JP3654512B2 - 防御組換えｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）高分子量タンパク質をコードする核酸分子、形質転換ベクター、形質転換菌株ならびにそれらを用いたタンパク質の生産方法 - Google Patents
防御組換えｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）高分子量タンパク質をコードする核酸分子、形質転換ベクター、形質転換菌株ならびにそれらを用いたタンパク質の生産方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
(関連出願の参照)
本出願は、1998年10月７日に出願された出願第０９/１６７,５６８号の一部継続出願である。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は分子遺伝子学の分野に関し、詳細には、組換えＨaeｍophilus influenzae高分子量タンパク質の生産と、それに使用される核酸分子およびベクターに関する。
【０００３】
(発明の背景)
被包性Ｈaeｍophilus influenzae Ｂ型菌株は、細菌性髄膜炎およびその他の小児に生じる侵襲性感染の、主な原因である。しかし、非被包性の、または非分類型Ｈ.influenzae(ＮＴＨi)は、中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎、および気管気管支炎を含めた広い範囲にわたるヒトの病気の原因である。ジフテリアトキソイド(参考文献１ 本出願全体を通し、本発明が関係する現況技術をより十分に記述するために括弧内に示した種々の参考文献が参照される。各引例に関する全書誌情報を本明細書の終わりに示す。これらの参考文献の開示を、参照により本発明の開示に組み込む。)、破傷風トキソイド(参考文献２および米国特許第４,４９６,５３８号)、またはＮeisseria ｍeningitidis(髄膜炎菌)外膜タンパク質(参考文献３)に共有結合させたＨ.influenzae Ｂ型きょう膜多糖類をベースにしたワクチンは、Ｈ.influenzae Ｂ型により誘発された髄膜炎を軽くするのに効果的であったが、ＮＴＨi誘発型の病気には効果的ではなかった(参考文献４)。
【０００４】
中耳炎は幼児期の最も一般的な疾病であり、２才未満の子供全ての 60％から 70％が耳の感染症を１回から３回経験している(参考文献５)。慢性中耳炎は、子供の聴覚障害、言語障害、および認識障害の原因になる。急性中耳炎の症例の約30％、そして慢性中耳炎の約60％は、Ｈ.influenzae感染が原因である。米国だけで、中耳炎の治療には、抗生物質と外科的処置、例えば扁桃摘出やアデノイド切除、中耳腔換気用チューブの挿入などに、１年当たり 10億ドルから 20億ドルかかる。さらに、言語療法や特殊教育学級などの補助療法に、１年当たり 300億ドルが費やされると見積もられている。さらに、中耳炎を引き起こす生物体の多くは、抗生物質による治療に対して耐性を持つようになる。そのため中耳炎に有効な予防ワクチンが望まれている。
【０００５】
ＮＴＨiに自然感染している間、抗体反応を刺激する表面露出状態の外膜タンパク質は、殺菌性抗体および/または防御抗体の重要な標的となる可能性があり、したがってこのタンパク質はワクチンの候補になり得る。ＢarenkaｍpおよびＢodor(参考文献６)は、ＮＴＨiが原因で中耳炎に罹った子供の回復期血清が、高分子量(ＨＭＷ)のタンパク質に対する抗体を含有していることを実証した。ＮＴＨi菌株の約70％から 75％がＨＭＷタンパク質を発現し、これらの菌株のほとんどが、hｍｗ１ＡＢＣおよび hｍｗ２ＡＢＣと呼ばれる２種の遺伝子クラスタを含有している。hｍｗＡ遺伝子は構造ＨＭＷＡタンパク質をコードし、hｍｗＢ遺伝子および hｍｗＣ遺伝子は、ＨＭＷＡタンパク質のプロセッシングおよび分泌に関与する補助遺伝子である(参考文献７、８、９；米国特許第５,６０３,９３８号；ＷＯ９７/３６９１４)。ＨＭＷＡタンパク質は、ヒト上皮細胞への付着を仲介する付着因子であることが実証されており(参考文献 10)、適正にプロセッシングされたＨＭＷＡタンパク質のみが有効な付着因子になると考えられる(参考文献８)。天然のＨＭＷ１Ａタンパク質とＨＭＷ２Ａタンパク質の混合物で免疫化した結果、中耳炎のチンチラ胞内攻撃誘発モデルで防御が得られた(参考文献 11；ＷＯ９７/３６９１４)。ＮＴＨi菌株 12 からの原型 hｍｗ１Ａ遺伝子は、35kＤa のアミノ末端フラグメントの切断によって処理された 160kＤa のＨＭＷ１Ａタンパク質をコードし、成熟した 125kＤa のＨＭＷ１Ａタンパク質を発生させる。同様に、ＮＴＨi菌株 12hｍｗ２Ａ遺伝子は、ほぼ同一の 35kＤa のアミノ末端フラグメントを切断することによって処理された 155kＤa のＨＭＷ２Ａタンパク質をコードし、成熟した 120kＤa のＨＭＷ２Ａタンパク質を産生する。
【０００６】
プラスミド pＨＭＷ１-15(参考文献８)は、pＴ7-7 骨格を有し(参考文献 12)、５'-および３'-フランキング領域を有する完全なＮＴＨi菌株 12 hｍｗ1ＡＢＣオペロンを含有する。hｍｗ1Ａ構造遺伝子のＴ７プロモーターとその始まりの間に位置付けられた、約400bp の５'-フランキング配列がある。プラスミドpＨＭＷ２-21(参考文献 10)は、pＴ7-7 骨格を有し、５'-および３'-フランキング配列を有する完全なhｍｗ２ＡＢＣオペロンを含有する。hｍｗ２Ａ構造遺伝子のＴ７プロモーターとその始まりの間に位置付けられた、約800bp の５'-フランキング配列がある。rＨＭＷ1Ａタンパク質および rＨＭＷ２Ａタンパク質は、プラスミド pＨＭＷ１-15 およびプラスミドpＨＭＷ２-21 から比較的低い収量で産生される。
【０００７】
Ｈ.influenzae hｍｗ1 ＡＢＣ遺伝子または hｍｗ２ ＡＢＣ遺伝子に遺伝子操作を行って、35kＤaのリーダー配列をコードする配列を欠失させることにより、成熟組換えＨＭＡ1Ａタンパク質またはＨＭＷ２Ａタンパク質を産生することができるが、これは通常、Ｈ.influenzae でのプロセッシングによって除去されるものである。リーダー配列が欠失したので、Ｈ.influenzae で成熟ＨＭＷ1Ａ構造タンパク質および成熟ＨＭＷ２Ａ構造タンパク質のプロセッシングおよび分泌に役立つ hｍｗ1ＢＣ遺伝子または hｍｗ２ＢＣ遺伝子の必要が無くなる(参考文献９)。rＨＭＷ1Ａタンパク質または rＨＭＷ２Ａタンパク質の収量は、リーダー配列を欠失させ遺伝子をプロセッシングすることによって著しく増加させることができるが、精製された組換えタンパク質には防御能が無い。本明細書で述べるように、hｍｗ1ＢＣ遺伝子および hｍｗ２ＢＣ遺伝子またはそれらのタンパク質産物は、明らかに rＨＭＷ1Ａタンパク質および rＨＭＷ２Ａタンパク質の防御能に寄与する。通常なら余分な補助遺伝子に関するこのような要件は意外なことである。
【０００８】
Ｅ.coli cer 遺伝子は、多重化を防止することによってプラスミドを安定化すると考えられている(参考文献 13)。発現ベクターが多量に挿入された場合、cer 遺伝子を使用してプラスミドを安定化することができる。
【０００９】
(発明の概要)
本発明は、ある特定の核酸分子とそれを含有するベクターを提供することによって、防御能のある組換え非分類型Ｈ.influenzae 高分子量タンパク質を提供することを対象とする。
【００１０】
今回、防御能のある非分類型Ｈaeｍophilus の組換え高分子量(ＨＭＷ)タンパク質を得るために、成熟ＨＭＷタンパク質をコードするオペロンのＡ部分のセグメントのみ含有するベクター、すなわちリーダー配列をコードするＡ遺伝子のセグメントとオペロンのＢ部分およびＣ部分が欠けているベクターを提供することが必要であることがわかった。また、そのベクターに、成熟タンパク質、Ｅ.coli からの cer 遺伝子、またはこれらの両方をコードする少なくとも１つの追加のセグメントを含めることによって、成熟タンパク質の発現のレベルを高めることができることもわかった。
【００１１】
したがって本発明の一態様では、Ｅ.coli で機能性があり、かつＡ、Ｂ、およびＣ遺伝子を含む非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の修飾オペロンに作働するように結合されたプロモーターを含む核酸分子が提供されるが、このオペロンのＡ遺伝子は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の成熟高分子量タンパク質をコードする核酸配列のみを含有し、そのためリーダー配列をコードするＡ遺伝子の部分は存在しない。
【００１２】
任意の適切なプロモーターを使用して、Ｅ.coli に成熟ＨＭＷタンパク質を発現させることができる。しかし、Ｔ７プロモーターを使用することが好ましい。
【００１３】
コードされた成熟高分子量タンパク質は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株のＨＭＷ１タンパク質またはＨＭＷ２タンパク質でよい。この非分類型Ｈaeｍophilus菌株は、非分類型Ｈaeｍophilus influenzaeの菌株 12、Joyc、Ｋ21、ＬＣＤＣ２、ＰＭＨ１、および 15 からなる群から選択することができる。
【００１４】
また本発明は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の、対応するＨＭＷ１タンパク質およびＨＭＷ２タンパク質の推定アミノ酸配列と共に、予め単離されず、精製されず、発現していないある特定の非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株の hｍｗ1Ａおよび/またはhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列も提供する。
【００１５】
したがって、本発明の別の態様では、
(a)図18、19、20、21、22、23、24、25、26、および 27(配列番号: 25、27、29、32、33、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64)に示されるものからなる群から選択されたＤＮＡ配列またはそれらと相補的な配列、あるいは
(b)図18、19、20、21、22、23、24、25、26、および 27(配列番号: 26、28、30、32、34、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65)に示されるものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する高分子量タンパク質をコードするＤＮＡ配列、またはそれらと相補的な配列
を有する、非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株の高分子量(ＨＭＷ)タンパク質をコードする、単離され精製された核酸分子が提供される。
【００１６】
本発明の第１の態様の修飾オペロンは、配列(配列番号：27、31、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72)をコードする成熟タンパク質、または図 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、および 29 に示されるアミノ酸配列(配列番号： 28、32、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73)を有する成熟タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むことができる。
【００１７】
本発明の第１の態様により提供される核酸分子は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株のオペロンの成熟コード領域のみ、Ｅ.coli の cer 遺伝子、またはそのようなセグメントの両方の少なくとも１つの追加のコピーを含有する配列を、さらに含むことができる。
【００１８】
本発明の第１の態様により提供される核酸分子は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の成熟防御高分子タンパク質の発現を目的として、Ｅ.coli の形質転換を行うために、ベクター、通常はプラスミドベクターに組み込むことができる。
【００１９】
この成熟防御高分子タンパク質の発現を目的とするプラスミドベクターは、
ＤＳ-1046-1-1
JＢ-2507-7
ＢＫ-86-1-1
ＢＫ-35-4
ＢＫ-76-1-1
ＤＳ-2334-5
ＤＳ-2400-13
からなる群から選択されるプラスミドの識別形質を有することができる。
【００２０】
そのようなプラスミドの構造および調製の詳細を、図および実施例に示す。
【００２１】
本発明は、その別の態様において、本明細書で提供されるベクターにより形質転換され、かつ非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の防御高分子量タンパク質を発現するＥ.coli の菌株にまで範囲を広げる。本発明はさらに、形質転換されたＥ.coli によって産生可能な、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の単離され精製された組換え防御高分子量タンパク質、その免疫原性セグメント、またはその類似体を含む。
【００２２】
本発明はさらに、その追加の態様において、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の防御高分子量タンパク質を産生する組換え方法を含み、この方法は、
本発明の第１の態様で提供された核酸分子を含むベクターでＥ.coli を形質転換すること、
Ｅ.coli を成長させて、コードした成熟高分子量(ＨＭＷ)タンパク質を発現させること、および
発現したＨＭＷタンパク質を単離し精製することを含む。
【００２３】
非分類型Ｈaeｍophilus 菌株は前記菌株のいずれかでよく、高分子量タンパク質は、その他のタンパク質で汚染されていない形で提供されるＨＭＷ１タンパク質またはＨＭＷ２タンパク質でよい。精製ステップは、ＨＭＷ Ａタンパク質とＢタンパク質およびＣタンパク質との分離を含むことができる。
【００２４】
本発明は、その追加の態様において、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の単離され精製された防御ＨＭＷ１タンパク質であって、非分類型Ｈaeｍophilus の同じ菌株のＨＭＷ２タンパク質で汚染されていない防御ＨＭＷ１タンパク質を提供する。
【００２５】
さらに別の態様で、本発明は、非分類型Ｈaeｍophilus の単離され精製された防御ＨＭＷ２タンパク質であって、非分類型Ｈaeｍophilus の同じ菌株のＨＭＷ１タンパク質で汚染されていない防御ＨＭＷ２タンパク質を提供する。
【００２６】
ＨＭＷ１タンパク質またはＨＭＷ２タンパク質は、上述の非分類型Ｈaeｍophilus 菌株のいずれかからのものでよく、配列番号 28、32、37、41、45、49、53、57、61、65、69、または 73 を有するものでよい。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、本明細書で提供される少なくとも１種の核酸分子、本明細書で提供される少なくとも１種の組換えＨＭＷタンパク質、または本明細書で提供される少なくとも１種の新奇なＨＭＷタンパク質からなる群から選択された少なくとも１種の免疫学上活性な成分と、医薬品として許容されるこれらの担体を含む、免疫原性組成物が提供される。少なくとも１種の活性成分は、宿主に投与されると免疫応答を引き起こす。
【００２８】
本明細書で提供される免疫原性組成物は、Ｈ.influenzae によって引き起こされる病気を予防するため、宿主に in vivo 投与するためのワクチンとして処方することができる。このような目的で、組成物を、ミクロ粒子、ＩＳＣＯＭ、またはリポソーム製剤として処方することができる。免疫原性組成物は、免疫系の特定の細胞または粘膜表面に送達するための標的化分子と組み合わせて提供することができる。本発明の免疫原性組成物(ワクチンを含む)は、少なくとも１つのその他の免疫原性材料または免疫促進材料をさらに含むことができ、この免疫促進材料は、少なくとも１つのアジュバントまたは少なくとも１つのサイトカインでよい。
【００２９】
本発明で使用される適切なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ21、Ｑuil Ａ、これらの誘導体および成分、ＩＳＣＯＭマトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、グリコリピド類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミールジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ-chol、ＤＤＢＡ、およびリポタンパク質、およびその他のアジュバントが含まれる(しかしこれらに限定するものではない)。アジュバントの有利な組合せは、1994年６月16日出願の同時係属の米国特許出願第 08/261,194 号および 1995年６月７日出願の第 08/483,856 号に記載されているが、これは本出願の譲受人に譲渡されたものであり、その開示を参照により本明細書に組み込む(1995年11月21日に公表されたＷＯ 95/34308)。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、宿主に免疫応答を生じさせる方法であって、ヒトなどの罹患した宿主に有効な量の上記免疫原性組成物を投与するステップを含む方法が提供される。免疫応答は、体液性または細胞性の免疫応答でよく、Ｈaeｍophilus により引き起こされる病気の予防ができる。病気の予防が可能な宿主には、ヒトを含めた霊長類が含まれる。
【００３１】
ＨＭＷ１タンパク質およびＨＭＷ２タンパク質をコードするオペロンのＢ部分およびＣ部分の核酸配列は、非分類型Ｈaeｍophilus 種の核酸配列中に高レベルで保存されており、Ｅ.coli などの形質転換した宿主からＨＭＷ１ＡまたはＨＭＷ２Ａを発現させる目的で、非分類型Ｈaeｍophilusの様々な菌株からの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質またはＨＭＷ２Ａタンパク質をコードする核酸配列を受容するための万能プラスミドベクター上に提供できることがわかった。
【００３２】
したがって、本発明のさらに別の態様では、非分類型Ｈaeｍophilus菌株の高分子量タンパク質を発現させるためのプラスミドベクターであって、Ｔ７プロモーター、クローニング部位、非分類型Ｈaeｍophilus菌株のhｍｗオペロンのＢ部分およびＣ部分を含むベクターが提供される。プラスミドは、Ｅ.coli cer遺伝子を含有することもできる。プラスミドベクターは、プラスミドJＢ-2646-１でよい。
【００３３】
本発明によれば、その様々な態様において、非分類型Ｈaeｍophilus菌株に感染して引き起こされる病気の予防が可能な免疫原性組成物を提供するのに有用な、非分類型Ｈaeｍophilusの防御高分子量タンパク質の産生が可能になる。
【００３４】
本発明は、図面を参考とした次の記述によって更に理解されるであろう。
【００３５】
(発明の一般的な説明)
本発明の実施形態によって代表されるように、ＨＭＷ１Ａ、ＨＭＷ１Ｂ、ＨＭＷ１Ｃ、ＨＭＷ２Ａ、ＨＭＷ２ＢまたはＨＭＷ２Ｃタンパク質に対しコードする少なくとも一部分を含む、精製され、単離された核酸分子(ＤＮＡ分子の形態をしている)を得るために、hｍｗ遺伝子を有する任意のＨaeｍophilus菌株が好都合に使用される。このような菌株は、一般に臨床源およびＡｍerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionのような細菌培養収集機関から入手できる。非分類型Ｈaeｍophilusの適切な菌株は、
非分類型Ｈ.influenzae 12 菌株、
非分類型Ｈ.influenzae Joyc菌株、
非分類型Ｈ.influenzae Ｋ１菌株、
非分類型Ｈ.influenzae Ｋ21 菌株、
非分類型Ｈ.influenzae ＬＣＤＣ２菌株、
非分類型Ｈ.influenzae ＰＭＨ１菌株、または
非分類型Ｈ.influenzae 15 菌株
を含む。
【００３６】
この出願において、「ＨＭＷタンパク質」という用語は、非分類型Ｈaeｍophilusの様々な菌株に見出されるようなアミノ酸配列に自然発生した変異を有し、約100 から約150 までの見掛け分子量を特徴とするタンパク質を含む一群のＨＭＷタンパク質を定義するために使用される。
【００３７】
以下の実施例と共に、本発明の原理を説明するために有用な、本発明の現時点で好ましい実施形態をこれから詳述する。本発明の詳細な説明を以下の節に分けて行うが、その目的は開示を明確にするためであって、限定するためではない。
【００３８】
1.Ｅ.coliからの組換えＨＭＷタンパク質の改良生産
Ｈ.influenzae中での生来のＨＭＷ１ＡまたはＨＭＷ２Ａタンパク質の産生は非常に少ない。プラスミドpＨＭＷ１-15 およびpＨＭＷ２-21(参考文献８、10)は、ＮＴＨi 12 菌株から得られ、発現ベクターpＴ７-７中にクローン化された完全なhｍｗ１ＡＢＣおよびhｍｗ２ＡＢＣオペロンを含んでいる。これらのプラスミドからの組換えrＨＭＷ１ＡまたはrＨＭＷ２Ａタンパク質の生産は、恐らくＴ７プロモーターとhｍｗＡ遺伝子の開始コドンとの間に挿入された５'-フランキング配列およびhｍｗプロモーター配列のために、少ない。５'-フランキング配列およびhｍｗプロモーター配列の除去によって、プラスミドＤＳ-1091-２およびＤＳ-1094-２(図１および２)から生産されるrＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａタンパク質の収量はわずかに改善された。
【００３９】
Ｈ.influenzae中で生産されるとき、生来のＨＭＷＡタンパク質は、35 kＤaのＮ末端断片が除かれてプロセッシングされ、分泌される。Ｅ.coliによるrＨＭＷＡタンパク質の正しいプロセッシングと分泌に頼るのではなく、Ｎ末端 35 kＤa断片をコード化する遺伝子配列がhｍｗ１ＡＢＣおよびhｍｗ２ＡＢＣの各遺伝子から遺伝学的に除去された。生成した新しい構築体、ＤＳ-1046-１-１およびＤＳ-1174-４(図３および４)においては、rＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａ成熟タンパク質の生産が促進された。rＨＭＷ ＢＣタンパク質も過剰に生産された。pＴ７-７ベクター中へのhｍｗ１ＡＢＣおよびhｍｗ２ＡＢＣ遺伝子挿入体は、依然として各々約 8.6 kbと約 8.3 kbであった。ＨＭＷＡタンパク質は構造タンパク質であり、防御タンパク質であるので、hｍｗＢＣ遺伝子の一部または全部を削除することによって、その遺伝子挿入体の大きさを減らすことができると考えられた。一般により小さな挿入体を有する発現ベクターは、組換えタンパク質を生産する上でより効果的であり、rＨＭＷＢＣタンパク質の過剰生産は望ましくないと考えられた。
【００４０】
ベクターＤＳ-1200-３、ＤＳ-1122-２、JＢ-2330-７およびＤＳ-2084-３(図４、５、６および８)において、hｍｗＢＣ遺伝子を削除したとき、rＨＭＷＡタンパク質の生産はわずかに改善された。しかし、rＨＭＷＢとrＨＭＷＣのタンパク質の生産が除かれ、タンパク質精製プロセスが簡潔になった。ベクターJＢ-2369-６およびＤＳ-2084-１(図７および８)からrＨＭＷＡタンパク質を発現させるために、Ｔ７ hｍｗＡ遺伝子カセットのタンデムコピーを用いたとき、その生産はわずかに改善された。
【００４１】
この系列の発現ベクターの構築によって、Ｅ.coliからrＨＭＷ１およびrＨＭＷ２タンパク質の生産を増加させることができることが判明した。しかし、鼻咽腔コロニー形成防御モデルで試験したとき、改良したベクターから生産されたrＨＭＷＡタンパク質は防御性を示さなかった。生来のＨＭＷ１Ａ＋ＨＭＷ２Ａタンパク質混合物、または完全なhｍｗＡＢＣ遺伝子を含む比較的低収量のベクターから生産されたrＨＭＷＡタンパク質だけが防御性を示した。
【００４２】
2.組換え防御性ＨＭＷタンパク質を生産するための発現ベクターの修飾
完全な長さのＨＭＷ１Ａ(ＤＳ-1091-２)またはＨＭＷ２Ａ(ＤＳ-1094-２)のタンパク質をコード化するhｍｗＡＢＣ遺伝子を含み、そのプロセッシングをＥ.coliに依存する発現ベクターは、動物モデルで試験するのに十分なタンパク質を生産しなかった。成熟ＨＭＷ１Ａ(ＤＳ-1046-１-１)またはＨＭＷ２Ａ(ＤＳ-1174-４)タンパク質をコード化するhｍｗＡＢＣ遺伝子を含む発現ベクターは、中位の収量で防御性rＨＭＷＡタンパク質を発現した。rＨＭＷＡタンパク質だけを過剰に生産したベクターは、防御性抗原を産生しなかった。
【００４３】
防御性rＨＭＷＡタンパク質の収量を高めるために、２通りの手法を試みた。成熟rＨＭＷ１Ａタンパク質を発現するＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを含むベクターに、Ｅ.coli cer 遺伝子を導入した。cer遺伝子は多重化の防止によってプラスミドを安定化させると考えられ、その存在は大きなhｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを含む発現ベクターを安定化することができる。cer 遺伝子の存在は、組換えタンパク質の生産も増加させることがあることも判明した。Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer構築体(図10)から過剰生産されたrＨＭＷ１Ａ抗原は、鼻咽腔コロニー形成モデルで防御性を示した(表２)。
【００４４】
防御性rＨＭＷＡタンパク質を過剰生産する第２の手法は、rＨＭＷＢＣタンパク質の存在下でrＨＭＷＡタンパク質を過剰生産するベクターを構築することであった。成熟rＨＭＷ１Ａタンパク質を発現するＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを含むベクターに、追加のＴ７ hｍｗＡ遺伝子カセットを追加した。Ｔ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ構築体(図９)から過剰生産されたrＨＭＷ１Ａ抗原は、鼻咽腔コロニー形成モデルで防御性を示した(表２)。
【００４５】
Ｔ７ hｍｗＡ/Ｔ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子のタンデムコピーを同一プラスミドＤＳ-2400-13 上のＥ.coli cer 遺伝子と同時発現するように、前記２手法を組み合せることができる(図34)。
【００４６】
3.追加hｍｗＡ遺伝子のクローニングおよび配列分析
hｍｗＡ遺伝子およびコード化タンパク質の配列は可変である。完全に有効なワクチンを生産するためには、非分類型Ｈaeｍophilusの多種の菌株から創られるrＨＭＷＡタンパク質を使用することが必要である。非分類型Ｈaeｍophilus influenzaeの数菌株から得たhｍｗ１Ａおよび/またはhｍｗ２Ａ遺伝子をＰＣＲ増幅し、かつその配列を決定した。図18 から 26 は、各々Joyc菌株からのhｍｗ１Ａ遺伝子、Joyc菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子、Ｋ１菌株からの欠陥hｍｗ１Ａ遺伝子、Ｋ21 菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子、ＬＣＤＣ２菌株からのhｍｗ１Ａ遺伝子、ＬＣＤＣ２菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子、ＰＭＨ１菌株からのhｍｗ１Ａ遺伝子、ＰＭＨ１菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子、15 菌株からのhｍｗ１Ａ遺伝子および 15 菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子に対するヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。推定タンパク質配列を前記の 12 菌株ＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質配列(図 28 および 29)と並べると、配列の保存および分岐の両領域が認識される(図 30)。このような情報は、ワクチン接種や診断の目的でペプチドを創るために、エピト―プとなり得るものの確認に有用である。様々な非分類型Ｈaeｍophilus菌株から得られる成熟ＨＭＷタンパク質の分子量を表３に含めている。
【００４７】
4.組換え防御性ＨＭＷタンパク質を生産するための属共通発現ベクターの構築
非分類型Ｈaeｍophilus菌株から新しいhｍｗＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、上記のように配列決定することができる。しかし、防御性rＨＭＷＡ抗原を生産するためには、hｍｗＡ遺伝子をhｍｗＢＣ遺伝子の存在下で発現しなければならない。原型 12 菌株から得られる付属ＨＭＷ１ＢおよびＨＭＷ２Ｂタンパク質の推定配列は、99 ％同一であることが判明し、一方同一菌株から得られるＨＭＷ１ＣおよびＨＭＷ２Ｃタンパク質の推定配列は 96 ％同一であった(参考文献８、米国特許第 5603938 号)。hｍｗＢＣ遺伝子の高い保存性から、ある原型菌株から得られるhｍｗＢＣ遺伝子を用いて属共通の発現ベクターを構築し、そのベクター中に発現させるために、任意のhｍｗＡ遺伝子をそのベクターに導入することが可能となる。図 32 は、Ｔ７プロモーター、hｍｗＡ遺伝子導入のためのＸba Iクローニング部位、12 菌株hｍｗ１ＢＣ遺伝子、およびＥ.coli cer遺伝子を含有する属共通発現ベクター(JＢ-2646-１)の構築を図示する。図 33 は、属共通発現ベクター中でのキメラＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットの構築を図示し、そこではＰＣＲ増幅ＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子が 12 菌株hｍｗ１ＢＣ遺伝子と組み合されることによりプラスミドＤＳ-2334-５を生成する。キメラ構築体からの遺伝子の発現は、ＮＴＨi 12 菌株のhｍｗ１Ａおよびhｍｗ２Ａ遺伝子に基くＴ７ hｍｗ１ＡＢＣまたはＴ７ hｍｗ２ＡＢＣ構築体に対して見た場合と同様であった。
【００４８】
本発明の様々な実施形態がワクチン接種、診断、Ｈaeｍophilus感染の処置および免疫剤の創製の各分野での応用に使用できることは、当分野の技術者に明白である。このような用途に関する更なる非限定的な考察を以下に提示する。
【００４９】
5.ワクチンの調製および使用
ワクチンとして使用するのに適当な免疫原性組成物は、非分類型Ｈaeｍophilus菌株の免疫原性高分子量(ＨＭＷ)タンパク質、その免疫原性類縁体および断片、および/または本明細書に開示したような免疫原性ペプチドから調製される。そのワクチンは、抗ＨＭＷ抗体およびオプソニン作用または殺菌作用を示す抗体を含む抗体を産生する免疫反応を引起す。ワクチンを含め、免疫原性組成物は注入剤、即ち液体溶液または乳濁液として調製され得る。ＨＭＷタンパク質、その免疫原性類縁体および断片、および/または免疫原性ペプチドを、ＨＭＷタンパク質、その免疫原性断片、類縁体または免疫原性ペプチドと適合性のある製剤上許容可能な賦形剤と混合してもよい。このような賦形剤は水、塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよびその組合せを含む。免疫原性組成物およびワクチンは、さらに湿潤剤または乳化剤、pＨ緩衝剤、ワクチンの有効性を高めるためのアジュバント等の補助物質を含有してもよい。免疫原性組成物およびワクチンは、非経口的に、即ち皮下注射または筋肉内注射によって投与される。あるいは、本発明に従って形成される免疫原性組成物は、粘膜表面の免疫反応を引起すように製剤され、送達されてもよい。したがって、免疫原性組成物を、例えば鼻腔または経口(胃内)ルートによって粘膜表面に投与してもよい。免疫系の特定の細胞または粘膜表面に送達するために、免疫原性組成物を標的指向性分子と併用してもよい。このような幾つかの標的指向性分子は、ビタミンＢ 12、ＷＯ 92/17167(Ｂiotech Ａustralia Ｐty.Ｌtd.)に記載されているような細菌毒素の断片、および米国特許第 5194254 号(Ｂarber等)に記載されているようなモノクローナル抗体を含む。あるいは、坐薬や経口製剤を含む他の投与方式が好ましいかもしれない。坐薬に対しては、結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む。経口製剤は、例えば製剤用のサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の普通に使用される賦形剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続性放出製剤または粉末の形態を採り、約１から 95 ％のＨＭＷタンパク質、断片、類縁体および/またはペプチドを含有する。
【００５０】
ワクチンは調剤処方に適合した方式で、かつ治療上有効で、防御性で免疫原性を示すような量を投与される。投与すべき量は、例えば抗体を合成し、必要であれば細胞性免疫反応を起こすその個人の免疫系の能力を含め、治療される対象者に依存する。必要とされる活性成分の精確な投与量は、担当開業医の判断次第である。しかし、適当な投与量範囲は当分野の技術者によって容易に決定することができ、高分子量タンパク質、その類縁体および断片、および/またはペプチドの数マイクログラムの位数である。初回投与および追加投与に対する適当な投与計画も変動し得るが、初回投与とその後の投与を含み得る。ワクチンの投与量は投与ルートにも依存し、宿主の大きさに従って変化する。
【００５１】
非分類型ＨaeｍophilusのＨＭＷタンパク質をコード化する核酸分子も、ＤＮＡの直接投与、例えば遺伝学的免疫形成のために注射するか、またはサルモネラ、ＢＣＧ、アデノウィルス、ポックスウィルス、ワクシニアまたはポリオウィルス等のその核酸分子を含有した生体ベクターを構築することによって、免疫形成のために直接使用されてもよい。免疫系に異種抗原を運ぶために使用されてきた幾つかの生体ベクターに関する考察は、例えばＯ'Ｈagan(1992 年)(参考文献 17)の中に含まれている。遺伝学的免疫形成のために被験対象中にＤＮＡを直接注射する方法が、例えばＵlｍer等、1993 年(参考文献 18)の中に記載されている。
【００５２】
リン酸緩衝塩水中 0.05 から 1.0 パーセント溶液として普通使用するアジュバントと共に、抗原を同時投与した場合、免疫原性をかなり改善することができる。アジュバントは抗原の免疫原性を高めるが、それ自体は必ずしも免疫原性を示さない。アジュバントは、貯蔵効果を生むために投与部位近傍に抗原を局在させることによって作用し、免疫系の細胞に対する抗原の遅い持続的な放出を促進する。アジュバントは抗原貯蔵部に免疫系の細胞を引寄せ、免疫反応を引起すようにこのような細胞を刺激することもできる。
【００５３】
例えばワクチンに対する宿主免疫反応を改善するために、免疫刺激剤即ちアジュバントが長年にわたり使用されてきた。リポ多糖類のような内在性アジュバントは、通常ワクチンとして用いられる死滅または弱体化細菌の成分である。外来性アジュバントは、抗原に普通は非共有結合で結合され、宿主免疫反応を高めるように処方された免疫調節剤である。したがって、非経口的に送達された抗原に対する免疫反応を高めるアジュバントが確認された。しかし、これらのアジュバントの一部は有毒であり、望ましくない副作用を引起すことができ、ヒトや多くの動物に使用するには不適当である。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム(普通アラムと総称される)だけしか、ヒトや動物のワクチン中のアジュバントとして日常的に使用されていない。ジフテリアおよび破傷風のトキソイドに対する抗体反応を増加させる上で、アラムの有効性が十分に確立されている。
【００５４】
広範囲の外来性アジュバントが、抗原に対する効力のある免疫反応を引起すことができる。これらのアジュバントは、膜タンパク質抗原と複合したサポニン(免疫刺激複合体)、鉱油を含んだpluronicポリマー、殺菌マイコバクテリアと鉱油、完全フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド(ＭＤＰ)やリポ多糖(ＬＰＳ)およびリピッドＡのような細菌生成物、およびリポソ―ムを含む。
【００５５】
体液性免疫反応(ＨIＲ)および細胞性免疫(ＣＭI)を効果的に誘発するためには、免疫原をアジュバント中に乳化する。多くのアジュバントは有毒で、肉芽腫、急性および慢性の炎症(完全フロイントアジュバント、ＦＣＡ)、細胞溶解(サポニンおよびpluronicポリマー)および発熱性、関節炎および前部ブドウ膜炎(ＬＰＳおよびＭＤＰ)を誘発する。ＦＣＡは優れたアジュバントで研究では広く使用されているが、毒性のためにヒトや動物のワクチンに使用することは認可されていない。
【００５６】
理想的なアジュバントの望ましい特性は、
(１)毒性がないこと、
(２)長期に持続する免疫反応を刺激することができること、
(３)製造の簡潔さと長期保存時の安定性、
(４)必要ならば、様々なルートで投与される抗原に対して細胞性免疫も体液性免疫反応も引起すことができること、
(５)他のアジュバントとの相助作用、
(６)抗原提示細胞(ＡＰＣ)の集団と選択的に相互作用をすることができること、
(７)適当なＴH１またはＴH２細胞特異的免疫反応を特異的に引起すことができること、および
(８)抗原に対する適当な抗体イソタイプレベル(例えばIgＡ)を選択的に増加させることができることを含む。
【００５７】
1989年８月８日にＬockhoff等に与えられ、参考のために本明細書に挿入されている米国特許第 4855283 号は、免疫調節剤またはアジュバントとして、その各々が糖残基においてアミノ酸で置換されているＮ-グリコシルアミド、Ｎ-グリコシルウレアおよびＮ-グリコシルカルバメートを含む糖脂質類縁体を教示している。したがって、Ｌockhoff等 1991 年(参考文献 19)は、スフィンゴ糖脂質やグリセロ糖脂質のような天然糖脂質に構造の類似したＮ-糖脂質類縁体が、単純疱疹ウィルスワクチンにも仮性狂犬病ウィルスワクチンにも強い免疫反応を引起すことができることを報告した。天然の脂質残基の機能を模倣するために、幾つかの糖脂質が長鎖アルキルアミンおよびアノマー炭素原子を介して糖と直接連結した脂肪酸から合成されてきた。
【００５８】
Ｍoloneyに与えられ、本発明の譲受人に譲渡され、参考のために本明細書に挿入されている米国特許第 4258029 号は、破傷風トキソイドやホルマリン不活化I、IIおよびIII型ポリオウィルスワクチンと複合したとき、オクタデシルチロシン塩酸塩(ＯＴＨ)がアジュバントとして機能することを教示している。また、Ｎixon-Ｇeorge等,1990年(参考文献 20)は、組換えＢ型肝炎表面抗原と複合した芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ型肝炎ウィルスに対し宿主免疫反応を高めると報告した。
【００５９】
6.免疫検定
本発明の、非分類型Ｈaeｍophilusの菌株のＨＭＷタンパク質、その類縁体および断片、および/またはペプチドは、免疫原として、酵素結合イムノソルベント検定(ＥＬＩＳＡ)、ＲIＡおよび他の非酵素結合抗体結合検定を含む免疫検定、または抗菌性ＨaeｍophilusＨＭＷタンパク質および/またはペプチド抗体を検出するための当分野で公知の手順における抗原として有用である。ＥＬＩＳＡ検定では、ＨＭＷタンパク質、類縁体、断片、および/またはＨＭＷタンパク質の部分に対応するペプチドが、選択された表面、例えばポリスチレンミクロタイタープレートのウェルのような、タンパク質やペプチドを結合することのできる表面の上に固定化される。吸着の不完全なＨＭＷタンパク質、類縁体、断片、および/またはペプチドを除去するために洗浄した後、試験試料に対して抗原として中性であることが知られているウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)やカゼインの溶液のような非特異的タンパク質が、その選択表面に結合される。これによって固定化表面上の非特異的吸着部位が封鎖され、したがつて抗血清の表面への非特異的結合によつて起こるバックグランドが低下する。
【００６０】
次いで、免疫複合体(抗原/抗体)の形成に資するように、固定化表面を臨床物質や生物物質のような試験試料と接触させる。この操作には、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン(ＢＧＧ)および/またはリン酸緩衝塩水(ＰＢＳ)/Ｔｗeenのような希釈剤で試料を希釈することが含まれる。次に、約 25 ℃から約 37 ℃のオーダーのような温度で、約２時間から約４時間、試料をインキュベートする。インキュベーションの後、非免疫複合体物質を除去するために、試料接触表面を洗浄する。この洗浄操作は、ＰＢＳ/Ｔｗeenやホウ酸緩衝液のような溶液で洗浄することを含む。
【００６１】
試験試料および結合したＨＭＷタンパク質、類縁体、断片、および/またはペプチドとの特異的免疫複合体を形成し、次に洗浄した後、免疫複合体を第１抗体に対する特異性を有する第２の抗体に曝すことによって、免疫複合体形成の発生および発生量をも決定し得る。試験試料がヒト由来のものである場合、第２抗体はヒト免疫グロブリンに対する特異性を有する抗体であて、一般にIgＧである。検出手段を提供するために、第２抗体は、例えば適当な発色性物質とインキュベートしたときに発色を起こす酵素活性のような関連する活性を有する。次いで、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて発色度を測定することによって、定量化が実現される。
【００６２】
7.ハイブリダイゼーションプローブとしての配列の使用
hｍｗ遺伝子の新たに単離し、特定した配列を含む本発明のヌクレオチド配列は、Ｈaeｍophilusの他の非分類型菌株から得られるhｍｗ遺伝子の同定およびクローニングを可能にする。
【００６３】
本発明のhｍｗ遺伝子の配列を含むヌクレオチド配列は、他のhｍｗ遺伝子の相補性鎖と２本鎖分子を選択的に形成することができるために有用である。用途により、他のhｍｗ遺伝子に対するプローブの様々な程度の選択性を実現するために、多様なハイブリダイゼーション条件が使用される。高度の選択性のためには、約 50℃から 70℃の間の温度で 0.02Ｍから 0.15ＭのＮaＣlで実現されるような、低塩および/または高温の条件のような比較的厳しい条件が、２本鎖を形成するために使用される。幾つかの用途に対しては、20℃から 55℃の間にわたる温度で 0.15Ｍから 0.9Ｍの塩のような厳しさのもっと小さいハイブリダイゼーション条件でよい。ハイブリッド２本鎖を不安定化するために、ホルマミドの添加量を増やすことによっても、ハイブリダイゼーション条件をより厳しくすることができる。したがって、特定のハイブリダイゼーション条件を容易に扱うことができ、選択される方法は一般に望ましい結果に依存することになろう。一般に、50％ホルマミドと 0.15ＭのＮaＣlの存在下で好都合なハイブリダイゼーション温度は、標的核酸断片との相同性が約95 から 100％であるhｍｗ遺伝子に対しては 42℃で、約90 から 95％の相同性に対して 37℃で、約85 から 90％の相同性に対して 32℃である。
【００６４】
臨床診断の実施形態では、ハイブリダイゼーションを決定するために、本発明のhｍｗ遺伝子の核酸配列は、標識のような適当な手段と組合せて使用される。放射性リガンド、酵素性リガンド、または検出可能なシグナルを提供することのできるアビジン/ビオチンのような他のリガンドを含め、多様な適切な標識手段が当分野で知られている。幾つかの診断実施形態では、ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素タグが、放射性タグの代わりに使用される。酵素タグの場合、hｍｗ遺伝子配列を含む試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するために、ヒトの肉眼に見える手段を提供するために使用するか、または分光光度計によって使用することのできる比色定量用指示薬基質が知られている。
【００６５】
本発明のhｍｗ遺伝子の核酸配列は、溶液ハイブリダイゼーションおよび固相操作を用いる実施形態におけるハイブリダイゼーションプローブとして有用である。固相操作を伴う実施形態では、浸出液、体液(例えば、血清、羊水、中耳溢出液、唾液、気管支肺胞洗浄液)または組織までも含む臨床試料のような試料から得られる試験ＤＮＡ(またはＲＮＡ)が、選択されたマトリックスまたは表面に吸着されるか、そうでない場合は付着される。次いで、固定された単鎖核酸は、望ましい条件下で、本発明のhｍｗ遺伝子またはその断片の核酸配列を含む選択されたプローブとの特異的なハイブリダイゼーションを受ける。選択される条件は、例えばＧ＋Ｃ含量、標的核酸の型、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさ等に依存して必要とされる特定の規準に基く特定の状況に依存するであろう。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためにハイブリダイゼーション表面を洗浄した後、標識によって特異的ハイブリダイゼーションが検出されるか、または定量化さえもなされる。Ｈaeｍophilus 種の中に保存されている核酸配列部分を選択することが好ましい。選択されるプローブは長さが少なくとも 18 bpであり、長さが 30 bpから 90 bpの範囲に入る。
【００６６】
8.高分子量タンパク質遺伝子の発現
宿主細胞との適合性を示す種から誘導されるレプリコン配列および制御配列を含んだプラスミドベクターは、発現系で高分子量タンパク質遺伝子を発現するために使用される。ベクターは普通、形質転換細胞中に表現型の選択をもたらすことのできる標識配列だけでなく、複製部位をも担持する。例えばＥ.coliは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含むpＢＲ 322 を用いて形質転換され、したがって形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。このpＢＲ 322 プラスミド、または他の微生物プラスミド、またはファージは、自己のタンパク質を発現するために、宿主細胞が使用することのできるプロモーターも含んでいるか、または含むように修飾されねばならない。
【００６７】
その上、宿主との適合性を示すレプリコン配列および制御配列を含んだファージベクターを、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして使用することができる。例えばλ ＧＥＭTM-11 中のファージを、Ｅ.coli ＬＥ 392 のような宿主細胞を形質転換するために使用することのできる組換えファージベクターを作る際に、利用することができる。
【００６８】
組換えＤＮＡの構築に普通使用されるプロモーターは、β-ラクタマ―ゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーター系、および本明細書の好ましい実施形態(米国特許第 4952496 号)で使用されるＴ７プロモーター系のような他の微生物プロモーターを含んでいる。プロモーターのヌクレオチド配列に関する詳細が公知であり、したがつて技術者はプロモーターを機能的に遺伝子と連結することができる。使用される特定のプロモーターは、一般に望ましい結果に依存する選択の問題であろう。ＨＭＷタンパク質および免疫学的断片またはその類縁体の発現に適当な宿主は、Ｅ.coli、Ｂordetella種、Ｂacillus種、Ｈaeｍophilus、かび、酵母を含み、あるいはバキュロウィルス発現系が使用されてもよい。Ｅ.coliが本発明で使用される好ましい宿主である。
【００６９】
特に、Ｈaeｍophilus種の培養物から精製されるような天然ＨＭＷタンパク質が痕跡量の毒性物質や他の汚染物質を含んでいるとき、本発明に従って組換え法によりＨＭＷタンパク質を生産することが好ましい。特に本明細書に記載の構築体を用いて、精製物質中の汚染物質を最小限に抑えるように、宿主から単離することのできる組換え生産ＨＭＷタンパク質を異種系中で使用することによって、この問題を回避することができる。その上、組換え生産法によって、ＨＭＷ１またはＨＭＷ２、または免疫原性断片およびその類縁体を、Ｈaeｍophilus菌株中に存在する普通の組み合わさったタンパク質と異なり、別々に、かつ高純度に生産することができる。
【００７０】
生物学的寄託物
本明細書に記載し、言及した非分類型Ｈaeｍophilusの菌株の高分子量タンパク質に対する核酸コーディングを含む一定のベクターを、ブダペスト条約に従いこの出願前に、10801 Ｕniversity Ｂoulevard，Ｍanassas，Ｖirginia 20110-2209，ＵＳＡに在るＡｍerica Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託した。寄託したベクターの試料を公衆は入手することができ、この米国特許出願に基く特許が与えられたときに、寄託物の入手に課されるあらゆる規制が除かれることになろう。その上、寄託所が生体試料を分与できなければ寄託物を更新することになろう。寄託した実施形態は本発明の単なる例示を意図したものにすぎないので、本明細書に記載し、請求した本発明の範囲は寄託した生物学的材料によって限定されるものではない。この出願書に記載のものと同等または類似の抗原をコード化する核酸を含有する、任意の同等または類似のベクターは、本発明の範囲内にある。
【００７１】
【表１】
【００７２】
(実施例)
上述の開示は、本発明を一般的に述べている。下記の具体的な実施例を参考文献することによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は例示の目的で述べられているに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。状況によってはよい方法になるかもしれないので、形状の変更および均等物の代用が考えられる。本明細書では特定の用語が用いられているが、これらの用語は記述的な意味のためのものであり、制限の目的のためではない。
【００７３】
本開示とこれらの実施例で用いられているが明示的には述べられていない分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学、および発行技術の方法は科学文献では広く報告されており、充分に当業者の能力範囲にある。
【００７４】
実施例１
この実施例では、全長160kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1091-２の構築について述べる。
【００７５】
プラスミドpＨＭＷ１-15(参考文献８)は、Ｔ７プロモーターとhｍｗ１ＡＢＣコード領域の開始点との間に挿入されるhｍｗ１プロモーターを含めて約 400 bpの５'-フランキング領域を含む(図１)。pＨＭＷ１-15 のマルチクローニング部位の中にはユニークＢgl II部位が１つあり、hｍｗ１Ａのコード領域内にはユニークＢaｍＨ I部位が１つある。2.2 kbのＢgl II―ＢaｍＨ I断片を別の操作のためにサブクローニングして、プラスミドＤＳ-1035-12 を生成させた。５'-フランキング領域を含む 400 kbのＸba I-Ｂsｍ I断片を、Ｔ７プロモーターを直接プラスミドＤＳ-1055 Ｒ-２中のhｍｗ１Ａ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに接合させる約 86 bpのオリゴヌクレオチド配列(図１Ｂ)で置き換えた。ＤＳ-1055 Ｒ-２からの 1.5 kbのＸba I-Ｂaｍ I断片を、プラスミドＤＳ-1091-２を生成するために、同じ酵素で消化されていたpＨＭＷ１-15 に挿入した。
【００７６】
実施例２
この実施例では、全長 155 kＤaのＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1094-２の構築について述べる。
【００７７】
プラスミドpＨＭＷ２-21(参考文献 10)は、Ｔ７プロモーターとhｍｗ２ＡＢＣのコード配列(図２)の開始点との間に挿入されるhｍｗ２プロモーターを含めて約 800 bpの５'-フランキング配列を含む。プラスミドpＨＭＷ２-21 は２つのＥcoＲ I部位を有し、１つはマルチクローニング部位中にあり、もう１つはhｍｗ２Ａ遺伝子のコード配列中にある。2.5 kbのＥcoＲ I断片を別の操作のためにサブクローニングし、プラスミドＤＳ-1036-９を生成させた。５'-フランキング配列を含む約 800 kbのＸba I-Ｂsｍ I断片を、Ｔ７プロモーターを直接hｍｗ２ＡのＡＴＧ開始コドンに接合させるために、hｍｗ/に用いられた約 86 bpの同じオリゴヌクレオチド(図１Ｂ)に取り替え、プラスミドＤＳ-1056 Ｒ-１-１が生成された。中間プラスミド(ＤＳ-1078-４)は適切な制限酵素部位を導入するのに必要であり、Ｘba Iの挿入を行い、次いでプラスミドＤＳ-1085-８の定位を変えるために連結した。プラスミドＤＳ-1085-８をＥcoＲ Iによって線状化し、脱リン酸化し、pＨＭＷ２-21 からの８kbのＥcoＲ I断片によって連結し、hｍｗ２ＡＢＣのコード配列に直接連結されたＴ７プロモーターを含むプラスミドＤＳ-1094-２が生成された。
【００７８】
実施例３
この実施例は、全長 125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1046-1-1 の構築について例示するものである。
【００７９】
プラスミドpＨＭＷ１-15(参考文献８)はＴ７プロモーター配列内にＸba I部位を、成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(図３Ａ)のコード配列内にユニークＢaｍＨ I部位を含む。pＨＭＷ１-15 の 1.8 kbのＸba I-ＢaｍＨ I断片を欠失させ、オリゴヌクレオチド(図３Ｂ)から生成させた約 114 bpのＸba I-ＢaｍＨ I断片で置き換えた。生成させた 11.3 kbのプラスミドＤＳ-1046-1-1 は、したがって、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣオペロンと構造上接合されたＴ７プロモーターを含む。
【００８０】
実施例４
この実施例は、全長 120 kＤaの成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２ＡＢのＣ遺伝子の一部を発現するプラスミドＤＳ-1200-３の構築について例示するものである。
【００８１】
プラスミドpＨＭＷ２-21(参考文献 10)は、成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質のコード配列内に１つのＥcoＲ I部位を含む。しかしながら、それは特異的ではない(図４Ａ)。複数のステップから成る構築過程は、105 bpのオリゴヌクレオチド(図４Ｂ)からのＴ７プロモーターおよび成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２Ａ遺伝子の開始点の第１の再形成部分を含む。プラスミドＤＳ-1134-２は、完全なＴ７プロモーターおよび成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質をコードする５'-配列を含む。プラスミドＤＳ-1134-２をＥcoＲ Iによって線状化し、脱リン酸化し、大部分のhｍｗ２Ａ遺伝子およびhｍｗ２Ｂとhｍｗ２Ｃ遺伝子すべてを含むpＨＭＷ２-21 からの８kbのＥcoＲ I断片を挿入した。プラスミドＤＳ-1147-４は、Ｔ７hｍｗ２ＡＢＣ遺伝子カセットを含むpＵＣベースのプラスミドである。プラスミドＤＳ-1200-３を生成するために、このカセットすべてを 6.5 kbのＢgl II―Ｘho I断片上に取り除き、Ｂal IIとＳal Iで消化されていたpＴ７-７に挿入した。この構築中にhｍｗ２Ｃ遺伝子の一部が削除された。
【００８２】
実施例５
この実施例は、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１Ａ遺伝子およびhｍｗ１Ｂ遺伝子の一部を含むプラスミドＤＳ-1122-２の構築について例示するものである。
【００８３】
プラスミドＤＳ-1046-１-１(図３Ａ；実施例３)は３つのＨind III部位を含み、１つはhｍｗ１Ｂ遺伝子内に、１つはhｍｗ１Ｃ遺伝子内に、さらにもう１つはマルチクローニング部位(図５)の３'-領域にある。ＤＳ-1046-１-１をＨind IIIで消化させ、次いで再連結させると、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードする完全なhｍｗ１Ａ遺伝子およびhｍｗ１Ｂ遺伝子の一部を含み、hｍｗ１Ｃ遺伝子をまったく含まない 125 kＤaの成熟プラスミドＤＳ-1122-２が生成された。
【００８４】
実施例６
この実施例は、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１Ａ遺伝子を含み、他のhｍｗ遺伝子をまったく含まないプラスミドJＢ-2330-７の構築について例示するものである。
【００８５】
ＰＣＲ法による増幅をプラスミドＤＳ-1122-２ＤＮＡ上で行い(図５；実施例５)、ターミネーターを介してhｍｗ１Ａの３'-末端近くにあるＫpn I部位から 500 bpの断片を生成し、３'-末端のＸho IとＨind III用に制限酵素部位を導入した。この断片をpＣＲ IIにクローニングし、プラスミドＤＳ-2056-１-１(図６Ａ)を生成させた。さらに、使用したヌクレオチドを図６Ｂに示す。プラスミドＤＳ-1122-２をＫpn IとＨind IIIによって消化し、それによって大部分のhｍｗ１Ａ遺伝子およびすべてのhｍｗ１Ｂ遺伝子断片が欠失された。ＤＳ-1122-２からの 2.6 kbのＫpn I-Ｈind IIIベクター断片をＤＳ-2056-１-１からの 0.5 kbのＫpn I-Ｈind III断片と連結し、約 0.2 kbの５'-hｍｗ１Ａ配列および約 0.5 kbの３'-hｍｗ１Ａ配列を含むＫpn I部位に接合されたプラスミドJＢ-2321-１が生成された。プラスミドJＢ-2321-１をＫpn Iによって線状化し、脱リン酸化し、ＤＳ-1122-２からの 2.7 kbの内在Ｋpn I断片を挿入し、プラスミドJＢ-2330-７を作成した。このプラスミドは付加のhｍｗ１遺伝子配列がまったくないＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットを含む。
【００８６】
実施例７
この実施例は、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドJＢ-2369-６の構築について例示するものである。
【００８７】
プラスミドJＢ-2330-７(図６Ａ；実施例６)をＢgl IIとＨind IIIによって消化し、Ｔ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットをＢgl IIとＨind IIIによって消化されていたpＵＣ-ＢgＸbにサブクローニングし、プラスミドJＢ-2337-１(図７)を作成した。プラスミドJＢ-2337-１をＳal IとＸho Iによって消化し、互換性の末端を有する断片上にＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットを切り離した。ベクターＤＳ-1843-２は、転写終止コドンおよびユニークＸho I部位を有するマルチクローニング部位を含むpＢＲ 328 ベースのプラスミドである。ベクターＤＳ-1843-２をＸho Iで消化し、脱リン酸化し、次いで 3.5 kbのＳal I-Ｘho I Ｔ７hｍｗ１Ａ遺伝子カセットと連結させ、プラスミドJＢ-2347-５を生成させた。Ｓal IおよびＸho I部位は閉ざされているので、このプラスミドはJＢ-2337-１に由来する付加のＳal I-Ｘho I Ｔ７hｍｗ１Ａ遺伝子カセットを挿入するのに用いられるＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子の３'-末端にユニークＸho I部位を含む。プラスミドJＢ-2369-６は、このようにして導入された２つのタンデムＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子を含む。
【００８８】
実施例８
この実施例は、成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットの１つまたは２つのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-2084-３およびＤＳ-2084-１の構築について例示するものである。
【００８９】
プラスミドＤＳ-1200-３(図４Ａ,実施例４)は、Ｃ遺伝子カセットの一部であるＴ７ hｍｗ２ＡＢを含む。ＤＳ-1200-３内には２つのＭlu I部位があり、１つはhｍｗ２Ａの３'-末端近くに位置し、もう１つはhｍｗ２Ｂの５'-末端近くに位置する(図８Ａ)。オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによってＭlu I部位からのhｍｗ２Ａ遺伝子３'-末端の 247 bpの断片を増幅させ、ユニークＢaｍＨ I部位の次にhｍｗ２Ａの停止コドンを導入した(図８Ｂ)。247 bpのＰＣＲ断片をpＣＲ IIにサブクローニングして、プラスミドＤＳ-2056-３-１を生成させた。プラスミドＤＳ-1200-３をＢgl IIとＭlu Iによって消化し、Ｔ７プロモーターおよび大部分のhｍｗ２Ａ遺伝子を含む 3.2 kbの断片を精製した。プラスミドpＵＣ-ＢgＸbをＢgl IIとＢaｍＨ Iによって消化して脱リン酸化した。Ｂgl II-Ｍlu I hｍｗ２Ａ遺伝子断片およびＤＳ-2056-３-１からのＭlu I-ＢaｍＨ I ＰＣＲ断片を連結させてpＣＵベクターにして、Ｂgl II-ＢaｍＨ I断片上に 3.4 kbのＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットを含み付加のhｍｗ２遺伝子をまったく含まないプラスミドＤＳ-2073-３を生成させた。プラスミドＤＳ-1843-２をＢgl IIで線状化し、3.4 kbのＢgl II-ＢaｍＨ Iカセットを挿入し、単一のＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットおよび２つのタンデムＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットを含むプラスミドＤＳ-2084-１を含むプラスミドＤＳ-2084-３を生成させた。
【００９０】
実施例９
この実施例は、約 125 kbの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするタンデムＴ７hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を含み、アンシピリンまたはカナマイシンに対してそれぞれ耐性のあるプラスミドJＢ-2057-７およびＢＫ-86-１-１の構築について例示するものである。
【００９１】
プラスミドＤＳ-1046-１-１(図３Ａ；実施例３)は、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子カセットを含み、成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質のコード領域内にユニークＢaｍＨ I部位を有する。プラスミドJＢ-2369-６(図７；実施例７)は複数のタンデムＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットを含み、その各々がＨＭＷ１Ａ用のコード配列内に内在ＢaｍＨ I部位を含む。プラスミドJＢ-2369-６をＢaｍＨ Iで消化すると、第１のhｍｗ１Ａ遺伝子の３'-末端、Ｔ７プロモーター、および第２のhｍｗ１Ａ遺伝子の５'-末端を含む 3.5 kbの断片を生成させた。この断片をＤＳ-1046-１-１のＢaｍＨ I部位に連結させて、タンデムＴ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子カセットを含むプラスミドJＢ-2507-７を作成した(図９)。pＴ７-７ベクターの基幹のマルチクローニング部位にあるユニークＳal I部位をJＢ-2507-７の線状化に用いた。カナマイシンに耐性のあるカセットを、Ｓal Iでの消化によるpＵＣ-４Ｋから切除し、JＢ-2507-７ベクターと連結させ、プラスミドＢＫ-86-１-１を生成させた。
【００９２】
実施例 10
この実施例は、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子カセットおよびＥ.coli cer遺伝子を含み、アンシピリンまたはカナマイシンに対してそれぞれ耐性のあるプラスミドＢＫ-35-４およびＢＫ-76-１-１の構築について例示するものである。
【００９３】
プラスミドＤＳ-2224-１-４(図 10)は、pＵＣ-ＢgＸbのＢaｍＨ I部位にクローニングされた約 290 bpのオリゴヌクレオチドからのＥ.coli cer遺伝子(参考文献 13)を１つ含む。プラスミドＤＳ-1046-１-１(図３Ａ；実施例３)は、Ｔ７プロモーターの上流にユニークＢgl II部位を含む。プラスミドＤＳ-1046-１-１をＢgl IIで線状化し、脱リン酸化し、ＤＳ-2224-１-４からのcer遺伝子を含む 290 bpのＢaｍＨ I断片と連結させ、プラスミドＢＫ-35-４を形成させた。カナマイシンに耐性のあるカセットを、Ｓal Iでの消化によるpＵＣ-４Ｋから削り取り、ＢＫ-35-４のユニークＳal I部位に挿入し、プラスミドＢＫ-76-１-１を形成させた。
【００９４】
実施例 11
この実施例は、前述の実施例において生成された異なる構築体からのrＨＭＷ１およびrＨＭＷ２タンパク質生成の分析を例示するものである。
【００９５】
プラスミドを、Ｂiorad器具を用いたエレクトロポレーションによって、Ｅ.coli ＢＬ 21(ＤＥ３)細胞に導入した。37 ℃のＮＺＣＹＭ媒体中で、菌株を光学濃度Ａ878＝0.3 まで成長させ、次いで４時間かけてラクトースを 1.0 ％まで加えることによって誘発した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥリーシスとローディングバッファーによって、サンプルを 0.2 ＯＤ/μlに調整し、同量のタンパク質サンプルをＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上にのせた。図 11 は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルによって分析され、さまざまな構築体からのrＨＭＷタンパク質の相対的生成量を例示するものである。特定の構築体に関するレーンの同定結果は、上述の図の記述の中で与えられている。「a」はＨＭＷＡタンパク質のバンドを示し、「b」はＨＭＷＢタンパク質のバンドを示し、「c」はＨＭＷＣタンパク質のバンドを示す。
【００９６】
図を見ると分かるように、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(160)構築体(レーン３)からのＨＭＷ１Ａ、ＢおよびＣタンパク質の生成はごくわずかである。３つのタンパク質すべての生成が、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)構築体(レーン４)では向上する。レーン５では、ＨＭＷ１Ｃタンパク質の生成がまったくなく、Ｂ構築体の一部のＴ７ hｍｗ１Ａ内の遺伝子の先端が切り取られることによって、ＨＭＷ１Ｂタンパク質の大きさがわずかに減少する。レーン６では、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)構築体からのＨＭＷ１ＢまたはＨＭＷ１Ｃタンパク質の生成がまったくない。レーン７は、Ｔ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１Ａ構築体からのＨＭＷ１Ａの生成の向上は、たとえあるにしてもわずかであった。レーン８では、ＨＭＷ１Ａ、ＨＭＷ１Ｂ、およびＨＭＷ１Ｃタンパク質の生成は、それらがＴ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ構築体から発現される場合は明らかである。レーン９では、ＨＭＷ１Ａ、ＨＭＷ１Ｂ、およびＨＭＷ１Ｃタンパク質はすべてＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer構築体から生成される。
【００９７】
実施例 12
このサンプルは、組換え型ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパク質の精製を例示するものである。
【００９８】
さまざまな構築体中のＢまたはＣ遺伝子の削除が完全であれ部分的であれ、すべての組換え型ＨＭＷタンパク質がＥ.coli内の封入体として発現され、同じ手順(図 12)で精製された。500 ｍl培地からのＥ.coli細胞のペレットを、pＨ 8.0 で 0.1 Ｍ ＮaＣlを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl 50 ｍl中で再懸濁して、超音波によってかき混ぜた。抽出液を 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離して、生成した上澄みを捨てた。pＨ 8.0 で 0.5 ％Ｔriton Ｘ-100 および 10 ｍＭ ＥＤＴＡを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl 50 ｍl中で、ペレット(ＰＰＴ1)をさらに抽出して、次いで 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離して、上澄みを捨てた。pＨ 8.0 で１％のオクチルグルコサイドを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl 50 ｍl中で、ペレット(ＰＰＴ2)をさらに抽出して、次いで 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離して、上澄みを捨てた。
【００９９】
上述の抽出後に得られたペレット(ＰＰＴ3)は、封入体を含む。このペレットをpＨ 8.0 で６Ｍグアニジンおよび５ｍＭ ＤＴＴを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl ６ｍl中で可溶化した。pＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl 12 ｍlをこの溶液に加えて、混合物を 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離した。その上澄み(ＳＵＰ4)をポリエチレングリコール(ＰＥＧ)4000 で、最終濃度７％に沈殿させた。生成したペレット(ＰＰＴ5)を 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間の遠心分離で除去して、その上澄みを飽和度 50 ％の(ＮＨ4)2ＳＯ4で沈殿した。(ＮＨ4)2ＳＯ4を加えた後、その溶液をタンパク質で相分離し上相にして、次いで 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離した。生成したペレット(ＰＰＴ6)を６ＭグアニジンＨＣlおよび５ｍＭ ＤＴＴを含むpＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl ２ｍl中で溶解し、その透明溶液を、pＨ 8.0 で２ＭグアニジンＨＣlを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl中で平衡化されたＳuperdex 200 ゲルろ過コラムで精製した。その留分をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、精製rＨＭＷ１を含むものをプールして４℃で一昼夜ＰＢＳに対してディスプレーし、次いで 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離した。この条件下ではタンパク質は可溶性のままであり、マイナス 20 ℃で保存するためにrＨＭＷ１沈殿にグリセリンを加えて最終濃度 20 ％にした。
【０１００】
さまざまな精製段階の代表的なrＨＭＷ１タンパク質(abc/cer)のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を図 13 に示す。レーンの同定を図の記載中に示す。最初の３つの抽出液、pＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl/0.1 Ｍ ＮaＣl(レーン３)、pＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl/0.5 ％ Ｔriton Ｘ-100(レーン４)、pＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl/１％オクチルグルコシド(レーン５)の後では、約110、80、60 kＤaの３つの主なタンパクの質バンド(レーン６)は明らかであった。Ｎ-末端アミノ酸配列で確認されるように、これら３つのタンパク質は、それぞれhｍｗ１Ａ、Ｃ、Ｂ遺伝子の産物である。ＢおよびＣ遺伝子の産物は、グアニン塩酸塩溶液中では可溶性が低く(レーン７)、グラニジンＨＣl濃度を６Ｍから２Ｍに希釈することによって、遺伝子Ａの産物(ＨＭＷ１、レーン８)から容易に分離された。７％ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)4000 による沈降で、rＨＭＷ１調製からの他の混合タンパク質(レーン９)を除去した。最終的な硫酸アンモニウム沈降で、ＰＥＧ可溶性留分(レーン 10)からのrＨＭＷ１を凝集しただけでなく、残留したＰＥＧ(レーン 11)、高濃度の(ＮＨ4)2ＳＯ4を有するＰＥＧ溶液の混合による相分離を介した(ＮＨ4)2ＳＯ4塩(レーン 12)効果的に除去した。次いでrＨＭＷ１ペレットを、６ＭグアニジンＨＣlおよび５ｍＭ ＤＴＴを含むpＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl中で溶解し、pＨ 8.0 で２ＭグアニジンＨＣlを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl中であらかじめ平衡化されたＳuperdex 200 ゲルろ過コラムで精製した(図 14、パネルＡ)。精製されたrＨＭＷ１の平均量は、培地１Ｌあたり 10 ｍgである。Ｔ７ hｍｗ２Ａ/Ｔ７ hｍｗ２Ａ構築体からのrＨＭＷ２Ａ精製のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を図 14、パネルＢに示す。
【０１０１】
実施例 13
この実施例は、精製されたrＨＭＷ１Ａタンパク質の安定性を例示するものである。
【０１０２】
rＨＭＷ１Ａの安定性を研究するために、実施例 12 に従って生成された精製されたrＨＭＷ１Ａタンパク質を、グリセリンと共にまたはグリセリンなしで、４℃またはマイナス 20 ℃で保存してた。グリセリンが存在しない場合、タンパク質は４℃で保存されると解体され、マイナス 20 ℃で保存されると沈殿する傾向があった。最終濃度 20 ％までグリセリンを加えると、rＨＭＷ１Ａの可溶性が大幅に上がっただけでなく、マイナス 20 ℃で保存する場合のタンパク質の安定性が増した。繰り返しの凍結および解凍の後も、タンパク質は少なくとも８週間はそのままの状態だった(図 15)。
【０１０３】
実施例 14
この実施例は、異なる構築体から生成されたrＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａタンパク質の免疫原性を例示するものである。
【０１０４】
Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(pＤＳ-1046-１-１、図３Ａ、実施例３)またはＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer(pＢＫ-76-１-１、図 10、実施例 10)構築体から生成され、実施例 12 の手順に従って精製されたrＨＭＷ１タンパク質の免疫原性を研究するために、５匹のＢＡＬＢ/cマウス(ケベック州チャールズリバー産)を、ＡlＰＯ4(一投与量あたり 1.5 ｍg)の存在下で１日、29 日、43 日目に 0.3、１、３μgの抗原で免疫性を与えた。０、14、28、42、56 日目に、血液サンプルを集めた。
【０１０５】
Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣまたはＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer構築体(一投与量あたり 0.3 から３μgに由来する精製rＨＭＷ１によって免疫性を与えられたマウスは、投与量依存性抗rＨＭＷ１抗体反応を起こし(図 16)、この反応は両方のタンパク質が封入体の抽出および可溶化の後でも免疫遺伝的であることを示唆している。マウスにおいて、この２つの構築体からのタンパク質によって誘発される抗体の滴定濃度中には、統計的に大幅な差異は見られなかった。
【０１０６】
いくつかの異なる構築体から生成され実施例 12 に従って精製された、rＨＭＷ１およびrＨＭＷ２タンパク質の免疫原性を比較するために、ＡlＰＯ4(一投与量あたり 1.5 ｍg)の存在下でrＨＭＷタンパク質 30 μgを用いて、１、14、28 日目に９匹のチンチラ(モールトンチンチラ牧場産)のグループに免疫性を与えた。42 日目に、血液サンプルを集めた。さまざまな型のrＨＭＷによって誘発されるチンチラ抗ＨＭＷ抗体反応を表１に要約する。
【０１０７】
Ｔ７ hｍｗ１ＡＢ(125)(ab/Δ)(pＤＳ-1122-２、図５、実施例５)構築体ではなく、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(abc)(pＤＳ-1046-１-１、図３Ａ、実施例３)、Ｔ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(a/abc)(pＢＫ-86-１-１、図９、実施例９)、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer(abc/cer)(pＢＫ 76-１-１、図 10、実施例 10)、およびＴ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１Ａ(２Ｘa)(pJＢ-2369-６、図７、実施例７)構築体から調製されたrＨＭＷ１が、３つの免疫処置後にチンチラの体内で相当な抗体滴定濃度を誘発することが分かった。同様に、Ｔ７ hｍｗ２ＡＢＣ(abc)(pＤＳ-1147-４、図４Ａ、実施例４)またはＴ７ hｍｗ２Ａ/Ｔ７ hｍｗ２Ａ(２Ｘa)(pＤＳ-2084-１、図８Ａ、実施例８)構築体から調製され、実施例 12 に従って精製されたrＨＭＷ２が３つの免疫処置後にチンチラの体内で相当な抗体滴定濃度を引き出すことが分かった。
【０１０８】
抗rＨＭＷ IgＧ滴定濃度を、抗原特異的酵素連結免疫吸着剤アッセイ(ＥIＡs)によって決定した。Ｍicrotiter ｗells(ナンク-マキシソープ、ナンク、デンマーク)をタンパク質抗原 50 μl(0.5 μg ｍl-1)でコーティングした。このアッセイで用いられた試薬は次の通りである:ホースラディシュペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウスIgＧ(Ｆc特異的)の親和性精製されたＦ(ab')2断片(Jackson Iｍｍuno Ｒesearch Ｌabs.、オンタリオ州ミシソーガ)、親和性精製されたモルモット抗IgＧ抗体(１μgｍl-1)(この研究室で調製された)、およびレポーターとして用いられたホースラディシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)に結合させたヤギ抗モルモットIgＧ(Ｈ＋Ｌ)抗体(Jackson Iｍｍuno Ｒesearch Ｌabs.)。チンチラIgＧを、Ｂarenkaｍp(参考文献 14)に従ってチンチラ血清から精製した。モルモット抗チンチラIgＧ抗体の発生および精製については前に述べた(参考文献 15)。テトラメチルベンジジンを用いて反応を進展させ(ＴＭＢ/Ｈ2Ｏ2、ＡＤI、オンタリオ州ミシソーガ)、Ｆloｗ Ｍultiskan ＭＣＣ マイクロプレートリーダー(IＣＮ Ｂiocheｍicals、オンタリオ州ミシソーガ)で 450 nｍで吸光度を測定した(基準波長として 540 nｍを用いた)。抗血清の反応による滴定濃度を、常に２倍以上の吸光度の増加を示すあらかじめ採取した血清サンプルと共に得られた希釈度の逆数として定義した。
【０１０９】
実施例 15
この実施例は、異なる構築体から生成されたrＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａタンパク質の防御能を例示するものである。
【０１１０】
チンチラにおける新しく成長させたストレプトマイシン耐性ＮＴＨ１菌株 12 での免疫および鼻腔内の攻撃誘発については述べてきた(参考文献 15)。簡潔に述べると、８から９匹の動物グループを次のもので３度筋肉内免疫した:０、14、28 日目に精製rＨＭＷ１およびrＨＭＷ 30 μg、アラム中の熱不活性(56 ℃、10 分)ＮＴＨi全細胞２× 109 cfu、またはアラムのみで。ＥIＡsによって抗ＨＭＷ１または抗rＨＭＷ２抗体の滴定濃度を測定するために、血清サンプルおよび鼻洗浄サンプルを 42 日目に取り出した。
【０１１１】
44 日目に、筋内注射(体重１kgあたり 0.06 ｍgキシラジンおよび 0.3 ｍgケタミンＨＣl)によるキシラジン/ケタミンＨＣlを用いて動物に軽度の麻酔をかけた。共に２μgｍl-1であるヘミンおよびＮＡＤを補充したＢＨI培地で新しく培養した、ストレプトマイシン耐性ＮＴＨi菌株 12 に受動的吸入法(鼻腔あたり 50 μl、動物あたり計 0.1 ｍl)によって鼻腔内でインキュレーションを行った。バクテリア攻撃の投与量は、動物あたり１× 108 cfuであった。インキュレーション後に、麻酔したチンチラに、４日間鼻咽喉洗浄を行った(キシラジン/ケタミンＨＣl、44 日目と同じ方法および投与量)。１ｍlの滅菌塩水で鼻咽喉を洗浄して、反対側の鼻腔から流体を集めることによって分泌物を得た。標準的に、各々の動物から流体約 500 μlを集めて、ストレプトマイシン 50 μl(20 ｍg ｍl-1)の存在下で、サンプル 25 μlをチョコレート寒天培地上で培養した。
【０１１２】
ＮＴＨi菌株 12 を有するチンチラ鼻咽喉のＮＰコロニゼーションにおけるさまざまなrＨＭＷ１およびrＨＭＷ２調製に関する非経口免疫処置の保護効果を表２に要約する。アラムのみで免疫性を与えられた対照動物の 67 ％から 88 ％は、培地陽性の鼻部洗浄流体を有した。対照的に、構築体abc(pＤＳ-1046-１-１)a/abc(pＢＫ 86-１-１)、またはabc/cer(pＢＫ-76-１-１)から精製されたrＨＭＷ１タンパク質で免疫性を与えられた動物の 67 ％から 80 ％は広く保護された。構築体abΔ(pＤＳ-1122-２)または構築体２Ｘa(pJＢ-2369-６)に由来するrＨＭＷ１タンパク質で免疫性を与えられた動物は、70 ％から 90 ％が感染した。これらの結果によって、チンチラモデルにおけるＮＴＨi菌株 12 のコロニゼーションに対して有意な保護を得るためには、rＨＭＷ１タンパク質は無傷のＡＢＣ遺伝子を有する構築体に由来しなければならないことが明らかに示された。
【０１１３】
rＨＭＷ２タンパク質に関しても、同様の結果をを観察した。表２に示すように、構築体２Ｘa(pＤＳ-2084-１)からではなく構築体abc(pＤＳ-1147-４)から精製されたrＨＭＷ２タンパク質で免疫性を与えられた動物は、チンチラモデルにおけるＮＴＨi菌株 12 のコロニゼーションに対して保護された。いずれの場合も、米国特許第５,603,938 号に従って調整された、熱不活性ＮＴＨi 12 の全細胞調製によって免疫性を与えられたチンチラにおいては有意な保護を観察した。
【０１１４】
実施例 16
この実施例は、付加のＮＴＨi菌株からのhｍｗＡ遺伝子のクローニングおよび配列分析を例示するものである。
【０１１５】
染色体ＤＮＡをいくつかのＮＴＨi菌株から調製し、図 17 に示したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ法を行った。センスプライマー(5522.ＳＬ、配列番号 21)は、プロセシング部位のすぐ上流に成熟ＨＭＷタンパク質の残基をコードするhｍｗＡ遺伝子の保存領域に対応する。アンチセンスプライマー(5523.ＳＬ、配列番号 24)は、これもまた保存されているhｍｗＢ遺伝子の開始点に対応する。
【０１１６】
ＰＣＲ法による増幅を次のように行った:５〜 100 ngのＤＮＡを含む各反応混合物、各プライマー１μg、taq＋またはtag＋(Ｓangon)またはtaq plus long(Ｓtratagene)の５ユニット、２ｍＭ dＮＴＰs、20 ｍＭ Ｔris-ＨＣl(pＨ 8.8)、10 ｍＭ Ｋcl、10 ｍＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭ ＭgＳＯ4、0.1 ％ Ｔriton Ｘ-100 ＢＳＡ。循環条件は、95 ℃で１分間、次に 95 ℃で 30 秒を 25 サイクル、45 ℃で１分間、72 ℃で２分間、次いで 72 ℃で 10 分間。
【０１１７】
菌株Joycからのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 25)および推定アミノ酸配列(配列番号 26)を図 18 に示す。菌株Joycからの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 27、アミノ酸配列番号 28 をエンコードしている)は、分子量 125.9 kＤaであり 8.21.のpIを有する。Joyc ＨＭＷ１Ａ中には、ＲＧＤモティーフはまったく見られない。菌株Joycからのhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 29)および推定アミノ酸配列(配列番号 30)を図 19 に示す。菌株Joycからの予想される成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質(配列番号 31、アミノ酸配列番号 32 をエンコードしている)は、分子量 100.9 kＤaであり 6.91.のpIを有する。Joyc ＨＭＷ２Ａ中には、ＲＧＤモティーフはまったく見られない。
【０１１８】
Ｋ１菌株からの欠損hｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 33)および推定アミノ酸配列(配列番号 34,35)を図 20 に示す。Ｋ１菌株中には完全なhｍｗ１Ａ遺伝子が存在するが、ポリＧ域のすぐ次にフレームシフトがあり、これによってアミノ酸 326 以降のＨＭＷ１Ａタンパク質の早期停止が起こる。
【０１１９】
菌株Ｋ 21 からのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 38)および推定アミノ酸配列(配列番号 39)を図 21 に示す。菌株Ｋ 21 からの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 40、アミノ酸配列番号 41 をエンコードしている)は、分子量 104.4 kＤaであり 8.71.のpIを有する。Ｋ 21 ＨＭＷ１Ａ中の残基 20 から 22 に位置するＲＧＤモティーフが１つある。
【０１２０】
菌株ＬＣＤＣ２からのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 42)および推定アミノ酸配列(配列番号 43)を図 22 に示す。菌株ＬＣＤＣ２からの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 44、アミノ酸配列番号 45 をエンコードしている)は、分子量 114.0 kＤaであり 8.72.のpIを有する。ＬＣＤＣ２ ＨＭＷ１Ａ中には、ＲＧＤモティーフはまったく見られない。菌株ＬＣＤＣ２からのhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 46)および推定アミノ酸配列(配列番号 47)を図 23 に示す。菌株ＬＣＤＣ２からの予想される成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質(配列番号 48、アミノ酸配列番号 49 をエンコードしている)は、分子量 111.7 kＤaであり 8.22.のpIを有する。ＬＣＤＣ２ ＨＭＷ２Ａ中には、ＲＧＤモティーフはまったく見られない。
【０１２１】
菌株ＰＭＨ１からのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 50)および推定アミノ酸配列(配列番号 51)を図 24 に示す。菌株ＰＭＨ１からの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 52、アミノ酸配列番号 53 をエンコードしている)は、分子量 102.4 kＤaであり 6.73.のpIを有する。ＰＭＨ１ ＨＭＷ１Ａ中には２つのＲＧＤモティーフがあり、第１のモティーフは残基 19 から 21、第２のモティーフは残基 505 から 507 にある。菌株ＰＭＨ１からのhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 54)および推定アミノ酸配列(配列番号 55)を図 25 に示す。菌株ＰＭＨ１からの予想される成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質(配列番号 56、アミノ酸配列番号 57 をエンコードしている)は、分子量 103.9 kＤaであり 9.07.のpIを有する。ＰＭＨ１ ＨＭＷ２Ａ中には２つのＲＧＤモティーフがあり、第１のモティーフは残基 26 から 28、第２のモティーフは残基 532 から 534 にある。
【０１２２】
菌株 15 からのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 58)および推定アミノ酸配列(配列番号 59)を図 26 に示す。菌株 15 からの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 60、アミノ酸配列番号 61 をエンコードしている)は、分子量 103.5 kＤaであり 8.06.のpIを有する。菌株 15 のＨＭＷ１Ａ中にはＲＧＤモティーフはまったく見られない。菌株 15 からのhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 62)および推定アミノ酸配列(配列番号 63)を図 27 に示す。菌株 15 からの予想される成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質(配列番号 64、アミノ酸配列番号 65 をエンコードしている)は、分子量 121.9 kＤaであり 8.22.のpIを有する。菌株 15 のＨＭＷ２Ａ中にはＲＧＤモティーフはまったく見られない。
【０１２３】
米国特許第５,603,938 号に含まれるように、菌株 12 からのhｍｗ１Ａおよびhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号: 66,70)および推定アミノ酸配列(配列番号: 67,71)を図 28 および図 29 にそれぞれ示す。
【０１２４】
推定ＨＭＷ１Ａタンパク質および推定ＨＭＷ２Ａタンパク質の配列と、公表されている菌株 12 からのＨＭＷ１Ａタンパク質およびＨＭＷ２Ａタンパク質の配列を図 30 に示す(配列番号 67,71)。成熟タンパク質の開裂部位を矢印で示す。特に残基約 980 〜 1168 とカルボキシル末端の残基約 1360 〜末端との間で、同様の領域が同定される。残基 1219 あたりに挿入されるタンパク質の中には繰り返し配列があるものもあるようであり、最も顕著なのは２つのタンデム挿入繰り返し配列を有すると思われるJoyc ＨＭＷ１ＡとＫ１ ＨＭＷ１Ａであるが、Ｋ 21 ＨＭＷ１ＡとＬＣＤＣ２ ＨＭＷ２Ａは繰り返し配列のコピーを１つしか含まない。菌株 15 ＨＭＷ２Ａは、同じ場所に位置する異なった繰り返し部分を含む。菌株 15 ＨＭＷ２Ａ以外のすべてのＨＭＷ２Ａタンパク質で見られる残基 583 に挿入された半保存配列の短い部分がある。しかしながら菌株 15 ＨＭＷ１Ａタンパク質では、それが見られる。
【０１２５】
実施例 17
この実施例は、hｍｗ１Ａまたはhｍｗ２Ａ遺伝子が増幅されたかどうかを決定するために用いられる、ＰＣＲ法による増幅を例示するものである。
【０１２６】
hｍｗ１オペロンとhｍｗ２オペロンの間に保存されている配列上のプライマーによってhｍｗＡ遺伝子をＰＣＲ法で増幅すると、増幅した遺伝子はhｍｗ１またはhｍｗ２のどちらかであるはずである。hｍｗ遺伝子は包み込まれた菌株内では発生しないが、
Ｈ.インフルエンザ菌株ＲＤの遺伝配列内で５'-および３'-フランキングが見られるはずである(参考文献 16)。菌株ＲＤ遺伝子ＨI 1679 からの５'-hｍｗ１フランキング(プライマー 5672.ＳＬ、配列番号 74)および菌株Ｒdの遺伝子ＨI 1598 由来の５'-hｍｗ２フランキング領域(プライマー 5676.ＳＬ、配列番号 75)を基にオリゴヌクレオチドセンスプライマーが生成された。増幅されたhｍｗＡ遺伝子の内部配列を基に、アンチセンスプライマーが生成された。オリゴヌクレオチドプライマーを図 31 に示す。プライマー 5742.ＳＬ(配列番号 78)を用いて、菌株Ｋ１、Ｋ 21、ＰＭＨ１、15 からのhｍｗＡ遺伝子を増幅させる一方で、プライマー 5743.ＳＬ(配列番号 81)を用いてＰＣＲ法によって菌株JoycとＬＣＤＣ２からのhｍｗＡ遺伝子を増幅させた。hｍｗＡ特異性プライマー(5742.ＳＬおよび 5743.ＳＬ)および実施例 16 でクローニングされた遺伝子の配列と対照をなす配列を用いて、増幅した断片を直接シークエンスした。ＰＣＲ法で増幅されたhｍｗＡ遺伝子をhｍｗ１Ａまたはhｍｗ２Ａであると同定した後に、特異的ＰＣＲプライマーを用いて、成熟タンパク質の開始点で工作された開始コドンを有する遺伝子の第２のコピーを増幅した。発現用のＬＣＤＣ２hｍｗ２Ａ遺伝子を増幅させるために用いられるＰＣＲプライマーの代表的なペアを、図 33 Ｂに示す(5972.ＳＬ、配列番号 92 ； 5973.ＳＬ、配列番号 95)。
【０１２７】
実施例 18
この実施例は、Ｅ.coli中のhｍｗＡＢＣ遺伝子の発現に必要な一般的なプラスミドの構築を例示するものである。
【０１２８】
実施例 16 に示すように、hｍｗ１Ａおよびhｍｗ２Ａ遺伝子は、hｍｗを含みＨ.インフルエンザ型ではないあらゆる菌株からＰＣＲ法により増幅されるが、保護性のある組み替え抗原を生成するためではなく、これらはhｍｗＢＣ遺伝子の存在下で発現されなければならない。一般的な発現プラスミドは、Ｔ７プロモーター、菌株 12 hｍｗ１ＢＣ遺伝子、Ｅ.coli cer遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、あらゆるhｍｗＡ遺伝子を挿入するためのクローン部位を含むように構築される。
【０１２９】
プラスミドＢＫ-76-１-１(図 10、実施例 10)をＥcoＲ Iで消化して最連結させ、hｍｗ１Ａの３'-末端と削除されたhｍｗ１Ｂの５'-末端を含む２kbのＥcoＲ I断片を有するプラスミドJＢ-2581-２-１を生成した(図 32 Ａ)。次の操作のためにＢＫ-76-１-１からの２kbのＥcoＲ I断片をpＵＣ-ＢgＸbにサブクローニングして、プラスミドJＢ-2581-１-１を作成した。図 32 Ｂでは、hｍｗ１Ａの３'-末端(5947.ＳＬ、配列番号 83 ； 5948.ＳＬ、配列番号 86)およびhｍｗ１Ｂの５'-末端(5949.ＳＬ、配列番号 87 ； 5950.ＳＬ、配列番号 90)の増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを示し、２つの遺伝子の接合におけるＸba I部位を紹介する。プラスミドJＢ-2603-１-１は、hｍｗ１Ａ遺伝子の-ＥcoＲ IＸbaI３'-断片 1.5 kbを含み、プラスミドJＢ-2603-２-１は、hｍｗＡ-Ｂ相互遺伝配列およびhｍｗ１Ｂの５'-末端のＸba I-ＥcoＲ I断片約 550 bpを含む。プラスミドJＢ-2581-２-１をＥcoＲ Iで線状化して、脱リン酸化して、JＢ-2603-１-１およびJＢ-2603-２-１からのＥcoＲ I-Ｘba I挿入物と連結させて、プラスミドJＢ-2641-１を生成した。hｍｗ１Ａ遺伝子とhｍｗ１Ｂ遺伝子の間に余分なＸba I部位を含むこと以外は、このプラスミドはＢＫ-76-１-１と全く同じである。プラスミドJＢ-2641-１をＸba Iで消化すると完全なhｍｗ１Ａ遺伝子が削除されたが、hｍｗ１ＢＣ遺伝子はそのまま残った。ベクター断片の再連結によって、hｍｗＡ遺伝子をＸba I部位でクローニング可能な一般的な発現ベクターであるプラスミドJＢ-2646-１が生成した(図 32 Ａ)。
【０１３０】
一般的な発現ベクターの有用性を例証するために、菌株 12 hｍｗ１ＢＣ遺伝子と結びついたＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子を含むキメラＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを生成した。ＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子を、図 33 Ｂで例示されpＣＲ IIにクローニングされるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅させ、半時計方向の定位にhｍｗ２Ａ遺伝子を含むプラスミドＢＫ-137-３-10 を生成した。クローニング用にhｍｗ２Ａ遺伝子の定位を変えるために、このプラスミドをＢaｍＨ Iで消化してhｍｗ２Ａ挿入物を切り離して、次いで両断片を再連結した。プラスミドＢＫ-177-３-２は、時計方向の定位にＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子を含む。プラスミドＢＫ-177-３-２をＮde IおよびＸho Iで消化して、hｍｗ２Ａ断片をＮde IおよびＳal Iで消化しておいたpＴ７-７に連結させ、プラスミドＢＫ-189-２-５を生成した。一般的な発現プラスミドJＢ-2646-１(図 32 Ａ)をＸba Iで線状化して脱リン酸化した。プラスミドＢＫ-189-２-５をＸba Iで消化して、それによって発現ベクターに挿入するはずのhｍｗ２Ａ遺伝子を切り離した。したがってプラスミドＤＳ 2334-５は、ＬＣＤＣ２からのhｍｗ２Ａ遺伝子および菌株 12 からのhｍｗ１ＢＣ遺伝子から成るＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを含む。
【０１３１】
実施例 19
この実施例は、Ｔ７ hｍｗＡ/Ｔ７ hｍｗＡＢＣカセット、Ｅ.coli cer遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ 2400-13 の構築について例示するものである。
【０１３２】
プラスミドＤＳ 1843-２は、ＥcoＲ I部位とＰst I部位の間に挿入されるマルチクローニング部位を含むテトラサイクリン耐性pＢＲベースベクターである。ＤＳ-1843-２をＸho Iで線状化し、脱リン酸化して、pＵＣ-４Ｋからのカナマイシン耐性遺伝子をＳal I断片上に挿入して、テトラサイクリンとカナマイシンの両方に耐性のあるプラスミドＤＳ-2372-31 を生成した。プラスミドＤＳ-2372-31 をＢgl IIで線状化、脱リン酸化して、プラスミドＤＳ-2224-１-４からの合成Ｅ.coli cer遺伝子をＢaｍＨ I断片上に挿入して、プラスミドＤＳ-2379-２-６を生成した。プラスミドＤＳ-1046-１-１(図３Ａ、実施例３)をＢgl-IIおよびＳal-Iで消化して、Ｔ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子断片をＢaｍＨ IおよびＳal Iで消化されていたＤＳ-2379-２-６に挿入した。生成したプラスミド(ＤＳ-2391-１)は、Ｔ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子およびＥ.coli cer遺伝子を含むpＢＲベースカナマイシン耐性およびテトラサイクリン感受性ベクターである。JＢ-2369-６(図７、実施例７)をＢaｍＨ Iで消化して、pＢＲ Ｔ７hｍｗＡＢＣ/cer/kanＲベクターの特異的ＢaｍＨ I部位に挿入される内在３'-hｍｗＡ/Ｔ７ ５'-hｍｗＡ断片を切り離した。したがって、生成したpＢＲ Ｔ７ hｍｗＡ/Ｔ７ hｍｗＡＢＣ/cer/kanＲプラスミド(ＤＳ-2400-13)は複数のhｍｗＡ遺伝子を含む(図 34 参考文献)。
【０１３３】
(開示の概要)
本開示を要約すると、本発明は、核酸分子および核酸分子が組み込まれた構築体を提供するものであり、防御的な非分類型Ｈaeｍophilus influenzaeの高分子量タンパク質の組換えによる生産を可能にする。本発明の範囲内で、修正は可能である。
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
９匹のチンチラのグループに、アラムに吸収される上述の抗原 30 μlで、１,14,28 日目に免疫性を与えた。血液サンプルは 42 日目に集めた。抗血清の反応による滴定濃度を、常に２倍以上の吸光度の増加を示すあらかじめ採取した血清サンプルと共に得られた希釈度の逆数として定義した。２組の数字が２組の実験を示す。
【０１３６】
【表３】
【０１３７】
９匹のチンチラのグループに、アラムに吸収される上述の抗原 30 μlで、１,14,28 日目に免疫性を与えた。血液サンプルは 42 日目に集めた。44 日目に、生き生きと培養されたステレオマイシン耐性ＮＴＨi菌株 12 による鼻腔イノキュレーションによって動物を攻撃した。バクテリア攻撃の投与量は、動物あたり１× 108 cfuであった。イノキュレーションの４日後に鼻咽喉洗浄を行い、鼻腔洗浄液 25 μlをチョコレート寒天培地上で培養した。
【０１３８】
鼻腔洗浄流体 25 μlから 50 cfuを超えるバクテリアが回収できない場合、動物は感染していると定義した。
【０１３９】
対照動物とＭann-Ｗhiteney Ｒank Ｓuｍ Ｔestと比較した場合、統計的な有意が見られた(Ｐ＜ 0.05)。
【０１４０】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 全長 160 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1091-２を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＢsがＢsｍ I、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＨＭＷ１pがhｍｗ１プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図１Ｂ】 図１Ａの構築方式に使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号１、２および３)の配列を示す図である。
【図２】 全長 155 kＤaのＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1094-２を創る構築方式である。制限酵素部位の各略号は、ＢgがＢgl II、ＢsがＢsｍ I、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＨＭＷ２pがhｍｗ２プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図３Ａ】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1046-１-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＨＭＷ１pがhｍｗ１プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図３Ｂ】 図３Ａの構築方式に使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号４、５および６)の配列を示す図である。
【図４Ａ】 成熟した 120 kＤaのＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２ＡＢ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1200-３を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＨＭＷ２pがhｍｗ２プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図４Ｂ】 図４Ａの構築方式に使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号７、８および９)を示す図である。
【図５】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１Ａ遺伝子およびhｍｗ１Ｂ遺伝子の一部を含有するプラスミドＤＳ-1122-２を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図６Ａ】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１Ａ遺伝子を発現するプラスミドJＢ-2330-７を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＸhoがＸho Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図６Ｂ】 図６Ａの構築方式でhｍｗ１Ａの３'-末端をＰＣＲ増幅するために使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号 10、11、12、13 および 14)を示す図である。
【図７】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットのタンデムコピーを発現するプラスミドJＢ-2369-６を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＴcＲがテトラサイクリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼ、tt１が転写終結因子１、tt２が転写終結因子２、ＭＣＳが多重クローニング部位を示す。
【図８Ａ】 成熟 120 kＤaのＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットの各々１個または２個のコピーを含有するプラスミドＤＳ-2084-３およびＤＳ-2084-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＭがＭlu I、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＴcＲがテトラサイクリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼ、tt１が転写終結因子１、tt２が転写終結因子２、ＭＣＳが多重クローニング部位を示す。
【図８Ｂ】 図８Ａの構築方式でhｍｗ２Ａの３'-末端をＰＣＲ増幅するために使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号 15、16、17、18 および 19)を示す図である。
【図９】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードし、アンピシリンまたはカナマイシンで各々選択したタンデムＴ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を含有するプラスミドJＢ-2507-７およびＢＫ-86-１-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＴcＲがテトラサイクリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図１０】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードし、各々アンピシリンまたはカナマイシンによる選択を利用したＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer遺伝子を含有するプラスミドＢＫ-35-４およびＢＫ-76-１-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図１１】 様々な構築体から得られる組換えＨＭＷ１タンパク質の発現のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は広範囲の分子量マーカー、レーン２はＤＳ-1046-１-１[pＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)]、誘導なし、レーン３はＤＳ-1091-２[pＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ(160)]、レーン４はＤＳ-1046-１-１[pＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)]、レーン５はＤＳ-1122-２[pＴ７ hｍｗ１Ａ 部分Ｂ(125)]、レーン６はJＢ-2330-７[pＴ７ hｍｗ１Ａ(125)]、レーン７はJＢ-2369-６[pＢr 328 Ｔ７ hｍｗ１Ａ(125)/Ｔ７ hｍｗ１Ａ(125)]、レーン８はＢＫ-86-１-１[pＴ７ hｍｗ１Ａ(125)/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)/kanＲ]、レーン９はＢＫ-76-１-１[pＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)/cer/kanＲ]、レーン 10 は広範囲の分子量マーカーである。
【図１２】 ＨＭＷ１およびＨＭＷ２の各組換えタンパク質に対する精製方式を示す図である。各略号は、ＰＰＴがペレット、ＳＵＰが上清液、ＯＧがオクチルグルコシド、ＰＥＧがポリエチレングリコールを示す。
【図１３】 rＨＭＷ１抽出物のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は予備染色したタンパク質分子量マーカー、レーン２はＥ.coli全細胞溶解物、レーン３はＴris-ＨＣl/ＮaＣl抽出液中の可溶性タンパク質、レーン４はＴris-ＨＣl/Ｔriton Ｘ-100/ＥＤＴＡ抽出液中の可溶性タンパク質、レーン５はＴris-ＨＣl/オクチルグルコシド抽出液中の可溶性タンパク質、レーン６はＴris-ＨＣl/オクチルグルコシド抽出後のペレット、レーン７は２ＭグアニジンＨＣl中の不溶性タンパク質、レーン８は７％ ＰＥＧ沈殿の上清液、レーン９は７％ ＰＥＧ沈殿のペレット、レーン 10 は 50 ％硫酸アンモニウム沈殿の相間ペレット、レーン 11 は下相に回収されるタンパク質、レーン 12 は上相に回収されるタンパク質を示す。
【図１４】 パネルＡおよびＢを含み、精製したrＨＭＷ１およびrＨＭＷ２のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１５】 構築体Ｔ７ hｍｗＡＢＣ/cer/kanＲから得られ、20 ％グリセリン存在下、-20 ℃に保存されたrＨＭＷ１の安定性を示すＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を含んだ図である。
【図１６】 パネルＡおよびＢを含み、様々な構築体から産生されたrＨＭＷ１Ａタンパク質の免疫原性を示す図である。
【図１７】 非分類型Ｈ.influenzaeの染色体ＤＮＡ由来の、追加hｍｗ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す図である(配列番号 20、21、22、23 および 24)。
【図１８】 ＮＴＨi菌株Joycから得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 25)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 26)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 27、アミノ酸配列は配列番号 28)。
【図１９】 ＮＴＨi菌株Joycから得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 29)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 30)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 31、アミノ酸配列は配列番号 32)。
【図２０】 ＮＴＨi菌株Ｋ１から得られる欠陥hｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 33)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 34、35)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 36、アミノ酸配列は配列番号 37、35)。
【図２１】 ＮＴＨi菌株Ｋ 21 から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 38)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 39)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 40、アミノ酸配列は配列番号 41)。
【図２２】 ＮＴＨi菌株ＬＣＤＣ２から得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 42)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 43)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 44、アミノ酸配列は配列番号 45)。
【図２３】 ＮＴＨi菌株ＬＣＤＣ２から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 46)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 47)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 48、アミノ酸配列は配列番号 49)。
【図２４】 ＮＴＨi菌株ＰＭＨ１から得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 50)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 51)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 52、アミノ酸配列は配列番号 53)。
【図２５】 ＮＴＨi菌株ＰＭＨ１から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 54)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 55)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 56、アミノ酸配列は配列番号 57)。
【図２６】 ＮＴＨi菌株 15 から得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 58)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 59)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 60、アミノ酸配列は配列番号 61)。
【図２７】 ＮＴＨi菌株 15 から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 62)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 63)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 64、アミノ酸配列は配列番号 65)。
【図２８】 ＮＴＨi菌株 12 から得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 66)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 67)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 68、アミノ酸配列は配列番号 69)。
【図２９】 ＮＴＨi菌株 12 から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 70)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 71)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 72、アミノ酸配列は配列番号 73)。
【図３０】 推定されるＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質配列(配列番号 26、30、34、35、39、43、47、51、55、59、63)を公表された菌株 12 のＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質配列(米国特許第 5603938 号)(配列番号 67、71)と一直線に並べた図である。
【図３１】 ＰＣＲ増幅されたhｍｗＡ遺伝子がhｍｗ１か、またはhｍｗ２であるかを決定するために使用されるオリゴヌクレオチド(配列番号 74、75、76、77、78、79、80、81)を示す図である。
【図３２Ａ】 任意のhｍｗＡ遺伝子を挿入することのできる属共通のＴ７ hｍｗＡＢＣ発現プラスミドJＢ-2646-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba Iを示す。他の略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリフォスファターゼを示す。
【図３２Ｂ】 図 32 Ａの構築方式でhｍｗ１Ａの３'-末端およびhｍｗ１Ｂの５'-末端をＰＣＲ増幅するために使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号 82、83、84、85、86、87、88、89、90)を示す図である。
【図３３Ａ】 ＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子およびＮＴＨI 12 hｍｗＢＣ遺伝子のキメラＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子を含むＤＳ-2334-５の構築を示す図である。制限酵素部位は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＮがＮde I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリフォスファターゼを示す。
【図３３Ｂ】 図 33 Ａに示すように構築される属共通の発現ベクターに発現するために、ＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号 91、92、93、94、95)を示す図である。
【図３４】 Ｔ７ hｍｗＡ/Ｔ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子およびＥ.coli cer遺伝子を含むＤＳ-2400-13 の構築を示す図である。制限酵素部位は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＴetＲがテトラサイクリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリフォスファターゼを示す。
(関連出願の参照)
本出願は、1998年10月７日に出願された出願第０９/１６７,５６８号の一部継続出願である。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は分子遺伝子学の分野に関し、詳細には、組換えＨaeｍophilus influenzae高分子量タンパク質の生産と、それに使用される核酸分子およびベクターに関する。
【０００３】
(発明の背景)
被包性Ｈaeｍophilus influenzae Ｂ型菌株は、細菌性髄膜炎およびその他の小児に生じる侵襲性感染の、主な原因である。しかし、非被包性の、または非分類型Ｈ.influenzae(ＮＴＨi)は、中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎、および気管気管支炎を含めた広い範囲にわたるヒトの病気の原因である。ジフテリアトキソイド(参考文献１ 本出願全体を通し、本発明が関係する現況技術をより十分に記述するために括弧内に示した種々の参考文献が参照される。各引例に関する全書誌情報を本明細書の終わりに示す。これらの参考文献の開示を、参照により本発明の開示に組み込む。)、破傷風トキソイド(参考文献２および米国特許第４,４９６,５３８号)、またはＮeisseria ｍeningitidis(髄膜炎菌)外膜タンパク質(参考文献３)に共有結合させたＨ.influenzae Ｂ型きょう膜多糖類をベースにしたワクチンは、Ｈ.influenzae Ｂ型により誘発された髄膜炎を軽くするのに効果的であったが、ＮＴＨi誘発型の病気には効果的ではなかった(参考文献４)。
【０００４】
中耳炎は幼児期の最も一般的な疾病であり、２才未満の子供全ての 60％から 70％が耳の感染症を１回から３回経験している(参考文献５)。慢性中耳炎は、子供の聴覚障害、言語障害、および認識障害の原因になる。急性中耳炎の症例の約30％、そして慢性中耳炎の約60％は、Ｈ.influenzae感染が原因である。米国だけで、中耳炎の治療には、抗生物質と外科的処置、例えば扁桃摘出やアデノイド切除、中耳腔換気用チューブの挿入などに、１年当たり 10億ドルから 20億ドルかかる。さらに、言語療法や特殊教育学級などの補助療法に、１年当たり 300億ドルが費やされると見積もられている。さらに、中耳炎を引き起こす生物体の多くは、抗生物質による治療に対して耐性を持つようになる。そのため中耳炎に有効な予防ワクチンが望まれている。
【０００５】
ＮＴＨiに自然感染している間、抗体反応を刺激する表面露出状態の外膜タンパク質は、殺菌性抗体および/または防御抗体の重要な標的となる可能性があり、したがってこのタンパク質はワクチンの候補になり得る。ＢarenkaｍpおよびＢodor(参考文献６)は、ＮＴＨiが原因で中耳炎に罹った子供の回復期血清が、高分子量(ＨＭＷ)のタンパク質に対する抗体を含有していることを実証した。ＮＴＨi菌株の約70％から 75％がＨＭＷタンパク質を発現し、これらの菌株のほとんどが、hｍｗ１ＡＢＣおよび hｍｗ２ＡＢＣと呼ばれる２種の遺伝子クラスタを含有している。hｍｗＡ遺伝子は構造ＨＭＷＡタンパク質をコードし、hｍｗＢ遺伝子および hｍｗＣ遺伝子は、ＨＭＷＡタンパク質のプロセッシングおよび分泌に関与する補助遺伝子である(参考文献７、８、９；米国特許第５,６０３,９３８号；ＷＯ９７/３６９１４)。ＨＭＷＡタンパク質は、ヒト上皮細胞への付着を仲介する付着因子であることが実証されており(参考文献 10)、適正にプロセッシングされたＨＭＷＡタンパク質のみが有効な付着因子になると考えられる(参考文献８)。天然のＨＭＷ１Ａタンパク質とＨＭＷ２Ａタンパク質の混合物で免疫化した結果、中耳炎のチンチラ胞内攻撃誘発モデルで防御が得られた(参考文献 11；ＷＯ９７/３６９１４)。ＮＴＨi菌株 12 からの原型 hｍｗ１Ａ遺伝子は、35kＤa のアミノ末端フラグメントの切断によって処理された 160kＤa のＨＭＷ１Ａタンパク質をコードし、成熟した 125kＤa のＨＭＷ１Ａタンパク質を発生させる。同様に、ＮＴＨi菌株 12hｍｗ２Ａ遺伝子は、ほぼ同一の 35kＤa のアミノ末端フラグメントを切断することによって処理された 155kＤa のＨＭＷ２Ａタンパク質をコードし、成熟した 120kＤa のＨＭＷ２Ａタンパク質を産生する。
【０００６】
プラスミド pＨＭＷ１-15(参考文献８)は、pＴ7-7 骨格を有し(参考文献 12)、５'-および３'-フランキング領域を有する完全なＮＴＨi菌株 12 hｍｗ1ＡＢＣオペロンを含有する。hｍｗ1Ａ構造遺伝子のＴ７プロモーターとその始まりの間に位置付けられた、約400bp の５'-フランキング配列がある。プラスミドpＨＭＷ２-21(参考文献 10)は、pＴ7-7 骨格を有し、５'-および３'-フランキング配列を有する完全なhｍｗ２ＡＢＣオペロンを含有する。hｍｗ２Ａ構造遺伝子のＴ７プロモーターとその始まりの間に位置付けられた、約800bp の５'-フランキング配列がある。rＨＭＷ1Ａタンパク質および rＨＭＷ２Ａタンパク質は、プラスミド pＨＭＷ１-15 およびプラスミドpＨＭＷ２-21 から比較的低い収量で産生される。
【０００７】
Ｈ.influenzae hｍｗ1 ＡＢＣ遺伝子または hｍｗ２ ＡＢＣ遺伝子に遺伝子操作を行って、35kＤaのリーダー配列をコードする配列を欠失させることにより、成熟組換えＨＭＡ1Ａタンパク質またはＨＭＷ２Ａタンパク質を産生することができるが、これは通常、Ｈ.influenzae でのプロセッシングによって除去されるものである。リーダー配列が欠失したので、Ｈ.influenzae で成熟ＨＭＷ1Ａ構造タンパク質および成熟ＨＭＷ２Ａ構造タンパク質のプロセッシングおよび分泌に役立つ hｍｗ1ＢＣ遺伝子または hｍｗ２ＢＣ遺伝子の必要が無くなる(参考文献９)。rＨＭＷ1Ａタンパク質または rＨＭＷ２Ａタンパク質の収量は、リーダー配列を欠失させ遺伝子をプロセッシングすることによって著しく増加させることができるが、精製された組換えタンパク質には防御能が無い。本明細書で述べるように、hｍｗ1ＢＣ遺伝子および hｍｗ２ＢＣ遺伝子またはそれらのタンパク質産物は、明らかに rＨＭＷ1Ａタンパク質および rＨＭＷ２Ａタンパク質の防御能に寄与する。通常なら余分な補助遺伝子に関するこのような要件は意外なことである。
【０００８】
Ｅ.coli cer 遺伝子は、多重化を防止することによってプラスミドを安定化すると考えられている(参考文献 13)。発現ベクターが多量に挿入された場合、cer 遺伝子を使用してプラスミドを安定化することができる。
【０００９】
(発明の概要)
本発明は、ある特定の核酸分子とそれを含有するベクターを提供することによって、防御能のある組換え非分類型Ｈ.influenzae 高分子量タンパク質を提供することを対象とする。
【００１０】
今回、防御能のある非分類型Ｈaeｍophilus の組換え高分子量(ＨＭＷ)タンパク質を得るために、成熟ＨＭＷタンパク質をコードするオペロンのＡ部分のセグメントのみ含有するベクター、すなわちリーダー配列をコードするＡ遺伝子のセグメントとオペロンのＢ部分およびＣ部分が欠けているベクターを提供することが必要であることがわかった。また、そのベクターに、成熟タンパク質、Ｅ.coli からの cer 遺伝子、またはこれらの両方をコードする少なくとも１つの追加のセグメントを含めることによって、成熟タンパク質の発現のレベルを高めることができることもわかった。
【００１１】
したがって本発明の一態様では、Ｅ.coli で機能性があり、かつＡ、Ｂ、およびＣ遺伝子を含む非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の修飾オペロンに作働するように結合されたプロモーターを含む核酸分子が提供されるが、このオペロンのＡ遺伝子は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の成熟高分子量タンパク質をコードする核酸配列のみを含有し、そのためリーダー配列をコードするＡ遺伝子の部分は存在しない。
【００１２】
任意の適切なプロモーターを使用して、Ｅ.coli に成熟ＨＭＷタンパク質を発現させることができる。しかし、Ｔ７プロモーターを使用することが好ましい。
【００１３】
コードされた成熟高分子量タンパク質は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株のＨＭＷ１タンパク質またはＨＭＷ２タンパク質でよい。この非分類型Ｈaeｍophilus菌株は、非分類型Ｈaeｍophilus influenzaeの菌株 12、Joyc、Ｋ21、ＬＣＤＣ２、ＰＭＨ１、および 15 からなる群から選択することができる。
【００１４】
また本発明は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の、対応するＨＭＷ１タンパク質およびＨＭＷ２タンパク質の推定アミノ酸配列と共に、予め単離されず、精製されず、発現していないある特定の非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株の hｍｗ1Ａおよび/またはhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列も提供する。
【００１５】
したがって、本発明の別の態様では、
(a)図18、19、20、21、22、23、24、25、26、および 27(配列番号: 25、27、29、32、33、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64)に示されるものからなる群から選択されたＤＮＡ配列またはそれらと相補的な配列、あるいは
(b)図18、19、20、21、22、23、24、25、26、および 27(配列番号: 26、28、30、32、34、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65)に示されるものからなる群から選択されたアミノ酸配列を有する高分子量タンパク質をコードするＤＮＡ配列、またはそれらと相補的な配列
を有する、非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株の高分子量(ＨＭＷ)タンパク質をコードする、単離され精製された核酸分子が提供される。
【００１６】
本発明の第１の態様の修飾オペロンは、配列(配列番号：27、31、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72)をコードする成熟タンパク質、または図 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、および 29 に示されるアミノ酸配列(配列番号： 28、32、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73)を有する成熟タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むことができる。
【００１７】
本発明の第１の態様により提供される核酸分子は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株のオペロンの成熟コード領域のみ、Ｅ.coli の cer 遺伝子、またはそのようなセグメントの両方の少なくとも１つの追加のコピーを含有する配列を、さらに含むことができる。
【００１８】
本発明の第１の態様により提供される核酸分子は、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の成熟防御高分子タンパク質の発現を目的として、Ｅ.coli の形質転換を行うために、ベクター、通常はプラスミドベクターに組み込むことができる。
【００１９】
この成熟防御高分子タンパク質の発現を目的とするプラスミドベクターは、
ＤＳ-1046-1-1
JＢ-2507-7
ＢＫ-86-1-1
ＢＫ-35-4
ＢＫ-76-1-1
ＤＳ-2334-5
ＤＳ-2400-13
からなる群から選択されるプラスミドの識別形質を有することができる。
【００２０】
そのようなプラスミドの構造および調製の詳細を、図および実施例に示す。
【００２１】
本発明は、その別の態様において、本明細書で提供されるベクターにより形質転換され、かつ非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の防御高分子量タンパク質を発現するＥ.coli の菌株にまで範囲を広げる。本発明はさらに、形質転換されたＥ.coli によって産生可能な、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の単離され精製された組換え防御高分子量タンパク質、その免疫原性セグメント、またはその類似体を含む。
【００２２】
本発明はさらに、その追加の態様において、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の防御高分子量タンパク質を産生する組換え方法を含み、この方法は、
本発明の第１の態様で提供された核酸分子を含むベクターでＥ.coli を形質転換すること、
Ｅ.coli を成長させて、コードした成熟高分子量(ＨＭＷ)タンパク質を発現させること、および
発現したＨＭＷタンパク質を単離し精製することを含む。
【００２３】
非分類型Ｈaeｍophilus 菌株は前記菌株のいずれかでよく、高分子量タンパク質は、その他のタンパク質で汚染されていない形で提供されるＨＭＷ１タンパク質またはＨＭＷ２タンパク質でよい。精製ステップは、ＨＭＷ Ａタンパク質とＢタンパク質およびＣタンパク質との分離を含むことができる。
【００２４】
本発明は、その追加の態様において、非分類型Ｈaeｍophilus 菌株の単離され精製された防御ＨＭＷ１タンパク質であって、非分類型Ｈaeｍophilus の同じ菌株のＨＭＷ２タンパク質で汚染されていない防御ＨＭＷ１タンパク質を提供する。
【００２５】
さらに別の態様で、本発明は、非分類型Ｈaeｍophilus の単離され精製された防御ＨＭＷ２タンパク質であって、非分類型Ｈaeｍophilus の同じ菌株のＨＭＷ１タンパク質で汚染されていない防御ＨＭＷ２タンパク質を提供する。
【００２６】
ＨＭＷ１タンパク質またはＨＭＷ２タンパク質は、上述の非分類型Ｈaeｍophilus 菌株のいずれかからのものでよく、配列番号 28、32、37、41、45、49、53、57、61、65、69、または 73 を有するものでよい。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、本明細書で提供される少なくとも１種の核酸分子、本明細書で提供される少なくとも１種の組換えＨＭＷタンパク質、または本明細書で提供される少なくとも１種の新奇なＨＭＷタンパク質からなる群から選択された少なくとも１種の免疫学上活性な成分と、医薬品として許容されるこれらの担体を含む、免疫原性組成物が提供される。少なくとも１種の活性成分は、宿主に投与されると免疫応答を引き起こす。
【００２８】
本明細書で提供される免疫原性組成物は、Ｈ.influenzae によって引き起こされる病気を予防するため、宿主に in vivo 投与するためのワクチンとして処方することができる。このような目的で、組成物を、ミクロ粒子、ＩＳＣＯＭ、またはリポソーム製剤として処方することができる。免疫原性組成物は、免疫系の特定の細胞または粘膜表面に送達するための標的化分子と組み合わせて提供することができる。本発明の免疫原性組成物(ワクチンを含む)は、少なくとも１つのその他の免疫原性材料または免疫促進材料をさらに含むことができ、この免疫促進材料は、少なくとも１つのアジュバントまたは少なくとも１つのサイトカインでよい。
【００２９】
本発明で使用される適切なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ21、Ｑuil Ａ、これらの誘導体および成分、ＩＳＣＯＭマトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、グリコリピド類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミールジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ-chol、ＤＤＢＡ、およびリポタンパク質、およびその他のアジュバントが含まれる(しかしこれらに限定するものではない)。アジュバントの有利な組合せは、1994年６月16日出願の同時係属の米国特許出願第 08/261,194 号および 1995年６月７日出願の第 08/483,856 号に記載されているが、これは本出願の譲受人に譲渡されたものであり、その開示を参照により本明細書に組み込む(1995年11月21日に公表されたＷＯ 95/34308)。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、宿主に免疫応答を生じさせる方法であって、ヒトなどの罹患した宿主に有効な量の上記免疫原性組成物を投与するステップを含む方法が提供される。免疫応答は、体液性または細胞性の免疫応答でよく、Ｈaeｍophilus により引き起こされる病気の予防ができる。病気の予防が可能な宿主には、ヒトを含めた霊長類が含まれる。
【００３１】
ＨＭＷ１タンパク質およびＨＭＷ２タンパク質をコードするオペロンのＢ部分およびＣ部分の核酸配列は、非分類型Ｈaeｍophilus 種の核酸配列中に高レベルで保存されており、Ｅ.coli などの形質転換した宿主からＨＭＷ１ＡまたはＨＭＷ２Ａを発現させる目的で、非分類型Ｈaeｍophilusの様々な菌株からの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質またはＨＭＷ２Ａタンパク質をコードする核酸配列を受容するための万能プラスミドベクター上に提供できることがわかった。
【００３２】
したがって、本発明のさらに別の態様では、非分類型Ｈaeｍophilus菌株の高分子量タンパク質を発現させるためのプラスミドベクターであって、Ｔ７プロモーター、クローニング部位、非分類型Ｈaeｍophilus菌株のhｍｗオペロンのＢ部分およびＣ部分を含むベクターが提供される。プラスミドは、Ｅ.coli cer遺伝子を含有することもできる。プラスミドベクターは、プラスミドJＢ-2646-１でよい。
【００３３】
本発明によれば、その様々な態様において、非分類型Ｈaeｍophilus菌株に感染して引き起こされる病気の予防が可能な免疫原性組成物を提供するのに有用な、非分類型Ｈaeｍophilusの防御高分子量タンパク質の産生が可能になる。
【００３４】
本発明は、図面を参考とした次の記述によって更に理解されるであろう。
【００３５】
(発明の一般的な説明)
本発明の実施形態によって代表されるように、ＨＭＷ１Ａ、ＨＭＷ１Ｂ、ＨＭＷ１Ｃ、ＨＭＷ２Ａ、ＨＭＷ２ＢまたはＨＭＷ２Ｃタンパク質に対しコードする少なくとも一部分を含む、精製され、単離された核酸分子(ＤＮＡ分子の形態をしている)を得るために、hｍｗ遺伝子を有する任意のＨaeｍophilus菌株が好都合に使用される。このような菌株は、一般に臨床源およびＡｍerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionのような細菌培養収集機関から入手できる。非分類型Ｈaeｍophilusの適切な菌株は、
非分類型Ｈ.influenzae 12 菌株、
非分類型Ｈ.influenzae Joyc菌株、
非分類型Ｈ.influenzae Ｋ１菌株、
非分類型Ｈ.influenzae Ｋ21 菌株、
非分類型Ｈ.influenzae ＬＣＤＣ２菌株、
非分類型Ｈ.influenzae ＰＭＨ１菌株、または
非分類型Ｈ.influenzae 15 菌株
を含む。
【００３６】
この出願において、「ＨＭＷタンパク質」という用語は、非分類型Ｈaeｍophilusの様々な菌株に見出されるようなアミノ酸配列に自然発生した変異を有し、約100 から約150 までの見掛け分子量を特徴とするタンパク質を含む一群のＨＭＷタンパク質を定義するために使用される。
【００３７】
以下の実施例と共に、本発明の原理を説明するために有用な、本発明の現時点で好ましい実施形態をこれから詳述する。本発明の詳細な説明を以下の節に分けて行うが、その目的は開示を明確にするためであって、限定するためではない。
【００３８】
1.Ｅ.coliからの組換えＨＭＷタンパク質の改良生産
Ｈ.influenzae中での生来のＨＭＷ１ＡまたはＨＭＷ２Ａタンパク質の産生は非常に少ない。プラスミドpＨＭＷ１-15 およびpＨＭＷ２-21(参考文献８、10)は、ＮＴＨi 12 菌株から得られ、発現ベクターpＴ７-７中にクローン化された完全なhｍｗ１ＡＢＣおよびhｍｗ２ＡＢＣオペロンを含んでいる。これらのプラスミドからの組換えrＨＭＷ１ＡまたはrＨＭＷ２Ａタンパク質の生産は、恐らくＴ７プロモーターとhｍｗＡ遺伝子の開始コドンとの間に挿入された５'-フランキング配列およびhｍｗプロモーター配列のために、少ない。５'-フランキング配列およびhｍｗプロモーター配列の除去によって、プラスミドＤＳ-1091-２およびＤＳ-1094-２(図１および２)から生産されるrＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａタンパク質の収量はわずかに改善された。
【００３９】
Ｈ.influenzae中で生産されるとき、生来のＨＭＷＡタンパク質は、35 kＤaのＮ末端断片が除かれてプロセッシングされ、分泌される。Ｅ.coliによるrＨＭＷＡタンパク質の正しいプロセッシングと分泌に頼るのではなく、Ｎ末端 35 kＤa断片をコード化する遺伝子配列がhｍｗ１ＡＢＣおよびhｍｗ２ＡＢＣの各遺伝子から遺伝学的に除去された。生成した新しい構築体、ＤＳ-1046-１-１およびＤＳ-1174-４(図３および４)においては、rＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａ成熟タンパク質の生産が促進された。rＨＭＷ ＢＣタンパク質も過剰に生産された。pＴ７-７ベクター中へのhｍｗ１ＡＢＣおよびhｍｗ２ＡＢＣ遺伝子挿入体は、依然として各々約 8.6 kbと約 8.3 kbであった。ＨＭＷＡタンパク質は構造タンパク質であり、防御タンパク質であるので、hｍｗＢＣ遺伝子の一部または全部を削除することによって、その遺伝子挿入体の大きさを減らすことができると考えられた。一般により小さな挿入体を有する発現ベクターは、組換えタンパク質を生産する上でより効果的であり、rＨＭＷＢＣタンパク質の過剰生産は望ましくないと考えられた。
【００４０】
ベクターＤＳ-1200-３、ＤＳ-1122-２、JＢ-2330-７およびＤＳ-2084-３(図４、５、６および８)において、hｍｗＢＣ遺伝子を削除したとき、rＨＭＷＡタンパク質の生産はわずかに改善された。しかし、rＨＭＷＢとrＨＭＷＣのタンパク質の生産が除かれ、タンパク質精製プロセスが簡潔になった。ベクターJＢ-2369-６およびＤＳ-2084-１(図７および８)からrＨＭＷＡタンパク質を発現させるために、Ｔ７ hｍｗＡ遺伝子カセットのタンデムコピーを用いたとき、その生産はわずかに改善された。
【００４１】
この系列の発現ベクターの構築によって、Ｅ.coliからrＨＭＷ１およびrＨＭＷ２タンパク質の生産を増加させることができることが判明した。しかし、鼻咽腔コロニー形成防御モデルで試験したとき、改良したベクターから生産されたrＨＭＷＡタンパク質は防御性を示さなかった。生来のＨＭＷ１Ａ＋ＨＭＷ２Ａタンパク質混合物、または完全なhｍｗＡＢＣ遺伝子を含む比較的低収量のベクターから生産されたrＨＭＷＡタンパク質だけが防御性を示した。
【００４２】
2.組換え防御性ＨＭＷタンパク質を生産するための発現ベクターの修飾
完全な長さのＨＭＷ１Ａ(ＤＳ-1091-２)またはＨＭＷ２Ａ(ＤＳ-1094-２)のタンパク質をコード化するhｍｗＡＢＣ遺伝子を含み、そのプロセッシングをＥ.coliに依存する発現ベクターは、動物モデルで試験するのに十分なタンパク質を生産しなかった。成熟ＨＭＷ１Ａ(ＤＳ-1046-１-１)またはＨＭＷ２Ａ(ＤＳ-1174-４)タンパク質をコード化するhｍｗＡＢＣ遺伝子を含む発現ベクターは、中位の収量で防御性rＨＭＷＡタンパク質を発現した。rＨＭＷＡタンパク質だけを過剰に生産したベクターは、防御性抗原を産生しなかった。
【００４３】
防御性rＨＭＷＡタンパク質の収量を高めるために、２通りの手法を試みた。成熟rＨＭＷ１Ａタンパク質を発現するＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを含むベクターに、Ｅ.coli cer 遺伝子を導入した。cer遺伝子は多重化の防止によってプラスミドを安定化させると考えられ、その存在は大きなhｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを含む発現ベクターを安定化することができる。cer 遺伝子の存在は、組換えタンパク質の生産も増加させることがあることも判明した。Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer構築体(図10)から過剰生産されたrＨＭＷ１Ａ抗原は、鼻咽腔コロニー形成モデルで防御性を示した(表２)。
【００４４】
防御性rＨＭＷＡタンパク質を過剰生産する第２の手法は、rＨＭＷＢＣタンパク質の存在下でrＨＭＷＡタンパク質を過剰生産するベクターを構築することであった。成熟rＨＭＷ１Ａタンパク質を発現するＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを含むベクターに、追加のＴ７ hｍｗＡ遺伝子カセットを追加した。Ｔ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ構築体(図９)から過剰生産されたrＨＭＷ１Ａ抗原は、鼻咽腔コロニー形成モデルで防御性を示した(表２)。
【００４５】
Ｔ７ hｍｗＡ/Ｔ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子のタンデムコピーを同一プラスミドＤＳ-2400-13 上のＥ.coli cer 遺伝子と同時発現するように、前記２手法を組み合せることができる(図34)。
【００４６】
3.追加hｍｗＡ遺伝子のクローニングおよび配列分析
hｍｗＡ遺伝子およびコード化タンパク質の配列は可変である。完全に有効なワクチンを生産するためには、非分類型Ｈaeｍophilusの多種の菌株から創られるrＨＭＷＡタンパク質を使用することが必要である。非分類型Ｈaeｍophilus influenzaeの数菌株から得たhｍｗ１Ａおよび/またはhｍｗ２Ａ遺伝子をＰＣＲ増幅し、かつその配列を決定した。図18 から 26 は、各々Joyc菌株からのhｍｗ１Ａ遺伝子、Joyc菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子、Ｋ１菌株からの欠陥hｍｗ１Ａ遺伝子、Ｋ21 菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子、ＬＣＤＣ２菌株からのhｍｗ１Ａ遺伝子、ＬＣＤＣ２菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子、ＰＭＨ１菌株からのhｍｗ１Ａ遺伝子、ＰＭＨ１菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子、15 菌株からのhｍｗ１Ａ遺伝子および 15 菌株からのhｍｗ２Ａ遺伝子に対するヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。推定タンパク質配列を前記の 12 菌株ＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質配列(図 28 および 29)と並べると、配列の保存および分岐の両領域が認識される(図 30)。このような情報は、ワクチン接種や診断の目的でペプチドを創るために、エピト―プとなり得るものの確認に有用である。様々な非分類型Ｈaeｍophilus菌株から得られる成熟ＨＭＷタンパク質の分子量を表３に含めている。
【００４７】
4.組換え防御性ＨＭＷタンパク質を生産するための属共通発現ベクターの構築
非分類型Ｈaeｍophilus菌株から新しいhｍｗＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、上記のように配列決定することができる。しかし、防御性rＨＭＷＡ抗原を生産するためには、hｍｗＡ遺伝子をhｍｗＢＣ遺伝子の存在下で発現しなければならない。原型 12 菌株から得られる付属ＨＭＷ１ＢおよびＨＭＷ２Ｂタンパク質の推定配列は、99 ％同一であることが判明し、一方同一菌株から得られるＨＭＷ１ＣおよびＨＭＷ２Ｃタンパク質の推定配列は 96 ％同一であった(参考文献８、米国特許第 5603938 号)。hｍｗＢＣ遺伝子の高い保存性から、ある原型菌株から得られるhｍｗＢＣ遺伝子を用いて属共通の発現ベクターを構築し、そのベクター中に発現させるために、任意のhｍｗＡ遺伝子をそのベクターに導入することが可能となる。図 32 は、Ｔ７プロモーター、hｍｗＡ遺伝子導入のためのＸba Iクローニング部位、12 菌株hｍｗ１ＢＣ遺伝子、およびＥ.coli cer遺伝子を含有する属共通発現ベクター(JＢ-2646-１)の構築を図示する。図 33 は、属共通発現ベクター中でのキメラＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットの構築を図示し、そこではＰＣＲ増幅ＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子が 12 菌株hｍｗ１ＢＣ遺伝子と組み合されることによりプラスミドＤＳ-2334-５を生成する。キメラ構築体からの遺伝子の発現は、ＮＴＨi 12 菌株のhｍｗ１Ａおよびhｍｗ２Ａ遺伝子に基くＴ７ hｍｗ１ＡＢＣまたはＴ７ hｍｗ２ＡＢＣ構築体に対して見た場合と同様であった。
【００４８】
本発明の様々な実施形態がワクチン接種、診断、Ｈaeｍophilus感染の処置および免疫剤の創製の各分野での応用に使用できることは、当分野の技術者に明白である。このような用途に関する更なる非限定的な考察を以下に提示する。
【００４９】
5.ワクチンの調製および使用
ワクチンとして使用するのに適当な免疫原性組成物は、非分類型Ｈaeｍophilus菌株の免疫原性高分子量(ＨＭＷ)タンパク質、その免疫原性類縁体および断片、および/または本明細書に開示したような免疫原性ペプチドから調製される。そのワクチンは、抗ＨＭＷ抗体およびオプソニン作用または殺菌作用を示す抗体を含む抗体を産生する免疫反応を引起す。ワクチンを含め、免疫原性組成物は注入剤、即ち液体溶液または乳濁液として調製され得る。ＨＭＷタンパク質、その免疫原性類縁体および断片、および/または免疫原性ペプチドを、ＨＭＷタンパク質、その免疫原性断片、類縁体または免疫原性ペプチドと適合性のある製剤上許容可能な賦形剤と混合してもよい。このような賦形剤は水、塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよびその組合せを含む。免疫原性組成物およびワクチンは、さらに湿潤剤または乳化剤、pＨ緩衝剤、ワクチンの有効性を高めるためのアジュバント等の補助物質を含有してもよい。免疫原性組成物およびワクチンは、非経口的に、即ち皮下注射または筋肉内注射によって投与される。あるいは、本発明に従って形成される免疫原性組成物は、粘膜表面の免疫反応を引起すように製剤され、送達されてもよい。したがって、免疫原性組成物を、例えば鼻腔または経口(胃内)ルートによって粘膜表面に投与してもよい。免疫系の特定の細胞または粘膜表面に送達するために、免疫原性組成物を標的指向性分子と併用してもよい。このような幾つかの標的指向性分子は、ビタミンＢ 12、ＷＯ 92/17167(Ｂiotech Ａustralia Ｐty.Ｌtd.)に記載されているような細菌毒素の断片、および米国特許第 5194254 号(Ｂarber等)に記載されているようなモノクローナル抗体を含む。あるいは、坐薬や経口製剤を含む他の投与方式が好ましいかもしれない。坐薬に対しては、結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む。経口製剤は、例えば製剤用のサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の普通に使用される賦形剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続性放出製剤または粉末の形態を採り、約１から 95 ％のＨＭＷタンパク質、断片、類縁体および/またはペプチドを含有する。
【００５０】
ワクチンは調剤処方に適合した方式で、かつ治療上有効で、防御性で免疫原性を示すような量を投与される。投与すべき量は、例えば抗体を合成し、必要であれば細胞性免疫反応を起こすその個人の免疫系の能力を含め、治療される対象者に依存する。必要とされる活性成分の精確な投与量は、担当開業医の判断次第である。しかし、適当な投与量範囲は当分野の技術者によって容易に決定することができ、高分子量タンパク質、その類縁体および断片、および/またはペプチドの数マイクログラムの位数である。初回投与および追加投与に対する適当な投与計画も変動し得るが、初回投与とその後の投与を含み得る。ワクチンの投与量は投与ルートにも依存し、宿主の大きさに従って変化する。
【００５１】
非分類型ＨaeｍophilusのＨＭＷタンパク質をコード化する核酸分子も、ＤＮＡの直接投与、例えば遺伝学的免疫形成のために注射するか、またはサルモネラ、ＢＣＧ、アデノウィルス、ポックスウィルス、ワクシニアまたはポリオウィルス等のその核酸分子を含有した生体ベクターを構築することによって、免疫形成のために直接使用されてもよい。免疫系に異種抗原を運ぶために使用されてきた幾つかの生体ベクターに関する考察は、例えばＯ'Ｈagan(1992 年)(参考文献 17)の中に含まれている。遺伝学的免疫形成のために被験対象中にＤＮＡを直接注射する方法が、例えばＵlｍer等、1993 年(参考文献 18)の中に記載されている。
【００５２】
リン酸緩衝塩水中 0.05 から 1.0 パーセント溶液として普通使用するアジュバントと共に、抗原を同時投与した場合、免疫原性をかなり改善することができる。アジュバントは抗原の免疫原性を高めるが、それ自体は必ずしも免疫原性を示さない。アジュバントは、貯蔵効果を生むために投与部位近傍に抗原を局在させることによって作用し、免疫系の細胞に対する抗原の遅い持続的な放出を促進する。アジュバントは抗原貯蔵部に免疫系の細胞を引寄せ、免疫反応を引起すようにこのような細胞を刺激することもできる。
【００５３】
例えばワクチンに対する宿主免疫反応を改善するために、免疫刺激剤即ちアジュバントが長年にわたり使用されてきた。リポ多糖類のような内在性アジュバントは、通常ワクチンとして用いられる死滅または弱体化細菌の成分である。外来性アジュバントは、抗原に普通は非共有結合で結合され、宿主免疫反応を高めるように処方された免疫調節剤である。したがって、非経口的に送達された抗原に対する免疫反応を高めるアジュバントが確認された。しかし、これらのアジュバントの一部は有毒であり、望ましくない副作用を引起すことができ、ヒトや多くの動物に使用するには不適当である。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム(普通アラムと総称される)だけしか、ヒトや動物のワクチン中のアジュバントとして日常的に使用されていない。ジフテリアおよび破傷風のトキソイドに対する抗体反応を増加させる上で、アラムの有効性が十分に確立されている。
【００５４】
広範囲の外来性アジュバントが、抗原に対する効力のある免疫反応を引起すことができる。これらのアジュバントは、膜タンパク質抗原と複合したサポニン(免疫刺激複合体)、鉱油を含んだpluronicポリマー、殺菌マイコバクテリアと鉱油、完全フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド(ＭＤＰ)やリポ多糖(ＬＰＳ)およびリピッドＡのような細菌生成物、およびリポソ―ムを含む。
【００５５】
体液性免疫反応(ＨIＲ)および細胞性免疫(ＣＭI)を効果的に誘発するためには、免疫原をアジュバント中に乳化する。多くのアジュバントは有毒で、肉芽腫、急性および慢性の炎症(完全フロイントアジュバント、ＦＣＡ)、細胞溶解(サポニンおよびpluronicポリマー)および発熱性、関節炎および前部ブドウ膜炎(ＬＰＳおよびＭＤＰ)を誘発する。ＦＣＡは優れたアジュバントで研究では広く使用されているが、毒性のためにヒトや動物のワクチンに使用することは認可されていない。
【００５６】
理想的なアジュバントの望ましい特性は、
(１)毒性がないこと、
(２)長期に持続する免疫反応を刺激することができること、
(３)製造の簡潔さと長期保存時の安定性、
(４)必要ならば、様々なルートで投与される抗原に対して細胞性免疫も体液性免疫反応も引起すことができること、
(５)他のアジュバントとの相助作用、
(６)抗原提示細胞(ＡＰＣ)の集団と選択的に相互作用をすることができること、
(７)適当なＴH１またはＴH２細胞特異的免疫反応を特異的に引起すことができること、および
(８)抗原に対する適当な抗体イソタイプレベル(例えばIgＡ)を選択的に増加させることができることを含む。
【００５７】
1989年８月８日にＬockhoff等に与えられ、参考のために本明細書に挿入されている米国特許第 4855283 号は、免疫調節剤またはアジュバントとして、その各々が糖残基においてアミノ酸で置換されているＮ-グリコシルアミド、Ｎ-グリコシルウレアおよびＮ-グリコシルカルバメートを含む糖脂質類縁体を教示している。したがって、Ｌockhoff等 1991 年(参考文献 19)は、スフィンゴ糖脂質やグリセロ糖脂質のような天然糖脂質に構造の類似したＮ-糖脂質類縁体が、単純疱疹ウィルスワクチンにも仮性狂犬病ウィルスワクチンにも強い免疫反応を引起すことができることを報告した。天然の脂質残基の機能を模倣するために、幾つかの糖脂質が長鎖アルキルアミンおよびアノマー炭素原子を介して糖と直接連結した脂肪酸から合成されてきた。
【００５８】
Ｍoloneyに与えられ、本発明の譲受人に譲渡され、参考のために本明細書に挿入されている米国特許第 4258029 号は、破傷風トキソイドやホルマリン不活化I、IIおよびIII型ポリオウィルスワクチンと複合したとき、オクタデシルチロシン塩酸塩(ＯＴＨ)がアジュバントとして機能することを教示している。また、Ｎixon-Ｇeorge等,1990年(参考文献 20)は、組換えＢ型肝炎表面抗原と複合した芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ型肝炎ウィルスに対し宿主免疫反応を高めると報告した。
【００５９】
6.免疫検定
本発明の、非分類型Ｈaeｍophilusの菌株のＨＭＷタンパク質、その類縁体および断片、および/またはペプチドは、免疫原として、酵素結合イムノソルベント検定(ＥＬＩＳＡ)、ＲIＡおよび他の非酵素結合抗体結合検定を含む免疫検定、または抗菌性ＨaeｍophilusＨＭＷタンパク質および/またはペプチド抗体を検出するための当分野で公知の手順における抗原として有用である。ＥＬＩＳＡ検定では、ＨＭＷタンパク質、類縁体、断片、および/またはＨＭＷタンパク質の部分に対応するペプチドが、選択された表面、例えばポリスチレンミクロタイタープレートのウェルのような、タンパク質やペプチドを結合することのできる表面の上に固定化される。吸着の不完全なＨＭＷタンパク質、類縁体、断片、および/またはペプチドを除去するために洗浄した後、試験試料に対して抗原として中性であることが知られているウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)やカゼインの溶液のような非特異的タンパク質が、その選択表面に結合される。これによって固定化表面上の非特異的吸着部位が封鎖され、したがつて抗血清の表面への非特異的結合によつて起こるバックグランドが低下する。
【００６０】
次いで、免疫複合体(抗原/抗体)の形成に資するように、固定化表面を臨床物質や生物物質のような試験試料と接触させる。この操作には、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン(ＢＧＧ)および/またはリン酸緩衝塩水(ＰＢＳ)/Ｔｗeenのような希釈剤で試料を希釈することが含まれる。次に、約 25 ℃から約 37 ℃のオーダーのような温度で、約２時間から約４時間、試料をインキュベートする。インキュベーションの後、非免疫複合体物質を除去するために、試料接触表面を洗浄する。この洗浄操作は、ＰＢＳ/Ｔｗeenやホウ酸緩衝液のような溶液で洗浄することを含む。
【００６１】
試験試料および結合したＨＭＷタンパク質、類縁体、断片、および/またはペプチドとの特異的免疫複合体を形成し、次に洗浄した後、免疫複合体を第１抗体に対する特異性を有する第２の抗体に曝すことによって、免疫複合体形成の発生および発生量をも決定し得る。試験試料がヒト由来のものである場合、第２抗体はヒト免疫グロブリンに対する特異性を有する抗体であて、一般にIgＧである。検出手段を提供するために、第２抗体は、例えば適当な発色性物質とインキュベートしたときに発色を起こす酵素活性のような関連する活性を有する。次いで、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて発色度を測定することによって、定量化が実現される。
【００６２】
7.ハイブリダイゼーションプローブとしての配列の使用
hｍｗ遺伝子の新たに単離し、特定した配列を含む本発明のヌクレオチド配列は、Ｈaeｍophilusの他の非分類型菌株から得られるhｍｗ遺伝子の同定およびクローニングを可能にする。
【００６３】
本発明のhｍｗ遺伝子の配列を含むヌクレオチド配列は、他のhｍｗ遺伝子の相補性鎖と２本鎖分子を選択的に形成することができるために有用である。用途により、他のhｍｗ遺伝子に対するプローブの様々な程度の選択性を実現するために、多様なハイブリダイゼーション条件が使用される。高度の選択性のためには、約 50℃から 70℃の間の温度で 0.02Ｍから 0.15ＭのＮaＣlで実現されるような、低塩および/または高温の条件のような比較的厳しい条件が、２本鎖を形成するために使用される。幾つかの用途に対しては、20℃から 55℃の間にわたる温度で 0.15Ｍから 0.9Ｍの塩のような厳しさのもっと小さいハイブリダイゼーション条件でよい。ハイブリッド２本鎖を不安定化するために、ホルマミドの添加量を増やすことによっても、ハイブリダイゼーション条件をより厳しくすることができる。したがって、特定のハイブリダイゼーション条件を容易に扱うことができ、選択される方法は一般に望ましい結果に依存することになろう。一般に、50％ホルマミドと 0.15ＭのＮaＣlの存在下で好都合なハイブリダイゼーション温度は、標的核酸断片との相同性が約95 から 100％であるhｍｗ遺伝子に対しては 42℃で、約90 から 95％の相同性に対して 37℃で、約85 から 90％の相同性に対して 32℃である。
【００６４】
臨床診断の実施形態では、ハイブリダイゼーションを決定するために、本発明のhｍｗ遺伝子の核酸配列は、標識のような適当な手段と組合せて使用される。放射性リガンド、酵素性リガンド、または検出可能なシグナルを提供することのできるアビジン/ビオチンのような他のリガンドを含め、多様な適切な標識手段が当分野で知られている。幾つかの診断実施形態では、ウレアーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ等の酵素タグが、放射性タグの代わりに使用される。酵素タグの場合、hｍｗ遺伝子配列を含む試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するために、ヒトの肉眼に見える手段を提供するために使用するか、または分光光度計によって使用することのできる比色定量用指示薬基質が知られている。
【００６５】
本発明のhｍｗ遺伝子の核酸配列は、溶液ハイブリダイゼーションおよび固相操作を用いる実施形態におけるハイブリダイゼーションプローブとして有用である。固相操作を伴う実施形態では、浸出液、体液(例えば、血清、羊水、中耳溢出液、唾液、気管支肺胞洗浄液)または組織までも含む臨床試料のような試料から得られる試験ＤＮＡ(またはＲＮＡ)が、選択されたマトリックスまたは表面に吸着されるか、そうでない場合は付着される。次いで、固定された単鎖核酸は、望ましい条件下で、本発明のhｍｗ遺伝子またはその断片の核酸配列を含む選択されたプローブとの特異的なハイブリダイゼーションを受ける。選択される条件は、例えばＧ＋Ｃ含量、標的核酸の型、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさ等に依存して必要とされる特定の規準に基く特定の状況に依存するであろう。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためにハイブリダイゼーション表面を洗浄した後、標識によって特異的ハイブリダイゼーションが検出されるか、または定量化さえもなされる。Ｈaeｍophilus 種の中に保存されている核酸配列部分を選択することが好ましい。選択されるプローブは長さが少なくとも 18 bpであり、長さが 30 bpから 90 bpの範囲に入る。
【００６６】
8.高分子量タンパク質遺伝子の発現
宿主細胞との適合性を示す種から誘導されるレプリコン配列および制御配列を含んだプラスミドベクターは、発現系で高分子量タンパク質遺伝子を発現するために使用される。ベクターは普通、形質転換細胞中に表現型の選択をもたらすことのできる標識配列だけでなく、複製部位をも担持する。例えばＥ.coliは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含むpＢＲ 322 を用いて形質転換され、したがって形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。このpＢＲ 322 プラスミド、または他の微生物プラスミド、またはファージは、自己のタンパク質を発現するために、宿主細胞が使用することのできるプロモーターも含んでいるか、または含むように修飾されねばならない。
【００６７】
その上、宿主との適合性を示すレプリコン配列および制御配列を含んだファージベクターを、これらの宿主に関連する形質転換ベクターとして使用することができる。例えばλ ＧＥＭTM-11 中のファージを、Ｅ.coli ＬＥ 392 のような宿主細胞を形質転換するために使用することのできる組換えファージベクターを作る際に、利用することができる。
【００６８】
組換えＤＮＡの構築に普通使用されるプロモーターは、β-ラクタマ―ゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーター系、および本明細書の好ましい実施形態(米国特許第 4952496 号)で使用されるＴ７プロモーター系のような他の微生物プロモーターを含んでいる。プロモーターのヌクレオチド配列に関する詳細が公知であり、したがつて技術者はプロモーターを機能的に遺伝子と連結することができる。使用される特定のプロモーターは、一般に望ましい結果に依存する選択の問題であろう。ＨＭＷタンパク質および免疫学的断片またはその類縁体の発現に適当な宿主は、Ｅ.coli、Ｂordetella種、Ｂacillus種、Ｈaeｍophilus、かび、酵母を含み、あるいはバキュロウィルス発現系が使用されてもよい。Ｅ.coliが本発明で使用される好ましい宿主である。
【００６９】
特に、Ｈaeｍophilus種の培養物から精製されるような天然ＨＭＷタンパク質が痕跡量の毒性物質や他の汚染物質を含んでいるとき、本発明に従って組換え法によりＨＭＷタンパク質を生産することが好ましい。特に本明細書に記載の構築体を用いて、精製物質中の汚染物質を最小限に抑えるように、宿主から単離することのできる組換え生産ＨＭＷタンパク質を異種系中で使用することによって、この問題を回避することができる。その上、組換え生産法によって、ＨＭＷ１またはＨＭＷ２、または免疫原性断片およびその類縁体を、Ｈaeｍophilus菌株中に存在する普通の組み合わさったタンパク質と異なり、別々に、かつ高純度に生産することができる。
【００７０】
生物学的寄託物
本明細書に記載し、言及した非分類型Ｈaeｍophilusの菌株の高分子量タンパク質に対する核酸コーディングを含む一定のベクターを、ブダペスト条約に従いこの出願前に、10801 Ｕniversity Ｂoulevard，Ｍanassas，Ｖirginia 20110-2209，ＵＳＡに在るＡｍerica Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託した。寄託したベクターの試料を公衆は入手することができ、この米国特許出願に基く特許が与えられたときに、寄託物の入手に課されるあらゆる規制が除かれることになろう。その上、寄託所が生体試料を分与できなければ寄託物を更新することになろう。寄託した実施形態は本発明の単なる例示を意図したものにすぎないので、本明細書に記載し、請求した本発明の範囲は寄託した生物学的材料によって限定されるものではない。この出願書に記載のものと同等または類似の抗原をコード化する核酸を含有する、任意の同等または類似のベクターは、本発明の範囲内にある。
【００７１】
【表１】
(実施例)
上述の開示は、本発明を一般的に述べている。下記の具体的な実施例を参考文献することによって、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は例示の目的で述べられているに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。状況によってはよい方法になるかもしれないので、形状の変更および均等物の代用が考えられる。本明細書では特定の用語が用いられているが、これらの用語は記述的な意味のためのものであり、制限の目的のためではない。
【００７３】
本開示とこれらの実施例で用いられているが明示的には述べられていない分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学、および発行技術の方法は科学文献では広く報告されており、充分に当業者の能力範囲にある。
【００７４】
実施例１
この実施例では、全長160kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1091-２の構築について述べる。
【００７５】
プラスミドpＨＭＷ１-15(参考文献８)は、Ｔ７プロモーターとhｍｗ１ＡＢＣコード領域の開始点との間に挿入されるhｍｗ１プロモーターを含めて約 400 bpの５'-フランキング領域を含む(図１)。pＨＭＷ１-15 のマルチクローニング部位の中にはユニークＢgl II部位が１つあり、hｍｗ１Ａのコード領域内にはユニークＢaｍＨ I部位が１つある。2.2 kbのＢgl II―ＢaｍＨ I断片を別の操作のためにサブクローニングして、プラスミドＤＳ-1035-12 を生成させた。５'-フランキング領域を含む 400 kbのＸba I-Ｂsｍ I断片を、Ｔ７プロモーターを直接プラスミドＤＳ-1055 Ｒ-２中のhｍｗ１Ａ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに接合させる約 86 bpのオリゴヌクレオチド配列(図１Ｂ)で置き換えた。ＤＳ-1055 Ｒ-２からの 1.5 kbのＸba I-Ｂaｍ I断片を、プラスミドＤＳ-1091-２を生成するために、同じ酵素で消化されていたpＨＭＷ１-15 に挿入した。
【００７６】
実施例２
この実施例では、全長 155 kＤaのＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1094-２の構築について述べる。
【００７７】
プラスミドpＨＭＷ２-21(参考文献 10)は、Ｔ７プロモーターとhｍｗ２ＡＢＣのコード配列(図２)の開始点との間に挿入されるhｍｗ２プロモーターを含めて約 800 bpの５'-フランキング配列を含む。プラスミドpＨＭＷ２-21 は２つのＥcoＲ I部位を有し、１つはマルチクローニング部位中にあり、もう１つはhｍｗ２Ａ遺伝子のコード配列中にある。2.5 kbのＥcoＲ I断片を別の操作のためにサブクローニングし、プラスミドＤＳ-1036-９を生成させた。５'-フランキング配列を含む約 800 kbのＸba I-Ｂsｍ I断片を、Ｔ７プロモーターを直接hｍｗ２ＡのＡＴＧ開始コドンに接合させるために、hｍｗ/に用いられた約 86 bpの同じオリゴヌクレオチド(図１Ｂ)に取り替え、プラスミドＤＳ-1056 Ｒ-１-１が生成された。中間プラスミド(ＤＳ-1078-４)は適切な制限酵素部位を導入するのに必要であり、Ｘba Iの挿入を行い、次いでプラスミドＤＳ-1085-８の定位を変えるために連結した。プラスミドＤＳ-1085-８をＥcoＲ Iによって線状化し、脱リン酸化し、pＨＭＷ２-21 からの８kbのＥcoＲ I断片によって連結し、hｍｗ２ＡＢＣのコード配列に直接連結されたＴ７プロモーターを含むプラスミドＤＳ-1094-２が生成された。
【００７８】
実施例３
この実施例は、全長 125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1046-1-1 の構築について例示するものである。
【００７９】
プラスミドpＨＭＷ１-15(参考文献８)はＴ７プロモーター配列内にＸba I部位を、成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(図３Ａ)のコード配列内にユニークＢaｍＨ I部位を含む。pＨＭＷ１-15 の 1.8 kbのＸba I-ＢaｍＨ I断片を欠失させ、オリゴヌクレオチド(図３Ｂ)から生成させた約 114 bpのＸba I-ＢaｍＨ I断片で置き換えた。生成させた 11.3 kbのプラスミドＤＳ-1046-1-1 は、したがって、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣオペロンと構造上接合されたＴ７プロモーターを含む。
【００８０】
実施例４
この実施例は、全長 120 kＤaの成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２ＡＢのＣ遺伝子の一部を発現するプラスミドＤＳ-1200-３の構築について例示するものである。
【００８１】
プラスミドpＨＭＷ２-21(参考文献 10)は、成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質のコード配列内に１つのＥcoＲ I部位を含む。しかしながら、それは特異的ではない(図４Ａ)。複数のステップから成る構築過程は、105 bpのオリゴヌクレオチド(図４Ｂ)からのＴ７プロモーターおよび成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２Ａ遺伝子の開始点の第１の再形成部分を含む。プラスミドＤＳ-1134-２は、完全なＴ７プロモーターおよび成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質をコードする５'-配列を含む。プラスミドＤＳ-1134-２をＥcoＲ Iによって線状化し、脱リン酸化し、大部分のhｍｗ２Ａ遺伝子およびhｍｗ２Ｂとhｍｗ２Ｃ遺伝子すべてを含むpＨＭＷ２-21 からの８kbのＥcoＲ I断片を挿入した。プラスミドＤＳ-1147-４は、Ｔ７hｍｗ２ＡＢＣ遺伝子カセットを含むpＵＣベースのプラスミドである。プラスミドＤＳ-1200-３を生成するために、このカセットすべてを 6.5 kbのＢgl II―Ｘho I断片上に取り除き、Ｂal IIとＳal Iで消化されていたpＴ７-７に挿入した。この構築中にhｍｗ２Ｃ遺伝子の一部が削除された。
【００８２】
実施例５
この実施例は、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１Ａ遺伝子およびhｍｗ１Ｂ遺伝子の一部を含むプラスミドＤＳ-1122-２の構築について例示するものである。
【００８３】
プラスミドＤＳ-1046-１-１(図３Ａ；実施例３)は３つのＨind III部位を含み、１つはhｍｗ１Ｂ遺伝子内に、１つはhｍｗ１Ｃ遺伝子内に、さらにもう１つはマルチクローニング部位(図５)の３'-領域にある。ＤＳ-1046-１-１をＨind IIIで消化させ、次いで再連結させると、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードする完全なhｍｗ１Ａ遺伝子およびhｍｗ１Ｂ遺伝子の一部を含み、hｍｗ１Ｃ遺伝子をまったく含まない 125 kＤaの成熟プラスミドＤＳ-1122-２が生成された。
【００８４】
実施例６
この実施例は、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１Ａ遺伝子を含み、他のhｍｗ遺伝子をまったく含まないプラスミドJＢ-2330-７の構築について例示するものである。
【００８５】
ＰＣＲ法による増幅をプラスミドＤＳ-1122-２ＤＮＡ上で行い(図５；実施例５)、ターミネーターを介してhｍｗ１Ａの３'-末端近くにあるＫpn I部位から 500 bpの断片を生成し、３'-末端のＸho IとＨind III用に制限酵素部位を導入した。この断片をpＣＲ IIにクローニングし、プラスミドＤＳ-2056-１-１(図６Ａ)を生成させた。さらに、使用したヌクレオチドを図６Ｂに示す。プラスミドＤＳ-1122-２をＫpn IとＨind IIIによって消化し、それによって大部分のhｍｗ１Ａ遺伝子およびすべてのhｍｗ１Ｂ遺伝子断片が欠失された。ＤＳ-1122-２からの 2.6 kbのＫpn I-Ｈind IIIベクター断片をＤＳ-2056-１-１からの 0.5 kbのＫpn I-Ｈind III断片と連結し、約 0.2 kbの５'-hｍｗ１Ａ配列および約 0.5 kbの３'-hｍｗ１Ａ配列を含むＫpn I部位に接合されたプラスミドJＢ-2321-１が生成された。プラスミドJＢ-2321-１をＫpn Iによって線状化し、脱リン酸化し、ＤＳ-1122-２からの 2.7 kbの内在Ｋpn I断片を挿入し、プラスミドJＢ-2330-７を作成した。このプラスミドは付加のhｍｗ１遺伝子配列がまったくないＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットを含む。
【００８６】
実施例７
この実施例は、125 kＤaの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドJＢ-2369-６の構築について例示するものである。
【００８７】
プラスミドJＢ-2330-７(図６Ａ；実施例６)をＢgl IIとＨind IIIによって消化し、Ｔ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットをＢgl IIとＨind IIIによって消化されていたpＵＣ-ＢgＸbにサブクローニングし、プラスミドJＢ-2337-１(図７)を作成した。プラスミドJＢ-2337-１をＳal IとＸho Iによって消化し、互換性の末端を有する断片上にＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットを切り離した。ベクターＤＳ-1843-２は、転写終止コドンおよびユニークＸho I部位を有するマルチクローニング部位を含むpＢＲ 328 ベースのプラスミドである。ベクターＤＳ-1843-２をＸho Iで消化し、脱リン酸化し、次いで 3.5 kbのＳal I-Ｘho I Ｔ７hｍｗ１Ａ遺伝子カセットと連結させ、プラスミドJＢ-2347-５を生成させた。Ｓal IおよびＸho I部位は閉ざされているので、このプラスミドはJＢ-2337-１に由来する付加のＳal I-Ｘho I Ｔ７hｍｗ１Ａ遺伝子カセットを挿入するのに用いられるＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子の３'-末端にユニークＸho I部位を含む。プラスミドJＢ-2369-６は、このようにして導入された２つのタンデムＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子を含む。
【００８８】
実施例８
この実施例は、成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットの１つまたは２つのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-2084-３およびＤＳ-2084-１の構築について例示するものである。
【００８９】
プラスミドＤＳ-1200-３(図４Ａ,実施例４)は、Ｃ遺伝子カセットの一部であるＴ７ hｍｗ２ＡＢを含む。ＤＳ-1200-３内には２つのＭlu I部位があり、１つはhｍｗ２Ａの３'-末端近くに位置し、もう１つはhｍｗ２Ｂの５'-末端近くに位置する(図８Ａ)。オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによってＭlu I部位からのhｍｗ２Ａ遺伝子３'-末端の 247 bpの断片を増幅させ、ユニークＢaｍＨ I部位の次にhｍｗ２Ａの停止コドンを導入した(図８Ｂ)。247 bpのＰＣＲ断片をpＣＲ IIにサブクローニングして、プラスミドＤＳ-2056-３-１を生成させた。プラスミドＤＳ-1200-３をＢgl IIとＭlu Iによって消化し、Ｔ７プロモーターおよび大部分のhｍｗ２Ａ遺伝子を含む 3.2 kbの断片を精製した。プラスミドpＵＣ-ＢgＸbをＢgl IIとＢaｍＨ Iによって消化して脱リン酸化した。Ｂgl II-Ｍlu I hｍｗ２Ａ遺伝子断片およびＤＳ-2056-３-１からのＭlu I-ＢaｍＨ I ＰＣＲ断片を連結させてpＣＵベクターにして、Ｂgl II-ＢaｍＨ I断片上に 3.4 kbのＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットを含み付加のhｍｗ２遺伝子をまったく含まないプラスミドＤＳ-2073-３を生成させた。プラスミドＤＳ-1843-２をＢgl IIで線状化し、3.4 kbのＢgl II-ＢaｍＨ Iカセットを挿入し、単一のＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットおよび２つのタンデムＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットを含むプラスミドＤＳ-2084-１を含むプラスミドＤＳ-2084-３を生成させた。
【００９０】
実施例９
この実施例は、約 125 kbの成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするタンデムＴ７hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を含み、アンシピリンまたはカナマイシンに対してそれぞれ耐性のあるプラスミドJＢ-2057-７およびＢＫ-86-１-１の構築について例示するものである。
【００９１】
プラスミドＤＳ-1046-１-１(図３Ａ；実施例３)は、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子カセットを含み、成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質のコード領域内にユニークＢaｍＨ I部位を有する。プラスミドJＢ-2369-６(図７；実施例７)は複数のタンデムＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットを含み、その各々がＨＭＷ１Ａ用のコード配列内に内在ＢaｍＨ I部位を含む。プラスミドJＢ-2369-６をＢaｍＨ Iで消化すると、第１のhｍｗ１Ａ遺伝子の３'-末端、Ｔ７プロモーター、および第２のhｍｗ１Ａ遺伝子の５'-末端を含む 3.5 kbの断片を生成させた。この断片をＤＳ-1046-１-１のＢaｍＨ I部位に連結させて、タンデムＴ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子カセットを含むプラスミドJＢ-2507-７を作成した(図９)。pＴ７-７ベクターの基幹のマルチクローニング部位にあるユニークＳal I部位をJＢ-2507-７の線状化に用いた。カナマイシンに耐性のあるカセットを、Ｓal Iでの消化によるpＵＣ-４Ｋから切除し、JＢ-2507-７ベクターと連結させ、プラスミドＢＫ-86-１-１を生成させた。
【００９２】
実施例 10
この実施例は、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子カセットおよびＥ.coli cer遺伝子を含み、アンシピリンまたはカナマイシンに対してそれぞれ耐性のあるプラスミドＢＫ-35-４およびＢＫ-76-１-１の構築について例示するものである。
【００９３】
プラスミドＤＳ-2224-１-４(図 10)は、pＵＣ-ＢgＸbのＢaｍＨ I部位にクローニングされた約 290 bpのオリゴヌクレオチドからのＥ.coli cer遺伝子(参考文献 13)を１つ含む。プラスミドＤＳ-1046-１-１(図３Ａ；実施例３)は、Ｔ７プロモーターの上流にユニークＢgl II部位を含む。プラスミドＤＳ-1046-１-１をＢgl IIで線状化し、脱リン酸化し、ＤＳ-2224-１-４からのcer遺伝子を含む 290 bpのＢaｍＨ I断片と連結させ、プラスミドＢＫ-35-４を形成させた。カナマイシンに耐性のあるカセットを、Ｓal Iでの消化によるpＵＣ-４Ｋから削り取り、ＢＫ-35-４のユニークＳal I部位に挿入し、プラスミドＢＫ-76-１-１を形成させた。
【００９４】
実施例 11
この実施例は、前述の実施例において生成された異なる構築体からのrＨＭＷ１およびrＨＭＷ２タンパク質生成の分析を例示するものである。
【００９５】
プラスミドを、Ｂiorad器具を用いたエレクトロポレーションによって、Ｅ.coli ＢＬ 21(ＤＥ３)細胞に導入した。37 ℃のＮＺＣＹＭ媒体中で、菌株を光学濃度Ａ878＝0.3 まで成長させ、次いで４時間かけてラクトースを 1.0 ％まで加えることによって誘発した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥリーシスとローディングバッファーによって、サンプルを 0.2 ＯＤ/μlに調整し、同量のタンパク質サンプルをＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上にのせた。図 11 は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルによって分析され、さまざまな構築体からのrＨＭＷタンパク質の相対的生成量を例示するものである。特定の構築体に関するレーンの同定結果は、上述の図の記述の中で与えられている。「a」はＨＭＷＡタンパク質のバンドを示し、「b」はＨＭＷＢタンパク質のバンドを示し、「c」はＨＭＷＣタンパク質のバンドを示す。
【００９６】
図を見ると分かるように、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(160)構築体(レーン３)からのＨＭＷ１Ａ、ＢおよびＣタンパク質の生成はごくわずかである。３つのタンパク質すべての生成が、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)構築体(レーン４)では向上する。レーン５では、ＨＭＷ１Ｃタンパク質の生成がまったくなく、Ｂ構築体の一部のＴ７ hｍｗ１Ａ内の遺伝子の先端が切り取られることによって、ＨＭＷ１Ｂタンパク質の大きさがわずかに減少する。レーン６では、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)構築体からのＨＭＷ１ＢまたはＨＭＷ１Ｃタンパク質の生成がまったくない。レーン７は、Ｔ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１Ａ構築体からのＨＭＷ１Ａの生成の向上は、たとえあるにしてもわずかであった。レーン８では、ＨＭＷ１Ａ、ＨＭＷ１Ｂ、およびＨＭＷ１Ｃタンパク質の生成は、それらがＴ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ構築体から発現される場合は明らかである。レーン９では、ＨＭＷ１Ａ、ＨＭＷ１Ｂ、およびＨＭＷ１Ｃタンパク質はすべてＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer構築体から生成される。
【００９７】
実施例 12
このサンプルは、組換え型ＨＭＷ１およびＨＭＷ２タンパク質の精製を例示するものである。
【００９８】
さまざまな構築体中のＢまたはＣ遺伝子の削除が完全であれ部分的であれ、すべての組換え型ＨＭＷタンパク質がＥ.coli内の封入体として発現され、同じ手順(図 12)で精製された。500 ｍl培地からのＥ.coli細胞のペレットを、pＨ 8.0 で 0.1 Ｍ ＮaＣlを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl 50 ｍl中で再懸濁して、超音波によってかき混ぜた。抽出液を 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離して、生成した上澄みを捨てた。pＨ 8.0 で 0.5 ％Ｔriton Ｘ-100 および 10 ｍＭ ＥＤＴＡを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl 50 ｍl中で、ペレット(ＰＰＴ1)をさらに抽出して、次いで 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離して、上澄みを捨てた。pＨ 8.0 で１％のオクチルグルコサイドを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl 50 ｍl中で、ペレット(ＰＰＴ2)をさらに抽出して、次いで 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離して、上澄みを捨てた。
【００９９】
上述の抽出後に得られたペレット(ＰＰＴ3)は、封入体を含む。このペレットをpＨ 8.0 で６Ｍグアニジンおよび５ｍＭ ＤＴＴを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl ６ｍl中で可溶化した。pＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl 12 ｍlをこの溶液に加えて、混合物を 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離した。その上澄み(ＳＵＰ4)をポリエチレングリコール(ＰＥＧ)4000 で、最終濃度７％に沈殿させた。生成したペレット(ＰＰＴ5)を 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間の遠心分離で除去して、その上澄みを飽和度 50 ％の(ＮＨ4)2ＳＯ4で沈殿した。(ＮＨ4)2ＳＯ4を加えた後、その溶液をタンパク質で相分離し上相にして、次いで 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離した。生成したペレット(ＰＰＴ6)を６ＭグアニジンＨＣlおよび５ｍＭ ＤＴＴを含むpＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl ２ｍl中で溶解し、その透明溶液を、pＨ 8.0 で２ＭグアニジンＨＣlを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl中で平衡化されたＳuperdex 200 ゲルろ過コラムで精製した。その留分をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、精製rＨＭＷ１を含むものをプールして４℃で一昼夜ＰＢＳに対してディスプレーし、次いで 20,000 ｇ(重力加速度) で 30 分間遠心分離した。この条件下ではタンパク質は可溶性のままであり、マイナス 20 ℃で保存するためにrＨＭＷ１沈殿にグリセリンを加えて最終濃度 20 ％にした。
【０１００】
さまざまな精製段階の代表的なrＨＭＷ１タンパク質(abc/cer)のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を図 13 に示す。レーンの同定を図の記載中に示す。最初の３つの抽出液、pＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl/0.1 Ｍ ＮaＣl(レーン３)、pＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl/0.5 ％ Ｔriton Ｘ-100(レーン４)、pＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl/１％オクチルグルコシド(レーン５)の後では、約110、80、60 kＤaの３つの主なタンパクの質バンド(レーン６)は明らかであった。Ｎ-末端アミノ酸配列で確認されるように、これら３つのタンパク質は、それぞれhｍｗ１Ａ、Ｃ、Ｂ遺伝子の産物である。ＢおよびＣ遺伝子の産物は、グアニン塩酸塩溶液中では可溶性が低く(レーン７)、グラニジンＨＣl濃度を６Ｍから２Ｍに希釈することによって、遺伝子Ａの産物(ＨＭＷ１、レーン８)から容易に分離された。７％ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)4000 による沈降で、rＨＭＷ１調製からの他の混合タンパク質(レーン９)を除去した。最終的な硫酸アンモニウム沈降で、ＰＥＧ可溶性留分(レーン 10)からのrＨＭＷ１を凝集しただけでなく、残留したＰＥＧ(レーン 11)、高濃度の(ＮＨ4)2ＳＯ4を有するＰＥＧ溶液の混合による相分離を介した(ＮＨ4)2ＳＯ4塩(レーン 12)効果的に除去した。次いでrＨＭＷ１ペレットを、６ＭグアニジンＨＣlおよび５ｍＭ ＤＴＴを含むpＨ 8.0 の 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl中で溶解し、pＨ 8.0 で２ＭグアニジンＨＣlを含む 50 ｍＭ Ｔris-ＨＣl中であらかじめ平衡化されたＳuperdex 200 ゲルろ過コラムで精製した(図 14、パネルＡ)。精製されたrＨＭＷ１の平均量は、培地１Ｌあたり 10 ｍgである。Ｔ７ hｍｗ２Ａ/Ｔ７ hｍｗ２Ａ構築体からのrＨＭＷ２Ａ精製のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を図 14、パネルＢに示す。
【０１０１】
実施例 13
この実施例は、精製されたrＨＭＷ１Ａタンパク質の安定性を例示するものである。
【０１０２】
rＨＭＷ１Ａの安定性を研究するために、実施例 12 に従って生成された精製されたrＨＭＷ１Ａタンパク質を、グリセリンと共にまたはグリセリンなしで、４℃またはマイナス 20 ℃で保存してた。グリセリンが存在しない場合、タンパク質は４℃で保存されると解体され、マイナス 20 ℃で保存されると沈殿する傾向があった。最終濃度 20 ％までグリセリンを加えると、rＨＭＷ１Ａの可溶性が大幅に上がっただけでなく、マイナス 20 ℃で保存する場合のタンパク質の安定性が増した。繰り返しの凍結および解凍の後も、タンパク質は少なくとも８週間はそのままの状態だった(図 15)。
【０１０３】
実施例 14
この実施例は、異なる構築体から生成されたrＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａタンパク質の免疫原性を例示するものである。
【０１０４】
Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(pＤＳ-1046-１-１、図３Ａ、実施例３)またはＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer(pＢＫ-76-１-１、図 10、実施例 10)構築体から生成され、実施例 12 の手順に従って精製されたrＨＭＷ１タンパク質の免疫原性を研究するために、５匹のＢＡＬＢ/cマウス(ケベック州チャールズリバー産)を、ＡlＰＯ4(一投与量あたり 1.5 ｍg)の存在下で１日、29 日、43 日目に 0.3、１、３μgの抗原で免疫性を与えた。０、14、28、42、56 日目に、血液サンプルを集めた。
【０１０５】
Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣまたはＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer構築体(一投与量あたり 0.3 から３μgに由来する精製rＨＭＷ１によって免疫性を与えられたマウスは、投与量依存性抗rＨＭＷ１抗体反応を起こし(図 16)、この反応は両方のタンパク質が封入体の抽出および可溶化の後でも免疫遺伝的であることを示唆している。マウスにおいて、この２つの構築体からのタンパク質によって誘発される抗体の滴定濃度中には、統計的に大幅な差異は見られなかった。
【０１０６】
いくつかの異なる構築体から生成され実施例 12 に従って精製された、rＨＭＷ１およびrＨＭＷ２タンパク質の免疫原性を比較するために、ＡlＰＯ4(一投与量あたり 1.5 ｍg)の存在下でrＨＭＷタンパク質 30 μgを用いて、１、14、28 日目に９匹のチンチラ(モールトンチンチラ牧場産)のグループに免疫性を与えた。42 日目に、血液サンプルを集めた。さまざまな型のrＨＭＷによって誘発されるチンチラ抗ＨＭＷ抗体反応を表１に要約する。
【０１０７】
Ｔ７ hｍｗ１ＡＢ(125)(ab/Δ)(pＤＳ-1122-２、図５、実施例５)構築体ではなく、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(abc)(pＤＳ-1046-１-１、図３Ａ、実施例３)、Ｔ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(a/abc)(pＢＫ-86-１-１、図９、実施例９)、Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer(abc/cer)(pＢＫ 76-１-１、図 10、実施例 10)、およびＴ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１Ａ(２Ｘa)(pJＢ-2369-６、図７、実施例７)構築体から調製されたrＨＭＷ１が、３つの免疫処置後にチンチラの体内で相当な抗体滴定濃度を誘発することが分かった。同様に、Ｔ７ hｍｗ２ＡＢＣ(abc)(pＤＳ-1147-４、図４Ａ、実施例４)またはＴ７ hｍｗ２Ａ/Ｔ７ hｍｗ２Ａ(２Ｘa)(pＤＳ-2084-１、図８Ａ、実施例８)構築体から調製され、実施例 12 に従って精製されたrＨＭＷ２が３つの免疫処置後にチンチラの体内で相当な抗体滴定濃度を引き出すことが分かった。
【０１０８】
抗rＨＭＷ IgＧ滴定濃度を、抗原特異的酵素連結免疫吸着剤アッセイ(ＥIＡs)によって決定した。Ｍicrotiter ｗells(ナンク-マキシソープ、ナンク、デンマーク)をタンパク質抗原 50 μl(0.5 μg ｍl-1)でコーティングした。このアッセイで用いられた試薬は次の通りである:ホースラディシュペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウスIgＧ(Ｆc特異的)の親和性精製されたＦ(ab')2断片(Jackson Iｍｍuno Ｒesearch Ｌabs.、オンタリオ州ミシソーガ)、親和性精製されたモルモット抗IgＧ抗体(１μgｍl-1)(この研究室で調製された)、およびレポーターとして用いられたホースラディシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)に結合させたヤギ抗モルモットIgＧ(Ｈ＋Ｌ)抗体(Jackson Iｍｍuno Ｒesearch Ｌabs.)。チンチラIgＧを、Ｂarenkaｍp(参考文献 14)に従ってチンチラ血清から精製した。モルモット抗チンチラIgＧ抗体の発生および精製については前に述べた(参考文献 15)。テトラメチルベンジジンを用いて反応を進展させ(ＴＭＢ/Ｈ2Ｏ2、ＡＤI、オンタリオ州ミシソーガ)、Ｆloｗ Ｍultiskan ＭＣＣ マイクロプレートリーダー(IＣＮ Ｂiocheｍicals、オンタリオ州ミシソーガ)で 450 nｍで吸光度を測定した(基準波長として 540 nｍを用いた)。抗血清の反応による滴定濃度を、常に２倍以上の吸光度の増加を示すあらかじめ採取した血清サンプルと共に得られた希釈度の逆数として定義した。
【０１０９】
実施例 15
この実施例は、異なる構築体から生成されたrＨＭＷ１ＡおよびrＨＭＷ２Ａタンパク質の防御能を例示するものである。
【０１１０】
チンチラにおける新しく成長させたストレプトマイシン耐性ＮＴＨ１菌株 12 での免疫および鼻腔内の攻撃誘発については述べてきた(参考文献 15)。簡潔に述べると、８から９匹の動物グループを次のもので３度筋肉内免疫した:０、14、28 日目に精製rＨＭＷ１およびrＨＭＷ 30 μg、アラム中の熱不活性(56 ℃、10 分)ＮＴＨi全細胞２× 109 cfu、またはアラムのみで。ＥIＡsによって抗ＨＭＷ１または抗rＨＭＷ２抗体の滴定濃度を測定するために、血清サンプルおよび鼻洗浄サンプルを 42 日目に取り出した。
【０１１１】
44 日目に、筋内注射(体重１kgあたり 0.06 ｍgキシラジンおよび 0.3 ｍgケタミンＨＣl)によるキシラジン/ケタミンＨＣlを用いて動物に軽度の麻酔をかけた。共に２μgｍl-1であるヘミンおよびＮＡＤを補充したＢＨI培地で新しく培養した、ストレプトマイシン耐性ＮＴＨi菌株 12 に受動的吸入法(鼻腔あたり 50 μl、動物あたり計 0.1 ｍl)によって鼻腔内でインキュレーションを行った。バクテリア攻撃の投与量は、動物あたり１× 108 cfuであった。インキュレーション後に、麻酔したチンチラに、４日間鼻咽喉洗浄を行った(キシラジン/ケタミンＨＣl、44 日目と同じ方法および投与量)。１ｍlの滅菌塩水で鼻咽喉を洗浄して、反対側の鼻腔から流体を集めることによって分泌物を得た。標準的に、各々の動物から流体約 500 μlを集めて、ストレプトマイシン 50 μl(20 ｍg ｍl-1)の存在下で、サンプル 25 μlをチョコレート寒天培地上で培養した。
【０１１２】
ＮＴＨi菌株 12 を有するチンチラ鼻咽喉のＮＰコロニゼーションにおけるさまざまなrＨＭＷ１およびrＨＭＷ２調製に関する非経口免疫処置の保護効果を表２に要約する。アラムのみで免疫性を与えられた対照動物の 67 ％から 88 ％は、培地陽性の鼻部洗浄流体を有した。対照的に、構築体abc(pＤＳ-1046-１-１)a/abc(pＢＫ 86-１-１)、またはabc/cer(pＢＫ-76-１-１)から精製されたrＨＭＷ１タンパク質で免疫性を与えられた動物の 67 ％から 80 ％は広く保護された。構築体abΔ(pＤＳ-1122-２)または構築体２Ｘa(pJＢ-2369-６)に由来するrＨＭＷ１タンパク質で免疫性を与えられた動物は、70 ％から 90 ％が感染した。これらの結果によって、チンチラモデルにおけるＮＴＨi菌株 12 のコロニゼーションに対して有意な保護を得るためには、rＨＭＷ１タンパク質は無傷のＡＢＣ遺伝子を有する構築体に由来しなければならないことが明らかに示された。
【０１１３】
rＨＭＷ２タンパク質に関しても、同様の結果をを観察した。表２に示すように、構築体２Ｘa(pＤＳ-2084-１)からではなく構築体abc(pＤＳ-1147-４)から精製されたrＨＭＷ２タンパク質で免疫性を与えられた動物は、チンチラモデルにおけるＮＴＨi菌株 12 のコロニゼーションに対して保護された。いずれの場合も、米国特許第５,603,938 号に従って調整された、熱不活性ＮＴＨi 12 の全細胞調製によって免疫性を与えられたチンチラにおいては有意な保護を観察した。
【０１１４】
実施例 16
この実施例は、付加のＮＴＨi菌株からのhｍｗＡ遺伝子のクローニングおよび配列分析を例示するものである。
【０１１５】
染色体ＤＮＡをいくつかのＮＴＨi菌株から調製し、図 17 に示したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ法を行った。センスプライマー(5522.ＳＬ、配列番号 21)は、プロセシング部位のすぐ上流に成熟ＨＭＷタンパク質の残基をコードするhｍｗＡ遺伝子の保存領域に対応する。アンチセンスプライマー(5523.ＳＬ、配列番号 24)は、これもまた保存されているhｍｗＢ遺伝子の開始点に対応する。
【０１１６】
ＰＣＲ法による増幅を次のように行った:５〜 100 ngのＤＮＡを含む各反応混合物、各プライマー１μg、taq＋またはtag＋(Ｓangon)またはtaq plus long(Ｓtratagene)の５ユニット、２ｍＭ dＮＴＰs、20 ｍＭ Ｔris-ＨＣl(pＨ 8.8)、10 ｍＭ Ｋcl、10 ｍＭ (ＮＨ4)2ＳＯ4、２ｍＭ ＭgＳＯ4、0.1 ％ Ｔriton Ｘ-100 ＢＳＡ。循環条件は、95 ℃で１分間、次に 95 ℃で 30 秒を 25 サイクル、45 ℃で１分間、72 ℃で２分間、次いで 72 ℃で 10 分間。
【０１１７】
菌株Joycからのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 25)および推定アミノ酸配列(配列番号 26)を図 18 に示す。菌株Joycからの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 27、アミノ酸配列番号 28 をエンコードしている)は、分子量 125.9 kＤaであり 8.21.のpIを有する。Joyc ＨＭＷ１Ａ中には、ＲＧＤモティーフはまったく見られない。菌株Joycからのhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 29)および推定アミノ酸配列(配列番号 30)を図 19 に示す。菌株Joycからの予想される成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質(配列番号 31、アミノ酸配列番号 32 をエンコードしている)は、分子量 100.9 kＤaであり 6.91.のpIを有する。Joyc ＨＭＷ２Ａ中には、ＲＧＤモティーフはまったく見られない。
【０１１８】
Ｋ１菌株からの欠損hｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 33)および推定アミノ酸配列(配列番号 34,35)を図 20 に示す。Ｋ１菌株中には完全なhｍｗ１Ａ遺伝子が存在するが、ポリＧ域のすぐ次にフレームシフトがあり、これによってアミノ酸 326 以降のＨＭＷ１Ａタンパク質の早期停止が起こる。
【０１１９】
菌株Ｋ 21 からのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 38)および推定アミノ酸配列(配列番号 39)を図 21 に示す。菌株Ｋ 21 からの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 40、アミノ酸配列番号 41 をエンコードしている)は、分子量 104.4 kＤaであり 8.71.のpIを有する。Ｋ 21 ＨＭＷ１Ａ中の残基 20 から 22 に位置するＲＧＤモティーフが１つある。
【０１２０】
菌株ＬＣＤＣ２からのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 42)および推定アミノ酸配列(配列番号 43)を図 22 に示す。菌株ＬＣＤＣ２からの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 44、アミノ酸配列番号 45 をエンコードしている)は、分子量 114.0 kＤaであり 8.72.のpIを有する。ＬＣＤＣ２ ＨＭＷ１Ａ中には、ＲＧＤモティーフはまったく見られない。菌株ＬＣＤＣ２からのhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 46)および推定アミノ酸配列(配列番号 47)を図 23 に示す。菌株ＬＣＤＣ２からの予想される成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質(配列番号 48、アミノ酸配列番号 49 をエンコードしている)は、分子量 111.7 kＤaであり 8.22.のpIを有する。ＬＣＤＣ２ ＨＭＷ２Ａ中には、ＲＧＤモティーフはまったく見られない。
【０１２１】
菌株ＰＭＨ１からのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 50)および推定アミノ酸配列(配列番号 51)を図 24 に示す。菌株ＰＭＨ１からの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 52、アミノ酸配列番号 53 をエンコードしている)は、分子量 102.4 kＤaであり 6.73.のpIを有する。ＰＭＨ１ ＨＭＷ１Ａ中には２つのＲＧＤモティーフがあり、第１のモティーフは残基 19 から 21、第２のモティーフは残基 505 から 507 にある。菌株ＰＭＨ１からのhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 54)および推定アミノ酸配列(配列番号 55)を図 25 に示す。菌株ＰＭＨ１からの予想される成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質(配列番号 56、アミノ酸配列番号 57 をエンコードしている)は、分子量 103.9 kＤaであり 9.07.のpIを有する。ＰＭＨ１ ＨＭＷ２Ａ中には２つのＲＧＤモティーフがあり、第１のモティーフは残基 26 から 28、第２のモティーフは残基 532 から 534 にある。
【０１２２】
菌株 15 からのhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 58)および推定アミノ酸配列(配列番号 59)を図 26 に示す。菌株 15 からの予想される成熟ＨＭＷ１Ａタンパク質(配列番号 60、アミノ酸配列番号 61 をエンコードしている)は、分子量 103.5 kＤaであり 8.06.のpIを有する。菌株 15 のＨＭＷ１Ａ中にはＲＧＤモティーフはまったく見られない。菌株 15 からのhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 62)および推定アミノ酸配列(配列番号 63)を図 27 に示す。菌株 15 からの予想される成熟ＨＭＷ２Ａタンパク質(配列番号 64、アミノ酸配列番号 65 をエンコードしている)は、分子量 121.9 kＤaであり 8.22.のpIを有する。菌株 15 のＨＭＷ２Ａ中にはＲＧＤモティーフはまったく見られない。
【０１２３】
米国特許第５,603,938 号に含まれるように、菌株 12 からのhｍｗ１Ａおよびhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号: 66,70)および推定アミノ酸配列(配列番号: 67,71)を図 28 および図 29 にそれぞれ示す。
【０１２４】
推定ＨＭＷ１Ａタンパク質および推定ＨＭＷ２Ａタンパク質の配列と、公表されている菌株 12 からのＨＭＷ１Ａタンパク質およびＨＭＷ２Ａタンパク質の配列を図 30 に示す(配列番号 67,71)。成熟タンパク質の開裂部位を矢印で示す。特に残基約 980 〜 1168 とカルボキシル末端の残基約 1360 〜末端との間で、同様の領域が同定される。残基 1219 あたりに挿入されるタンパク質の中には繰り返し配列があるものもあるようであり、最も顕著なのは２つのタンデム挿入繰り返し配列を有すると思われるJoyc ＨＭＷ１ＡとＫ１ ＨＭＷ１Ａであるが、Ｋ 21 ＨＭＷ１ＡとＬＣＤＣ２ ＨＭＷ２Ａは繰り返し配列のコピーを１つしか含まない。菌株 15 ＨＭＷ２Ａは、同じ場所に位置する異なった繰り返し部分を含む。菌株 15 ＨＭＷ２Ａ以外のすべてのＨＭＷ２Ａタンパク質で見られる残基 583 に挿入された半保存配列の短い部分がある。しかしながら菌株 15 ＨＭＷ１Ａタンパク質では、それが見られる。
【０１２５】
実施例 17
この実施例は、hｍｗ１Ａまたはhｍｗ２Ａ遺伝子が増幅されたかどうかを決定するために用いられる、ＰＣＲ法による増幅を例示するものである。
【０１２６】
hｍｗ１オペロンとhｍｗ２オペロンの間に保存されている配列上のプライマーによってhｍｗＡ遺伝子をＰＣＲ法で増幅すると、増幅した遺伝子はhｍｗ１またはhｍｗ２のどちらかであるはずである。hｍｗ遺伝子は包み込まれた菌株内では発生しないが、
Ｈ.インフルエンザ菌株ＲＤの遺伝配列内で５'-および３'-フランキングが見られるはずである(参考文献 16)。菌株ＲＤ遺伝子ＨI 1679 からの５'-hｍｗ１フランキング(プライマー 5672.ＳＬ、配列番号 74)および菌株Ｒdの遺伝子ＨI 1598 由来の５'-hｍｗ２フランキング領域(プライマー 5676.ＳＬ、配列番号 75)を基にオリゴヌクレオチドセンスプライマーが生成された。増幅されたhｍｗＡ遺伝子の内部配列を基に、アンチセンスプライマーが生成された。オリゴヌクレオチドプライマーを図 31 に示す。プライマー 5742.ＳＬ(配列番号 78)を用いて、菌株Ｋ１、Ｋ 21、ＰＭＨ１、15 からのhｍｗＡ遺伝子を増幅させる一方で、プライマー 5743.ＳＬ(配列番号 81)を用いてＰＣＲ法によって菌株JoycとＬＣＤＣ２からのhｍｗＡ遺伝子を増幅させた。hｍｗＡ特異性プライマー(5742.ＳＬおよび 5743.ＳＬ)および実施例 16 でクローニングされた遺伝子の配列と対照をなす配列を用いて、増幅した断片を直接シークエンスした。ＰＣＲ法で増幅されたhｍｗＡ遺伝子をhｍｗ１Ａまたはhｍｗ２Ａであると同定した後に、特異的ＰＣＲプライマーを用いて、成熟タンパク質の開始点で工作された開始コドンを有する遺伝子の第２のコピーを増幅した。発現用のＬＣＤＣ２hｍｗ２Ａ遺伝子を増幅させるために用いられるＰＣＲプライマーの代表的なペアを、図 33 Ｂに示す(5972.ＳＬ、配列番号 92 ； 5973.ＳＬ、配列番号 95)。
【０１２７】
実施例 18
この実施例は、Ｅ.coli中のhｍｗＡＢＣ遺伝子の発現に必要な一般的なプラスミドの構築を例示するものである。
【０１２８】
実施例 16 に示すように、hｍｗ１Ａおよびhｍｗ２Ａ遺伝子は、hｍｗを含みＨ.インフルエンザ型ではないあらゆる菌株からＰＣＲ法により増幅されるが、保護性のある組み替え抗原を生成するためではなく、これらはhｍｗＢＣ遺伝子の存在下で発現されなければならない。一般的な発現プラスミドは、Ｔ７プロモーター、菌株 12 hｍｗ１ＢＣ遺伝子、Ｅ.coli cer遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、あらゆるhｍｗＡ遺伝子を挿入するためのクローン部位を含むように構築される。
【０１２９】
プラスミドＢＫ-76-１-１(図 10、実施例 10)をＥcoＲ Iで消化して最連結させ、hｍｗ１Ａの３'-末端と削除されたhｍｗ１Ｂの５'-末端を含む２kbのＥcoＲ I断片を有するプラスミドJＢ-2581-２-１を生成した(図 32 Ａ)。次の操作のためにＢＫ-76-１-１からの２kbのＥcoＲ I断片をpＵＣ-ＢgＸbにサブクローニングして、プラスミドJＢ-2581-１-１を作成した。図 32 Ｂでは、hｍｗ１Ａの３'-末端(5947.ＳＬ、配列番号 83 ； 5948.ＳＬ、配列番号 86)およびhｍｗ１Ｂの５'-末端(5949.ＳＬ、配列番号 87 ； 5950.ＳＬ、配列番号 90)の増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを示し、２つの遺伝子の接合におけるＸba I部位を紹介する。プラスミドJＢ-2603-１-１は、hｍｗ１Ａ遺伝子の-ＥcoＲ IＸbaI３'-断片 1.5 kbを含み、プラスミドJＢ-2603-２-１は、hｍｗＡ-Ｂ相互遺伝配列およびhｍｗ１Ｂの５'-末端のＸba I-ＥcoＲ I断片約 550 bpを含む。プラスミドJＢ-2581-２-１をＥcoＲ Iで線状化して、脱リン酸化して、JＢ-2603-１-１およびJＢ-2603-２-１からのＥcoＲ I-Ｘba I挿入物と連結させて、プラスミドJＢ-2641-１を生成した。hｍｗ１Ａ遺伝子とhｍｗ１Ｂ遺伝子の間に余分なＸba I部位を含むこと以外は、このプラスミドはＢＫ-76-１-１と全く同じである。プラスミドJＢ-2641-１をＸba Iで消化すると完全なhｍｗ１Ａ遺伝子が削除されたが、hｍｗ１ＢＣ遺伝子はそのまま残った。ベクター断片の再連結によって、hｍｗＡ遺伝子をＸba I部位でクローニング可能な一般的な発現ベクターであるプラスミドJＢ-2646-１が生成した(図 32 Ａ)。
【０１３０】
一般的な発現ベクターの有用性を例証するために、菌株 12 hｍｗ１ＢＣ遺伝子と結びついたＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子を含むキメラＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを生成した。ＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子を、図 33 Ｂで例示されpＣＲ IIにクローニングされるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅させ、半時計方向の定位にhｍｗ２Ａ遺伝子を含むプラスミドＢＫ-137-３-10 を生成した。クローニング用にhｍｗ２Ａ遺伝子の定位を変えるために、このプラスミドをＢaｍＨ Iで消化してhｍｗ２Ａ挿入物を切り離して、次いで両断片を再連結した。プラスミドＢＫ-177-３-２は、時計方向の定位にＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子を含む。プラスミドＢＫ-177-３-２をＮde IおよびＸho Iで消化して、hｍｗ２Ａ断片をＮde IおよびＳal Iで消化しておいたpＴ７-７に連結させ、プラスミドＢＫ-189-２-５を生成した。一般的な発現プラスミドJＢ-2646-１(図 32 Ａ)をＸba Iで線状化して脱リン酸化した。プラスミドＢＫ-189-２-５をＸba Iで消化して、それによって発現ベクターに挿入するはずのhｍｗ２Ａ遺伝子を切り離した。したがってプラスミドＤＳ 2334-５は、ＬＣＤＣ２からのhｍｗ２Ａ遺伝子および菌株 12 からのhｍｗ１ＢＣ遺伝子から成るＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子カセットを含む。
【０１３１】
実施例 19
この実施例は、Ｔ７ hｍｗＡ/Ｔ７ hｍｗＡＢＣカセット、Ｅ.coli cer遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ 2400-13 の構築について例示するものである。
【０１３２】
プラスミドＤＳ 1843-２は、ＥcoＲ I部位とＰst I部位の間に挿入されるマルチクローニング部位を含むテトラサイクリン耐性pＢＲベースベクターである。ＤＳ-1843-２をＸho Iで線状化し、脱リン酸化して、pＵＣ-４Ｋからのカナマイシン耐性遺伝子をＳal I断片上に挿入して、テトラサイクリンとカナマイシンの両方に耐性のあるプラスミドＤＳ-2372-31 を生成した。プラスミドＤＳ-2372-31 をＢgl IIで線状化、脱リン酸化して、プラスミドＤＳ-2224-１-４からの合成Ｅ.coli cer遺伝子をＢaｍＨ I断片上に挿入して、プラスミドＤＳ-2379-２-６を生成した。プラスミドＤＳ-1046-１-１(図３Ａ、実施例３)をＢgl-IIおよびＳal-Iで消化して、Ｔ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子断片をＢaｍＨ IおよびＳal Iで消化されていたＤＳ-2379-２-６に挿入した。生成したプラスミド(ＤＳ-2391-１)は、Ｔ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子およびＥ.coli cer遺伝子を含むpＢＲベースカナマイシン耐性およびテトラサイクリン感受性ベクターである。JＢ-2369-６(図７、実施例７)をＢaｍＨ Iで消化して、pＢＲ Ｔ７hｍｗＡＢＣ/cer/kanＲベクターの特異的ＢaｍＨ I部位に挿入される内在３'-hｍｗＡ/Ｔ７ ５'-hｍｗＡ断片を切り離した。したがって、生成したpＢＲ Ｔ７ hｍｗＡ/Ｔ７ hｍｗＡＢＣ/cer/kanＲプラスミド(ＤＳ-2400-13)は複数のhｍｗＡ遺伝子を含む(図 34 参考文献)。
【０１３３】
(開示の概要)
本開示を要約すると、本発明は、核酸分子および核酸分子が組み込まれた構築体を提供するものであり、防御的な非分類型Ｈaeｍophilus influenzaeの高分子量タンパク質の組換えによる生産を可能にする。本発明の範囲内で、修正は可能である。
【０１３４】
【表２】
９匹のチンチラのグループに、アラムに吸収される上述の抗原 30 μlで、１,14,28 日目に免疫性を与えた。血液サンプルは 42 日目に集めた。抗血清の反応による滴定濃度を、常に２倍以上の吸光度の増加を示すあらかじめ採取した血清サンプルと共に得られた希釈度の逆数として定義した。２組の数字が２組の実験を示す。
【０１３６】
【表３】
９匹のチンチラのグループに、アラムに吸収される上述の抗原 30 μlで、１,14,28 日目に免疫性を与えた。血液サンプルは 42 日目に集めた。44 日目に、生き生きと培養されたステレオマイシン耐性ＮＴＨi菌株 12 による鼻腔イノキュレーションによって動物を攻撃した。バクテリア攻撃の投与量は、動物あたり１× 108 cfuであった。イノキュレーションの４日後に鼻咽喉洗浄を行い、鼻腔洗浄液 25 μlをチョコレート寒天培地上で培養した。
【０１３８】
鼻腔洗浄流体 25 μlから 50 cfuを超えるバクテリアが回収できない場合、動物は感染していると定義した。
【０１３９】
対照動物とＭann-Ｗhiteney Ｒank Ｓuｍ Ｔestと比較した場合、統計的な有意が見られた(Ｐ＜ 0.05)。
【０１４０】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 全長 160 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1091-２を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＢsがＢsｍ I、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＨＭＷ１pがhｍｗ１プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図１Ｂ】 図１Ａの構築方式に使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号１、２および３)の配列を示す図である。
【図２】 全長 155 kＤaのＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1094-２を創る構築方式である。制限酵素部位の各略号は、ＢgがＢgl II、ＢsがＢsｍ I、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＨＭＷ２pがhｍｗ２プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図３Ａ】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1046-１-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＨＭＷ１pがhｍｗ１プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図３Ｂ】 図３Ａの構築方式に使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号４、５および６)の配列を示す図である。
【図４Ａ】 成熟した 120 kＤaのＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするhｍｗ２ＡＢ遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-1200-３を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＨＭＷ２pがhｍｗ２プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図４Ｂ】 図４Ａの構築方式に使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号７、８および９)を示す図である。
【図５】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１Ａ遺伝子およびhｍｗ１Ｂ遺伝子の一部を含有するプラスミドＤＳ-1122-２を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図６Ａ】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするhｍｗ１Ａ遺伝子を発現するプラスミドJＢ-2330-７を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＸhoがＸho Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図６Ｂ】 図６Ａの構築方式でhｍｗ１Ａの３'-末端をＰＣＲ増幅するために使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号 10、11、12、13 および 14)を示す図である。
【図７】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードするＴ７ hｍｗ１Ａ遺伝子カセットのタンデムコピーを発現するプラスミドJＢ-2369-６を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＴcＲがテトラサイクリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼ、tt１が転写終結因子１、tt２が転写終結因子２、ＭＣＳが多重クローニング部位を示す。
【図８Ａ】 成熟 120 kＤaのＨＭＷ２Ａタンパク質をコードするＴ７ hｍｗ２Ａ遺伝子カセットの各々１個または２個のコピーを含有するプラスミドＤＳ-2084-３およびＤＳ-2084-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＭがＭlu I、ＲがＥcoＲ I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＴcＲがテトラサイクリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼ、tt１が転写終結因子１、tt２が転写終結因子２、ＭＣＳが多重クローニング部位を示す。
【図８Ｂ】 図８Ａの構築方式でhｍｗ２Ａの３'-末端をＰＣＲ増幅するために使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号 15、16、17、18 および 19)を示す図である。
【図９】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードし、アンピシリンまたはカナマイシンで各々選択したタンデムＴ７ hｍｗ１Ａ/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ遺伝子を含有するプラスミドJＢ-2507-７およびＢＫ-86-１-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＴcＲがテトラサイクリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図１０】 成熟 125 kＤaのＨＭＷ１Ａタンパク質をコードし、各々アンピシリンまたはカナマイシンによる選択を利用したＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ/cer遺伝子を含有するプラスミドＢＫ-35-４およびＢＫ-76-１-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位の各略号は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba Iを示す。他の各略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリホスファターゼを示す。
【図１１】 様々な構築体から得られる組換えＨＭＷ１タンパク質の発現のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は広範囲の分子量マーカー、レーン２はＤＳ-1046-１-１[pＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)]、誘導なし、レーン３はＤＳ-1091-２[pＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ(160)]、レーン４はＤＳ-1046-１-１[pＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)]、レーン５はＤＳ-1122-２[pＴ７ hｍｗ１Ａ 部分Ｂ(125)]、レーン６はJＢ-2330-７[pＴ７ hｍｗ１Ａ(125)]、レーン７はJＢ-2369-６[pＢr 328 Ｔ７ hｍｗ１Ａ(125)/Ｔ７ hｍｗ１Ａ(125)]、レーン８はＢＫ-86-１-１[pＴ７ hｍｗ１Ａ(125)/Ｔ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)/kanＲ]、レーン９はＢＫ-76-１-１[pＴ７ hｍｗ１ＡＢＣ(125)/cer/kanＲ]、レーン 10 は広範囲の分子量マーカーである。
【図１２】 ＨＭＷ１およびＨＭＷ２の各組換えタンパク質に対する精製方式を示す図である。各略号は、ＰＰＴがペレット、ＳＵＰが上清液、ＯＧがオクチルグルコシド、ＰＥＧがポリエチレングリコールを示す。
【図１３】 rＨＭＷ１抽出物のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１は予備染色したタンパク質分子量マーカー、レーン２はＥ.coli全細胞溶解物、レーン３はＴris-ＨＣl/ＮaＣl抽出液中の可溶性タンパク質、レーン４はＴris-ＨＣl/Ｔriton Ｘ-100/ＥＤＴＡ抽出液中の可溶性タンパク質、レーン５はＴris-ＨＣl/オクチルグルコシド抽出液中の可溶性タンパク質、レーン６はＴris-ＨＣl/オクチルグルコシド抽出後のペレット、レーン７は２ＭグアニジンＨＣl中の不溶性タンパク質、レーン８は７％ ＰＥＧ沈殿の上清液、レーン９は７％ ＰＥＧ沈殿のペレット、レーン 10 は 50 ％硫酸アンモニウム沈殿の相間ペレット、レーン 11 は下相に回収されるタンパク質、レーン 12 は上相に回収されるタンパク質を示す。
【図１４】 パネルＡおよびＢを含み、精製したrＨＭＷ１およびrＨＭＷ２のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１５】 構築体Ｔ７ hｍｗＡＢＣ/cer/kanＲから得られ、20 ％グリセリン存在下、-20 ℃に保存されたrＨＭＷ１の安定性を示すＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を含んだ図である。
【図１６】 パネルＡおよびＢを含み、様々な構築体から産生されたrＨＭＷ１Ａタンパク質の免疫原性を示す図である。
【図１７】 非分類型Ｈ.influenzaeの染色体ＤＮＡ由来の、追加hｍｗ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す図である(配列番号 20、21、22、23 および 24)。
【図１８】 ＮＴＨi菌株Joycから得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 25)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 26)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 27、アミノ酸配列は配列番号 28)。
【図１９】 ＮＴＨi菌株Joycから得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 29)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 30)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 31、アミノ酸配列は配列番号 32)。
【図２０】 ＮＴＨi菌株Ｋ１から得られる欠陥hｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 33)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 34、35)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 36、アミノ酸配列は配列番号 37、35)。
【図２１】 ＮＴＨi菌株Ｋ 21 から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 38)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 39)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 40、アミノ酸配列は配列番号 41)。
【図２２】 ＮＴＨi菌株ＬＣＤＣ２から得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 42)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 43)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 44、アミノ酸配列は配列番号 45)。
【図２３】 ＮＴＨi菌株ＬＣＤＣ２から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 46)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 47)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 48、アミノ酸配列は配列番号 49)。
【図２４】 ＮＴＨi菌株ＰＭＨ１から得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 50)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 51)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 52、アミノ酸配列は配列番号 53)。
【図２５】 ＮＴＨi菌株ＰＭＨ１から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 54)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 55)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 56、アミノ酸配列は配列番号 57)。
【図２６】 ＮＴＨi菌株 15 から得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 58)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 59)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 60、アミノ酸配列は配列番号 61)。
【図２７】 ＮＴＨi菌株 15 から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 62)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 63)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 64、アミノ酸配列は配列番号 65)。
【図２８】 ＮＴＨi菌株 12 から得られるhｍｗ１Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 66)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 67)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 68、アミノ酸配列は配列番号 69)。
【図２９】 ＮＴＨi菌株 12 から得られるhｍｗ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号 70)および推定されるアミノ酸配列(配列番号 71)を示す図である。矢印は成熟タンパク質の予想される開始部位を示す(成熟タンパク質:コード化配列は配列番号 72、アミノ酸配列は配列番号 73)。
【図３０】 推定されるＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質配列(配列番号 26、30、34、35、39、43、47、51、55、59、63)を公表された菌株 12 のＨＭＷ１ＡおよびＨＭＷ２Ａタンパク質配列(米国特許第 5603938 号)(配列番号 67、71)と一直線に並べた図である。
【図３１】 ＰＣＲ増幅されたhｍｗＡ遺伝子がhｍｗ１か、またはhｍｗ２であるかを決定するために使用されるオリゴヌクレオチド(配列番号 74、75、76、77、78、79、80、81)を示す図である。
【図３２Ａ】 任意のhｍｗＡ遺伝子を挿入することのできる属共通のＴ７ hｍｗＡＢＣ発現プラスミドJＢ-2646-１を創る構築方式を示す図である。制限酵素部位は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba Iを示す。他の略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリフォスファターゼを示す。
【図３２Ｂ】 図 32 Ａの構築方式でhｍｗ１Ａの３'-末端およびhｍｗ１Ｂの５'-末端をＰＣＲ増幅するために使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号 82、83、84、85、86、87、88、89、90)を示す図である。
【図３３Ａ】 ＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子およびＮＴＨI 12 hｍｗＢＣ遺伝子のキメラＴ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子を含むＤＳ-2334-５の構築を示す図である。制限酵素部位は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＫがＫpn I、ＮがＮde I、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリフォスファターゼを示す。
【図３３Ｂ】 図 33 Ａに示すように構築される属共通の発現ベクターに発現するために、ＬＣＤＣ２ hｍｗ２Ａ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用される各オリゴヌクレオチド(配列番号 91、92、93、94、95)を示す図である。
【図３４】 Ｔ７ hｍｗＡ/Ｔ７ hｍｗＡＢＣ遺伝子およびＥ.coli cer遺伝子を含むＤＳ-2400-13 の構築を示す図である。制限酵素部位は、ＢがＢaｍＨ I、ＢgがＢgl II、ＨがＨind III、ＲがＥcoＲ I、ＳがＳal I、ＸbがＸba I、ＸhoがＸho Iを示す。他の略号は、Ｔ７pがＴ７プロモーター、ＡpＲがアンピシリン耐性遺伝子、ＫanＲがカナマイシン耐性遺伝子、ＴetＲがテトラサイクリン耐性遺伝子、ＣＡＰが子ウシアルカリフォスファターゼを示す。
Claims (13)
- Ｅ.coli で機能し、Ａ遺伝子、Ｂ遺伝子、およびＣ遺伝子を含む非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株12の修飾オペロンに作働可能に結合されたプロモーターを含む核酸分子であって、オペロンのＡ遺伝子が、非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株の成熟高分子量タンパク質をコードする核酸配列のみ含有することを特徴とする核酸分子。
- 前記プロモーターがＴ７プロモーターであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
- 前記オペロンが、非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株の高分子量タンパク質１(ＨＭＷ１)または非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株の高分子量タンパク質２(ＨＭＷ２)をコードすることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸分子。
- 成熟高分子量タンパク質をコードする前記核酸配列が、
配列番号68 または 72 を有する核酸配列を有すること、あるいは、
配列番号69 または 73 を有するアミノ酸配列を有するＨＭＷ１タンパク質またはＨＭＷ２タンパク質をコードすること
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子。 - 非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株の成熟高分子量タンパク質をコードする追加の核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子。
- Ｅ.coli の cer 遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子。
- (a)図28 または 29 に示された ( それぞれ配列番号 68 または 72 である )ＤＮＡ配列、または
(b)図28 または 29 に示された ( それぞれ配列番号 69 または 73 である )アミノ酸配列を有する高分子量タンパク質をコードするＤＮＡ配列
を有することを特徴とする、非分類型Ｈaeｍophilus influenzae菌株の高分子量(ＨＭＷ)タンパク質をコードする、単離され精製された核酸分子。 - 請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子を含む宿主を形質転換するように適合されたことを特徴とするベクター。
- プラスミドベクターであることを特徴とする請求項８に記載のベクター。
- 前記プラスミドが、プラスミド
ＤＳ-2400-13 (ＡＴＣＣ Ｎo.:203257)
の識別形質を有することを特徴とする請求項９に記載のベクター。 - 請求項８〜 10のいずれかに記載の発現ベクターにより形質転換され、非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株12の防御高分子量タンパク質を発現させることを特徴とするＥ.coli菌株。
- 請求項８〜 11のいずれかに記載のベクターでＥ.coliを形質転換すること、
Ｅ.coliを成長させて、コードした成熟高分子量(ＨＭＷ)タンパク質を発現させること、および
発現したＨＭＷタンパク質を単離し精製すること
を含むことを特徴とする、非分類型Ｈaeｍophilus influenzae 菌株12の防御高分子量タンパク質を生産する方法。 - 前記単離し精製する手順が、ＨＭＷＡタンパク質と、Ｂ部分およびＣ部分とを分離することを含むことを特徴とする請求項13に記載の方法。
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