JP2002538169A

JP2002538169A - インフルエンザ菌に起因する疾患を防御するための、少なくとも３つの抗原を含む多成分系ワクチン

Info

Publication number: JP2002538169A
Application number: JP2000602299A
Authority: JP
Inventors: ルーズモア、シーナ、エム．; ヤング、ヤン−ピング; クレイン、マイケル、エイチ．
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1999-03-03
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2002-11-12
Also published as: NZ514413A; MXPA01008913A; WO2000051633A2; CA2366316A1; AU769256B2; EP1159001A2; CA2366316C; WO2000051633A3; US6342232B1; AU2790400A

Abstract

(57)【要約】多成分系免疫原性組成物は、免疫された宿主に対しインフルエンザ菌に起因する疾患に対する防御をもたらす。このような組成物は、インフルエンザ菌の少なくとも３つの異なる抗原を含み、そのうち２つはアドヘシンである。分類不能型インフルエンザ菌の高分子量(ＨＭＷ)タンパク質およびインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質は、アドヘシン成分を含み、他の抗原は、Ｈin４７タンパク質の非タンパク質分解性類縁体である。それぞれの成分は、他成分の免疫原性を損なうことはない。ヘモフィルスワクチンを、１型、２型および/または３型を含む不活化ポリオウイルス、および/またはＰＲＰ-Ｔを含むインフルエンザ菌の莢膜多糖および破傷風またはジフテリアトキソイドの結合体であってもよいＤＴＰコンポーネントワクチンと混合し、他の抗原の免疫原性を損なうことなく多価コンポーネントワクチンを提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (発明の分野) 本発明は、ワクチン学の分野、具体的には、インフルエンザ菌(ヘモフィルス
・インフルエンジー(Ｈaeｍophilus influenzae))に由来する組換えタンパク質
を含み、中耳炎を含むインフルエンザ菌に起因する疾患を防御するのに有用な多
成分系ワクチンに関する。

【０００２】 (発明の背景) インフルエンザ菌は、髄膜炎、喉頭蓋炎、敗血症および中耳炎などいくつかの
重篤なヒト疾患の原因である。インフルエンザ菌には、aからfと表され、莢膜多
糖によって識別される６種類の血清型がある。b型インフルエンザ菌(Ｈib)は、
１９８０年代にいくつかのＨib結合ワクチンが導入されるまでは細菌性髄膜炎の
主要な原因であった(ref.１.本出願全体にわたって、様々な参考文献を括弧内に
引用し、本発明が関係する技術分野の現状をより完全に説明する。それぞれの引
用に関する完全な文献情報は、明細書の最後、特許請求の範囲の直前に見い出さ
れる。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む)。ジフテリア
トキソイド(ref.２)、破傷風トキソイド(ref.３および米国特許４,４９６,５３
８)、または髄膜炎菌外膜タンパク質(ref.４)に結合したb型インフルエンザ菌莢
膜多糖をベースとするワクチンは、b型インフルエンザ菌誘発髄膜炎を減らすの
に有効とされてきた。他の血清型インフルエンザ菌が侵襲性疾患に関連する頻度
は低いが、Ｈib疾患の発生率が減少するにつれてこれらの菌株に起因する疾患の
発生率が増加しているように見える(ref.５、６)。非被包性すなわち分類不能型
インフルエンザ菌(ＮＴＨi)もまた、中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎および気管気管支
炎を含む広範囲のヒト疾患の原因となる。ＮＴＨi誘発疾患の発生率は、Ｈibワ
クチンの導入によって影響を受けなかった(ref.７)。

【０００３】中耳炎は、幼児期に最もよくみられる病気であり、２歳未満の子供全体の６０
から７０％が１回から３回の耳感染症を経験する(ref.８)。子供における慢性中
耳炎は、聴力、発話および認知障害の原因となる。インフルエンザ菌感染症は、
急性中耳炎の症例の約３０％、慢性中耳炎の約６０％を占める。米国だけでも、
中耳炎の治療には、抗生物質ならびに扁桃摘出術、咽頭扁桃切除術および中耳腔
換気用チューブの挿入などの外科的処置に年間１０億から２０億ドルが費やされ
ている。言語療法および特殊教育授業などの付加的療法に対し、年間さらに３０
０億ドルが費やされていると推定される。さらに、中耳炎の病原菌の多くは、抗
生物質治療に耐性になりつつある。したがって、中耳炎に対して有効な予防的ワ
クチンが望まれている。

【０００４】自然感染では、抗体反応を刺激する表面に露出した外膜タンパク質が殺菌およ
び/または防御抗体として潜在的に重要な標的であり、したがって、潜在的なワ
クチン候補である。ＢarenkaｍpおよびＢodor(ref.９)は、ＮＴＨiによる中耳炎
に罹患している子供の回復期血清が、高分子量(ＨＭＷ)タンパク質に対する抗体
を含むことを明らかにした。ＮＴＨi菌株の約７０から７５％がＨＭＷタンパク
質を発現し、これらの菌株の大部分は、hｍｗ１ＡＢＣおよびhｍｗ２ＡＢＣと呼
ばれる２つの遺伝子群を含む(ref.１０、１１)。ＨＭＷＡタンパク質は、ヒト上
皮細胞への付着を仲介するアドヘシンであることが明らかとなった(ref.１２)。
未変性のＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質の混合物による免疫は、中耳炎
のチンチラ胞内チャレンジモデルにおいて部分的防御をもたらした(ref.１３)。

【０００５】セントルイス大学およびワシントン大学に譲渡され、その開示を参照により本
明細書に組み込む米国特許第５,６０３,９３８号(Ｂarenkaｍp)は、分類不能型
ヘモフィルスの菌株１２のＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパク質をコードする遺伝
子のクローニング、発現および配列決定について記載している。ＨＭＷタンパク
質は、分子量約１２０から１２５kＤaの分類不能型インフルエンザ菌に由来する
タンパク質の１つで、インフルエンザ菌の被包性菌株には存在しない。

【０００６】インフルエンザ菌による未変性ＨＭＷタンパク質の産生は極めて少なく、防御
的組換えＨＭＷ(rＨＭＷ)タンパク質の製造方法は、本出願と同じ譲受人に譲渡
され、その開示を参照により本明細書に組み込む１９９８年１０月７日出願の同
時係属米国特許出願第０９/１６７,５６８号に記載されている。チンチラ鼻咽頭
コロニー形成モデルが特にアドヘシンのワクチンとしての有効性を明らかにする
ために開発され(ref.１４)、前述の同時係属米国特許出願第０９/１６７,５６８
号に記載のようにこのrＨＭＷタンパク質はこのモデルにおいて防御性がある。r
ＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａタンパク質は、同等の防御を与えることが分かり
、以後のワクチン研究にはrＨＭＷ１Ａタンパク質を選んだ。この出願では、rＨ
ＭＷはＮＴＨi菌株１２に由来する組換えＨＭＷ１Ａタンパク質を指すが、他の
ＮＴＨi菌株に由来する対応する組換えＨＭＷ１Ａタンパク質およびＮＴＨi菌株
に由来する対応するrＨＭＷ２Ａタンパク質をrＨＭＷとして用いてもよい。対応
する天然に存在するタンパク質を用いてもよい。

【０００７】高分子量接着タンパク質の第二のファミリーが、ＮＴＨIの約２５％および被
包性インフルエンザ菌株で同定されている(ref.１５、１６、１７)。この第二の
ファミリーのＮＴＨiメンバーは、インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈaeｍophilus
influenzae adhesin)すなわちＨiaと呼ばれ、被包性菌株の相同タンパク質は
、インフルエンザ菌表面原線維タンパク質(Ｈaeｍophilus influenzae surfac
e fibril protein)すなわちＨsfと呼ばれる。

【０００８】セントルイス大学およびワシントン大学に譲渡され、その開示を参照により本
明細書に組み込む米国特許第５,６４６,２５９号(Ｓt.Ｇeｍe、III他)は、ＵＳ
Ｐ５,６０３,９３８のＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパク質に対して限られた相同
性を有するＨiaおよびＨsfタンパク質をコードする遺伝子のクローニング、発現
および配列について記載している。

【０００９】 hia遺伝子は、中耳炎患者の回復期血清を用い発現ライブラリーから最初にク
ローニングされ、疾患における重要な免疫原であることが明らかとなった。プロ
トタイプのＨiaおよびＨsfタンパク質は、約８２％の配列類似性を示すが、Ｈsf
タンパク質はかなり大きい。このタンパク質は保存されたアミノおよびカルボキ
シ末端ならびにいくつかの繰り返しモチーフからなり、Ｈiaに比べてＨsfはより
多くの繰り返し配列を含む。

【００１０】本出願と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む１
９９９年３月１６日出願の米国特許出願第０９/２６８,３４７号は、大腸菌にお
ける完全長およびＮ末端切断型Ｈiaタンパク質(rＨia)の産生について記載して
いる。これらの組換えタンパク質は、a型およびb型インフルエンザ菌に起因する
菌血症を防御し、分類不能インフルエンザ菌による鼻咽頭コロニー形成に対して
部分的防御をもたらすことが明らかになった。この出願では、rＨiaは、ＮＴＨi
菌株１１に由来するＶ３８ rＨiaを意味するが、他のＮＴＨi菌株に由来する他
の組換え完全長およびＮ末端切断型Ｈiaタンパク質を用いてもよい。対応する天
然に存在するタンパク質を用いてもよい。

【００１１】高温などの環境ストレスの下で、生物体はストレス応答または熱ショックタン
パク質(hsps)を過剰生産する。細菌のhspsは、重要な免疫原であり、Ｂ細胞とＴ
細胞を共に刺激することが分かった(ref.１８)。細菌のＨtrＡまたはＤegＰ熱シ
ョックタンパク質はストレス条件下で発現し、インフルエンザ菌ＨtrＡまたはＨ
in４７タンパク質は、中耳炎の胞内チャレンジモデルにおいて部分的な防御抗原
であることが分かっている(ref.１９)。ＨtrＡタンパク質はセリンプロテアーゼ
であり、そのタンパク質分解活性はタンパク質を不安定にする。さらに、多成分
系ワクチンの成分として、野生型ＨtrＡタンパク質は混合された抗原を分解する
。インフルエンザ菌ＨtrＡ遺伝子(hin４７と呼ばれる)の部位特異的変異誘発お
よび変異体の特性は、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照により本
明細書に組み込む米国特許第５,５０６,１５９号(Ｌoosｍore他)にすべて記載さ
れている。

【００１２】米国特許第５,５０６,１３９号(Ｌoosｍore他)は、天然のＨin４７タンパク質
の約１０％未満にプロテアーゼ活性が低下し、天然のＨin４７タンパク質とほぼ
同等な免疫原性を有することが好ましいインフルエンザ菌Ｈin４７タンパク質類
縁体の調製について記載している。この特許はまた、Ｈin４７類縁体をコードす
る核酸分子の分離、精製および確認についても記載している。天然のＨin４７タ
ンパク質は、免疫学的にはインフルエンザ菌の分類不能型とb型分離株中に保存
されている。天然Ｈin４７タンパク質のアミノ酸配列およびhin４７遺伝子をコ
ードするヌクレオチド配列は、１９９４年１月６日発行で参照により本明細書に
組み込むＷＯ９４/００１４９に記載されている。

【００１３】米国特許第５,５０６,１３９号のＨin４７類縁体は、本明細書で具体的に述べ
るように、天然Ｈin４７タンパク質のプロテアーゼ活性に寄与する少なくとも１
つのアミノ酸を欠失させるか、異なるアミノ酸で置換すること、または天然Ｈin
４７タンパク質に少なくとも１つのアミノ酸を挿入することによって調製する。
少なくとも１つの欠失または置換されるアミノ酸は、Ｈin４７の１９５から２０
１のアミノ酸から選択することができ、具体的にはセリン-１９７であって、こ
れを欠失させるかアラニンで置換することができる。さらに、少なくとも１つの
欠失または置換されるアミノ酸は、Ｈis-９１でもよく、欠失させるかアラニン
、リジンまたはアルギニンで置換することができる。さらに、少なくとも１つの
欠失または置換されるアミノ酸は、Ａsp-１２１でもよく、欠失させるかアラニ
ンで置換することができる。

【００１４】本出願と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む１
９９５年６月７日出願の米国特許出願第０８/４８７,１６７号(ＷＯ９６/０３５
０６)には、天然Ｈin４７タンパク質の様々なアミノ酸で行われ、非タンパク質
分解性Ｈin４７類縁体を与える多重変異が記載されている。

【００１５】本発明では、ヒスチジン９１のアラニンへの変異(本明細書ではしばしば「Ｈ
９１Ａ」と称する)を変異体Ｈin４７タンパク質の例として用いるが、前述の特
許および出願に記載されているようなプロテアーゼ活性の低下した他のＨin４７
変異体を使用してもよい。

【００１６】非タンパク質分解性ＨtrＡ類縁体であるＨ９１ＡＨin４７は、b型インフル
エンザ菌に起因する菌血症および分類不能型インフルエンザ菌に起因する中耳炎
に対する防御抗原であることが判明している(ref.１９)。ＨtrＡは、インフルエ
ンザ菌のすべての被包性菌株を含むすべての被験菌株中に見いだされる。

【００１７】中耳炎に対する予防的ワクチンの主な目標は、免疫原としてアドヘシンを含め
ることによって鼻咽頭コロニー形成の確立を予防することである。インフルエン
ザ菌ＨＭＷおよびＨiaタンパク質は、コロニー形成を予防することが分かってい
るアドヘシンである。しかしながら、hｍｗまたはhia遺伝子を含まないインフル
エンザ菌株が少ない割合で存在し、広範囲の疾患防御が望まれることから、Ｈ９
１ＡＨin４７抗原を加えてこのような菌株に対する防御を提供してきたが、Ｈ
in４７の他のいかなる非タンパク質分解性類縁体を用いてもよい。本発明は、被
包性または非被包性インフルエンザ菌に起因するコロニー形成および疾患を防御
するための多成分系ワクチンを提供する。

【００１８】選択された相対量の選択された抗原を含有するインフルエンザ菌成分を含む有
効な混合ワクチンを提供することが望まれている。

【００１９】 (発明の概要) 本発明は、中耳炎を含む、インフルエンザ菌による感染に起因する疾患を防御
するための、少なくとも３つの抗原を含む多成分系ワクチンの提供を対象とする
。

【００２０】本発明の一態様によれば、宿主において中耳炎を含むインフルエンザ菌による
感染に起因する疾患に対する防御をもたらすための免疫原性組成物であって、イ
ンフルエンザ菌の少なくとも３つの異なる抗原を含み、異なる抗原のうち少なく
とも２つがアドヘシンである組成物が提供される。

【００２１】アドヘシンである抗原の１つは、ヘモフィルスの分類不能型菌株の高分子量タ
ンパク質(ＨＭＷ)、具体的には分類不能型菌株のＨＭＷ１またはＨＭＷ２タンパ
ク質であってもよく、組換えによって製造することができる。

【００２２】アドヘシンであるもう１つの抗原は、インフルエンザ菌の分類不能型菌株のイ
ンフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質、またはインフルエンザ菌の分類可
能菌株のインフルエンザ菌表面原線維(Ｈsf)タンパク質である。

【００２３】アドヘシンではないインフルエンザ菌の抗原は、インフルエンザ菌株の非タン
パク質分解性熱ショックタンパク質であってよい。インフルエンザ菌株の非タン
パク質分解性熱ショックタンパク質は、天然のＨin４７タンパク質の約１０％未
満にプロテアーゼ活性が低下したインフルエンザ菌Ｈin４７タンパク質の類縁体
であってもよい。

【００２４】本発明の本態様の好ましい実施形態によれば、宿主において中耳炎を含むイン
フルエンザ菌に起因する疾患に対する防御をもたらすための免疫原性組成物であ
って、 (a)天然のＨin４７タンパク質の約１０％未満にプロテアーゼ活性が低下した
インフルエンザ菌Ｈin４７タンパク質の類縁体、 (b)分類不能型インフルエンザ菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)、お
よび (c)分類不能型インフルエンザ菌株の高分子量(ＨＭＷ)タンパク質を含む組成
物が提供される。

【００２５】Ｈin４７タンパク質の類縁体は、プロテアーゼ活性に寄与する天然Ｈin４７タ
ンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が欠失するか、異なるアミノ酸で置換され
、天然のＨin４７タンパク質とほぼ同等な免疫原性を有する類縁体でよい。

【００２６】この少なくとも１つのアミノ酸は、天然Ｈin４７タンパク質のアミノ酸９１、
１２１および１９５〜２０７からなる群から選択することができる。用いること
ができる具体的な変異体には、セリン-１９７がアラニンで置換され、ヒスチジ
ン-９１がアラニン、リジンまたはアルギニンで置換され、Ａsp-１２１がアラニ
ンで置換されている。

【００２７】インフルエンザ菌の分類不能型菌株のＨＭＷタンパク質は、ＨＭＷ１またはＨ
ＭＷ２タンパク質でよく、組換えによって製造することができる。ＨＭＷ１およ
びＨＭＷ２タンパク質は分類不能型インフルエンザ菌のそれぞれの菌株に由来し
、下表Iに示すそれぞれの分子量を有している。

【００２８】

【表２】

【００２９】Ｈiaタンパク質は、組換えによって製造することができ、Ｎ末端切断型Ｖ３８
rＨiaタンパク質を含んでいてもよい。

【００３０】本発明の免疫原性組成物はさらにアジュバントと共に製剤化することができる
。本発明で使用するためのアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アル
ミニウム、ＱＳ２１、Ｑuil Ａ、その誘導体および成分、IＳＣＯＭマトリック
ス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ
酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、IＳＣＯ
ＰＲＥＰ、ＤＣ-chol、ＤＤＢＡおよびリポタンパク質ならびに他のアジュバン
トが含まれるが、これらに限定されるものではない。アジュバントの有利な組合
せは、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込
む１９９４年６月１６日出願の同時係属米国特許出願第０８/２６１,１９４号、
および１９９５年６月７日出願の第０８/４８３,８５６号(１９９５年１１月２
１日発行のＷＯ９５/３４３０８)に記載されている。アジュバントは、リン酸
アルミニウムまたは水酸化アルミニウム(まとめてミョウバンとして知られてい
る)を含むことが好ましい。

【００３１】免疫原性組成物の成分は、所望の免疫応答をもたらすのに適当な量で存在する
ことができる。成分は、宿主へのin vivo投与用ワクチンとして製剤化すること
ができる。ワクチン組成物は、 (a)Ｈin４７タンパク質約２５から１００μg、 (b)Ｈiaタンパク質約２５から１００μg、および (c)ＨＭＷタンパク質約２５から１００μgを含有することができる。

【００３２】免疫原性組成物を他の抗原成分と製剤化し、追加の抗原成分が別の病原体に起
因する疾患に対する防御をもたらす多価ワクチンを提供することができる。この
ような追加の抗原は、得られるワクチンの個々の成分の免疫原性が、組成物の他
のそれぞれの成分によって損なわれないような量で存在しなければならない。こ
のような追加の抗原は、コンポーネントワクチンを製造するために規定量の精製
抗原であることが好ましい。

【００３３】このような追加抗原は、多価防御ワクチンに伝統的に見いだされるジフテリア
トキソイド、破傷風トキソイドおよび百日咳トキソイド、繊維状赤血球凝集素、
パータクチンおよび/または凝集原を含む百日咳抗原などの抗原であってよい。

【００３４】得られる多価ワクチンはまた、不活化ポリオウイルスなどの非毒性ポリオウイ
ルスを含有してもよく、１型、２型および/または３型ポリオウイルスであって
もよい。多成分系ワクチンはさらに、破傷風またはジフテリアトキソイドおよび
インフルエンザ菌の莢膜多糖、好ましくはＰＲＰ-Ｔの結合体を含むことができ
る。

【００３５】本発明は、中耳炎を含むインフルエンザ菌による感染に起因する疾患に対して
宿主を免疫化する方法であって、本明細書で提供される免疫有効量の免疫原性組
成物を宿主に投与することを含む方法まで拡大する。

【００３６】本発明の利点には、被包性および非被包性インフルエンザ菌疾患に対し、安全
かつ有効に防御をもたらすことができる多成分系ワクチンが含まれる。

【００３７】本発明は、図面を参照し以下の説明からより理解されよう。

【００３８】 (発明の一般的説明) 組換えインフルエンザ菌抗原rＨＭＷ、rＨiaおよびＨ９１ＡＨin４７の製造
および精製はそれぞれ、前述の米国特許出願第０９/１６７,５６８号、第０９/
２６８,３４７号、および前述の米国特許第５,５０６,１５９号に全て記載され
ている。

【００３９】鼻咽頭のコロニー形成は、多くの細菌性またはウイルス性病原体にとって疾患
発現の第一段階であり、アドヘシン分子を含有するワクチンは、疾患進行のこの
第一段階を防御しなければならない。分類不能型インフルエンザ菌の約７５％に
見いだされる高分子量(ＨＭＷ)タンパク質は、ワクチン組成物として投与された
場合にコロニー形成に対して防御的であるアドヘシンであることが分かった。Ｈ
ＭＷタンパク質は、被包性インフルエンザ菌株および約２５％の分類不能型イン
フルエンザ菌株には存在しないので、全菌株に対する防御性を有する完全に有効
なワクチンとしては不十分である。

【００４０】Ｈia/Ｈsfタンパク質もまた、アドヘシンであることが分かり、すべての被包
性インフルエンザ菌株およびＨＭＷタンパク質を産生しない大部分の分類不能型
インフルエンザ菌株に存在する。rＨiaタンパク質は、ＮＴＨiによるコロニー形
成およびa型およびb型インフルエンザ菌に起因する菌血症に対して防御性である
。ＨＭＷもＨiaタンパク質も産生しないＮＴＨi菌株の割合は小さい。

【００４１】ＨtrＡタンパク質またはＨin４７は、すべての被包性および分類不能型インフ
ルエンザ菌株に見いだされる。Ｈin４７、またはその非タンパク質分解性Ｈ９１
ＡＨin４７変異体は、b型インフルエンザ菌に起因する菌血症および分類不能
型インフルエンザ菌に起因する中耳炎に対して防御性であるが、コロニー形成を
予防しない。rＨＭＷ、rＨiaおよびＨ９１ＡＨin４７抗原を含む混合ワクチン
を製剤化すれば、中耳炎を含むインフルエンザ菌疾患を防御することができる。
本発明では、このような混合ワクチンを提供する。

【００４２】多成分系ワクチンの組成は、最大限の効率のために重要である。ワクチン成分
は、適合性でなくてはならず、適当な比率で混合された場合に、抗原性の妨害を
避け、可能ないずれの相乗効果も最適化しなければならない。他の既存ワクチン
と共に投与する場合には、そのワクチンによってもたらされる他の疾患に対する
防御を妨害してはならない。

【００４３】二成分系rＨＭＷ＋Ｈ９１ＡＨin４７ワクチンの調製、免疫原性および防御
性は、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込
む１９９８年１２月１５日出願の米国特許出願第０９/２１０,９９５号に記載さ
れている。

【００４４】２つの動物種で三成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ＋rＨiaワクチンについ
て様々な抗原比率を比較する。rＨiaの増量による抗Ｈ９１ＡＨin４７応答に
対する影響はなかった。抗原性の妨害は、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞ
れ０.３μg用量をrＨiaの用量を増やしながら混ぜた場合に、抗rＨＭＷ応答につ
いてマウスで観察された。しかしながら、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞ
れ３.０μg用量においては、rＨiaの増量による抗rＨＭＷ応答の抑制はなかった
。０.３μg用量をＨ９１Ａ＋rＨＭＷそれぞれ３μgと混合した場合、４２日目に
抗Ｈia応答の一過性の抑制が見られたが、５６日目までにこの効果は有意でなく
なった。モルモットでは、rＨiaの添加は、抗Ｈ９１ＡＨin４７および抗rＨＭ
Ｗ応答に影響しなかった。しかしながら、追加免疫としてＨ９１ＡＨin４７＋
rＨＭＷの存在下では抗Ｈia応答に対する小さいが統計的効果が存在するようで
ある。これらのデータは、すべての成分に対して良好な免疫応答を得るためには
三成分系ワクチンの組成が重要であることを示している。

【００４５】図１を参照しながら、マウスにおける三成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ
＋rＨiaワクチンのＨ９１ＡＨin４７抗原に対する抗体反応を説明する。最終
放血においてすべてのワクチンの組合せについて高い抗体価が得られる。図２を
参照しながら、マウスにおける三成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ＋rＨiaワ
クチンのrＨＭＷ抗原に対する抗体反応を説明する。Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭ
Ｗそれぞれ３.０μg用量では、ワクチン組成物中のrＨiaの量とは無関係に、最
終放血血清中に高い抗rＨＭＷ抗体価が見いだされた。しかしながら、Ｈ９１Ａ
Ｈin４７＋rＨＭＷそれぞれ０.３μg用量では、添加するrＨiaの量が増加する
とともに抗rＨＭＷ力価は劇的に低下した。図３を参照すると、rＨiaの０.３μg
用量では、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷの量が増加するとともに４２日目に抗r
Ｈia免疫応答に対する抑制効果が存在する。しかしながら、この効果は５６日目
までに消失し、より高用量でも観察されず、免疫応答に対する因果関係はない。

【００４６】図４を参照しながら、モルモットにおける三成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨ
ＭＷ＋rＨiaワクチンのＨ９１ＡＨin４７抗原に対する抗体反応を説明する。
最終放血においてすべてのワクチンの組合せについて高い抗体価が得られ、相乗
または抑制効果は観察されなかった。図５を参照しながら、モルモットにおける
三成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ＋rＨiaワクチンのrＨＭＷ抗原に対する
抗体反応を説明する。最終放血においてすべてのワクチンの組合せについて高い
抗体価が得られ、相乗または抑制効果は観察されなかった。図６を参照しながら
、モルモットにおける三成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ＋rＨiaワクチンの
rＨia抗原に対する抗体反応を説明する。最終放血においてすべてのワクチンの
組合せについて高い抗体価が得られた。

【００４７】図７を参照しながら、鼻咽頭コロニー形成モデルにおいて三成分系Ｈ９１Ａ
Ｈin４７＋rＨＭＷ＋rＨIa混合ワクチンによって得られる防御を、rＨＭＷ成分
単独または二成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷワクチンによって得られる防
御と比較して説明する。三成分系ワクチンは極めて防御性があり、より多くの抗
原の添加はrＨＭＷ成分の防御能力に影響しないことを示した。

【００４８】図１３を参照しながら、チンチラモデルにおいて三成分系Ｈ９１ＡＨin４７
＋rＨＭＷ＋rＨia混合ワクチンによって得られる中耳感染に対する防御を説明す
る。防御は、一成分系Ｈ９１ＡＨin４７ワクチンおよび二成分系Ｈ９１ＡＨ
in４７＋rＨＭＷワクチンによって得られる防御に匹敵する。

【００４９】 (生物寄託) 本明細書に記載され参照されたヘモフィルスの分類不能型菌株の高分子量タン
パク質をコードする核酸を含む特定のベクターは、本出願の出願に先立ってブダ
ペスト条約に従い、１０８０１Ｕniversity Ｂoulevard、Ｍanassas、Ｖirgi
nia２０１１０-２２０９、米国に所在するアメリカ培養コレクション(ＡＴＣＣ)
に寄託した。寄託されたベクターのサンプルは、公共に利用可能とし、課される
すべての制限または寄託物を利用する権利は、この米国特許出願に基づく特許の
許可を受けることとする。さらに、受託者が生存可能なサンプルを分配できない
場合には、寄託物を元に戻すこととする。本明細書に記載および請求する本発明
は、寄託された生物材料によってその範囲を限定されるものではないが、それは
寄託された実施形態が本発明の例示のみを意図しているからである。本出願の記
載と等価または同様な抗原をコードする核酸を含むいずれの等価または類似のベ
クターも本発明の範囲に入る。

【００５０】

【表３】

【００５１】 (実施例) 上記の開示は、本発明を一般的に説明している。より完全な理解は、以下の具
体的実施例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、例示
の目的で記載されたに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していない。
状況が適切であると示唆または適切となるような形の変更および等価体の置換は
、企図されている。本明細書では具体的な用語を用いてきたが、これらの用語は
記述的意味を意図するもので、限定の目的ではない。

【００５２】用いる分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学および発酵技術の方法は、本開
示およびこれらの実施例中ではっきりとは説明されていないが、科学文献に十分
に報告されており、おそらく当業者の能力の範囲内にある。 (実施例１) 本実施例は、Ｈ９１ＡＨin４７ワクチン成分の調製について記載している。

【００５３】Ｈ９１ＡＨin４７変異体は、前述の米国特許第５,５０６,１３９号に記載さ
れ、図８に図示されるように調製した。簡単に言うと、９１位のヒスチジン残基
をアラニンに変えることができるオリゴヌクレオチド５’ＡＴＣＡＡＴＡＡＣＡ
ＧＣＡＴＴＡＴＴＧＧＴ３’(配列番号１)を合成した(ref.１９)。

【００５４】プラスミドＪＢ-１２７６-１-２は、ＥcoＲI断片上にＴ７/hin４７遺伝子を含
むpＵＣベースのプラスミドであり、これを用い、ＡｍershaｍのIn Ｖitro Ｓ
ite-Ｄirected Ｍutagenesisキットにより部位特異的変異誘発でＭ１３ｍp１８
中にhin４７遺伝子をクローニングした。プラスミドＪＢ-１２７６-１-２の調製
は、ＵＳＰ５,５０６,１３９に記載されている。Ｈis９１コドンのＡla９１への
変異は、局所配列決定によって行った。Ｈ９１Ａ変異体hin４７遺伝子をpＴ７-
７中にサブクローニングすると、プラスミドＤＳ-１２７７-１９が生成した(図
８)。

【００５５】Ｈ９１ＡＨin４７発現プラスミド(ＤＳ-１２７７-１９)は、アンピシリン選
択を利用する。テトラサイクリン選択が使用できるように、Ｔ７/Ｈ９１Ａ hin
４７遺伝子をpＢＲ３２８中にクローニングした。このように、ベクターＤＳ-１
３１２-１２は、pＢＲ３２８ベースのプラスミドで、ＥcoＲIとＣlaI部位の間に
Ｔ７/Ｈ９１Ａ hin４７遺伝子配列を含み、機能性のアンピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性遺伝子を有し、pＢＲ３２８とpＥＶvrflの双方に見いだされるＨ
indIII-ＢaｍＨ I配列の繰り返しを含む。

【００５６】カナマイシン選択を利用するＤＳ-１３１２-１２をベースとする新たなプラス
ミドを構築した。構築スキームを図８に示す。ＤＳ-１３１２-１２に由来するプ
ラスミドＤＮＡをＨindIIIで消化すると、２つの断片が生成した。より大きな５
.９kb断片は、プロモーターを欠くtetＲ遺伝子、aｍpＲ遺伝子およびＴ７/Ｈ９
１Ａ hin４７遺伝子を含み、自身が再連結してベクターＤＳ-２１４０-３を生
成した。プラスミドＤＳ-２１４０-３をＰst Iで消化し、プラスミドpＵＣ-４
Ｋ(Ｐ-ＬＢiocheｍicals)に由来するkanＲ遺伝子をＰst I部位に挿入すると
、kanＲでありアンピシリンとテトラサイクリンの双方に感受性のプラスミドＤ
Ｓ-２１５０-１が生成した。

【００５７】ＤＳ-２１５０-１に由来するプラスミドＤＮＡは、ＨolｍesおよびＱuigley法
(ref.２１)に基づくプロトコルを用い、フェノールおよびクロロホルムによる抽
出を含む５０ｍＬ培養から調製した。大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞は、以下のよ
うにエレクトロコンピテントにした。簡単に言うと、１０ｍＬのオーバーナイト
培養をＹＴ培地５００ｍＬに接種し、Ａ₆₂₀＝０.５４０に達するまで振盪しなが
ら３７℃で細胞を生長させた。培養物を氷で３０分間冷やし、５Ｋrpｍで１５分
間回転し、細胞ペレットを氷冷滅菌水５００ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液を前
と同様に遠心分離し、細胞ペレットを氷冷滅菌水２５０ｍＬに再懸濁した。細胞
懸濁液を再び回転させ、細胞を１０％グリセロール１０ｍＬに再懸濁した。グリ
セロール懸濁液を回転させ、細胞を１０％グリセロール１.５ｍＬに再懸濁し、
４０μＬのサンプルに等分し、-７０℃で保存した。

【００５８】エレクトロコンピテントＢＬ２１(ＤＥ３)細胞の一アリコートを氷上で解凍し
、ＤＳ-２１５０-１ＤＮＡ約９ngを加えた。サンプルを氷上で３分間インキュベ
ートし、-２０℃のＢioＲad Ｇene Ｐulser電極キュベットに移し、電気パル
スをかけた。ＳＯＣ培地９００μlを加え、混合物を培養管に移し、３７℃で１
時間インキュベートし、カナマイシン２５μg/ｍＬを含むＹＴ寒天上にプレート
した。プレートを３７℃で一夜インキュベートし、単一コロニーを発現試験に使
用した。

【００５９】個々のコロニーは、Ａ_{600 nm}約０.３までＮＺＣＹＭ培地中で生長させ、乳糖
を１％まで加えて発現を誘導した。細胞を４時間生長させ、次いで採取しＳＤＳ
ＰＡＧＥにより分析した。高レベルのＨ９１ＡＨin４７を発現するクローン
ＤＳ-２１７１-１-１を、代表的クローンとして選択した。

【００６０】ＤＳ-２１７１-１-１を含む大腸菌は、ＥＣＧＭ(グルコース８g/Ｌを含む、p
Ｈ６.５)２５０ｍＬを含む２×２Ｌフラスコ中で生長させ、３７℃で約９時間、
２５０rpｍで振盪しながら暗所でインキュベートした。培養液(２×２５０ｍＬ)
を１０Ｌの発酵槽に接種し、培養物を３７℃で生長させた。約１０時間のインキ
ュベーション後、誘導のために１％乳糖(最終濃度)を加え、続いてさらに４時間
インキュベートした。

【００６１】培養液を滅菌したトランスファボトルに採取し、pＨ８.０のＴris/ＨＣI緩衝
液５０ｍＭに対するクロスフローろ過によって濃縮し、ダイアフィルトレーショ
ンを行った。濃縮物中の細胞を高圧ホモジナイザー(１５,０００psiで２通過)で
溶解し、Ｈ９１ＡＨin４７タンパク質を遊離させた。細胞細片は１５,０００r
pｍで１.５時間遠心分離することにより除去した。上澄みを遠心分離によってさ
らに浄化し、０.２２μｍのデッドエンドろ過器を通してろ過した。生成物は、
さらに処理するまで-７０℃で凍結保存した。

【００６２】清澄なサンプルに塩化ナトリウム(ＮaＣl)を加え、１００ｍＭの最終濃度とし
た。次いで、１００ｍＭＮaＣlを含むpＨ８.０の５０ｍＭＴrisで平衡化した陰
イオン交換クロマトグラフィカラム(ＴＭＡＥ-Ｆractogel)上でサンプルを精製
した。Ｈ９１ＡＨin４７タンパク質が大ざっぱに得られた。

【００６３】 pＨ８.０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した１型セラミックヒド
ロキシアパタイト(ＣＨＴＰ-１)上に水層を充填した。次いで、pＨ８.０の１５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄し、１ＭＮaＣlを含むpＨ８.０
の１７５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でＨ９１ＡＨin４７を溶出した。

【００６４】Ｈ９１ＡＨin４７の精製タンパク質を、１０kＤa分子量カットオフ膜を用い
、続いて約１０倍量のpＨ７.５リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)によるダイアフィルト
レーションにより濃縮した。

【００６５】Ｈ９１ＡＨin４７の精製タンパク質を、Ｑ６００Ｓartobind膜吸着器に通し
た。溶液の通過後、１.０ＭＫＣl/１.０ＭＮaＯＨを用い、続いて１ＭＫ
Ｃlで洗浄し、次いでＰＢＳで平衡化することにより膜を再生した。このプロセ
スを２回繰り返した。濃縮されダイアフィルトレーションを受けたＨ９１ＡＨ
in４７タンパク質を、０.２２μｍの膜ろ過器を通して滅菌ろ過した。滅菌Ｈ９
１ＡＨin４７タンパク質をリン酸アルミニウムでアジュバント化した。吸着さ
れた精製濃縮物を希釈し、１００μg/ｍＬで吸着されたバルクを製造した。

【００６６】Ｈ９１ＡＨin４７ワクチン成分の濃度をＰＢＳ(pＨ７.３)で４００μgｍl^-1 に調整し、リン酸アルミニウムでアジュバント化して最終濃度を３ｍgｍl^-1とし
た。原液をＰＢＳに溶かした３ｍgｍl^-1のリン酸アルミニウムで希釈することに
より様々な用量を調製した。 (実施例２) 本実施例は、rＨＭＷワクチン成分の調製について記載している。

【００６７】ＨＭＷタンパク質の製造および精製は、１９９８年１０月７日出願の同時係属
米国特許出願第０９/１６７,５６８号に記載されており、図９に図示する。

【００６８】簡単に言うと、プラスミドpＨＭＷ１-１５(ref.１３)は、Ｔ７プロモーター配
列内にＸba I部位を、分類不能型ヘモフィルス菌株１２の成熟ＨＭＷ１Ａタン
パク質のコード配列内に独特なＢaｍＨ I部位を含む。pＨＭＷ１-１５の１.８k
bのＸba I-ＢaｍＨ I断片は欠失し、オリゴヌクレオチドから生成する約１１
４bpのＸba I-ＢaｍＨ I断片によって置換された。すなわち、得られる１１.
３kbプラスミド、ＤＳ-１０４６-１-１は、成熟１２５kＤaＨＭＷ１Ａタンパク
質をコードするhｍｗ１ＡＢＣオペロンとフレーム中で結合したＴ７プロモータ
ーを含む(図９)。

【００６９】プラスミドＤＳ-１０４６-１-１は、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子カセットを含
み、成熟ＨＭＷ１Ａ遺伝子のコード領域の外部に独特のＢgl II部位を有する。
プラスミドＤＳ-２２２４-１-４は、ＢaｍＨ I断片上に位置する大腸菌cer遺伝
子を含む。この断片を分離し、プラスミドＤＳ-１０４６-１-１のＢgl II部位
に連結するとプラスミドＢＫ-３５-４が生成した(図９)。カナマイシン耐性カセ
ットをＳal I制限酵素によってpＵＣ４Ｋから切り取り、Ｓal Iで切断され
たＢＫ-３５-４プラスミド中に連結すると、プラスミドＢＫ-７６-１-１が生成
した。

【００７０】プラスミドは、ＢioＲad装置を用い電気穿孔法によって大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ
３)細胞中に導入した。吸光度がＡ₅₇₈＝０.３となるまでＮＺＣＹＭ培地中３７
℃で菌株を成長させ、次いで１.０％まで乳糖を添加することにより４時間誘導
した。サンプルをＳＤＳ-ＰＡＧＥ溶解＋添加緩衝液で０.２ＯＤ/μlに調整し、
同量のタンパク質サンプルをＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上に充填した。種原液を調製
するために代表的クローンとしてクローンＢＫ-１１６-１-１を選択した。

【００７１】組換えＨＭＷタンパク質は、大腸菌中の封入体として発現し、同じ方法で精製
した(図１２)。５００ｍl培養液からの大腸菌細胞ペレットを、０.１ＭＮaＣl
を含むpＨ８.０の５０ｍＭＴris-ＨＣl５０ｍlに再懸濁し、超音波処理によっ
て破壊した。抽出物を２０,０００gで３０分間遠心分離し、得られる上澄みは捨
てた。０.５％Ｔriton Ｘ-１００および１０ｍＭＥＤＴＡを含むpＨ８.０の
５０ｍＭＴris-ＨＣl５０ｍl中でペレットをさらに抽出し、次いで２０,００
０gで３０分間遠心分離し、上澄みは捨てた。１％オクチルグルコシドを含むpＨ
８.０の５０ｍＭＴris-ＨＣl５０ｍl中でペレットをさらに抽出し、次いで２
０,０００gで３０分間遠心分離し、上澄みは捨てた。

【００７２】上記の抽出後に得られるペレットは、封入体を含む。６Ｍグアニジンおよび５
ｍＭＤＴＴを含むpＨ８.０の５０ｍＭＴris-ＨＣl６ｍl中でペレットを可溶
化した。pＨ８.０の５０ｍＭＴris-ＨＣl１２ｍlをこの溶液に加え、混合物を
２０,０００gで３０分間遠心分離した。上澄みを、最終濃度７％のポリエチレン
グリコール(ＰＥＧ)４０００で沈殿させた。２０,０００gで３０分間の遠心分離
により得られるペレットを除去し、５０％飽和の(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄により上澄みを
沈殿させた。(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄の添加後、溶液を相分離するとタンパク質は上層に
行き、次いで２０,０００gで３０分間遠心分離した。６ＭグアニジンＨＣlおよ
び５ｍＭＤＴＴを含むpＨ８.０の５０ｍＭＴris-ＨＣl２ｍlに得られたペレ
ットを溶かし、透明溶液を、２ＭグアニジンＨＣlを含むpＨ８.０の５０ｍＭ
Ｔris-ＨＣl中で平衡化したＳuperdex ２００ゲルろ過カラム上で精製した。Ｓ
ＤＳ-ＰＡＧＥによって分画を分析し、精製rＨＭＷ１を含む分画をプールしＰＢ
Ｓに対して４℃で一夜透析し、次いで２０,０００gで３０分間遠心分離した。こ
れらの条件下ではタンパク質は溶けたままであり、最終濃度２０％のグリセロー
ルをrＨＭＷ１調製物に加え-２０℃で保存した。

【００７３】 rＨＭＷワクチン成分の濃度をＰＢＳ(pＨ７.３)で４００μgｍl^-1に調整し、
リン酸アルミニウムでアジュバント化して最終濃度を３ｍgｍl^-1にした。原液を
ＰＢＳに溶かした３ｍgｍl^-1のリン酸アルミニウムで希釈することにより様々な
用量を調製した。 (実施例３) 本実施例は、rＨiaワクチン成分の調製について記載している。

【００７４】Ｈiaタンパク質の製造および精製は、前述の１９９９年３月１６日出願の同時
係属米国特許出願第０９/２６８,３４７号に記載されており、図１０に図示する
。

【００７５】簡単に言うと、ＮＴＨi菌株１１から染色体ＤＮＡを精製し、オリゴヌクレオ
チド(５０３８.ＳＬおよび５０３９.ＳＬ)(図１１)を用いて完全長hia遺伝子を
ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物には５’末端のＮdeI部位および３’末端のＢaｍＨ
I部位が含まれていた。この断片を、ＮdeI/ＢaｍＨIで切断されたプラスミドＤ
Ｓ-２００８-２-３(図１０)を産生するpＴ７-７発現ベクター(ref.２０)中にク
ローニングした。

【００７６】ＰＣＲプライマー(５５２６.ＳＬおよび５５２８.ＳＬ)(図１２)を用い、プラ
スミドＤＳ-２００８-２-３のＶ３８部位からＳty I部位まで切断型hia遺伝子
断片を増幅し、得られた断片をプラスミドpＣＲII(Invitrogen)中にＴＡクロー
ニングするとプラスミドＤＳ-２１５３-３-５が生成した。次いでこのプラスミ
ドをＮde IおよびＳty Iで切断し、ＤＳ-２００８-２-３から分離したＮde I
/Ｓty Iの５.７kbベクター断片に連結するとプラスミドＤＳ-２１８６-２-１が
生成した。

【００７７】Ｖ３８切断型hia遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２１８６-２-１をＢgl IIおよ
びＢaｍＨ Iで切断するとrＨia遺伝子が遊離する。この断片を分離し、ＢglII
で切断され、ＣＡＰ処理されたプラスミドＢＫ-２-１-２中にクローニングする
とプラスミドＢＫ９６-２-１１が生成した。このプラスミドは、カナマイシン耐
性マーカーおよび大腸菌cer遺伝子ならびに切断型Ｖ３８菌株１１hia遺伝子を所
有する。

【００７８】 rＨiaワクチン成分の濃度をＰＢＳ(pＨ７.３)で４００μgｍl^-1に調整し、リ
ン酸アルミニウムでアジュバント化して最終濃度を３ｍgｍl^-1にした。原液をＰ
ＢＳに溶かした３ｍgｍl^-1のリン酸アルミニウムで希釈することにより様々な用
量を調製した。 (実施例４) 本実施例は、三成分系ワクチンとしてのＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ＋rＨia
の組合せについて記載している。

【００７９】二成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷワクチンの調製は、前述の１９９８年
１２月１５日出願の同時係属米国特許出願第０９/２１０,９９５号に記載されて
いる。簡単に言うと、成分を０日目に混合し、４℃で一夜混ぜ、１日目に等分す
ることにより、Ｈ９１ＡＨin４７およびrＨＭＷの組合せからなるワクチンを
調製した。混合ワクチンは、免疫化期間を通し４℃で保存した。

【００８０】表IIに含まれるような以下のrＨiaと二成分系ワクチンとの組合せからなるワ
クチンを調製した。

【００８１】

【表４】

【００８２】ワクチン成分は０日目に混合し、４℃で一夜混ぜ、１日目に等分した。混合ワ
クチンは、免疫化期間を通し４℃で保存した。 (実施例５) 本実施例は、動物における多成分系ワクチンの免疫原性の分析について記載し
ている。

【００８３】Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを含む二成分系ワクチンの免疫原性は、前述の
１９９８年１２月１５日出願の同時係属米国特許出願第０９/２１０,９９５号に
記載されている。

【００８４】５匹のＢＡＬＢ/cマウス(Ｃharles Ｒiver、Ｑuebec)からなる群を、実施例
４に記載のマウスワクチンの１つで１、２９および４３日目に皮下(s.c.)で免疫
化した。血液サンプルは、０、１４、２８、４２および５６日目に採取した。

【００８５】５匹のＨartley非近交系モルモット(Ｃharles Ｒiver、Ｑuebec)からなる群
を、実施例４に記載のモルモットワクチンの１つで１、２９および４３日目に筋
肉内(i.ｍ.)で免疫化した。血液サンプルは、０、１４、２８、４２および５６
日目に採取した。

【００８６】抗Ｈ９１ＡＨin４７、抗rＨＭＷおよび抗rＨia IgＧ抗体価は、抗原特異的
酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬIＳＡ)により測定した。マイクロタイターウエル(
ＮuncＭＡＸIＳＯＲＢ、Ｎunc、Ｄeｍｍark)をタンパク質溶液(Ｈ９１ＡＨin
４７の場合０.４μgｍl^-1、rＨＭＷの場合０.４μgｍl^-1、またはrＨiaの場合０
.４μgｍl^-1)でコーティングした。用いる二次抗体は、西洋わさびペルオキシダ
ーゼ(Ｊackson IｍｍunoＲesearch Ｌabs、Ｍississauga、Ｏntario)に結合し
たヤギの抗マウスIgＧ(Ｆc特異的)または抗モルモットIgＧ(Ｆc特異的)のアフィ
ニティー精製Ｆ(ab’)₂断片とした。テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ/Ｈ２０２
、ＡＤI、Ｍississauga、Ｏntario)を用いて反応を展開し、ＦloｗＭultiskan
ＭＣＣマイクロプレートリーダー(IＣＮＢioｍedicals、Ｍississauga、Ｏn
tario)中４５０nｍ(対照波長として５４０nｍを用いる)で吸光度を測定した。抗
血清の反応価は、放血前の血清サンプルで得られた吸光度に対して２倍の吸光度
の増加を確実に示す希釈度の逆数と定義する。

【００８７】免疫原性試験の結果を図１から６に示す。図１に示すように、Ｈ９１ＡＨin
４７＋rＨＭＷそれぞれ０.３μgまたはＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ３
.０μgおよびrＨia０、０.３、１.０、３.０または１０μgで免疫化されたマウ
スから得られる最終放血血清はすべて、Ｈ９１ＡＨin４７に対して等しく高い
抗体価を有していた。これらのデータは、添加されたrＨiaによる抗Ｈ９１Ａ
Ｈin４７抗体価に対する相乗効果も妨害効果もないことを示している。

【００８８】図２、パネルＡに示すように、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ０.３μ
gおよびrＨia０、０.３、１.０、３.０または１０μgで免疫化されたマウスから
得られる最終放血血清の抗ＨＭＷ力価は、rＨiaの添加量が増加するとともに著
しく低下した。これらのデータは、低濃度のＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷでは
、rＨiaの添加に起因する抗ＨＭＷ抗体反応の抑制があることを示している。マ
ウスをＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ３μgおよびrＨia０、０.３、１.
０、３.０または１０μgで免疫化した場合には、影響は観察されず、最終放血血
清中に高い抗rＨＭＷ抗体価が得られた(図２、パネルＢ)。

【００８９】図３、パネルＡに示すように、rＨia０.３μgにＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ
それぞれ３.０μgを添加すると、４２日目に抗rＨia応答に対して一過性の抑制
作用があったが、５６日目までに消失した。しかしながら、図３、パネルＢから
Ｄに示すように、より高用量のrＨiaでは抑制作用は観察されなかった。

【００９０】図４に示すように、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ２５μgまたはＨ９
１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ５０μgおよびrＨia０、２５、５０または１
００μgで免疫化されたモルモットから得られる最終放血血清はすべて、高い抗
Ｈ９１ＡＨin４７抗体価を有していた。これらのデータは、３つの抗原の存在
下で抗Ｈ９１ＡＨin４７抗体反応に対する相乗的効果も抑制的効果もないこと
を示している。

【００９１】図５、パネルＡおよびＢに示すように、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞ
れ２５μgまたはＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ５０μgおよびrＨia０、
２５、５０または１００μgで免疫化されたモルモットから得られる最終放血血
清はすべて、高い抗rＨＭＷ抗体価を有していた。これらのデータは、３つの抗
原の存在下で抗rＨＭＷ抗体反応に対する相乗効果も抑制効果もないことを示し
ている。

【００９２】図６、パネルＡからＣに示すように、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを添加し
、または添加せずにrＨia２５、５０または１００μgで免疫化されたモルモット
から得られる最終放血血清はすべて、高い抗rＨia抗体価を有していた。しかし
ながら、３つの抗原すべてを含む追加免疫後に、僅かであるが統計学的な抗rＨi
a応答の阻害があった。 (実施例６) 本実施例は、疾患の動物モデルにおける多成分系ワクチンの防御能力について
記載している。

【００９３】若いチンチラでは、分類不能型インフルエンザ菌による鼻咽頭コロニー形成が
中耳炎につながることが明らかにされている(ref.１４)。同時係属米国特許出願
第０９/１６７,５６８号に記載のように、チンチラ鼻咽頭コロニー形成チャレン
ジモデルにおいてrＨＭＷは部分的に防御性がある。このモデルでは、このモデ
ルでは、ミョウバンに吸着させたrＨＭＷ２５、５０または１００μgで０、１４
および２８日目に筋肉内で動物を免疫化し、鼻腔内に送達された生菌１０⁸cfu(
鼻孔あたり５０μl)で４４日目にチャレンジする。

【００９４】洗浄液として滅菌食塩水１ｍlを用い、チャレンジ後４日間鼻咽頭洗浄を行う
。洗浄液２５μlをストレプトマイシン存在下でチョコレート寒天上にプレート
し、プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。(ストレプトマイシンに
よって殺される自然細菌叢の存在下での回収細菌の定量を容易にするために、連
続継代培養によってストレプトマイシン耐性のチャレンジ菌株を作成した)回復
期動物またはミョウバンのみで模擬免疫化した動物を対照として用いる。多成分
系ワクチン試験の場合には、実施例４に記載のようにrＨＭＷ、rＨiaおよびＨ９
１ＡＨin４７それぞれ５０μgを混ぜ、前述のようにチンチラを免疫化した。

【００９５】防御試験の結果を図７に示すが、rＨＭＷ＋rＨia＋Ｈ９１ＡＨin４７の組合
せによる鼻咽頭コロニー形成チャレンジモデルにおいても優れた防御が得られる
ことを示している。

【００９６】さらに、図１３に示すように、三成分系ワクチンは疱内チャレンジモデルで部
分的に防御性があった。このモデルについては以前に記載した(ref.１９)。若い
チンチラを、ミョウバンに吸着させた試験抗原それぞれ５０μgで０、１４およ
び２８日目に筋肉内で免疫化する。次いで、鼓室上胞を経由して中耳空間に送達
した生きた微生物３５０cfuで４４日目にチンチラをチャレンジする。次いで、
鼓膜聴力検査により動物をモニターし、チャレンジ後４日間中耳液を集め、ＢＨ
I培地２００μlと混ぜ、希釈液をチョコレート寒天プレート上にプレートし、３
７℃で２４時間インキュベートする。回復期動物またはミョウバンのみで模擬免
疫化した動物を対照として用いる。多成分系ワクチン試験の場合には、Ｈ９１Ａ
Ｈin４７、rＨＭＷおよびrＨiaそれぞれ５０μlを実施例４に記載のように混
ぜる。

【００９７】 (開示の概要) 本開示を要約すると、本発明は、広範囲の有効性を有し、インフルエンザ菌の
３つの異なる抗原を含み、その異なる抗原のうち２つがアドヘシンである多成分
系ワクチンを提供する。本発明の範囲内で変更形態が可能である。

【００９８】参考文献

【００９９】

【表５】

【０１００】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】棒グラフＡおよびＢを含み、マウスにおけるＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ＋r
Ｈia混合ワクチンの抗Ｈ９１ＡＨin４７免疫応答を示す図である。パネルＡ、
Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ０.３μgおよびrＨiaを増量。パネルＢ、
Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ３.０μgおよびrＨiaを増量。

【図２】棒グラフＡおよびＢを含み、マウスにおけるＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ＋r
Ｈia混合ワクチンの抗ＨＭＷ免疫応答を示す図である。パネルＡ、Ｈ９１ＡＨ
in４７＋rＨＭＷそれぞれ０.３μgおよびrＨiaを増量。パネルＢ、Ｈ９１ＡＨ
in４７＋rＨＭＷそれぞれ３.０μgおよびrＨiaを増量。アスタリスクは統計学的
有意を示す。

【図３】棒グラフＡ、Ｂ、ＣおよびＤを含み、マウスにおけるＨ９１ＡＨin４７＋r
ＨＭＷ＋rＨia混合ワクチンの抗Ｈia免疫応答を示す図である。パネルＡ、rＨia
０.３μgおよびＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを増量。パネルＢ、rＨia１.０μg
およびＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを増量。パネルＣ、rＨia３.０μgおよびＨ
９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを増量。パネルＤ、rＨia１０μgおよびＨ９１Ａ
Ｈin４７＋rＨＭＷを増量。アスタリスクは統計学的有意を示す。

【図４】棒グラフＡおよびＢを含み、モルモットにおけるＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭ
Ｗ＋rＨia混合ワクチンの抗Ｈ９１ＡＨin４７免疫応答を示す図である。パネ
ルＡ、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ２５μgおよびrＨiaを増量。パネ
ルＢ、Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ５０μgおよびrＨiaを増量。

【図５】棒グラフＡおよびＢを含み、モルモットにおけるＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭ
Ｗ＋rＨia混合ワクチンの抗ＨＭＷ免疫応答を示す図である。パネルＡ、Ｈ９１
ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ２５μgおよびrＨiaを増量。パネルＢ、Ｈ９１
ＡＨin４７＋rＨＭＷそれぞれ５０μgおよびrＨiaを増量。

【図６】棒グラフＡ、ＢおよびＣを含み、モルモットにおけるＨ９１ＡＨin４７＋r
ＨＭＷ＋rＨia混合ワクチンの抗Ｈia免疫応答を示す図である。パネルＡ、rＨia
２５μgおよびＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを増量。パネルＢ、rＨia５０μgお
よびＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを増量。パネルＣ、rＨia１００μgおよびＨ
９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを増量。アスタリスクは統計学的有意を示す。

【図７】鼻咽頭コロニー形成のチンチラモデルにおけるＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷ
＋rＨia混合ワクチンの防御を、１成分系すなわちＨＭＷワクチンおよび二成分
系rＨＭＷ＋Ｈ９１ＡＨin４７および回復期対照と比較して示す図である。

【図８】Ｈ９１Ｈin４７類縁体をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２１５０-
１を製造するための構築スキームを示す図である。

【図９】ＮＴＨi菌株１２に由来するhｍｗlＡＢＣ遺伝子群を含むプラスミドＢＫ-７６
-１-１を製造するための構築スキームを示す図である。

【図１０】ＮＴＨi菌株１１に由来するＮ-切断型Ｖ３８Ｈiaをコードする遺伝子を含む
プラスミドＢＫ-９６-２-１１を製造するための構築スキームを示す図である。

【図１１】菌株１１hia遺伝子をＰＣＲ増幅するために用いられるオリゴヌクレオチドを
示す図である。センス(５０３８.ＳＬ)、配列番号２、コード化されたアミノ酸
配列番号３；アンチセンス(５０３９.ＳＬ)、配列番号４、相補配列番号５、コ
ード化されたアミノ酸配列番号６。

【図１２】５’断片をＰＣＲ増幅して切断型遺伝子を製造するするために用いられるオリ
ゴヌクレオチドを示す図である。Ｖ３８切断:センス(５５２６.ＳＬ)、配列番号
７、コード化されたアミノ酸配列番号８；アンチセンス(５５２８.ＳＬ)、配列
番号９、相補配列番号１０、コード化されたアミノ酸配列番号１１。

【図１３】疱内チャレンジのチンチラモデルにおいてＨ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷrＨia
混合ワクチンによって得られる防御を示す図である。三成分系ワクチンによって
得られる防御を、一成分系Ｈ９１ＡＨin４７ワクチン、二成分系rＨＭＷおよ
びＨ９１ＡＨin４７ワクチンおよび回復期対照について得られる防御と比較す
る。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年２月２８日（２００１．２．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【表１】に示すそれぞれの分子量を有する、請求項１８に記載の組成物。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０００６】インフルエンザ菌による未変性ＨＭＷタンパク質の産生は極めて少なく、防御
的組換えＨＭＷ(rＨＭＷ)タンパク質の製造方法は、本出願と同じ譲受人に譲渡
され、その開示を参照により本明細書に組み込む１９９８年１０月７日出願の同
時係属米国特許出願第０９/１６７,５６８号(ＷＯ００/２０６０９)に記載され
ている。チンチラ鼻咽頭コロニー形成モデルが特にアドヘシンのワクチンとして
の有効性を明らかにするために開発され(ref.１４)、前述の同時係属米国特許出
願第０９/１６７,５６８号(ＷＯ００/２０６０９)に記載のようにこのrＨＭＷタ
ンパク質はこのモデルにおいて防御性がある。rＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａタ
ンパク質は、同等の防御を与えることが分かり、以後のワクチン研究にはrＨＭ
Ｗ１Ａタンパク質を選んだ。この出願では、rＨＭＷはＮＴＨi菌株１２に由来す
る組換えＨＭＷ１Ａタンパク質を指すが、他のＮＴＨi菌株に由来する対応する
組換えＨＭＷ１Ａタンパク質およびＮＴＨi菌株に由来する対応するrＨＭＷ２Ａ
タンパク質をrＨＭＷとして用いてもよい。対応する天然に存在するタンパク質
を用いてもよい。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００１０】本出願と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む１
９９９年３月１６日出願の米国特許出願第０９/２６８,３４７号(ＷＯ００/５５１９１) は、大腸菌における完全長およびＮ末端切断型Ｈiaタンパク質(rＨia)
の産生について記載している。これらの組換えタンパク質は、a型およびb型イン
フルエンザ菌に起因する菌血症を防御し、分類不能インフルエンザ菌による鼻咽
頭コロニー形成に対して部分的防御をもたらすことが明らかになった。この出願
では、rＨiaは、ＮＴＨi菌株１１に由来するＶ３８ rＨiaを意味するが、他の
ＮＴＨi菌株に由来する他の組換え完全長およびＮ末端切断型Ｈiaタンパク質を
用いてもよい。対応する天然に存在するタンパク質を用いてもよい。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３８】 (発明の一般的説明) 組換えインフルエンザ菌抗原rＨＭＷ、rＨiaおよびＨ９１ＡＨin４７の製造
および精製はそれぞれ、前述の米国特許出願第０９/１６７,５６８号(ＷＯ０
０/２０６０９)、第０９/２６８,３４７号(ＷＯ００/５５１９１)、および前
述の米国特許第５,５０６,１５９号に全て記載されている。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００４３】二成分系rＨＭＷ＋Ｈ９１ＡＨin４７ワクチンの調製、免疫原性および防御
性は、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込
む１９９８年１２月１５日出願の米国特許出願第０９/２１０,９９５号(ＷＯ
００/３５４７７)に記載されている。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００５８】エレクトロコンピテントＢＬ２１(ＤＥ３)細胞の一アリコートを氷上で解凍し
、ＤＳ-２１５０-１ＤＮＡ約９ngを加えた。サンプルを氷上で３分間インキュベ
ートし、−２０℃のＢioＲad(商標) Ｇene Ｐulser電極キュベットに移し、電
気パルスをかけた。ＳＯＣ培地９００μlを加え、混合物を培養管に移し、３７
℃で１時間インキュベートし、カナマイシン２５μg/ｍLを含むＹＴ寒天上にプ
レートした。プレートを３７℃で一夜インキュベートし、単一コロニーを発現試
験に使用した。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００６７】ＨＭＷタンパク質の製造および精製は、１９９８年１０月７日出願の同時係属
米国特許出願第０９/１６７,５６８号(ＷＯ００/２０６０９)に記載されてお
り、図９に図示する。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７１】組換えＨＭＷタンパク質は、大腸菌中の封入体として発現し、同じ方法で精製
した(図１２)。５００ｍl培養液からの大腸菌細胞ペレットを、０.１ＭＮaＣl
を含むpＨ８.０の５０ｍＭＴris-ＨＣl５０ｍlに再懸濁し、超音波処理によっ
て破壊した。抽出物を２０,０００gで３０分間遠心分離し、得られる上澄みは捨
てた。０.５％Ｔriton(商標) Ｘ-１００および１０ｍＭＥＤＴＡを含むpＨ８
.０の５０ｍＭＴris-ＨＣl５０ｍl中でペレットをさらに抽出し、次いで２０,
０００gで３０分間遠心分離し、上澄みは捨てた。１％オクチルグルコシドを含
むpＨ８.０の５０ｍＭＴris-ＨＣl５０ｍl中でペレットをさらに抽出し、次い
で２０,０００gで３０分間遠心分離し、上澄みは捨てた。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７３】Ｈiaタンパク質の製造および精製は、前述の１９９９年３月１６日出願の同時
係属米国特許出願第０９/２６８,３４７号(ＷＯ００/５５１９１)に記載され
ており、図１０に図示する。

【手続補正１０】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００７９】二成分系Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷワクチンの調製は、前述の１９９８年
１２月１５日出願の同時係属米国特許出願第０９/２１０,９９５号(ＷＯ００/ ３５４７７) に記載されている。簡単に言うと、成分を０日目に混合し、４℃で
一夜混ぜ、１日目に等分することにより、Ｈ９１ＡＨin４７およびrＨＭＷの
組合せからなるワクチンを調製した。混合ワクチンは、免疫化期間を通し４℃で
保存した。表IIに含まれるような以下のrＨiaと二成分系ワクチンとの組合せからなるワ
クチンを調製した。

【手続補正１１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００８３】Ｈ９１ＡＨin４７＋rＨＭＷを含む二成分系ワクチンの免疫原性は、前述の
１９９８年１２月１５日出願の同時係属米国特許出願第０９/２１０,９９５号(
ＷＯ００/３５４７７)に記載されている。

【手続補正１２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００８６】抗Ｈ９１ＡＨin４７、抗rＨＭＷおよび抗rＨia IgＧ抗体価は、抗原特異的
酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬIＳＡ)により測定した。マイクロタイターウエル(
ＮuncＭＡＸIＳＯＲＢ(商標)、Ｎunc、Ｄeｍｍark)をタンパク質溶液(Ｈ９１Ａ
Ｈin４７の場合０.４μgｍl^-1、rＨＭＷの場合０.４μgｍl^-1、またはrＨiaの
場合０.４μgｍl^-1)でコーティングした。用いる二次抗体は、西洋わさびペルオ
キシダーゼ(Ｊackson IｍｍunoＲesearch Ｌabs、Ｍississauga、Ｏntario)に
結合したヤギの抗マウスIgＧ(Ｆc特異的)または抗モルモットIgＧ(Ｆc特異的)の
アフィニティー精製Ｆ(ab’)₂断片とした。テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ/Ｈ
２０２、ＡＤI、Ｍississauga、Ｏntario)を用いて反応を展開し、ＦloｗＭul
tiskan ＭＣＣマイクロプレートリーダー(IＣＮＢioｍedicals、Ｍississaug
a、Ｏntario)中４５０nｍ(対照波長として５４０nｍを用いる)で吸光度を測定し
た。抗血清の反応価は、放血前の血清サンプルで得られた吸光度に対して２倍の
吸光度の増加を確実に示す希釈度の逆数と定義する。

【手続補正１３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００９３】若いチンチラでは、分類不能型インフルエンザ菌による鼻咽頭コロニー形成が
中耳炎につながることが明らかにされている(ref.１４)。同時係属米国特許出願
第０９/１６７,５６８号(ＷＯ００/２０６０９)に記載のように、チンチラ鼻
咽頭コロニー形成チャレンジモデルにおいてrＨＭＷは部分的に防御性がある。
このモデルでは、このモデルでは、ミョウバンに吸着させたrＨＭＷ２５、５０
または１００μgで０、１４および２８日目に筋肉内で動物を免疫化し、鼻腔内
に送達された生菌１０⁸cfu(鼻孔あたり５０μl)で４４日目にチャレンジする。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年９月３日（２００１．９．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【表１】に示すそれぞれの分子量を有することを特徴とする請求項１６または１７に記載
の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/39 Ａ６１Ｋ 39/39 Ａ６１Ｐ 11/04 Ａ６１Ｐ 11/04 25/28 25/28 27/16 27/16 31/04 31/04 31/12 31/12 31/16 31/16 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヤング、ヤン−ピングカナダ国エム２アール３エヌ７オンタリオ州ウィロウデイルトーレスデイルアヴェニュー 120 アパートメント 709 (72)発明者クレイン、マイケル、エイチ．カナダ国エム２ピー１ビー９オンタリオ州ウィロウデイルモンローブールヴァード 16 Ｆターム(参考） 4C085 AA03 AA04 AA05 BA51 BA53 BA82 CC21 CC24 DD86 EE01 EE03 EE06 FF01 FF02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】宿主においてインフルエンザ菌(ヘモフィルス・インフルエ
ンジー(Ｈaeｍophilus influenzae))に起因する疾患に対する防御をもたらすた
めの免疫原性組成物であって、インフルエンザ菌の少なくとも３つの異なる抗原を含み、異なる抗原のうち少
なくとも２つがアドヘシンである組成物。
【請求項２】アドヘシンである前記抗原のうち１つがインフルエンザ菌の
分類不能型菌株の高分子量(ＨＭＷ)タンパク質である、請求項１に記載の免疫原
性組成物。
【請求項３】前記ＨＭＷタンパク質が、インフルエンザ菌の分類不能型菌
株のＨＭＷ１またはＨＭＷ２タンパク質である、請求項２に記載の免疫原性組成
物。
【請求項４】アドヘシンである抗原のうち１つが、インフルエンザ菌の分
類不能型菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質またはインフルエ
ンザ菌の分類可能型菌株のインフルエンザ菌表面原線維(Ｈsf)タンパク質である
、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】アドヘシンではないインフルエンザ菌の抗原が、インフルエ
ンザ菌株の非タンパク質分解性熱ショックタンパク質である、請求項１に記載の
免疫原性組成物。
【請求項６】インフルエンザ菌株の非タンパク質分解性熱ショックタンパ
ク質が、天然Ｈin４７タンパク質の約１０％未満までプロテアーゼ活性が低下し
たインフルエンザ菌Ｈin４７タンパク質の類縁体である、請求項６に記載の免疫
原性組成物。
【請求項７】アドヘシンである前記抗原のうち１つが、インフルエンザ菌
の分類不能型菌株の高分子量(ＨＭＷ)タンパク質であり、アドヘシンである前記
抗原のうちもう１つが、インフルエンザ菌の分類不能型菌株のインフルエンザ菌
アドヘシン(Ｈia)タンパク質またはインフルエンザ菌の分類可能型菌株のインフ
ルエンザ菌表面原線維(Ｈsf)タンパク質である、請求項１に記載の免疫原性組成
物。
【請求項８】宿主においてインフルエンザ菌に起因する疾患に対する防御
をもたらすための免疫原性組成物であって、 (a)天然Ｈin４７タンパク質の約１０％未満までプロテアーゼ活性が低下した
インフルエンザ菌Ｈin４７タンパク質の類縁体、 (b)インフルエンザ菌の分類不能型菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)
タンパク質、および (c)インフルエンザ菌の分類不能型菌株の高分子量(ＨＭＷ)タンパク質を含む
組成物。
【請求項９】前記Ｈin４７、ＨiaおよびＨＭＷタンパク質が、タンパク質
の個々の免疫原性を損なわない量で存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】Ｈin４７タンパク質の前記類縁体が、プロテアーゼ活性に
寄与する天然Ｈin４７タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が欠失するか、異
なるアミノ酸で置換され、天然のＨin４７タンパク質とほぼ同等な免疫原性を有
する類縁体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】前記の少なくとも１つのアミノ酸が、天然Ｈin４７タンパ
ク質のアミノ酸９１、１２１および１９５〜２０１からなる群から選択される、
請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】セリン-１９７がアラニンで置換されている、請求項１１
に記載の組成物。
【請求項１３】ヒスチジン-９１がアラニン、リジンまたはアルギニンで
置換されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】ヒスチジン-９１がアラニンで置換されている、請求項１
３に記載の組成物。
【請求項１５】Ａsp-１２１がアラニンで置換されている、請求項１１に
記載の組成物。
【請求項１６】前記Ｈiaタンパク質が組換えで製造される、請求項９に記
載の組成物。
【請求項１７】前記組換え製造のＨiaタンパク質がＮ末端切断Ｖ３８rＨi
aである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】前記ＨＭＷタンパク質が、インフルエンザ菌の分類不能型
菌株のＨＭＷ１またはＨＭＷ２タンパク質である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１９】ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパク質が組換えで製造される
、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】前記ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパク質が分類不能型イン
フルエンザ菌のそれぞれの菌株に由来し、下表【表１】に示すそれぞれの分子量を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】さらにアジュバントを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項２２】前記アジュバントが水酸化アルミニウムまたはリン酸アル
ミニウムである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】 (a)Ｈin４７タンパク質類縁体約２５から約１００μg、 (b)Ｈiaタンパク質約２５から約１００μg、および (c)ＨＭＷタンパク質約２５から約１００μgを含む、請求項８に記載の組成物
。
【請求項２４】別の病原体に起因する感染症に対する防御をもたらすため
の少なくとも１つの追加抗原成分をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項２５】前記少なくとも１つの追加抗原成分が、ジフテリアトキソ
イド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、非毒性ポリオウイルスおよびＰＲ
Ｐ-Ｔからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項２６】前記百日咳抗原が、百日咳トキソイド、繊維状赤血球凝集
素、ペルタクチンおよび凝集原からなる群から選択される、請求項２５に記載の
組成物。
【請求項２７】中耳炎を含むインフルエンザ菌による感染に起因する疾患
に対して宿主を免疫化する方法であって、免疫有効量の請求項１または８に記載
の組成物を宿主に投与することを含む方法。