳菌（Ｂｐ））に対する抗体産生を誘発することが可能な免疫原性ペプチドに関する。本開示はまた、特定の実施態様では、免疫原性ペプチドを含む融合ポリペプチドおよび担体分子、ならびに、これらの免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、および／またはペプチドを保有している担体分子を含む免疫原性組成物に関する。

本開示はまた、特定の実施態様では、疾患を引き起こす生物の１つまたは複数の株に対する抗体応答を生じさせる、上記免疫原性ペプチド／ポリペプチド／担体分子／免疫原性組成物の使用方法に関する（Ｂｐ、例えば（限定としてではないが）、ワクチンとして、または、対象の能動もしくは受動免疫付与のための抗血清を産生するため）。

本開示のペプチド、融合ポリペプチド、および担体分子組成物、ならびにそれらの使用方法の様々な実施態様をより詳細にさらに説明する前に、本開示は、以下の説明に記載される方法および組成物の詳細に対する適用に制限されないことが理解されるべきである。本明細書中に提供される説明は、例示目的のみを意図しており、限定する意味で解釈されることを意図しない。本開示は、他の実施態様が可能であり、または、様々な方法で実施もしくは実行されることが可能である。したがって、本明細書中で用いられる言語は、できるだけ幅広い範囲および意味が与えられることが意図されており、実施態様は例示的であることを意味し、網羅的ではない。また、本明細書中で用いられる語法および専門用語は説明目的のためであり、別段の指示がない限り限定としてみなされるべきでないと理解される。さらに、以下の詳細な説明において、非常に多くの具体的な詳細が、本開示のより徹底的な理解を提供するために示されている。しかしながら、本開示の様々な実施態様がこれらの具体的な詳細を用いずに実施され得ることが当業者に明らかである。

他の例では、当業者によく知られた特徴は、説明の不必要な複雑化を避けるために、詳細には説明されていない。当業者に明らかな全ての代替、置換、改変、および等価物は、本明細書中で定義されるように本開示の範囲内に含まれることが意図される。したがって、以下に説明される実施例（特定の実施態様を含む）は、本開示の実施を例示するのに役立ち、示される詳細（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｓ）は、例としてのものであり、特定の実施態様の例示的な考察目的のみのためであり、手順ならびに本開示の原理および概念的態様の有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されることが理解される。

本明細書中に開示される組成物ならびにそれらの生産および適用および使用の方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をせずに作製および実施され得る。したがって、本開示の組成物および方法は、特定の実施態様の観点から説明されているが、組成物および／または方法に対して、ならびに、本明細書中に記載の方法のステップまたはステップの順番において、バリエーションが、本開示の概念、主旨、および範囲を逸脱せずに適用され得ることが当業者に明らかである。

本明細書中で言及される全ての特許、公開された特許出願、および非特許文献は、本開示が属する当業者のレベルを示すものである。

本明細書において別段の定義がない限り、本開示との関連で用いられる科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別段の要求がされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。

本開示の方法および組成物に従って使用されるように、以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解される：

語「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに用いられる場合、「１つの（ｏｎｅ）」を意味し得るが、「１つまたは複数の」、「少なくとも１つの」および「１つまたは１つよりも多くの」という意味とも一致する。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替のみを指すことを明確に指示または代替が相互排他的である場合でない限り、「および／または」を意味するために用いられるが、その開示は、代替のみと、「および／または」を指す定義をサポートする。「少なくとも１つの」という用語の使用は、１つおよび１を超える（制限されないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、またはその中に含まれる任意の整数を含む）任意の量を含むことが理解される。用語「少なくとも１つ」は、それが付けられる用語に応じて、１００まで、または１０００まで、またはそれよりも多くまでに及んでよく；さらに、１００／１０００という量は、より高い限界もまた満足する結果を生じさせ得るので、限定と考えるべきでない。さらに、「Ｘ、Ｙ、およびＺの少なくとも１つ」という用語の使用は、Ｘのみ、Ｙのみ、およびＺのみ、ならびに、Ｘ、Ｙ、およびＺの任意の組み合わせを含むと理解される。

本明細書および特許請求の範囲において用いられるように、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および、ｈａｖｉｎｇの任意の形態、例えば、「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態、例えば、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」）、または、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態、例えば、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」）は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されないエレメントまたは方法ステップを排除しない。

本明細書において用いられる用語「またはそれらの組み合わせ」は、その用語に先行する列挙されたアイテムの全ての並べ替えおよび組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣの少なくとも１つ、および、特定の文脈において順番が重要ならば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢも含むことが意図される。この例で続けると、１つまたは複数のアイテムまたは用語の繰り返しを含む組み合わせ、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどが明白に含まれる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、典型的に、任意の組み合わせにおけるアイテムまたは用語の数に制限はないことを当業者は理解している。

本出願全体を通して、用語「約」は、値が、組成物、組成物を投与するために用いられる方法に関する本来備わっている誤差変動、または、試験対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。本明細書において用いられる修飾語句「約」または「およそ」は、正確な値、量、程度、方向、または、他の認定された（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）特徴または値を含むことが意図されるだけでなく、測定誤差、製造の許容誤差、様々な部分または構成要素に対するストレス、観察者誤差、摩耗、およびそれらの組み合わせなどに起因するいくつかのわずかな変動も含むことが意図される。用語「約」または「およそ」は、量、時間的な持続などの測定可能な値に対して言及ときに本明細書において用いられる場合、例えば、規定の値から±１０％の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示される方法を実施するのに適切であり、当業者によって理解されるとおりである。本明細書において用いられる用語「実質的に」は、続いて記載されるイベントまたは状況が完全に生じること、または、続いて記載されるイベントまたは状況がかなりの程度または度合いまで生じることを意味する。例えば、用語「実質的に」は、続いて記載されるイベントまたは状況が、時間の少なくとも９０％、または時間の少なくとも９５％、または時間の少なくとも９８％、生じることを意味する。

本明細書において用いられる、「一実施態様（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施態様（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という言及はいずれも、その実施態様に関して記載される特定のエレメント、特色、組成物、構造、または特徴が、少なくとも１つの実施態様に含まれることを意味する。本明細書中の様々な場所における「一実施態様では」という語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施態様を指しているわけではない。

用語「突然変異体」または「変異体」は、タンパク質、ペプチド、または核酸の野生型バージョンとは異なるアミノ酸またはヌクレオチドを少なくとも１つ有するタンパク質、ペプチド、または核酸を指すことを意図し、制限されないが、点置換、複数の連続または非連続の置換、キメラ、または融合タンパク質、およびそれらをコードする核酸を含む。保存的アミノ酸置換の例は、限定されないが、同一のグループ内、例えば、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）および小さなアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、およびメチオニン）のグループ内になされる置換を含む。あり得る置換の他の例は以下に記載される。

「薬学的に許容できる」という用語は、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の有害な副作用（例えば、毒性、炎症、および／またはアレルギー反応）を伴わずにヒトおよび／または動物へ投与するのに適切な、化合物および組成物を指す。

「生物学的に活性」とは、活性薬剤がどのようにその生理学的効果を有するのか言及せずに、生物の生理系を改変する能力を意味する。

本明細書において用いられる、「純粋」または「実質的に純粋」は、対象種が、存在する優勢種である（すなわち、モル基準で、その組成物内の任意の他の対象種よりも大量である）ことを意味し、特に、実質的に精製された画分は、対象種が、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０％（モル基準）を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物内に存在する全ての巨大分子種の約８０％よりも多く、より具体的には、約８５％よりも多く、約９０％よりも多く、約９５％よりも多く、または、約９９％よりも多くを含む。用語「純粋」または「実質的に純粋」は、対象種（例えば、ペプチド化合物）が、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも７０％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも７５％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも８５％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも９２％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも９５％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも９６％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも９７％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも９８％（ｗ／ｗ）純粋、または少なくとも９９％（ｗ／ｗ）純粋、または１００％（ｗ／ｗ）純粋である製剤も指す。

用語「対象」および「患者」は、本明細書において相互交換可能に用いられ、温血動物、特に哺乳類を指すことが理解される。この用語の範囲および意味内の動物の非限定的な例は、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、チンチラ、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物園の動物、旧世界ザルおよび新世界ザル、非ヒト霊長類、ならびにヒトを含む。

「処置」は、治療的な処置を指す。「予防」は、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防の（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置手順を指す。用語「処置」は、治療的目的のために患者へ組成物を投与することを指す。

用語「治療的組成物」および「医薬組成物」は、当技術分野で知られている、または本明細書において他の方法で検討される、任意の方法によって対象へ投与され得る活性薬剤を含んでいる組成物を指し、ここで、組成物の投与は、本明細書中の他のどこかに記載される治療的効果をもたらす。さらに、本開示の組成物は、当技術分野でよく知られている製剤化技術を用いて、遅延された、制御された、延長された、および／または、持続した放出を提供するように設計されてよい。

用語「有効量」は、本開示の様式で用いられる場合、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な有害な副作用（例えば、毒性、炎症、およびアレルギー反応）を伴わずに検出可能な治療的効果を示すのに十分な活性薬剤の量を指す。患者のための有効量は、患者のタイプ、患者のサイズおよび健康、治療される症状の性質および重症度、投与方法、治療の持続時間、同時的な療法の性質（あるならば）、用いられる特定の製剤などに依存する。したがって、正確な有効量を前もって明示することは不可能である。しかしながら、特定の状況に関する有効量は、本明細書において提供される情報に基づいてルーチン実験を用いて当業者によって決定され得る。

用語「ペプチド」は、本明細書において、典型的に隣接アミノ酸のα－アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに結合されてアミノ酸配列を形成する一連のアミノ酸残基を指すために用いられる。単語「ペプチド」は、長さを定義することを意図しないが、タンパク質の一部であることのみ意図する。特に、表面露出ペプチドは、抗体結合に曝露されるタンパク質の任意の領域である。特定の実施態様では、免疫原性ペプチドは、８から１５まで２５まで４０まで６０まで７５まで１００まで、またはより多くのアミノ酸、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個のアミノ酸の長さの範囲であってよい。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書において、典型的に隣接アミノ酸のα－アミノ基とカルボニル基の間でペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を指すために用いられて、ここで、長さは、単一ペプチドよりも長い。「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は（相互交換に用いられてよく）、連続的な立体配置でペプチドを結合するために組み換えまたは合成方法によって作製されたタンパク質またはポリペプチドを指す。

本明細書において用いられる「免疫原性組成物」は、宿主細胞または宿主生物において抗体産生などの免疫応答を誘発する、例えば、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、または、ペプチドもしくはポリペプチドがコンジュゲートされた担体分子を含んでいる組成物を指す。免疫原性組成物は、アジュバントを含んでもよい。特定の実施態様では、免疫原性組成物はワクチンである。

本明細書において用いられる場合、用語「抗原性フラグメント」は、免疫原性応答を誘発することも可能な本明細書において記載される抗原性ペプチドのフラグメントを指す。

本明細書において用いられる用語「相同」または「同一性％」は、対応する参照（例えば、野生型）の核酸、ペプチド、またはタンパク質に対してある程度の相同性を有する核酸（またはそのフラグメント）またはアミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）を意味し、７０％以上、または８０％以上、または８５％以上、または８６％以上、または８７％以上、または８８％以上、または８９％以上、または９０％以上、または９１％以上、または９２％以上、または９３％以上、または９４％以上、または９５％以上、または９６％以上、または９７％以上、または９８％以上、または９９％以上であってよい。例えば、ペプチドまたはポリペプチドに関しては、本明細書において記載される相同性または同一性のパーセンテージは典型的に、１００アミノ酸の長さに４つのギャップがそのアライメント内に補助のために導入されてよい場合に、比べられる配列内の同一のアミノ酸残基で並べられた２つの配列の短い方に見られるアミノ酸残基のパーセンテージとして計算される（Ｄａｙｈｏｆｆによって、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，ｐ．１２４，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７２）に記載される）。一実施態様では、上述の相同性パーセンテージは、２つの配列の短い方に見られて２つの配列の長い方にも見ることのできる（ギャップの導入を伴う）、構成要素のパーセンテージとして計算されて、構成要素は、４つの連続するアミノ酸の配列として定義される。実質的に相同であるものとして、天然のタンパク質産物に対する抗体との交差反応性のおかげで単離され得る任意のタンパク質産物も含まれる。配列同一性または相同性は、配列ギャップを最小限にしながらオーバーラップおよび同一性を最大限にするように並べた場合の配列を比較することによって決定することができる。特に、配列同一性は、複数の数学的アルゴリズムのいずれかを用いて決定され得る。２つの配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４－２２６８；Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３－５８７７）において改変）のアルゴリズムである。少なくとも１つの実施態様では、「同一性％」は、同一の活性を有するタンパク質または同様のタンパク質をコードする、２つの配列内の対応する位置において同一である、アミノ酸またはヌクレオチドの数を指す。例えば、それぞれ１００個の残基を有する２つのアミノ酸配列は、対応する位置におけるアミノ酸の９５個が同一である場合、９５％同一性を有する。同様に、それぞれ１００個の残基を有する２つのアミノ酸配列は、対応する位置におけるアミノ酸の少なくとも９０個が同一である場合、少なくとも９０％の同一性を有する。同様に、それぞれ２０個の残基を有する２つのアミノ酸配列は、対応する位置におけるアミノ酸の１９個が同一である場合は９５％同一性を有し、または、対応する位置におけるアミノ酸の少なくとも１８個が同一である場合は９０％同一性を有し、または、対応する位置におけるアミノ酸の少なくとも１７個が同一である場合は８５％同一性を有し、または、対応する位置におけるアミノ酸の少なくとも１６個が同一である場合は８０％同一性を有する。

さらに、本明細書において、配列が参照配列「と少なくともＸ％同一性」を有すると説明される場合、別段の指示がない限り、例えば、（Ｘ＋１）％、（Ｘ＋２）％、（Ｘ＋３）％、（Ｘ＋４）％など、Ｘ％よりも大きい１００％までの全てのパーセンテージを含むことを意図する。

配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ（１９８８）４：１１－１７）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメント・ソフトウェア・パッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いることができる。局所配列類似性およびアライメントの領域を同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：２４４４－２４４８）において記載されるＦＡＳＴＡアルゴリズムである。

別のアルゴリズムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェア（いくつかのＵＮＩＸプラットフォームのためのＷＵ－ＢＬＡＳＴバージョン２．０実行可能プログラム）である。このプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいており、それはパブリックドメインＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づいている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ＆Ｇｉｓｈ，１９９６，Ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６，４６０－４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９０，２１５，４０３－４１０；Ｇｉｓｈ＆Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９３、３：２６６－２７２；Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３－５８７７；全て、参照により本明細書中に援用される）。

本明細書において他に言及されるものに加えて、ＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）によって提供される）のプログラムも参照される。これらのプログラムは、この目的のために当該分野において広く用いられ、２つのアミノ酸配列の相同領域を並べることができる。スイート内の全ての検索プログラムにおいて、ギャップ付きアライメントのルーチンは、データベース検索自体に統合される。ギャップ付けは必要に応じてオフにすることができる。長さ１のギャップに関するデフォルトのペナルティ（Ｑ）は、タンパク質およびＢＬＡＳＴＰについてはＱ＝９であり、ＢＬＡＳＴＮについてはＱ＝１０であるが、任意の整数に変更してよい。デフォルトの、ギャップ伸長のための残基あたりのペナルティー（Ｒ）は、タンパク質およびＢＬＡＳＴＰについてはＲ＝２であり、ＢＬＡＳＴＮについてはＲ＝１０であるが、任意の整数に変更してよい。配列ギャップを最小限にしながらオーバーラップおよび同一性を最大限にするように配列を並べるために、ＱおよびＲに関する値の任意の組み合わせを用いることができる。デフォルトのアミノ酸比較マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であるが、ＰＡＭなどの他のアミノ酸比較マトリックスを使用することができる。

本明細書において用いられる用語「ポリヌクレオチド配列」または「核酸」は、ペプチドまたは融合タンパク質（またはポリペプチド）をコードする任意のポリヌクレオチド配列を含み、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態、または、クローニングによって得られる、または化学合成技術によって生産される、またはそれらの組み合わせによる、例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態のポリヌクレオチドを含む。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖ＤＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であってよく、または、非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）であってよい。ペプチドまたは融合タンパク質をコードする、または治療的に効果的なそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド配列は、免疫原性が活性のペプチドまたは融合タンパク質をコードする限り、内因性コード配列のコード配列と実質的に同一であってよい。さらに、ペプチドまたは融合タンパク質は、遺伝子コードの縮退または対立遺伝子変異に起因してコドン使用頻度が異なるポリヌクレオチド配列（単数または複数）を用いて発現されてよい。さらに、本開示のペプチドおよび融合タンパク質およびそれらをコードする核酸は、さらなる置換（保存的または非保存的）を含むペプチド／タンパク質および核酸の変異体を含む。

例えば、免疫原性ペプチド変異体は、限定されないが、本明細書に開示される配列と全く同じではないが、本明細書中に挙げられる様々な配列に関して明確に記載される置換に加えて、本明細書において記載される変異体の活性または特性を実質的に損なわないアミノ酸残基のさらなる置換（保存的または非保存的）を有する変異体を含む。そのような保存的アミノ酸置換の例は、限定されないが：ａｌａからｇｌｙ、ｓｅｒ、またはｔｈｒ；ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓ、またはｌｙｓ；ａｓｎからａｓｐ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｓｅｒ、またはｔｈｒ；ａｓｐからａｓｎまたはｇｌｕ；ｃｙｓからｓｅｒ；ｇｌｎからａｒｇ、ａｓｎ、ｇｌｕ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、またはｍｅｔ；ｇｌｕからａｓｐ、ｇｌｎ、またはｌｙｓ；ｇｌｙからｐｒｏまたはａｌａ；ｈｉｓからａｒｇ、ａｓｎ、ｇｌｎ、またはｔｙｒ；ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、またはｖａｌ；ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、またはｖａｌ；ｌｙｓからａｒｇ、ａｓｎ、ｇｌｎ、またはｇｌｕ；ｍｅｔからｇｌｎ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、またはｖａｌ；ｐｈｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｔｒｐ、またはｔｙｒ；ｓｅｒからａｌａ、ａｓｎ、ｍｅｔ、またはｔｈｒ；ｔｈｒからａｌａ、ａｓｎ、ｓｅｒ、またはｍｅｔ；ｔｒｐからｐｈｅまたはｔｙｒ；ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅまたはｔｒｐ；および、ｖａｌからｉｌｅ、ｌｅｕ、またはｍｅｔを含んでよい。当業者は、そのような変異体を、作製し、同定し、選択し、または、１つまたは複数の疾患を引き起こす生物に対する免疫原性活性に関して試験する方法を容易に知っている。

用語「感染」、「形質導入」および「トランスフェクション」は本明細書において相互交換可能に用いられ、コードされるタンパク質産物が発現されるように細胞内に遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチド配列を導入することを指す。本開示のポリヌクレオチドは、さらなる配列、例えば、同一転写ユニット内のさらなるコード配列、制御エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、ポリアデニル化部位、同一または異なるプロモーターの制御下のさらなる転写ユニット、クローニング、発現、相同組み換え、および宿主細胞の形質転換を可能にする配列、および、本開示の実施態様を提供するのに望ましくあり得る任意のそのような構築物を含んでよい。

特定の実施態様では、本開示は、本明細書中に記載の１つまたは複数の融合ポリペプチドを発現することが可能な発現ベクターを含む。異なる細胞型のための発現ベクターは当技術分野でよく知られており、過度の実験を伴わずに選択することができる。一般に、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現ベクター、例えば（制限されないが）プラスミド内に、発現のために適切な方向および正しいリーディングフレームで挿入される。必要であれば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてよいが、そのような制御は発現ベクターにおいて一般に利用可能である。それから、ベクターは、標準的な技術によって宿主内に導入される。ガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ ２００１））に見ることができる。

ワクチン内に含まれる各ペプチドの最適量および最適投与レジメンは、当業者によって過度の実験を伴わずに決定され得る。例えば（限定としてではないが）、ペプチドまたはその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注入、皮下（ｓ．ｃ．）注入、皮内（ｉ．ｄ．）注入、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注入のために調製されてよい。ＤＮＡ注入の特定の非限定的な経路は、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、および静脈内である。ペプチドは、実質的に純粋であってよく、または１つまたは複数の免疫刺激アジュバント（本明細書中の他のどこかに議論される）と組み合わせてよく、または、免疫刺激サイトカインと組み合わせて用いてよく、または、適切な送達システム、例えば（制限されないが）リポソームによって投与されてよい。アジュバントは、免疫応答（例えば、抗原に対してＣＴＬおよびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって仲介される免疫応答）を非特異的に強化または増強する物質であり、したがって、ワクチンとして用いた場合に本開示の組成物において有用であると考えられる。適切なアジュバントは、限定されないが：１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、例えば、制限されないが、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、または硫酸アルミニウム、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０、８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、Ｍｏｌｏｇｅｎ’ｓ ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、インターフェロン－αまたは－β、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭｓ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル・リピドＡ、および他の非毒性ＬＰＳ誘導体、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０／１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、およびＯＭ－１７４を含む。

他の薬学的に適切なアジュバントの非限定的な例は、非毒性リピドＡ関連のアジュバント、例えば、非限定的な例として、非毒性モノホスホリル・リピドＡ（例えば、Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．１０：ｓ３２－ｓ３７（２００２）を参照）、例えば、３ Ｄｅ－０－アシル化モノホスホリル・リピドＡ（ＭＰＬ）（例えば、イギリス特許出願番号ＧＢ２２２０２１１を参照）を含む。他の有用なアジュバントは、ＱＳ２１およびＱｕｉｌＡを含み、それは、トリテルペングリコシドまたは南米に見られるＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅの樹皮から単離されるサポニンを含む（例えば、Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）；および米国特許番号５，０５７，５４０を参照）。他の適切なアジュバントの非限定的な例は、多量体または単量体アミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸またはポリリジン、リポソーム、およびＣｐＧを含む（例えば、Ｋｌｉｎｍａｎ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００６）２５（３－４）：１３５－５４）、および米国特許番号７，４０２，５７２を参照）。本明細書中に開示される組成物において用いられ得るアジュバントの他の例は、限定されないが、米国特許番号８，８９５５，１４に開示されるものを含む。

細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、無傷の外来抗原自体よりむしろ、ＭＨＣ分子（例えば、クラスＩまたはＩＩ）に結合したペプチドの形態での抗原を認識する。ＭＨＣ分子自体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面に位置する。したがって、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、およびＡＰＣの三量体複合体が存在する場合にのみ可能である。それに相応して、本開示の特定の実施態様は、ＭＨＣ分子を介して提示されたペプチドを有するＡＰＣを含んでいる組成物を含む。

他の実施態様では、組成物は、糖類、糖アルコール類、アミノ酸、例えば、グリシン、アルギニン、グルタミン酸およびその他を、フレームワーク・フォーマーとして含んでよい。糖類は、単糖類、二糖類、または三糖類であってよい。これらの糖類は、単独および糖アルコール類と組み合わせて用いてよい。糖類の非限定的な例は、単糖類として、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトースまたはソルボース；二糖類として、ショ糖、ラクトース、マルトースまたはトレハロース；および、三糖類としてラフィノースを含む。糖アルコールは、例えば（限定としてではないが）、マンニトールおよび／またはソルビトールであってよい。さらに、組成物は、生理学的に十分許容性のある賦形剤、例えば、（制限されないが）アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤；フェノール、ｍ－クレゾール、メチル－もしくはプロピルパラベン、クロロブタノール、チオメルサール（チメロサール）、または塩化ベンザルコニウムのような保存剤；および、可溶化剤、例えば、ＰＥＧ３０００、３３５０、４０００もしくは６０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または、シクロデキストリン、例えば、ヒドロキシプロピル－シクロデキストリン、スルホブチルエチル－シクロデキストリンまたはｙ－シクロデキストリン、または、デキストラン類またはポロキシマー類、例えば、ポロキシマー４０７、ポロキシマー１８８、Ｔｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０を含んでよい。

他の実施態様では、本開示は、（ａ）本明細書中に記載の１つまたは複数の医薬組成物を、溶液または凍結乾燥された形態で含むコンテナー；（ｂ）凍結乾燥された製剤のための希釈剤または再構成溶液を含んでいる第２のコンテナー（任意選択）；および（ｃ）（ｉ）溶液の使用または（ｉｉ）凍結乾燥された製剤の再構成および／または使用に関する説明書を含んでいてもよい、キットを含む。キットは、（ｉｉｉ）バッファー、（ｉｖ）希釈剤、（ｖ）フィルター、（ｖｉ）針、または（ｖｉｉ）シリンジのうちの１つまたは複数をさらに含んでよい。コンテナーは（特定の、非限定的な実施態様では）、ボトル、バイアル、シリンジ、または試験管であり；多数回使用のコンテナーであってよい。コンテナーは、（制限されないが）ガラスまたはプラスチックのような様々な材料で形成されてよい。キットおよび／またはコンテナーは、再構成および／または使用のための指導を示すコンテナーに対するまたは関する説明書を含んでよい。例えば、ラベルは、凍結乾燥された製剤が上述のペプチド濃度に再構成されるべきであることを示してよい。ラベルは、製剤が皮下または筋肉内投与に有用であること、またはそれを意図することをさらに示してよい。製剤を保持しているコンテナーは、多数回使用のバイアルであってよく、再構成された製剤の繰り返しの投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする。キットは、適切な希釈剤（例えば、炭酸水素ナトリウム溶液）を含んでいる第２のコンテナーをさらに備えてよい。キットは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書付きの添付文書を含む、工業上およびユーザの立場から望ましい他の材料をさらに含んでよい。

免疫原性ペプチド（および、融合ポリペプチド、二量体ペプチド、全長もしくは成熟タンパク質、または、タンパク質を発現している細菌）に特異的に結合する抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＡに属していてよい。本明細書中に記載の免疫原性ペプチドおよび融合ポリペプチドを特徴付けるために、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体の使用が所望され得る。抗体は、動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ）および哺乳類（限定されないが、マウス、ラット、チンチラ、ハムスター、ウサギ、他の齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、または他の霊長類を含む）から取得されてよく、またはそれらに由来してよい。本明細書中に記載されるように、ポリクローナル抗血清は、免疫原性ペプチド（単数または複数）、融合ポリペプチド（単数または複数）を含んでいる免疫原性組成物を用いて動物に免疫付与することによって、動物から取得される。

本明細書中に記載の免疫原性ペプチドまたは融合ポリペプチドに対して抗体が結合するレベルは、当業者によって日常的に実施される任意の１つまたは複数の免疫測定法を用いて容易に決定することができる。非限定的な例として、免疫測定法は、ＥＬＩＳＡ、イムノブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む。

任意の１つまたは複数の免疫原性ペプチド、融合ポリペプチド、またはそれらを含む免疫原性組成物を用いて免疫付与され得る非ヒト動物は、非限定的な例として：マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、フェレット、イヌ、ネコ、ラクダ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ニワトリ、ラマ、および非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル・マカク、チンパンジー、アカゲザル、オラウータン、およびヒヒ）を含む。非ヒト動物の免疫付与のために典型的に用いられるアジュバントは、限定されないが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ、Ｒｉｂｉアジュバント・システム（ＲＡＳ）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、およびニトロセルロース吸着抗原を含む。一般に、最初の注入後、対象は、とりわけ、免疫原、アジュバント（あるならば）、および／または特定の対象種によって異なってよい特定の（制限されない）スケジュールに従って、１つまたは複数のブースター免疫付与を受ける。

動物対象において、免疫応答は、動物を定期的に出血させて、回収した血液から血清を分離して、免疫測定法、例えば（制限されないが）ＥＬＩＳＡアッセイにおいて血清を分析して、特定の抗体力価を決定することによってモニターされ得る。十分な抗体力価が実証されたら、動物対象を定期的に出血させてポリクローナル抗血清を蓄積させてよい。それから、免疫原に特異的に結合するポリクローナル抗体が、当業者によって理解されるように、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって、適切な固体支持体上に固定化されたプロテインＡまたはプロテインＧを用いて、免疫の抗血清から精製され得る。アフィニティークロマトグラフィーが行なわれてよく、ここで特定の免疫付与された動物対象のＩｇ定常領域に特異的な抗体が、適切な固体支持体上に固定化されている。アフィニティークロマトグラフィーは、１つまたは複数の免疫原性ペプチド、または融合タンパク質の使用を組み込んでもよく、そのことは、ポリクローナル抗体を、特定の免疫原性ペプチドに対するそれらの結合活性によって分けるのに有用であり得る。免疫原性ペプチドおよび／または融合タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、および所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生する不死の真核生物細胞株（例えば、ハイブリドーマ）はまた、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－９７（１９７６）；および、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１－１９（１９７５））の技術およびそれに対する改良を用いて調製され得る。

本明細書中に記載の免疫原性組成物は、複数の免疫原性ペプチドおよび／または複数の融合ポリペプチドおよび／または担体分子に連結された免疫原性ペプチドを、少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせることによって製剤化されてよい。本明細書中に記載されるように、免疫原性組成物は、薬学的に適切なアジュバントをさらに含んでよい。典型的に、対象へ投与されることが意図される全ての免疫原性ペプチドまたは全ての融合ポリペプチドは、単一の免疫原性組成物において組み合わされ、それは、少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤を含んでよく、少なくとも１つの薬学的に適切なアジュバントをさらに含んでよい。あるいは、例えば、複数の免疫原性組成物は、別個の投与のために別々に製剤化されてよく、それは、本明細書中に記載またはその他の当技術分野で知られている任意の経路によるものであってよく、連続的または同時的であってよい。

本明細書中に記載の免疫原性組成物は、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁液、またはエマルションとして製剤化されてよく、それらは、本明細書中に記載のように、生理的に許容できる賦形剤（担体と呼んでもよい）および／または希釈剤を追加で含んでもよい。免疫原性組成物は、固体、液体、または気体（エアロゾル）の形態であってよい。あるいは、本明細書中に記載の免疫原性組成物は、凍結乾燥物（すなわち、凍結乾燥された組成物）として製剤化されてよく、または、当技術分野でよく知られている技術を用いてリポソーム内に封入されてよい。本明細書中の他のどこかに記載されるように、免疫原性組成物は、他の構成要素を含んでもよく、それは生物学的に活性または不活性であってよい。かかる構成要素は、限定されないが、バッファー（例えば、中性緩衝塩類またはリン酸緩衝塩類）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質（例えばアルブミン）、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン、抗酸化剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン、安定剤、色素、香料、懸濁剤、および／または防腐剤を含む。一般に、本明細書において議論されるように、賦形剤のタイプは、投与モードに基づき選択される。本明細書中に記載の組成物および製剤は、例えば（限定としてではなく）：局所、口腔、舌、経口、鼻腔内、髄腔内、直腸、膣、眼球内、結膜下、経皮、舌下、または非経口投与を含む任意の適切な投与様式のために製剤化されてよい。

用量サイズは一般に、当該分野の慣例に従って決定されてよい。用量は、処置される対象の体重、重量、または血液容量に依存し得る。一般に、用量中に存在する本明細書中に記載の免疫原性ペプチド（単数または複数）、融合ポリペプチド（単数または複数）、および／または担体分子組成物（単数または複数）の量は、例えば（制限されないが）、約１μｇ～約１００ｍｇ、約１０μｇ～約５０ｍｇ、約５０μｇ～約１０ｍｇの範囲であり、５～５０ｋｇの対象に適切な用量を含む。ブースター免疫付与は、複数回（例えば、２回、３回、４回、またはそれよりも多く）、例えば、約２週～約２６週の範囲の所望の時間間隔、例えば、約２、４、８、１２、１６、または２６週の間隔で投与されてよい。異なる用量の間（例えば、一次用量と二次用量の間、または、二次用量と三次用量の間）の時間間隔は、同一でなくてよく、２つの用量の間の時間間隔は、独立に決定されてよい。治療的に有効量の本開示のペプチドまたは融合ポリペプチドの非限定的な実施態様は、一般に、約０．１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（活性物質の重量／対象の体重）を送達するのに十分な活性物質を含む。特に、組成物は、約０．５μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、より具体的には約１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇを送達する。

特定の実施態様では、本開示は、表１、表３、または表４に示されるペプチド群に記載されるアミノ酸配列、および／または、与えられた群内の前記ペプチド（単数または複数）と少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％、または少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有するそれらの変異アミノ酸配列または変異アミノ酸配列を有する、少なくとも１または２または３または４または５またはそれよりも多い（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多い）異なるペプチド、および薬学的に許容できる担体を含んでいる、ペプチド組成物に関する。

ペプチドは、以下にさらに詳細に記載されるように、鎖状につながれ（ｃｏｎｃａｎｔｅｎａｔｅｄ）（ペプチド間のリンカー配列を用いてまたは用いずに連続してコンジュゲートされて１つまたは複数の融合ポリペプチドを形成する）、または、１つまたは複数の担体分子にコンジュゲートされてよい。例えば、ペプチドは、適切な担体分子、例えば、制限されないが、破傷風トキソイドタンパク質、ジフテリアトキソイドタンパク質、ＣＲＭ１９７タンパク質、髄膜炎菌の外膜複合体、インフルエンザ菌プロテインＤ、百日咳毒素突然変異体、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン、および／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、コンジュゲートまたは他の方法で連結されてよい。用いられ得る担体タンパク質の他の例は、限定されないが、米国特許出願公開２０１３／００７２８８１、２０１３／０２０９５０３、および２０１３／０３３７００６に開示されるものを含む。

特定の実施態様では、１つまたは複数の免疫原性ペプチドは、単一の融合ポリペプチドを含み、またはその中に含まれ、または、１つまたは複数の担体分子に連結される。さらなるペプチドは、第１の融合ポリペプチドを含んでいる組成物とは別個の融合ポリペプチドまたは担体分子内に提供されてもよい。特定の一実施態様では、融合ポリペプチドまたは担体分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個の免疫原性ペプチドを含み、それらの少なくとも５個は互いに異なる。免疫原性ペプチドが融合ポリペプチド上に連結される順番は、本明細書中に記載および当該分野において日常的に実施される方法および技術を用いて当業者によって容易に決定され得て、したがって、順番は、それぞれの融合ポリペプチドの免疫原性の最適化を確実にするために過度の経験的な試行錯誤分析を必要としない。特定の実施態様では、融合ポリペプチドのアミノ末端における免疫原性ペプチドは、融合ポリペプチドのカルボキシ末端において繰り返される（すなわち、重複される）。かかる融合ポリペプチド（融合タンパク質）の形成の方法は、当業者に知られており；したがって、本明細書においてそれについて詳細な議論を含む必要はないと考えられる。しかしながら、融合ポリペプチドの形成のための非限定の例示的な方法は、米国特許番号８，６９７，０８５に示され、その全体は本明細書中に参照により明確に援用される。

さらに他の実施態様では、性質が異種である免疫原性ポリペプチドが開示される。異種とは、同一タンパク質上の異なる遺伝子座におけるペプチド領域の配列に由来する配列および／または、同一の株、種または生物内の異なるタンパク質に由来する配列を有するペプチドからなることを意味する。

本開示の実施態様は、以下の実施例および説明を参照することによってより容易に理解され、それらは上記のとおり、本開示の特定の態様および実施態様の単なる例示目的のために含まれており、限定を意図しない。以下の詳細な実施例および方法は、本開示の様々なペプチド、融合タンパク質、およびペプチドに連結された免疫原性担体分子の作製および使用方法を説明し、上記のとおり、単なる例示であり、どのような方法であっても本開示の限定ではないと解釈されるべきである。当業者は、本明細書中に記載の材料および手順から、適切なバリエーションを即座に認識する。

本明細書中に記載のように、細胞外／表面に露出した、配列が保存されたペプチドを融合ポリペプチドとして送達する手法は、他のワクチン手法に対していくつかの利点がある。第１に、ワクチンは、防御に寄与し得ない多くの領域からなる全体タンパク質の代わりに、防御に有用であるエピトープのみを含む。第２に、これらのワクチンは、実践的な送達システムを同時に用いながら、多くのタンパク質を標的化する。例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対して本明細書中に記載されるように試験された２つのポリペプチド、Ｂｐ Ｐｏｌｙ １およびＢｐ Ｐｏｌｙ ３は、２１個のエピトープ（１３個のタンパク質由来）および３０個のエピトープ（１２個のタンパク質）をそれぞれ標的化する。このことは、防御有効性（標的の数が大きいこと）、および、ワクチンを遺伝学的にエスケープする突然変異体の選択の防止の両方に重要であり得る。

ペプチド単独では、信頼性のある免疫原性であるためには小さすぎる。対照的に、ポリペプチドは免疫原性である。このことは、自己担体として機能する融合ペプチドを除きペプチドを担体タンパク質に付着させることに機能的に似ている。さらに、線形ポリペプチドの製造は単純かつ安価である。

実施例１：抗原の設計
標的となる生物の全ての単離株にわたる推定のワクチン構成要素の存在および保存は、成功的なワクチンの開発にとって必要条件である。したがって、百日咳菌感染のような疾患の予防のための、保存された抗原性標的を探す。はじめに、複数の生物情報学解析ツールを用いて、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ株の推定の表面露出タンパク質（ＳＥＰ）の補体を同定してよく、本質的に、インフルエンザ菌に関して以前に記載されたとおりである（Ｗｈｉｔｂｙ ｅｔ ａｌ ２０１５，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｅ０１３６８６７）。Ｔｏｈａｍａ株のＳＥＰ補体が同定されているので、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおいて利用可能）を用いて、公共データベースにおいて利用可能な全ての完全にシーケンシングされたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ単離株におけるそれぞれのＳＥＰの存在または不存在を決定することができる。この様式で、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの全ての株にわたって保存された全てのＳＥＰが同定された。

同定されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの保存されたＳＥＰを個々に試験して、ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｅｌ Ｐｏｒｔａｌ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｄｅｌｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／）によって利用可能なモデリング・アルゴリズムを用いて他の公知の構造的に定義されたタンパク質に対する相同性を決定した。生じた構造を、Ｃｈｉｍｅｒａを用いて比較および可視化して、潜在的に表面が露出した領域を同定した。

生産されたタンパク質モデルから、２５アミノ酸長よりも大きな予測表面露出領域を選択した。多数の配列アライメントを、それぞれのコアタンパク質について行なった。それぞれの個々のＳＥＰに関する全ての利用可能なＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓタンパク質配列を用いて、これらのアライメントを行なった；アライメントを用いて、それぞれの予測表面露出領域の配列保存を確認した。種にわたってアミノ酸レベルで１００％保存を有する表面露出領域を、さらなる試験のための潜在的なペプチド抗原として選択した。

これらの保存された表面露出ペプチドのサブセットを連続して連結して、３つの個々のポリペプチドを生産した。連結は、選択されたペプチドのそれぞれを順にコードして第１のペプチドが末端で繰り返されている人工ＤＮＡフラグメントを合成することによって達成された（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。人工ＤＮＡフラグメントを、発現ベクターｐＥＴ１００内に挿入して、コードされたポリペプチドの誘導型の発現を可能にし、発現ポリペプチドの金属アフィニティー精製を容易にするためにポリヒスチジン－タグを追加で組み込んだ。

本明細書において用いられるポリペプチド「ＢｐＰｏｌｙ１」は、１３個のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓタンパク質由来の２１個の固有のペプチドを含み、９９ｋＤａの理論分子量を有する。また、本明細書において用いられるポリペプチド「ＢｐＰｏｌｙ３」は、１２個のタンパク質由来の３０個の固有のペプチドを含み、９９ｋＤａの分子量である。

［ポリペプチドの精製］
ポリペプチドをコードするプラスミド構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）内に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、振とうしながら６００ｎｍでＯＤ＝０．５～０．７まで増殖させて、そのＯＤにおいて、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導した。ＩＰＴＧの添加の後に、培養物を振とうしながら４時間インキュベートして、その時点で、細胞を遠心分離によって回収して、その後の精製手順のために凍結させた。

解凍された細胞ペレットを、２００μｇ／ｍｌのリゾチームおよび５０ユニット／ｍｌのｂｅｎｚｏｎａｓｅを含んでいるＣｅｌＬｙｔｉｃＢ（１０ｍｌ／細胞のグラム）中に再懸濁して、１時間室温でインキュベートした。１６，０００ｇで１５分間遠心分離した後に、ペレットを、グアニジン溶解バッファー中に、振動させながら１時間室温で再懸濁させた。２回目の同一の遠心分離後、上清を、平衡化されたＮｉ精製カラムに対する適用のために保存した。３回の洗浄後、Ｎｉカラムに結合したポリペプチドを標準的なプロトコルによって溶出させて、１ｍｌの画分を回収した。精製されたポリペプチドの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価して、＞９０％の純度を有する画分を、その後（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）の使用のために選択した。

［マウスの免疫付与］
１２匹または２４匹のナイーブ雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４～６週齢）のグループを、０、１４、および２８日目に、ミョウバンアジュバント（ＡｄｊｕＰｈｏｓ；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に結合された１０μｇの精製ポリペプチドおよび２μｇのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ；Ｓｉｇｍａ）で筋肉内に免疫付与した。コントロール群は、ＡｄｊｕＰｈｏｓおよびＭＰＬＡのみで免疫付与された。それぞれの免疫付与の前および最終の免疫付与の２０日後に、マウスを出血させて、ＥＬＩＳＡによる抗体力価の決定のために血清を得た。

［マウスの感染］
４９日目に、軽く麻酔したマウスに、２０μｌのＰＢＳ中およそ３，０００ＣＦＵのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ株を鼻腔内に曝露した。１２匹のマウスのコホートから６匹のマウスを、感染後３日目および７日目にそれぞれ安楽死させた。２４匹のマウスのコホートについては、６匹のマウスを、感染後３日目、７日目、１０日目および１４日目にそれぞれ安楽死させた。肺および気管を、全ての安楽死マウスから無菌的に摘出して、ＰＢＳ中でホモジナイズし、プレーティングして、存在する合計細菌を数え上げた。

［統計］
肺内の合計細菌カウントを、ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定を用いてグループ間で比較した。図１～図３を参照。それぞれのＢｐポリペプチドの免疫原性を１２匹のマウスにおいて分析して、精製されたポリペプチドに結合する抗体の血清力価を定量化した。抗－Ｂｐポリペプチド抗体力価は、それぞれのＢｐポリペプチドに対して全てのマウスにおいて増大し、それぞれのＢｐが全てのマウスにおいて免疫原性であることが示された（以下の表１および表２を参照）。免疫付与後の抗体力価は、Ｂｐ Ｐｏｌｙ１について１／２００～１／５１，２００の範囲であり、Ｂｐ Ｐｏｌｙ３について１／１２，８００～１／２０４，８００であった。免疫前の血清のＥＬＩＳＡシグナルはバックグラウンドと同様であった。

実施例２：Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのための細菌ワクチンポリペプチド（ＢＶＰ）に関するペプチド選択基準としての転写レベル（ｍＲＮＡ）。
我々の初期の研究において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを標的化する推定のワクチンペプチドは、以下の基準に基づいて選択された：１）利用可能なＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓゲノムを用いた表面露出タンパク質（ＳＥＰ）の種で保存されたコアの同定。これらは、外膜内に埋め込まれた分泌および表面露出タンパク質ならびにペリプラズム間隙内に位置するタンパク質を含む（後者は、表面上およびペリプラズム内の両方に可変的に発現されるので）；２）配列保存（各タンパク質の多配列アライメントの分析に基づく）；３）コアタンパク質の表面露出（三次元構造および潜在的に表面露出した残基を決定するためのインシリコ・モデリングに基づく）。これらの基準を用いて、≧２０アミノ酸残基長である、およそ１５０個のペプチドのプールを、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに関して同定した。これらから、単一の細菌ワクチンポリペプチド（ＢＶＰ）が、ペプチドの無作為の類別によって以前に設計された。このＢＶＰ（Ｂｐ Ｐｏｌｙ １）は、マウス肺モデルにおいて有意に防御的であることが示された（データ示さず）。

ペプチドの選択をさらに改良するために、我々は、全ＲＮＡトランスクリプトーム試験において遺伝子特異的なｍＲＮＡの相対存在量を試験して、高レベルの転写（一般に、細菌内で生産されるタンパク質の量と相関する）が、防御的な標的を同定するための有用な基準であり得るかどうかを決定した。かかる手法はいくつかの利点がある。公共データベースは、多くの病原体に関する多くのトランスクリプトーム試験を含む。ＲＮＡ－ｓｅｑの出現によって、データは高品質であり、全ＲＮＡプロファイルを正確に反映する。ＲＮＡ－ｓｅｑはまた、より多くの量のスタート細菌を必要とする昔のミクロアレイデータとは異なり、小さなサンプルサイズを可能にする。したがって、今では、定量的な転写データに関する複数のソースが存在し、場合により重要なワクチンペプチド基準のアベイラビリティを高める。この基準を調べるために、我々は、上記基準を有し低レベル転写を有する遺伝子に由来するペプチドを用いてポリペプチド（Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００）を設計した。我々はまた、上記基準を有し高レベル転写を有する遺伝子に由来するペプチドを用いてポリペプチド（Ｂｐ Ｐｏｌｙ １０１）を設計した。それぞれのポリペプチドを精製して、それらの防御能力を百日咳のマウスモデルにおいて比較した。

［Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００およびＢｐ Ｐｏｌｙ １０１の設計］
転写レベルが防御的ペプチドの選択に有用であり得るかどうか試験するために、Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００およびＢｐ Ｐｏｌｙ １０１を、定量的ｍＲＮＡによって示されるトランスクリプトームデータに基づくワクチンペプチドの選択の優先順位付けの最終ステップを用いて設計した。我々は、ｄｅ Ｇｏｕｗら^１による公に利用可能なデータを、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓトランスクリプトームの相対的ｍＲＮＡ存在量とともに用いて、同定されたそれぞれのタンパク質の個々の相対存在量を分析した。ＳＥＰ遺伝子の我々が定義したコアを用いて、それぞれの個々の相対存在量（ＲＡ）を、ｄｅ Ｇｏｕｗら^１のデータに基づいて決定した。市販されるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチン中のタンパク質は除外した。ｍＲＮＡのＲＡが最も低い（２９～３７４の範囲の値）タンパク質由来のペプチドを、Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００内に取り込んだ。ｍＲＮＡのＲＡが最も高い（１１，８１９～４７，６５６の範囲の値）タンパク質由来のペプチドを、Ｂｐ１０１内に取り込んだ（図６および図７を参照）。ｄｅ Ｇｏｕｗらによって決定されるｍＲＮＡのＲＡの全体的な範囲は、最大限に発現される分泌タンパク質、ｐｔｘＡに関して０～５２，５４９である。Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００およびＢｐ Ｐｏｌｙ １０１をコードするＤＮＡを、精製を容易にするためにＨｉｓタグの下流に、ｐＥＴ１００発現ベクター内へ独立に組み込んだ。それぞれのポリペプチドを、標準的なニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。

［Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００対Ｂｐ Ｐｏｌｙ １０１の防御］
百日咳のマウスモデルにおける防御に関するＢｐ Ｐｏｌｙ １００対Ｂｐ Ｐｏｌｙ １０１の試験を、当該分野において以前に確立されたとおり^２に行なった。３つのグループ内のそれぞれのマウスは、アジュバント（ミョウバン＋ｍＰＬＡ）単独、アジュバントと１０μｇのＢｐ Ｐｏｌｙ １００、または、アジュバントと１０μｇのＢｐ Ｐｏｌｙ １０１を、免疫付与あたり受け取った。免疫付与は、Ｔ－０、Ｔ－２週、およびＴ－４週において行われた。３週後、２０ｕＬ ＰＢＳ中７．９Ｅ＋０３ ＣＦＵのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｔｏｈａｍａ Ｉ株を経鼻吸引によって動物に感染させた。感染後、３、７、および１０日目に、動物のサブグループを屠殺して、ホモジナイズした肺を定量的に培養した。

［結果］
［Ｂｐ Ｐｏｌｙ １０１（高レベル転写）は、Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００（低レベル転写）よりも防御的であった。］
ｍＲＮＡ転写量が、ＢＶＰ内に含めるためのペプチド間の選択において有用であり得るかどうかを試験するために、２つのＢＶＰを設計して比較した。Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００は、低レベルｍＲＮＡを有する遺伝子によってコードされるタンパク質内のペプチドから構成され、Ｂｐ Ｐｏｌｙ １０１は、高レベルｍＲＮＡを有する遺伝子によってコードされるタンパク質内のペプチドから構成された。防御を、百日咳のマウスモデルにおいて比較した。図７は、感染後３、７、および１０日目の、ホモジナイズしたマウス肺の定量的培養の結果を示す。表は、データの統計分析から得たｐ値を示す。

どの日においても、コントロール群と比較したＢｐ Ｐｏｌｙ １００を受け取った群由来の細菌量の間に有意差はなかった。対照的に、Ｂｐ Ｐｏｌｙ １０１を受け取った群から単離された細菌数は、１０日目および１４日目において、コントロール群よりも有意に少なかった。同様に、Ｂｐ Ｐｏｌｙ １０１を受け取った群から単離された細菌数は、３、１０、および１４日目において、Ｂｐ Ｐｏｌｙ １００を受け取った群よりも有意に少なかった。

［結論］
データは、高レベル転写を有する遺伝子によってコードされるタンパク質由来のペプチドからなるＢｐ Ｐｏｌｙ １０１は、それぞれの時点で、コントロール群（アジュバントのみ）または低レベル転写を有する遺伝子によってコードされるタンパク質由来のペプチドからなるＨｉ Ｐｏｌｙ １００よりも有意に良い防御を示したことを示している。以前の研究により、種全体にわたって存在するタンパク質内のペプチド、保存された配列、およびインシリコに基づく表面露出が示された。

実施例３：Ｈｉ Ｐｏｌｙ １に対する抗血清は、種の代表的なインフルエンザ株に結合する。
我々は、種内の全ての株に存在するペプチド、保存された配列、および、インシリコ・タンパク質構造解析に基づく表面露出の選択に基づく、細菌ワクチンポリペプチド（ＢＶＰ）方法論を提案した。インフルエンザ菌を用いて、我々は、菌血症の幼ラットモデルにおいて個々に防御的であるペプチドのサブグループを選択した。免疫原性を高めるために、ペプチドはポリペプチド内に連結して提供される。

多重標的化設計のため、ポリペプチドは、種内の全ての株に結合する抗体を刺激することが期待される。抗体の結合範囲を経験的に分析するために、我々は、生細胞ＥＬＩＳＡにおいて、種の幅を表わすことが以前に特徴付けられた株を用いた。

［材料および方法］
［インフルエンザ菌株。］Ｍｕｓｓｅｒらは、数多くのインフルエンザ菌株の遺伝子を多遺伝子座酵素電気泳動によって以前に特徴付けた。我々は、種の遺伝的な幅が代表的であるＭｕｓｓｅｒ株の９つを試験した。ＯＭを有する子どもから単離された無莢膜型の株は、ＨＩ１３７１、ＨＩ１３７５、ＨＩ１３８０、ＨＩ１３８７、ＨＩ１３９２、ＨＩ１３９７、ＨＩ１４０３、ＨＩ１４１７、およびＨＩ１４２５であった。我々は、２つの被包性のｂ型株、Ｅ１ＡおよびＨＩ０６９３も試験した。

［細菌増殖。］単離株を、バシトラシンを含むチョコレート寒天上で３７℃にて慣例的に維持した。インフルエンザ菌のブロス培養物を、１０μｇ／ｍｌのヘムおよび１０μｇ／ｍｌのβ－ＮＡＤで補充されたブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天（補充ＢＨＩ；ｓＢＨＩ）中で増殖させた。

［抗－Ｈｉ Ｐｏｌｙ １抗血清の産生。］Ｈｉ Ｐｏｌｙ １を、ニッケルクロマトグラフィーによって精製して、ミョウバンに吸着させて（１：１）、ラットにおいて抗－血清を産生させるための免疫原として用いた。免疫付与の前に、それぞれの動物から血液を採取した（免疫前血清、ＰＩＳ）。３用量のＨｉ Ｐｏｌｙ １を２週間隔で投与して、抗ＢＶＰ Ｈｉ Ｐｏｌｙ １免疫後血清（ＢＶＰＳ）を最終の免疫付与の３週後に回収した。血清サンプルを熱不活化させて、－８０℃で保管した。

［生細胞ＥＬＩＳＡ。］インフルエンザ菌の生培養物を全細胞ＥＬＩＳＡにおいて用いた。一晩の細菌懸濁液を希釈してＯＤ_６００＝０．０５を得て、１００μｌを、コーニングの高結合９６ウェルプレートのウェルに添加した。プレートを穏やかに遠心分離して、４℃で４時間、細胞を付着させた。インキュベーション後、上清を吸引して、付着した細菌を洗浄して、一次抗体としてラット免疫前血清（ＰＩＳ）または免疫後血清（ＢＶＰＳ）のいずれかとともにインキュベートした。一次抗体の付着を、製造元によって指導されるとおりにＨＲＰ－コンジュゲートヤギ－抗－ラット抗血清を用いて検出した。結合した二次抗体を、１００μｌのＴＭＢの添加によって定量化して、プレートをＡ_４５０で読み取った。それぞれのアッセイを三重で行ない、値を平均した。

［統計。］それぞれの単離株に関する、対応する（ｍａｔｃｈｅｄ）免疫前および免疫後の血清に由来する平均吸光度の値を、スチューデントのＴ検定を用いて比較した。

［結果］
結果（図８）は、免疫前血清において、抗体の結合に由来する吸光度が、０．２０～０．７５の範囲であったことを示す。免疫後抗血清における、抗体の結合に由来する吸光度は、０．３７５～１．６５８であった。試験された１２個のＨＩ単離株のそれぞれについて、免疫後抗血清（ＢＶＰＳ）を用いた結果は、対応する（ｍａｔｃｈｅｄ）免疫前血清（ＰＩＳ）を用いた結果よりも高かった。それぞれの株で、ＰＩＳとＢＶＰＳの吸光度の間の違いは、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。

［結論］
ＢＶＰ方法論は、連結されたペプチドが、種にわたる存在、配列保存、および、インシリコ・タンパク質構造解析に基づく表面露出を含む重要なワクチンの特徴によって明確に同定されたペプチドを送達するのに有用であり得ることを提案する。受動的な（抗体）防御を誘導するペプチドの同定は、連結されたペプチドが、種の代表的な株に結合する抗体を誘導するという仮説を経験的に試験する機会を提供した。免疫後の抗Ｈｉ Ｐｏｌｙ １抗血清において有意により高い結合を示している我々のデータは、この仮説を支持する。被包性のｂ型株に対する免疫後抗血清の有意により高い結合の存在は、ｂ型株および無莢膜型の両方のインフルエンザ菌に対して防御するワクチンとしてのＨｉ Ｐｏｌｙ １の興味深い可能性を高める。これらのデータは、細菌ワクチンポリペプチド方法論の有用性を支持し、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １をワクチン候補として支持する。

実施例３：無莢膜型インフルエンザ菌に対して防御的な細菌ワクチンポリペプチドの作製方法
ＮＴＨｉは、重大な公衆衛生負荷およびワクチン開発のための適切な標的のままである。
様々なＮＴＨｉ表面タンパク質が、ワクチン候補として提案されている。これらのタンパク質の１つであるプロテインＤは、臨床試験において試験されて、ＮＴＨｉ ＯＭの予防においておよそ３５％効果的であることが分かり、ヨーロッパで市販されている。その相対的に低い有効性に加えて、プロテインＤはまた、ＮＴＨｉの全ての臨床単離株において存在するものではない。したがって、複数の標的を用いた手法を含む、ＮＴＨｉワクチンに対する他の手法を検討すべきである。

ワクチンとしての全長タンパク質の代替として、我々は、ゲノムの生物情報学とインシリコ・構造予測を統合してＮＴＨｉの表面をマッピングして、配列が保存された、複数のゲノム遺伝子座によってコードされたタンパク質の表面露出領域（ペプチド）を同定する、新規の方法を提案する。受動的な防御の証拠を、表面の露出および抗体のアクセス可能性を確認するさらなる選択基準として用いた。

残念なことに、ペプチドを細菌ワクチンとして使用する以前の試みは成功していない。ワクチンにおけるペプチドの使用に対する１つの一般的な壁は、配列の保存がないことである（例えば線毛ワクチン）。したがって、線毛ペプチドワクチンは、相同株に対して効果的であり、非相同の線毛を有する同一種の別の株に対しては効果的でない。提案されるペプチドワクチンにおける配列保存の不存在に加えて、ペプチドの小さなサイズは、より低い免疫原性と相関する。最も小さな市販ワクチンは、２４ＫＤａの肝炎Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡＧ）であり、より小さなペプチドは通常、前臨床試験において免疫原性のために担体に連結される。

これらの問題を対処するために、我々は、複数のゲノム遺伝子座由来の、連結された、配列が保存された、表面露出ペプチドからなるＢＶＰが、免疫原性であり、中耳炎の確立された動物モデルにおいて生物学的に効果的であるという仮説を立てた。したがって、我々は、個々に生物学的に効果的であることが示されたペプチドからＮＴＨｉワクチンポリペプチドＨｉ Ｐｏｌｙ １を設計し、免疫原性、菌血症の幼ラットモデルにおける防御、および、ＯＭのチンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）モデルにおける有効性についてＨｉ Ｐｏｌｙ １を試験した。

［材料および方法。］
［細菌株および増殖条件］
ＮＴＨｉ株Ｒ２８６６は、ＯＭの後に髄膜炎の臨床徴候を有する免疫適格性の子どもの血液から単離されて特徴付けられた（Ａｒｎｏｌｄ Ｓｍｉｔｈ［２１］）。我々は、侵襲性のインフルエンザ菌疾患の幼ラットモデルにおいて、この株を以前に使用している。中耳炎のチンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）モデルにおいて用いられたＮＴＨｉ株８６－０２８ＮＰは、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ小児病院において慢性中耳炎のために鼓膜切開術および挿入管を受けた小児科患者由来の最小限に継代培養された臨床単離株である。８６－０２８ＮＰ株は、ＯＭのチンチラ・モデルにおいて広く特徴付けられている。我々および他の研究者らは、チンチラにおけるＮＴＨｉの病原性に関する非常に多くの研究において、この単離株を以前に用いている。インフルエンザ菌の単離株は、バシトラシンを含むチョコレート寒天上で３７℃にて慣例的に維持された。インフルエンザ菌のブロス培養を、１０μｇ／ｍｌのヘムおよび１０μｇ／ｍｌのβ－ＮＡＤで補充されたブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天（補充ＢＨＩ；ｓＢＨＩ）中で増殖させた。

大腸菌単離株ＢＬ２１（Ｄｅ３）をＬＢ寒天上で慣例的に維持して、プラスミドｐＨｉＰｏｌｙ１によって形質転換された単離株を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充されたＬＢ寒天上で維持した。

［Ｈｉ Ｐｏｌｙ １の設計］
我々は以前に、Ｈｅｌ１、ＨｘｕＣ１、ＨｘｕＣ２、およびＨｅｌ２を含む特定のＮＴＨｉ候補ワクチンペプチドについて、それらの、１）それぞれの試験されたゲノムにおける存在；２）構造解析に基づく表面露出；３）配列保存；および４）菌血症の幼ラットモデルにおける抗体防御の誘導に基づいた選択に関する方法論を報告した［１７］。同じ方法論に従って、我々は、菌血症の幼ラットモデルにおいて防御を示す（データ示さず）、ＮｕｃＡ－１、ＢａｍＡ－３、Ｌｐｔｅ－２、Ｌｐｔｅ－４およびＮｌｐＩ－２を含む他のペプチド候補を同定した。細菌ワクチンポリペプチド、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １を、両末端に免疫プロセスを高めるためのペプチドＢａｍＡ－３およびＮ末端の６Ｈｉｓタグを有する９個のペプチドの連続したアセンブリとして設計した（図９）。

［Ｈｉ Ｐｏｌｙ １の精製］
発現ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって商業的に製造して、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １ポリペプチドを発現させた。構築物をコードするＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉに関して最適化して、合成して、ｐＥＴ１００発現ベクターのＨｉｓタグの下流への挿入の前に正しい配列を確認した。プラスミド構築物（ｐＨｉＰｏｌｙ１）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｄｅ３）内に形質転換して、形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充されたＬＢ寒天上で選択して、形質転換された株を－８０℃で保管した。選択形質転換体をさらに試験して、正しいＤＮＡ配列の挿入を確認した。ｐＨｉＰｏｌｙ１を含んでいるＥ．ｃｏｌｉを、カルベニシリンに加えて１％グルコースで補充されたＬＢブロス中に接種して、Ａ_６００でおよそ０．５－０の光学濃度まで３７℃にて増殖させた。ｐＨｉＰｏｌｙ１の発現を１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加によって４時間誘導した。細菌ペレットを、４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離によって調製して、ペレットを、誘導されていないネガティブ・コントロールに対して細菌ワクチンポリペプチドの発現に関して試験した。細胞画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １が封入体として発現されることを示した。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １封入体を含んでいる細菌ペレットを、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（５０ユニット／ｍｌ最終）およびリゾチーム（０．２ｍｇ／ｍｌ最終）（Ｓｉｇｍａ）で補充された１０ｍｌの細胞溶解ＴＭ Ｂバッファー（Ｓｉｇｍａ）中に溶解させた。穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベーションした後、１６，０００ｘｇで４℃にて２０分間遠心分離によって封入体をペレット化させた。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １ポリペプチドを含んでいるペレットを、６Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭ、リン酸ナトリウムｐＨ７．８および０．５Ｍ ＮａＣｌ中に溶解させて、その後に１６，０００ｘｇでさらに遠心分離して、不溶性の不純物を除去した。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １ワクチンポリペプチドの精製を、ＰｒｏＢｏｎｄ（商標）精製システム（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のプロトコルによって指導されるとおりに変性状態下で、事前に平衡化されたＮｉ^＋２アフィニティーカラムを通してＨｉｓタグの親和性を用いて達成した。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １を、結合バッファー中３００ｍＭイミダゾールを用いてＮｉ^＋２カラムから溶出させて、溶出画分を、タンパク質の含有量および純度の分析のために回収した。精製されたＨｉ Ｐｏｌｙ １を、ＡｄｊｕＰｈｏｓに（１：１）、混合物を穏やかに混合しながら室温で２時間インキュベートすることによって吸着させた。吸着した混合物を、ＰＢＳに対して４℃で透析した。ＡｄｊｕＰｈｏｓに対するＨｉ Ｐｏｌｙ １の相対的な吸着を、遠心分離された調製物の上清のタンパク質濃度を測定することによって決定した。ミョウバンに吸着したＨｉ Ｐｏｌｙ １を、使用するまで４℃で保管した。

［ＥＬＩＳＡ］
ＥＬＩＳＡを、それぞれの製造元の特定のプロトコルに従って行なった。Ｎ末端Ｃｙｓ残基で合成されたペプチドを利用するペプチドＥＬＩＳＡを、マレイミドで活性化されたプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）において行なった。特定のペプチドを、結合バッファー中、２０％ジメチルホルムアミド、１０％ＴＣＥＰ中に１ｍｇ／ｍｌで溶解させて、その後に、結合バッファーを用いて５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。１００マイクロリットルのペプチド溶液を各ウェル内に添加して、プレートを穏やかに振とうしながら４℃で一晩インキュベートすることによってペプチドを固定化した。２００μｌのシステイン溶液（１０μｇ／ｍｌ）の添加によって、プレートを室温で１．５時間ブロッキングした。ｈｉｓタグを付けたＨｉ Ｐｏｌｙ １に対するＥＬＩＳＡを、コーニングの高結合プレートにおいて行なった。ワクチンポリペプチド、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １を、２０μｇ／ｍｌの濃度で、４Ｍ尿素、０．０５Ｍカーボネートバッファー、ｐＨ９．６中に可溶化させた。各ウェルに、１００μｌを添加して、プレートを４℃で一晩インキュベートしてポリペプチドを固定化した。それぞれのＥＬＩＳＡにおいて、チンチラ血清を一次抗体として用いて、ヤギ抗－ラットＨＲＰ－コンジュゲートＩｇＧを二次として用いた。結合した二次抗体を、１００μｌのＴＭＢの添加によって検出して、プレートをＡ_３７０で読み取った。決定された力価は、免疫前血清と比べて免疫後の抗血清の吸光度が０．１よりも高い、最終の抗体希釈であった。

［動物］
動物試験は、国立衛生研究所の動物実験の注意および使用に関するガイドにおける推奨に従って行われ、アリゾナ州立大学（チンチラ研究）およびアリゾナ大学（幼ラット研究）の動物実験委員会によって承認された。

［菌血症の幼ラットモデル］
受動防御の幼ラットモデルにおけるＨｉ Ｐｏｌｙ １による防御を、以前に述べられたとおりに試験した。免疫付与されたチンチラに由来する免疫付与前および免疫付与後の血清サンプルを用いて、幼ラットを受動的に免疫付与した。２日齢の幼ラット（ｐｕｐ）を雌親（ｄａｍｓ）に無作為に再度割り当てて、それぞれ１０匹の幼ラットの３つのコホートを得た。４日齢において、各コホート内の幼ラットは、免疫前チンチラ血清、免疫後血清またはＰＢＳ（コントロールとして）のいずれかの１００μｌのＩＰ注入を様々に受け取った。５日齢において、それぞれの幼ラットを、５０μｌのＰＢＳ中およそ１．５×１０^５ ＣＦＵ ＮＴＨｉ株Ｒ２８６６のＩＰ注入によって曝露させた。曝露の２４時間後、定量的なプレーティングのために各動物から血液を回収した。

［中耳炎のチンチラ・モデル］
ＯＭにおけるＨｉ Ｐｏｌｙ １の防御的有効性を試験するために、３～５月齢のチンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）をＭｏｕｌｔｏｎ Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ Ｒａｎｃｈから購入した。動物を、到着時に少なくとも７日間休ませて試験開始前に順応させた。試験開始時に耳鏡検査または鼓膜聴力検査によって中耳感染の所見がない動物を以前に述べられたとおりに用いた。予備実験を行なって、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １でチンチラに免疫付与するための最適用量を決定した。ミョウバンアジュバントと１：１で混合された精製Ｈｉ Ｐｏｌｙ １タンパク質を用いて、１０、５０、１００、２００および４００μｇの用量でチンチラのコホートを免疫付与した（３動物／コホート）。動物は、２週間隔で３回免疫付与されて、血清サンプルを最終ブーストの３週後に採取した。血清を回収して、抗原としてのＨｉ Ｐｏｌｙ １または個々のペプチドとともにＥＬＩＳＡにおいて用いた。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １は免疫原性であり、２００μｇの用量は、免疫前血清と比較して、ポリペプチドおよび全ての個々のペプチドに対するＩｇＧの明白な増加を誘導した（データ示さず）。免疫付与あたり２００μｇの用量を防御試験において用いた。

２つの免疫付与／防御のチンチラ実験を行なった。１つめの実験では、コホートは、テスト群およびコントロール群において１８匹の動物で構成された；反復試験は、コントロール群において２３匹の動物およびワクチン群において２２匹で構成された（ワクチンのコホートは、元々は２３匹の動物を含んでいたが；１匹の動物は、プロトコルと関連しない健康上の問題のせいで免疫付与の段階中に試験から除外した）。免疫付与、感染曝露、およびＯＭに関する試験は２つの実験に関して同一であり、データを分析のためにプールした。

［細菌曝露］
チンチラのコホートを、２週間隔で、ミョウバンを含む２００μｇのＨｉ Ｐｏｌｙ １またはＰＢＳ－ミョウバンを用いて３回免疫付与した。各動物の免疫付与前および最終免疫付与の２週後に採取したサンプル由来の抗血清を、熱不活化して、ＥＬＩＳＡによる抗体力価の試験および受動防御の幼ラットモデルにおける使用まで、－８０℃で保管した。最終免疫付与の３週後、それぞれのチンチラに、上部胞（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｂｕｌｌａｅ）への細菌懸濁液の直接注入によって、３００μｌ ＰＢＳ－ゼラチン（０．１％ｗ／ｖ）中およそ１５００ＣＦＵのＮＴＨｉ株８６－０２８ＮＰを両耳に曝露した。曝露用量をプレートのカウントによって確認した。

［中耳炎の証拠に関する実験］
直接感染の前および曝露後３、７、１０、および１４日目に、それぞれのチンチラを、ＯＭの証拠に関してビデオ耳鏡検査および鼓膜聴力検査によって試験した；各コホートのサブセットを、中耳滲出液（ＭＥＥ）について試験して、試験から除外した。ビデオ耳鏡検査（Ｖｉｄｅｏ ＶｅｔＳｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ，ＭｅｄＲｘ，Ｓｅｍｉｎｏｌｅ，ＦＬ，ＵＳＡ）による鼓膜炎症の徴候を、以前に説明されたとおりに、０ ｔｏ ４＋スケールで評価した（ｒａｔｅｄ ｏｎ）。それぞれの耳を試験するときに、ビデオ耳鏡検査を記録して、目に見える紅斑、膨れ、鼓膜の不透明性の変化、および、鼓膜の後ろの滲出液の可視化に基づいて０～４にグレード分けした。≧２でスコア化された個々の耳は、ＯＭに関してポジティブであると考えた。記録されたビデオ耳鏡検査は、第２の盲検観察者によって評価された。第１および第２の評価の間の違いを盲検的に解明した（第３の盲検観察者を含む）。鼓膜聴力検査（ＥａｒＳｃａｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｄａｙｔｏｎａ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用いて、以前に説明されたとおりに、鼓膜幅および鼓膜コンプライアンスの両方における変化をモニターした。鼓膜聴力検査を用いて、ティンパノグラムのコンプライアンスまたは高さによって、鼓膜のインピーダンスが測定されて、同等容量のミリリットルで表される。０．７５～１．５の範囲外の異常なコンプライアンスは、ＯＭの証拠と考えた。同様に、ティンパノグラムの幅および全体的な形状はＯＭの有用な指標であり、１５０ｄａＰａよりも大きな鼓膜聴力検査の幅（ＴＷ）は、ＯＭの証拠と考えた。ＭＥＥを、胞経由の（ｔｒａｎｓ－ｂｕｌｌａｒ）のタップによって回収して、１．５インチ２５－ゲージの皮下針を用いて中耳腔から流体を引き抜いた。ＭＥＥが検出されない場合は、同じ耳をさらに２回タップしてＭＥＥが存在しないことを確かめた。そのような耳は「ドライ」とスコア化した。ＭＥＥにおける細菌力価を、以前に説明されたとおりにトラック希釈（ｔｒａｃｋ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）方法を用いて決定した。

［統計分析。］
チンチラの実験１および２によるデータを、測定されたそれぞれの時点（感染後の日）におけるそれぞれの結果についてプールした。それぞれの日における、耳鏡検査、鼓膜聴力検査、およびＭＥＥの存在の、割合（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）を、フィッシャー直接検定を用いてワクチン接種群とコントロール群の間で比較した。チンチラにおけるＭＥＥのＣＦＵ／ｍｌおよび幼ラットモデルにおける血液を含む定量的な測定を、クラスカル・ワリス検定を用いてワクチン接種群とコントロール群の間で比較した。感度分析によって試験されたドライの耳のＭＥＥを、０ＣＦＵ／ｍｌとした。ＭＥＥにおける細菌力価を、ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定を用いて分析した。統計分析は、ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を用いて行なった。全ての統計的検定は、両側の５％有意水準で評価した。

［結果：］
［Ｈｉ Ｐｏｌｙ １］
６個のタンパク質由来の９個の固有のペプチドの連続的なアライメントを図１に示す。生じる２４９アミノ酸構築物は、２７，７２４Ｄａの理論分子量（Ｈｉｓタグによって３１，８４４）および９．５７のｐＩ（Ｈｉｓタグによって９．７１）を有すると計算された。

親和性精製後、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して（図１０）；単一のタンパク質バンドは、３２ＫＤａの理論ＭＷと相関した。このＨｉ Ｐｏｌｙ １の調製物を、Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓに１：１で吸着させた。

［Ｈｉ Ｐｏｌｙ １ワクチンポリペプチドの免疫原性。］
コントロール、免疫付与前および免疫付与後の血清を、ＥＬＩＳＡによって、抗原特異的ＩｇＧについて試験した。抗体力価は、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １を用いた免疫付与が、４０匹の動物のそれぞれにおいて、ポリペプチドに対する強力かつ再現性のある免疫応答（ｌｏｇ_２力価平均１７．０４）をもたらし、一方で、免疫付与前およびコントロールの動物由来の抗血清は、バックグラウンドレベルである（ｌｏｇ_２力価≦１．０）ことを示唆した（図１１）。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １を免疫原として用いると、構成要素ペプチドのそれぞれに対する免疫応答は有意であり、≧４（４．０３～１５．２７）のｌｏｇ２力価平均の増加を有した。それぞれの実験的ワクチン群において、最も低い応答は、ＨｘｕＣ由来の２つのペプチドに対するものであった。数匹の動物が、一方および／または他方のＨｘｕＣペプチドに対して測定可能な免疫応答を誘発することができなかった。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １を受け取った４０匹の動物のうち、１３匹および１８匹が、それぞれ、ＨｘｕＣ－１およびＨｘｕＣ－２に対する抗体力価の有意な増加を示さなかった。さらに、１０匹の動物は、ＬｐｔＥ－４に対する抗体力価において有意な増加はなかった。対照的に、他の構成要素に対する力価は高かった（１１～１５の範囲）。

［菌血症に対する防御］
菌血症におけるＨｉ Ｐｏｌｙ １の防御能力を試験するために、ＮＴＨｉ ２８６６株に対する幼ラットの受動防御に関して、チンチラの免疫付与後の抗血清を、ＰＢＳおよび免疫付与前のチンチラ血清と比較した（図１２）。ＰＢＳと免疫前血清の間に、検出可能な防御の違いはなかった。免疫後の抗血清は、ＰＢＳまたは免疫前血清と比較して菌血症を有意に減少させた（それぞれ、ｐ＝０．０１８および０．００９８）。

［中耳炎における防御］
最終の免疫付与の２１日後、チンチラに、３００μｌのＰＢＳ中ＮＴＨｉ ８６－０２８ＮＰを胞経由で（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒｌｙ）接種した。接種の定量的なカウントにより、両方の実験において、それぞれの胞（ｂｕｌｌａ）内に、およそ１．４×１０^３ ＣＦＵの滴下を確認した。

ティンパノグラム測定によって、１４日の実験にわたって、コントロール群と比較してＨｉ Ｐｏｌｙ １処置群において、ＯＭポジティブの耳の有意な低減が明らかになった（図１３）。曝露後初期（接種後３日目）には、コントロール動物の耳の９６％（８２のうち７９）がＯＭの臨床徴候を有し、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １免疫付与動物の８９％（８０のうち７１）がＯＭを有した。７日目までに、２つのコホート間に統計的な有意差があり；Ｈｉ Ｐｏｌｙ １群の７０％（６６のうち４６）がＯＭを有し、一方で、コントロール群の９４％（６８のうち６４）はＯＭについてポジティブであった（ｐ＝０．０００２）。この差は１０日目にも続いており、ワクチン群の５２％（４８のうち２５）およびコントロール群の８６％（５０のうち４３）がＯＭの証拠を有した（ｐ＝０．０００４）。接種後１４日目には、コントロール群は感染をクリアし始めていて；ワクチン・コホートの５０％がＯＭを有し、コントロール群の６６％がＯＭを有した。

鼓膜聴力検査データと同様に、３日目のビデオ耳鏡検査は、全ての耳が、ＯＭと一致する証拠を有することを示した（図１４）。７日目には、コントロール群の９９％（６８のうち６７）がＯＭに関してポジティブと定義されたが、ワクチン群の７４％（６６のうち４９）がＯＭポジティブであった（ｐ＝０．０００１）。１０日目には、コントロール群内の動物の耳の１００％（５０のうち５０）がＯＭに関してポジティブであり；ワクチン群内の動物の耳のたった５０％（４８のうち２４）がＯＭポジティブであった（ｐ＝０．０００１）。１４日目までには、コントロール群は疾患のクリアランスを示し始めていて、耳の６６％（３２のうち２４）がＯＭの徴候を示したが、ワクチン・コホートは、４３％（３０のうち１３）のＯＭポジティブまで低減した（ｐ＝０．０１９）。鼓膜聴力検査およびビデオ耳鏡検査のデータは両方とも、ワクチン処置された動物が、コントロールと比べて疾患のより迅速なクリアランスを示したことを示す。

ＯＭの外部試験に加えて、鼓室上部（ｅｐｉｔｙｍｐａｎｉｃ）のタップを、各コホート由来の動物のサブグループに対して行なった。サンプリングの時点において、それぞれの耳を、滲出液があるウェットまたは滲出液のないドライとしてグレード分けした。ドライの耳は、別々に３回サンプリングして、滲出液が存在しないことを確認した。滲出液を定量的に培養して、細菌力価を決定した。図１５は、それぞれの時点におけるドライの耳のパーセントを示す。３日目には、試験した全ての耳において滲出液が存在した。７日目には、ワクチン処置群とコントロール群の間に傾向の違いがあった。１０日目および１４日目には、これらの２つの群の間の違いは非常に有意であり（それぞれ、ｐ＝０．００１および０．００２８）、ワクチン感染の（ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ）耳の７０％よりも多くが、中耳流体のクリアランスを示した。

図１６は、ＭＥＥに関する平均ＣＦＵ／ｍｌを示す。３日目には、ＭＥＥ中の細菌密度は、ワクチン群とコントロール群の間で同様であった。しかしながら、ワクチン群がＭＥＥをクリアすると、ワクチン群の中耳における細菌密度は有意に少なかった（１０日目および１４日目、それぞれｐ＝０．００１および０．００２８）。コントロール動物におけるＭＥＥ細菌密度は、感染の最初の数日にかけて増加して、残りの実験にわたって平均１０^６ｃｆｕ／ｍｌであり、このモデルを用いた以前の実験と一致した。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １免疫付与群の大部分の耳は、１４日の期間にわたって滲出液をクリアしたが、僅かに残っているＭＥＥにおける細菌密度は、コントロール群におけるＭＥＥと統計的な差はなく、すなわち、およそ１０^６ｃｆｕ／ｍｌであった。

［検討］
ＮＴＨｉに起因する重大な粘膜および侵襲性の感染が持続していて非常に流行しているにもかかわらず、非常に効果的な市販ワクチンは利用可能でない。主要およびマイナーの外膜タンパク質、アドヘシン、およびリポオリゴ糖を含むいくつかの病原性因子の免疫防御が研究されている。ピリン系のペプチド・モチーフは防御が示された。しかしながら、防御は相同株に制限された（おそらくピリン系タンパク質の公知の配列不均質性の結果）。さらに、担体分子としてＨｉプロテインＤを用いた１１価の肺炎球菌ワクチンは、臨床試験において、ＮＴＨｉ ＯＭに対して３５％の防御を与えた。

生物情報学およびタンパク質構造解析を用いて、我々は、種全体にわたって存在し、配列が保存されていて、幼ラットモデルにおいて受動防御を個々に仲介する、複数のＮＴＨｉ表面タンパク質のペプチド領域を以前に同定した。防御的ペプチドを同定するプロセスは、生物学的機能に関して先入観がなく、ペプチドが、様々な機能および構造を有するタンパク質に由来することは注目に値する。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １内に取り込まれたペプチドは、βバレルおよびリポタンパク質由来である。ＨｘｕＣは、ヘムの取り込みに関与する、ＴｏｎＢ－依存性の外膜貫通のゲート付きポリン（ｇａｔｅｄ ｐｏｒｉｎ）である。タンパク質ＢａｍＡもβバレルであり、アセンブリおよびＯＭへの他のタンパク質の取り込みに関与する。リポタンパク質ＬｐｔＥは、バレル構造をしたＬｐｔＤに対するアクセサリータンパク質であり、ＯＭへのリポオリゴ糖の取り込みに寄与する。ＮｕｃＡは、膜に固定された、表面が露出した５’－ヌクレオチダーゼであり、Ｈｅｌ（リポタンパク質ｅ：Ｐ４）は、ヘムとＮＡＤの両方の獲得に関与するホスホモノエステラーゼである。新規のリポタンパク質ＮｌｐＩ（Ｎｏｖｅｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の生物学的機能は、まだ決定されていない。したがって、２８ｋＤａのポリペプチドＨｉ Ｐｏｌｙ １は、複数の生物学的に様々なタンパク質を標的化する。

ペプチドを細菌ワクチンとして用いる以前の試みは成功していない。小さいサイズに起因して免疫原性がないこと、表面露出を同定することができないこと、および、配列保存がないことは、細菌ワクチンにおけるペプチドの利用を制限している。現在の研究の中心的な仮説は、これらの障害を、順に（ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）送達されるＮＴＨｉ防御的ペプチドを用いたＢＶＰの方法論によって克服することができるというものである。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １は、免疫原性であることが分かり、１７．０４（１／１３４，７５６）のＬｏｇ_２力価を有していた。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １は、４．０３（１／１６．３）～１５．２７（１／３９，５００）のＬｏｇ_２力価の範囲のペプチド特異的な抗体も誘導した。全体的に、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １は、ワクチンとして用いられる他のタンパク質と同様に免疫原性であった。特定のタンパク質領域の免疫原性および防御有効性は通常特徴付けられないので、現行のワクチンとの詳細な比較は困難である。免疫原性に加えて、我々は、Ｈｉ Ｐｏｌｙ １を標的化する抗体が、感染の２つの別個のモデルにおいて、２つの別個のＮＴＨｉ単離株に対して防御的であることを示した。

ワクチンアジュバントは、免疫原性の重要な決定因子である。我々は、幼年ワクチンを模倣するために、現在の研究に関してミョウバンをアジュバントとして用いた。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １の免疫原性および免疫原性プロファイルは、広範なリストの市販アジュバント（例えば、新規のＳｈｉｎｇｒｉｘワクチンにおいて用いられるＡＳＯ１）によってさらに改善され得る可能性がある。したがって、新規に開発されるアジュバントは、未来のＢＶＰの免疫原性および免疫プロファイルを改善し得る可能性がある。受動防御による有効性を含む以前の研究によって、ＯＭに対する防御が主に血清抗体によって仲介されることが示されているので、我々は、ＯＭにおける防御の尺度として抗体に着目した。しかしながら、百日咳のような他の細菌に対して防御するためには代替の免疫のパスウェイが必要であり得る。

細菌ワクチンは、歴史的に、１）全細胞（例えば、１９９０年代よりも前の百日咳ワクチン）、２）タンパク質病原性因子（例えば、破傷風毒素および線毛）、または３）表面炭水化物（単独または免疫原性を改善するために担体タンパク質にコンジュゲートされる）を使用している。最近では、リバース・ワクチン工学によるゲノムデータの体系的なマイニング（ｍｉｎｉｎｇ）によって、髄膜炎菌ワクチンにおいて有用な防御的リポタンパク質が生み出されている。これらの手法は、流行性の感染の制御において非常に成功している。それらには、特定の制限もある。例えば、莢膜型ワクチンは、特定の莢膜型を有する種のメンバーを標的化して、無莢膜型株（インフルエンザ菌の場合）または異なる莢膜型を有する株（肺炎連鎖球菌の場合）は、残存病変を生じる。百日咳の場合は、現行のワクチンは３～５個のタンパク質を有しており、そのうちの１つはパータクチンであり；パータクチンを生産しない株が最近出現していて、ワクチン有効性の低下に寄与し得る。ＢＶＰ手法においては、標的は免疫がアクセス可能なタンパク質領域であり、複数のタンパク質領域が効率的に送達されるので、これらの制限は減少する。

その他は、防御的タンパク質の配列可変領域由来の複数のペプチドを用いて配列不均質性を克服している。しかしながら、複数のタンパク質の配列保存領域を標的化するＢＶＰには大きな利点がある。表面露出タンパク質の配列保存領域が種にわたって存在することは、これらの領域がタンパク質機能に必要とされ得ることを示唆しており；したがって、タンパク質機能の抗体阻害は、毒素のような病原性因子による干渉と同様に、ワクチンの有効性を高め得る。複数の部位の効果的な標的化は、露出を回避するためには複数の同時の突然変異が必要なので、遺伝学的エスケープの機会を減少させる。最後に、ＢＶＰにおいて複数の異なるタンパク質ターゲットを標的化することは、非常に費用効果的な製造アプローチを提供する。

ＢＶＰに対する１つの現在の制限は、免疫攻撃のために利用可能な特定のタンパク質領域を同定するための基礎的なツールがないことである。この制限は、細菌の表面構造の複雑性および調節された発現によって複雑化される。例えば、ＨｘｕＣは、鉄／ヘムによって調節されていて、広範囲の動物スクリーニングによって現在の研究において検出された。また、異なる細菌種を死滅させるために必要な特定の免疫メカニズムは、ペプチドの選択に影響し得て、あまり研究されていない。同様に、線形および二次エピトープの防御的役割を同定および識別する方法は、あまり特徴付けられていない。これらの領域における研究が、ＢＶＰのさらなる進歩に重要である。

ポリペプチドは、酵素的および治療的ポリペプチドのような様々な機能を発揮するようにインシリコで設計されている。我々は、ＢＶＰが、細菌表面上の複数のタンパク質を標的化する防御免疫を誘導するように特異的に設計されることを提案する。我々のデータは、関連のあるヒト病原体ＮＴＨｉに注目している。しかしながら、生物学的機能の理解はＢＶＰ方法論において重要なステップではないので、手法を他の細菌種に直接適用することができる。例えば、我々は、ＢＶＰが百日咳の前臨床モデルにおいて効果的であるという証拠を有している（データ示さず）。

［結論。］Ｈｉ Ｐｏｌｙ １（細菌ワクチンポリペプチド）を、インフルエンザ菌の全ての株に存在する表面露出タンパク質由来の配列が保存されたペプチドからなる多重標的化ポリペプチドとして設計した。Ｈｉ Ｐｏｌｙ １は、チンチラにおいて免疫原性であり、構成要素ペプチドのそれぞれに対して抗体が誘導された。免疫付与後のチンチラ抗血清は、ＰＢＳまたは免疫前血清と比べて、幼ラットモデルにおいてＮＴＨｉ Ｒ２８６６菌血症を減少させた。同様に、無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）中耳炎の十分に確立されたチンチラ・モデルにおいて、ワクチン群は、コントロール群よりも有意に迅速に、ＮＴＨｉ株８６－０２８による感染をクリアした。データは、ＮＴＨｉワクチンとしてのＨｉ Ｐｏｌｙ １のさらなる研究を支持し、他の病原体に関する細菌ワクチンポリペプチドの開発のためのモデルを提供する。

上述または本明細書において他の方法で検討される任意のペプチド組成物は、薬学的に許容できる担体、ビヒクル、希釈剤、および／またはアジュバントをさらに含んでよい。

本開示の特定の実施態様は、感染性生物に対する抗体応答を誘導することが可能な少なくとも１つの融合異種ポリペプチド（融合タンパク質）を含んでいるペプチド組成物に関する。融合ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多くの異なるペプチドを、連続して連結して含んでよく、ここで、１つまたは複数のペプチドのそれぞれは、１０～６０アミノ酸の長さである。

特定の他の実施態様では、本開示は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する抗体応答を誘導することが可能なペプチド組成物に関し、ここで、ペプチド組成物は、担体分子に連結された少なくとも１つのペプチドを含んでいる担体分子組成物である。

上述または本明細書において他の方法で検討される任意の担体分子組成物は、薬学的に許容できる担体、ビヒクル、希釈剤、および／またはアジュバントも含む組成物内に存在してよい。

特定の実施態様では、本開示は、感染性生物に対する能動または受動の免疫原性応答を対象において誘導する方法に関する。当該方法は、免疫原性として有効量の、上述または本明細書において他の方法で検討される任意のペプチド組成物、融合ポリペプチド、および／または担体分子組成物を、対象に投与するステップを含む。

特定の実施態様では、本開示は、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する対象における能動または受動の免疫防御を提供する方法に関する。当該方法は、上述または本明細書において他の方法で検討される任意の免疫原性ペプチド組成物、融合ポリペプチド、および／または担体分子組成物に対して産生される有効量の抗体組成物を、対象へ投与するステップを含む。

さらに、一部の実施態様では、直接送達されるにしても、またはウイルスベクターを介するにしても、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡをワクチン組成物として用いることができる。

本開示は、特定の実施態様との関連で、その態様がより完全に理解および認識され得るように、本明細書において記載されているが、本開示がこれらの特定の実施態様に限定されることを意図しない。それとは対照的に、全ての代替、改変および等価物は、本明細書中で定義されるように本開示の範囲内に含まれることが意図される。したがって、上述の実施例（特定の実施態様を含む）は、本開示の実施を例示するのに役立ち、示される詳細（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｓ）は、例としてのものであり、特定の実施態様の例示的な考察目的のみのためであり、手順ならびに本開示の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されることが理解される。本明細書中に記載の様々な組成物の製剤、本明細書中に記載の方法、または本明細書中に記載の方法のステップもしくはステップの順番は、本開示の主旨および範囲を逸脱せずに変更されてよい。さらに、本開示の様々な実施態様が、本明細書中の以下の特許請求の範囲に記載されているが、本開示がこれらの特定の特許請求の範囲に制限されることを意図しない。出願人らは、後の特許出願において、本明細書中の以下に示される特許請求の範囲を補正し、追加し、または置き換える権利を留保している。

［参考文献］
以下の参考文献は、本明細書中に示されるものを補う例示的な手順または他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書中に明確に援用される。

Claims (12)

1. 細菌物質からワクチン組成物を作製する方法であって、
   以下のステップ：
   （ａ）高い相対存在量のｍＲＮＡ発現を有する１つまたは複数の細菌遺伝子を選択するステップ；
   （ｂ）ステップ（ａ）において選択された１つまたは複数の遺伝子のペプチドを、防御アッセイによって、免疫原性効果について試験するステップ；および
   （ｃ）ステップ（ｂ）において防御を示す１つまたは複数の遺伝子のペプチドを用いて、細菌ワクチンポリペプチドを構築するステップ、
   を含む、
   方法。
2. 請求項１の方法であって、
   前記の高い相対存在量のｍＲＮＡは、約１１，８１９～約４７，６５６である、
   方法。
3. 請求項１の方法であって、
   目的の細菌種全体にわたる発現に基づいて、ステップ（ａ）に使用される１つまたは複数の細菌遺伝子を選択するステップをさらに含む、
   方法。
4. 請求項１または３の方法であって、
   インシリコ構造解析に基づいて、ステップ（ａ）に使用される１つまたは複数の細菌遺伝子を選択するステップをさらに含み、前記１つまたは複数の細菌遺伝子は、細胞表面に露出される、
   方法。
5. 対象における免疫原性応答を誘導する方法であって、
   前記対象に、感染性生物に対する免疫原性応答を刺激するのに効果的な量の異種融合ポリペプチド組成物を投与するステップを含む、
   方法。
6. 請求項５の方法であって、
   前記感染性生物はＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（Ｂｐ）であり、
   ここで、前記異種融合ポリペプチドは、ＢｐＰｏｌｙ１およびＢｐＰｏｌｙ３からなる群より選択される、
   方法。
7. 請求項５または６の方法であって、
   前記異種融合ポリペプチドは、担体分子に連結されて担体分子組成物を形成する、
   方法。
8. 請求項５の方法であって、
   前記異種融合ポリペプチドは、薬学的に許容できる担体、ビヒクル、希釈剤、および／またはアジュバントをさらに含む、
   方法。
9. 請求項５の方法であって、
   前記異種融合ポリペプチド組成物は、請求項１に従って作製される、
   方法。
10. 対象におけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する免疫原性応答を誘導する方法であって、
    前記対象に、ＢｐＰｏｌｙ１またはＢｐＰｏｌｙ３を含む、ある量の異種融合ポリペプチド組成物を投与するステップを含み、
    ここで、異種融合ポリペプチドの前記量は、前記対象におけるＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに対する免疫原性応答を刺激するのに効果的である、
    方法。
11. 請求項１０の方法であって、
    前記異種融合ポリペプチドは、担体分子に連結されて担体分子組成物を形成する、
    方法。
12. 請求項１０の方法であって、
    前記異種融合ポリペプチドは、薬学的に許容できる担体、ビヒクル、希釈剤、および／またはアジュバントをさらに含む、
    方法。

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