KR100394454B1 - 트랜스페린수용체유전자들 - Google Patents

Abstract

헤모필루스 계통의 트랜스페린 수용체 단백질 또는 단편 또는 트랜스페린 수용체 단백질의 유사체를 코딩하는 정제되고 분리된 핵산을 제공한다. 핵산 서열은 진단학과 의학적 치료의 목적으로 정상적으로 Tbp1 또는 Tbp2 단백질들을 지닌 박테리아로부터 유도된 불순물이 없는 펩티드들을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 핵산 분자는 감염 진단에서 사용될 수 있다. 또한, 재조합 Tbp1 또는 Tbp2 단백질과 이들을 정제하기 위한 방법이 제공된다. 백신접종을 위한 트랜스페린 수용체 단백질의 에피토프를 발현하는 생(live) 벡터들이 제공된다.

Description

트랜스페린 수용체 유전자들{@@@@}

위의 개시는 일반적으로 본 발명을 설명한다. 더 완전한 이해는 다음의 구체적 실시예와 관련해 얻을 수 있다. 이러한 실시예들은 오직 예시의 목적으로만 설명되었고 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않았다. 상황에 따라 어떤 수단이 제시되거나 제공되므로 형태에서의 변화와 등가물의 대체가 예상되었다. 비록 구체적 용어들이 여기에 사용되었지만, 그런 용어들은 제한적 목적이 아닌 설명적인 인식에서 의도되었다.

분자 유전학, 단백질 생화학, 면역학과 발효 기술이 사용되었으나 본 개시에서는 명백히 설명되지 않았고 이러한 실시예들은 과학 문학에서 충분히 보도되었으며 숙련된 기술을 가진 사람들의 능력내에서 만족스럽게 간주된다.

실시예 1

이 실시예는 H. 인플루엔자 변형 DL63, Eagan, MinnA, 및 PAK 12085와 SB33으로부터 염색체 DNA의 제조를 예를 들어 설명하고 있다.

헤모필루스 인플렌쟈 변형은 Harkness et al 1992에 의해 설명되었듯이 Muller-Hinton 한천이나 두뇌 심장 주입 액체 배양기에서 생장되었다.

A. 헤모필루스 인플렌쟈타입 b DL63으로부터의 염색체 추출

염색체 DNA는 다음과 같이 제조되었다. 250ml의 배양균은 Bechman J14의 회전자에 15분동안 8,000rpm의 원심분리에 의해 조그만 덩어리로 만들어졌다. 이 덩어리 200ml의 50mM 3-HCl, pH 8.0으로 씻겨졌고, 원심 분리되어졌으며, 12.5ml의 50mM tris-HCl, 50mM EDTA, pH 8.0에서 다시 정지되었고, -20℃에서 냉동되었다. 그후, 냉동 세포 덩어리에 0.25M 3-HCl, pH 8.0에서 10 mg/ml 리소짐 용해제 1.25 ml이 첨가되었다. 그 덩어리는 해동되어서 얼음위에서 45분간 배양되었다. 다음은 0.5% SDS, 0.4M EDTA, 50mM 3-HCl, pH 7.5에서 1mg/ml 단백질 분해 효소 K의 용해제 2.5ml가 첨가되었고 혼합물은 50℃에서 1시간동안 수시로 섞어지며 배양되었다. 용해질이 3번 완충된 페놀 15ml로 한 번 추출된 후, 3M 나트륨 아세테이트 1.5 ml와 에타놀 30ml가 DNA를 침전시키기 위해 첨가되었다. DNA가 유리 막대에 감겨진 후, 0.2mg/ml RNAse A를 포함하는 12.5ml의 50mM tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5에서 하룻밤동안 흔들림으로서 용해되었다. 견본은 동량의 클로로포름을 가지고 한 번 추출되며, 침전되고, 위에서와 같이 막대에 감기어졌다. DNA는 50mM tris-HCl의 2 ml, 1mM EDTA, pH 7.5에서 용해되었고 4℃에 저장되었다.

B. 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b Eagan으로부터 염색체 DNA 추출

50 ml의 배양액이 원심분리에 의해 작은 덩어리로 되었으며, 그 덩어리 TE(10mM tris, 1mM EDTA, pH 7.5)의 25ml에서 다시 부양되었고, 2 x 5ml 약수는 염색체 DNA 제조에 사용되었다. 각각의 약수에는 10%의 사르코실 0.6ml과 20mg/ml 단백질 분해 효소 K의 0.15ml가 첨가되었고 견본은 37℃에서 1시간동안 배양되었다. 용해질을 tris-포화된 페놀로 한 번 추출하였고 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1)로 세 번 추출되었다. 액상들은 7ml의 최종 용적으로 풀(pool)되었다. 그런 다음, 3M 나트륨 아세테이트(pH 5.2) 0.7 ml와 이소프로파놀 4.3 ml가 막대에 감겨진 DNA를 침전시키도록 첨가되었고, 70%의 에탄올로 씻어서 건조하여, 1 ml의 물로 다시 부유 되었다.

C. 헤모필루스 인플렌쟈 Eagan, MinnA, PAK 12085와

SB33으로부터 염색체 DNA 추출

세포들은 5,000 rpm으로 15-20분동안 4℃에서 원심분리에 의해 50 ml의 배양액에서 작은 덩어리로 되었다. 세포로 이루어진 덩어리는 TE(10mM 3-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5) 10 ml에서 다시 부유되었고, 프로나제와 SDS가 500 ㎍/ml와 1%의 최종 농축액에 각각 첨가되었다. 견본은 순수한 용해질이 얻어질 때까지 37℃에서 4시간동안 배양되었다. 용해질은 tris-포화 페놀로 한 번, tris-포화 페놀/클로로포름 (1:1)으로 한 번, 클로로포름으로 한 번 추출되었다. 최종 액상은 24시간 동안 1M NaCl의 2 x 500 ml에 대하여 4℃에서, 완충제를 한 번 바꾸어, 그리고 24시간 동안 TE의 2 x 500 ml에 대하여 4℃에서, 완충제를 한 번 바꾸어 투석되었다. 최종 투석물은 사용하도록 나누어졌다.

실시예 2

본 실시예는 염색체 라이브러리(libraries)들 제조를 예시한다.

A. H. 인플렌쟈 DL63-λZAP 라이브러리

TE에 있는 H. 인플렌쟈 DL63 염색체 DNA 100 ㎍는 25 게이지 바늘의 1ml 주사기에서 기계적으로 전단되었다. 전단된 DNA는 10 x S1 뉴클레아제 완충제 (2M NaCl, 500mM NaOAc, pH 4.5, 10mM ZnSO₄ , 5% 글리세롤) 405μl, 45μl, 그리고 100 U/μl에서 36℃로 15분간 배양되는 S1 뉴클레아제 1.7 μl의 최종 용적에 물을 첨가함으로써 끝 부분이 울퉁불퉁해졌다. 견본은 페놀/클로로포름으로 한 번 그리고 클로로포름으로 한 번 추출되었고 1ml의 에탄올이 DNA를 침전시키도록 첨가되었다. 견본은 얼음에서 10분 동안 아니면 -20℃에서 하룻밤 배양되었고, DNA는 30분 동안 마이크로푸지(microfuge)에서 원심분리에 의해 채취되었다. DNA는 70%의 에탄올로 씻겨져서 건조되었다. DNA 서열내의 Eco RI 부위는 표준 절차를 이용하여 메틸화되었다. 메틸화된 DNA에는 1000mM MgCl₂ 5μl, dNTP 혼합(dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각의 2.5 mM)의 8μl, U/μl 클레노우(Klenow) 4μl이 첨가되었다. 혼합물은 12℃에서 30분 동안 배양되었다. STE(0.1M NaCl, 10mM 3-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 450μl이 첨가되었고, 혼합물은 페놀/클로로포름으로 한 번 추출되었으며, DNA를 침전시키기 위해 1ml의 에탄올이 첨가되기 전에 클로로포름으로 한 번 추출되었다. 견본은 얼음에서 10분 동안 혹은 -20℃에서 하룻밤 배양되었다. DNA는 마이크로퓨지에서 30분 동안 원심분리에 의해 채취되었고, 70%의 에탄올로 헹구어지고 건조되었다.

DNA는 TE 7μl에서 다시 부유되었고 인산화된 Eco RI 링커들(200 ng/μl) 14 μl, 10 x 결찰(ligation) 완충제 3μ1, 10mM ATP 3μl, 그리고 T4 DNA 리가제 (4 U/μl) 3μl이 용액에 첨가되었다. 견본은 4℃에서 하룻밤동안 배양되었고, 리가제를 비활성화하도록 68℃에서 10분 동안 배양되었다. 혼합물에는 H₂O 218μl, 10x 유니버설 완충제 45 μl, 그리고 30 U/μl 의 Eco RI 7 μl이 첨가되었다. 37℃에서 1시간 반동안 배양후, 0.5MEDTA 1.5 μl이 첨가되었고, 혼합물은 얼음위에 놓여졌다.

DNA는 6-10 kb의 DNA를 함유하는 부분을 풀링하여, 자당의 증감으로 크기-분류된다. 풀된 DNA는 에탄올이 침전되며 TE 완충제 5 μl에서 다시 부유된다. 삽입 DNA 200ng는 최종 용량 5 μl내의 ZAP II 벡터 1㎍와 2-3일간 4℃에서 결찰되었다. 결찰 혼합물은 Gigapack II Gold (Stratagene)을 사용하여 포장되었고 NZY 금속판위에 E. coli SURE 세포로 덧씌어졌다. 라이브러리는 적정하게 확대되었고, 4℃에서 0.3%이하의 클로로포름에 저장되었다.

B. H. 인플렌쟈 Eagan-pUC 라이브러리

실시예 1C의 방법에 의해 H. 인플렌쟈 Eagan으로부터 조제된 염색체 DNA는 Sau3A I와 함께 2, 5, 그리고 10분동안 소화되었으며 견본들은 예비 아가로우스 겔에 전기 영동으로 분리되었다. 길이가 3-10 kb 사이의 DNA 단편을 포함한 겔 슬라이스들은 절제되었고 DNA는 표준 동결-해빙 절차에 의하여 추출되었다. pUC 8:2 (pUC 8은 부가적인 Bgl II와 복합 클로닝 부위의 Xba I 제한 효소 부위와 같이)로부터의 플라스미드 DNA는 BamH I과 Bal II과 함께 소화되었고, 비복 알칼리성 포스파타제(CAP)와 함께 인산화되었다. H. 인플렌쟈 Eagan DNA의 단편은 pUC로 결찰되었고 혼합물은 E. coli JM109 세포를 변형하도록 이용되었다.

C. H. 인플렌쟈 Eagan-λZAP 라이브러리

실시예 1B에서 제조되었듯이 H. 인플렌쟈 Eagan으로부터의 염색체 DNA는 Eco RI와 함께 소화되었고 예비 아가로제 겔에서 크기 분류되었다. 7-23 kb의 DNA 단편에 따른 겔 슬라이스들은 절제되었고 DNA는 14V에서 TAE(40mM 3-아세테이트, 1mM EDTA)의 3 ml을 포함하는 투석 배관에서 하룻밤 전기희석되었다. DNA는 두 번 침전되었고 Eco RI 소화 λZAP II DNA와 같이 밤새워 결찰되기 전에 물에서 다시 부유되었다. 결찰 혼합물은 지가팩 II 포장 도구(Stratagene)를 사용하여 포장되었고 E. coli XL1-Blue 세포로 덧씌어졌다. 라이브러리는 적정되었고, 확대되었으며, 4℃에서 0.3%미만 클로로포름에 저장되었다.

D. EMBL3 라이브러리

H. 인플렌쟈 MinnA 염색체 DNA (10 ㎍)는 실시예 1C에서처럼 조제되었고 Sau3A(40 units)와 함께 2, 4, 그리고 6분간 소화되고 난 후 TNE 완충제 (20mM 3-HCl, 5mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8)의 10-30% 자당 변화에 크기-분류되었다. 5 kb보다 큰 DNA 단편을 포함하는 일부는 고여서 침전되었다. 두번째 실험에서, 염색체 DNA(2.6 ㎍)는 Sau3A I(4 units)와 함께 1, 2, 그리고 3분 동안 소화되었고 예비 아가로즈 겔 전기 영동에 의해 크기-분류되었다. 10-20 kb의 DNA 단편을 포함하는 겔 슬라이스들은 절제되었고 DNA는 표준 동결/해빙 기술에 의해 추출되었다. 두 실험으로부터 크기-분류된 DNA는 EMBL3 (Promega)의 BamH I상지와 함께 결찰되도록 고였다. 결찰 혼합물은 지가적 II 포장 도구를 사용하여 포장되었고 E.coli LE392 세포로 덧씌어졌다. 라이브러리는 적정되었고, 확대되었으며, 4℃에서 0.3% 미만 클로로포름 존재하에서 저장되었다.

실시예 1C에서 제조되었듯이 H. 인플렌쟈 PAK 12085나 SB33 으로부터의 염색체 DNA는 Sau3A I(0.5 units/10 ㎍ DNA)와 함께 37℃에서 15분간 소화되었고 아가로제 겔 전기 영동에서 크기-분류되었다. 17-23 kb의 DNA 단편에 따른 겔 슬라이스들은 절제되었고 DNA는 14V에서 TAE의 3ml을 포함하는 투석 배관에서 밤새워 전기 희석되었다. DNA는 두 번 침전되었고 EMBL3 BamH I 상지(Promega)와 함께 밤새워 결찰되기전 물에서 다시 부유되었다. 결찰 혼합물은 생산자의 지시에 따라 비트로 포장 도구(Amersham)의 람브다를 사용하여 포장되었고 E. coli NM539 세포위에 덧씌어졌다. 라이브러리는 적정된후, 확대되었으며, 4℃에서 0.3%의 클로로포름 존재하에서 저장되었다.

실시예 3

본 실시예는 라이브러리의 선별법을 예시한다.

A. H. 인플렌쟈 DL63-λZAP 발현 라이브러리

Tbp1과 Tbp2 단백질은 고체상 인간 트랜스페린(hTf)에서 친화력-정제되었다. 간단히, 20ml의 hTf-세파로즈 칼럼은 CNBr-활성화 세파로즈(시그마)로의 결합 단백질 리간드의 생산자 프로토콜에 따라서 조제되었다. 그 결과로 생기는 매트릭스는 비공유 화합 hTf를 제거하기 위해 50mM 3-HCl의 3 칼럼 용적, 1M NaCl, 6M 구아니딘-HCl, pH 8.0을 가지고 세척되었다. 칼럼은 그 후에 50mM 3-HCl, pH 8.0에서 평형이 유지되었으며, 화합 hTf는 pH 8.6의 나트륨 구연산염과 나트륨 중탄산염 각각의 100mM를 포함하는 완충제에 1ml의 10mg/ml FeCl₃를 사용하여 철이 장착되었고, 그 다음에 50mM 3-HCl의 2 칼럼 용적, 1M NaCl, Ph 8.0이 뒤따른다. 전체 박테리아 막들은(전체 단백질 300mg) 상술된대로 철 결핍 배양액에 생장한 H. 인플렌쟈 계통 DL63로부터 조제되었다(Schryvers et al., 1989) 막들은 50mM 3-HCl, 1M NaCl, pH 8.0에서 2mg/ml로 희석되었고 EDTA를 첨가하여 15mM과 Sarkosyl NL97 1.5%로 용해되었다. 40,000 x g에서 1시간동안의 원심분리후예 상층액은 hTf 칼럼에 적용되었고 칼럼은 50mM 3-HCl의 10 칼럼 용적, 1M NaCl, 10mM EDTA, 0.5% Sarkosyl, pH 8.0에서 세척되었다. 수용체 단백질은 2M GnHCl를 이용하여 같은 완충제에서 희석되었고 희석된 부분은 25mM 암로니움 중탄산염 완충제(5 완충제 변화)에 대하여 광범하게 투석되었고, 동결 건조되었으며, -20℃에서 저장되었다. 분리된 단백질은 표준 기술을 이용하여 뉴질랜드 백토끼에서 트랜스페린 수용체-종 안티세라를 생성키 위해 사용되었다. 간단히, 토끼들은 2주 간격으로 첫 번째 주사에는 완전한 프로인즈의 보조제을 사용하여, 그 다음은 불완전한 Freund의 보조제를 사용하여 3번 피하로 면역되었다.

DL63 λZAP 라이브러리는 E. coli SURE 세포위에 덧 씌어졌으며 플라크는 pBluescript lacZ 프로모터로부터 발현을 유도하도록 10mM IPTG에 미리 담겨져 있는 니트로셀룰로스 막위로 전이되었다. 필터들은 폴리클로날 항-TfR 안티세라와 양고추냉이 페록시다제-교미 염소 항-토끼 IgG를 철저히 조사하기 전에 0.5%의 탈지 우유를 이용하여 50mM 30HCl, 150mM NaCl, pH 7.5에서 차단되었다. 플라크들은 3회의 선별 검사에 의해 정제되었고 재조합 pBluescript 플라스미드들(pBHIT1과 pBHIT2; 제 1A와 2도)은 in vivo 절단 절차에 의해 재생되었다(Short et al., 1988).

B. Eagan, MinnA, 그리고 PAK 12085 비발현 라이브러리들

(i) H. 인플렌쟈 Eagan-pUC 라이브러리의 선별검사

니트로셀룰로스위의 콜로니(colony)이동은 표준 기술을 이용하여 수행되었고 필터들은 제 2도에 예시된 트랜스페린 수용체 유전자의 5'pBHIT2 프로브로 검사되었다. 검사는 생산자의 명세서를 따라서 디곡시게닌(dig, Boehringer Mannheim)으로 이름지어졌다. 몇몇의 추정 클론들이 니트로셀룰로스에 얼룩으로 더럽혀졌으며 같은 5'pBHIT2 프로브를 사용하여 두 번째의 선별 검사법을 받게 되었다. 두 번째의 추정들은 제한효소 지도에 의해 분석되었고 클론 S-4368-3-3 (제 1B도, 제 2도)는 연속 분석을 위해 선별되였다.

(ii) H. 인플렌쟈 Eagan-λZAP 라이브러리 선별 검사법

파지 라이브러리는 LB 금속판과 0.7%의 아가로스 덮개층을 사용하여 XLI Blue 세포(스트라타진)에 표준 기술을 이용하여 덧씌어졌다. 플라크들은 표준 프로토콜을 이용하여 니트로셀룰로스위로 올려졌고 필터들은 DNA를 고정시키도록 진공상태에서 2시간동안, 80℃에서 구워졌다. 트랜스페린 수용체 유전자(제 2도)의 5'pBHIT2 검사법은 디옥시제닌으로 분류되었으며 필터들은 42℃에서 4시간동안 선 이종 교배된 후, 42℃에서 하룻밤동안 분류된 프로브를 가지고 잡종 교배되었다. 필터들은 자가 방사 기록후 68℃ 에서 세척되고 몇몇의 플라크들은 두 번째 선별 검사를 위해 선정되었다. 두 번째 추정으로부터 파지미드 DNA의 절단은 λZAP 시스템(프로메가)가 제공되는 프로토콜에 따라 수행되었다. ∼2.5 kb Eco RI 삽입물과 동일한 4개의 클론이 B도의 JB-901-5-3으로 얻어졌고, 제 2도가 그 예이다. 추정적인 플라크들도 확대되었고 파지 DNA는 500ml의 배양액에서 정제되었다. 삽입 DNA는 Xba I과의 소화에 의해 절단되었고 Xba I과 소화되어진 pUC 8:2 (다수의 클로닝 부위에 부가적인 Bgl II과 Xba I부위를 포함하는 pUC 8)로 클론이 만들어졌고 인산화되었다. 클론 JB-911-3-2(제 17도)는 H. 인플렌쟈 Eagan TfR 오페론의 3'-half를 포함한다.

(iii) EMBL 3 라이브러리 선별 검사

H. 인플렌쟈 MinnA 라이브러리는 NZCYM에 덮개층으로 0.7%의 상단 아가로스를 이용하여 NZCYM 금속판에 LE392 세포들위로 덧씌어졌다. 니트로셀룰로스 필터들위로의 플라크 이동은 표준 절차들을 따라 수행되었고, 필터들은 디곡시게닌으로 분류된 5'pBHIT2 프로브를 가지고 처리되고 검사되었다. 추정적인 플라크들은 똑같은 절차를 이용하여 덧씌어졌고 두 번째와 세 번째 선별 검사로 넘겨졌다. 파지 DNA는 표준 기술을 이용하여 500ml의 배양액으로부터 조제되었고, 삽입 DNA는 Sal I 소화되고 클론 DS-712-1-3를 생성토록 pUC로 클론화되었다(1C와 2도).

H. 인플렌쟈 PAK 12085 라이브러리는 NZCYM에서 덮개층으로 0.7%의 아가로스를 이용하여 NZCYM 금속판에 LE392 세포들로 덧씌어졌다. 플라크들은 니트로셀룰로스위로 이동되었고 필터들은 디곡시게닌으로 분류된 5'pBHIT2 프로브로 처리되고 검사되었다(제 2도). 추정적인 플라크들은 같은 절차를 이용하여 덧씌어졌고 두 번째와 세 번째 선별 검사를 받게 되었다. 파지 DNA는 표준 기술에 의해 500ml의 배양액으로부터 조제되었고, DNA 삽입은 Sal I와의 소화에 의해 절단되었고, 클론 JB-1042-7-6를 생성토록 pUC로 클론화되었다(1D와 2도).

H. 인플렌쟈 SB33 라이브러리는 NZCYM에서 덮개층으로 0.7%의 아가로스를 이용하여 NZCYM 금속판에 LE392 세포들로 덧씌어졌다. 플라크들은 니트로셀룰로스위로 이동되었고 필터들은 디곡시게닌으로 분류된 5'pBHIT2 프로브로 처리되어 검사되었다(제 2도). 추정적인 플라크들은 같은 절차에 따라 덧씌어졌고 두 번째와 세 번째 선별 검사를 받게 되었다. 파지 DNA는 표준 기술에 의해 500ml의 배양액으로부터 조제되었고, DNA 삽입은 Sal I와의 소화에 의해 절단되었고, 클론 JB-1031-2-9를 생성하도록 pUC로 클론화되었다(제 2도)

실시예 4

본 실시예는 TfR 오페론의 Tbp1과 Tbp2의 반복 진행을 예시하고 있다.

클론들 pBHIT 1, pBHIT 2, S-4368-3-3, JB-901-5-3, DS-712-1-3, JB-1042-7-6 그리고 JB-1031-2-9로부터의 플라스미드는 표준 기술을 이용하여 제조되었다. 길이 17-25 염기들의 올리고핵산염 연속 프라이머들(primers)은 ABI 모델 380B DNA 합성자로 합성되었고 Applied Biosystems Inc.사로부터 얻은 OPC 카트리지를 이용하여 색층 분석에 의해 정제되었으며, 생산자의 권고에 따라 사용되었다. 견본들은 생산자의 프로토콜에 따라서 ABI 모델 370A DNA 서열제어기(Sequencer)와 염색 종료기 화학을 이용하여 배열되었다. 계통 DL63로부터의 TfR 오페론의 진행 순서는 제 3도에 예시되었고, 계통 Eagan은 제 4도에, 계통 MinnA는 제 5도에, PAK 12085는 제 6도에 그리고 SB33은 제 7도에 예시되었다.

실시예 5

본 실시예는 비전형 H. 인플렌쟈 계통 SB12, SB29, SB30, 그리고 SB32로부터 tbp2 유전자의 PCR 증식을 예시하고 있다.

비전형 H. 인플렌쟈 계통 SB12, SB29, SB30, 그리고 SB32로부터의 염색체 DNA는 위에 설명된 것처럼 조제되었다. TfR 유전자들은 tbp1 다음에 있는 tbp2와 함께 오페론으로 조정되었다(제 12A도와 12B도 참조). 올리고핵산염은 tbp2의 5'- 끝과 tbp1 코딩 서열의 5'-끝의 역완성에 합성되었다. 프라이머들은 : Tbp2와 Tbp1의 리더(leader) 서열 MTKK(서열번호: 138)의 역 보체이자 유전자 사이 서열의 일부인 의 leader sequence로부터 MKSVPLISGS (서열번호 : 147)에 상응하는 이다(제 12A도와 12B도). PCR 증식은 10mM 3/HCl pH 8.3, 50 mM 칼륨 염화물과 1.5 mM 마그네슘 염화물을 포함하는 완충제에서 수행되었다. 각각의 100 μl 반응 혼합물은 염색체 DNA 5ng, 각 프라이머 1μl, 5 units amplitaq DNA 폴리메라제 (Perkin Elmer Cetus) 그리고 0.4 mM dNTPs(Perkin Elmer Cetus)를 포함하였다. 순환 조건은 94℃에서 1분간 25주기, 45℃에서 2분간 그리고 72℃에서 1분 30초간이었다. 구체적인 2 kb 단편은 개개의 견본을 위해 확대되었다(제 13도). SB33 DNA는 양성 제어로서 이용되었다(1레인). Tbp2 유전자 증식에 사용된 염색체 DNA는 1 레인, SB33; 2 레인, SB12; 3레인, SB29; 4레인, SB30; 그리고 5레인, SB32이다. 단편들은 TA 클로닝 벡터(Invitrogen)으로 클론화되었고 그들의 뉴클레오타이드 서열은 결정되었다. 계통 SB12 (서열번호: 108), SB29 (서열번호:110), SB30 (서열번호: 112)와 SB32 (서열번호: 114)로부터의 Tbp2의 핵산 서열은 제 8, 9, 10과 11도에서 차례로 보여주고 있다.

실시예 6

본 실시예는 부차적인 구조 분석에 의한 트랜스페린 수용체 단백질의 잠재적으로 노출된 에피토프의 트랜스페린 확인의 아미노산 서열 비교를 예시하고 있다.

제 14도를 참조하면, H. 인플렌쟈 타입 b Eagan, DL63, 비전형 H. 인플푸엔자 계통 PAK 12085와 SB33, 수막염균 계통 B16B6와 M982(Legrain et al., 1993) 그리고 임균 FA19(Cornelissen et al., 1992)로부터의 Tbp1의 아미노산 서열 비교를 보여주고 있다. 이 분석은 이런 모든 박테리아중에서 보존된 Tbp1의 영역을 밝혀 주었다.

제 15도를 참조하면, H. 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan, DL63, 비전형적 H. 인플렌쟈 PAK 12085, SB12, SB29, SB30과 SB32, 수막염균 계통 B16B6와 M982, 임균FA19와 액티노바실루스(헤모필루스) pleuropneumoniae (Gerlach et al., 1992) 205와 37로부터의 Tbp2의 아미노산 서열 비교를 보여주고 있다. 이 분석은 이런 모든 박테리아중에서 보존된 Tbp2의 영역을 밝혀 주었다.

단백질의 부차적인 구조 분석은 Chou와 Fasman의 알고리즘(1978)를 이용하여 수행되었고 친수성/친수성 구상은 Hopp 알고리즘(1986)을 이용하여 수행되었다. 연산값은 헤프타펩티드 윈도우(heptapeptide windows)의 평균치에서 나온 것이며, 각 단편의 중심점에 구분되었다. 제 16A도는 H. 인플렌쟈 타입 b Eagan으로부터 Tbp1의 예견된 부차적인 구조를 예시하고 제 16B도는 H. 인플렌쟈 타입 b Eagan으로부터 Tbp2의 예견된 부차적인 구조를 예시한다. 제 16A와 16B에 묘사된 예견된 부차적인 구조들은 위에 설명된 절차들을 이용하여 도달되었다. 그러나, 발명가들은 아직 부차적인 구조가 이 도면들에 의해 정확히 묘사되었다고 입증하지 못하고 있다.

몇 개의 다른 박테리아의 Tbp1과 Tbp2 단백질의 보존된 에피토피들은 제 14도와 15도에서 차례로 보여진 서열 정렬에 의해 확인되었다. 그렇게 보존된 에피토피들은 다음을 포함한다:

게다가, 예견된 부차적인 구조와 결합하여, 네개의 보존되어 노출된 에피토피들은 Tbp1에 확인되었고 두개는 Tbp2로 확인되었다. 그것들은 다음과 같다:

앞서 말한 보존된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 폴리펩티드나 펩티드들은 특징적 실시예에서 감지수단으로서 그리고 트랜스페린 수용체 단백질을 생산하는 박테리아에 의해 야기되는 질병으로부터 보호하고 검출하기 위한 면역원으로서 특히 유용하다. 면역을 위해서는 특별히 지적된 아미노산 서열이 면역시스템에 단백질이나 펩티드천서 나타날 수 있고 또는 살모넬라, BCG, 아데노바이러스, 폭스 바이러스, 백시니아나 폴리오바이러스와 같은 살아있는 전달 수단들이 사용되어질 수도 있다.

실시예 7

본 실시예는 E. coli로부터 Eagan Tbp1을 발현하는 플라스미드 JB-1468-29의 구조를 예시하고 있다.

플라스미드 S-4368-3-3(제 1B와 2도)과 JB-911-3-2 (제 17도)는 Eagan tbp1 유전자의 일부 5'-와 3'- 각각을 포함한다. 제 17도는 플라스미드 JB-1468-29의 구성 구조를 예시하고 있다. JB-1468-29의 구조에서 사용된 올리고핵산염 서열은 제 20도에서 보여지고 있다(서열번호S : 86과 87). 플라스미드 JB-1468-29는 계통 JB-1476-2-1을 생성하기 위해 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 E. coli 계통 BL21/DE3으로 삽입되었다.

JB-1476-2-1은 YT 매개물에서 성장되었고 IPTG를 따르는 표준 프로토콜로 유도되었다. 면역 유전과 다른 학문을 위한 Tbp1의 제조에는, 계통 JB-1476-2-1이 3%의 글루코즈를 포함하는 NZCYM 매체에서 하룻밤동안 성장되어진다. 1:40의 접종물(inoculum)이 글루코즈 없이 NZCYH 매체를 새롭게 하도록 첨가되었고, 배양액은 A₅₇₈=0.3으로 키워진다. 락토즈가 1%로 첨가되었고 배양액은 4시간동안 유도되었다. JB-1476-2-1 전체 세포 용해질의 SDS-PAGE 분석은 제 22도에서 보여진다. 1 레인, t_o일 때 JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1); 2 레인, t-4h 유도일 때 JB-1476-2-1; 3 레인, 200 kDa, 116 kDa, 97.4 kDa, 66 kDa, 45 kDa 그리고 31 kDa의 분자 중량 기록기; 4 레인, t_o일 때 JB-1437-4-1(T7/Eagan Tbp2); 5 레인, t=4h 유도일 때 JB-1437-4-1; 6 레인, t_o일 때 JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2), 7 레인, t-4h 유도일 때 JB-1607-1-1.

실시예 8

본 실시예는 E. coli로부터 Eagan Tbp2를 발현하는 플라스미드 JB-1424-2-8의 구조를 예시하고 있다.

제 18도와 관련하여, H. 인플렌쟈 타입 b Eagan으로부터 전체 tbp2 유전자를 포함하는 플라스미드 S-4368-3-3을 보여주고 있다. 제 18도는 플라스미드 JB-1424-2-8을 예시하고 제 19도는 사용된 올리고핵산염을 보여준다. 플라스미드 JB-1424-2-8은 계통 JB-1437-4-1을 생성하기 위해 일렉트로포레이션에 의해 E. coli 계통 BL21/DE3으로 삽입되었다. IPTG나 락토즈로 유도된 즉시 Tbp2는 제 22도에 보여진 것처럼 E. coli JB-1437-4-1에 의해 발현되어진다. 1 레인, t_o일 때 JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1); 2 레인, t=4h 유도일 때 JB-1476-2-1; 3 레인, 200 kDa, 116 kDa, 97.4 kDa, 66 kDa, 45 kDa 그리고 31 kDa의 분자 중량 기록기; 4 레인, t_o일 때 JB-1437-4-1(T7/Eagan Tbp2); 5 레인, t=4h 유도일 때 JB-1437-4-1; 6 레인, t_o일 때 JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2); 7 레인, t-4h 유도일 때 JB-1607-1-1.

실시예 9

본 실시예는 지방 단백질 리더 서열을 Tbp2 서열전에 코딩하는 플라스미드 구조를 예시하고 있다.

E. coli lpp (서열번호S : 88과 89), rlpB (서열번호S ; 90과 91)로부터 유래된 지방단백질 리더 서열와 함께 플라스미드이 구조에 사용된 올리고핵산염, 그리고 pal (서열번호S : 92 와 93) 전술의 Tbp2는 제 20도에 보여주고 있다. 구성된 플라스미드와 생성된 해당 계통들은 아래 표 1에 예시되었다.

실시예 10

본 실시예는 E. coli로부터 SB12 Tbp2를 발현하는 플라스미드 JB-1600-1의 구조를 예시하고 있다.

플라스미드 DS-1047-1-2 (제 21도)는 PCR 증식 SB12 tbp2 유전자를 포함한다. tbp2 유전자는 Nde I로서 EcoR I 제한 단편로 절단되었고 플라스미드 JB-1600-1을 생성키 위해 pT7-7 발현 벡터로 삽입되었다. BL21/DE3 세포로의 일렉트로페레이션은 SB12 Tbp2를 발현하는 E. coli 계통 JB-1607-1-1을 산출하였다. IPTG나 락토즈로 유도된 즉시 SB12 Tbp2는 제 22도에 보여진 것처럼 발현되어졌다. 1 레인, t_o일 때 JB-1476-2-1(T7/Eagan Tbp1); 2 레인, t=4h 유도일 때 JB-1476-2-1; 3 레인, 200 kDa, 116 kDa, 97.4 kDa, 66 kDa, 45 kDa 그리고 31 kDa의 분자 중량 기록기; 4 레인, t_o일 때 JB-1437-4-1(T7/Eagan Tbp2); 5 레인, t=4h 유도일 때 JB-1437-4-1; 6 레인, t_o일 때 JB-1607-1-1(T7/SB12 Tbp2); 7 레인, t-4h 유도일 때 JB-1607-1-1.

실시예 11

본 실시 예는 Tbp1과 Tbp2의 추출과 정제를 예시한다.

Tbp1과 Tbp2의 정제에 배합은 제 23도에 보여준다. 두 재조합 단백질은 E. coli에서 봉입체로 발현되었고 정제 배합은 동일하다. 500ml 배양액의 세포들은 Tbp1은 실시예 7에서 Tpb2는 실시예 8에서 설명되어 조제된 것처럼, 50ml의 50mM 3-HCl, pH 8.0에서 다시 부양되었고, 초음파 분해처리(3 x 10 min, 70% duty circle)에 의해 분쇄되었다. 추출물은 20,000 x g에서 30분간 원심 분리되었고 가용성 E. coli 단백질의 95%를 포함하는 합성 상층액은 폐기되었다.

나머지 작은 덩어리(제 23도 PPT₁)는 50ml의 50mM 3, 0.5%의 삼중자 X-100과 10mM EDTA를 포함하는 pH 8.0에서 추출되었다. 20,000 x g에서 30분간 원심침전된 후, 잔여의 가용성 단백질과 다수의 막 단백질을 포함하는 상층액은 폐기되었다. 위의 추출후에 얻어진 합성의 덩어리(제 23도, PPT₂)는 봉입체를 포함하였다. Tbp1과 Tbp2 단백질은 0.1%의 SDS 5 mM EDTA를 포함하며 50 mM 3, pH 8.0에서 가용화되었다. 원심 침전후, 합성 상층액은 0.1%의 SDS와 5mM DTT를 포함하며, 50 mM 3, pH 8.0에서 평형유지된 수퍼덱스 200 겔 여과 작용 칼럼에서 정제되었다. 분율은 SDS PAGE에 의해 분석되었고 정제된 Tbp1과 Tbp2를 포함하는 것들은 50mM 3 pH 8.0에 대하여 4℃에서 하룻밤동안 투석된 후, 20,000 x g에서 30분간 원심 분리되었다. 이런 조건들하에서 단백질은 가용성으로 남아 있었고 정제된 Tbp1과 Tbp2는 -20℃에 저장되었다.

정제 처리 과정의 SDS-PAGE 분석은 제 24도에서 보여진다. 1 레인들, 착색전의 분자 단백질 기록기들(106, 80, 49.5, 32.5, 27.5, 18,5 kDa); 2 레인들, E. coli 전체 세포 용해질; 3 레인들, 가용화된 봉입체들; 4 레인들, 정제된 Tbp1이나 Tbp2.

실시예 12

본 실시예는 쥐의 재조합 Tbp1과 Tbp2의 면역 유전학을 예시하고 있다.

다섯 개의 Balb/c 쥐 집단은 정제된 rTbp1과 rTbp2 (1㎍ to 10㎍)로 1, 29와 43째날에 피하 지방에 주사하였고, 제 11도에 설명되었듯이 A1PO₄(1회 투약마다 1.5 mg)의 면전에서 조제되었다. 혈액 견본은 EIA에 의한 항-rTbp1과 항-rTbp2 항체 적정 농도의 분석을 위해 14, 28, 42째 되는 날에 체취되었다. 면역 유전학의 결과는 제 25도에 예시되었다.

실시예 13

본 실시예는 쥐의 혈청에서 항-rTbp1과 항-rTbp2의 측정를 위한 EIA 성장 발생을 예시하고 있다.

항-rTbp1과 항-rTbp2 항체 적정 농도는 Panezutti et al.(1993)에 의해 설명되었듯이 필수적으로 측되었다. 극소 역가의 웰(well)들은 0.5 ㎍의 rTbp1이나 rTbp2로 입혀졌으며 제 11도에 설명되었듯이 16시간 동안 실온에서 조제되었고, PBS내의 0.1%의 (w/v) BSA로 차단되었다. 혈청은 연속적으로 희석되었고, 웰들에 첨가되었고, 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 양고추냉이 페록시다제에 접합된 염소 항-쥐 IgG (Fc 종) 항체의 친화력-정제된 F(ab') 단편들은 제 2항체로서 사용되었다. 반응들은 테트라메틸벤지딘 (TMB/H₂O₂)를 이용하여 발생되었고 흡광도는 Flow Multiskan MCC 마이크로플레이트 리더(microplate reader)에서 450nm (540nm을 참고 파장으로 이용하여)에 측정되었다. 항혈청의 반응 역가는 면역전 혈청 견본이 얻어진 것 이상으로 두배의 흡광도 증가를 일관되게 나타내는 희석의 역수로 한정되었다.

실시예 14

본 실시예는 H. 인플렌쟈의 다양한 계통과 함께, 재조합 Eagan Tbp1 과의 면역에 의해 생산되는 항-Tbp1 항혈청의 교차 반응성을 예시하고 있다.

NAD와 heme(Harkness et al., 1992) ± EDDA가 보충된 BHI 매체에서 성장한 H. 인플렌쟈 계통의 전체 세포 용해질들은 SDS PAGE 겔에 의해 분리되었고, 니트로셀룰로스 막으로 전이되었고, 재조합 Eagan Tbp1을 정제하도록 재배된 기니아 돼지 항-Tbp1 항혈청으로 검사되었다(제 26도). 1 레인, BL21/DE3; 2 레인, SB12--EDDA; 3 레인, SB12 +EDDA; 4 레인, SB29 -EDDA; 5 레인, SB29 +EDDA; 6 레인, SB33 -EDDA; 7 레인, SB33 +EDDA; 8 레인, Eagan -EDDA; 9 레인, Eagan +EDDA; 10 레인, B.catarrhalis 4223 - EDDA; 11 레인, B. catarrhalis 4223 + EDDA; 12 레인 N. meingitidis 608 - EDDA; 13 레인, N. meningitidis 608 + EDDA; 14레인, 재조합 Eagan Tbp1을 발현하는 유도된 JB-1476-2-1; 15 레인, 분자 중량 기록기. H. 인플렌쟈 계통들 SB12, SB29, SB33과 Eagan에 상응하여 레인 3, 4, 5, 7, 8과 9에서 항-Tbp1 항혈청과 반작용하는 종 ∼ 95 kDa 대(帶)들; B. catarrhalis 계통 4223에 상응하여 10과 11 레인들에서 ∼ 110 kDa 대(帶)들; N. meningitidis 608에 상응하는 12와 13 레인들에서 ∼ 80 kDa 대 (帶)들.

실시예 15

본 실시예는 H. 인플렌쟈의 다양한 계통과 함께, 재조합 Eagan Tbp2과의 면역에 의해 생산되는 항-Tbp2 항혈청의 교차 반응성을 예시하고 있다.

NAD와 heme(Harkness et al., 1992) + EDDA가 보충된 BHI 매체에서 성장한 H. 인플렌쟈 계통들의 전체 세포 용해질들은 SDS PAGE 겔에서 분리되었고, 니트로셀룰로스 막으로 전이되었고, 재조합 Eagan Tbp2을 정제하도록 재배된 기니아 돼지 항-Tbp2 항혈청으로 검사되었다(제 27도). 1 레인, 분자 중량 기록기; 2 레인, 재조합 Eagan Tbp2를 발현하는 유도된 JB-1437-4-1; 3 레인, SB12-EDDA; 4 레인, SB12 +EDDA; 5 레인, SB29 -EDDA; 6 레인, SB29 +EDDA; 7 레인, SB30 -EDDA; 8 레인, SB30 +EDDA; 9 레인, SB32 -EDDA; 10 레인, SB33 -EDDA; 11 레인, SB33 +EDDA; 12 레인, PAK -EDDA; 13 레인, PAK +EDDA; 14 레인, Eagan-EDDA; 15 레인, Eagan + EDDA. 약 60-70의 kDa 종(種) 대(帶)들은 헤모필루스 계통들 SB12, SB29, SB30, PAK과 Eagan에 상응하여 레인3, 6, 7, 8, 13, 14와 15에서의 항-Tbp2 항혈청과 반작용하였다.

실시예 16

본 실시예는 Tbp2와 Tbp1의 보존 영역에 상응하는 합성 펩티드들의 합성을 예시하고 있다.

Tbp1과 Tbp2의 유래된 아미노산 서열은 제 14와 15도에서 차례로 보여진 것처럼 비교되었다. 이 비교는 위에 설명된 트랜스페린 수용체내의 아미노산 서열 보존 영역을 확인하였고, 표 2와 3에 보인 것처럼, 펩티드들은 트랜스페린 수용체 일부를 포함하며 합성되었다. 이런 합성은 기술된 펩티드들을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터들의 합당한 숙주에서 발현에 의해서 혹은 표준 펩티드 합성에 의해 효능을 발할 수 있다.

간단히, 펩티드들은 ABI 430A 펩티드 합성기를 이용하여 합성되었고 생산자가 권고한 조건들을 이용하여 t-Boc 화학을 최대 활용하였으며, 펩티드들은 불화수소산(HF)을 이용하여 합성 수지로부터 분열되었다. 펩티드들은 분당 2ml 의 유량비로 40분 이상 발생된 0.1%의 트리를루오릴 아세틱산(TFA)에서 15-55%의 아세토니트릴 증감을 이용하여 Vydac C4 반-준비 칼럼(1 x 30 cm)위의 역-상 고 수행(reverse-phase high performance) 액체색층분석(RP-HPLC)에 의해 정제되었다. 생화학과 면역학에 이용된 모든 합성 펩티드들은 분석적 HPLC에 의해 판단된 것과 같이 >95%의 순도였다. 아미노산 혼합물 분석은 Waters Pico-Tag 시스템으로 수행되었고 이론적 혼합물들과 잘 조화되었다.

실시예 17

본 실시예는 실험 동물의 합성 펩티드의 면역 유전을 예시하고 있다.

기니아 돼지들은 100 ㎍의 펩티드로 근육 내부적으로 면역되었으며, 제 16도에 설명되어 조제된 것처럼, 0번째날에 Freund의 완전 면역 보강제에 유상으로 만들어졌으며 + 14와 + 28일 째 되는 날에는 Freund의 불완전 보강제에 같은 양의 펩티드가 유상화된 것을 이용하여 추가 항원 자극에 뒤따랐다. 혈청 견본들은 42 + 되는 날에 얻어졌으며 항체 역가는 효소-연계된 면역 흡수제 분석물(ELISA)에 의해 측정되었다. 간단히, 극소 역가 원천(Nunc-Immunoplate, Nunc, Denmark)는 16시간 동안 실온에서 50 μL의 덧입혀지는 완충제(15 mM Na₂CO₃, 35 mM NaHCO₃, pH 9.6)에서 어느 특정 펩티드의 500ng로 덧입혀졌다. 인산염 환충제 함염물(PBS)에서 0.1%(w/v) BSA를 가지고 실온에서 30분동안 차단되었다. 항혈청은 연속적으로 희석되었고, 웰들에 첨가되었고 1시간동안 실온에서 배양되었다. 항혈청의 제거후, 금속판들은 0.1% (w/v) Tween-20과 0.1% (w/v) BSA를 포함하는 PBS로 다섯차례 세척되었다. 양고추냉이 페록시다제와 접합한 염소 항-기니아 돼지 IgG 항체들로부터의 F(ab')는 (Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA) 세척 완충제로 희석되었고(1/8,000), 극소 역가 금속판으로 첨가되었다. 실온에서 1시간동안 배양 후, 금속판들은 세척 완충제로 다섯차례 세척되었다. 금속판은 배양기 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzine)(TMB)를 이용하여 H₂O₂에서 발생되었고 (ADI, Toronto), 반작용은 1N H₂SO₄로 정지되었고 광학 밀도는 Titretek Multiskan II를 이용하여 450 nm에서 측정되었다(Flow Labs., Virginia). 음성이 이런 ELISAs를 제어하므로 32 아미노산 잔기의 두 개의 부적절한 펩티들이 포함되었다. 역가 검정이 3배로 수행되었고, 각 항혈청의 작용 역가는 희석이 지속적으로 음성 제어로부터 얻어진 것들에 대하여 흡광도 값의 2배 증가를 보여주는 것에 따라 한정되었다. 기니아 돼지에 배양된 항혈청은 면역에 사용된 펩티드의 일종이었다. 다음의 면역이 얻어진 혈청 역가들은 표 4에 보여진다.

본 발명의 펩티드들은 표 2와 3에서 보여준 것들중의 어느 하나의 복사들이나 그것의 다수의 유사체 복사을 포함하는 핀티드들을 이룬다. 나아가 펩티드 하나는 표 2와 3에서 보여진 것들로부터 선별된 다수의 다른 펩티드들 또는 그것의 유사체를 이루고 적당한 운반 분자들을 포함한다. 보존 영역으로부터의 펩티드들은 항체를 발생시키도록 선호되었는데 그 이유는 면역- 또는 다른 형태의 접합 역가 검정이 헤모필루스의 몇가지 종을 검출토록 사용되어질 수 있기 때문이다. 표 2와 3은 그러므로 진단, 면역과 의학 치료에 유용하게 될 다른 펩티드를 확인하도록 트랜스페린 수용체의 몇몇 다른 보존 영역을 제시한다.

실시예 18

본 실시예는 트랜스페린 수용체의 보존 부분예 해당하는 펩티드에 대하여 배양된 항혈청의 능력을 브란하멜라 카타르알리스 (Branhamella catarrhalis)의 트랜스페린 수용체를 인지하기 위해 설명하고 있다.

기니아 돼지들은 트랜스페린 수용체의 보존된 일부에 상응하여 펩티드로 면역되었으며, 얻어진 항혈청은 실시예 17에서 설명되었다. 브란하멜라 카타르알리스의 전체 세포 추출은 이 세균으롭터 트랜스페린 수용체를 종적으로 인지하는 펩티드-종 항혈청으로 면역 파괴되었다. Tbp2 N-터미날 펩티드와 펩티드 TBP2-25로 면역된 기니아 돼지로부터의 항-펩티드 항혈청은 E. coli의 플라스미드 클론 pBHIT2에 의해 발현된 브란하멜라 카타프알리스와 재조합 Tbp2로부터 Tbp2 단백질을 종적으로 인지하였다. 클론 pBHIT2는 아미노산 80에서 시작되는 Tbp2의 절단된 변형을 발현한다(i.e.NKKFYSG 서열번호:105). 그러므로, pBHIT2로부터의 Tbp2 단백질은 두번째 에피토프 LEGGFYGP에 대하여 배양된 항체에 의해서만 인지된다(TBP2-25). 이 분석은 트랜스페린 수용체 사이의 보존된 서열에 해당하는 펩티드들이 트랜스페린 수용체를 생산하는, 전부는 아니더라도 대부분의 박테리아를 검출하고 트랜스페린 수용체에 대하여 면역 반응을 일으키기 위해 백신을 포함하여 면역 유전 혼합물의 요소로서 그리고 그런 박테리아에 의해 야기되는 질병에 대항하는 데 유용하다는 것을 보여준다.

이 토끼들의 혈청은 서열 LEGGFYCP(서열번호:74)와 결합하는 펩티드나 H. 인플렌쟈 계통 DL63, Tbp2에 대하여 ELISA에 의해 실험되었다. ELISA 금속판은 펩티드나 단백질로 덧입혀졌고 5%의 틸지 우유로 차단되었다. 인산염이 완화된 함염물안의 두겹으로 희석된 혈청, 0.05%의 tween-20, 그리도 1%의 건조된 우유는 금속판위에서 2시간동안 37℃에서 배양되었고, 인산염이 완화된 함염물에서 0.05%의 tween-20을 가지고 다섯차례 세척되었다. 세척된 금속판은 양고추냉이 페록시다제 (HRPO)-접합 당나귀 항-토끼 IgG를 가지고 30분 동안 시래 온도에서 검출되었고, 인산염이 완화된 함염물에서 0.05%의 tween-20을 가지고 다섯 차례 세척되었다. HPRO-배양기는 30분 동안 실내 온도의 어둠속에서 모든 웅덩이에 첨가되었고, 색 발생은 50 ul 1M 설파(sulphuric) 산이 첨가되어 중단되었다. 색은 흡광도를 450nm에서 측정하므로서 평가되었다.

실시예 19

본 실시예는 트랜스페린 수용체를 생산치 않는 H. 인플렌쟈 계통의 발생을 예시한다.

pBHIT1으로부터 삽입의 2.55 Eco RI 단편은 pUC4K의 Eco RI 부위로 부(sub)클론화되어, 이 벡터로부터 Tn903 카나마이신 내성 (kan) 카세트의 제거로 귀결되었다(pUHIT1;제 28도). 이 부클론화 단계는 제 28도의 pUHIT1KFH와 pUHIT1KFP를 생산하기 위한 이 구조에서 pUHIT1dml Hind III이나 Pst I 부위 둘 다 유일한 부위이기 때문에 이들로의 칸 카세트 (kan cassette)를 포함하는 HincII나 PstI pUC4K 단편의 연속 삽입을 용이하게 하였다. 중단된 유전자 서열들을 제거하기위한 Eco RI와의 다음의 침지에서, 구성은 미리 설명된 것처럼 M-IV 매체를 이용하여 변형에 의하여 H. 인플렌쟈 와일드 타입 게놈으로 유도되었다(Barcak et al., 1991). 변형물들은 20㎍/ml 카나마이신을 포함하는 BHINH 세균 배양기에서 선별되었다.

실시예 20

본 실시예는 트랜스페린 수용체의 에피토피를 발현하는 폴리바이러스 구조를 예시한다.

플리바이러스형 1의 염기 1175에서 2956까지의 cDNA 클론, 마호니(Mahoney) 계통(PV1-M) 게놈은 제한 효소 Sau I과 Hind III으로 절단되었다. 이러한 효소들은 제 29도에서 보여지듯이 PV1-M 아미노산 1094에서 1102까지를 코딩하는 염기 2754에서 2786까지를 포함하는 단편을 삭제한다. 이 응용에서, 우리는 폴리오바이러스 아미노산에 4자리 부호를 사용한다; 예를 들어, 1095는 캡시드 단백질 VP1의 아미노산 95이다. 폴리오바이러스와 트랜스페린 수용체 아미노산 서열 두 가지를 모두 코딩하는 새 혼합물 cDNA 클론은 삭제된 단편을 H. 인플렌쟈 Tbp2로부터 아미노산을 코딩하느 합성 올리고뉴클레오티드로 대체하여서 구성되었다. 새 혼합물 cDNA 클론은 폴리오바이러스 염기 2471부터 2956까지의 트랜스페린 수용체 DNA 서열을 포함하여, 혼합 단편을 삭제하는 제한 효소 Nhe I과 SnaB 1로 절단되었다. pT7XLD나 pT7CMCB과 같은 PV1-M의 전체 게놈의 cDNA 클론은 폴리오바이러스 염기 2471에서 2956까지의 단편을 삭제하도록 Nhe I과 SnaBIfh 절단되었다. 이것은 제 29도에 보여진 것처럼, 트랜스페린 수용체 아미노산을 포함하여 혼합 BC 루프를 코딩하는 염기들에 의해 대체된 2754부터 2786까지의 염기들과 함께 PV1-M의 게놈의 혼합 cDNA 클론을 생산키 위한 트랜스페린 수용체 DNA 서열을 포함하여 혼합 단편으로 대체되었다. 플라스미드 pT7XLD와 PT7CMCB과 같은 pT7XLD에서 파생된 클론들은 PV1-M cDNA의 5' 끝에서 효소 T7 RNA 폴리메라제의 프로모터 서열을 포함한다. PV1-M cDNA의 RNA 복사는, 트랜스페린 수용체 아미노산을 코딩하는 어느 염기들을 포함하여, van der Werf et al에 의해 설명되었듯이 T7 RNA 폴리메라제를 사용하여 조제되었다. 이런 RNA 복사들과의 Vero 세포의 트랜스펙션은 4개의 변형 혼합 바이러스를 생산하였고, PV1TBP2A, PV1TBP2B, PV1TBP2C와 PV1TBP2DF로 명명하여졌다. pT7CMCB의 복사와의 트랜스펙션은 PV1XLD로 명명된 트랜스픽션-파생된 외일드 타입 폴리바이러스를 산출하였다(제 29도).

PV1TBP2A, PV1TBP2B, PV1TBP2C와 PV1TBP2D의 항원 특질들은 표 5에서 보여준다. 서열 LEGGFYGP (서열번호: 74)와 결합하는 펩티드에 대하여 재배된 기니아-피그 항혈청에 의해 모두 중화되었고, 항원적으로 인지할수 있는 형태로 이 서열에 발현된 바이러스를 나타낸다. 항혈청을 생산하기 위해 여성 기니아 돼지들은 알루미늄 인산염(3mg/ml)에서 공식화된 200ug 펩티드를 포함하는 500ul 용량으로 면역되었다. 동물들은 1, 14, 28와 42째날에 면역되었고 0, 28, 42와 56일째 출혈되었다. 혈청은 56일째 출혈로부터 얻어졌다. PV1TBP2A와 PV1TBP2B는 H. 인플렌쟈 계통 DL63, Tbp2에 대하여 산출된 토끼 항혈청에 의해 중화되었고, 적어도 이 두가지 바이러스가 단백질에 대해 배양된 항체에 인지가능한 형태로 서열을 발현하였음을 나타낸다. 모든 바이러스들은 항-PV1 혈청에 의해 중화되었고, 소아마비 중화 항원 부위 I의 변화들이 바이러스의 다른 항원 부위에 중요하게 작용하지 않았음을 나타낸다.

실시예 21

본 실시예는 Tbp2에 대하여 고 역가 항혈청을 유도하기 위해 폴리오 바이러스 혼합물의 사용을 예시하고 있다.

토끼들은 CsCl-정제된 PV1TBP2A가 접종되었다(rabbits #40, 41, 42). 사용된 바이러스가 살아있을지라도, 폴리오바이러스는 토끼들속에서 복제되지 않으며 관찰된 어떤 반응도 비활성 항원에 효과적으로 반응하지 못함을 주목하라. 첫째날, 토끼들은 등의 피하에 Freund의 완전 보조제에 lug의 바이러스와 함께 접종되었고, 14일째에 토끼들은 등의 피하에 Freund의 불완전 보조제에 1 ug의 바이러스와 함께 접종되어 추가 자극되었다. 0째와 27일째에 토끼들은 출혈되었다. 한 접종당 바이러스 투약은 2.5 x 10₈ pfu 였고, 이것은 대략 3.0 x 10₁₁ 비리온이 되는 A₂₆₀ 값으로부터 확정되었다. 각 비리온이 에피토프의 60 복제를 발현하므로 이것은 바이러스의 0.5 pmol이나 LEGGFYG (SEQ, ID NO: 74) 에피토프의 30 pmol과 동등하다.

명세서의 요약

본 명세서를 요약하면, 본 발명은 트랜스페린 수용체 유전자, 이런 트랜스페린 수용체 유전자의 서열들과 그것에서 파생된 아미노산 서열을 포함하는 정제되고 분리된 DNA 분자를 제공한다. 발명은 또한 트랜스페린 수용체의 일부에 상응하는 펩티드들을 제공한다. 유전자, DNA 서열들, 재조합 단백질과 펩티드들은 진단, 면역과 진단적이고 면역적인 반응물의 발생에 유용하다. 발현된 재조합 Tbp1과/또는 Tbp2, 그것의 일부에 기초한 백신들, 혹은 제공된 서열에서 파생된 펩티드들은 트랜스페린 수용체를 생산하는 박테리아성 병원균에 의해 야기되는 질병 예방을 위해 조제되어질 수 있다. 본 발명의 범주 내에서의 변형이 가능하다.

표 1

표 2

예상된 항원 Tbp1 펩티드들

표 2 (계속)

1. 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan의 Tbp1 서열로부터의 잔기 수(제 8도에 도시됨).

2. 캐리어 단백질, 예를 들어 KLH과의 결합이 용이하도록 시스테인이 첨가됨.

표 3

예상된 보존 항원 Tbp2 펩티드들

표 3 (계속)

1. 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b Eagan 계통의 Tbp2 서열로부터의 잔기 수(제 9도에 도시됨)

표 4

Tbp1과 Tbp2 펩티드들에 대한 기니아 돼지 항체 반응들

표 5

폴리오/Tbp2 하이브리드 바이러스에 대한 항-Tbp2와 항-펩티드 혈청의 중화작용

^a Rb @PV1은 PV1XLD에 대하여 배양된 토끼 혈청의 풀혈(pool)이다. 토끼 516은 1일, 14일 28일째에

재조합 H. 인플렌쟈 DL63 트랜스페린 결합 단백질 2의 3번의 연속 3㎍의 투여로 면역되었다. 혈청은 0(D0)과 42(D42)일째에 수집되었다. 기니아-돼지들은 1, 14, 28과 42일째에 200㎍의 펩티드을 4번 연속 투여하여 면역되었다. 혈청은 0(DO)과 56(D56)일째에 수집되었다. 기니아-돼지 561과 562는 서열 LEGGFYGP (서열번호: 74)를 포함하는 펩티드를 수취하였다. 기니아-돼지 558, 559와 556은 관계가 없는 서열와 함께 제어 펩티드를 수취하였다.

^b 역가는 100 TCID₅₀의 바이러스에 대한 바이러스 중화 검정에서 50%의 종점을 주는 혈청의 희석 역수이다.

표 6

PV1TBP2A나 PV1TBP2B로 면역된 토끼의 펩티드-특이 IgG 역가

^a 역가들은 적어도 두 번 A₄₅₀ 배경값을 주는 혈청의 최대 희석 역수이다. 배경값은 토끼 혈청이 없이 검정된 웰(well)의 평균값 A₄₅₀이었다.

^b 토끼 10과 11의 역가는 PV1 Mahoney와 3번 면역후에 42일째에 채취된 혈청과 관련된다. 28일째에 주입한 부가적 효능 프로모터를 제외하고 토끼 10과 11은 토끼 40과 45와 같이 면역되었다.

참조 문헌 리스트

발명의 분야

본 발명은 트랜스페린 수용체를 코딩하는 유전자의 분자 클로닝에 관한 것이고, 더욱 특별하게는 헤모필루스 인플렌쟈로부터 트랜스페린 수용체 유전자들의 클로닝에 관한 것이다.

관련된 출원에 대한 참조

본 출원은, 1993. 11, 8일자로 출원된 미합중국특허 제 08/148,968호의 일부계속출원인, 1993, 12. 29일자로 출원된 미합중국특허 제 08/175,116호의 일부계속출원이다.

발명의 배경

캡술형 헤모필루스 인플렌쟈타입 b 계통은 어린이들에게 박테리아성 뇌막염과 기타 침투적인 감염의 주요한 원인이다. 그러나, 비-캡슐형 또는 비타입(non-typable) 헤모필루스 인플렌쟈(NTHi)는 중이염, 후두염, 폐렴, 및 기관지염을 포함하는 광범위한 영역에서 사람의 질병에 원인이 된다. 디프테리아 톡소이드, (Berkowitz et al., 1987. 이 출원을 통해, 다양한 참조문헌들이 본 발명이 속하는 기술상태를 충분히 설명하기 위해 삽입어구에 참조된다. 각 인용문헌에 대한 충분한 목록상의 정보는 청구범위 바로 전의 명세서의 끝에 나열되어 있다. 이 참조문헌들의 개시는 이에 본 발명에 참조로서 결합된다.), 파상풍 톡소이드(Classon et al., 1989과 미합중국 특허 제 4,496,538호), 또는 수막염균 외부 막 단백질에 접합된 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 캡슐형 폴리사카라이드에 기초한 백신들은 헤모필루스 인플렌쟈타입 b-유도된 수막염의 발생을 감소시키는데 효과적이었으나, NTHi-유도된 질병은(Bluestone, 1982)은 예외였다.

중이염은 어린이들에게 가장 일반적인 질병으로 대략 전체 어린이들의 60-70%가 2세이전에 적어도 한 번 내지 세번의 중이염을 앓는다. 만성적인 중이염은 어런이들에게 청각적인, 언어적인 그리고 인지적인 손상을 가져온다.

헤모필루스 인플렌쟈의 감염은 급성중이염의 약30%와 만성 중이염의 60%정도의 원인이 된다. 단지 미합중국에서만, 중이염의 치료로 항생제들과 편도적출, 인두편도적출 및 고막개방 튜브의 삽입과 같은 외과적인 조치들을 위하여, 연간 10 내지 20억 달러의 비용이 든다. 더욱이, 중이염의 많은 원인이 되는 유기체들은 항체 치료에 저항력이 생긴다. 그러므로 중이염에 대해 더 효과적인 예방백신은 바람직하다. 헤모필루스 인플렌쟈의 비타입 계통은 또한, 나이가 든 개인들과 특별히 호흡기 감염이 잘되는 개인들에서 폐렴의 원인이 되는 중요한 병원균들이다. 따라서 헤모필루스 인플렌쟈의 많은 항원타입들애 대하여 예방성을 부여하는 면역원적 처방내의 성분들로서 유용한, 헤모필루스 인플렌쟈로부터의 항원들이 필요하다.

철은 많은 박테리아의 성장을 위해 필수적인 자양분이다. 헤모필루스 인플렌쟈, 브란하멜라 카타르알린스(Branhamella Catarrhalis), 수막염균, 임균과 같은 사람의 여러 병원균들은 철 근원으로서 사람의 트랜스페린을 활용하였다 (Schryvers, 1988; Schryvers와 Lee, 1989; Mickelsen과 Sparling, 1981). 박테리아성 트랜스페린 수용체 (TfR)은 두 개의 사슬, Tbp₁과 Tbp₂.을 구성한다. 헤모필루스 인플렌쟈의 계통들에서, Tbp₁의 분자량은 대략 100,00인 반면에 Tbp₂의 분자량은 60,000 내지 90,000에 이르면서 가변적이고, 계통(Schryvers과 Gray-Owen, 1992; Holland et al., 1992)에 의존한다. 헤모필루스 인플렌쟈 트랜스페린 수용체의 발현은 철-및/또는 헤민(hemin)-조절된 (Morton et al., 1993)것으로 간주되고 추정된 퍼바인딩(furbinding)부위는 tbp2 (Braun Hantke, 1991)의 업스트림에서 확인되었다. 이 서열은 수막염균 TfR (Legrain et al., 1993)를 포함하는 철이 음성적으로 조절한 유전자의 프로모터 영역에서 발견된다. 프로모터는 tbp2과 tbp1 유전자가 뒤따르고, 이 배열은 다른 박테리아성 Tfr 오페론에서 발견되었다. 철 근원으로의 트랜스페린 수용체의 접근을 차단하는 항체는 박테리아성 성장을 방해한다. 부가적으로, 옵손나이징(opsonizing)하거나 살균성의 TfR에 대한 항체는 또한 양자택일적인 메카니즘을 제공한다. 그러므로, 트랜스페린 수용체, 그 단편, 그 구성 사슬들 또는 그로부터 유도된 펩티드들은 헤모필루스 인플렌쟈 질병으로부터 보호하는 백신 후보들이다.

프로인즈 보조제 (Freund's adjuvant)의 수막염균 TfR 단백질로 면역된 쥐는 동족의 도전으로부터 보호되고, 항-TfR 항혈청은 살균적이고 수동적인 전이 시험에서 보호적이다(Danve et al., 1993). 재조합 A. 늑막폐렴 Tbp2으로 면역화된 돼지는 동족 도전에 대해 보호적이나, 이종 도전(Rossi-Campos et al., 1992)에 대해서는 아니다. 이러한 데이터는 질병보호에 있어서 TfR에 기초한 백신들의 효율성을 나타낸다. 트랜스페린 수용체와 진단, 면역화와 진단상 면역성의 시약의 생성을 위해 그러한 서열을 포함하는 벡터들과 트랜스페린 수용체의 일부에 해당하는 펩티드들을 코딩하는 DNA분자 서열을 제공하는 것이 바람직하다.

폴리오바이러스는 엔테로바이러스이며, 피코르나바이러스과의 속이다. 세 개의 뚜렷한 바이러스 전형(serotype)이 있고, 각 전형내에 다수의 계통이 있다. 독성 계통은 마비성 소아마비의 원인제이다. 마비성 질병을 초래하는 것을 잠재적으로 감소시킨 약화된 계통과 불활성화된 바이러스 계통은 백신으로 사용된다. 바이러스로의 감염은 오래 지속되고, 보호적인, 점막성의 면역성을 유도한다. 불활성화된 폴리오바이러스 백신들로 접종은 또한 점막성의 면역반응을 유도한다.

폴리오바이러스의 구조는 공지되며, 계통과 전형중에서 매우 보존적이다. 다른 여러 피코르나바이러스들(피코르나바이러스과의 유전자에 속하는 바이러스들)의 구조가 결정되고, 폴리오바이러스의 구조에 근접하게 관련된 것을 나타내었다. 폴리오바이러스의 캡시드상에 이질 에피토프 (Murdin et al, 1992)를 발현하는 것이 가능하고,이 공정은 피코르나바이러스로 확대될 수 있다. 발현된 에피토프는 일반적으로 짧고, 매우 한정적이고, 접촉성의 에피토프들이고, 대부분은 폴리오바이러스 중화 항원 부위I (NAgI) 또는 다른 피코르나바이러스상의 동등한 부위내에 발현되었다. 이 부위는 폴리오바이러스 캡시드 단백질 VP1의 루프연결 베타 요소 B와 C (BC루프)를 포함한다. VP1의 BC루프는 적어도 25개의 이종 아미노산 서열(Murdin et al, 1991)로 대체 및 연장될 수 있는 9개의 아미노산이 표면-노출된 루프이다. 높은 티터(titre)로 성장하고 면역성인 트랜스페린 수용체 에피토프들을 발현하는 잡종 또는 키메릭 폴리오바이러스는 백신으로서 유용하고 면역성의 시약을 발생하는 수단으로서 유용하다.

발명의 요약

본 발명은 헤모필루스 계통의 트랜스페린 수용체 또는 단편 또는 트랜스페린 수용체 단백질의 유사체를 코딩하는 정제되고 분리된 핵산 분자들의 제공에 관한 것이다. 여기서 제공된 핵산 분자들은 헤모필루스 계통의 특이한 검출과 헤모필루스에 의한 감염 진단을 위해 유용하다. DNA와 같이 여기서 제공된 정제되고 분리된 핵산 분자들은 또한 경제적인 방법으로 정제되고 분리된 트랜스페린 수용체 서브유니트, 단편들 또는 그 유사체들을 제공하기 위한 재조합 DNA 수단에 의해 TfR 유전자를 발현하는 데 유용하다. 동일한 것을 코딩하는 핵산 분자들과 핵산 분자들을 포함하는 벡터들은 물론이고, 트랜스페린 수용체, 그 하위단위 또는 단편들 또는 그 유사체들은 헤모필루스에 의해 제기된 질병에 대한 면역원적 조성물에서 유용하고, 면역원성 시약의 생성을 위한 수단으로서 유용하다. 본 발명의 측면들에 의해 생성된 트랜스페린 수용체 단백질에 대해 제기된 모노클로날 항체들 또는 모노-특이성 항혈청(항체들)은 헤모필루스에 의한 감염 진단-헤모필루스의 특이성 검출 (예를 들면, 생체 외에서 또는 생체 내에서의 분석)과 헤모필루스에 의해 초래된 질병들의 치료에 유용하다.

트랜스페린 수용체 또는 그 유사체들의 일부에 해당하는 펩티드들은 헤모필루스에 의해 초래된 질병에 대한 유용한 면역원적 조성물이고, 헤모필루스에 의한 감염의 진단이며, 면역성 시약의 생성을 위한 수단이다. 본 발명에 의해 생성된 이러한 펩티드들에 대해 제기된 모노크로날 항체들 또는 항혈청들은 헤모필루스에 의한 감염 진단-헤모필루스의 특이성 검출 (예를 들면, 생체 외에서 또는 생체 내에서의 분석)-과 헤모필루스에 의해 초래된 질병들의 치료로서 수동적인 면역화에 유용하다.

본 발명의 한 측면에 의해, 헤모필루스 계통의 트랜스페린 수용체 단백질을 코딩하는 정제되고 분리된 핵산 분자들이 제공되며, 특히 헤모필루스 인플렌쟈의 계통, 특별히 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 DL63, Eagan 또는 MinnA와 같은 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b, 또는 헤모필루스 인플렌쟈 계통 PAK 12085, SB33, SB12, SB29, SB30 및 SB32와 같은 비타입 계통의 헤모필루스 인플렌쟈, 또는 단편 또는 트랜스페린 수용체 단백질의 유사체를 제공한다.

본 발명의 한 실시예에 있어서, 핵산 분자는 헤모필루스 계통의 Tbp1 단백질 또는 헤모필루스 계통의 Tbp2 단백질만을 코딩한다. 본 발명의 또다른 실시예에서, 핵산은 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하는 박테리아중에서 보존된 한 보존된 아미노산 서열을 지닌 헤모필루스의 서열의 트랜스페린 수용체 단백질의 단편을 코딩한다. 그러한 보존된 아미노산 서열은 헤모필루스 인플렌쟈의 다른 계통들의 해당하는 펩티드들 뿐만 아니라 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan에 대해 아래 표 2과 3에서 도시된 펩티드들의 아미노산 서열내에 포함된 아미노산 서열을 지닌다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 다음을 구성하는 그룹(기)로부터 선택된 DNA 서열을 지닌 정제되고 분리된 핵산 분자를 제공한다:

(a) 제 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11도(서열번호 : 1, 2, 3, 4, 105, 108, 110, 112, 114)에 설정된 DNA 서열들중의 어느 하나 또는 상기 서열들중의 어느 한 서열에 대한 상보적인 DNA 서열;

(b) 제 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11도(서열번호 : 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 106, 107, 109, 111, 113, 115)에 설정된 아미노산 서열들중의 하나를 코딩하는 DNA 서열 또는 그에 대한 상보적인 DNA 서열; 및

(c) 엄격한 조건하에서 (a) 또는 (b)에서 정의된 DNA 서열중의 어느 하나와 교배하는 DNA 서열.

(c)에서 바람직하게 정의된 DNA 서열이 (a)와 (b)에서 정의한 DNA 서열들중의 어느 하나와 적어도 약 90% 서열 동일성을 지닌다.

부가적인 측면에서, 본 발명은 여기서 제공된 핵산 분자를 포함하며 숙주의 형질전환(transformation,변형)을 위하여 적응된 벡터를 포함한다. 벡터는 ATCC 기탁번호 75603을 지닌 플라스미드 DS-712-1-3과 ATCC 기탁번호 75607을 지닌 플라스미드 JB-1042-7-6의 특성을 지닌 벡터이다.

플라스미드는 지질화되거나 비-지질화된 형태로 동족성의 또는 이종성의 숙주에서 코딩된 트랜스페린 수용체, 단편들 또는 그 유사체의 발현을 위해 적용된다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 여기서 제공된대로 핵산 분자를 구성하는 숙주의 형질전환을 위해 적용된 발현 벡터 및 트랜스페린 수용체 단백질의 숙주 또는 단편 또는 트랜스페린 수용체 단백질의 유사체에 의해 발현을 위한 핵산 분자에 작용적으로 연결된 발현 수단을 제공한다. 본 발명의 특정한 실시예에서, 핵산 분자는 실제로 모든 트랜스페린 수용체 단백질, 헤모필루스 계통의 Tbp1 단백질만 또는 Tbp2 단백질만을 코딩한다. 발현수단은 트랜스페린 수용체 단백질 또는 단편 또는 트렌스페린 수용체 단백질의 유사체를 숙주로부터 분비하도록 하는 리더 서열을 코딩하는 핵산 부분을 포함한다. 발현수단은 또한 트랜스페린 수용체 단백질의 지질화된 형태 또는 단편 또는 트랜스페린 수용체 단백질의 유사체를 숙주로부터의 발현되도록 지질신호를 코딩하는 핵산 부분을 포함한다. 발현 플라스미드는 플라스미드 JB-1468-29, JB-1600-1 및 JB-1424-2-8의 식별 특성들을 지닌다. 숙주는, 예를 들면, 에세리히아 콜리(Escherichia Coli), 바실루스(Bacillus), 헤모필루스, 진균류, 효모 또는 베큘로바이러스(baculovirus)로부터 선택되고, 셈리키 삼림(Semliki Forest) 바이러스 발현시스템들이 사용된다.

본 발명의 부가적인 측면에서, 여기서 제공된대로 발현 벡터를 포함하는 형질전환 숙주를 제공한다. 그러한 숙주는 JB-1476-2-1, JB-1437-4-1, JB-1607-1-1로부터 선택된다. 본 발명은 더욱 형질전환 숙주에 의해 생산가능한 재조합 트랜스페린 수용체 단백질 또는 단편 또는 트랜스페린 수용체 단백질의 유사체를 포함한다.

아래에서 더 상세히 설명한대로, 서로 분리된 Tbp1과 Tbp2 단백질 수용체들을 생성하였다. 그러므로, 본 발명의 다른 측면들은 헤모필루스 계통의 Tbp2 단백질이 없는 헤모필루스 계통의 정제되고 분리된 Tbp1 단백질과 헤모필루스 계통의 Tbp1 단백질이 없는 헤모필루스 계통의 정제되고 분리된 Tbp2를 제공한다. 헤모필루스 계통은 헤모필루스인 플루엔쟈 타입 b 또는 헤모필루스 인플렌쟈의 비타입 계통이다.

본 발명은 또한 트랜스페린 수용체의 부분에 해당하는 합성 펩티드(synthetic peptides)를 제공한다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에서, 6 이상의 아미노산과 150 미만의 아미노산을 지니며, 박테리아 계통의 트랜스페린 수용체 단백질 또는 트랜스페린 수용체 단백질의 유사체의 부분에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩티드를 제공한다. 박테리아성 계통은 바람직하게 헤모필루스 계통이고, 특히 헤모필루스 인플렌쟈 계통, 특별하게는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 또는 헤모필루스 인플렌쟈의 비타입 계통이다.

여기서 제공된 펩티드들은 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하는 박테리아중에서 보존된 아미노산 서열을 포함하며, 헤모필루스의 계통들을 지닌다. 펩티드들은 아미노산 서열, LEGGFYGP (서열번호 : 74) 또는 LEGGFYG (서열번호 : 85)를 지닌다. 여기서 제공된 펩티드들은 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b의 Eagan 계통과 헤모필루스 인플렌쟈의 다른 계통들을 위한 해당 아미노산 서열들에 대한 아래 표 2 또는 표 3에서의 서열들로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌다.

본 발명의 또 다른 측면에 의해, 여기서 제공된 대로 적어도 하나의 핵산 분자, 적어도 하나의 재조합의 단백질, 적어도 하나의 정제되고 분리된 Tbp1 또는 Tbp2 단백질들, 적어도 하나의 합성 펩티드와 생(live)벡터, 및 이를 위해 약학적으로 받아들일 수 있는 캐리어 또는 이를 위한 벡터로부터 선택된 적어도 하나의 활성 성분을 구성하는 면역원성 조성물을 제공한다. 적어도 하나의 활성성분은 숙주로 투여될 때 면역반응을 일으킨다.

여기서 제공된 면역원적 조성물들은 트랜스페린 수용체들을 생성하는 박테리아성 병원균들에 의해 초래된 질병으로부터 보호하기 위해 생체내 투여를 위한 백신으로 처방(공식화)된다. 그러한 목적을 위해, 조성물들은 미립자, 캡슐 또는 리포좀 제조로서 처방된다. 양자택일적으로, 조성물들은 면역 시스템의 특이적인 세포들과 점막표면으로의 전달을 위한 타겟 분자와 결합하여 제공된다. 면역원적 조성물은 박테리아를 생성하는 트랜스페린 수용체의 다수의 종들에 의해 야기된 질병들로부터의 보호를 위해 다수의 활성성분들을 포함한다. 면역원적 조성물들은 보조제를 더 포함한다.

본 발명이 또 다른 측면에 의해, 헤모필루스 또는 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하는 다른 박테리아에 의해 초래된 감염과 질병으로부터의 보호를 유도하는 방법을 제공하며, 이는 상술대로 효율적인 량의 면역원적 조성물을 사람과 같이 감염되기 쉬운 숙주에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명이 또 다른 측면에 의해, 재조합 단백질, 분리되고 정제된 Tbp1 단백질 또는 Tbp2 단백질, 합성 펩티드 또는 면역원적 조성물에 특이한 항혈청 또는 항체가 제공된다.

다른 측면에서, 상술된 핵산 분자를 지닌 벡터를 포함하며 숙주에 트랜스페린 수용체를 단백질 전달을 위한 생벡터를 제공한다. 벡터는 살모넬라, BCG, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 백시니아 및 폴리오바이러스로부터 선택된다. 벡터는 특히 폴리오바이러스이고 핵산 분자는LEGGFYGP (서열번호 : 74) 또는 LEGGFYG (서열번호 : 85)의 아미노산 서열을 지닌 트랜스페린 수용체의 단편을 코딩한다. 본 발명은 pT7TBP2A, pT7TBP2B, pT7TBP2C 또는 pT7TBP2D (ATCC 지정번호 75931, 75932, 75933, 75934)의 식별 특징들을 지닌 플라스미드 벡터를 포함한다.

본 발명의 부가적인 측면은 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하지 않는 헤모필루스 계통을 제공한다. 그러한 계통은 삽입 돌연변이 유발에 의한 것과 같이 기능적으로 무력한 트랜스페린 수용체를 코딩하는 유전자를 포함한다. 헤모필루스 계통은 약화된 계통이고, 약화된 계통은 트랜스페린 수용체의 전달을 위한 벡터를 포함한다.

상술된대로, 본 발명의 한 측면은 헤모필루스 계통의 새로운 Tbp1 또는 Tbp2 단백질, 바람직하게는 분리되고 정제되어 다른 것으로부터 격리된 헤모필루스 인플렌쟈와 계통을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 그러한 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 따라서, 이 측면에서, 본 발명은 헤모필루스 계통의 분리되고 정제된 Tbp1 또는 TbP2 단백질을 생성하는 방법을 제공하며, 다음 단계들을 포함한다.

(a) 봉입체(inclusion body, 산입체)들에서 양쪽이 아닌 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 발현하는 재조합 숙주를 제공하는 단계;

(b) 세포 덩어리(pellet)를 제공하기 위해 숙주를 성장시키는 단계;

(c) 세포 용해질(lysate)을 제공하기 위해 세포 덩어리를 분열시키는 단계;

(d) 실질적으로 대부분의 용해성 숙주 단백질들을 포함하는 제 1 상층액(supernatant)과 제 1 덩어리를 제공하기 위해 세포용해질을 분류(分溜)하는 단계;

(e) 제 1 덩어리로부터 제 1 상층액을 분리하는 단계;

(f) 모든 용해성 숙주 단백질들과 그로부터의 숙주막 단백질들을 실질적으로 제거하기 위해 제 1 덩어리를 선택적으로 추출하여 제 2 상층액과 봉입체들을 포함하는 추출된 덩어리를 제공하는 단계;

(g) 추출된 덩어리로부터 제 2 상층액을 분리하는 단계;

(h) 추출된 덩어리를 용해화하여 용해된 추출물을 제공하는 단계; 및

(i) 용해화된 추출물을 분류하여 단편(fraction)을 함유하는 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 제공한다.

세포용해질은 제 1 상층액을 제공하기 위해 분류되고, 제 1 덩어리는 적어도 하나의 세정제 추출물에 의해 효력을 미치게 된다.

용해화된 추출물은 겔 여과작용에 의해 분류되어 단편을 지닌 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 제공하며, 적어도 세정제를 제거하기 위해 연속적으로 투석하여 Tbp1 또는 Tbp2 단백질의 더 정제된 수용액을 제공한다.

도면들에 대한 간단한 설명

본 발명은 첨부된 도면들과 관련하여 다음에서 더 잘 설명된다:

제 1A도는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 DL63의 트랜스페린 수용체 오페론의 두 플라스미드 클론들 (pBHT1과 pBHT2)의 제한효소 지도를 나타낸다.

제 1B도는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan으로부터 TfR 유전자를 지닌 클론들 S-4368-3-3 JB-901-5-3의 제한효소 지도를 나타낸다.

제 1C도는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 MinnA으로부터 트랜스페린 수용체 유전자를 지닌 클론 DS-712-1-3의 제한효소 지도를 나타낸다.

제 1D도는 비타입 헤모필루스 인플렌쟈 계통 PAK 12085로부터 트랜스페린 수용체 유전자를 지닌 클론 JB-1042-7-6의 제한효소 지도를 나타낸다.

제 2도는 식별된 계통들의 클론된 Tbp1과 Tbp2 유전자들의 유기조직과 제한효소 지도들과 단일의 프로모터의 전사 조절하에서 오페론을 형성하는 일렬로 된 두 유전자 (Tbp1와 Tbp2)와 TfR 오페론의 유전상의 유기조직을 설명하며, 또한 헤모필루스 계통으로부터 TfR 유전자를 위한 라이브러리를 규명하기 위해 사용된 pBHIT2의 3.0 kb DNA 단편을 묘사한다.

제 3도는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 DL63으로부터 트랜스페린 수용체 유전자들 (서열번호 : 1)의 뉴클레오티드 서열들과 이들의 추론된 아미노산 서열들 (서열번호 : 5-Tbp1과 서열번호:6-Tbp2)을 나타낸다.

밑줄친 아미노산 서열들은 아미노산 시퀀싱에 의해 식별된 Tbp1의 펩티드들에 해당한다. 추정되는 신호 서열들은 두 개의 위줄로 표시되며, 1 내지 17의 Tbp1과 1 내지 25의 Tbp2 잔기들에 해당한다.

제 4도는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan으로부터 트랜스페린 수용체 유전자들 (서열번호 : 2)의 뉴클레오티드 서열들과 이들의 추론된 아미노산 서열들 (서열번호 : 7-Tbp1과 서열번호: 8-Tbp2)을 나타낸다. 추정되는 -35, -10과 리보솜 결합 자리(binding site) 서열들이 윗줄표시된다.

제 5도는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 MinnA로부터 트랜스페린 수용체 유전자들 (서열번호 : 3)의 뉴클레오티드 서열들과 이들의 추론된 아미노산 서열들 (서열번호 : 9-Tbp1과 서열번호: 10-Tbp2)을 나타낸다. 추정되는 -35, -10과 리보솜 결합 자리(binding site) 서열들이 윗줄표시된다.

제 6도는 비타입의 헤모필루스 인플렌쟈 계통 PAK 12085로부터 트랜스페린 수용체 유전자들 (서열번호 : 4)의 뉴클레오티드 서열들과 이들의 추론된 아미노산 서열들 (서열번호 : 11-Tbp1과 서열번호 : 12-Tbp2)을 나타낸다. 추정되는 -35, -10과 리보솜 결합 자리(binding site) 서열들이 윗줄표시된다.

제 7도는 비타입의 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB33으로부터 트랜스페린 수용체 유전자들 (서열번호 : 105)의 뉴클레오티드 서열들과 이들의 추론된 아미노산 서열들 (서열번호 : 106-TbP1과 서열번호: 107-TbP2)을 나타낸다.

제 8도는 비타입의 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB12로부터 Tbp2 유전자 (서열번호 : 108)의 뉴클레오티드 서열과 추론된 아미노산 서열 (서열번호 : 109-Tbp2)을 나타낸다.

제 9도는 비타입의 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB29로부터 Tbp2 유전자 (서열번호 : 110)의 뉴클레오티드 서열과 추론된 아미노산 서열 (서열번호 : 111-Tbp2)을 나타낸다.

제 10도는 비타입의 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB30으로부터 Tbp2 유전자 (서열번호 : 112)의 뉴클레오티드 서열과 추론된 아미노산 서열 (서열번호 : 113-Tbp2)을 나타낸다.

제 11도는 비타입의 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB32로부터 Tbp2 유전자 (서열번호 : 114)의 뉴클레오티드 서열과 추론된 아미노산 서열 (서열번호 : 115-Tbp2)을 나타낸다.

제 12A도는 헤모필루스 인플렌쟈 계통들 Eagan (서열번호 : 116), MinnA (서열번호 : 117), PAK12085 (서열번호:118) 및 SB33 (서열번호:119)로부터의 프로모터 영역들의 뉴클레오티드 서열들과 tbp2 유전자들의 5'-말단을 나타낸다. PCR에 의해 tbp2 유전자들을 증폭하는 데 사용된 코딩 계통 한가닥 프리머(primer)는 밑줄로 표시된다(서열번호:120).

제 12B도는 유전자간 영역의 뉴클레오티드 서열과 헤모필루스 인플렌쟈 계통들 Eagan (서열번호: 121), MinnA (서열번호: 122), DL63(서열번호:123), PAK12085 (서열번호:124), SB12 (서열번호:125) SB29(서열번호:126), SB30(서열번호:127), 및 SB32(서열번호:128)로부터의 tbp1 유전자들의 5'-말단을 나타낸다. PCR에 의해 tbp2 유전자들을 증폭하는 데 사용된 비-코딩 계통 한 가닥 프리머는 밑줄로 표시된다(서열번호:129).

제 13도는 비타입 헤모필루스 인플렌쟈 계통들 SB12, SB29, SB30, SB32 및 SB33으로부터의 PCR 증폭된 tbp2 유전자들의 아가로우스 겔 분석을 나타낸다. 레인 1은 SB33이고, 레인 2는 SB12, 레인 3은 SB29, 레인 4는 SB30, 레인 5는 SB32이다.

제 14도는 헤모필루스 인플렌쟈 계통들 Eagan, DL63, PAK12085 및 SB33 (서열번호:7, 5, 11, 106), 수막염균 계통들 B16B6과 M982 (서열번호:94와 95), 및 임균 계통 FA19 (서열번호:96)으로부터 Tbp1의 아미노산 서열들의 비교를 나타낸다.

제 15도는 헤모필루스 인플렌쟈 계통들 Eagan, DL63, PAK12085, SB12, SB29, SB30 및 SB32(서열번호: 8, 6, 12, 109, 110, 112, 114), 수막염균 계통들 B16B6와 M982 (서열번호:97와 98), 임균 계통 FA19 및 액티노바실루스(Actinobacillus) 늑막폐렴 계통들 AP205와 AP37 (서열번호: 99와 100)로부터 Tbp2의 아미노산 서열의 비교를 나타낸다.

제 16A도는 헤모필루스 인플렌쟈 Tbp1 단백질의 예측된 2차 구조를 보여주고, 제 16B도는 헤모필루스 인플렌쟈 Tbp2 단백질의 예측된 2차 구조를 나타낸다.

제 17도는 E. coli로부터 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b Eagan Tbp1을 발현하는 플라스미드 JB-1468-29의 구성구조를 나타낸다.

제 18도는 E. coli로부터 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b Eagan Tbp2를 발현하는 플라스미드 JB-1424-2-8의 구성 구조를 나타낸다.

제 19도는 플라스미드 JB-1424-2-8을 구성하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 쌍들 (서열번호:130, 131)을 나타낸다.

제 20도는 Tbp1과 Tbp2 발현 플라스미들을 구성하기 위한 올리고뉴클레오티드 쌍들 A(서열번호:86, 87), B(서열번호:88, 89), C(서열번호:90, 91)및 D(서열번호:92, 93)을 나타낸다.

제 21도는 E. coli로부터 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB12 Tbp2를 발현하는 플라스미드 JB-1600-1의 구성 구조를 나타낸다.

제 22도는 헤모필루스 타입 b Eagan Tbp1 단백질, Eagan Tbp2 단백질, 및 E. coli로부터 비타입 헤모필루스 인플렌쟈 SB12 Tbp2 단백질의 발현으로부터의 생성물들의 SDS-PAGE 겔들을 나타낸다. 레인 1은 t₀에서 JB-1476-2-1 (T7/Eagan Tbp1); 레인 2는 t=4h 유도(induction)에서 JB-1476-2-1, 레인 3은 200 kDa, 116 kDa, 97.4 kDa, 66 kDa, 45 kDa 및 31 kDa의 분자량 표식(marker); 레인 4는 t₀에서 JB-1437-4-1 (T7/Eagan Tbp2); 레인 5는 t=4h 유도에서 JB-1437-4-1, 레인 6은 t₀에서 JB-1607-1-1 (T7/SB12 Tbp2); 레인 7은 t=4h 유도에서 JB-1607-1-1이다.

제 23도는 E. coli로부터 발현된 재조합 Tbp1 또는 Tbp2에 대한 정제 개요를 나타낸다.

제 24도는 제 23도의 개요에 의해 정제된 재조합 Tbp1 또는 Tbp2 정제의 분석을 나타낸다. 레인 1은 분자량크기 표식들 (106, 80, 49.5, 32.5, 27.5 및 18.5 kDa)을 포함하고, 레인 2는 E. coli 전체 세포용해질이고, 레인 3은 용해화된 세포 봉입체들(inclusion bodies)이고, 레인 4는 정제된 Tbp1 또는 Tbp2이다.

제 25도는 쥐의 rTbp1 (상 패널)과 rTbp2 (하 패널)의 면역원성을 나타낸다.

제 26도는 웨스턴 블랏에서 다양한 헤모필루스 인플렌쟈 계통들과의 항-Eagan rTbp1 항혈청의 반응성을 나타낸다. 레인 1은 BL21/DE3; 레인 2 는 SB12-EDDA; 레인 3은 SB12+EDDA; 레인 4는 SB29-EDDA; 레인 5는 SB29+EDDA; 레인 6은 SB33 -EDDA; 레인 7은 SB33 + EDDA; 레인 8은 Eagan -EDDA; 레인 9는 Eagan +EDDA; 레인 10은 B. 카타르알리스(catarrhalis) 4223 -EDDA; 레인 11은 B. 카타르알리스 4223 +EDDA; 레인12는 수막염균 608 -EDDA; 레인 13은 수막염균 608 EDDA; 레인 14는 재조합 Eagan Tbp1을 발현하는 유도된 JB-1476-2-1; 레인 15는 분자량 표식들이다. 특이한 ∼ 95 kDa 띠는 헤모필루스 인플렌쟈 계통들 SB12, SB29, SB33 및 Eagan에 해당하는 레인들 3, 4, 5, 7, 8, 및 9에서; ∼110 kDa 띠(band)는 B. 카타르알리스 4223에 해당하는 레인 10과 11; 및 ∼80 kDa 띠는 수막염균 608에 해당하는 레인 12와 13에서 항-Tbp1 항혈청과 반응하였다.

제 27도는 웨스턴 블랏에서 다양한 헤모필루스 인플렌쟈 계통들과의 항-Eagan rTbp2 항혈청의 반응성을 나타낸다. 레인 1은 분자량 표식들; 레인 2는 재조합 Eagan Tbp2를 발현하는 유도된 JB-1437-4-1; 레인 3은 SB12-EDDA; 레인 4는 SB12+EDDA; 레인 5는 SB29-EDDA; 레인 6은 SB29+EDDA; 레인 7은 SB30 -EDDA; 레인 8은 SB30 + EDDA; 레인 9는 SB32 -EDDA; 레인 10은 SB33 - EDDA; 레인 11은 SB33 +EDDA; 레인 12는 PAK -EDDA; 레인 13은 PAK +EDDA; 레인 14는 Eagan -EDDA; 레인 15는 Eagan +EDDA이다. 60 내지 70 kDa의 특이한 띠는 레인들 3, 6, 7, 8, 13, 14 및 15, 즉 SB12, SB29, SB30, PAK 및 Eagan, 에서 항-Tbp2 항혈청과 반응하였다.

제 28도는 트랜스페린 수용체를 생성하지 않는 헤모필루스 인플렌쟈의 계통들을 생성하는 데 사용된 플라스미드 pUHITIKFH와 pUHITIKFP의 구성을 나타낸다.

제 29도는 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하는 바이러스중에서 보존된 트랜스페린 수용체 단백질로부터 유도된 에피토프를 발현하는 키메릭 폴리오바이러스를 코딩하는 구성을 나타낸다.

제 30도는 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하는 바이러스중에서 보존된 트랜스페린 수용체 단백질로부터 유도된 에피토프를 발현하는 폴리오바이러스 키메라들로 토끼를 면역화함으로써 생성된 항혈청의 반응성을 보여주는 웨스턴 블랏이다.

패널 A는 E. coli에서 발현된 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB12로부터 정제된 재조합 Tbp2 (레인 1), 브란하멜라 카타르알킬스 계통 4223으로부터 정제된 Tbp2 (레인 2), 철이 한정된 브란하멜라 카타르알리스 계통 4223의 전체 세포용해질(레인 3), 철이 한정되지 않은 상태(레인 5)에서 성장한 E. coli JM-109의 전체 세포용해질을 보여주는 코마시 브릴리언트 불루-착색된(Coomassie Brilliant Bule-stained) 겔을 나타낸다. 패널 B는 PV1TBP2A로 면역된 토끼들 (토끼 40, 41, 42)에서 27일에 수집한 혈청 풀(pool)을 사용하여 복제 겔의 웨스턴 블랏의 결과들을 보여준다. 패널 C는 동일 토끼에서 미리 방혈된 혈청의 풀에 대한 결과들을 보여주고, 극소의 특이한 반응성을 표시하였다.

상기 몇몇 도면들에서, 다음 약어들은 특정한 부위 특이 제한 엔도뉴클레아제를 지정하기 위해 사용되었다: R. Eco RI; Ps, Pst I; H, Hind III;Bg, Bgl II; Nde, Nde I; Ear, Ear I; 및 Sau, Sau3A I.

제 28도에서, 다음 약어들은 특정한 부위 특이 제한 엔도뉴클레아제를 지정하기 위해 사용되었다. A, Acc I; B Bam HI; E. Eco RI; O, Xho I; H, Hind III; Ps, Pst I; V, Eco RV; X, Xba I, G, Bgl II; S, Sal I; K, Kpn I; 및 S*, SacI.

발명의 일반적인 설명

어떠한 헤모필루스 계통이 DNA 분자의 형태일 수 있는 정제되고 분리된 핵산 분자들을 제공하는데 편리하게 사용될 수 있고, 본 발명의 실시예들에 의하여 정형화되는 바와 같은 트랜스페린 수용체를 코딩하는 핵산의 적어도 한 일부를 포함한다. 그러한 계통들은 일반적으로 임상적인 근원들로부터 그리고 미합중국 모식균 배양 수집(American Type Culture Collection, ATCC)과 같은, 박테리아성 배양 수집들로부터 이용할 수 있다.

본 발명의 한 측면에 의해, 트랜스페린 수용체 단백질은 Schryvers(1989), Ogunnaviwo와 Schryvers (1992) 및 미합중국 제 5,141,743호에 의해 설명된 방법들에 의한 헤모필루스 계통으로부터 분리될 수 있고, 본 내용은 이에 참조문헌으로서 참조된다. 적절한 공정의 세부사항이 미합중국 제 5,141,743호에 제시되었으나, 그러한 공정의 간략한 요약은 다음과 같다. 트랜스페린 수용체의 분리는, 트랜스페린 결합활성을 발현하는 박테리아 계통으로부터의 막 단편 분리하고, 트랜스페린 수용체에 트랜스페린을 예비 결합하고, 막을 용해화하고, 트랜스페린을 고정시키고, 고정된 트랜스페린으로부터 트랜스페린 수용체를 분리하는 연속적인 단계들에 관련한 친화방법에 의해 트랜스페린 수용체를 정제함으로써 이루어진다. 양자택일적으로, 수용체 단백질은 Ogunnaviwo와 Schryvers (1992)에서 설명된대로 고정된 트랜스페린 예비 결합단계가 취소되고 높은 농도의 염이 용해성 완충제에 포함되어 고정된 트랜스페린으로 직접적인 분리를 허용하는 상기 방법의 변형에 의해 분리될 수 있다.

본 출원서에서, 용어 "트랜스페린 수용체"는 예를 들어 헤모필루스의 다양한 계통들에서 천연적으로 일어나는 계통들을 포함하는 이들의 아미노산 서열들에서 변이성을 지닌 서열들을 포함하는 Tbp1 및/또는 Tbp2 단백질들의 과(family)을 한정하기 위해 사용된다. 트랜스페린 수용체의 다른 박테리아성 근원들은 나이세리아(Neisseria)속, 브라하멜라(Branhamella)속, 파스퇴렐라(Pasteurella)속 및 악티노바실러스(Actinobacillus)속의 종들이나, 한정하는 것은 아니다. 전부는 아니나, 몇 개의 박테리아는 Tbp1와 Tbp2를 포함한다. 본 발명의 트랜스페린 수용체를 코딩하는 적어도 한 부분을 포함하는 정제되고 분리된 DNA 분자들은 또한 트랜스페린 수용체의 기능 유사체를 코딩하는 분자들을 포함한다. 이 출원서에서, 1차 단백질 또는 펩티드는 1차 단백질이 면역성적으로 2차 단백질 또는 펩티드와 마찬가지로 동일한 기능에 관련되거나 동일한 기능을 지닌다면 2차 단백질의 "기능 유사체"이다. 예를 들면, 기능 유사체는 단백질의 단편 또는 대체, 부가 또는 삭제 돌연변이일 수 있다.

특정한 한 실시예에서, 트랜스페린 수용체는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 DL63으로부터 분리되고 Schryvers (1989), Ogunnaviwo와 Schryvers (1992) 및 미합중국 제 5,141,743호에 의해 설명된 대로 친화 크로마토그래피 방법들에 의해 정제된다. 분리되고 정제된 트랜스페린 수용체는 토끼에서 항-TfR 항혈청을 생성하는 데 사용된다. 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 DL63의 염색체 DNA는 기계적으로 전단되고, EcoRI 링거들이 첨가되고, λZAP 발현 라이브러리가 구성된다. 라이브러리는 항-TfR 토끼 항혈청으로 선별되고 두 양성 클론 (pBHIT1와 pBHIT2)은 제한효소 지도(제 1A도, 제 2도)를 중첩하여 얻어진다. 클론은 서열되고 두 개의 큰 공개된 읽기 프레임들은 구별된다(제 2도), 헤모필루스 인플렌쟈 DL63으로부터 트랜스페린 수용체 유전자 Tbp1 또는 Tbp2 (서열번호:1)의 뉴클레오티드 서열들과 이들의 추론된 아미노산 서열들(서열번호:5-Tbp1 및 서열번호:6-Tbp2)가 제 3도에 보여진다. 서열분석은 일렬로 배열되고 단일의 프로모터로부터 전사된 (특히, 제 2도와 제 3도에 도시된대로) 두 유전자(Tbp1 또는 Tbp2)로 이루어진 TfR 오페론을 보여주었다. Tbp2 단백질은 종들에 의존하는 분자량이 가변되는 경향이 있는 반면에, Tbp1 단백질은 TfR 유전자들을 지닌 다양한 박테리아와 교차하여 다소의 가변성으로 더 일관된 분자량을 지니는 경향이 있다. Tbp1의 분자량은 일반적으로 94 내지 106,000의 범위에 있는 반면에 Tbp2의 분자량은 58 내지 98000으로 상당히 가변적이다.

헤모필루스 인플렌쟈 DL63으로부터 트랜스페린 수용체의 N-말단과 시안 브롬화물 단편들의 아미노산 시컨싱이 이행된다. Tbp2의 N-말단들은 차단되나 아미노산 서열들은 Tbp1의 시컨싱에 의해 확인되고 제 3도의 단백질 서열내 밑줄로 표시된다. 이러한 펩티드 서열들은 Glu Thr Gln Ser Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Ile Ser Ser Glu Val Asp Thr (제 3도에서 도시된 대로, 서열번호:101)와 Leu Gln Leu Asn Leu Glu Lys Lys Ile Gln Gln Asn Trp Leu Thr His Gln Ile Ala Phe (제 3도에서 도시된 대로, 서열번호:102)이다. Tbp1의 신호 서열과 Tbp2의 추정적인 신호 서열은 제 3도에서 두개의 윗줄표시된다. Tbp1의 추정적인 신호 서열은 Met Thr Lys Lys Pro Tyr Phe Arg Leu Ser Ile Ile Ser Cys Leu Leu Ile Ser Cys Tyr Val Lys Ala (서열번호:103)이다. Tbp2의 추정적인 신호 서열은 Met Lys Ser Val Pro Leu Ile Ser Gly Gly Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ala(서열번호: 104)이다. Tbp2의 N-말단 영역의 파생된 아미노산 서열이 지방단백질임을 표시한다. 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan으로부터 염색체 DNA가 제조되었고 라이브러리가 발생하였다. 제 1 라이브러리는 ∼5-10 kb 단편들에 대해 크기-분류된 Sau3A I로 부분적으로 소화된 DNA로부터 구성하였고, pUC-기초한 플라스미드로 클론되었다. 제 2 라이브러리는 EcoRI-제한된 염색체 DNA 단편들로부터 구성되었고 λZAP로 클론되었다. 두 라이브러리는 제 2도에서 도시된대로 pBHIT 클론의 5'-단편으로 규명되었고 S-4368-3-3과 JB-901-5-3으로 불리는 헤모필루스 인플렌쟈 Eagan의 TfR 유전자의 부분 클론들을 얻었다. 그러므로, 제 1B도와 제 2도에 대한 본 발명의 또 다른 측면에 따라, 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan으로부터 Tbp1과 Tbp2를 코딩하는 플라스미드 클론들 S-4368-3-3과 JB-901-5-3을 설명한다. 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan으로부터 Tbp1과 Tbp2 유전자의 서열들(서열번호: 2)과 이들의 추론된 아미노산 서열들 (서열번호:7, 8)은 오페론에서 제 1 유전자인 Tbp2서열과 함께 제 4도에서 보여진다. 제 4도에서 추정적인 -35, -10과 리보솜 결합자리 서열들은 위줄 표시된다.

헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 MinnA로부터 염색체 DNA가 제조되었고 DNA는 10-20 kb 단편들에 대해 크기-분류된 Sau3A I로 부분적으로 소화되었고, EMBL3의 BamHI 자리로 클론되었다. 라이브러리는 pBHIT 클론의 5'-단편으로 규명되었고 (제 2도) TfR을 코딩하는 전 길이의 클론(DS-712-1-3)을 얻었다. 제 1C도와 제 2도에 대한 본 발명의 부가적인 측면들에 따라, 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 MinnA로부터 Tbp1과 Tbp2를 코딩하는 플라스미드 클론 DS-712-1-3을 설명한다. 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 MinnA로부터의 Tbp1과 Tbp2 (서열번호: 3)의 DNA 서열들과 이들의 추론된 아미노산 서열들(서열번호:9-Tbp1과 서열번호:10-Tbp2)은 오페론에서 첫째인 Tbp2 서열이 있는 제 5도에서 보여진다. 제 5도에서 추정적인 -35, -10과 리보솜 결합자리 서열들은 윗줄표시된다.

비타입 헤모필루스 인플렌쟈 계통 PAK 12085로부터 염색체 DNA가 제조되었다. DNA는 10-20 kb 단편들에 대해 크기-분류된 Sau3A I로 부분적으로 소화되었고, EMBL3의 BamHI자리로 클론되었다. 라이브러리는 pBHIT 클론의 단편들로 규명되었고 (제 2도) TfR을 코딩하는 전 길이의 클론(JB-1042-7-6)을 얻었다. 클론 JB-1042-7-6의 제한효소 지도가 제 1D 와 제 2도에 보여지고, 헤모필루스 인플렌쟈 PAK 12085로부터의 Tbp1과 Tbp2 유전자들의 뉴클레오티드 서열들(서열번호: 4)과 이들의 추론된 아미노산 서열들(서열번호:11,12) 첫째인 Tbp2 서열과 함께 제 6도에서 보여진다. 제 6도에서 추정적인 -35, -10과 리보솜 결합자리 서열들은 위줄표시된다.

비타입 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB33으로부터 파생된 중이염 배지으로부터 염색체 DNA가 제조되었다. DNA는 10-20 kb 단편들에 대해 크기-분류된 Sau3A I로 부분적으로 소화되었고, EMBL3의 BamHI 자리로 클론되었다. 라이브러리는 pBHIT 클론의 단편들로 규명되었고 (제 2도) TfR(JB-1031-2-9)을 코딩하는 전 길이의 클론(JB-1031-2-9)을 얻었다. 클론 JB-1031-2-9의 제한효소 지도가 제 2도에서 보여지고, 헤모필루스 인플렌쟈 SB33으로부터의 Tbp1과 Tbp2 유전자들의 뉴클레오티드 서열들(서열번호: 4)과 이들의 추론된 아미노산 서열들(서열번호:11,12)이 첫째인 Tbp2 서열과 함께 제 7도에서 보여진다. SB33 tbp2 유전자에 있어서 잔기 126에서 프레임-이동과 잔기 168에서 합성 단백질의 조기 절단으로 귀결된 단일의 염기 삭제가 있는 것을 발견하였다.

중이염을 파생한 NTHi 계통들 SB12, SB29, SB30 및 SB32로부터 tbp2 유전자의 PCR 증폭이 이루어지고, 유전자들이 배열된다.

비타입 헤모필루스 인플렌쟈 계통들 SB12(서열번호: 105), SB29(서열번호: 108), SB30(서열번호: 110) 및 SB32(서열번호: 112)로부터 tbp2 유전자의 뉴클레오티드 서열은 제 8, 9, 10 및 11도에 각각 도시된다.

모든 증폭된 tbp2 유전자들이 계통 SB33의 결합있는 tbp2 유전자가 불규칙함을 표시하는 전 길이의 Tbp2 단백질들을 코딩하는 것이 발견되었다.

세 개의 헤모필루스 인플렌쟈 b 계통들 모두는 tbp2와 tbp1사이의 13bp 짧은 유전자간 서열들이 동일하나, NTHi 계통들 PAK 12085와 SB33은 27bp (제 12도)의 더 긴 유전자간의 서열들을 지녔다.

계통 SB12는 헤모필루스 인플렌쟈 b 계통에서 발견된 대로의 서열에 동일한 13bp 유전자간 서열을 지닌 반면에, 계통들 SB29, SB30 및 SB32는 다른 NTHi 계통들 PAK 12085와 SB33(제 2B도)에서 발견된대로 더 긴 유전자간의 서열들(27-30bp)을 포함하였다. 아홉 개의 모든 계통들은 tbp2와 tbp1 유전자들간에 13bp 서열이 보존된 공통된 핵심을 지니다.

헤모필루스 인플렌쟈 Tbp1의 아미노 말단 근처의 펜타펩티드 서열을 확인하였고(제 12도), TonB 박스와 유사하다. 헤모필루스 인플렌쟈의 tonB 유전자는 근래에 클론되어 배열된다 (Jarosik et al, 1994).

헤모필루스 인플렌쟈 계통들 Eagan/MinnA, DL63, PAK 12085와 SB33으로부터 Tbp1의 아미노산 서열들이 제 14도에서 비교된다. Eagan과 MinnA의 Tbp1 단백질들은 동일하고 912 아미노산 길이이며, DL63의 계통은 914 잔기들을 지니며, PAK12085 계통은 914 잔기들을 지니며, SB33 계통은 911 잔기들을 지닌다. 헤모필루스 인플렌쟈 Tbp1 단백질들은 95-100%의 서열 동일성으로 잘 보존된다. 헤모필루스 인플렌쟈 계통들 Eagan/MinnA, DL63, PAK 12085, SB12, SB29, SB30과 SB32로부터 Tbp2의 아미노산 서열들이 제 15도에서 비교된다. Eagan과 MinnA의 Tbp2 단백질들은 동일하고 660 아미노산을 함유하며, DL63의 계통은 644 잔기들을 지니며, PAK12085 계통은 654 잔기들을 지닌다. SB33 tbp2 유전자에 있어서 잔기 126에서 프레임-이동과 잔기 168에서 합성 단백질의 조기 절단으로 귀결된 단일의 염기 삭제가 존재한다. 누락된 염기는 PCR 증폭된 염색체 DNA의 직접적인 시퀀싱에 의해 확인되었다. 동일한 Eagan과 MinnA를 제외하고, Tbp2 단백질 서열들은 더 적은 단지 66-70% 동일성으로만 보존되나, 제 15도에서 확인할 수 있는 보존된 서열의 몇 개의 짧은 세그먼트들이 있다. 계통들 SB12, SB29, SB30과 SB32로부터 PCR 증폭된 tbp2 유전자들이 전 길이의 Tbp2 단백질들을 코딩하기 위해 전부 발견되었다. 추론된 Tbp2 단백질들중에 서열과 크기 이질성이 존재하고, 여기서 SB12는 648 아미노산을 지니며, SB29는 631 잔기들을 지니며, SB30은 630, SB32는 631 잔기들을 지닌다.

Eagan Tbp1과 Tbp2의 추정의 2차적인 구조가 결정되었다 (제 16A와 16B도). 두 단백질들은 여러개의 막을 통한 영역들을 지니며, Tbp1이 막을 20회 횡단하고 Tbp2는 막을 12회 교차한다. 세 개의 노출 보존된 에피토프들이 Tbp1 아미노-말단 부위 (DNEVTGLGK-서열번호:43, EQVLN/DIRDLTRYD)-서열번호:139, 140, 및 GALNEIEYENVKAVEISK-서열번호:141)와 C-말단 부위(GI/VYNLF/LNYRYVTWE-서열번호; 142, 143)에서 확인되었다.

세 개의 작은 보존된 부위들은 인간 병원균의 Tbp2 단백질들내에서 확인할 수 있다: N-말단에서 CS/LGGG(G)SFD-서열번호;75, 144, 145, 내부에 위치한 LE/SGGFY/FGP-서열번호; 74, 146 및 C-말단에서 VVFGAR/K-서열번호;83, 84.

Tbp2 아미노산 서열이 헤모필루스의 계통간에 가변한다는 발견에 의해 헤모필루스를 동일한 Tbp2 아미노산 서열에 의해 규정된 서브그룹들로 분족(grouping)할 수 있다. 이 발견으로 인해 예를 들면, 헤모필루스 종들로부터 Tbp1과 Tbp2 에 서열 유사성을 지닌 트랜스페린 수용체를 생성하는 헤모필루스와 다른 박테리아에 의해 초래된 질병들로부터의 면역화를 위한 면역원적 조성물들에서 사용되는 헤모필루스의 계통들내에서 그러한 아형(subtype)에 의해 공유되는 에피토프들을 나타내는 Tbp1 및/또는 Tbp2 서열들 또는 합성 펩티드들에 대한 최소 수의 합리적인 선택을 할 수 있다.

더욱이, 박테리아성 병원균 범위로부터 트랜스페린 수용체의 아미노산 서열들(헤모필루스 인플렌쟈 타입 b, 비타입 헤모필루스 인플렌쟈, 수막염균, 임균 및 악티노바실루스 (헤모필루스) 늑막폐렴)이 제 14도와 15도에 도시된대로 비교되었다. 이 분석은 이러한 모든 박테리아 사이에 보존된 Tbp1과 Tbp2의 영역을 드러내었다. 다소의 보존된 서열은 표 2와 3에서 펩티드들을 포함한다. 특히, 서열들 DNEVTGLGK (서열번호:43), EQVLNIRDLTRYDPGI(서열번호:44), EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASBGYSIRGMD(서열번호:45), GAINEIEYENVKAVEISKG (서열번호:46), GALAGSV(서열번호 47)은 Tbp1에서 보존된다. (표 1과 제 14도). Tbp2에서 특별히 보존된 서열들은 LEGGFYGP(서열번호;74), CSGGGSFD(서열번호;75), YVYSGL(서열번호;76), CCSNLSYVKFG(서열번호:77), FLLGHRT(서열번호;78), EFMVOF(서열번호;79), NAFTGTA(서열번호;80), VNGAFYG(서열번호;81), ELGGYF(서열번호;82), VVFGAR(서열번호;83), VVFGAK(서열번호;84)을 포함한다 (표 2와 제 15도).

박테리아성 병원균 범위의 트랜스페린 수용체내에 보존된 서열들을 발견함으로써 트랜스페린 수용체를 지닌 병원균에 의해 초래된 질병들로부터 면역시키기 위해 특이한 아미노산 서열들(합성 펩티드들의 형태를 지닌)을 지닌 최소 수의 항원들을 선택할 수 있다. 상술된 내용에 부가하여 그러한 박테리아는 임균과 같은 나이세리아와 브란하멜라 카타르알리스를 포함하는 브란하멜라의 다른 종들을 포함한다. 많은 박테리아성 병원균들중에서 그러한 보존된 아미노산 서열들은 모노클로날 항체들을 포함하며, 모든 트랜스페린 수용체들은 아니더라도 대부분을 인식하는 TfR 특이 항체들의 생성을 허용한다. 항혈청은 트랜스페린 수용체의 보존된 일부에 해당하는 펩티드들로부터 제기된다. 이 항혈청은 브란하멜라 카타르알리스에서 트랜스페린 수용체를 인지하였다. 그러한 항혈청은 TfR 단백질을 생성하는 모든 박테리아는 아니더라도 대부분의 검출과 중화에 유용하고, 또한 그러한 병원균에 의해 초래된 질병들로부터의 수동적인 면역화에 유용하다. 보존된 아미노산 서열들을 사용하는 진단적인 검정과 키트(kit)들은 트랜스페린 수용체를 생성하는 모든 바이러스가 아니더라도 다수를 검출하는 데 유용하다.

상술된 아미노산 서열들을 포함하는 에피토프들을 그러한 서열들을 포함하는 합성 펩티드를 사용하거나, 그러한 서열들을 발현하는 생벡터를 사용하거나, 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자들을 직접 투여함으로써 면역 시스템의 세포들로 전달될 수 있다.

헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통들 Eagan, MinnA, DL63 및 비타입계통 PAK12085의 Tbp1 단백질들내에서 보존된 아미노산 서열들을 포함하는 몇몇 펩티드들이 표 2에 표시된다. 이 펩티드들에 대한 항체들은 기니어 피그에서 길러졌다(표 4). 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통들 Eagan, MinnA, DL63 및 비타입 계통 PAK12085의 Tbp2 단백질들내에서 보존된 아미노산 서열들을 포함하는 펩티드들이 표 3에 표시된다. 다소의 펩티드들에 대한 항체들은 기니어 피그에서 길러졌다(표 4).

Tbp1과 Tbp2 유전자의 코딩 서열들은 재조합 단백질들을 생성하기 위해 적당한 발현 벡터들로 클론될 수 있다. 재조합 Tbp1와 Tbp2는 T7 발현 시스템를 사용하여 E. coli로부터 발현되었다. 숙성된 Eagan Tbp1 단백질을 코딩하는 tbp1 유전자는, 제 17도에 보여진대로, 플라스미드JB-1468-29를 발생시키는 T7 프로모터 이면에 프레임내(in-frame)에서 클론되었다. BL21/DE3 세포들로 도입되고 IPTG 또는 락토오스, Eagan Tbp1 단백질과 함께 유도될 때, Eagan Tbp1 단백질은 제 22도에서 표시된 대로 발현되었다.

숙성된 Tbp2 단백질을 코딩하는 tbp2 유전자는, 제 18도에 보여진대로, 플라스미드 JB-1424-2-8를 발생시키는 T7 프로모터 이면에 프레임내에서 클론되었다. E. coli 세포들로 도입되고 상술된대로 유도될 때, Tbp2 단백질은 제 22도에서 표시된대로 발현되었다.

계통 NTHi SB12로부터의 tbp2 유전자는 PCR에 의해 증폭되었다. 결과에 의한 증폭된 DNA는 숙성된 단백질 이전에 확실한 헤모필루스 인플렌쟈 Tbp2 신호 서열을 포함한다. 신호 서열과 숙성된 단백질을 코딩하는 SB12 tbp2 유전자가 제 21도에서 도시된대로 pT7-7 발현 시스템로 클론되었다. 결과에 의한 플라스미드(JB-1600-1)가 E. coli BL21/DE3 세포들로 도입되고 유도되었을 때, SB12 Tbp2는 제 21도에서 도시된대로 발현되었다.

봉입체로서 E. coli에서 생성된 재조합 단백질들 Tbp1과 Tbp2는 제 23도에서 도시된 개요에 의해 정제되었다. 정제된 단백질들은 제 24도에서 도시된대로 적어도 약 70% 순도였다. 면역원성 연구는 정제된 재조합 Tbp1과 Tbp2 단백질에 의해 쥐에서 실행한다. 두 단백질을 쥐에게 3-10㎍을 투여하여 양호한 면역반응을 도출하였다.

하나의 헤모필루스 인플렌쟈 계통으로부터 유도된 재조합 Tbp1과 Tbp2에 제기된 항혈청은 다른 계통들과 교차반응하며, 이들은 잠재적으로 유용한 진단시약들을 만든다 (제 26과 27도).

제 28도에서 보여진 플라스미드 pUHITIKFH와 pUHITKFP는 트랜스페린 수용체 오페론내에 클론된 선택가능한 항생 저항 제조물을 포함하고, 삽입적으로 트랜스페린 수용체 오페론을 불활성화하도록 구성되었다. 이 플라스미드는 실시예 19에서 설명한대로 트랜스페린 수용체 Tbp1과 Tbp2 를 생성하지 않는 계통을 발생시키는 헤모필루스를 변형하는 데 사용되었다. 그러한 계통들은 생체 외에서 또는 생체 내에서 음성적 제어로서(TfR을 생성하지 않으므로) 검출과 진단상의 실시예들에서 유용하다. 그러한 계통들은 또한 생체 내 성장을 위해 약화되고, 살아있는 백신으로서 헤모필루스에 의해 초래된 질병들로부터 보호하는 데 유용하다.

상술된대로, 트랜스페린 수용체 단백질들의 에피토프들을 그러한 아미노산 서열들을 발현하는 생벡터를 사용하여 면역시스템의 세포에 전달할 수 있고, 생벡터는 폴리오바이러스일 수 있다. 제 29도에 있어서, Tbp2 LEGGFYGP(서열번호;74)로부터 보존된 에피토프를 포함하는 트랜스페린 수용체 단백질의 에피토프를 발현하는 하이브리드 폴리오바이러스의 구성을 설명한다. 그러한 바이러스들은 아미노산 서열 LEGGFYGP(서열번호;74)(표 5)을 결합하는 펩티드로부터 제기된 항체들에 의해 인식되었고, 바이러스들이 항원적으로 인식가능한 형태로 이 서열을 발현하였음을 나타낸다. PVITBP2A와 PVITBP2B는 또한 헤모필루스 인플렌쟈 계통 DL63 tbp2에 대해 제기된 토끼의 항혈청에 의해 중화되었으며, 적어도 이 두 개의 바이러스들이 단백질에 반하여 제기된 항체들에 대해 인식가능한 형태로 서열을 발현하였음을 표시한다. 모든 바이러스들은 항-PVI 혈청에 의해 중화가능하였고, 폴리오 중화 항원 부위 I에서의 변경이 바이러스상의 다른 항원 부위들에 대해 상당한 영향을 끼치지는 않는다는 것을 나타낸다.

더욱이, 폴리오바이러스 키메라 PVITBP2A와 PVITBP2B로 면역화하여 생성된 토끼 항혈청은 아미노산 서열 LEGGFYCP(서열번호;74)을 결합하는 펩티드를 인식하였다. 이는 PVITBP2A와 PVITBP2B에 의해 발현된 서열들이 면역원적이고 합성 펩티드의 전후관계에 있어서 동일한 서열을 인식할 수 있는 항체들을 도출한다.

제 30도에 있어서, 패널 A는 E. coli에서 발현된 헤모필루스 인플렌쟈 계통 SB12로부터 정제된 재조합 Tbp2 (레인 1), 브란하멜라 카타르알리스 계통 4223으로부터 정제된 Tbp2 (레인 2), 철이 한정된 브란하멜라 카타르알리스 계통 4223의 전체 세포용해질(레인 3), 철이 한정된 E. coli JM-109의 전체 세포용해질(레인 4), 및 비-철 한정된 조건하에서 E. coli JM-109의 전체 세포용해질(레인 5)을 보여주는 SDS PAGE 겔을 나타낸다.

패널 B는 PV1TBP2로 면역된 토끼들로부터 혈청 풀(pool)을 사용하여 복제 겔의 웨스턴 블랏의 결과들을 보여준다. 레인 1과 2에서 정제된 트랜스페린-결합 단백질들과, 레인 3엣 유사한 크기의 띠와 강한 반응이 있었다. E. coli 단백질과 중요한 반응은 없었다 (레인 4, 5). 패널 C는 동일 토끼에서 미리 방혈된 혈청의 풀에 대한 결과들을 보여주고, 극소의 특이한 반응성을 표시하였다. 이 결과들은 PVITBP2A가 헤모필루스 인플렌쟈와 브란하멜라 카타르알리스로부터 트랜스페린 결합 단백질들에 대해 특이한 항혈청을 유도할 수 있고, 항혈청이 등가의 단백질을 발현하지 않는 E. coli로부터 브란하멜라 카타르알리스를 구별할 수 있는 것을 보여준다.

여기서 설명된 실시예들에 의해 정형화된 헤모필루스의 종의 트랜스페린 수용체를 코딩하는 적어도 한 일부를 포함하는 정제되고 분리된 DNA 분자들은 다음에 의해 유리하다:

- 생체 외 또는 생체 내에서 헤모필루스 계통들의 특이한 동일성을 위한 핵산 프로브.

- DNA 분자들에 의해 코딩된 생성물들은 진단용 시약들, 헤모필루스-특이 항혈청의 생성을 위한, 헤모필루스의 종에 의해 초래된 질병에 대한 백신접종과 (예를 들어) 헤모필루스에 의한 감염을 감지하기 위한 항원, 으로서 유용하다.

- 여기서 설명한 실시예들에 의해 정형화된 바와같이 트랜스페린 수용체의 부분들에 해당하는 펩티드들은 진단용 시약, 헤모필루스-특이 항혈청의 생성을 위한, 헤모필루스의 종에 의해 초래된 질병에 대한 백신접종과(예를 들어) 헤모필루스에 의한 감염을 감지하기 위한 항원, 으로서 유용하다.

본 발명의 핵산 분자들에 의해 코딩된 트랜스페린 수용체, 단편들과 그 유사체들, 및 헤모필루스의 다양한 분리물과 트랜스페린 수용체를 생성하는 다른 박테리아간에 보존된 트랜스페린 수용체의 일부에 해당하는 서열들을 포함하는 펩티드들은 트랜스페린 수용체를 생성하는 어느 박테리아성 계통에 의해 초래된 질병으로부터의 면역화 진단에 있어서 유용하다. 특히, 서열 LEGGFYGP를 포함하는 펩티드들은 트랜스페린 수용체를 생성하는 다수의 박테리아성 병원균의 트랜스페린 수용체 단백질들에서 보존되고, 펩티드들은 트랜스페린 수용체를 생성하는 박테리아에 의해 초래된 질병으로부터의 면역화 진단에 적절하다. 그러한 박테리아는 헤모필루스, 네이세리아(수막염균과 임균을 포함하는) 및 브라하멜라(브란하멜라 카타르알리스를 포함하는) 종에 포함되나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 여러 실시예들이 백신접종, 진단, 예를 들면 헤모필루스 감염의 치료, 및 트랜스페린 수용체를 생성하는 다른 박테리아성 병원균으로 인한 감염과 면역성 시약의 생성 분야에서 많이 응용되었다는 것은 당해 기술분야에서 숙련된 이들에게는 분명히 명백하다. 그러한 사용상의 비-제한적인 논의는 아래와 같다.

1. 백신 제조와 사용

백신으로 사용하기에 적당한 면역원적 조성물들은 여기서 개시된대로 면역원적 트랜스페린 수용체, 유사체와 그 단편들 및/또는 펩티드들로부터 제조될 수 있다. 백신은 항-트랜스페린 수용체 항체들과 옵소닌 작용을 하거나 살균성이 있는 항체들을 포함하고, 항체들을 생성하는 면역 반응을 도출한다. 백신접종된 대상체가 헤모필루스나 트랜스페린 수용체를 생성하는 다른 박테리아에 의해 도전받는다면, 항체들은 트랜스페린 수용체에 속박되고 그에 의해 생존력을 위해 요구되는 철 근원으로의 박테리아의 접근을 방지한다. 더욱이, 옵소닌 작용 또는 살균성 항-TfR 항체들은 선택적인 메카니즘에 의해 예방될 수 있다.

펩티드들을 포함하는 백신들은 일반적으로 미합중국 특허 제 4,601,903 호, 제 4,599,231 호; 제 4,599,230 호; 및 제 4,596,792호; 모든 문헌들은 이에 참조으로 제시된다, 에 의해 예시화된대로 당해기술에서 공지된다. 백신을 포함하는 면역원적 조성물들은 액체 용액들 또는 에멀션으로서 주입가능한 형태로 제조될 수 있다. 트랜스페린 수용체, 유사체와 그 단편들 및/또는 펩티드들은 트랜스페린 수용체, 단편들, 유사체 또는 펩티드들과 양립할 수 있는 약학적으로 받아들여질 수 있는 부형제(excipient)와 혼합될 수 있다.

그러한 부형제들은, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그들의 조합을 포함할 수 있다. 면역원적 조성물들과 백신들은, 젖게 하는 또는 에멀션화하는 시료들, pH 완충 시료들, 또는 백신의 효과를 증대시키는 보조제와 같은, 보조 물질들을 더욱 함유할 수 있다. 면역원적 조성물들과 백신들은 피하로 또는 근육내로 비경구적으로 주입될 수 있다. 대신에, 본 발명에 따라서 형성된 면역원적 조성물들은 점막 표피들에서 면역 반응을 일으키게 하는 방식으로 형식화되고 전달될 수 있다. 따라서, 면역원적 조성물은, 예를 들어, 비강 또는 구강(위내로) 경로들에 의하여 점막 표피들로 주입될 수 있다. 면역원적 조성물은 면역시스템의 특이 세포들 또는 점막 표면들로 전달하기 위해 타겟화 분자와 결합하여 제공될 수 있다. 그러한 다소의 타겟화 분자들은 PCT 출원 WO 92/17167에서 설명한 대로 계통 B12와 박태리아성 독소의 단편들, 미합중국 특허 제 5,194,254 (Barber et al)에서 기술한대로 모노클로날 항체들을 포함한다. 대신에, 좌약들과 구강 형식들을 포함한 다른 주입 모드들이 적용될 수 있다. 좌약들의 경우, 예를 들어 폴리알칼렌 글리콜들 또는 트리글리세라이드들과 같은, 결합자들과 캐리어들이 포함될 수 있다. 구강 형식들은, 예를 들어 사카린, 셀룰로스 및 마그네슘 카보네이트의 약학적인 정도들과 같은 보통 사용되는 것들을 포함할 수 있다. 이러한 조성물들은 용액들, 서스펜션들, 정제들, 환약들, 캡슐들, 일관된 배출 형식들 또는 가루들의 형태를 취하고 약 10 내지 95%의 트랜스페린 수용체, 단편 유사체들 및/또는 펩티드들을 포함할 수 있다.

백신들은 복용 형식에 맞는 방식으로, 치료학적으로 효과적이고 예방적이며 면역원적인 양으로 주입된다. 주입되는 양은 처리되는 대상에 따라 달라지는데, 예를 들어 항체들을 합성하는, 필요에 따라서는 세포-매개된 면역 반응을 생성하는, 개인의 면역 시스템의 능력에 따라서 달라진다. 주입되는 것이 요구되는 활성적인 성분의 정확한 양은 실무자의 판단에 달려 있다. 그러나, 적당한 복용량 범위들은 본 분야에서 숙련된 사람에 의하여 용이하게 결정되며, 트랜스페린 수용체, 유사체과 그 단편들 및/또는 펩티드들의 마이크로그램 순서이다.

초기 주입과 부스터 복용량의 적당한 범위들도 또한 가변적이나, 초기 주입후에 계속적인 주입들을 포함할 수 있다. 백신의 투여량은 또한 주입의 경로들에 따라 달라지며 숙주의 크기에 따라서 달라질 수 있다.

본 발명에 따른 트랜스페린 수용체를 코딩하는 핵산 분자들은 또한, 예를 들면 유전학적 면역화의 주입에 의하여 또는 살모넬라, BCG, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 백시니아 또는 폴리오바이러스와 같은 생벡터를 구성함으로써, DNA의 직접적인 주입에 의하여 면역화하는데 직접적으로 사용될 수 있다. 면역 시스템에 이종의 항원들을 운반하는데 사용되어 왔던 어떤 생 벡터들에 대한 논의들이, 예를 들어, 0'Hagan (1992)에 논의되어 있다. 유전적인 면역화를 위하여 시험 대상들에서 DNA를 직접 주입하는 공정들이 예를 들어, Ulmer et al, 1993에 설명되어 있다.

생체 외에서 펩티드들의 사용은 펩티드들 자체가 충분히 긴 항혈청 및/또는 조직 반-수명 및/또는 충분한 면역원성을 지니지 못할 수 있으므로 우선 이들의 화학적 변형을 요구할 수 있다. 그러므로, 화학적으로 변형된 펩티드들은 여기서 "펩티드 유사체들"로서 언급된다. 용어 "펩티드 유사체"은 본 발명의 실행에 대하여 생체 외에서 또는 생체 내에서 증가된 안정성 및/또는 효능과 면역원성에 의해 특징지어진 펩티드들의 어떤 기능적, 화학적 등가물로 확대된다. 용어 "펩티드 유사체"는 설명된대로 펩티드들의 어떤 아미노산 유도체로 연장되어 사용될 수 있다. 여기서 심사숙고한 아미노산 유사체들은 곁사슬들에 대한 변형들, 이상 아미노산들 및/또는 펩티드 합성시 이들의 유도체의 결합과 교차결합기들(cross-linker)의 사용과 헵티드들과 이들 유사체에 형태 속박을 부여하는 다른 방법들을 포함되나 이에 한정되지 않는 공정에 의해 생성된다.

본 발명에 의해 심사숙고한 곁사슬의 실시예들은 NaBH₄의 환원에 따른 알데히드와 반응함으써 환원 알킬 반응; 메틸아세티미데이트와 아미드 반응; 아세트산 무수물과 아세틸 반응; 시안산염파 아미노 기들의 카루바밀 반응; 2, 4, 6, 트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)과 아미노 기들의 트리니트로벤질 반응; 숙식산 무수물과 테트라히드로프탈산 무수물과 아미노 기들의 알킬 반응; 및 NaBH₄의 환원에 따른 피리독살-5'-포스페이트와 리진의 피리독실 반을과 같은 아미노기들의 변형을 포함한다.

아르기닌 잔기들의 구아니디노기는 2, 3-부타네디온, 페닐그리옥살 및 글리옥살과 같은 시약으로 헤테로 고리 응축 생성물을 형성함으로써 변형될 수 있다.

카르복실기는, 예를 들면 해당 아미드로 연속적으로 유도화함으로써 따르는 O-아실리소레아(O-acylisourea) 형성을 거쳐 카르보디이미드 활성에 의해 변형될 수 있다.

설피드릴기들은 요오드아세트산 또는 요오드에세타미드와의 카르복시 메틸 반응; 시스테산에 대한 퍼포름산 산화; 다른 티올 화합물과 혼합된 디설파이드의 형성; 말레이미드와 반응; 말레인 무수물 또는 다른 대체된 말레이미드; 4-클로로머큐리벤조에이트, 4-클로로머큐리페닐설포닉산, 페닐머큐리 염화물, 2-클로로머큐릭-4-니트로페놀 및 다른 수은제; 알칼린 pH에서 시아산염과 카르바밀 반응과 같은 방법들에 의해 변형될 수 있다.

트리푸토판 잔기들은, 예를 들면 N-브롬숙신이미드와의 산화 또는 2-히드록시-5-니트로벤질 브롬화물 또는 설포닐 할로겐화물과 인돌링의 알킬 반응에 의해 변형될 수 있다. 트리오신 잔기들은 3-니트로틸로신 유도체를 형성하기 위해 테트라니트로메탄과 이미 질화함으로써 변경될 수 있다.

히스티딘 잔기의 이미다졸 링의 변형은 요오드아세트산 유도체들과 알킬 반응 또는 디에틸피로카르보네이트와 N-카르베톡실 반응에 의해 이루어진다.

펩티드 합성시 이상 아미노산들과 유도체들을 결합하는 실시예들은 노르레우신의 사용, 4-아미노부틸산, 4-아미노-3-히드록시-5-페닐펜타노산, 6-아미노헥사노산-, t-부틸글리신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵타노산, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산들의 D-이성체들을 포함하나 이에 한정하는 것은 아니다.

면역원성은 항원들이 포스페이트-완충된 함염에서 0.05 내지 1.0% 수용액으로서 일반적으로 사용된 보조제와 같이 주입된다면 상당히 진전될 수 있다. 보조제들은 항원의 면역원성을 향상시키나 그 자체가 반드시 면역원적이지는 않다. 보조제들은 주입 부위 근처에 국부적으로 항원을 유지함으로써 작용하여 면역 시스템의 세포로 항원의 완만하고 일관된 노출을 촉진시키는 저장물질의 효능을 발생시킨다. 보조제들은 또한 면역 시스템의 세포를 항원 저장물질로 유인하고 면역반응을 유도하기 위해 그러한 세포들을 자극할 수 있다.

면역흥분제들 또는 보조제들을, 예를 들어 벡신에 대한 숙주면역반응를 향상시키기 위해 수 년간 사용해 왔다. 리포폴리당류와 같은 고유의 보조제들은 보통 백신으로 사용된 소멸되거나 약화된 박테리아의 성분들이다. 외적 보조제들은 전형적으로 비-공유적으로 항원들에 연결된 조절인자들이고 숙주면역 반응을 높이기 위해 공식화된다. 그러므로, 보조제들이 비경구적으로 전달된 항원에 대한 면역반응을 향상시키는 것이 확인되었다. 이런 보조제들중의 다소는 유독하나 바람직하지 못한 부작용을 일으킬 수 있고, 사람이나 많은 동물에 사용하는 것은 적합하지 않다. 실제로, 알루미늄 수산화물과 알루미늄 인산염 (총괄적으로 공통적으로 명반으로서 관련된)을 사람과 수의용 백신으로 통상적으로 사용한다. 디프테리아와 파상풍 톡소이드에 항체 반응을 증가시킴에 있어서 명반이 효능은 몇몇 응용을 위해 잘 확립될 것이고 근래에 더 HBsAg 백신이 명반과 함께 보조되었다. 예를 들면, 명반은 인플렌쟈 백신접종에 대해서는 비효율적이고 일관성없이 세포 매개된 면역반응을 유도한다. 명반-보조된 항원에 의해 도출된 항체들은 쥐에서 주로 IgGi 동형이고, 다소의 백신 시제에 의한 예방이 최상이 아닐 수도 있다.

광범위한 외적 보조제들은 항원에 대해 영항력있는 면역반응을 일으킬 수 있다. 보조제들은 막 단백질 항원들에 복합된 사포닌 (면역 자극 복합체), 무기 오일을 지닌 플루론 중합체, 소멸된 미코박테리아와 무기 오일, 프로인즈 완전 보조제, 지질 A 뿐만 아니라 뮤라밀 디펩티드(MDP) 리포폴리당류(LPS)와 같은 박테리아성 생성물, 및 리포좀을 포함한다.

효과적으로 체액 면역반응들(HIR)과 세포-매개된 면역질을 유도하기 위해, 면역원들은 보조제에서 유화된다. 많은 보조제들은 유독하고 육아종을 유도하고, 급성 및 만성 염증(프로인즈 완전 보조제, FCA), 세포용해 (사포닌과 플루론 중합체) 및 발열, 관절염 및 전포도막염(LPS와 MDP)이다. FCA가 우수한 보조제이고 조사에서 널리 사용되었음에도 불구하고, 그 독성으로 인애 사람과 수의용 백신으로 사용하는 것을 인가하지 않는다.

이상적인 보조제들의 바람직한 특성들은

(1) 독성의 결핍;

(2) 장시간 지속되는 면역 반응을 자극하는 능력;

(3) 제조의 단순성과 장기간 저장에서의 안정성;

(4) 요구된다면, 다양한 경로에 의해 주입된 항원에 CMI과 HIR을 유도하는 능력;

(5) 다른 보조제들과 상승작용;

(6) 항원발효세포(APC)의 개체군과 선태적으로 상호작용하는 성능;

(7) 적당한 T_H1 또는 T_H2 세포-특이 면역 반응들을 명확히 도출하는 능력; 및

(8) 항원에 대해 적당한 항체 동형 정도(예를들면, I_GA)를 선택적으로 증가시키는 능력.

여기서 참증으로서 제시된 1989년 8월 8일자로 Lockhoff et al에게 승인한 미합중국 제 4,855,283호는 N-글리코실아미드, N-글리코실우레아와 N-글리코실카르밤에이트를 포함하는 당지질 유사체들을 가리키며, 그 각각은 이뮤노-조절인자 또는 보조제로서 아미노산에 의해 당 잔기에서 대체된다. 그러므로, Lockhoff et al (1991)은 글리코스핀고리피드들과 글리코글리세록리피드들과 같은 천연적으로 발생하는 당지질에 구조적인 유사성을 표시하는 당지질 유사체들이 포진 단순 바이러스 백신과 위광견병 바이러스 백신과 같은 강한 면역반응을 유도할 수 있다. 다소의 당지질들은 아노머 탄소원자를 통해 당과 직접적으로 연결되는 긴 사슬-알킬아민과 지방산으로 무터 합성되어, 천연적으로 발생하는 지질 잔기들의 기능들을 모방한다.

본 양수인에게 양도되고 이에 참조로서 제시된 Moloney에게 승인한 미합중국 제 4,258,029호는 옥타데실 티로신 염산염(OTH)이 테타누스 톡소이드와 포르말린 불활성화된 타입 I, II와 III 회백수염 바이러스 백신과 혼합될 때, 옥타데실 티로신 염산염(OTH)이 보조제로서 작용하는 것을 가르킨다. 또한, Nixon-George et al (1990)은 재조합 B형 간염표면 항원과 복합된 방향성 아미노산의 옥타데실 에스테르가 B형 간염 바이러스에 대한 숙주면역 반응을 향상시켰다고 보고하였다.

합성 펩티드들의 지질화는 또한 이들의 면역원성을 증가시키기 위해 사용되었다. 그러므로, Wiesmuller (1989)는 Gram 음성 박테리아로부터 지방 단백질의 N-말단 부위의 합성 유사체인, 보조제 트리팔미틸-에스-글리세릴-시스테인일세릴세린에 연결된 아구창 바이러스성 단백질에 동족인 서열과 함께 펩티들를 설명한다. 더욱이, Deres et al (1989)는 지방 펩티드, N-팔미틸 -에스-[2,3-비스(팔미틸시)-(2RS)-프로필-[R]-시스테인(TPC)에 연결되어 인플렌쟈 바이러스 핵산 단백질로부터 유도된 변형된 합성 펩티드들로 이루어진 합성 지방펩티드 백신과 바이러스-르페시픽(lpecific) 세포파괴성 T 림포구들의 생체 외 기폭제를 보고하였다.

2. 면역검정들

본 발명의 트랜스페린 수용체, 그 유사체와 단편들 및/또는 펩티드들은 면역원으로서 효소-연결된 면역흡착 검정들(ELISA), RIAs및 다른 비-효소 연결된 항체 결합 검정들 또는 항-박테리아성, 헤모필루스, 및 TfR 및/또는 펩티드 항체들의 감지를 위하여 본 분야에서 알려진 공정들을 포함하는 면역검정들에서 항원들로서 유용하다. ELISA 검정들에서, TfR 단백질의 일부에 해당하는 트랜스페린 수용체, 유사체, 단편들 및/또는 펩티드들은, 예를들어 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 웰(Well)들과 같은 단백질들 또는 펩티드들을 결합할 수 있는 표면과 같은 선택된 표면위에 고정된다. 불완전하게 흡착된 트랜스페린 수용체, 유사체, 단편들 및/또는 펩티드들을 제거하기 위하여 세척한 후에, 시험 샘플에 대하여 항원적으로 중성으로 알려진, 소과의 혈청 알부민(BSA)의 용액과 같은 비특이성 단백질이 선택된 표면에 결합될 수 있다. 이것은 고정된 표면위의 비특이성 흡착 주위들을 블록킹하게 하여 표면위로의 항혈청의 비특이적인 결합들에 의하여 생기는 배경을 감소시킨다. 바람직하게, 선택된 펩티드들은 표 2 또는 3의 보존된 영역에 의거하여 하나의 특정한 박테리아성 종이 감지되지 않는다면 교차-종들 감지를 강화시킨다. 그 경우에, 폴리펩티드가 선택되고 이는 그 특정한 종들의 TfR에 유일한 것이다. 정상적으로, 펩티드들은 12 잔기들 및 그 이상, 바람직하게는 14 내지 30 잔기들의 범위내에 있다. 그러나, 펩티드들의 혼합물은 백신에서 항원으로서 또는 진단제로서 사용될 수 있다. 보존된 영역들 및/또는 비-보존된 영역들로부터의 펩티드들의 혼합물이 교차-종 보호 및/또는 진단을 제공하기 위해 사용되는 환경이 존재한다. 이 예시에서, 펩티드 면역원들의 혼합물은 보통 백신 또는 진단제로 사용하기 위한 "칵테일(cocktail)" 제조로 언급된다.

고정된 표면은, 임상적인 또는 생물학적인 물질들과 같은, 샘플들에 의하여 접촉되어 면역 복합체(항원/항체) 형성에 관련된 방식으로 시험된다. 이것은 BSA, 소과의 감마 글로블린 (BGG) 및/또는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)/Tween의 용액들과 같은 희석제들로 샘플을 희석하는 것을 포함한다. 그런 다음 샘플은 약 25℃ 내지 37℃ 오더와 같은 온도에서, 2 내지 4시간동안 배양되도록 한다. 배양후에, 샘플-접촉된 표면이 비-면역복합체 물질을 제거하기 위하여 세척된다. 세척 공정은, PBS/Tween 또는 보레이트 완충용액과 같은 용액으로 세척하는 것을 포함한다.

시험 샘플과 결합된 트랜스페린 수용체, 그 유사체와 단편들 및/또는 펩티드 사이의 특이한 면역복합체들의 형성, 계속적인 세척후예, 면역복합체 형성의 여부와 그 양이, 제 1항체에 대하여 특이성을 가지는 제 2항체를 접하게 함에 의하여 결정될 수 있다. 만약 시험 샘플이 사람 근원이라면, 제 2 항체는 사람의 이뮤노글로블린들과 일반적으로 IgG에 대하여 특이성을 가지는 항체이다. 감지 수단을 제공하기 위하여, 제 2항체는, 예를 들어 적당한 발색성 기질과 배양되었을 때 색을 띠는 효소적인 활성과 같은 관련된 활성을 가질 수 있다. 그런 다음, 정량적인 분석은, 예를 들어 가시적인 스펙트라 스펙트로포토미터를 사용하여 발색된 색의 정도를 측정함에 의하여 달성될 수 있다.

3. 하이브리드 형성 프로브들로서 서열들의 사용

트랜스페린 수용체 유전자의 서열을 가지는, 본 발명의 핵산 분자들은, 트랜스페린 수용체 유전자들을 지닌 어떠한 헤모필루스의 종들과 다른 박테리아로부터 트랜스페린 수용체 유전자들의 클로닝과 인식을 가능하게 한다.

본 발명의 트랜스페린 수용체 유전자들의 서열을 가지는 핵산 분자들은, 다른 TfR 유전자들의 상보적인 스트렛치들을 가지는 이중 분자들을 선택적으로 형성할 수 있는데 유용하다. 응용에 따라서, 다양한 하이브리드 형성 조건들이 다른 TfR 유전자들에 대한 다양한 프로브의 선택성의 정도를 달성하기 위하여 적용될 수 있다. 높은 정도의 선택성을 위하여, 50 내지 70℃에서 0.02M 내지 0.15M NaCl과 같은, 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건과 같은 상대적으로 엄격한 조건들이 이중체들을 형성하는데 사용된다. 여러 응용을 위해, 20 내지 55℃의 온도에서 0.15M 내지 0.9M 염과 같은, 덜 엄격한 조건들이 요구된다. 하이브리드 형성 조건들은 또한, 하이브리드 이중체를 불안정하게 하기 위하여, 증가된 양의 포르마미드의 첨가에 의하여 더욱 엄격해질 수 있다. 따라서, 특정한 하이브리드 형성 조건들이 용이하게 조작될 수 있으며, 일반적으로 원하는 결과들에 따른 선택방법의 문제이다. 일반적으로, 50% 포르마미드 존재하에서 편리한 하이브리드 형성 온도는 타겟 단편에 95 내지 100% 동종인 프로브에 대해 42℃, 90 내지 95% 동종성에 대해 37℃ 및 85 내지 90% 동종성에 32℃이다.

임상적인 진단의 실시예에서, 본 발명의 TfR 유전자들의 핵산 서열들은 하이브리드 형성을 결정하기 위하여, 레이블과 같은, 적당한 수단들과 함께 사용될 수 있다. 감지될 수 있는 신호를 제공할 수 있는, 방사능활성, 효소적인 또는 아비딘/바이오틴과 같은 리간드들을 포함하여 광범위한 적정한 지시 수단들이 본 분야에서 알려져 있다. 몇가지 진단적인 실시예들에서, 방사능활성의 꼬리표를 대신하여, 우레아제, 알칼린 포스파타아제 또는 퍼옥시다아제와 같은 효소 꼬리표가 사용될 수 있다. 효소적인 꼬리표들의 경우에는, TfR 유전자 서열들을 함유하는 샘플들과의 특이적인 하이브리드 형성을 감지하기 위한, 사람의 눈이나 스펙트로포토메타에 의하여 기시적인 수단을 제공하는데 사용될 수 있는 색상적인 지시약 기질들이 알려져 있다.

본 발명의 TfR 유전자들의 핵산 서열들은 용액 하이브리드 형성과 고체-상 공정들을 적용하는 실시예들에서 하이브리드 형성 프로브들로서 유용하다. 고체-상 공정들에 관련된 실시예들에서, 삼출액들, 체액들 (예를 들어, 혈청, 양막 용액, 중이 삼출액, 담, 기관지 세척액), 또는 심지어 조직들을 포함하는 임상적인 샘플들과 같은 샘플들로부터의 DNA(또는 RNA)시험이 선택된 매트릭스 또는 표면에 흡착되거나 또는 부착된다. 그런 다음, 고정된 단일-스트랜드의 핵산은 원하는 조건들하에서 본 발명의 TfR 유전자들 또는 그 단편들의 핵산 서열들을 포함하는 선택된 프로브과 특이적인 하이브리드 형성을 하게 된다. 선택된 조건들은, 예를 들어, G+C 함량들, 타겟 핵산의 타입, 핵산의 근원, 하이브리드 형성 프로브의 크기 등에 따라서 요구되는 특정한 조건들에 기초한 특별한 환경들에 달려 있다. 비-특이적으로 결합된 프로브 분자들을 제거하기 위하여 하이브리드 형성 표면을 세척한 후에, 특이적인 하이브리드 형성이 라벨에 의하여 감지되고, 심지어 정량화된다. 펩티드의 선택에서, 제 8, 9, 13 및 14도와 특히 표 2와 3에 표시된 보존된 펩티드 서열을 코딩하는 아미노산 서열들과 같은 헤모필루스의 종중에서 보존된 핵산 서열 일부를 선택하는 것이 선호된다. 선택된 프로브는 적어도 18 bp이고 30bp 내지 90bp 길이 범위내에 있을 수 있다.

4. 트랜스페린 수용체 유전자의 발현

레플리콘과 숙주 세포와 양립할 수 있는 종에서 유도된 제어 서열을 포함하는 플라스미드 벡터들은 시시템에서 트랜스페린 수용체 유전자의 발현을 위해 사용되어질 수 있다. 벡터는 변형 세포에서 표현형 선별을 제공하는 능력이 있는 서열을 제동할 뿐 아니라 보통 복제 부위를 운반한다. 예를 들어, E. coli은 암피실린과 테트라사이클린 저항 유전자를 포함하는 pBR322를 이용하여 변형될 수 있으며 변형 세포를 인지하는 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 혹은 다른 미생물 플라스미드 또는 파지(phage)는 그 자체의 단백질 발현을 위한 숙주 세포에 의해 이용될 수 있는 프로모터를 포함하거나, 또는 포함하도록 수정된다.

게다가, 레플리콘과 숙주와 양립할 수 있는 제어 서열을 포함하는 파지 벡터는 이런 숙주들과 관련해서 변형 벡터로서 이용될 수 있다. 예를들어, 람브다 GEM™-11은 E. coli LE392와 같은 숙주 세포를 변형하도록 이용되는 재조합 파지 벡터를 만드는 데 사용될 수 있다.

재조합 DNA 구조에 보통 사용되는 프로모터는 β-락타마제(페니실리나제)와 락토오스 프로모터 시스템 (Chang et al., 1978: Itakura et al., 1977 Goeddel at al., 1979; Goeddel et al., 1980)와 T7 프로모터 시스템(미합중국 특허 제 4,952,496호)과 같은 다른 미생물 프로모터를 포함한다. 프로모터의 뉴클레오티드 서열에 관한 세부사항들은 알려져 있으며, 숙련공이 그들을 유전자와 함께 기능적으로 결찰하는 것을 가능하게 한다. 사용된 특정한 프로모터는 일반적으로 원하던 결과에 따라 선택의 문제가 될 것이다. 트렌스페린 수용체 유전자, 단편 유사체 또는 변이형의 발현에 적합한 숙주들은 E. coli, 바실러스 종 혹은 헤모필루스, 균류, 이스트를 포함하고 아니면 바쿨로바이러스 발현 시스템이 사용될 수도 있다.

본 발명에 따르면, 단백질은 재조합 방법으로 만드는 것이 더 좋고, 특별히 헤모필루스 종의 배양으로부터 정제될 때 자연적으로 발생하는 TfR 단백질은 독성이 있는 물질이나 다른 오염물질의 미세한 양을 포함할 수도있다. 이 문제는 정제된 물질에서 오염물질을 최소화하려는 방법으로 숙주로부터 고립될 수 있는 이종성 시스템에서 재조합으로 생산되는 TfR 단백질을 사용하여 피할 수 있다. 이 점에 관해서 발현에 특별히 바람직한 숙주들은 LPS를 가지고 있지 않으므로 내독소를 면한 그램 양성 박테리아를 포함한다. 그런 숙주들은 바실루스 종들을 포함하고 비-발열물의 트렌스페린 수용체, 단편 또는 그 유사체의 생산에 특히 유용할 수 있다. 더욱이, 재조합 생산 방법은 Tpb1이나 Tbp2 또는 단편 제조를 허락하고 그것으로부터 서로 분리하여 헤모필루스에 내재된 정상적 복합 단백질과 구분된다.

생물학적 기탁들

여기에 설명된 주어진 헤모필루스 인플루엔쟈의 변형으로부터 트랜스페린 수용체를 코딩하는 적어도 한 일부를 포함하는 일정한 플라스미드는 부다페스트 조약에 의거하고 본 출원서의 출원에 우선하여 미합중국 메릴랜드의 록빌에 있는 미합중국형 타입 배양 수집소 (ATCC)에 기탁되어 있다. 기탁된 플라스미드의 견본들은 본 미합중국 특허 출원서에 기초한 특허의 승인되어 즉시 일반에게 이용되어질 수 있게 된다. 기탁된 실시예는 발명의 예시로서만 의도되었기 때문에 이에 설명되어 청구된 발명은 기탁된 플라스미드에 의한 범주에 한정되지 않는다. 본 출원서에 설명된 것처럼 유사한 또는 등가의 항원을 코딩하는 어느 등물이나 유사한 플라스미드는 발명의 범주내에 있다.

기탁 요약

헤모필루스의 계통들

Hib 변형 Eagan은 캐나다 M2R 3T4, 온타리오, 월로우데일, 스틸레스애버뉴 웨스트, 1755에 소재한 코노트래보러토리즈 리미티드로부터 입수가능하다.

Hib 변형 MinnA는 미주리주 63110 세인트 루이스의 워싱톤 의대 소아과, 미생물과 면역학부, Dr, Robert Munson의 소장품에서 얻을 수 있었다.

Hib 변형 DL63은 텍사스 75235-9048, 달라스, 불바르 해기 하이스 5323의 텍사스대 남서부 의학 센터, 미생물학부, Dr. Eric Hansen의 소장품에서 얻을 수 있었다.

PAK 12085는 Dr. Robert Munson(위의)의 소장품에서 얻을 수 있었다.

SB12, 29, 30, 32와 33은 St. Louis, Missouri 63104의 세인트 루이스대 의학 센터, 의과대학, 소아과, Dr. Stephen Barenkamp의 소장품에서 얻할 수 있었다.

Claims (34)

1. 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하는 박테리아 중에서 보존된 아미노산 서열을 지닌 헤모필루스 계통의 트랜스페린 수용체 단백질의 단편을 코딩하는 정제되고 분리된 핵산분자에 있어서,

   상기 보존된 아미노산 서열은 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통 Eagan에 대해 표 2와 3에서 나타낸 펩티드들의 아미노산 서열들 내에 포함된 아미노산 서열을 지니는 정제되고 분리된 핵산분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 보존된 아미노산 서열은 아미노산 서열 LEGGFYGP(서열번호:74) 또는 LEGGFYG(서열번호:85)을 지닌 것을 특징으로 하는 정제되고 분리된 핵산분자.
3. 헤모필루스 계통의 상기 트랜스페린 수용체 단백질 또는 단편을 코딩하고,

   (a) 헤모필루스 인플렌쟈에 대해 제 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11도(서열번호 : 1, 2, 3, 4, 105, 108, 110, 112, 114)에 설정된 DNA 서열들 중의 어느 하나; 또는

   (b) 헤모필루스 인플렌쟈에 대해 제 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11도(서열번호 : 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 106, 107, 109, 111, 113, 115)에 설정된 아미노산 서열들 중의 하나를 코딩하는 DNA서열을 특징으로 하는 정제되고 분리된 핵산분자.
4. 제3항에 있어서, 상기 헤모필루스 인플렌쟈 계통의 Tbp1 단백질만을 코딩하는 것을 특징으로 하는 정제되고 분리된 핵산분자.
5. 제3항에 있어서, 상기 헤모필루스 인플렌쟈 계통의 Tbp2 단백질만을 코딩하는 것을 특징으로 하는 정제되고 분리된 핵산분자.
6. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 청구된 핵산분자를 포함하는 숙주의 형질전환을 위하여 적응된 벡터.
7. 제6항에 있어서, 상기 벡터는 ATCC 기탁번호 75603을 지닌 플라스미드 DC-712-1-3 또는 ATCC 기탁번호 75607을 지닌 플라스미드 JB-1042-7-6의 식별(identifying) 특성들을 지닌 것을 특징으로 하는 벡터.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서 청구된 핵산분자와 헤모필루스 계통의 상기 트랜스페린 수용체 단백질의 숙주에 의한 발현을 위해 핵산 분자에 효과적으로 결합된 발현 수단을 포함하는 숙주의 형질전환을 위하여 적응된 발현 벡터.
9. 제8항에 있어서, 상기 핵산분자는 본질적으로 헤모필루스 계통의 모든 트랜스페린 수용체 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
10. 제8항에 있어서, 상기 발현벡터는 ATCC 기탁번호 75937을 지닌 플라스미드 JB-1424-2-8, ATCC 기탁번호 75935을 지닌 플라스미드 JB-1600-1 또는 ATCC 기탁번호 75936을 지닌 플라스미드 JB-1468-29의 식별(identifying) 특성들을 지닌 것을 특징으로 하는 발현벡터.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 청구된 핵산분자와 헤모필루스 계통의 상기 트랜스페린 수용체 단백질의 숙주에 의한 발현을 위해 핵산분자에 효과적으로 결합된 발현수단을 포함하는 형질전환숙주.
12. 제11항에 있어서, 숙주는 JB-1476-2-1, JB-1437-4-1과 JB-1607-1-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 형질전환숙주.
13. 제11항에 있어서, 숙주는 상기 발현벡터에 의해 유전적으로 형질 전환된 헤모필루스 계통인 것을 특징으로 하는 형질전환숙주.
14. 제11항에 있어서 청구된 형질전환숙주에 의해 생산가능한 재조합 트랜스페린 수용체 단백질 또는 단편.
15. 헤모필루스 계통의 Tbp2 단백질이 없는 헤모필루스의 계통의 분리되고 정제된 Tbp1 단백질.
16. 헤모필루스 계통의 Tbp1 단백질이 없는 헤모필루스의 계통의 분리되고 정제된 Tbp2 단백질.
17. 제15항에 있어서, 상기 헤모필루스의 계통은 헤모필루스 인플렌쟈인 것을 특징으로 Tbp1 단백질.
18. 제17항에 있어서, 상기 헤모필루스의 계통은 헤모필루스인플렌쟈 타입 b 계통 또는 비-타입 헤모필루스 인플렌쟈인 것을 특징으로 하는 Tbp1 단백질.
19. 6 이상의 아미노산과 150 미만의 아미노산을 지니고 헤모필루스의 계통의 트랜스페린 수용체 단백질의 부분만에 해당하는 아미노산서열을 포함하며,

    상기 헤모필루스계통은 DL63, MinnA, Eagan 및 다른 타입 b 계통들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b 계통이고 상기 트랜스페린 수용체 단백질은 제 3, 4 및 5도 (서열번호: 5, 6, 7, 8, 9, 10)에 제시된 서열들로부터 선택된 아미노산서열 또는 다른 타입 b 계통 또는 PAK12085, SB12, SB29, SB32, SB33 및 다른 비-타입 계통들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비-타입 헤모필루스 인블렌쟈 계통들에 대한 해당 아미노산서열들을 지니며, 상기 트랜스페린 수용체 단백질은 제 6, 7, 8, 9, 10 및 11도(서열번호 : 106, 107, 109, 111, 113, 115)에 제시된 서열들로부터 선택된 아미노산서열과 다른 비-타입 계통들에 대한 해당 아미노산서열을 포함하는 펩티드.
20. 6 이상의 아미노산과 150 미만의 아미노산을 지니고 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하는 박테리아 중에서 보존되고 LEGGFYGP (서열번호 74) 또는 LEGGFYG (서열번호 : 85)인 아미노산 서열을 지닌 펩티드.
21. 6 이상의 아미노산과 150 미만의 아미노산을 지니고 헤모필루스 인플렌쟈 타입 b의 Eagan 계통과 헤모필루스 인플렌쟈의 다른 계통들의 해당 아미노산 서열들에 대해 표 2와 3에서 나타낸 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 지닌 펩티드.
22. 면역원적 조성물에 있어서,

    (A) 헤모필루스의 계통의 트랜스페린 수용체 단백질 또는 단편을 코딩하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서 청구된 정제되고 분리된 핵산분자;

    (B) 제14항에서 청구된 재조합 트랜스페린 수용체 단백질 또는 단편;

    (C) 헤모필루스 계통의 Tbp2 단백질이 없는 헤모필루스 계통의 분리되고 정제된 Tbp1 단백질;

    (D) 헤모필루스 계통의 Tbp1 단백질이 없는 헤모필루스의 계통의 분리되고 정제된 Tbp2 단백질;

    (E) 제19항, 제20항 또는 제21항에서 청구된 펩티드; 및

    (F) (A)의 핵산분자를 함유한 벡터를 포함하며, 숙주에 트랜스페린 수용체를 전달하기 위한 생(live)벡터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 활성성분; 및

    숙주로 주입될 때 상기 적어도 하나의 활성 성분이 면역 반응을 일으키게 하기 위한 약학적으로 받아들일 수 있는 캐리어를 포함하는 면역원적조성물.
23. 제22항에 있어서, 트랜스페린 수용체들을 생성하는 박테리아성 병원균들로 인해 초래된 질병들로부터 보호하기 위해 생체 내 주입을 위한 백신으로 처방된 것을 특징으로 하는 면역원적조성물.
24. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 청구된 핵산분자를 포함하는 벡터로 구성되며, 숙주에게 트랜스페린 수용체 단백질을 전달하기 위한 생벡터.
25. 제24항에 있어서, 상기 벡터는 살모렐라, BCG, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생벡터.
26. 제24항에 있어서, 상기 벡터는 폴리오바이러스이고 핵산분자는 LEGGFYGP (서열번호 : 74) 또는 LEGGFYG (서열번호 : 85)의 아미노산서열을 지닌 트랜스페린 수용체의 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 생벡터.
27. ATCC 기탁번호 75931를 지닌 pT7TBP2A, ATCC 기탁번호 75932를 지닌 pT7TBP2B, ATCC 기탁번호 75933을 지닌 pT7TBP2C 또는 ATCC 기탁번호 75934를 지닌 pT7TBP2D의 식별 특성들을 지닌 플라스미드벡터.
28. 제24항에 있어서, 상기 백터는 트랜스페린 수용체 단백질을 생성하지않는 약화된 헤모필루스 계통인 것을 특징으로 하는 생벡터.
29. 헤모필루스 계통의 분리되고 정제된 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 생성하는 방법에 있어서,

    (a) 봉입체들에서 양쪽이 아닌 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 발현하는 재조합숙주를 제공하는 단계;

    (b) 세포 덩어리(mass)를 제공하기 위해 상기 숙주를 성장시키는 단계;

    (c) 세포 용해질(lysate)을 제공하기 위해 세포덩어리를 분열시키는 단계;

    (d) 실질적으로 대부분의 용해성 숙주 단백질들을 포함하는 제 1 상층액(supernatant)과 제 1 덩어리(pellet)를 제공하기 위해 세포용해질을 분류(分溜)하는 단계;

    (e) 상기 제 1 덩어리로부터 상기 제 1 상층액을 분리하는 단계;

    (f) 모든 용해성 숙주 단백질들과 그로부터의 숙주막 단백질들을 실질적으로 제거하기 위해 제 1 덩어리를 선택적으로 추출하여 제 2 상층액과 봉입체를 포함하는 추출된 덩어리를 제공하는 단계;

    (g) 상기 추출된 덩어리로부터 제 2 상층액을 분리하는 단계;

    (h) 용해된 추출물을 제공하기 위해서 추출된 덩어리를 용해화하는 단계; 및

    (i) 단편(fraction)을 함유하는 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 제공하기 위해 용해화된 추출물을 분류하는 단계들로 구성되는 것을 특징으로 하는 헤모필루스 계통의 분리되고 정제된 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 생성하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 세포용해질은 원심분리에 의해 분류됨을 특징으로 하는 방법.
31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 제 1 덩어리로부터 선택적으로 분리하는 단계는 적어도 하나의 세정제 추출을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 용해화된 추출물은 겔 필트레이션(filtration)에 의해 분류되어 단편을 지닌 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 적어도 상기 세정제를 제거하기 위해 단편을 함유한 Tbp1 또는 Tbp2 단백질을 연속하여 투석하여 Tbp1 또는 Tbp2 단백질의 더 정제된 수용액을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제29항, 제30항 또는 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤모필루스의 계통은 헤모필루스 인플렌쟈의 계통임을 특징으로 하는 방법.