JP3516688B2 - トランスフェリン受容体遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 本発明は、トランスフェリン受容体をコードする遺伝
子の分子クローニングに関するものであり、詳細には、
インフルエンザ菌からのトランスフェリン受容体遺伝子
のクローニングに関するものである。

発明の背景 被包性インフルエンザ菌ｂ型株は、若年小児における
細菌性髄膜炎および他の侵襲性感染の主要な原因となっ
ている。しかしながら、非被包性または分類できないイ
ンフルエンザ菌（NTHi）が、中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎お
よび気管気管支炎などの広範囲のヒト疾患の原因となっ
ている。ジフテリアトキソイド（Berkowitz et al.,198
7。本願においては、各種参考文献を括弧内に示して、
本発明が関係する最新技術についてより詳細に説明する
ようにしている。各引例についての完全な文献情報は明
細書末尾で請求の範囲の直前にある。それによって、こ
れら参考文献の開示は、本開示に引用によって含まれる
ものである。）、破傷風トキソイド（Classon et al.,1
989および米国特許449638号）または髄膜炎菌外膜蛋白
（Black et al.,1991）に接合したインフルエンザ菌ｂ
型莢膜多糖に基づくワクチンが、インフルエンザ菌ｂ型
誘発髄膜炎の低減に有効であったが、NTHi誘発疾患には
効果はなかった（Bluestone,1982）。

中耳炎は若年小児において最も一般的な疾病であり、
２歳未満の小児全体の60〜70％が１〜３回の耳感染を経
験している。慢性中耳炎は、小児における聴覚、言語お
よび認識力の障害の原因となっている。急性中耳炎の患
者の約30％および慢性中耳炎の約60％の原因が、インフ
ルエンザ菌であるとされる。米国のみで見ると、中耳炎
治療の費用は、抗生物質ならびに扁桃摘除術、咽頭扁桃
摘出術および鼓膜切開管の挿入などの外科的手術に対し
て、年間で10〜20億ドルとなっている。さらに、中耳炎
の原因となる微生物の多くが、抗生物質治療に対して耐
性である。そこで、中耳炎に対して有効な予防ワクチン
が望まれる。分類できないインフルエンザ菌株は、高齢
者および他の呼吸系感染に対して特に感受性の高い者に
おける肺炎の原因ともなっている。そこで、多くの血清
型のインフルエンザ菌に対する保護を提供する免疫原性
製剤中での成分として有用なインフルエンザ菌からの抗
原が必要とされている。

鉄は、多くの細菌の成長において必須の栄養素であ
る。インフルエンザ菌、カタル球菌、髄膜炎菌、淋菌お
よび非病原性の共生ナイセリア菌株などのいくつかのヒ
ト病原菌は、鉄源としてヒトトランスフェリンを利用す
ることができる（Schryvers,1988;Schryvers and Lee,1
989;Mickelsen and Sparling,1981）。細菌トランスフ
ェリン受容体（TfR）は、２つの鎖Tbp1およびTbp2から
成る。インフルエンザ菌株では、Tbp1の分子量は約1000
00であるのに対して、Tbp2の分子量は60000〜90000の範
囲で変動し、菌株ごとに異なる（Schryvers and Gray−
Owen,1992;Holland et al.,1992）。インフルエンザ菌
トランスフェリン受容体の発現は、鉄および／またはヘ
ミン調節性であると考えられ（Morton et al.）、tbp2
の上流で、fur結合部位（Braun and Hantke,1991）が確
認されている。この配列は、髄膜炎菌TfR（Legrain et
al.,1993）などの鉄による負の調節を受ける遺伝子のプ
ロモータ領域で認められる。そのプロモータの次には、
tbp2遺伝子およびtbp1遺伝子が来て、その配置は他のTf
Rオペロンで認められるものである（Legrain et al.,19
93;Wilton et al.,1993）。トランスフェリン受容体の
鉄源への接近を遮断する抗体は、細菌の成長を防止する
ことができる。さらに、オプソニン作用性または殺細菌
性であるTfRに対する抗体も、別途の機序によって保護
を行うことができる。そこで、トランスフェリン受容
体、それの断片、それの構成鎖またはそれから誘導され
るペプチドは、インフルエンザ菌疾患に対する予防を行
う上でのワクチン候補となる。フロイントアジュバント
で髄膜炎菌TfR蛋白によって免疫感作されたマウスは、
同種攻撃から保護され、抗TfR抗血清は受身伝達アッセ
イにおいて殺細菌性であり、予防効果があった（Danve
et al.,1993）。組換え牛肺疫菌Tbp2によって免疫感作
されたブタは、同種攻撃に対して保護されたが、異種攻
撃については保護されなかった（Rossi−Campos et a
l.,1992）。これらのデータは、疾患からの保護におけ
るTfRに基づくワクチンの効力を示すものである。診
断、免疫感作および診断・免疫感作試薬の生成におい
て、トランスフェリンの一部に相当するトランスフェリ
ン受容体およびペプチドをコードするDNA分子の配列な
らびにそのような配列を有するベクターを提供すること
が望ましいものと考えられる。

ポリオウィルスは、ピコルナウイルス科の属であるエ
ンテロウィルスである。そのウィルスには３つの異なる
血清型があり、各血清型には複数の株がある。病毒性株
は、麻痺性灰白髄炎の病原体である。麻痺性疾患を起こ
す能力を低下させた弱毒化株および失活させた病毒性株
は、ワクチンとして有用である。そのウィルスに感染す
ると、長期間の保護的な粘膜の免疫が誘発される。不活
化ポリオウィルスワクチンの接種によっても、粘膜免疫
応答を誘発することができる。

ポリオウィルスの構造は公知であり、菌株および血清
型間で非常に高い保守性がある。いくつかの他のピコル
ナウィルス（ピコルナウィルス科の属に属するウィル
ス）の構造も決定されており、ポリオウィルスの構造と
近い関係にあることが明らかになっている。ポリオウィ
ルスのカプシドにおいて異種エピトープを発現すること
は可能であり（Murdin et al,1992）、その研究は他の
ピコルナウィルスに拡張されている。これまで発現され
たエピトープは通常は、短く、明瞭で近接したエピトー
プであり、ほとんどが、ポリオウィルス中和抗原性部位
Ｉ（NAg I）または他のピコルナウィルスの等価な部位
内で発現されたものである。この部位には、ポリオウィ
ルスカプシド蛋白VP1のβ鎖ＢおよびＣを連結するルー
プ（BCループ）がある。VP1のBCループは、アミノ酸９
個の表面露出ループであり、それらのアミノ酸は25個以
上の異種アミノ酸によって置換および延長され得るもの
である（Murdin et al.,1991）。高力価まで成長し、免
疫原性であるトランスフェリン受容体エピトープを発現
するハイブリッドまたはキメラのポリオウィルスは、ワ
クチンとして、さらには免疫原性試薬製造の手段として
有用であると考えられる。

本発明者らのWO 95/13370では、ヘモフィルス株のト
ランスフェリン受容体蛋白をコードする精製・単離核酸
分子の提供が記載されており、具体的には、インフルエ
ンザ菌ｂ型DL63株、MinnAおよびEaganのトランスフェリ
ン受容体遺伝子についての核酸配列と、分類できないイ
ンフルエンザ菌株であるPACK12085、SB12、SB29、SB3
0、SB32およびSB33についての核酸配列、ならびにコー
ドTpb1およびTpb2蛋白の誘導アミノ酸配列を提供してい
る。組換えによるものおよび細菌からのものの両方のTb
p1およびTbp2蛋白の製造について記載されている。WO 9
5/13370からのある種の記載および図面を本明細書にお
いても繰り返してある。

発明の概要 全長のTbp2蛋白少量を、大腸菌で産生させる。本発明
者らは、遺伝子の3'末端の切断によってTbp2の収量を高
くできること、ならびにある種のそのような切断によっ
て、菌血症の幼若ラットモデルで動物を保護する能力が
保持されることを認めている。

本発明は、ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体
の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核酸分子
を提供することを目的とする。本発明で提供される核酸
分子は、ヘモフィルス株の特異的検出、ならびにヘモフ
ィルスによる感染の診断に有用である。DNAなどの本発
明で提供される精製・単離核酸分子は、組換えDNA手段
によって切断TfR遺伝子を発現することで、経済的な形
で、トランスフェリン受容体蛋白の精製・単離切断類縁
体を提供する上でも有用である。トランスフェリン受容
体蛋白の切断類縁体、ならびにそれをコードする核酸分
子およびそのような核酸分子を有するベクターは、ヘモ
フィルスによって起こる疾患に対する免疫原性組成物、
ヘモフィルスによる感染の診断において、さらには免疫
試薬の形成手段として有用である。本発明の態様に従っ
て産生されるトランスフェリン受容体蛋白の切断類縁体
に対して形成されたモノクローナル抗体または単一特異
的抗血清（抗体）は、ヘモフィルスによる感染の診断、
ヘモフィルスの特異的検出（例えば、in vitroおよびin
vivoでのアッセイで）およびヘモフィルスによって生
じる疾患の治療において有用である。

本発明の１態様によれば、ヘモフィルス株、詳細には
インフルエンザ菌株、具体的にはインフルエンザｂ型DL
63株、EaganもしくはMinnAまたはインフルエンザ菌株PA
K12085、SB33、SB12、SB29、SB30もしくはSB32などの分
類できないインフルエンザ菌株のトランスフェリン受容
体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・単離核
酸分子、あるいは該トランスフェリン受容体蛋白の断片
もしくは類縁体が提供される。

本発明の好ましい１実施態様において、核酸分子は、
Ｃ末端から切断されたトランスフェリン受容体蛋白の切
断類縁体、特にはヘモフィルス株の切断Tbp2蛋白をコー
ドすることができる。そのようなコードされた切断Tbp2
蛋白は、インフルエンザ菌ｂ型のEagan株について図31
に示したものまたは別のヘモフィルス株からの等価なTb
p2蛋白のいずれかであることができる。

本発明の別の態様においては、ヘモフィルス株のトラ
ンスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコード
する精製・単離核酸分子であって、該核酸分子が、
（ａ）図３、４、５、６、７、８、９、10もしくは11に
示したDNA配列（配列番号:1、２、３、４、105、108、1
10、112、114）のいずれかまたは前記配列のいずれかの
相補的DNA配列；（ｂ）図３、４、５、６、７、８、
９、10、11もしくは31に示したアミノ酸配列（配列番
号:5、６、７、８、９、10、11、12、106、107、109、1
11、113、115）のいずれかをコードするDNA配列または
それに対する相補的DNA配列；ならびに（ｃ）厳しい条
件下に（ａ）もしくは（ｂ）で定義されたDNA配列のい
ずれかに対してハイブリッド形成するDNA配列からなる
群から選択される切断型のDNA配列である分子が提供さ
れる。（ｃ）で定義されるDNAは好ましくは、（ａ）お
よび（ｂ）で定義されるDNA配列のいずれかと配列が約9
0％以上同一である。

別の態様において本発明には、宿主の形質転換に使用
される発現ベクターであって、本発明で提供される核酸
分子ならびにトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切
断類縁体の宿主による発現を行うための核酸分子に効果
的に結合された発現手段とを有してなるベクターが含ま
れる。発現手段は、トランスフェリン受容体蛋白の切断
類縁体の宿主からの分泌のためのリーダー配列をコード
する核酸部分を含むことができる。発現プラスミドは、
免疫原性切断類縁体を発現する表８のクローンのいずれ
かから選択することができる。宿主は、例えば大腸菌、
桿菌、ヘモフィルス、真菌、酵母またはバキュロウィル
スから選択することができ、Semiliki forestウィルス
発現系を使用することができる。

本発明のさらに別の態様では、本発明で提供される発
現ベクターを有する形質転換宿主が提供される。本発明
にはさらに、形質転換された宿主によって産生可能なト
ランスフェリン受容体蛋白の組換え免疫原性切断類縁体
も含まれる。

本発明は、さらに別のその態様において、ヘモフィル
ス株の免疫原性切断Tbp2蛋白を提供するものである。Tb
p2蛋白は、そのＣ末端から切断することができ、特には
インフルエンザ菌ｂ型のEagan株について図31に示した
切断蛋白のいずれか、または別のヘモフィルス株からの
等価なTbp2蛋白であることができる。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明で提供され
る１以上の核酸分子、本発明で提供される１以上の組換
え蛋白、本発明で提供されるヘモフィルス株の１以上の
免疫原性切断Tbp2蛋白および本発明で提供される生ベク
ターから選択される１以上の活性成分と、該活性成分の
担体または該活性成分のベクターを有してなる免疫原性
組成物が提供される。その１以上の活性成分は、宿主に
投与した際に、免疫応答を生じるものである。

本発明で提供される免疫原性組成物は、in vivoで投
与して、トランスフェリン受容体を産生する病原菌によ
って起こる疾患に対する保護を行うワクチンとして製剤
することができる。そのような目的で、組成物は、微粒
子、カプセルまたはリポソーム製剤として製剤すること
ができる。別法として、免疫系の特異的細胞または粘膜
表面への運搬のためのターゲティング分子との併用で組
成物を提供することができる。免疫原性組成物は、複数
の活性成分を含有して、複数種のトランスフェリン受容
体産生細菌によって起こる疾患に対する保護を提供する
ことができる。免疫原性組成物にはさらに、アジュバン
トを含有させることができる。

本発明のさらに別の態様によれば、トランスフェリン
受容体蛋白を産生するヘモフィルスその他の病原菌によ
って生じる感染もしくは疾患に対する保護を行う方法で
あって、ヒトなどの感受性宿主に、有効量の上記のよう
な免疫原性組成物を投与する段階を有する方法が提供さ
れる。

本発明のさらに別の態様によれば、組換え切断蛋白、
切断Tbp2蛋白または免疫原性組成物に対して特異的な抗
血清または抗体が提供される。

さらに別の態様では、宿主へのトランスフェリン受容
体の運搬のための生ベクターであって、上記のような核
酸分子を含むベクターを有してなる生ベクターが提供さ
れる。そのベクターは、サルモネラ、BCG、アデノウィ
ルス、ポックスウイルス、牛痘およびポリオウィルスか
ら選択することができる。

さらに別の態様において本発明は、ヘモフィルス株の
免疫原性切断Tpb2蛋白を製造する方法であって、制御配
列に対して有効に結合したヘモフィルス株の免疫原性切
断Tbp2蛋白をコードする核酸分子を有する発現ベクター
を構築する段階；前記発現ベクターを宿主に導入する段
階；ならびに免疫原性切断Tbp2蛋白を宿主から発現させ
る段階を有してなる方法を提供するものである。使用さ
れる発現ベクターは、表８に示した発現ベクターのいず
れかであることができる。

図面の簡単な説明 図面を参照しながら、以下の説明によって、本発明に
ついての理解を深めることができる。

図1Aは、インフルエンザ菌ｂ型DL63株のトランスフェ
リン受容体オペロンの２個のプラスミドクローン（pBHT
1およびpBHT2）の制限マップを示す図である。

図1Bは、インフルエンザ菌ｂ型Eagan株からのTfR遺伝
子を含むクローンＳ−4368−３−３およびJB−901−５
−３の制限マップを示す図である。

図1Cは、インフルエンザ菌ｂ型MinnA株からのトラン
スフェリン受容体遺伝子を含むクローンDS−712−１−
３の制限マップを示す図である。

図1Dは、分類できないインフルエンザ菌株PAK12085か
らのトランスフェリン受容体遺伝子を含むクローンJB−
1042−７−６の制限マップを示す図である、 図２は、クローニングされたTbp1およびTbp2遺伝子の
構造および制限マップと、単一プロモータの転写調節下
にオペロンを形成する縦列での２個の遺伝子（tbp1およ
びtbp2）を有するTfRオペロンの遺伝子構造を示し、ヘ
モフィルス株からのTfR遺伝子についてのライブラリを
調べるのに使用されるpBHIT2の3.0kb DNA断片を描いた
図である。

図３は、インフルエンザ菌ｂ型DL63株からのトランス
フェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号:
1）とその推定アミノ酸配列（配列番号:5−Tbp1および
配列番号:6−Tbp2）を示す図である。下線を施してある
アミノ酸配列は、アミノ酸配列決定によって確認された
Tbp1のペプチドに相当する。推定信号配列は二重上線で
示してあり、Tbp2では１〜17の残基およびTbp1では１〜
23の残基に相当する。

図４は、インフルエンザ菌ｂ型Eagan株からのトラン
スフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配列番
号:2）とその推定アミノ酸配列（配列番号:7−Tbp1およ
び配列番号:8−Tbp2）を示す図である。推定の−35、−
10およびリボソーム結合部位配列には上線が施してあ
る。

図５は、インフルエンザ菌ｂ型Minn株からのトランス
フェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号:
3）とその推定アミノ酸配列（配列番号:9−Tbp1および
配列番号:10−Tbp2）を示す図である。推定の−35、−1
0およびリボソーム結合部位配列には上線が施してあ
る。

図６は、分類できないインフルエンザ菌株PAK12085か
らのトランスフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列
（配列番号:4）とその推定アミノ酸配列（配列番号:11
−Tbp1および配列番号:12−Tbp2）を示す図である。推
定の−35、−10およびリボソーム結合部位配列には上線
が施してある。

図７は、分類できないインフルエンザ菌株SB33からの
トランスフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列（配
列番号:105）とその推定アミノ酸配列（配列番号:106−
Tbp1および配列番号:107−Tbp2）を示す図である。

図８は、分類できないインフルエンザ菌株SB12からの
Tbp2遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号:108）とその
推定アミノ酸配列（配列番号:109−Tbp2）を示す図であ
る。

図９は、分類できないインフルエンザ菌株SB29からの
Tbp2遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号:110）とその
推定アミノ酸配列（配列番号:111−Tbp2）を示す図であ
る。

図10は、分類できないインフルエンザ菌株SB30からの
Tbp2遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号:112）とその
推定アミノ酸配列（配列番号:113−Tbp2）を示す図であ
る。

図11は、分類できないインフルエンザ菌株SB32からの
Tbp2遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号:114）とその
推定アミノ酸配列（配列番号:115−Tbp2）を示す図であ
る。

図12Aは、インフルエンザ菌株Eagan、MinnA、PAK1208
5およびSB33からのプロモータ領域のヌクレオチド配列
とtbp2遺伝子の5'末端を示す図である（それぞれ、配列
番号:116、117、118および119）。PCRによってtbp2遺伝
子を増幅するのに使用されるコード鎖プライマーには下
線が施してある（配列番号:120）。

図12Bは、インフルエンザ菌株Eagan、MinnA、Dl63、P
AK12085、SB12、SB29、SB30およびSB32からの遺伝子間
領域とtbp1遺伝子の5'末端を示す図である（それぞれ、
配列番号:121、122、123、124、125、126、127および12
8）。PCRによってtbp2遺伝子を増幅するのに使用される
非コード鎖プライマーには下線が施してある（配列番
号:129）。

図13は、分類できないインフルエンザ菌株SB12、SB2
9、SB30、SB32およびSB33からのPCR増幅tbp2遺伝子のア
ガロースゲル分析を示す図である。列１はSB33であり、
列２はSB12であり、列３はSB29であり、列４はSB30であ
り、列５はSB32である。

図14は、インフルエンザ菌株Eagan、DL63、PAK12085
およびSB33から、髄膜炎菌株B16B6およびM982から、な
らびに淋菌株FA19からのTbp1のアミノ酸配列を比較した
図である（それぞれ、配列番号:7、５、11および106;配
列番号:94および95;配列番号:96）。

図15は、インフルエンザ菌株Eagan、DL63、PAK1208
5、SB12、SB29、SB30およびSB32から（配列番号:8、
６、12、109、110、112、114）、髄膜炎菌株B16B6およ
びM982（配列番号:97および98）から、淋菌株FA19なら
びにアクチノバチルス牛肺疫菌株AP205およびAP37（配
列番号:99および100）からのTbp2のアミノ酸配列を比較
した図である。

図16Aは、インフルエンザ菌Tbp1蛋白の予想２次構造
を示す図であり、図16Bは、インフルエンザ菌Tbp2蛋白
の予想２次構造を示す図である。

図17は、大腸菌からのインフルエンザ菌ｂ型Eagan Tb
p1を発現するプラスミドJB−1468−29の構築図式を示す
図である。

図18は、大腸菌からのインフルエンザ菌ｂ型Eagan Tb
p2を発現するプラスミドJB−1424−２−８の構築図式を
示す図である。

図19は、プラスミドJB−1424−２−８の構築に使用さ
れるオリゴヌクレオチド対（配列番号:130および131）
を示す図である。

図20は、Tbp1およびTbp2発現プラスミドを構築するた
めのオリゴヌクレオチド対Ａ（配列番号:86および8
7）、Ｂ（配列番号:88および89）、Ｃ（配列番号:90お
よび91）およびＤ（配列番号:92および93）の配列を示
す図である。

図21は、大腸菌からのインフルエンザ菌SB12 Tbp2を
発現するプラスミドJB−1600−１の構築図式を示す図で
ある。

図22は、大腸菌からのヘモフィルスｂ型Eagan Tbp1蛋
白、Eagan Tbp2蛋白および分類できないインフルエンザ
菌SB12 Tbp2蛋白の発現からの生成物のSDS−PAGEゲルを
示す図である。列１はt_oでのJB−1476−２−１（T7/Eag
an Tbp1）であり、列２はｔ＝4h誘発でのJB−1476−２
−１であり、列３は、200kDa、116kDa、97.4kDa、66kD
a、45kDaおよび31kDaの分子量マーカーであり、列４はt
_oでのJB−1437−４−１（T7/Eagan Tbp2）であり、列５
はｔ＝4h誘発でのJB−1437−４−１であり、列６はt_oで
のJB−1607−１−１（T7/SB12 Tbp2）であり、列７はｔ
＝4h誘発でのJB−1607−１−１である。

図23は、大腸菌から発現された組換えTbp1およびTbp2
の精製図式を示した図である。

図24は、図23の図式によって精製した組換えTbp1およ
びTbp2の純度分析を示す図である。列１には分子量マー
カーがあり（106、80,49.5、32.5、27.5および18.5kD
a）、列２は大腸菌全細胞溶解物である。列３は、可溶
化封入体である。列４は精製Tbp1またはTbp2である。

図25は、マウスにおけるrTbp1（上図）およびrTbp2
（下図）の免疫原性を示す図である。

図26は、ウェスタンブロッティングでの各種インフル
エンザ菌株との抗Eagan rTbp1抗血清の反応性を示す図
である。列１はBL21/DE3であり、列２はSB12−EDDAであ
り、列３はSB12＋EDDAであり、列４はSB29−EDDAであ
り、列５はSB29＋EDDAであり、列６はSB33−EDDAであ
り、列７はSB33＋EDDAであり、列８はEagan−EDDAであ
り、列９はEagan＋EDDAであり、列10はカタル球菌4223
−EDDAであり、列11はカタル球菌4223＋EDDAであり、列
12は髄膜炎菌608−EDDAであり、列13は髄膜炎菌608＋ED
DAであり、列14は組換えEagan Tbp1を発現する誘発JB−
1476−２−１であり、列15は分子量マーカーである。特
異的な約95kDaの帯域は、インフルエンザ菌株SB12、SB2
9、SB33およびEaganに相当する列３、４、５、７、８お
よび９で抗Tbp1抗血清と反応し、約110kDaの帯域は、カ
タル球菌株に相当する列10および11で反応し、約80kDa
の帯域は、髄膜炎菌608に相当する列12および13で反応
した。

図27は、ウェスタンブロッティングにおける各種イン
フルエンザ菌株との抗Eagan rTbp2抗血清の反応性を示
す図である。列１は分子量マーカーであり、列２は組換
えEagan Tbp2を発現する誘発JB−1437−４−１であり、
列３はSB12−EDDAであり、列４はSB12＋EDDAであり、列
５はSB29−EDDAであり、列６はSB29＋EDDAであり、列７
はSB30−EDDAであり、列８はSB30＋EDDAであり、列９は
SB32−EDDAであり、列10はSB33−EDDAであり、列11はSB
33＋EDDAであり、列12はPAK−EDDAであり、列13はPAK＋
EDDAであり、列14はEagan−EDDAであり、列15はEagan＋
EDDAである。60〜70kDaの特異的帯域は、列３、６、
７、８、13、14および15、すなわち株SB12、SB29、SB3
0、PAKおよびEaganでの抗Tbp2抗血清と反応性であっ
た。

図28は、トランスフェリン受容体を産生しないインフ
ルエンザ菌株を得るのに使用されるプラスミドpUHIT1KF
HおよびpUHIT1KFPの構築を示した図である。

図29は、トランスフェリン受容体蛋白を産生する細菌
間で保存されるトランスフェリン受容体蛋白由来のエピ
トープを発現するキメラのポリオウィルスをコードする
プラスミドの構築を示す図である。

図30は、トランスフェリン受容体蛋白を産生する細菌
間で保存されるトランスフェリン受容体蛋白由来のエピ
トープを発現するポリオウィルスキメラによるウサギの
免疫感作によって産生される抗血清の反応性を示すウェ
スタンブロッティングである。Ａ図は大腸菌で発現され
たインフルエンザ菌株SB12からの精製組換えTbp2（列
１）、カタル球菌株4223からの精製Tbp2（列２）、鉄制
限カタル球菌株4223の全細胞溶解物（列３）、非鉄制限
条件下に成長させた大腸菌JM109の全細胞溶解物（列
５）を示すクマシー・ブリリアント・ブルー染色ゲルを
示す図である。Ｂ図は、PV1TBP2Aで免疫感作したウサギ
から第27日に採取した血清蓄積液を用いた複製ゲルのウ
ェスタンブロッティングの結果を示す図である。Ｃ図
は、同じものからの採血前血清の蓄積液についての結果
であって、最小の特異的反応性を示したものの図であ
る。

図31は、トランスフェリン受容体蛋白Tbp2の多くの切
断類縁体を示す図である。

図32は、トランスフェリンに対する切断Tbp2蛋白の結
合を示す図である。

上記の図の一部においては、以下の略称を用いて、特
定部位特異的な制限エンドヌクレアーゼを称している。
すなわち、ＲはEco R Iであり、PsはPst Iであり、Ｈは
Hind IIIであり、BgはBg1 IIであり、NdeはNde Iであ
り、EarはEar Iであり、SauはSau3A Iである。

図28において、以下の略称を用いて、特定部位特異的
な制限エンドヌクレアーゼを称している。すなわち、Ａ
はAcc Iであり、ＢはBam H Iであり、ＥはEco R Iであ
り、ＯはXho Iであり、ＨはHind IIIであり、PsはPst I
であり、ＶはEco R Vであり、ＸはXba Iであり、ＧはBg
l IIであり、ＳはSal Iであり、ＫはKpn Iであり、Ｓ^＊
はSac Iである。

発明の詳細な説明 ヘモフィルス株を適切に使用して、本発明の実施態様
を代表とするトランスフェリン部分をコードする核酸の
少なくとも一部を有してなるDNA分子の形態であること
ができる精製・単離核酸を提供することができる。その
ような菌株は一般に、臨床的入手源および細菌培養収集
（例:American Type Culture Collection）から入手す
ることができる。

本発明の１態様によれば、トランスフェリン受容体蛋
白は、既報の方法（Schryvers（1989）、ogunnaviwo an
d Schryvers（1992）および米国特許5141743号（これの
テーマは引用によって本明細書に含まれるものであ
る））によってヘモフィルス株から単離することができ
る。適切な方法の詳細は米国特許5141743号に記載され
ているが、そのような方法の簡単な要旨を以下に説明す
る。トランスフェリン受容体の単離は、トランスフェリ
ン結合活性を発現する細菌株から膜分画を単離し、膜分
画中のトランスフェリン受容体に対してトランスフェリ
ンを予め結合させる段階、膜を可溶化する段階、トラン
スフェリンを固定化する段階および固定化トランスフェ
リンからトランスフェリン受容体を分離する段階という
一連の段階が関与するアフィニティ法によってトランス
フェリン受容体を精製することで行われる。別法とし
て、受容体蛋白は、予め結合させる段階を省略し、高濃
度の塩を可溶化緩衝液に含有させて、既報の方法（Ogun
nariwo and Schryvers（1992））に従って固定化トラン
スフェリンによる直接単離を可能とする、上記の方法の
変法によって単離することができる。

本願において、「トランスフェリン受容体蛋白の切断
類縁体」という用語は、全長蛋白と比較して切断された
Tbp1および／またはTbp2蛋白類を定義するために用いら
れ、例えばヘモフィルスなどの各種菌株における天然の
ものなどの、それら蛋白のアミノ酸配列が変わったもの
も含まれる。トランスフェリン受容体の他の細菌源とし
ては、ナイセリア属、ブランハメラ属、パストレラ属お
よびアクチノバチルス属などがあるが、これらに限定さ
れるものではない。

特定の実施態様において、トランスフェリンはインフ
ルエンザ菌ｂ型DL63株から単離され、既報の方法（例:S
chryvers（1989）、Ogunnariwo and Schryvers（1992）
および米国特許5141743号）に従ってアフィニティクロ
マトグラフィー法にて精製した。単離・精製トランスフ
ェリン受容体を用いて、ウサギにおいて抗Tf抗Ｒ血清を
得た。インフルエンザ菌ｂ型DL63株からの染色体DNAを
機械的に剪断し、EcoR Iリンカーを加え、λZAP発現ラ
イブラリを構築した。このライブラリを抗TfRウサギ抗
血清でスクリーニングし、重複する制限マップを有する
２つの陽性クローン（pBHIT1およびpBHIT2）を得た（図
1Aおよび図２）。これらのクローンについて配列決定を
行い、２つの大きい転写解読枠を確認した（図２）。イ
ンフルエンザ菌DL63からのトランスフェリン受容体遺伝
子Tbp1およびTbp2のヌクレオチド配列（配列番号:1）な
らびにそれらの推定アミノ酸配列（配列番号:5−Tbp1お
よび配列番号:6−Tbp2）を図３に示してある。配列分析
から、TfRオペロンが、縦列に配置され、単一のプロモ
ータから転写された２個の遺伝子（Tbp1およびTbp2）か
ら成ることが明らかとなった（特には、図２および図３
に示したもの）。Tbp2蛋白は、菌種に応じて分子量が変
動する傾向があるが、Tbp1蛋白はそれより安定した分子
量を持つ傾向があり、TfR遺伝子を有する各種細菌でわ
ずかに変動し得る。Tbp1の分子量は通常、94〜106000の
範囲であるのに対して、Tbp2の分子量は58〜98000まで
かなり変動する。

インフルエンザ菌DL63からのトランスフェリン受容体
のＮ末端および臭化シアン断片のアミノ酸配列決定を行
った。Tbp2のＮ末端は遮断したが、Tbp1の配列決定によ
ってアミノ酸配列を確認し、それを図３の蛋白配列で下
線を施して示してある。これらのペプチド配列は、Glu
Thr Gln Ser Ile Lys Asp Thy Lys Glu Ala Ile Ser Se
r Glu Val Asp Thr（図３に示した通り、配列番号:10
1）およびLeu Gln Leu Asn Leu Glu Lys Lys Ile Gln G
ln Asn Trp Leu Thr His Gln Ile Ala Phe（図３に示し
た通り、配列番号:102）である。Tbp1の信号配列および
Tbp2の推定信号配列を図３で二重上線によって示してあ
る。Tbp1の推定信号配列は、Met Thr Lys Lys Pro Tyr
Phe Arg Leu Ser Ile Ile Ser Cys Leu Leu Ile Ser Cy
s Tyr Val Lys Ala（配列番号:103）である。Tbp2の推
定信号配列は、Met Lys Ser Val Pro Leu Ile Ser Gly
Gly Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ala（配列番号:104）で
ある。Tbp2のＮ末端領域の所望のアミノ酸配列は、それ
がリポ蛋白であることを示している。

インフルエンザ菌ｂ型Eagan株からの染色体DNAを得
て、ライブラリを形成した。第１のライブラリは、Sau3
A Iで部分的に消化し、約５〜10kb断片についての分子
量分別を行い、pUCに基づくプラスミドにクローニング
したDNAから構築した。第２のライブラリは、λZAPにク
ローニングしたEco R I制限染色体DNA断片から構築し
た。いずれのライブラリも、図２に示したようにpBHIT
クローンの5'断片で調べ、Ｓ−4368−３−３およびJB−
901−５−３と称されるインフルエンザ菌のTfR遺伝子の
部分クローンを得た。そこで図1Bおよび２について説明
すると、本発明の別の態様によって、インフルエンザ菌
ｂ型Eagan株からのTbp1およびTbp2をコードするプラス
ミドクローンＳ−4368−３−３およびJB−901−５−３
が示してある。インフルエンザ菌ｂ型Eagan株からのTbp
1およびTbp2遺伝子のDNA配列（配列番号:2）ならびにそ
れらの推定アミノ酸配列（配列番号:7および８）を図４
に示してあり、Tbp2配列がオペロンの最初の遺伝子とな
っている。図４において、推定−35、−10およびリボソ
ーム結合部位配列には上線が施してある。

インフルエンザ菌ｂ型MinnA株からの染色体DNAを得
て、そのDNAをSau3A Iで部分的に消化し、10〜20kb断片
についての分子量分別を行い、EMBL3のBamH I部位にク
ローニングした。そのライブラリを、pBHITクローンの
5'断片で調べ（図２）、TfRをコードする全長クローン
（DS−712−１−３）を得た。図1Cおよび２について説
明すると、本発明の別の態様によって、インフルエンザ
菌ｂ型MinnA株からのTbp1およびTbp2をコードするプラ
スミドクローンDS712−１−３が示してある。インフル
エンザ菌ｂ型MinnA株からのTbp1およびTbp2のDNA配列
（配列番号:3）ならびにそれらの推定アミノ酸配列（配
列番号:9−Tbp1および配列番号:10−Tbp2）を図５に示
してあり、この場合Tbp2配列がオペロンの最初の遺伝子
となっている。図５において、推定−35、−10およびリ
ボソーム結合部位配列には上線が施してある。

分類できないインフルエンザ菌株PAK12085からの染色
体DNAを得た。そのDNAをSau3A Iで部分的に消化し、10
〜20kb断片についての分子量分別を行い、EMBL3のBamH
I部位にクローニングした。そのライブラリを、pBHITク
ローンの断片で調べ（図２）、TfRをコードする全長ク
ローン（JB−1042−７−６）を得た。図1Dおよび２に、
クローンJB−1042−７−６の制限マップを示してあり、
図６にはインフルエンザ菌PAK12085からのTbp1およびTb
p2遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号:4）ならびにそ
れらの推定アミノ酸配列が示してあり（配列番号:11お
よび12）、この場合Tbp2配列が最初である。図６におい
て、推定−35、−10およびリボソーム結合部位配列には
上線が施してある。

中耳炎由来の分類できないインフルエンザ菌株SB33か
らの染色体DNAを得た。そのDNAをSau3A Iで部分的に消
化し、10〜20kb断片についての分子量分別を行い、EMBL
3のBamH I部位にクローニングした。そのライブラリ
を、pBHITクローンの断片で調べ（図２）、TfRをコード
する全長クローン（JB−1031−２−９）を得た。図２
に、クローンJB−1031−２−９の制限マップを示してあ
り、図７にはインフルエンザ菌SB33からのTbp1およびTb
p2遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号:105）ならびに
それらの推定アミノ酸配列が示してあり（配列番号:106
および107）、この場合Tbp2配列が最初である。SB33tbp
2遺伝子は１個の塩基欠失を有し、そのために残基126で
のフレームシフトおよび残基168での得られた蛋白の早
期切断が生じる。

中耳炎由来のNTHi株SB12、SB29、SB30およびSB32から
のtbp2遺伝子のPCR増幅を行って、遺伝子の配列決定を
行った。

分類できないインフルエンザ菌SB12株（配列番号:10
5）、SB29（配列番号:108）、SB30（配列番号:110）お
よびSB32（配列番号:112）からのtbp2遺伝子のヌクレオ
チド配列を図８、９、10および11にそれぞれ示してあ
る。

増幅tbp2遺伝子はいずれも全長Tbp2蛋白をコードする
ことが認められ、菌株SB33の欠陥tbp2遺伝子が非定型で
あることを示している。

３つのインフルエンザ菌ｂ型株はいずれもtbp2とtbp1
の間にわずか13bpの同じ短い遺伝子間配列を持つが、NT
Hi株PAK12085およびSB33は27bpのそれより長い遺伝子間
配列を持っていた（図12）。

株SB12は、インフルエンザ菌ｂ型株で認められるもの
と同じ13bpの遺伝子間配列を持っていたが、株SB29、SB
30およびSB32は、他のNTHi株PAK12085およびSB33で認め
られたものと同様のそれより長い遺伝子間配列（27〜30
bp）を持っていた（図2B）。これら９種類の株のいずれ
も、そのtbp2遺伝子とtbp1遺伝子の間に共通の核が保存
された13bpの配列を持っている。

インフルエンザ菌Tbp1のアミノ末端近くのペンタペプ
チド配列は同一であり（図12）、TonBボックスと同様で
あった。インフルエンザ菌のtonB遺伝子は、最近クロー
ニングされ、配列決定されている（Jarosik et al.,199
4）。

インフルエンザ菌株Eagan/MinnA、DL63、PAK12085お
よびSB33からのTbp1のアミノ酸配列を図14で比較してあ
る。EaganおよびMinnAのTbp1蛋白は同一であって長さは
912アミノ酸であり、DL63のものは914残基を持ち、PAK1
2085のものは914残基を持ち、SB33のものは911残基を持
つ。インフルエンザTbp1蛋白は、配列の一致率95〜100
％でかなり保存されている。インフルエンザ菌株Eagan/
MinnA、DL63、PAK12085、SB12、SB29、SB30およびSB32
からのTbp2のアミノ酸配列を図15で比較してある。Eaga
nおよびMinnAのTbp2蛋白は同一であって660アミノ酸を
持ち、DL63のものは644残基を持ち、PAK12085のものは6
54残基を持つ。SB33のtbp2遺伝子には１個の欠失があ
り、そのために残基126でのフレームシフトおよび残基1
68での得られた蛋白の早期切断が生じている。失われた
塩基は、PCR増幅染色体DNAの直接配列決定によって確認
した。同一であるEaganおよびMinnAを例外として、Tbp2
蛋白配列は一致率わずか66〜70％と比較的保存率が低い
が、図15で確認することができるいくつかの短い保存配
列部分がある。菌株SB12、SB29、SB30およびSB32からの
PCR増幅tbp2遺伝子はいずれも、全長Tbp2蛋白をコード
することが認められた。推定Tbp2蛋白間で配列および大
きさの不一致があり、SB12は648アミノ酸を持ち、SB29
は631残基を持ち、SB30は630残基を持ち、SB32は631残
基を持つ。EaganTbp1およびTbp2の推定二次構造を決定
した（図16Aおよび16B）。いずれの蛋白も、いくつかの
膜横断ドメインを持ち、Tbp1は膜を20回横断し、Tbp2は
それを12回横断している。Tbp1アミノ末端領域では、３
つの露出した保存エピトープが同一であり（DNEVTGLGK
−配列番号:43、EQVLN/DIRDLTRYD−配列番号:139および
140、GAINEIEYENVKAVEISK−配列番号:141）、Ｃ末端領
域では一つであった（GI/VYNLF/LNYRYVTWE−配列番号:1
42および143）。ヒト病原体のTbp2蛋白では、一致して
いたのはわずか３つの小さい保存領域であった。すなわ
ち、Ｎ末端でCS/LGGG（Ｇ）SFD−配列番号:75、144およ
び145であり、内部でLE/SGGFY/FGP−配列番号:74および
146であり、Ｃ末端でVVFGAR/K−配列番号:83および84で
あった。

Tbp2アミノ酸配列がヘモフィルス株間で変わるという
発見から、ヘモフィルスを同じTbp2アミノ酸配列によっ
て定義される小群に分けることができる。この発見によ
って、ヘモフィルス種からのTbp1およびTbp2と配列の類
似性を有するトランスフェリン受容体を産生するヘモフ
ィルスその他の細菌によって生じる疾患に対する免疫感
作などのための免疫原性組成物で使用されるヘモフィル
ス株におけるそのようなサブタイプが共有するエピトー
プを代表する最少数のTbp1および／またはTbp2配列また
は合成ペプチドの合理的選択を行うことができる。そこ
で、最少数のトランスフェリン受容体、類縁体、断片お
よび／またはペプチドを用いて、トランスフェリン受容
体を産生するヘモフィルスおよび他の病原菌の多くまた
は全ての菌株に対する免疫感作を行うことができる。

さらに、広範囲の病原菌（インフルエンザ菌ｂ型、分
類できないインフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌およびア
クチノバチルス（ヘモフィルス）牛肺疫菌）からのトラ
ンスフェリン受容体のアミノ酸配列を図14および15に示
したように比較した。この分析から、これら細菌のいず
れの間でも保存されているTbp1およびTbp2の領域が明ら
かになった。そのような保存配列の一部が、表２および
表３のペプチドにある。詳細には、配列DNEVTGLGK（配
列番号:43）EQVLNIRDLTRYDPGI（配列番号:44）、EQVLNI
RDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGMD（配列番号:45）、GAIN
EIEYENVKAVEISKG（配列番号:46）およびGALAGSV（配列
番号:48）がTbp1で保存されている（表１および図1
4）。Tbp1における特定の保存配列には、LEGGFYGP（配
列番号:74）、CSGGGSFD（配列番号:75）、YVYSGL（配列
番号:76）、CCSNLSYVKFG（配列番号:77）、FLLGHRT（配
列番号:78）、EFNVOF（配列番号:79）、NAFTGTA（配列
番号:80）、VNGAFYG（配列番号:81）、ELGGYF（配列番
号:82）、VVFGAR（配列番号:83）およびVVFGAK（配列番
号:84）がある（表２および図15）。

広範囲の病原菌のトランスフェリン受容体で保存され
る配列の発見により、特定のアミノ酸配列を有する最少
数の抗原（合成ペプチドの形のものを含む）を選択し
て、トランスフェリン受容体を有する病原体によって生
じる疾患に対して免疫感作を行うことができる。上記の
もの以外のそのような細菌には、淋菌などのナイセリア
属およびカタル球菌などのブランハメラ属などがある。
多くの病原菌間でのそのような保存アミノ酸により、全
てではなくともほとんどのトランスフェリンを認識する
モノクローナル抗体などのTfR特異的抗体を形成するこ
とができる。トランスフェリン受容体の保存部分に相当
するペプチドに対して抗血清を形成した。この抗血清
は、カタル球菌におけるトランスフェリン受容体を認識
した。そのような抗血清は、全てではなくともTfR蛋白
を産生するほとんどの細菌の検出および中和に有用であ
り、そのような病原体によって生じる疾患に対する受動
免疫にも有用である。そのような保存アミノ酸配列を用
いる診断アッセイおよびキットは、全てではなくともト
ランスフェリン受容体を産生する多くの細菌を検出する
のに有用である。

上記のアミノ酸配列を有するエピトープは、そのよう
な配列を有する合成ペプチドの使用によって、またはそ
のような配列を発現する生ベクターの使用によって、ま
たはそのアミノ酸配列をコードする核酸分子の直接投与
によって免疫系の細胞に運搬することができる。

インフルエンザ菌ｂ型株Eagan、MinnA、DL63および分
類できない株PAL12085のTbp1蛋白内での保存アミノ酸配
列を有するいくつかのペプチドを表２に示してある。こ
れらのペプチドの一部に対する抗体をモルモットで形成
した（表４）。インフルエンザ菌ｂ型株Eagan、MinnA、
DL63および分類できない株PAK12085のTbp2蛋白内の保存
アミノ酸配列を有するペプチドを表３に示してある。こ
れらのペプチドの一部に対する抗体をモルモットで形成
した（表４）。

Tbp1およびTbp2遺伝子のコード配列を適切な発現ベク
ターにクローニングすることで、組換え蛋白を産生する
ことができる。組換え蛋白Tbp1およびTbp2を、T7発現系
を用いて、大腸菌から発現させた。成熟Eagan Tbp1蛋
白をコードするtbp1遺伝子を、図17に示したように、プ
ラスミドJB−1468−29を形成するT7プロモータの背後で
フレーム内でクローニングした。BL21/DE3細胞に導入さ
れ、IPTGまたは乳糖で誘発された場合、Eagan Tbp1蛋白
は図22に示すように発現された。

成熟Tbp2蛋白をコードするtbp2遺伝子を、図18に示し
たように、プラスミドJB−1424−２−８を形成するT7プ
ロモータの背後でフレーム内でクローニングした。大腸
菌細胞に導入され、上記のように誘発された場合、Tbp2
蛋白は図22に示すように発現された。

株NTHi SB12からのtbp2遺伝子をPCRによって増幅し
た。得られた増幅DNAは、成熟蛋白前に真正のインフル
エンザTbp2信号配列がある。その信号配列および成熟蛋
白をコードするSB12 tbp2遺伝子を、図21に示すよう
に、pT7−７発現系にクローニングした。得られたプラ
スミド（JB−1600−１）を大腸菌BL21/DE3細胞に導入
し、誘発した場合、SB12 Tbp2は図22に示すように発現
された。

封入体として大腸菌で産生される組換え蛋白Tbp1およ
びTbp2を図23に示した図式によって精製した。精製蛋白
は図24に示したように、約70％以上の純度であった。精
製組換えTbp1およびTbp2蛋白を用いて、マウスにおける
免疫原性試験を行った。いずれの蛋白も、３〜10μｇの
用量で、良好な免疫応答を引き起こした（図25）。

一つのインフルエンザ菌株由来の組換えTbp1またはTb
p2に対して形成された抗血清は他の菌株と交差反応性で
あることから、有用な診断試薬となり得る（図26および
27）。

図28に示したプラスミドpUHIT1KFHおよびpUHITKFP
は、トランスフェリン受容体オペロン内でクローニング
された選択可能な抗生物質抵抗性マーカーを有し、トラ
ンスフェリン受容体オペロンを挿入によって失活させる
よう構築されたものである。これらのプラスミドを用い
てヘモフィルスの形質転換を行って、実施例19に記載し
た方法に従って、トランスフェリンTbp1および／または
Tbp2を産生しない菌株を形成した。そのような菌株は、
in vitroおよびin vivoでの検出および診断の実施態様
において陰性対照として有用である（それらがTfRを産
生しないことから）。そのような菌株はさらに、in viv
o成長のために弱毒化されることが期待され、ヘモフィ
ルスによって生じる疾患に対する保護を提供する生ワク
チンとして有用である。

以上述べたように、トランスフェリン受容体蛋白のエ
ピトープは、アミノ酸配列などを発現する生ベクターを
使用することで免疫系の細胞に運搬することができ、生
ベクターはポリオウィルスとすることができる。図29に
ついて説明すると、Tbp2からの保存エピトープLEGGFYGP
（配列番号:74）を含むトランスフェリン受容体蛋白の
エピトープを発現するハイブリッドポリオウィルスの構
築を図示してある。そのようなウィルスは、アミノ酸配
列LEGGFYGP（配列番号:74）を組み込んだペプチドに対
して形成された抗体によって認識され（表５）、ウィル
スが、抗原的に認識可能な形でこの配列を発現したこと
示している。PV1TBP2AおよびPV1TBP2Bも、インフルエン
ザ菌株DL63 tbp2に対して形成されたウサギ抗血清によ
って中和することができ、少なくともこれら２つのウィ
ルスが、蛋白に対して形成された抗体に対して認識可能
な形でその配列を発現したことを示していた。いずれの
ウィルスも、抗PV1血清によって中和可能であって、ポ
リオ中和抗原部位Ｉにおける変化はウィルスにおける他
の抗原部位に対してほとんど影響しなかったことを示し
ている。さらに、ポリオウィルスキメラPV1TBP2Aまたは
PV1TBP2Bによる免疫感作によって産生されたウサギ抗血
清は、アミノ酸配列LEGGFYGP（配列番号:74）を組み込
んだペプチドを認識した。これは、PV1TB2AおよびPV1TB
P2Bによって発現される配列が免疫原性で、合成ペプチ
ドの文脈で同じ配列を認識することができる抗体を誘発
することを示している。

図30について説明すると、Ａ図には、大腸菌で発現さ
れたインフルエンザ菌株SB12からの精製組換えtbp2（列
１）、カタル球菌株4223からのtbp2（列２）、鉄制限カ
タル球菌株4223の全細胞溶解物（列３）、鉄制限大腸菌
JM109の全細胞溶解物（列４）、ならびに非鉄制限条件
下で成長させた大腸菌JM109の全細胞溶解物（列５）を
示すSDS PAGEゲルを示してある。Ｂ図には、PV1TBP2Aで
免疫感作したウサギからの血清の蓄積液を用いた複製ゲ
ルのウェスタンブロッティングの結果を示してある。列
１および２では、精製トランスフェリン結合蛋白との強
力な反応があり、列３では同様の大きさの帯域があっ
た。大腸菌蛋白とほとんど反応はなかった（列４および
５）。Ｃ図は、最少の特異的反応を示した同じウサギか
らの採血前血清の蓄積液についての結果を示してある。
これらの結果から、PV1TBP2Aが、インフルエンザ菌およ
びカタル球菌からのトランスフェリン結合蛋白に特異的
な抗血清を誘発できること、ならびにその抗血清が、等
価な蛋白を発現しない大腸菌からのカタル球菌を識別で
きることが明らかである。

モルモットの抗Eagan rTbp1、抗Eagan rTbp2および
抗SB12 rTbp2抗血清を用いて、Tbp1およびTbp2蛋白の抗
原性保存について、一群のインフルエンザ菌のスクリー
ニングを行った。抗Eagan rTbp1抗血清を用いたウェス
タンブロッティングによってスクリーニングした33の株
のうち、全てが約100kDaの反応性帯域を持っていた。抗
Eagan rTbp2抗血清を用いたウェスタンブロッティング
によってスクリーニングした89の株のうち、85の株が、
60〜90kDaの反応性帯域を持っていた。抗SB12 rTbp2抗
血清を用いたウェスタンブロッティングによってスクリ
ーニングした86の株のうち、82の株が、60〜90kDaの反
応性帯域を持っていた。抗Eagan rTbp2抗血清および抗S
B12 rTbp2抗血清のいずれによっても認識されなかった
株が１株だけあり、それは欠陥tbp2遺伝子を有するNHTi
株SB33であった。これらのデータは、トランスフェリン
受容体蛋白はインフルエンザ菌株で非常に高い率で保存
されることを示しており、これら蛋白が抗原として、さ
らにはインフルエンザ菌によって生じる疾患に対する免
疫感作およびそれの診断のためのワクチンなどの免疫原
性組成物においてのこれら蛋白の使用を支持するもので
ある。

菌血症の幼若ラットモデル（Loeb et al,1987）を用
いて、抗Eagan rTbp1抗血清および抗Eagan rTbp2抗血清
の保護能力を評価した。ウサギまたはモルモットのいず
れかで形成した抗Eagan rTbp1抗血清はこのモデルでは
保護効果を示さなかったが、ウサギまたはモルモットの
いずれかで形成した抗Eagan rTbp2抗血清には保護効果
があった（表７）。これらのデータは、インフルエンザ
菌によって生じる疾患に対する保護抗原としてのrTbp2
の使用を示すものである。

中耳炎のチンチラモデル（Barenkamp et al.,1986）
を用いて、SB12 rTbp2の保護能力を評価した。データ
は、対照群と比較して、免疫感作した動物の疾患の重度
が軽いことを示していた。

本発明によれば、表８および図31に示したようなトラ
ンスフェリン受容体蛋白Tbp2の多くの切断類縁体、なら
びにそれをコードする核酸分子が提供される。そのよう
な切断類縁体の中には、組換え発現系（例：大腸菌）で
非常に強く発現され、本発明の診断および予防接種の実
施態様で適切な抗血清および免疫原を提供するものもあ
る。

本明細書に記載の実施態様を代表的なものとするヘモ
フィルス株のトランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切
断類縁体をコードする精製・単離DNA分子は、次のもの
として有利である。

−in vitroまたはin vivoでのヘモフィルス株の特異的
識別のための核酸プローブ −DNA分子によってコードされる免疫原性切断生成物
は、ヘモフィルス株によって生じる疾患に対する予防接
種および（例えば）ヘモフィルスによる感染の検出用の
ヘモフィルス特異的抗血清の製造のための診断試薬、抗
原として有用である。

本発明の核酸分子によってコードされるトランスフェ
リン受容体蛋白の切断類縁体は、トランスフェリン受容
体を産生する細菌株によって生じる疾患の診断およびそ
の疾患に対する免疫感作において有用である。そのよう
な細菌には、ヘモフィルス属、ナイセリア属（髄膜炎菌
および淋菌など）およびブランハメラ属（例：カタル球
菌）の株などがあるが、これらに限定されるものではな
い。

本発明の各種実施態様が、例えばヘモフィルス感染お
よびトランスフェリン受容体を産生する他の病原菌によ
る感染の予防接種、診断、治療の分野および免疫試薬形
成の分野で多くの利用場面を有することは当業者には明
らかである。そのような用途についてのさらに詳細な考
察を以下に行うが、これらに限定されるものではない。

1.ワクチンの製造および使用 ワクチンとしての使用に好適な免疫原性組成物を、ト
ランスフェリン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体から製
造することができる。このワクチンは、抗トランスフェ
リン受容体抗体およびオプソニン作用性または殺細菌性
である抗体などの抗体を産生する免疫応答を誘発する。
予防接種対象者をヘモフィルスその他のトランスフェリ
ン受容体を産生する細菌が攻撃したとしても、抗体がト
ランスフェリン受容体に結合し、それによって、生存の
ために必要な鉄源への細菌の接近が防止される。さら
に、オプソニン作用性または殺細菌性の抗TfR抗体は、
別の機序によって保護を与える可能性もある。

ペプチドを含むワクチンは、いずれも引用によって本
明細書に含まれる米国特許4601903号、4599231号、4599
230号および4596792号などのように、当業界では公知で
ある。ワクチンを含む免疫原性組成物は、液剤や乳剤な
どの注射剤として製剤することができる。免疫原は、そ
の免疫原と適合性である医薬的に許容される賦形剤と混
合することができる。そのような賦形剤としては、水、
生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよび
それらの組み合わせたものなどがあり得る。免疫原性組
成物およびワクチンは、湿展剤もしくは乳化剤、pH緩衝
剤またはアジュバントなどの補助物質をさらに含有し
て、その有効性を高めることができる。免疫原性組成物
およびワクチンは、皮下注射もしくは筋肉注射によっ
て、非経口的に投与することができる。別法として、本
発明によって得られる免疫原性組成物を、粘膜表面での
免疫応答を誘発するような形で製剤および運搬すること
ができる。そこで、免疫原性組成物を、例えば鼻腔また
は経口（胃内投与）投与によって粘膜表面に投与するこ
とができる。免疫原性組成物は、免疫系の特異的細胞ま
たは粘膜表面への運搬のためのターゲティング分子との
併用で提供することができる。そのようなターゲティン
グ分子には、WO 92/17167（Biotech Australia Pty.Lt
d.）に記載のようなB12株および細菌毒素の断片、なら
びに米国特許5194254号（Barber et al）に記載のよう
なモノクローナル抗体などがある。別法として、坐剤お
よび経口製剤などの他の投与形態が望ましい場合があ
る。坐剤の場合、結合剤および担体には、例えばポリア
ルカレングリコールまたはトリグリセリドなどがあり得
る。経口製剤には、例えば医薬用のサッカリン、セルロ
ースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用されるイン
シピエント（incipient）などがあり得る。これらの組
成物は、液剤、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性
製剤または粉剤の形態を取り、免疫原を10〜95％含有す
る。

ワクチンは、その製剤に適合する方法にて、治療上有
効で、保護効果があり、免疫原性であるような量で投与
される。投与量は、治療を受ける対象者によって決まる
ものであり、例えば、抗体を合成し、必要に応じて細胞
介在性免疫応答を生じるその対象者における免疫系の能
力によって決まる。投与に必要な有効成分の正確な量
は、医師の判断によって決まる。しかしながら、好適な
用量範囲は、当業者であれば容易に決定し得るものであ
り、トランスフェリン受容体、それの類縁体および断片
および／またはペプチドをμｇ単位とすることになると
考えられる。初期投与および追加免疫投与における好適
な投与法も変動し得るものであるが、初期投与とそれに
続く投与を行うことになると考えられる。ワクチンの用
量は投与経路によっても決まるものであり、宿主の大き
さに応じて変動する。

本発明の核酸分子は、例えば遺伝的免疫感作を行う注
射によって、あるいはサルモネラ、BCG、アデノウィル
ス、ポックスウィルス、ワクチニアまたはポリオウィル
スなどの生ベクターを構築することによって、直接DNA
を投与することで直接免疫感作を行うのに使用すること
もできる。免疫系に異種抗原を運搬するのに使用されて
いるいくつかの生ベクターについての考察が行われてい
る文献がある（例:O'Hagan,1992）。被験対象者へのDNA
の直接注射による遺伝的免疫感作の方法については報告
がある（例:Ulmer et al.,1993）。

通常は0.05〜1.0％のリン酸緩衝生理食塩水溶液とし
て使用される、アジュバントと抗原を同時投与すれば、
免疫原性を大幅に向上させることができる。アジュバン
トは、抗原の免疫原性を高めるが、必ずしもそれ自体が
免疫原性とは限らない。アジュバントは、抗原を投与部
位付近に局所的に保持することで、免疫系の細胞への抗
原の緩やかな徐放を促進する貯蔵効果を生じることで作
用し得るものである。アジュバントはさらに、免疫系の
細胞を抗原貯蔵部まで引き寄せ、そのような細胞を刺激
して免疫応答を誘発することができる。

免疫刺激剤またはアジュバントは、例えばワクチンに
対する宿主の免疫応答を改善するために、長年にわたっ
て使用されている。リポ多糖類などの内在性アジュバン
トは通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒化
細菌の成分である。外因性アジュバントは、代表的には
非共有結合的に抗原に結合する免疫調節剤であり、宿主
の免疫応答を促進するよう製剤されている。そうして、
非経口的に運搬される抗原に対する免疫応答を促進する
アジュバントが確認されている。しかしながら、そのよ
うなアジュバントの一部は有毒であり、望ましくない副
作用を起こし得るものであることから、ヒトや多くの動
物で使用するには不適なものとなっている。実際、水酸
化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（総称して通
常は、ミョウバンと称される）のみがヒトワクチンおよ
び動物ワクチンにおけるアジュバントとして常用され
る。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに対
する抗体応答上昇におけるミョウバンの効力は明らかに
なっており、HBsAgワクチンにミョウバンがアジュバン
トとして使用されている。ミョウバンの有用性は一部の
利用分野で明らかになっているが、それには制限があ
る。例えば、ミョウバンはインフルエンザ予防接種には
無効であり、必ずしも細胞介在性免疫応答を誘発すると
は限らない。ミョウバンをアジュバントとする抗原によ
って誘発される抗体は、マウスにおいては主としてIgG1
アイソタイプであり、一部のワクチン剤による保護には
最適ではない可能性がある。

広範囲の外因性アジュバントが抗原に対して強力な免
疫応答を起こし得る。本発明での使用に好適なアジュバ
ントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、
QS21、QuilA、それらの誘導体および成分、ISCOM基材、
リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖
脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミ
ルジペプチド、ポリホスファゼン、ISCOPREP、DC−cho
l、DDBAおよびリポ蛋白などがあるが、これらに限定さ
れるものではない。アジュバントの有利な組み合わせに
ついては、1994年６月16日出願の同時係属中の米国特許
出願08/261194号（WO 95/34308）に記載されている。

体液性免疫応答（HIR）および細胞介在性免疫（CMI）
を効果的に誘発するためには、免疫原をアジュバント中
で乳化させる。多くのアジュバントが有毒であり、症状
としては、肉芽腫、急性および慢性の炎症（完全フロイ
ントアジュバント、FCA）、細胞崩壊（サポニンおよび
プルロニックポリマー）および発熱性、関節炎および前
部ブドウ膜炎（LPSおよびMDP）などがある。FCAは優れ
たアジュバントであり、研究で広範囲に使用されている
が、その毒性のために、ヒトワクチンや動物ワクチンで
の使用には特許されていない。

理想的なアジュバントの望ましい特性には次のものが
ある。

（１）毒性がないこと （２）長期間の免疫応答を刺激する能力 （３）製造が簡単で、長期保存において安定であること （４）必要に応じて、各種経路で投与される抗原に対し
てCMIとHIRの両方を誘発できること （５）他のアジュバントとの相乗作用 （６）抗原提供細胞（APC）の群との選択的相互作用を
行う能力 （７）適切なT_H1またはT_H2細胞特異的免疫応答を特異的
に誘発する能力 （８）抗原に対して適切な抗体アイソタイプ濃度（例:I
gA）を選択的に上昇させる能力 ロックホッフ（Lockhoff）らに対して1989年８月８日
に与えられた米国特許4855283号（引用によって本明細
書に含まれる）には、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ−グリ
コシル尿素およびＮ−グリコシルカーバメート（これら
はそれぞれ、免疫調節剤またはアジュバントとしてのア
ミノ酸によって糖残基が置換されている）などの糖脂質
類縁体が開示されている。そこで、ロックホッフらの報
告（1991年）では、糖スフィンゴ脂質およびグリセロ糖
脂質などの天然糖脂質と構造的に類似しているＮ−糖脂
質類縁体が単純疱疹ウィルスワクチンおよび偽性狂犬病
ウィルスワクチンの両方において強力な免疫応答を誘発
できることが報告されている。糖脂質の中には、アノマ
ー炭素原子を介して糖と直接結合する長鎖のアルキルア
ミンおよび脂肪酸から合成されて、天然脂質残基の機能
を模倣するものもある。

モロニー（Moloney）に対して与えられ、本願の譲受
人に対して譲渡され、引用によって本明細書に含まれる
米国特許4258029号には、オクタデシルチロシン塩酸塩
（OTH）が、破傷風トキソイドならびにホリマリンで失
活させたＩ型、II型およびIII型小児麻痺ウィルスワク
チンと複合させた場合に、アジュバントとして機能する
ことが開示されている。さらに、ニクソン−ジョージら
（Nixon−George et al,1990）は、組換えＢ型肝炎表面
抗原と複合させた芳香族アミノ酸のオクタデシルエステ
ルがＢ型肝炎ウィルスに対する宿主の免疫応答を促進し
たと報告している。

2.イムノアッセイ 本発明の免疫原性切断類縁体は、免疫原として、酵素
結合抗体免疫アッセイ（ELISA）、RIAおよび他の非酵素
結合抗体結合アッセイなどのイムノアッセイまたは抗細
菌性ヘモフィルスTfR抗体の検出に関して当業界で公知
の方法の抗原として有用である。ELISAアッセイでは、
免疫原性切断類縁体を、選択された表面、例えばポリス
チレン微量定量プレートのウェルなどの蛋白もしくはペ
プチドと結合することができる表面に固定化する。洗浄
によって、吸着が不完全な切断類縁体を除去した後、被
験サンプルに関して抗原的に中性であることが知られて
いるウシ血清アルブミン（BSA）またはカゼインの溶液
などの非特異的蛋白をその選択された表面に結合させる
ことができる。これによって、固定化表面での非特異的
吸着部位を遮断して、その表面での抗血清の非特異的結
合によって生じるバックグラウンドを低減させることが
できる。

固定化表面を次に、免疫複合体（抗原／抗体）形成を
起こすような形で、検査対象の臨床材料または生物材料
などのサンプルと接触させる。これには、BSA、ウシγ
−グロブリン（BGG）および／またはリン酸緩衝生理食
塩水（PBS）/Tweenなどの希釈剤によるサンプルの希釈
などがあり得る。次にサンプルを室温（約25℃〜37℃の
レベル）で約２〜４時間インキュベーションする。イン
キュベーション後、サンプルと接触する表面を洗浄し
て、免疫複合体形成していない材料を除去する。洗浄法
には、PBS/Tweenなどの溶液またはホウ酸緩衝液による
洗浄などがある。

被験サンプルと結合した切断類縁体との間の特異的免
疫複合体の形成とそれに続く洗浄後、第１の抗体に対す
る特異性を有する第２の抗体に対して免疫複合体を曝露
することで、免疫複合体形成の発生とその量も測定する
ことができる。被験サンプルがヒト起源のものである場
合、第２の抗体は、ヒト免疫グロブリン（一般的にはIg
G）に対する特異性を有する抗体である。検出手段を提
供するためには、第２の抗体は、例えば適切な発色性物
質とともにインキュベーションすることで発色する酵素
活性などの関連する活性を有することができる。次に、
例えば可視スペクトルの分光光度計を用いて発色の程度
を測定することで定量を行うことができる。

3.ハイブリッド形成プローブとしての配列の使用 そこで、トランスフェリン受容体遺伝子の配列を有す
る本発明のヌクレオチド配列により、トランスフェリン
受容体遺伝子を有するヘモフィルスおよび他の細菌種か
らのトランスフェリン受容体遺伝子の確認およびクロー
ニングが可能である。

本発明のトランスフェリン受容体遺伝子の配列を有し
て成るヌクレオチド配列は、他のTfR遺伝子の相補的延
長部とともに選択的に二重鎖分子を形成する能力がある
ことで有用である。利用分野に応じて、各種のハイブリ
ッド形成条件を用いて、他のTfR遺伝子に対するプロー
ブの各種程度の選択性を得ることができる。高い選択性
を得るには、比較的厳しい条件を用いて、二重鎖を形成
する。その条件としては例えば、約50℃〜70℃の温度で
の約0.02M〜0.15MのNaClのような低塩および／または高
温条件などがある。利用分野によっては、約20℃〜55℃
という範囲の温度で約0.15M〜0.9Mの塩のような、それ
より緩やかなハイブリッド形成条件が必要となる場合が
ある。ホルムアミドの添加量を増やしてハイブリッド形
成条件をさらに厳しくすることで、ハイブリッド二重鎖
を不安定化させることができる。そこで、特定のハイブ
リッド形成条件を容易に操作することができ、所望する
結果に応じた選択法となる。通常、50％ホルムアミド存
在下での適切なハイブリッド形成温度は、標的断片に対
して95〜100％相同性であるプローブの場合には42℃で
あり、90〜95％相同性の場合には37℃であり、85〜90％
相同性の場合には32℃である。

臨床的診断の実施態様においては、本発明の核酸配列
を、標識などの適切な手段と併用して、ハイブリッド形
成の測定を行うことができる。広範囲の適切な指示手段
が当業界で公知であり、それには検出可能な信号を提供
することができるアビジン／ビオチンなどの放射能、酵
素その他のリガンドなどがある。一部の診断の実施態様
では、放射能タグに代えて、ウレアーゼ、アルカリホス
ファターゼもしくはペロオキシダーゼなどの酵素タグを
用いることができる。酵素タグの場合、ヒトの肉眼によ
る観察または分光測光法的に見ることができる手段を提
供して、TfR遺伝子配列を有するサンプルによる特異的
ハイブリッド形成を確認するのに使用可能である比色指
示物質が知られている。

本発明の核酸配列は、溶液ハイブリッド形成および固
相法を用いる実施態様でハイブリッド形成プローブとし
て有用である。固相法が関与する実施態様においては、
滲出液、体液（例：血清、羊水、中耳滲出液、痰、細気
管支肺胞洗浄液）または組織などの臨床検体のようなサ
ンプルからの被験DNA（またはRNA）を、選択された基材
または表面に吸着その他の方法で固定する。次に、固定
化した１本鎖核酸に対して、望ましい条件下に、本発明
の核酸配列を有してなる特定のプローブで特異的ハイブ
リッド形成を行う。選択される条件は、例えばＧ＋Ｃ含
有量、標的核酸の種類、核酸の入手源、ハイブリッド形
成プローブの大きさなどによって決まる必要な特定の基
準に基づく特定の環境によって決まるものである。ハイ
ブリッド形成表面を洗浄して特異的に結合していないプ
ローブ分子を除去した後、標識によって、特異的ハイブ
リッド形成を検出するか、もしくは定量も行う。

4.トランスフェリン受容体遺伝子の発現 宿主細胞と適合性の菌種由来のレプリコンおよび制御
配列を有するプラスミドベクターを用いて、トランスフ
ェリン受容体遺伝子の発現および発現系における本発明
によるそれの切断を行うことができる。通常ベクター
は、複製部位と、形質転換細胞において表現型選択を行
うことができる標識配列を有する。例えば、アンピシリ
ンおよびテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を有すること
で、形質転換細胞識別の簡単な手段を提供するpBR322を
用いて、大腸菌を形質転換することができる。pBR322プ
ラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージ
も、宿主細胞が使用してそれ自体の蛋白を発現させるこ
とができるプロモータを有するか、あるいはそれを有す
るように変性させることができる。

さらに、宿主と適合するレプリコンおよび制御配列を
有するファージベクターは、その宿主との関係で絵形質
転換ベクターとして使用することができる。例えば、λ
−GEM（登録商標）−11におけるファージを、組換えフ
ァージベクターの形成に使用し、そのベクターを使用し
て大腸菌LE392などの宿主細胞の形質転換を行うことが
できる。

組換えDNA構築で通常使用されるプロモータには、β
−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳糖プロモー
タ系（Chang et al.,1978;Itakura et al.,1977;Goedde
l et al.,1979;Goeddel et al.,1980）ならびにT7プロ
モータ系（米国特許4952496号）などの他の微生物プロ
モータなどがある。プロモータのヌクレオチド配列に関
する詳細については公知であり、当業者であればそれを
効果的に遺伝子に結びつけることができる。使用される
特定のプロモータは通常、所望の結果によって決まる選
択事項である。本発明で行われる切断などのトランスフ
ェリン受容体遺伝子の発現に適した宿主には、大腸菌、
バチルス菌、ヘモフィルス、真菌、酵母などがあり、あ
るいはバキュロウィルス発現系を用いることができる。

本発明によれば、トランスフェリン受容体蛋白の切断
類縁体は組換え法によって得られる。異種系で組換え的
に産生された切断類縁体は、精製物における汚染物の量
を低減するような形で、宿主から単離することができ
る。この点で発現に特に望ましい宿主には、LPSを持た
ず、従ってエンドトキシンを持たないグラム陽性菌など
がある。そのような宿主には、バチルス菌などがあり、
トランスフェリン受容体蛋白の非発熱性の切断類縁体の
製造に特に有用である。

生物寄託 本明細書に記載および言及されているインフルエンザ
菌株からのトランスフェリン受容体をコードする部分を
少なくとも有するある種のプラスミドを、本願出願に先
だって、ブダペスト条約に従って寄託した（American T
ype Culture Collection（ATCC）,Rockville,Maryland,
USA）。寄託プラスミドのサンプルは、本米国特許出願
に基づく特許が賦与された時点で一般に入手可能とな
り、その入手可能性に対する全ての制限がその時点でな
くなる。寄託した実施態様は本発明の例示を目的とした
ものであるに過ぎないことから、本明細書に記載および
特許請求されている本発明は、寄託したプラスミドによ
る範囲に限定されるものではない。本願に記載のものと
類似または等価な抗原をコードする等価もしくは類似の
プラスミドは、本発明の範囲に含まれるものである。

ヘモフィルス株 Hib株Eaganは市販されている（Connaught Laboratori
es Limited,1755 Steeles Ave.W.,Willowdale,Ontario,
Canada M2R 3T4）。

Hib株MinnAは収集品から入手した（Dr.Robert Munso
n,Department of Microbiology and Immunology,Washin
gton University School of Medicine,Children's Hosp
ital,St.Louis,Missouri 63110）。

Hib株DL63は収集品から入手した（Dr.Eric Hansen,De
partment of Microbiology,University of Texas South
western Medical Center,5323 Harry Hines Boulevard,
Dallas,Texas 75235−9048）。

PAK12085も上記の収集品から入手した（Dr.Robert Mu
nson）。

SB12、29、30、32および33は、収集品から入手した
（Dr.Stephen Barenkamp,Department of Pediatrics,Sc
hool of Medicine,Saint Louis University Medical Ce
ntre,St.Louis,Missouri 63104）。

実施例 上記の開示内容は、本発明の全般を説明するものであ
るので、以下の具体的な実施例を参照することで、より
完全な理解を得ることができる。これら実施例は単に説
明を目的として記載されているものであって、本発明の
範囲を限定するものではない。状況から見て示唆される
かあるいは好都合なものとなる可能性がある場合、等価
なものの形態および置換に対して変更を加えることは想
到されるものである。本明細書においては具体的な用語
を用いているが、そのような用語は説明のためのもので
あって、本発明を限定するものではない。

本開示およびこれらの実施例において使用されている
が明瞭には説明されていない分子遺伝学、蛋白生化学、
免疫学および発酵の技術は、科学文献に広く報告されて
いるものであり、十分に当業者の能力の範囲内のもので
ある。

実施例１ 本実施例は、インフルエンザ菌株DL63、Eagan、MinnA
およびPAK12085ならびにSB33からの染色体DNAの製造を
説明するものである。

インフルエンザ菌株は、ハルクネスらの方法に従って
（Harkness et al.,1992）、ミュラー−ヒントン寒天
（Mueller−Hinton agar）または脳心臓灌流肉汁で成長
させた。

A.インフルエンザ菌ｂ型DL63からの染色体DNA抽出 染色体DNAを以下のようにして得た。ベックマンJ14ロ
ーターで8000rpmにて15分間遠心することで、培地250mL
をペレット状とした。ペレットを50mMトリス−HCl（pH
8.0）200mLで洗浄し、前述のように遠心し、50mMトリス
−HCl、50mM EDTA（pH8.0）12.5mLに再懸濁させ、−20
℃で冷凍した。次に、10mg/mLのリゾチームの0.25Mトリ
ス−HCl（pH8.0）溶液1.25mLを冷凍細胞ペレットに加え
た。ペレットを解凍し、氷上で45分間インキュベーショ
ンした。次に、1mg/mLのプロテイナーゼＫの0.5％SDS、
0.4M EDTA、50mMトリス−HCl（pH7.5）溶液2.5mLを加
え、混合物を時々攪拌しながら50℃で１時間インキュベ
ーションした。溶解物をトリス緩衝フェノール15mLで１
回抽出し、次に3M酢酸ナトリウム1.5mLおよびエタノー
ル30mLを加えて、DNAを沈殿させた。DNAをガラス棒に巻
き付け、終夜振盪することで、0.2mg/mLのRNAseAを含む
50mMトリス−HCl、1mM EDTA（pH7.5）12.5mLに溶かし
た。サンプルを同量のクロロホルムで１回抽出し、上記
と同様に沈殿・巻き付けを行った。DNAを50mMトリス−H
Cl、1mM EDTA（pH7.5）2mLに溶かし、４℃で保存した。

B.インフルエンザ菌ｂ型Eaganからの染色体DNAの抽出 培地50mLを遠心によってペレットとし、ペレットをTE
（10mMトリス、1mM EDTA、pH7.5）25mLに再懸濁させ、5
mLずつの少量サンプル２つを染色体DNA製造に用いた。
各少量サンプルに、10％サルコシル（sarkosyl）0.6mL
および20mg/mLプロテイナーゼK0.15mLを加え、サンプル
を37℃で１時間インキュベーションした。溶解物をトリ
ス飽和フェノールで１回およびクロロホルム：イソアミ
ルアルコール（24:1）で３回抽出した。水相を蓄積し
て、最終容量7mLとした。次に、3M酢酸ナトリウム（pH
5.2）0.7mLおよびイソプロパノール4.3mLを加えてDNAを
沈殿させ、それを巻き付け、70％エタノールで洗浄し、
乾燥し、水1mLに再懸濁させた。

C.インフルエンザ菌株Eagan、MinnA、PAK12085およびSB
33からの染色体DNAの抽出 ４℃で15〜20分間にわたり、5000rpmでの遠心を行う
ことで、培地50mLから細胞をペレット化した。細胞ペレ
ットをTE（10mMトリス、1mM EDTA、pH7.5）10mLに再懸
濁させ、プロナーゼおよびSDSを加えて最終濃度をそれ
ぞれ500μg/mLおよび１％とした。サンプルを37℃で４
時間インキュベーションして、透明溶解物を得た。溶解
物を、トリス飽和フェノールで１回、トリス飽和フェノ
ール／クロロホルム（1:1）で１回およびクロロホルム
で１回抽出した。最終水相を、緩衝液を１回換えながら
４℃で1M NaCl500mLに対して２回24時間透析し、緩衝液
を１回換えながら４℃でTE500mLに対して２回24時間透
析した。最終透析液を小分けして使用に供した。

実施例２ 本実施例は、染色体ライブラリの製造について説明す
るものである。

A.インフルエンザ菌DL63−λZAPライブラリ インフルエンザ菌DL63染色体DNAのTE液100μｇをゲー
ジ25の針を有する1mL注射器中で機械的に剪断した。剪
断されたDNAに水を加えて最終容量405μＬとし、10×S1
ヌクレアーゼ緩衝液（2M NaCl、500mM NaOAc、pH4.5、1
0mM ZnSO₄、５％グリセロール）45μＬおよび100U/μＬ
のS1ヌクレアーゼ1.7μＬを加え、37℃で15分間インキ
ュベーションすることで平滑末端とした。サンプルをフ
ェノール／クロロホルムで１回およびクロロホルムで１
回抽出し、エタノール1mLを加えてDNAを沈殿させた。サ
ンプルを氷上で10分間または−20℃で終夜インキュベー
ションし、微量遠心装置で30分間遠心することで、DNA
を回収した。DNAを70％エタノールで洗浄し、乾燥し
た。DNA配列のEcoR I部位を標準的な方法を用いてメチ
ル化した。このメチル化DNAに、100mM MgCl₂5μＬ、dNT
P混合液（dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを各2.5mM）８μ
Ｌおよび5U/μＬのクレノウ（Klenow）４μＬを加え
た。混合物を12℃で30分間インキュベーションした。ST
E（0.1M NaCl、10mMトリス−HCl、1mM EDTA、pH8.0）45
0μＬを加え、混合物をフェノール／クロロホルムで１
回、クロロホルムで１回抽出し、エタノール1mLを加え
てDNAを沈殿させた。サンプルを氷上で10分間または−2
0℃で終夜インキュベーションした。微量遠心装置で30
分間遠心することで、DNAを回収し、70％エタノールで
洗浄し、乾燥した。

DNAをTE 7μＬに再懸濁させ、その液にリン酸化EcoR
Iリンカー（200ng/μＬ）14μＬ、10×連結緩衝液３μ
Ｌ、10mM ATP3μＬ、T4 DNAリガーゼ（4U/μＬ）３μＬ
を加えた。サンプルを４℃で終夜インキュベーション
し、68℃で10分間インキュベーションして、リガーゼを
失活させた。この混合物に、H₂O 218μＬ、10×ユニバ
ーサル緩衝液（Universal buffer）45μＬおよび30U/μ
ＬのEcoR I 7μＬを加えた。37℃で1.5時間インキュベ
ーションした後、0.5M EDTA 1.5μＬを加え、混合物を
氷冷した。

DNAをショ糖勾配で分子量分別し、６〜10kbのDNAを含
む分画を蓄積した。蓄積DNAをエタノールで沈殿させ、T
E緩衝液５μＬに再懸濁させた。挿入DNA200ngを、最終
容量５μＬでZAP IIベクター１μｇで、４℃にて２〜３
日間連結反応させた。連結混合物をパッケージ化し（Gi
gapack II Gold（Stratagene）使用）、NZYプレートの
大腸菌SURE細胞で平板培養した。ライブラリの力価測定
を行い、増幅し、0.3％クロロホルム下に４℃で保管し
た。

B.インフルエンザ菌Eagan−pUCライブラリ 実施例1Cの方法によってインフルエンザ菌Eaganから
得た染色体DNAをSau3A Iによって２分間、５分間および
10分間消化し、サンプルについて分取アガロースゲルで
電気泳動を行った。長さ約３〜10kbのDNA断片を有する
ゲルスライスを切り取り、標準的冷凍−解凍法によって
DNAを抽出した。pUC8:2（多重クローニング部位での別
のBgl IIおよびXba I制限酵素部位を有するpUC8）から
のプラスミドDNAをBamH IおよびBgl IIで消化し、ウシ
アルカリホスファターゼ（CAP）で脱リン酸化を行っ
た。インフルエンザ菌Eagan DNAの断片をpUCに連結し、
その混合物を用いて、大腸菌JM109細胞の形質転換を行
った。

C.インフルエンザ菌Eagan−λZAPライブラリ 実施例1Bに記載の方法に従って得られたインフルエン
ザEaganからの染色体DNAを、EcoR Iによって消化し、分
取アガロースゲルで分子量分割を行った。７〜23kbのDN
A断片に相当するゲルスライスを切り取り、DNAを、TAE
（40mMトリス酢酸塩、1mM EDTA）3mLの入った透析管
中、14Vで終夜電気泳動を行った。連結混合物をパッケ
ージ化し（Gagapack II包装キット（Stratagene））、
大腸菌XL1−Blue細胞で平板培養した。そのライブラリ
の力価を測定し、増幅し、0.3％クロロホルム下に４℃
で保存した。

D. EMBL3ライブラリ 実施例1Cの方法によってインフルエンザ菌MinnA染色
体DNA（10μｇ）を得て、それをSau3A I（40単位）によ
って２分間、４分間および６分間消化し、TNE（20mMト
リス−HCl、5mM NaCl、1mM EDTA、pH8）緩衝液中10〜30
％ショ糖勾配で分子量分別を行った。5kbより大きいDNA
断片を有する分画を蓄積し、沈殿させた。第２の実験
で、染色体DNA（2.6μｇ）をSau3A I（４単位）によっ
て１分間、２分間および３分間消化し、分取アガロース
ゲル電気泳動で分子量分別を行った。10〜20kbのDNA断
片を有するゲルスライスを切り取り、DNAを、標準的な
冷凍／解凍法によって抽出した。これら２つの実験から
の分子量分別DNAを蓄積して、EMBL3（Promega）のBamH
Iアーム（arm）による連結に供した。連結混合物をパッ
ケージ化し（Gagapack IIパッケージキット（Stratagen
e）使用）、大腸菌LE392細胞で平板培養した。そのライ
ブラリの力価を測定し、増幅し、0.3％クロロホルム下
に４℃で保存した。

実施例1Cの方法によって得たインフルエンザ菌PAK120
85またはSB33からの染色体DNAをSau3A I（0.5単位/10μ
gDNA）によって37℃で15分間消化し、アガロースゲル電
気泳動によって分子量分別を行った。15〜23kbのDNA断
片に相当するゲルスライスを、14Vで、TAE3mLの入った
透析管中で、終夜電気溶離した。DNAを２回沈殿させ、
水に再懸濁してから、EMBL3 BamH Iアーム（Promega）
で終夜連結を行った。連結混合物を、製造業者の説明に
従ってラムダ（Lambda）in vitroパッケージキット（Am
ersham）を用いてパッケージ化し、大腸菌NM539細胞で
平板培養した。そのライブラリの力価を測定し、増幅
し、0.3％クロロホルム存在下に４℃で保存した。

実施例３ この実施例は、ライブラリのスクリーニングについて
説明するものである。

A.インフルエンザDL63−λZAP発現ライブラリ Tbp1およびTbp2蛋白を、固相ヒトトランスフェリン
（hTf）でアフィニティ精製した。すなわち、20mLのhTf
−セファロースカラムを、CNBr活性化セファロース（Si
gma）への蛋白リガンドの結合についての製造業者のプ
ロトコールに従って得た。得られた基材を、カラムの３
倍容量の50mMトリス−HCl、1M NaCl、6Mグアニジン−HC
l（pH8.0）で洗浄して、共有結合的に結合していないhT
fを除去した。カラムを50mMトリス−HCl（pH8.0）で平
衡とし、クエン酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムを
それぞれ100mMで含有するpH8.6の緩衝液に入った10mg/m
LのFeCl₃1mLと、次に２倍カラム容量の50mMトリス−HC
l、1M NaCl（pH8.0）を用いて、結合したhTfに鉄負荷を
行った。総細菌膜（総蛋白300mg）を、前述のような（S
chryvers et al.,1989）鉄欠乏培地で成長させたインフ
ルエンザ菌株DL63から得た。膜を50mMトリス−HCl、1M
NaCl（pH8.0）で2mg/mLまで希釈し、EDTAを15mMまで、
サルコシルL97を1.5％まで加えることで可溶化した。40
000×ｇで１時間遠心した後、上清をhTfカラムに負荷
し、カラムを10倍カラム容量の50mMトリス−HCl、1M Na
Cl、10mM EDTA、0.5％サルコシル（pH8.0）で洗浄し
た。受容体蛋白を2M GnHClの同じ緩衝液の溶液を用いて
溶離し、溶出分画を25mM重炭酸アンモニウム緩衝液に対
して強力に透析し（緩衝液を５回交換）、凍結乾燥し、
−20℃で保存した。単離した蛋白を用いて、標準的方法
にて、ニュージーランドホワイトラビットでトランスフ
ェリン受容体特異的抗血清を得た。すなわち、最初の注
射では完全フロイントアジュバントを用い、次の注射で
は不完全フロイントアジュバントを用いて、２週間の間
隔を設けて、皮下注射にてウサギを３回免疫感作した。

DL63λZAPライブラリを大腸菌SURE細胞で平板培養
し、溶菌斑を、10mM IPTGに予め浸漬しておいたニトロ
セルロース膜に移して、pBluescript lacZプロモータか
らの発現を誘発した。0.5％スキムミルクの50mMトリス
−HCl、150mM NaCl（pH7.5）溶液を用いてフィルターを
遮断してから、ポリクローナル抗TfR抗血清および西洋
ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギIgGで調べ
た。溶菌斑を３回のスクリーニングによって精製し、組
換えpBluescriptプラスミド（pBHIT1およびpBHIT2;図1A
および２）を、in vivo切除法（Short et al.,1988）に
よって回収した。

B. Eagan、MinnAおよびPAK12085非発現ライブラリ （ｉ）インフルエンザ菌Eagan−pUCライブラリのスクリ
ーニング 標準的方法を用いて、ニトロセルロース上のコロニー
回収を行い、図２に示したトランスフェリン受容体遺伝
子の5'pBHIT2プローブを用いてフィルターを調べた。プ
ローブは製造業者の説明に従って、ジゴキシゲニン（di
g、Boehringer Mannheim）によって標識した。いくつか
の推定クローンをニトロセルロース上にドットブロッテ
ィングし、同じ5'pBHIT2プローブを用いて２回目のスク
リーニングを行った。第２回の推定物を、制限酵素マッ
ピングによって分析し、クローンＳ−4368−３−３（図
1B、図２）を配列分析用に選択した。

（ii）インフルエンザ菌Eagan−λZAPライブラリのスク
リーニング 標準的方法により、LBプレートおよび0.7％アガロー
ス被覆層を用いて、ファージライブラリをXLI Blue細胞
（Stratagene）で平板培養した。溶菌斑を、標準的なプ
ロトコールを用いてニトロセルロースに取り、フィルタ
ーを減圧下に80℃で２時間加熱して、DNAを固定した。
トランスフェリン受容体遺伝子（図２）の5'pBHIT2プロ
ーブをジゴキシゲニンで標識し、フィルターを42℃で４
時間予備ハイブリッド形成し、42℃で標識プローブで終
夜ハイブリッド形成した。フィルターを68℃で洗浄し、
オートラジオグラフィー後に、いくつかの溶菌斑を選択
して、第２のスクリーニングに供した。第２回の推定物
からのプラスミドDNAのin vivoでの切り取りを、λZAP
系（Promega）に添付のプロトコールに従って行った。
同じ約2.5kbのEcoR I挿入物との４つのクローンを得
た。そのうちのJB−901−５−３の例が図２の図Ｂにあ
る。推定溶菌斑は増幅も行い、ファージDNAを培地500mL
から精製した。挿入物DNAを、Xba Iによる消化によって
切り取り、Xba Iで消化し、脱リン酸化しておいたpUC8:
2（多重クローニング部位に別のBgl IIおよびXba I部位
を有するpUC8）にクローニングした。クローンJB−911
−３−２（図17）には、インフルエンザ菌Eagan TfRオ
ペロンの3'側半分を有する。

（iii）EMBLの３つのライブラリのスクリーニング インフルエンザ菌MinnAライブラリを、0.7％上層アガ
ロースを含むNZCYMを被覆として用いて、NZCYMプレート
のLE392細胞で平板培養した。ニトロセルロースフィル
ター上の溶菌斑回収を、標準法に従って行い、フィルタ
ーを処理し、ジゴキシゲニンで標識した5'pBHIT2プロー
ブ（図２）を用いて調べた。推定溶菌斑を平板培養し、
同じ手順を用いて第２回のスクリーニングを行った。フ
ァージDNAを標準的方法によって培地500mLから得て、DN
A挿入物をSal Iによる消化によって切り取り、pUCにク
ローニングして、クローンJB−1042−７−６（図1Dおよ
び２）を得た。

インフルエンザ菌SB33ライブラリを、0.7％アガロー
スを含むNZCYMを被覆として用いて、NZCYMプレートのLE
392細胞で平板培養した。溶菌斑をニトロセルロースフ
ィルターで回収し、フィルターを処理し、ジゴキシゲニ
ン標識5'pBHIT2プローブ（図２）を用いて調べた。推定
溶菌斑を平板培養し、同じ手順を用いて第２回のスクリ
ーニングを行った。ファージDNAを標準的方法によって
培地500mLから得て、DNA挿入物をSal Iによる消化によ
って切り取り、pUCにクローニングして、クローンJB−1
031−２−９（図２）を得た。

実施例４ 本実施例は、TfRオペロンのTbp1およびTbp2遺伝子の
配列決定を説明するものである。

クローンpBHIT1、pBHIT2、Ｓ−4368−３−３、JB−90
1−５−３、DS−712−１−３、JB−1042−７−６および
JB−1031−２−９からのプラスミドDNAを、標準的方法
を用いて得た。長さ17〜25塩基のオリゴヌクレオチド配
列決定プライマーを、ABI380B型DNA合成装置で合成し、
OPCカートリッジ（Applied Biosystems Inc.から入手。
製造業者のプロトコールに従って使用）を用いるクロマ
トグラフィーによって精製した。DL63株からのTfRオペ
ロンの配列を図３に示してあり、Eagan株のものを図４
に、MinnA株からのものを図５に、PAK12085株のものを
図６に、SB33のものを図７に示した。

実施例５ この実施例は、分類できないインフルエンザ菌株SB1
2、SB29、SB30およびSB32からのtbp2遺伝子のPCR増幅を
説明するものである。

上記の方法に従って、インフルエンザ菌株SB12、SB2
9、SB30およびSB32からの染色体DNAを得た。tbp2とそれ
に続いてtbp1（図12Aおよび12B参照）を有するオペロン
としてTfR遺伝子を配置した。tbp2の5'末端およびtbp1
コード配列の5'末端の逆補体にオリゴヌクレオチドを合
成した。プライマーは、Tbp2のリーダー配列からのMKSV
PLISGS（配列番号:147）に相当するGGATCCATATGAAATCTG
TACCTCTTATCTCTGGT（配列番号:120）およびTbp1のリー
ダー配列MTKK（配列番号:138）の逆補体であって遺伝子
間配列の一部であるTCTAGAAGCTTTTTTAGTCATTTTTAGTATTC
CAT（配列番号:137）であった（図12Aおよび12B）。10m
Mトリス/HCl（pH8.3）、50mM塩化カリウムおよび1.5mM
塩化マグネシウムを含む緩衝液でPCR増幅を行った。反
応混合物各100μＬには、染色体DNA5ng、各プライマー
１μｇ、アンプリタク（amplitaq）DNAポリメラーゼ（P
erkin Elmer Cetus）５単位および0.4mMのdNTP（Perkin
Elmer Cetus）を含有させた。繰り返し条件は、94℃で
1.0分、45℃で2.0分間、72℃で1.5分間を25回とした。
特異的2kb断片を各サンプルについて増幅した（図1
3）。Tbp2遺伝子の増幅に使用した染色体DNAは、列１が
SB33、列２がSB12、列３がSB29、列４がSB30、列５がSB
32であった。断片をTAクローニングベクター（Invitrog
en）にクローニングし、そのヌクレオチド配列を求め
た。株SB12（配列番号:108）、SB29（配列番号:110）、
SB30（配列番号:112）およびSB32（配列番号:114）から
のTbpの核酸配列をそれぞれ、図８、９、10および11に
示してある。

実施例６ 本実施例は、トランスフェリンのアミノ酸配列の比較
と、二次構造分析によるトランスフェリン受容体蛋白の
露出エピトープの確認について説明するものである。

図14について説明すると、インフルエンザ菌ｂ型Eaga
n、DL63、分類できないインフルエンザ菌株PAK12085お
よびSB33、髄膜炎菌株B16B6およびM982（Legrain et a
l.,1993）および淋菌FA19（Cornelissen et al.,1992）
からのTbp1のアミノ酸配列の比較を示してある。この分
析から、これら全ての細菌で保存されているTbp1の領域
が明らかになった。

図15について説明すると、インフルエンザ菌ｂ型Eaga
n、DL63、分類できないインフルエンザ菌株PAK12085、S
B12、SB29、SB30およびSB32、髄膜炎菌株B16B6およびM9
82、淋菌FA19ならびにアクチノバチルス（ヘモフィル
ス）牛肺疫菌（Gerlach et al.,1992）205および37から
のTbp2のアミノ酸配列の比較を示してある。この分析か
ら、これら全ての細菌で保存されているTbp2の領域が明
らかになった。

蛋白の二次構造分析を、チョウ（Chou）およびファス
マン（Fasman）のアルゴリズム（1978）を用いて行い、
親水性／疎水性プロットを、ホップ（Hopp）のアルゴリ
ズム（1986）を用いて行った。値は、ヘプタペプチドウ
ィンドウの平均から誘導し、各断片の中間点でプロット
した。図16Aには、インフルエンザ菌ｂ型EaganからのTb
p1の予想二次構造を示してあり、図16Bには、インフル
エンザ菌ｂ型EaganからのTbp2の予想二次構造が示して
ある。図16Aおよび16Bに描いた予想二次構造は、上記の
方法を用いて得られたものである。しかしながら本発明
者らは、二次構造がこれらの図によって正確に描けてい
るかどうかを検証できていない。

いくつかの異なる細菌からのTbp1およびTbp2蛋白の保
存エピトープを、それぞれ図14および図15に示したよう
な配列の位置合わせによって確認した。

そのような保存エピトープの一部として以下の挙げた
ものがある。

さらに、予想二次構造と組み合わせて、４つの保存露
出エピトープがTbp1で確認され、２つがTbp2で確認され
た。これらは以下の通りである。

上記の保存アミノ酸配列を有する蛋白、ポリペプチド
またはペプチドは、診断実施態様における検出手段とし
て、ならびにトランスフェリン受容体蛋白を産生する細
菌によって生じる疾患の検出もしくはその疾患からの予
防のための免疫原として特に有用である。免疫感作を行
うために、特に指定されたアミノ酸配列を、蛋白もしく
はペプチドなどの免疫系に提供することができるか、あ
るいはサルモネラ、BCG、アデノウィルス、ポックスウ
ィルス、ワクチニアまたはポリオウィルスなどの生運搬
媒体を使用することができる。

実施例７ 本実施例は、大腸菌からのEagan Tbp1を発現するプラ
スミドJB−1468−29の構築を説明するものである。

プラスミドＳ−4368−３−３（図1Bおよび２）および
JB−911−３−２（図17）は、それぞれEagan tbp1遺伝
子の5'部分および3'部分を有する。図17は、プラスミド
JB−1468−29の構築図式を示してある。JB−1468−29の
構築で使用されるオリゴヌクレオチド配列を図20に示し
てある（配列番号:86および87）。プラスミドJB−1468
−29をエレクトロポレーションによって大腸菌株BL21/D
E3に導入して、JB−1476−２−１株を得た。

JB−1476−２−１株をYT培地で成長させ、標準的プロ
トコールに従ってIPTGで誘発した。免疫原性および他の
試験のためのTbp1を得るために、JB−1476−２−１株
を、３％グルコースを含むNZCYM培地で終夜成長させ
た。グルコースを含まない新鮮なNZCYM培地に1:40の接
種物を加え、培地をA₅₇₈＝0.3まで成長させた。乳糖を
１％まで加え、培地を４時間誘発した。JB−1476−２−
１の全細胞溶解物のSDS−PAGE分析を図22に示してあ
る。列１はt_oでのJB−1476−２−１（T7/Eagan Tbp1）
であり、列２はｔ＝4h誘発でのJB−1476−２−１であ
り、列３は、200kDa、116kDa、97.4kDa、66kDa、45kDa
および31kDaの分子量マーカーであり、列４はt_oでのJB
−1437−４−１（T7/Eagan Tbp2）であり、列５はｔ＝4
h誘発でのJB−1437−４−１であり、列６はt_oでのJB−1
607−１−１（T7/SB12Tbp2）であり、列７はｔ＝4h誘発
でのJB−1607−１−１である。

実施例８ 本実施例は、大腸菌からのEagan Tbp2を発現するプラ
スミドJB−1424−２−８の構築を説明するものである。

図18について説明すると、インフルエンザ菌ｂ型Eaga
nからの全tbp2遺伝子を有するプラスミドＳ−4368−３
−３が示してある。図18はプラスミドJB−1424−２−８
を示しており、図19は使用したオリゴヌクレオチドを示
している。プラスミドJB−1424−２−８をエレクトロポ
レーションによって大腸菌株BL21/DE3に導入して、大腸
菌株JB−1437−４−１を得た。IPTGまたは乳糖による誘
発で、図22に示したように、Tbp2を大腸菌JB−1437−４
−１によって発現した。列１はt_oでのJB−1476−２−１
（T7/Eagan Tbp1）であり、列２はｔ＝4h誘発でのJB−1
476−２−１であり、列３は、200kDa、116kDa、97.4kD
a、66kDa、45kDaおよび31kDaの分子量マーカーであり、
列４はt_oでのJB−1437−４−１（T7/Eagan Tbp2）であ
り、列５はｔ＝4h誘発でのJB−1437−４−１であり、列
６はt_oでのJB−1607−１−１（T7/SB12 Tbp2）であり、
列７はｔ＝4h誘発でのJB−1607−１−１である。

実施例９ 本実施例は、Tbp2配列前にリポ蛋白リーダー配列をコ
ードするプラスミドの構築を説明するものである。

Tbp2の前にある大腸菌lpp（配列番号:88および89）、
rlbB（配列番号:90および91）およびpal（配列番号:92
および93）由来のリポ蛋白リーダー配列を有するプラス
ミドの構築に使用したオリゴヌクレオチドを図20に示し
てある。構築したプラスミドおよび得られた相当する菌
株を以下の表１に示してある。

実施例10 本実施例は、大腸菌からのSB12 Tbp2を発現するプラ
スミドJB−1600−１の構築を説明するものである。

プラスミドDS−1047−１−２（図21）は、PCR増幅SB1
2 tbp2遺伝子を有する。このtpb2遺伝子は、EcoR I制限
断片に対するNde Iとして切り取られ、pT7−７発現ベク
ターに挿入されて、プラスミドJB−1600−１を形成して
いる。BL21/DE3細胞へのエレクトロポレーションによっ
て、SB12 Tbp2を発現する大腸菌株JB−1607−１−１が
得られた。IPTGまたは乳糖による誘発で、図22に示した
ように、SB12 Tbp2を発現させた。列１はt_oでのJB−147
6−２−１（T7/Eagan Tbp1）であり、列２はｔ＝4h誘発
でのJB−1476−２−１であり、列３は、200kDa、116kD
a、97.4kDa、66kDa、45kDaおよび31kDaの分子量マーカ
ーであり、列４はt_oでのJB−1437−４−１（T7/Eagan T
bp2）であり、列５はｔ＝4h誘発でのJB−1437−４−１
であり、列６はt_oでのJB−1607−１−１（T7/SB12 Tbp
2）であり、列７はｔ＝4h誘発でのJB−1607−１−１で
ある。

実施例11 本実施例は、Tbp1およびTbp2の抽出および精製を説明
するものである。

Tbp1およびTbp2の精製図式を図23に示してある。いず
れの組換え蛋白も、大腸菌における封入体として発現さ
れ、精製図式は同じである。Tbp1については実施例７
で、Tbp2については実施例８で記載した方法に従って得
られた培地500mLからの細胞を、50mMトリス−HCl（pH8.
0）50mLに懸濁させ、超音波照射によって粉砕した（10
分間３回、70％全体効率（duty circle））。抽出物を2
0000×ｇで30分間遠心し、95％未満で可溶性の大腸菌蛋
白を含む取得上清は廃棄した。

得られたペレット（図23、PPT₁）をさらに、0.5％ト
リトンＸ−100および10mM EDTAを含む50mMトリス（pH8.
0）50mLに抽出した。20000×ｇで30分間遠心した後、残
留する可溶性蛋白および膜蛋白の大部分を含む上清を廃
棄した。上記の抽出後に得られた取得ペレット（図23、
PPT₂）は、封入体を含んでいた。Tbp1およびTbp2蛋白
を、0.1％SDSおよび5mM DTTを含む50mMトリス（pH8.0）
に溶解させた。遠心後、得られた上清をさらに、0.1％S
DSおよび5mM DTTを含む50mMトリス（pH8.0）で平衡とし
たスーパーデックス（Superdex）200ゲル濾過カラムで
精製した。得られた分画をSDS PAGEで分析し、精製Tbp1
またはTbp2を含む分画を、50mMトリス（pH8.0）に対し
て４℃で終夜透析し、20000×ｇで30分間遠心した。蛋
白はこの条件で可溶性を保っており、精製Tbp1およびTb
p2を−20℃で保存した。

精製工程のSDS−PAGE分析を図24に示してある。列１
は、予め染色した分子量蛋白マーカーであり（106、8
0、49.5、32.5、27.5および18.5kDa）、列２は大腸菌全
細胞溶解物であり、列３は、可溶化封入体であり、列４
は精製Tbp1またはTbp2である。

組換えrTbp1およびrTbp2の抽出および精製の別法にお
いては、Tbp1について実施例７で、Tbp2について実施例
８で記載した方法に従って得られた培地500mLからの細
胞を、5mM AEBSF（４−（２−アミノエチル）ベンゼン
スルホニルフルオライド）を含む50mMトリス−HCl（pH
8.0）40mLに懸濁させ、超音波照射によって粉砕した（1
0分間３回、70％全体効率（duty circle））。抽出物を
20000×ｇで30分間遠心し、得られたペレットをさら
に、10mM EDTAおよび0.5％トリトンＸ−100を含む50mM
トリス（pH8.0）40mLに室温で１時間抽出した。上記の
方法に従って遠心した後、得られたペレットはrTbp1ま
たはrTbp2封入体を含んでいた。次に、rTbp1またはrTbp
2を、6Mグアニジンおよび5mM DTTを含む50mMトリス（pH
8.0）に溶解させた。遠心後、得られた上清をさらに、2
Mグアニジンおよび5mM DTTを含む50mMトリス（pH8.0）
で平衡としたスーパーデックス200ゲル濾過カラムで精
製した。得られた分画をSDS PAGEで分析し、精製rTbp1
またはrTbp2を含む分画を蓄積した。蓄積液にトリトン
Ｘ−100を加えて最終濃度を0.1％とし、溶液を50mMトリ
ス−HCl（pH8.0）に対して４℃で終夜透析した。蛋白は
この条件で可溶性を保っており、精製rTbp1およびrTbp2
を４℃で保存した。

実施例12 本実施例は、マウスにおける組換えTbp1およびTbp2の
免疫原性試験を説明するものである。

Balb/cマウス５匹ずつの群に、AlPO₄存在下で（用量
当たり1.5mg）、実施例11に記載の方法で得られたrTbp1
またはrTbp2（１μｇ〜10μｇ）を、第１日、第29日お
よび第43日に皮下（s.c.）注射した。EIAによる抗rTbp1
および抗rTbp2抗体力価の分析のために、第14日、第28
日、第42日および第56日に採血を行った。免疫原性試験
の結果は図25に示してある。

実施例13 本実施例は、マスウ血清における抗rTbp1および抗Tbp
2抗体の測定のためのEIA開発について説明するものであ
る。

抗rTbp1および抗rTbp2の抗体力価は基本的に、パネズ
ッチら報告の方法（Panezutti et al.,1993）に従って
求めた。微量定量ウェルを、室温で実施例11の方法に従
って得られたrTbp1またはrTbp2 0.5μｇにて16時間被覆
し、0.1％（重量／容量）BSAのPBS液で遮断した。血清
を連続希釈し、ウェルに加え、室温で１時間インキュベ
ーションした。西洋ワサビペルオキシダーゼに接合した
ヤギ抗マウスIgG（Fc特異的）のアフィニティ精製した
Ｆ（ab'）_２断片を第２の抗体として用いた。テトラメ
チルベンジジン（TMB/H₂O₂）を用いて反応を展開し、45
0nmで吸光度を測定した（参照波長として540nmを使用。
Flow Multiskan MCC微量平板読取装置）。抗血清の反応
性力価は、免疫前血清サンプルで得られた値に対して吸
光度に常に２倍の上昇を示す希釈度の逆数として定義し
た。

実施例14 本実施例は、組換えEagan Tbp1による免疫感作によっ
て得られた抗Tbp1抗血清と各種インフルエンザ菌株との
交差反応性を説明するものである。

NADおよびヘム（Harkness et al.,1992）±EDDAを補
給したBHI培地で成長させたインフルエンザ菌株の全細
胞溶解物を、SDS PAGEゲルによって分離し、ニトロセル
ロース膜に移し、精製組換えEagan Tbp1に対して形成し
たモルモット抗Tbp1抗血清で調べた（図26）。列１はBL
21/DE3であり、列２はSB12−EDDAであり、列３はSB12＋
EDDAであり、列４はSB29−EDDAであり、列５はSB29＋ED
DAであり、列６はSB33−EDDAであり、列７はSB33＋EDDA
であり、列８はEagan−EDDAであり、列９はEagan＋EDDA
であり、列10はカタル球菌4223−EDDAであり、列11はカ
タル球菌4223＋EDDAであり、列12は髄膜炎菌608−EDDA
であり、列13は髄膜炎菌608＋EDDAであり、列14は組換
えEagan Tbp1を発現する誘発JB−1476−２−１であり、
列15は分子量マーカーである。特異的な約95kDaの帯域
は、インフルエンザ菌株SB12、SB29、SB33およびEagan
に相当する列３、４、５、７、８および９で抗Tbp1抗血
清と反応し、約110kDaの帯域は、カタル球菌株に相当す
る列10および11で反応し、約80kDaの帯域は、髄膜炎菌6
08に相当する列12および13で反応した。

実施例15 本実施例は、組換えEagan Tbp2による免疫感作によっ
て得られた抗Tbp2抗血清と各種インフルエンザ菌株との
交差反応性を説明するものである。

NADおよびヘム（Harkness et al.,1992）±EDDAを補
給したBHI培地で成長させたインフルエンザ菌株の全細
胞溶解物を、SDS PAGEゲルによって分離し、ニトロセル
ロース膜に移し、精製組換えEagan Tbp2に対して形成し
たモルモット抗Tbp2抗血清で調べた（図27）。列１は分
子量マーカーであり、列２は組換えEagan Tbp2を発現す
る誘発JB−1437−４−１であり、列３はSB12−EDDAであ
り、列４はSB12＋EDDAであり、列５はSB29−EDDAであ
り、列６はSB29＋EDDAであり、列７はSB30−EDDAであ
り、列８はSB30＋EDDAであり、列９はSB32−EDDAであ
り、列10はSB33−EDDAであり、列11はSB33＋EDDAであ
り、列12はPAK−EDDAであり、列13はPAK＋EDDAであり、
列14はEagan−EDDAであり、列15はEagan＋EDDAである。
約60〜70kDaの特異的帯域は、インフルエンザ菌株SB1
2、SB29、SB30、PAKおよびEaganに相当する、列３、
６、７、８、13、14および15における抗Tbp2抗血清と反
応性であった。

実施例16 本実施例は、Tbp2およびTbp1における保存領域に相当
する合成ペプチドの合成について説明するものである。

Tbp1およびTbp2の推定アミノ酸配列をそれぞれ、図14
および15に示してある。この比較は、上記のトランスフ
ェリン受容体内でのアミノ酸配列保存の領域を確認する
ものであり、表２および表３に示したように、トランス
フェリン受容体の一部を有するペプチドを合成した。そ
のような合成は、前記ペプチドをコードする核酸を含む
組換えベクターの好適な宿主における発現または標準的
なペプチド合成によって行うことができる。

すなわち、ABI430Aペプチド合成装置と、製造業者推
奨の条件を用いる至適化ｔ−Boc化学を用いてペプチド
を合成し、フッ化水素酸（HF）を用いて樹脂からペプチ
ドを剥離させた。流量2mL/分で40分間にわたって15〜55
％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）の勾
配溶離による展開を用いて、Vydac C4半分取カラム（１
×30cm）での逆相高速液体クロマトグラフィー（RP−HP
LC）によって、ペプチドを精製した。生化学試験および
免疫学試験で使用した合成ペプチドはいずれも、分析HP
LCによる測定で、95％を超える純度のものであった。ア
ミノ酸組成分析を、ウォーターズPico−Tagシステムで
行い、論理的組成と良好な一致があった。

実施例17 本実施例は、被験動物における合成ペプチドの免疫原
性について説明するものである。

第０日に、実施例16に記載の方法で精製し、フロイン
トの完全アジュバントに乳濁させたペプチド100μｇを
筋肉注射してモルモットを免疫感作し、次に、フロイン
トの不完全アジュバントに乳濁させた同量のペプチドを
用いて第14日および第28日に追加免疫を行った。第42日
に血清検体を得て、抗体力価を酵素結合抗体免疫アッセ
イ（ELISA）によって測定した。すなわち、微量定量ウ
ェル（Nunc−Immunoplate,Nunc,Denmark）を、特定のペ
プチド500ngのコーティング緩衝液（15mM Na₂CO₃、35mM
NaHCO₃、pH9.6）（50μＬ）溶液で室温にて16時間被覆
した。プレートを、0.1％（重量／容量）BSAのリン酸緩
衝生理食塩水（PBS）液で、室温にて30分間遮断した。
抗血清を連続希釈し、ウェルに加え、室温で１時間イン
キュベーションした。抗血清除去後、0.1％（重量／容
量）Tween−20および0.1％（重量／容量）BSAを含むPBS
でプレートを５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（Jacjson ImmunoResearch Labs Inc.,PA）に接合し
たヤギ抗モルモットIgG抗体からのＦ（ab'）_２を、洗浄
緩衝液で希釈し（1/8000）、微量定量プレートに加え
た。室温で１時間インキュベーションした後、プレート
を洗浄緩衝液で５回洗浄した。基質テトラメチルベンジ
ジン（TMB）のH₂O₂液（ADI,Toronto）を用いてプレート
を展開し、1N H₂SO₄で反応を停止し、450nmで光学密度
を測定した（Titretek Multiskan II,Flow Labs.,Virgi
niaを使用）。これらのELISAでは、陰性対照として、32
アミノ酸残基の２つの無関係なペプチドを含有させた。
アッセイは３連で行い、各抗血清の反応性力価は、陰性
対照から得られた値に対して吸光度値に常に２倍の上昇
を示す希釈度として定義した。モルモットにおいて形成
した抗血清は、免疫感作で使用したペプチドについて単
一特異的であった。免疫感作後に得られた血清の力価を
表４に示してある。

本発明のペプチドは、表２および表３に示したものの
１個のコピーまたはそれらの類縁体の複数のコピーを有
するペプチドを有して成るものである。ペプチドはさら
に、表２および表３に示したものから選択される異なる
ペプチドまたはそれらの類縁体を複数有することがで
き、好適な担体分子を含む。免疫その他の種類の結合ア
ッセイを用いていくつかの種類のヘモフィルスを検出で
きることから、保存される領域からのペプチドを用いて
抗体を形成することが好ましい。従って、表２および３
には、診断、免疫感作および医学的治療において有用で
あると考えられる他のペプチドを確認するためのトラン
スフェリン受容体の他のいくつかの保存領域を示してあ
る。

モルモット抗Eagan rTbp1、抗Eagan rTbp2および抗SB
12 rTbp2抗血清を用いて、Tbp1およびTbp2蛋白の抗原性
保存について、インフルエンザ菌株群のスクリーニング
を行った。抗Eagan rTbp1抗血清を用いたウェスタンブ
ロッティングによってスクリーニングした33の株のう
ち、全てが約100kDaの反応性帯域を持っていた。抗Eaga
n rTbp2抗血清を用いたウェスタンブロッティングによ
ってスクリーニングした89の株のうち、85の株が、60〜
90kDaの反応性帯域を持っていた。抗SB12 rTbp2抗血清
を用いたウェスタンブロッティングによってスクリーニ
ングした86の株のうち、82の株が、60〜90kDaの反応性
帯域を持っていた。抗Eagan rTbp2抗血清および抗SB12
rTbp2抗血清のいずれによっても認識されなかった株が
１株だけであり、それは欠陥tbpB遺伝子を有するNHTi株
SB33であった。これらのデータは、トランスフェリン受
容体蛋白はインフルエンザ菌株で非常に高い率で保存さ
れることを示しており、これら蛋白が抗原として、さら
にはインフルエンザ菌によって生じる疾患に対する免疫
感作およびそれの診断のためのワクチンなどの免疫原性
組成物においてのこれら蛋白の使用を支持するものであ
る。

実施例18 本実施例は、トランスフェリン受容体の保存部分に相
当するペプチドに対して形成された抗血清が、カタル球
菌のトランスフェリン受容体を認識する能力について説
明する。

トランスフェリン受容体の保存部分に相当するペプチ
ドでモルモットを免疫感作し、得られた抗血清について
は実施例17に記載してある。カタル球菌の全細胞抽出物
を、この細菌からのトランスフェリン受容体を特異的に
認識するペプチド特異的抗血清で免疫ブロッティングし
た。Tbp2 N末端ペプチドおよびペプチドTBP2−25で免疫
感作したモルモットからの抗ペプチド抗血清は、カタル
球菌からのTbp2蛋白および大腸菌のプラスミドクローン
pBHIT2によって発現された組換えTbp2を特異的に認識し
た。クローンpBHIT2は、アミノ酸80で開始するTbp2の切
断したもの（すなわち、NKKFYSG配列番号:105）を発現
する。従って、pBHIT2からのTbp2蛋白は、第２のエピト
ープLEGGFYGP（TBP2−25）に対して形成された抗体によ
ってのみ認識することができる。この分析から、トンラ
スフェリン受容体間での保存配列に相当するペプチド
は、全てではないが、トランスフェリン受容体を産生す
るほとんどの細菌を検出する上で有用であり、トランス
フェリン受容体に対する免疫応答を生じさせ、そのよう
な細菌によって生じる疾患に対する予防を行うワクチン
などの免疫原性組成物における成分として有用である。

これらウサギからの血清を、配列LEGGFYGP（配列番
号:74）を組み込んだペプチドまたはインフルエンザ菌
株DL63 Tbp2に対するELISAによって調べた。ELISAプレ
ートをペプチドまたは蛋白で被覆し、次に５％スキムミ
ルクで遮断した。リン酸緩衝生理食塩水、0.05％Tween
−20および１％乾燥ミルクでの血清の連続２倍希釈液
を、プレートで37℃にて２時間インキュベーションし、
その後プレートを、0.05％Tween−20を含むリン酸緩衝
生理食塩水で５回洗浄した。洗浄したプレートを、西洋
ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）接合ロバ抗ウサギIgG
で室温にて30分間調べ、次に0.05％Tween−20を含むリ
ン酸緩衝生理食塩水で５回洗浄した。HRPO基質を全ての
ウェルに加えて、暗所にて室温で30分間経過させ、次
に、1M硫酸50μＬを加えて発色を停止させた。450nmで
の吸光度を測定することで、色を測定した。

実施例19 本実施例は、トランスフェリン受容体を産生しないイ
ンフルエンザ菌株の形成について説明するものである。

pBHIT1からの挿入物の2.55Eco R I断片を、pUC4KのEc
oR I部位にサブクローニングし、このベクターからTn90
3カナマイシン耐性（kan）カセットを取り出した。いず
れもこの構築において特有の部位であって、pUHIT1KFH
およびpUHIAT1KFP（図28）を産生することから、このサ
ブクローニング段階により、kanカセットを有するHinc
IIまたはPst I pUC4K断片のいずれかのその後のpUHIT1
のHind IIIまたはPst I部位への挿入が容易となった。E
coR Iによる消化によって中断された遺伝子配列を除去
した後、既報の方法（Barcak et al..,1991）に従って
Ｍ−IV培地を用いる形質転換によって構築物をインフル
エンザ菌野生型ゲノムに導入し、20μg/mLカナマイシン
を含有するBHINH寒天で、形質転換体を選抜した。

実施例20 本実施例は、トランスフェリン受容体のエピトープを
発現するポリオウィルスの構築を説明するものである。

ポリオウィルス１型マホーニー（Mahoney）株（PV1−
Ｍ）ゲノムの塩基1175〜2956のcDNAクローンを、制限酵
素Sau IおよびHind IIIで切断した。これらの酵素は、
塩基2754〜2786を有する断片を切り取り、その断片は図
29に示したように、PV1−Ｍアミノ酸1094〜1102をコー
ドしている。本願において本発明者らは、ポリオウィル
スアミノ酸に対して４文字の符号を用いている。例え
ば、1095は、カプシド蛋白VP1のアミノ酸95である。切
り取った断片をインフルエンザ菌Tbp2からのアミノ酸を
コードする合成オリゴヌクレオチドに代えることで、ポ
リオウィルスおよびトランスフェリン受容体の両方のア
ミノ酸配列をコードする新たなハイブリッドcDNAクロー
ンを構築した。その新たなハイブリッドcDNAクローンを
制限酵素Nhe IおよびSnaB Iで切断した。これらの制限
酵素は、ポリオウィルス塩基2471〜2956からトランスフ
ェリン受容体DNA配列などのハイブリッド断片を切り取
るものである。PV1−Ｍの全ゲノムの例えばpT7XLDまた
はpT7CMCBのようなcDNAクローンを、Nhe IおよびSnaB I
で切断して、ポリオウィルス塩基2471〜2956からの断片
を切り取った。次にこれを、トランスフェリン受容体DN
A配列を有するハイブリッド断片に代えて、図29に示し
たように、トランスフェリン受容体アミノ酸を有するハ
イブリッドBCループをコードする塩基によって置換され
た塩基2754〜2786を有するPV1−Ｍのゲノムのハイブリ
ッドcDNAクローンを得た。

プラスミドpT7XLDpypのpT7CMCBなどのpT7XLD由来のク
ローンは、PV1−McDNAの5'末端に酵素T7 RNAポリメラー
ゼのプロモータ配列を有する。既報の方法（van der We
rf et al）に従って、T7 RNAポリメラーゼを用いて、ト
ランスフェリン受容体アミノ酸をコードする塩基などの
PV1−McDNAのRNA転写体を得た。これらRNA転写体による
ベロ細胞のトランスフェクションによって、PV1TBP2A、
PV1TBP2B、PV1TBP2CおよびPV1TBP2Dと称される４つの生
ハイブリッドウィルスが得られた。pT7CMCBの転写物に
よるトランスフェクションによって、PV1XLDと称される
トランスフェクション由来の野生型ポリオウィルスが得
られた（図29）。

PV1TBP2A、PV1TBP2B、PV1TBP2CおよびPV1TBP2Dの抗原
特性を表５に示してある。これらはいずれも、配列LEGG
FYGP（配列番号:74）を組み込んだペプチドに対して形
成されたモルモット抗血清によって中和され、ウィルス
が抗原的に認識できる形でこの配列を発現したことを示
している。この抗血清を得るために、雌モルモットを、
リン酸アルミニウム（3mg/mL）で製剤してペプチド200
μｇを含む容量500μＬのIMで免疫感作した。動物は第
１日、第14日、第28日および第42日に免疫感作し、第０
日、第28日、第42日および第56日に採血した。血清は第
56日の採血からのものとした。PV1TBP2AおよびPV1TBP2B
も、インフルエンザ菌DL63株Tbp2に対して形成したウサ
ギ抗血清によって中和され、少なくともこれら２つのウ
ィルスはその蛋白に対して生じた抗体に対して認識可能
な形で配列を発現していることが示された。全てのウィ
ルスが抗PV−１血清によって中和可能であり、ポリオ中
和抗原部位Ｉにおける変化がウィルスにおける他の抗原
性部位にはほとんど影響しなかったことを示している。

実施例21 本実施例は、ポリオウィルスハイブリッドを用いたTb
p2に対する高力価抗血清の誘発について説明するもので
ある。

ウサギに、CsCl精製PV1TBP2Aを接種した（ウサギ番号
40、41および42）。使用したウィルスは生存ウィルスで
あったが、ポリオウィルスははウサギでは複製せず、認
められる反応は実際には失活抗原に対する反応であるこ
とは留意すべき点である。第１日に、ウサギの背中に、
ウィルスの不完全フロイントアジュバント液１μｇを皮
下注射にて接種し、第14日に、ウサギの背中に、ウィル
スの不完全フロイントアジュバント液１μｇを皮下注射
して追加免疫を行った。第０日（接種前採血）および第
27日にウサギから採血した。接種当たりのウィルスの用
量は、2.5×10⁸pfuであり、これはA₂₆₀値から求めたと
ころ約3.0×10¹¹ビリオンであった。各ビリオンはエピ
トープ60コピーを発現することから、これはウィルス0.
5pmolまたはLEGGFYG（配列番号:74）エピトープ30pmol
に相当する。

実施例22 本実施例は、インフルエンザ菌によって生じる疾患か
らの関連する動物モデルの予防について説明するもので
ある。

菌血症の幼若ラットモデル（Loeb et al,1987）を用
いて、抗Eagan rTbp1および抗Eagan rTbp2抗血清の予防
能力を評価した。ウサギまたはモルモットのいずれかに
対して形成した抗Eagan rTbp1抗血清はこのモデルでは
予防効果を示さなかったが、ウサギまたはモルモットの
いずれかに対して形成した抗Eagan rTbp2抗血清には予
防効果があった（表７）。これらのデータは、保護抗原
としてのrTbp2蛋白の使用を示すものである。

組換えTbp2（rTbp2）の鼻咽頭コロニー形成防止能力
をチンチラで求めた。インフルエンザ菌株12を、ストレ
プトマイシン10〜100μg/mL含む補足ミュラー・ヒント
ン寒天（Mueller Hinton agar）で成長させて、自然str
^Rコロニーを得た。100μg/mLのストレプトマイシンに対
して耐性の菌株12をコロニー形成で使用して、鼻洗浄液
からのインフルエンザ菌の特異的培養を行うことができ
た。

ミョウバン中のrTbp2 30μｇ、またはミョウバン中の
２×109cfuの失活菌株12全細胞、またはミョウバン単独
のいずれかによって、第０日、第14日および第28日にチ
ンチラ（３〜４ヶ月齢または１〜２歳）の免疫感作を行
った。第44日に、ケタミンHClを用いて動物に軽く麻酔
を施した。ヘミンおよびニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NAD）を補給したBHI培地に入った培養したば
かりのストレプトマイシン耐性NTHi株12の受動吸入（鼻
孔当たり50μＬ、動物当たりの総量0.1mL）によって鼻
腔内接種を行った。細菌負荷の用量は、動物当たり１×
10⁸cfuとした。

鼻咽頭洗浄を、接種後第５日および第９日に実施し
た。無菌希釈液（希釈液:BHI 50mL、生理食塩水100mL、
NAD 200μｇおよび１％ヘミン25μＬ）1mLで鼻咽頭を洗
浄し、反対側の鼻孔から出てくる液体を回収すること
で、麻酔を施したチンチラから分泌物を得た。通常は、
各動物から液体500μＬを回収し、サンプル25μＬを、
ストレプトマイシン1mg存在下にチョコレート寒天平板
で平板培養した。結果を表10に示してある。負荷後第５
日および第９日の両方について、未希釈の鼻洗浄液を、
ストレプトマイシン存在下に平板培養した。２つの陽性
対照群（全細胞免疫感作および回復期）の数匹の動物が
負荷後第５日に鼻咽頭コロニー形成が陽性であったが、
第９日までにはこれら動物で、いずれの細菌も消失し、
これら２群の動物において耳感染を起こした動物はなか
った。そこで、rTbp2が、NTHiコロニー形成に対してチ
ンチラを部分的に保護したことが明らかである。

実施例23 本実施例は、本発明の１実施態様によるトランスフェ
リン受容体蛋白Tbp2の切断類縁体の形成について説明す
る。

大腸菌によって、インフルエンザ菌Tbp2を少量得る。
塩基消去キット（Erase−ａ−base kit）を用いて、Eag
an tbpB遺伝子をその3'末端から切断した。切断遺伝子
を、T7プロモータからの大腸菌BL21（DE3）で発現させ
た。図31および表８に示したようなTbp2の多くの切断類
縁体が得られた。残っている成熟Eagan rTbp2のパーセ
ントを示してあり、切断クローンの発現レベルを、全長
Eagan rTbp2クローンのものと比較した（表８）。ヒト
トランスフェリン（Tf）への切断クローンの結合を、モ
ートンらの報告（Morton and Williams,1990）に記載の
アッセイを用いて測定した。データは、蛋白のカルボキ
シ領域の切断によって、Eagan rTbp2の収量を大幅に向
上させることができることを示している。そのデータは
さらに、トランスフェリン結合部位が、成熟Eagan Tbp2
蛋白の残基348および446の間にある可能性のあることを
示している（表３および図32）。しかしながら、切断rT
bp2におけるTf結合部位の保存は、それを保護免疫原と
して使用する上で必要ではないと考えられる。

菌血症の幼若ラットモデル（Loeb et al.,1987）を用
いて、モルモットおよびウサギで形成された抗血清のト
ランスフェリン受容体蛋白Tbp2の切断類縁体に対する保
護能力を評価し、結果を表９に示した。動物が血液２μ
Ｌ中に＜10cfuを有している場合、その動物は保護され
たものと考えられる。

開示の要旨 本開示内容をまとめると、本発明は、トランスフェリ
ン受容体蛋白の免疫原性切断類縁体をコードする精製・
単離核酸分子およびその切断類縁体、特にはTbp2を提供
するものである。その核酸分子および切断類縁体は、診
断、免疫感作および診断・免疫感作試薬の形成において
有用である。発現組換え切断Tbp2に基づくワクチンを製
造して、トランスフェリン受容体を産生する病原菌によ
って生じる疾患の予防を行うことができる。本発明の範
囲内においての変更は可能である。

モルモットおよびウサギにおいて、Eagan rTb1および
Eagan Tbp2蛋白に対して抗血清を形成した。幼若ラット
を抗血清0.1mLで皮下注射にて免疫感作し、24時間後に
インフルエンザ菌ｂ型MinnA株350cfuを腹腔内投与にて
負荷した。負荷後20時間で採血を行い、チョコレート寒
天で平板培養を行った。

参考文献リスト Barcak et al.,（1991）Methods Enzymol.204:321−3
42. Berkowitz et al.,（1987）J.Pediatr.110:509. Black et al.,（1991）Pediatr.infect.Dis.J.10:97. Bluestone,N.（1982）Engl.J.Med.306:1399. Chang et al.,（1978）Nature 375:615. Chou et al.,（1978）Annual Reviews Of Biochemist
ry 47,251−276. Claesson et al.,（1989）J.Pediatr.114:97. Cornelissen et al.,（1992）J.Bacteriol.174:5788. Danve,et al.,（1993）.Vaccine 11,1214−1220. Deres et al.,（1989）Nature 342:651. Gerlach,et al.,（1992）Infect.Immun.608:325 Goeddel et al.,（1979）Nature 281:544. Goeddel et al.,（1980）Nucl.Acids Res.8:4057. Harkness et al.,（1992）J.Bacteriol.174:2425. Holland et al.,（1992）Infect.Immun.60:2986. Hopp,T.P.（1986）Journal of Immunological Method
s 88,1−18. Itakura et al.,（1977）Science 198:1056. Jarosik et al.,（1994）.Infection and Immunity 6
2,2470−2477. Legrain et al.,（1993）.Gene 130:73. Lockhoff et al.,（1991）Chem.Int.Ed.Engl.30:161
1. Mickelsen and Sparling,（1981）Infect.Immun.33:5
55. Morton et al.,（1993）Infection and Immunity 61,
4033−4037. Murdin et al.,（1992）J.Gen.Viral 73:607. Murdin et al.,（1991）Microbial Pathogenesis 10:
27. Nixon−George et al.,（1990）J.Immunol.14:4798. Ogunnariwo,and Schryver8,（1992）Avian Dis.36:65
5. O'Hagan（1992）Clin Phamokinet.22:1. Panezutti et al.,（1993）Infection and Immunity
61,1867−1872. Roosi−Campos et al.,（1992）Vaccine 10,512−51
8. Schryvers,（1988）Molec.Microbiol.2:467. Schryvers and Lee,（1989）Can.J.Microbiol.35:40
9. Schryvers and Gray−Owen,（1992）J.Infect.Dis.16
5 suppl 1:S103. Schryvers（1989）Med.Microbiol.29:121. Short et al.,（1988）Nucl.Acids Res.16:7583. Ulmer et al.,（1993）Curr.Opinion Invest.Drugs.2
（９）2 983−989. Van der Werf et al.,（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.8
3:2330. Weismuller et al.,（1989）Vaccine 8:29. Wilton et al.,（1993）FEMS Microbiology Letters
107,59−66. Loeb et al,1987 Infect.Immun.55:2612−2618. Barenkamp et al,1988 Infect.Immun.52:572−578. Morton and Williams 1990−J.Gen.Microbiol.136:92
7−933. 米国特許4855283号 米国特許4258029号 米国特許4496538号 米国特許4599230号 米国特許4599231号 米国特許4601903号 米国特許5141743号 米国特許4596792号 米国特許4952496号 米国特許5194254号 WO 92/17167

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｐ 31/04 5/00 Ｂ (72)発明者 ハークネス、ロビン イー. カナダ国 エム２ケー １ビー８ オン タリオ州 ウイロウデイル シェパード アヴェニュー イースト 640 アパ ートメント 1706番 (72)発明者 シュライヴァーズ、アンソニー ビー. カナダ国 ティー３エー ３ヴイ８ ア ルバータ州 カルガリー エヌ．ダブリ ュ． エドフォース ロード 39 (72)発明者 チョン、ペレ カナダ国 エル４シー ０ビー９ オン タリオ州 リッチモンド ヒル エスト リル ストリート 32 (72)発明者 グレイ−オーエン、スコット カナダ国 ティー３ビー ５エイチ４ アルバータ州 カルガリー エヌ．ダブ リュ． シルヴァーグローヴ ドライヴ 2210−142 (72)発明者 ヤン、ヤン−ピン カナダ国 エム２アール ３エヌ７ オ ンタリオ州 ウイロウデイル トレスデ イル アヴェニュー 120 アパートメ ント 1709 (72)発明者 マーディン、アンドリュー ディー. カナダ国 エル３エックス １ヴイ２ オンタリオ州 ニューマーケット ロー デス サークル 146 (72)発明者 クライン、マイケル エイチ. カナダ国 エム２ピー １ビール オン タリオ州 ウイロウデイル ムンロ ブ ールヴァード 16 (56)参考文献 国際公開95／013370（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/31 A61K 39/102 A61K 48/00 C07K 14/285 A61P 31/04 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体
   蛋白の防護免疫原性Ｃ末切断型類縁体をコードする精製
   ・単離核酸分子であって、 前記Ｃ末切断型類縁体は、該トランスフェリン受容体蛋
   白の全アミノ酸配列長の少なくとも54％を保持するもの
   であることを特徴とする核酸分子。
2. 【請求項２】コードされる前記Ｃ末切断型類縁体が基と
   する、全アミノ酸配列長のヘモフィルス株のトランスフ
   ェリン受容体蛋白は、ヘモフィルス株のTbp2蛋白である
   ことを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
3. 【請求項３】前記Ｃ末切断型類縁体が基とする全アミノ
   酸配列長のヘモフィルス株のTbp2蛋白は、その全アミノ
   酸配列を図31に示されるインフルエンザ菌ｂ型のEagan
   株由来のTbp2蛋白、または、該インフルエンザ菌ｂ型の
   Eagan株由来のTbp2蛋白と等価な別のヘモフィルス株由
   来のTbp2蛋白であり、 前記Ｃ末切断型類縁体の保持する、該ヘモフィルス株の
   Tbp2蛋白全アミノ酸配列長に対する比率は、 表８中に、その保持比率を示し、対応するアミノ酸配列
   を図31中に表示する、アミノ酸番号18−637のクローンD
   S−1461−８−１として表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末
   切断型類縁体の比率98％、 アミノ酸番号18−537のクローンDS−1466−１−１とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率83
   ％、 アミノ酸番号18−529のクローンDS−1466−１−14とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率80
   ％、 アミノ酸番号18−463のクローンDS−1466−２−６とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率69
   ％、 アミノ酸番号18−425のクローンDS−1466−３−４とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率63
   ％、 アミノ酸番号18−417のクローンDS−1466−３−１とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率62
   ％、 アミノ酸番号18−411のクローンDS−1644−７−９とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率61
   ％、 アミノ酸番号18−404のクローンDS−1466−１−４とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率60
   ％、 アミノ酸番号18−365のクローンDS−1457−３−１とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率54
   ％ のいずれかを選択することを特徴とする請求項２に記載
   の核酸分子。
4. 【請求項４】ヘモフィルス株のトランスフェリン受容体
   蛋白の防護免疫原性Ｃ末切断型類縁体をコードする精製
   ・単離核酸分子であって、 前記核酸分子は、 （ａ） 図３に示した配列番号:1のDNA配列、図４に示
   した配列番号:2のDNA配列、図５に示した配列番号:3のD
   NA配列、図６に示した配列番号:4のDNA配列、図７に示
   した配列番号:105のDNA配列、図８に示した配列番号:10
   8のDNA配列、図９に示した配列番号:110のDNA配列、図1
   0に示したの配列番号:112のDNA配列もしくは図11に示し
   た配列番号:114のDNA配列のいずれかDNA配列； （ｂ） 図３に示した配列番号:5のアミノ酸配列、図４
   に示した配列番号:6のアミノ酸配列、図５に示した配列
   番号:7のアミノ酸配列、図６に示した配列番号:8のアミ
   ノ酸配列、図７に示した配列番号:9のアミノ酸配列、図
   ８に示した配列番号:10のアミノ酸配列、図９に示した
   配列番号:10のアミノ酸配列、図10に示した配列番号:11
   のアミノ酸配列、図11に示した配列番号:12のアミノ酸
   配列、もしくは図31に示した配列番号:106、配列番号:1
   07、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113または
   配列番号:115のアミノ酸配列、このいずれかのアミノ酸
   配列をコードするDNA配列；および （ｃ） 前記（ａ）または（ｂ）に定義されるDNA配列
   のいずれかに対して厳しい条件下にハイブリッド形成す
   るDNA配列 から成る群から選択されるDNA配列の切断形であり、 前記類縁体は、該トランスフェリン受容体蛋白の全アミ
   ノ酸配列長の少なくとも54％を保持するものであること
   を特徴とする核酸分子。
5. 【請求項５】前記（ｃ）に定義されるDNA配列が、
   （ａ）または（ｂ）に定義されるDNA配列のいずれかと
   少なくとも90％の配列一致率を有することを特徴とする
   請求項４に記載の核酸分子。
6. 【請求項６】宿主の形質転換を行うための発現ベクター
   であって、 前記請求項１〜５のいずれか一項に記載される核酸分子
   と 前記核酸分子によって、コードされる該ヘモフィルス株
   のトランスフェリン受容体蛋白の防護免疫原性切断型類
   縁体を宿主から発現させるために、前記核酸分子と有効
   に結合した発現手段とを含んでなる発現ベクター。
7. 【請求項７】請求項６に記載の発現ベクターを保持する
   形質転換宿主。
8. 【請求項８】前記発現ベクターが発現する該ヘモフィル
   ス株のトランスフェリン受容体蛋白の防護免疫原性切断
   型類縁体は、 表８中に、その保持比率を示し、対応するアミノ酸配列
   を図31中に表示する、アミノ酸番号18−637のクローンD
   S−1461−８−１として表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末
   切断型類縁体、 アミノ酸番号18−537のクローンDS−1466−１−１とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−529のクローンDS−1466−１−14とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−463のクローンDS−1466−２−６とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−425のクローンDS−1466−３−４とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−417のクローンDS−1466−３−１とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−411のクローンDS−1644−７−９とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−404のクローンDS−1466−１−４とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−365のクローンDS−1457−３−１とし
   て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体 のいずれかから選択される、 その全アミノ酸配列を図31に示されるインフルエンザ菌
   ｂ型のEagan株由来のTbp2蛋白に基づく、Ｃ末切断型類
   縁体であることを特徴とする請求項７に記載の形質転換
   宿主。
9. 【請求項９】前記請求項７または８に記載の形質転換宿
   主により産生可能なトランスフェリン受容体蛋白の組み
   換え型の防護免疫原性Ｃ末切断型類縁体。
10. 【請求項１０】基となるヘモフィルス株のTbp2蛋白全ア
    ミノ酸配列長の少なくとも54％を保持する、該ヘモフィ
    ルス株の防護免疫原性Ｃ末切断型Tbp2蛋白。
11. 【請求項１１】前記Ｃ末切断型類縁体が基とする全アミ
    ノ酸配列長のヘモフィルス株のTbp2蛋白は、その全アミ
    ノ酸配列を図31に示されるインフルエンザ菌ｂ型のEaga
    n株由来のTbp2蛋白、または、該インフルエンザ菌ｂ型
    のEagan株由来のTbp2蛋白と等価な別のヘモフィルス株
    由来のTbp2蛋白であり、 前記Ｃ末切断型類縁体の保持する、該ヘモフィルス株の
    Tbp2蛋白全アミノ酸配列長に対する比率は、 表８中に、その保持比率を示し、対応するアミノ酸配列
    を図31中に表示する、アミノ酸番号18−637のクローンD
    S−1461−８−１として表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末
    切断型類縁体の比率98％、 アミノ酸番号18−537のクローンDS−1466−１−１とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率83
    ％、 アミノ酸番号18−529のクローンDS−1466−１−14とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率80
    ％、 アミノ酸番号18−463のクローンDS−1466−２−６とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率69
    ％、 アミノ酸番号18−425のクローンDS−1466−３−４とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率63
    ％、 アミノ酸番号18−417のクローンDS−1466−３−１とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率62
    ％、 アミノ酸番号18−411のクローンDS−1644−７−９とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率61
    ％、 アミノ酸番号18−404のクローンDS−1466−１−４とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率60
    ％、 アミノ酸番号18−365のクローンDS−1457−３−１とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体の比率54
    ％ のいずれかを選択することを特徴とする請求項10に記載
    の切断型Tbp2蛋白。
12. 【請求項１２】（Ａ） 請求項１〜５のいずれか一項に
    記載の精製・単離核酸分子； （Ｂ） 請求項９に記載のトランスフェリン受容体蛋白
    の組み換え型防護免疫原性Ｃ末切断型類縁体；および （Ｃ） 請求項10または11に記載の少なくとも１つのヘ
    モフィルス株の防護免疫原性切断Tbp2蛋白 から構成される群から選択される少なくとも１つの活性
    成分と 前記活性成分用の医薬的に許容される担体とを含んでな
    り、 前記の少なくとも１つの活性成分は宿主への投与時に免
    疫応答を起こすものである免疫原性組成物。
13. 【請求項１３】ヘモフィルス株の防護免疫原性Ｃ末切断
    型Tbp2蛋白の製造方法であって、 該Ｃ末切断型類縁体は、前記Tbp2蛋白の全アミノ酸配列
    長の少なくとも54％を保持するものであり、 制御配列に有効に結合した該ヘモフィルス株の防護免疫
    原性Ｃ末切断型Tbp2蛋白をコードする核酸分子を含んで
    なる発現ベクターを構築する工程； 前記発現ベクターを宿主に導入する工程；および 前記宿主から前記防護免疫原性Ｃ末切断型Tbp2蛋白を発
    現させる工程 とを有することを特徴とする方法。
14. 【請求項１４】前記発現ベクターが発現する該ヘモフィ
    ルス株のTbp2蛋白の防護免疫原性切断型類縁体は、 表８中に、その保持比率を示し、対応するアミノ酸配列
    を図31中に表示する、アミノ酸番号18−637のクローンD
    S−1461−８−１として表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末
    切断型類縁体、 アミノ酸番号18−537のクローンDS−1466−１−１とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−529のクローンDS−1466−１−14とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−463のクローンDS−1466−２−６とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−425のクローンDS−1466−３−４とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−417のクローンDS−1466−３−１とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−411のクローンDS−1644−７−９とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−404のクローンDS−1466−１−４とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体、 アミノ酸番号18−365のクローンDS−1457−３−１とし
    て表記する成熟型Tbp2蛋白のＣ末切断型類縁体 のいずれかから選択される、 その全アミノ酸配列を図31に示されるインフルエンザ菌
    ｂ型のEagan株由来のTbp2蛋白に基づく、Ｃ末切断型類
    縁体であることを特徴とする請求項13に記載の方法。