KR100271888B1

KR100271888B1 - 모락셀라 카타랄리스의 유용한 항원과 관련된 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR100271888B1
Application number: KR1019940700431A
Authority: KR
Inventors: 제이.한센 에릭; 헬미넨 머자; 마치버 이소벨
Original assignee: 파라비 레이; 보드 오브 리전츠 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
Priority date: 1991-08-15
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 2000-11-15
Also published as: DE69212495T2; DE69212495D1; CA2115565C; EP0612250B1; WO1993003761A1; FI940681A; AU666329B2; DK0612250T3; FI106844B; EP0612250A1; US5599693A; US5759813A; FI940681A0; JPH07501210A; ES2092696T3; NO20002413D0; NO20002413L; NO308413B1; NO940502L; GR3021423T3

Abstract

본 발명은 다양한 유용한 특성을 지니는 것으로 발견된 모락셀라 카타랄리스의 외막으로부터 수득된 선택된 항원성 단백질에 관한 것이다. OMPs(“외막 단백질”)이란 명칭의 이들 단백질은 분자량이 각각 약 30kD, 80kD 및 약 200 내지 700kD로서 특징화된다. 상술된 연구는 이들 단백질에 대해 관련된 모노클로날 항체는 동물 모델에서 모락셀라 카타랄리스에 의한 감염에 대해 보호 효과를 준다는 것을 입증하며, 수동 면역을 부여할 경우 이러한 항체의 강력한 유용성 및 백신 제조에서 이들 OMPs, 또는 이의 변형체의 강력한 유용성을 입증한다. 또한 이들 OMPs를 암호화하는 DNA 단편, 재조합 DNA 기술을 적용하여 항원, 또는 변형체의 제조방법, 진단법 및 양태를 기술한다.

Description

[발명의 명칭]

모락셀라 카타랄리스의 유용한 항원과 관련된 방법 및 조성물

[발명의 배경]

[발명의 분야]

본 발명은 일반적으로 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis)-관련 질환의 치료시 사용하기 위한 백신 또는 보호성 항체의 제조와 같이, 본 발명자들이 면역치료요법시 유용한 목적물인 것으로 밝혀낸 모락셀라 카타랄리스의 다양한 외막 단백질(OMP)에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 SDS- 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정한 것으로서, 분자량이 각각 약 30kD 및 80kD인 것으로 확인된 항원 및 “고분자량 단백질” 또는 “HMWP”로 지칭되는 분자량이 약 200 내지 700kD인 제3의 항원에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 이들 항원을 암호화하는 재조합 클론, 이로부터 유도된 항원 단편, 이의 등가물 및 이러한 종류와 반응하는 항체에 관한 것이다. 더우기, 본 발명은 모락셀라 카타랄리스 항원 및 항체의 검출 방법, 및 모락셀라 카타랄리스 감염에 대한 수동 및 능동 면역 모두에 있어서 특정 항원 및 항체의 용도에 관한 것이다.

[관련 기술의 설명]

모락셀라 카타랄리스[이전에는 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis) 또는 나이세리아 카타랄리스(Neisseria catarrhalis)로 공지됨]는 이전에는 기도 상부의 무해한 부패균으로 간주되어 왔다. 그러나, 지난 10년간 이 유기체는 중요한 사람 병원균인 것으로 밝혀졌다. 사실, 최근의 연구에서 이러한 그람-음성 쌍구균은 다수의 사람 감염을 유발시킨다는 것이 확증되었다[참조 : Murphy, 1989]. 예를 들어, 모락셀라 카타랄리스는 중이염, 급성 상악 부비강염 뿐만 아니라 기도 하부의 일반적인 감염의 유발원이다[참조: Murphy et al., 1989]. 모락셀라 카타랄리스 감염에 따른 중이염 및 부비강염의 발병이 증가하고 있으며, 이 균이 제3의 가장 흔한 원인성 유기체임을 확증하는 연구들이 보고되었다. 사실상, 간호를 받는 유아 및 어린이에게 가장 흔한 질환으로 중이염임이 보고 되어 있다(참조: Consensus, 1989).

상술한 “컨센서스(Consensus)” 보고에서는, 유아 및 어린이 뿐만 아니라 모든 연령 그룹의 특정 집단에서 중이염이 발병되므로 중이염의 방지가 중요한 보건 목표라고 결론짓고 있다. 사실상, 중이염에 대한 총 재정적 부담금은 매년 25억 이상, 또는 대략 보건 예산의 3%인 것으로 평가되었다. 다수의 원인으로 인한 질환의 예방에 있어서 가장 바람직한 시도로서 백신이 동정되어 왔다. 예를 들어, 백신으로 중이염의 발병을 30%로 감소시킬 수 있다면, 이 지출액은 매년 보건 비용을 400만 달러 이상 절약할 수 있을 것으로 평가되었다. 그러나, 3종의 일반적인 중이염 병원체중의 2종, 즉 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococus pneumoniae) 및 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)에 대한 백신 개발이 진전되어 왔다 해도, 모락셀라 카타랄리스에 대해서는 유사한 진전은 이루어지지 않았다. 특히, 모락셀라 카타랄리스가 전체 중이염 감염중 대략 17 내지 20%에 대해 관측된다는 점에서 특히 문제가 된다[참조: Murphy, 1989].

감염에 대한 사람 면역 반응의 매우 중요한 표적물로서 사용하는 모락셀라 카타랄리스 항원을 동정하고 특성화하기 위한 시도가 이미 이루어져 왔다[참조 : Murphy, 1989; Goldblatt et al., 1990; Murphy et al., 1990], 일반적으로, 모락셀라 카타랄리스의 표면은 외막 단백질(OMP), 리포올리고-사카라이드(LOS) 및 핌브리아에(fimbriae)로 이루어져 있다. 머피(Murphy)의 지적에 따르면, 모락셀라 카타랄리스는, 세포 엔벨로프(envelope)의 세제 분획화 방법으로 유기체의 외막을 분리하는 경우 그 결과가 일정하게 얻어지지 않아 성공적이지 않음이 입증되었으므로, 다른 그람-음성 세균과는 다소 구별되는 것으로 여겨진다. 더우기, 제제가 세포질막으로 오염되는 것으로 밝혀졌으며 이는 모락셀라 카타랄리스 세포의 엔벨로프의 독특한 특성을 제시하는 것이다.

그러나, 당 분야의 연구자들은 7개 또는 8개의 주요 OMP 종의 존재를 입증하였으며, 이것은 시험한 균주의 큰 다양성에도 불구하고, 모락셀라 카타랄리스 균주에서 매우 일치되는 것으로 보인다. 예를 들어, 캄파그나리 등(Campagnari et al.)은 분자량 98kD의 밴드(OMP-A)로부터 시작하여 분자량 약 21kD의 밴드(OMP-A)로 진행되는 문자 A 내지 H의 OMP를 동정하였다[참조 : Campagnari et al., 1987].

모락셀라 카타랄리스의 LOS도 또한 백신 개발에 있어 가능한 표적물로서 제시되어 왔다. LOS는 모락셀라 카타랄리스 균주로부터 분리되었으며, SDS-PAGE 및 은 염색에 적용시켰다[참조: Murphy, 1989]. 하나의 균주를 제외한 모든 균주는 LOS 염색 양상이 동일한 것으로 보고되었다. 따라서, 모락셀라 카타랄리스의 LOS는 항원 보존성이 매우 높아 백신 성분으로서 LOS 분자 부분의 사용 가능성을 제시하였다.

최근들어, 핌브리아에가 가능한 백신 후보물질인 것으로 제시되었다. 핌브리아에는 명백히 일부 세균에 있어서 점막 부분의 부착 및 콜로니화에서 역활을 담당한다. 당 분야의 연구자들은, 항원적으로 보존된 에피토프가 핌브리아에상에서 발현되어 동정될 경우, 이와 같은 에피토프에 대한 항체는 치료학적으로 유용하거나 이와 같은 에피토프는 백신 성분으로서 사용할 수 있다고 추정하였다.

불행히도, 모락셀라 카타랄리스 세포의 다양한 부성분이 백신 후보물질에 대한 조사를 개시하기 위한 여지를 제시하였다해도, 아직까지 이와 같은 후보물질이 동정되지는 않았다. 명백히, 보호성 항체를 유발하는 것으로 밝혀진 항원성 에피토프 또는 에피토프들이 없었다. 따라서, 명백히 백신과 같은 능동 및 수동적인 면역치료제 모두의 제조시 사용가능한 유용한 항원으로서 재공될 수 있는 모락셀라 카타랄리스 성분을 동정할 필요성이 있다. 또한, 이와 같은 항원 또는 항원들이 동정된다면, 이러한 백신 제조를 가능케 하는 방법 및 조성물 및 치료시 이들을 광범위하게 사용 가능케 하는 양을 제공할 필요가 있다.

[발명의 요약]

따라서, 일반적이고 광범위한 의미로서, 본 발명은 질환을 방지하고 진단하는데 모두 사용되는 모락셀라 카타랄리스 항원종을 동정하고 제조하는 것에 관한 것이다. 더욱 특정하게는, 본 발명은 30kD, 80kD 및 HMWP OMP 항원을 포함한 특정 모락셀라 카타랄리스 OMP 항원이 백신 개발에 특별히 이용된다는 본 발명자들의 놀라운 발견에 관한 것이다. 본 발명자들은, 이러한 항원이 백신의 성분으로서 직접 사용될 수 있거나 서열 분석을 통하여 상응하는 항원 또는 등가 항원의 제조시 사용될 수 있다고 간주하였다.

이러한 OMP 항원에 대한 본 발명자들의 연구에서, 30kD 및 HMWP의 2 가지의 OMP 종에 대해 지시된 항체가 모락셀라 카타랄리스 아종 및 분리물과 광범위하게 반응하는 것으로 나타났기 때문에, 본 발명자들은 30kD 및 HMWP 종이 가장 유용한 것으로 입증될 것이라 생각하였다. 그러나, 80kD 종에 대한 항체는 아직 모든 아종과 반응하는 것으로 밝혀진 바 없으므로, 범-반응성(pan-reactive)이 아니다. 따라서, 본 발명의 특히 바람직한 양태는 30kD 및 HMWP OMP 항원, 이러한 항원 및 관련된 종을 암호화하는 DNA 단편, 이러한 항원 종을 인지하는 항체에 관한 것이다.

특정 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 엠.카타랄리스 OMP 항원과 면역학적으로 교차- 반응성인 에피토프를 삽입하고 있는 정제된 단백질 또는 펩타이드 항원을 함유하는 항원 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 정제된 단백질 또는 펩타이드 항원이 OMP 자체를 포함하는 한, 본 발명은 이러한 OMP 항원의 변이체, 관련된 항원성 에피토프를 삽입한 펩타이드 및 이들 각각의 항원성 작용 등가물을 제조하는데 이용될 수 있는 기술을 제공한다. 더우기, 본 발명에서는 다양한 OMP 항원을 암호화하는 DNA 분절을 기술하고 있으며, 이때 항원은 재조합 기술의 적용을 통하여 다른 엠. 카타랄리스 항원으로부터의 항원성 에피토프가 본질적으로 제거된 채로 제공될 수 있다. 즉, 엠. 카타랄리스 또는 관련된 종 이외의 숙주 세포를 사용하는 재조합 발현 수단에 의해서 항원을 제조할 수 있으므로, 다른 엠. 카타랄리스 항원이 없는 본질적으로 순수한 항원성 상태로서의 항원을 제공할 수 있다. 따라서, 이와 같은 제제는 LOS 또는 핌브리아에 항원과 같은 물질이 함유되지 않는다.

또다른 양태에서는, 표준 DNA 서열분석 기술을 이용하여, 본원에 기술된 DNA 분절을 서열분석할 수 있으며, 이러한 DNA 서열로부터 선택된 OMP 단백질의 기초가 되는 아미노산 서열이 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP 종인지의 여부를 결정할 수 있다. 일단 이러한 정보가 입수되는 경우, 적합한 항원성 에피토프는 예를 들면 당해 분야의 숙련가에게 이용되고 있는 이와 같은 에피토프의 예측용 소프트웨어 프로그램을 사용해서 비교적 용이하게 동정된다. 이어서 이러한 “에피토프성 코어 서열(epitopic core sequence)”의 아미노산 서열은 펩타이드 합성 또는 재조합 기술을 적용시킴으로써 보다 짧은 펩타이드로 용이하게 구성할 수 있다.

바람직한 펩타이드의 길이는 일반적으로 15 내지 50개 아미노산, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 30개 아미노산이다. 선택된 OMP의 에피토프를 삽입하고 있는 보다 짧은 항원성 펩타이드가 특정 상황, 예를 들면 백신의 제조 또는 면역학적 검출 검정시 유리하다고 제시되었다. 이러한 장점에는 재조합체 생성에 의해 제조된 단백질과 흔히 연관된 오염 및 순도 문제를 극복하는 능력이 포함되며, 이러한 길이의 펩타이드는 펩타이드 합성기를 사용하는 합성 수단에 의해 용이하게 제조할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 정제된 단백질 또는 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP와 면역학적으로 교차-반응성인 에피토프를 삽입하고 있는 펩타이드 항원을 함유하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일반적인 의미에서, 이 방법은 우선 이와 같은 단백질 또는 펩타이드 항원을 발현할 수 있는 세포를 선별하고, 항원을 발현시키기에 효과적인 조건하에서 세포를 배양하여, 항원을 수집함으로써 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. OMP 항원 자체를 제조하고자 하는 경우에, 제1단계로서 엠. 카타랄리스 세포를 단순히 배양하고자 할 것이다. 이 경우, 항원은 발현 후, 세포의 외막 분획내에 제공될 것이다. 이어서, 막 분획을 제조한 후, 이은성 또는 비-이온성 세제를 사용하여 제조된 막으로부터 항원을 용해 및 추출함으로써 항원을 제조한다. 추가의 정제는 컬럼 분획화, 등전점 포커싱 등, 또는 OMP-지시된 항체를 사용하는 면역 흡착을 포함하는 다양한 방법으로 달성할 수 있다.

물론, 본원 기술 내용에 비추어 볼 때, 재조합체 숙주 세포내에서 항원을 암호화하는 재조합체 DNA 분절을 발현시킴을 포함하여 목적하는 항원을 제조하기 위한 더욱 바람직한 양태를 선택할 수도 있다. 본 발명에 따른 항원의 발현용으로 바람직한 재조합체 숙주 세포는, 항원이 세균성 항원인 세균 숙주 세포가 대표적이다. 바람직한 세균 숙주 세포에는 이.콜라이, 에이취. 인플루엔자에(H. influenzae), 살모넬라 종(Salmonella speices), 마이코박테리움 종(Mycobacterium species), 또는 심지어는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포가 포함된다. 물론, 바람직하게는 또한 진핵 세포내에서도 목적한 항원 또는 항원들을 발현시킬 수 있다.

상기 제시한 바와 같이, 특수한 양태로서, 본 발명은 목적 단백질 또는 펩타이드 항원을 암호화하는 DNA 분절에 관한 것이다. 본원에서는 천연적으로 존재하는 상태에서의 분절과 비교시 정제된 상태로서의 분절을 수득하기 위한 방법을 기술하고 있다. 이 DNA분절은 다수의 장점 및 이용을 갖는다. 예를 들어, 전체 OMP 유전자를 암호화하는 분절을 재조합체 숙주 세포로 삽입하고 전체 단백질 항원을 발현시키는데 사용할 수 있다. 또한, 유전 공학 기술을 적용하여, 선택된 OMP 유전자의 아부위 또는 유도체를 사용함으로써 목적한 항원성 에피토프를 삽입하고 있는 보다 짧은 펩타이드 서열을 제조할 수 있다. 더우기, 부위-지시된 돌연변이 유발 기술을 적용시킴으로써, 예를 들어 에피토프성 코어 서열의 항원성이 증진되도록 암호화 서열을 변경시키기 위해 본 발명의 DNA 분절을 재조작하여 항원적으로 작용적 등가인 펩타이드를 제조할 수 있다. 물론, 경우에 따라서, 예를 들면 항원 암호화 영역이 동일한 발현 단위내에, 예를들어 면역 검출 목적용으로의 다른 바람직한 항원 또는 단백질 또는 목적하는 작용을 지닌 펩타이드(예: 효소 표지 암호화 영역)과 함께 배열되어 있는, 융합 단백질을 또한 제조할 수 있다.

사용된 숙주 시스템에 따라, 본 발명의 DNA 분절을 예를 들어 숙주 세포의 형질 감염 효율성을 증진시킬 수 있는 적절한 벡터내로 삽입시키는 경우, 특히 유리할 수 있다. 세균 숙주 세포를 사용하는 경우에는, 사실상 선택한 숙주 세포에 대해 적절한 것으로 당해 분야에 공지된 어떠한 벡터도 사용가능하다. 따라서, 이 콜라이의 경우에는, pBR322와 같은 플라즈미드 벡터, 또는 λGEM-11과 같은 박테리오파아지의 사용이 특히 유리할 수 있다. 기타 특수한 예는 이후에 기술한다.

적절하게 형질감염된 세포가 선택되는 재조합체 클론 뱅크의 제조시, 일반적으로 선택된 OMP 유전자 서열의 발현은 자체의 고유한 프로모터 서열을 지닌 벡터를 사용하지 않고도 이와 같은 숙주내에서 달성될 수 있을 것이다. 이것은 클론뱅크 제조에 사용된 게놈성 엠. 카타랄리스 DNA 단편이 다양한 암호화 서열과 연관된 내인성 프로모터를 포함할 것이기 때문이다. 그러나, 본 발명자들은 본 발명의 항원-암호화 단편의 프로모터 영역을 재-조작하여 이종의 프로모터를 도입함이 매우 바람직할 수 있음을 제시하고 있다. 이 공정은 엠, 카타랄리스 세포에 의한 천연의 발현과 비교하여 OMP 항원을 과발현하도록 할 수 있다.

본 발명의 핵산 분절은 항원성 펩타이드 또는 단백질의 발현과 관련하여 다른 무엇보다도 많은 용도를 지닐 것으로 간주된다. 예를 들어, OMP 유전자 서열의 영역을 삽입하고 있는 길이가 14개 이상의 뉴클레오타이드를 지닌 핵산 분절은 선택된 샘플내에서 엠. 카타랄리스 서열을 검출하거나 예를 들면 상응하거나 관련된 서열을 포함하는 클론을 동정하기 위해 클론 뱅크를 선별하는데 선택적인 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다. 더우기, 짧은 분절은 예를들면 클로닝 및 공학적인 조작을 포함하는 다수의 적용시 또는 PCR-기준한 검출 프로토콜에서 사용하기 위해 PCR 기술과 관련하여 핵산 프라이머로서 사용될 수 있다.

또다른 양태에서, 본 발명은 OMP 항원의 에피토프와 면역 복합작용할 수 있는 항체의 제조에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항체를 제조하기 위한 특정 기술은 후술한다. 그러나, 본 발명자들은 항체의 제조를 위해 일반적으로 당해 분야에서 공지되어 있는 어떠한 현 기술도 모노클로날 또는 폴리클로날 기술의 적용을 통하여 이용할 수 있음을 제시한다 상기 주목한 바와 같이, 본 발명의 놀라운 측면은, 30kD, 80kD 및 HMWP OMP 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체가 동물 모델내에서 엠. 카타랄리스 챌린지(challenge)에 대해 보호 효과를 제공한다는 발견을 포함한다. 이러한 놀라운 발견은 상기 항체가 수동 면역 치료요법과 관련하여 사용하기 위한 조성물의 제조시 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 또한 이러한 OMP 항원의 에피토프가 백신 조성물의 제조시 사용될 수 있음을 밝힌다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 항원 또는 이와 같은 항원에 대한 항체와 함께 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 보조제를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

또다른 양태에서, 본 발명은 면역 검출 방법 및 연관된 키트에 관한 것이다. 본 발명의 항원을 이와 반응성을 지닌 항체를 검출하는데 사용하거나, 달리는 본 발명에 따라서 제조한 항체를 항원을 검출하는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 이들 방법은 우선 이러한 항원 또는 항체를 함유하는 것으로 추측되는 샘플을 수득하고, 이 샘플을 항체가 검출될 항원 또는 항체와 면역복합체를 형성하기에 충분한 조건하에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항원과 접촉시키며, 면역복합제의 형성을 검출함으로써 샘플내 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함할 것이다.

일반적으로, 면역복합제 형성의 검출은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 다수의 접근을 적용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 ELISA, RIA, 면역블롯, 도트블롯, 간접적인 면역형광 기술 등의 적용을 고려한다. 일반적으로, 면역 복합체 형성은 방사선 표지물 또는 효소 택(tag)[예: 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제 등)와 같은 표지물을 사용함으로써 검출할 수 있다. 물론, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 제2의 항체와 같은 제2의 결합 리간드 또는 바이오틴/아비딘 리간드 결합 배열의 사용이 더욱 유리할 수 있다.

진단 목적을 위해서, 실질적으로 검출하려는 항원 또는 항체를 포함하는 것으로 추측되는 어떠한 샘플도 사용할 수 있다. 혈액 또는 혈청 샘플, 귀 면봉 물질, 객담 샘플, 중이액 또는 심지어 뇨 샘플과 같은 환자로부터 입수한 임상적 샘플을 포함하는 일례의 샘플들이 사용될 수 있다. 더우기, 이와 같은 양태는 하이브리도마 선별시 항원 또는 항체 샘플의 적정에서와 같이 비-임상적인 샘플에 적용시킬 수 있다.

관련된 양태로서, 본 발명은 샘플중의 항원 및/또는 항체의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 키트의 제조를 고려한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 키트는 적합한 OMP 항원(예: 30kD, 80kD 또는 HMWP 종, 또는 이러한 종 하나 이상에 상응하는 에피토프를 함유하는 단백질), 또는 이와 같은 항원에 대해 지시된 항체와 함께, 면역검출 시약, 및 항체 또는 항원 및 시약을 보유하는 수단을 포함할 것이다. 면역검출 시약은 통상적으로 항체 또는 항원과 관련된 표지물, 또는 제2의 결합 리간드와 관련된 표지물을 포함할 것이다. 리간드의 예에는 제1항체 또는 항원에 대해 지시된 제2항체 또는 관련된 표지물을 지닌 바이오틴 또는 아비딘(또는 스트렙토아미딘) 리간드가 포함된다. 물론, 상기 제시한 바와 같이, 표지물의 다수 예가 당해 분야에 공지되어 있으며 이와 같은 모든 표지물이 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다.

용기 수단은 일반적으로 항체, 항원 또는 검출 시약이 놓일 수 있는, 바람직 하게는 적절하게 분취될 수 있는 바이알을 포함한다. 본 발명의 키트는 또한 통상적으로 상업적 시판을 위해 밀폐되어 있는 항체, 항원, 및 시약 용기를 포함하기 위한 수단을 포함한다. 이와 같은 용기는 내부에 목적 바이알이 보유되어 있는 사출 또는 취입-성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 80kD OMP를 인지하는 모노클로날 항체 10F3을 프로브로서 사용하는 엠. 카타랄리스 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. A 레인은 레인보우(Rainbow) 단백질 분자량 마커(분자량 14.3 내지 200kD, Amersham 제조원)이고; B 레인은 4B1/pBR322/RR1(여기서 4B1은 모노클로날 항체 4B1에 의해 인지되는 비관련된 단백질을 암호화 하는 엠. 카타랄리스 유전자이다)의 전체 세포 용해질을 포함하는 음성 대조군이며; C 및 D 레인은 10F3/pBR322/RR1의 전체 세포 용해질이고; E 레인은 블랭크 대조군(blank control)이다.

제2도는 Mab 10F3-반응성 80kD 항원을 암호화하는 분절을 포함하는, pMEH 120의 예비적 제한 지도를 도시한 것이다.

제3도는 Mab 17C7-반응성 HMWP 항원을 암호화하는 분절을 포함하는, 파아지 MEH 200의 예비적 제한 지도를 도시한 것이다.

제4도는 30kD OMP를 인지하는 모노클로날 항체 8B6을 프로브로서 사용하는 엠. 카타랄리스 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. A 레인은 레인보우 단백질 분자량 마커(분자량 14.3 내지 200kD, Amersham 제조원)이고; 레인 B는 예비 염색된 SDS-PAGE-표준물[저 분자량; 분자량 16 내지 110kD, Bio- Rad 제조원)이며; C 레인은 30kD OMP를 발현하는 재조항체 이. 콜라이의 파아지 용해질로부터의 단백질(LE392/8B6)을 함유하고; 레인 D는 블랭크 대조군이며; 레인 E는 음성 대조군(HMWP OMP를 발현하는 재조합체 이. 콜라이로부터의 파아지 용해질, LE392/17C7)이고; F 레인은 양성 대조군(엠. 카타랄리스 035E 외막 소포)이다.

제5도는 HMWP OMP를 인지하는, 모노클로날 항체 17C7을 프로브로서 사용하는 엠. 카타랄리스 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. A 레인은 레인보우 단백질 분자량 마커 (분자량 14.3 내지 200kD, Amersham 제조원)이고; 레인 B는 예비 염색된 SDS-PAGE-표준물(저 분자량; 분자량 16 내지 110kD, Bio- Rad 제조원)이며; C, D 및 E 레인은 HMWP OMP를 발현하는 재조합체 이. 콜라이의 파아지 용해질로부터의 단백질(LE392/17C7)을 함유하고; F 레인은 블랭크 대조군이며; H 레인은 음성 대조군(30kD OMP를 발현하는 재조합체 이. 콜라이로부터의 파아지 용해질, 이. 콜라이/8B6 파아지 용해질)이며: G 레인은 양성 대조군(엠. 카타랄리스 035E 외막 소포)이다.

[바람직한 양태의 상세한 기술]

본 발명은 예를 들어, 진단제 및 치료제의 제조시, 특히 유용한 특성을 지닌 것으로 밝혀진 모락셀라 카타랄리스의 특정 외막 단백질(OMP)의 발명자적 동정에 관한 것이다. 이 단백질은 천연 상태에서 세포 표면에 노출된 것으로 여겨지며, SDS-PAGE시 각각의 분자량은 약 30kD, 80kD 및 약 200 내지 700kD를 나타낸다. 특정 양태는 이들 단백질, 항원성 아분획(subfragment), 변이체 등을 암호화하는 서열의 재조합체 클로닝에 관한 것이다. 본 발명은 또한 뮤린 모델 시스템을 사용하는 폐 정화도(clearance) 연구에서 입증된 바와 같이, 국소화된 폐 감염시 존재하는 감염성의 엠. 카타랄리스 세균의 수를 감소시키는 것으로 밝혀진, 엠. 카타랄리스 OMP에 대한 모노클로날 항체에 관한 것이다.

하나 이상의 선택된 OMP를 발현하며, 정제된 OMP 항원 및 돌연변이체 또는 변이체 단백질 종을 상당한 양으로 제조하는데 사용될 수 있는, 재조합체 클론이 본 발명의 영역에 포함된다. 선택된 OMP 항원 및 이의 변이체는 엠. 카타랄리스 감염을 진단하고 치료하는데 상당히 유용한 것으로 기대된다. 예를 들어, 이러한 OMP 항원 또는 펩타이드 변이체는 엠. 카타랄리스를 검출하기 위한 면역검정시 사용되거나 엠. 카타랄리스 감염을 치료하기 위한 백신으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 더욱 특수한 일면을 수행하는데 있어서 숙련가를 보조하기 위하여, 각각 30kD, 80kD 및 HMWP OMP 항원을 암호화하는 DNA 분절을 지닌 재조합체 클론을, 부다페스트 조약하에서 1992년 8월 4일에 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(American Type Culture Collection. ATCC)에 기탁하였다. 특히, 30kD OMP 항원을 암호화하는 분절을 지닌 플라즈미드 pMEH 300(ATCC 기탁 번호 제69043호); 80kD OMP 항원을 암호화하는 분절을 지닌 플라즈미드 pMEH 120(ATCC 기탁 번호 제75285호); 및 HMWP OMP 항원을 암호화하는 분절을 지닌 파아지 MEH 200(ATCC 기탁 번호 제75286호)을 파아지 용해질(MEH 200의 경우), 정제된 플라즈미드 DMA(pMEH 120의 경우) 또는 재조합체 이. 콜라이 균주 RR1(pMEH 300의 경우)의 형태로 기탁하였다.

pMEH 300 플라즈미드는 pLG338이 XhoI로 분해되고, SacI 링커가 가해진 변형 된 pLG338 벡터인 것으로 특징화될 수 있다. 이 새로운 벡터는 SacI을 사용한 분해에 의해 절단될 수 있는 약 20kD 크기의 모락셀라 카타랄리스 염색체성 DNA 삽입체를 함유한다. 이 삽입체는 모노클로날 항체 8B6와 반응하는 30kD 황원을 암호화하는 엠. 카타랄리스 유전자를 함유한다. 따라서 벡터의 총 크기는 단지 약 7.3kD를 포함하는 벡터와 함께 대략 27kb이다.

80kD OMP를 암호화하는 유전자는 먼저 pMEH 100으로 지정된 pBR322-기준한 재조합체 플라즈미드내에 클로닝된다. 이어서, 이 유전자는 서열 분석을 위해 pBluescript 내에 아클로닝시킨다. pMEH 120으로 지정된 이러한 새로운 플라즈미드는 ATCC에 기탁되어 있는 것이다. 재조합체 플라즈미드 pMEH 120은 크기가 대략 4.5kb인 엠. 카타랄리스 염색체 NA의 삽입체를 함유하는 pBluescript II SK+ 벡터이며, 모노클로날 항체 10F3와 반응하는 약 80kD의 단백질을 암호화한다. pMEH 120의 예비적 제한 지도가 제2도에서 나타나 있다.

HMWP OMP 항체를 암호화하며 Mab 17C7과 반응성인 유전자는 하기 실시예에서 기술한 클로닝 공정을 위해 사용된 λGEM-11 파아지, 즉 파아지 MEH 200을 벗어나 아클로닝되지 않는다. λGEM-11 파아지 벡터는 SfiI 또는 SacI을 사용한 분해에 의해 파아지 DNA로부터 절단될 수 있는, 약 11kb 크기의 엠. 카타랄리스 염색체성 DNA 삽입체를 포함한다. 예비적인 제한 지도는 제3도에서 나타나 있다.

당해 분야의 숙련가들에게는 명백한 바와 같이, 본원에 나타낸 상세한 기술에 비추어, 본 발명은 ATCC에 기탁된 전술한 또는 기타 특정 양태에 의해 제한되는 것은 아니다.

선택된 OMP 항원을 암호화하는 핵산 서열, 또는 이의 변이체는 엠. 카타랄리스를 검출하기 위한 하이브리드화 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 방법에서 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 기술에는 다수의 잠재적인 용도를 지닌 광범위한 DNA 단편을 제조하는데 이용가능한 정보, 예를 들면 항원의 비교적 짧은 면역학적/항원적 펩타이드 아분획의 제조, PCR 및 하이브리드화 연구시 시험관내 검출용 프로브로서의 DNA 또는 RNA 서열의 용도, 및 엠. 카타랄리스 감염의 조사, 진단 및 치료와 관련된 기타의 유용한 의학 및 생의학적 적용이 포함된다.

본 발명의 OMP 항원은 각각 30kD, 80kD 및 HMWP OMP 로서 언급된다. 이들 단백질은 본 발명자들에 의해서 엠. 카타랄리스 외막 소포에 대한 모노클로날 항체의 배터리(battery)로부터 선택된 모노클로날 항체를 참조하여 동정되었다. 이러한 항체는 엠. 카타랄리스 035E 외막 소포 제제의 SDS-PAGE 수행으로부터 상응하는 항원을 동정하기 위해 웨스턴 블롯 프로브로서 사용된다. 30kD OMP를 인지하는 모노클로날 항체는 8B6이라 칭하고, 80kD OMP를 인지하는 항체를 10F3이라 칭하고, HMWP OMP 항원을 인지하는 항체는 17C7로 지정하였다(참조: 제1도, 제4도 및 제5도). 중요하게도, 각각의 전술한 하이브리도마는 동물 모델에서 엠. 카타랄리스 감염에 대해 보호성인 것으로 나타났다.

재조합체 벡터 및 클론의 ATCC 기탁과 마찬가지로, 바람직한 OMP 항원을 인지하는 상기 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마도 부다페스트 조약하에서 1992년 7월 30일에 ATCC에 기탁하였다. 이 기탁된 하이브리도마는 각각 30kD OMP 항원을 인지하는 모노클로날 항체 8B6(ATCC 기탁 번호 제HB 11091호): 80kD OMP 항원을 인지하는 모노클로날 항체 10F3 (ATCC 기탁 번호 제HB11092호): 및 HWP OMP 항원을 인지하는 모노클로날 항체 17C7(ATCC 기탁 번호 제HB11093호)을 분비한다.

본 발명은 천연 공급원(즉, 엠. 카타랄리스 세균 세포) 또는 재조합체 DNA 공급원(즉, 이. 콜라이 또는 미생물 세포)으로부터 정제된 또는 부분적으로 정제된 단백질의 분리에 걸쳐서, 본 발명의 OMP 항원 단백질을 생성 및 분리하기 위한 다양한 수단을 고려한다. 후자의 경우, 본 발명의 OMP 항원 또는 이로부터 기원한 항원성 펩타이드는 선택된 OMP 종과 관련되지 않는 기타의 엠. 카타랄리스 에피토프가 함유되지 않은 본질적으로 항원적으로 순수한 상태로서 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 천연 또는 재조합체 공급원으로부터의 OMP 항원의 분리는, 세포 엔벨로프 또는 외막을 분리한 다음 세제-기초한 정제를 이용하여 달성할 수 있다. 재조합체 세포의 경우, 바람직한 항원은 봉입체 내에 존재할 수 있다.

30kD, 80kD 및 HMWP OMP 항원에 대한 모노클로날 항체가 본 발명에 기술되어 있기 때문에, 면역흡착 기술의 이용은 OMP 항원 또는 이의 면역학적으로 교차 반응성인 변이체를 정제하는데 유용한 것으로 기대된다. 이러한 목적을 위해 유용한 항체는 후술된 기술에 의해서, 또는 모노클로날의 제조에 대해 당 분야에서 일반적으로 공지된 기술에 의해서 제조할 수 있으며(참조, 미합중국 특허 제4,514,498호 및 제4,740,467호), 목적한 OMP 단백질 또는 펩타이드와 반응성인 것을 선택한다. 더우기, 선행의 일반적인 분리 공정이 OMP 변이체 또는 단백질의 항원성/면역학적 아분획의 분리에 대해서도, 단지 목적한 펩타이드 영역에 대해 친화성이 있는 항체가 생성되고 사용되는한, 매우 동일하게 적용될 수 있는 것으로 여겨진다.

또한, DNA 돌연변이 유발과 같은 기술을 적용함으로써. 본 발명은 변형되거나 또는 단순화된 단백질 구조를 갖는, 소위 "2세대" 분자의 용이한 제조를 가능케 한다. 이러한 2세대 단백질은 전형적으로 특정한 항원성/면역원성 에피토프 코어서열과 같이 완전한 길이의 항원과 공통되는 하나 이상의 특성을 갖는다. 에피토프성 서열은 펩타이드에 대한 지식으로부터 또는 기초가 되는 DNA 서열정보로부터 제조된 비교적 짧은 분자상에 제공될 수 있다. 이 같은 변이체 분자는 단백질 구조의 선택된 면역원성/항원성 영역으로 부터 유래할 뿐만 아니라 추가로 또는 달리는 천연의 서열에 대해 유사성 또는 심지어는 차이에 근거하여 선택된 하나 또는 그 이상의 작용적으로 등가인 아미노산을 포함한다.

[OMP 항원의 에피토프성 코어 서열]

상기 주지한 바와 같이, 에피토프성/ 면역원성 코어 서열을 포함하는 합성 펩타이드를 제조하는 것이 특히 유리할 수 있다. 이러한 에피토프성 코어 서열은 본원의 특정 양태에서 OMP 항원의 친수성 영역으로 동정된다. 이들 영역이 T-세포 또는 B-세포 자극을 촉진하여 특정한 항체 생산을 유도해내는 것으로 보이는 영역인 것으로 제시되었다. 본원에서 사응된 바와 같이, 에피토프성 코어 서열은, OMP-지시된 항체상의 항원 결합 부위에 "상보적" 이며, 이에 따라 이와 결합하게 되는 비교적 짧은 스트레치의 아미노산이다. 추가로 또는 달리, 에피토프성 코어서열은 OMP 지시된 항체와 교차 반응하는 항체를 유도해내는 것아다. 본 원에서, “상보적”이란 서로에 대해 인력을 나타내는 아미노산 또는 펩타이드를 의미한다. 따라서, 본 발명의 특정 에피토프 코어 서열은 목적하는 OMP 항원과 상응하는 OMP-지시된 항혈청의 결합에 대해 경쟁하거나 또는 이러한 결합을 대체시키는 능력면에서 작동적으로 정의될 수 있다.

일반적으로, 폴리펩타이드 항원의 크기는, 이것이 적어도 동정된 코어 서열 또는 서열들을 수반하기에 충분히 크다고 동정되는 한, 특별히 중요한 것이 아닌것으로 여겨진다. 본 기술에 의해 예측되는 가장 작은 유용한 코어 서열의 길이는 약 15개의 아미노산일 것이다 따라서, 이 크기는 일반적으로 본 발명에 따라 제조되는 가장 작은 펩타이드 항원에 상응한다. 그러나, 항원의 크기는, 이것이 기본적인 에피토프성 코어 서열을 포함하는 한, 필요에 따라, 보다 클 수 있다.

따라서, 컴퓨터화된 펩타이드 서열 분석 프로그램(DNAStar Software, DNAStar Inc. 제품 : 위스콘신 메디슨 소재)을 이용하여 본 발명자는 단백질의 특 정 에피토프를 포함하는 에피토프성 코어 서열을 구성하는 것으로 여겨지는 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP 항원의 특정한 친수성 펩타이드 영역을 동정하는 것을 제시한다.

서열내에 항원성 에피토프를 포함하는 에피토프성 서열 또는 펩타이드의 합성은 고체상 방법과 같은 통상적인 합성 기술을 이용하여 용이하게 성취된다(예를 들어, Applied Biosystems Model 430A 펩타이드 합성기와 같은 시판되는 펩타이드 합성기를 사용). 이어서 이런 방법으로 합성한 펩타이드 항원을 예정된 양으로 소분량으로 나누어 통상적인 방법, 예를 들어 수용액 또는 보다 더 바람직하게는 분말 또는 동결건조시킨 사용대기중인 상태로 저장한다.

일반적으로, 펩타이드의 상대적 안정성 때문에, 이들은 필요에 따라서 상당히 오랜 기간 동안 예를 들어 6개월 이상 수용액중에, 실질적으로 어떠한 수용액 중에서도 눈에 띄는 항원성 활성의 파괴 또는 손실없이 보관할 수 있다. 그러나, 장기 수성 저장이 필요한 경우, pH를 7.0 내지 7.5 사이로 유지시키기 위해 트리스 또는 인산염 완충액과 같은 완충액을 포함하는 제제를 포함할 수 있다. 또한, 나트륨 아자이드 또는 머티올레이트와 같은 미생물 번식을 억제시키는 제제를 포함하는 것도 바람직하다. 수성 상태로 장기 보존하기 위해, 용액을 4℃에서, 또는 보다 바람직하게는 냉동 상태로 보존하는 것이 바람직하다. 물론, 펩타이드(들)를 냉동건조 또는 분말 상태로 저장한다면, 이들은 예를들어 사용하기 전에 예정된 양의 (바람직하게는 증류시킨) 물 또는 완충액으로 재수화시킬 수 있는 계량된 분취물로서 실질적으로 무제한적으로 저장할 수 있다.

[항원적으로 작용성인 등가 아미노산]

상기 주지한 바와 같이, 목적하는 OMP 항원 또는 이의 항원성/면역원성 아부분의 구조내에 여러가지 변형 및 변화가 가해질 수 있으며 유사하거나 또는 달리는 바람직한 특성을 갖는 분자를 제조할 수 있다.

예를 들어, 이의 항원성 또는 면역원성 활성을 변형시키거나 증강시키기 위해 단백질 구조내의 특정의 아미노산을 다른 아미노산을 치환시킬 수 있다는 것은 공지되어 있다[참조: Kyte, et al., or Hopp, U.S. Patent No. 4,554,101, 본원에 참조로 인용됨]. 예를 들어, 대체 아미노산의 치환을 통해, 항원성 펩타이드에 적은 형태적 변화를 가하여, 이것이 항원과 항체 결합 영역 사이의 친화도를 증진시킬 수 있다. 달리는, 특정한 OMP 항원성 펩타이드에서의 아미노산 치환은, 다른 목적에 유용하도록 출발 펩타이드의 충분한 항원성을 보유하는 펩타이드-분자 결합체를 제공하기 위해 다른 분자에 결합시킬 수 있는 잔기를 제공하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 진단 방식에서 특히 유리한 고체 지지체에 결합된 선택된 OMP 펩타이드를 제조할 수 있다.

단백질상에서 상호반응성 생물학적 작용을 부여하는 아미노산의 수치료 지수의 중요성이, 카이트 등[참조 : Kyte et al, 1982]에 의해 고찰된 바 있는데, 여기에서 특정의 아미노산이 유사한 수치료 지수 또는 코어를 갖는 다른 아미노산 대신 치환되어 여전히 유사한 생물학적 활성을 유지할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 하기 표에 나타내는 바와 같이, 아미노산은 이들의 소수성 및 하전 특성에 기초하여 수치료 지수를 부여한다. 아미노산의 상대적 수치료 특성이 생성되는 단백질의 2차 구조를 결정하며, 이는 다시 단백질과 기질 분자간의 상호작용을 제한하는 것으로 여겨진다. 결합능을 모니터링하기 위한 바람직한 치환은 일반적으로 서로에 대해 ±2 단위이내의 지수, 보다 바람직하게는 ±1 단위 및 가장 바람직하게는 ±0.5 단위 이내의 지수를 갖는 아미노산을 포함할 수 있다.

[표 1]

아미노산 수치료 지수

이소루이신 4.5

발린 4.2

루이신 3.8

페닐알라닌 2.8

시스테인/시스틴 2.5

메티오닌 1.9

알라닌 1.8

글라이신 -0.4

트레오닌 -0.7

트립토판 -0.9

세린 -0.8

티로신 -1.3

프롤린 -1.6

히스티딘 -3.2

글루탐산 -3.5

글루타민 -3.5

아스파트산 -3.5

아스파라긴 -3.5

라이신 -3.9

아르기닌 -4.5

따라서, 예를 들어, +4.5의 수치료 지수를 갖는 이소루이신은 바람직하게는 발린(+4.2) 또는 루이신(+3.8)과 같은 아미노산으로 치환될 것이다. 달리는, 라이신(-3.9)이 바람직하게는 아르기닌(-4.5) 대신 치환될 것이다.

또한, 특히 생물학적 작용적 등가 단백질 또는 펩타이드가 면역학적 양태에서 이의 사용이 의도되는 경우, 친수성을 기초로 하는 유사 아미노산 치환이 수행될 수 있다. 본원에서 참조로 인용하고 있는 미합중국 특허 제4,554,101호는, 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 것과 같이 단백질의 가장 큰 국소적 평균 친수성이 이의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 관련되어 있다고 기술하고 있다.

미합중국 특허 제4,554,101호에 상세히 기술하고 있는 바와 같이, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌(+3.0): 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1), 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2): 글루타민(+0.2): 글라이신(0); (0±1): 트레오닌(-0.4): 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5): 시스테인(-1.0); 메티오닌 (-1.3): 발린(-1.5), 루이신(-1.8): 이소루이신(-1.8): 타이로신(-2.3): 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 가지는 다른 아미노산에 의해 대체되어 여전히 생물학적으로 등가인, 특히 면역학적으로 등가인 단백질을 수득할 수 있다. 이 같은 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내가 보다 바람직하며, ±0.5 이내가 가장 바람직하다.

따라서, 이들 아미노산 치환은 일반적으로 R-그룹 치환체의 크기, 친전자 특성, 하전등의 상대적 유사성에 근거하고 있다. 일반적으로, 전술한 여러가지 특성을 고려한 바람직한 치환은 다음을 포함한다:

[표 2]

최초 잔기 치환의 예

Ala gly; ser

Arg lys

Asn gln; his

Asp glu

Cys ser

Gln asn

Glu asp

Gly ala

His asn; gln

Ile leu; val

Leu ile; val

Lys arg; gln; glu

Met leu; ala

Ser thr

Thr ser

Trp tyr

Tyr trp; phe

Val ile; leu

[엠. 카타랄리스 OMP에 대한 모노클로날 항체의 제조]

본 발명의 모락셀라 카타랄리스 OMP에 특이적인 모노클로날 항체는 통상적인 면역화 기술로 제조할 수 있다. 먼저, 외막 소포 제제와 같은 OMP의 항원성 에피토프를 함유하는 조성물을 사용하여 실험 동물, 예를 들어, 마우스를 면역화시키고, 이로부터 비장 또는 임파 세포군을 수득할 수 있다. 그후 비장 또는 임파 세포를 항체-분비 하이브리도마를 생성시키기 위해 사람 또는 마우스 골수종 세포와 같은 세포주와 융합시킬 수 있다. 이들 하이브리도마를 분리하여 개개의 클론을 수득한 후 이를 목적하는 OMP에 대한 항체 제조에 대해 스크리닝할 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명은 엠. 카타랄리스로부터의 외막 단편을 사용하여 실험 동물에서 면역 반응을 유도한다. 면역화 후, 비장 세포를 적출해내고 표준 융합 프로토콜[참조: The Cold Spring Harbor Manual for Hybridoma Development, 본원에선 참고로 인용됨]을 이용하여 형질세포층 세포와 비장 세포를 융합시켜 외막 단백질에 대한 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조한다. 선택된 OMP에 대한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마는 ELISA 및 웨스턴 블롯 방법과 같은 표준 기술을 이용하여 확인한다.

그후 하이브리도마 클론을 액체 배지중에서 배양하고 배양 상등액을 정제하여 OMP-특이적 모노클로날 항체를 수득한다.

[OMP 항원에 대한 모노클로날 항체의 이용]

일반적으로, 엠. 카타랄리스의 목적하는 OMP 항원에 대한 모노클로날 항체는 엠. 카타랄리스 감염의 진단 및 치료 모두에 사용할 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체는 ELISA 및 웨스턴 블롯 방법과 같은 표준 면역화학적 공정 뿐만 아니라 OMP 에피토프에 특이적인 항체를 활용하는 다른 공정에서도 이의 적용이 유용할 것이다. 이들 OMP-특이적 모노클로날 항체는, 예를 들어 수동 면역화 공정에서 이들의 적용을 통한, 엠. 카타랄리스 감염 치료에 여러가지 방법으로 유용할 것으로 기대된다.

또한, 특정의 OMP에 특이적인 모노클로날 항체는 다른 유용한 적용에 활용될 수 있다. 예를 들어, 면역흡착 프로토콜에서의 이들의 사용은 천연 또는 재조합 OMP 종류 또는 이의 변이체를 정제하는데 유용할 수 있다.

본 발명의 OMP 항원에 대한 항체 제제가 엠. 카타랄리스 감염에 대해 현저한 보호 효과를 가진다는 연구결과가 밝혀졌다. 본 발명자들은 이들 OMP에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 수동 면역화가 엠. 카타랄리스 세균의 거환(bolus) 주입 후에 이의 숫자를 현저하게 감소시킨다는 것을 밝혔다. 이것은 이들 OMP 항원이 엠. 카타랄리스 감염과 관련된 질환에 대한 수동 면역화에 사용하기 위한 감마글로불린 제제의 제조시 사용될 수 있거나 또는 직접 백신 성분으로서 사용할 수 있음을 입증하는 것이다.

[엠. 카타랄리스 OMP를 암호화하는 재조합 클로닝 유전자]

적절한 감마글로불린 제제를 수득하기 위해, 모노클로날 항체, 바람직하게는 사람 또는 사람화한(humanized) 하이브리도마를 제조하는 것이 필요하다. 달리는, 과면역화된 개체로부터의 글로불린 분획을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 엠, 카타랄리스 OMP 유전자 또는 서열 변이체의 분리, 적절한 벡터내로의 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP 유전자를 암호화하는 DNA 분절의 삽입 및 적절한 숙주의 형질전환에 의해 재조합 단백질 또는 이의 변이체가 발현되도록 하는 단계를 포함하고 있다. 당해 분야의 전문가라면 본 기술에 비추어, 본 발명이 목적하는 OMP를 발현하는 엠. 카타랄리스 아종 또는 분리물과 같은 적절한 암호화 서열을 포함하는 적절한 공급원으로부터의 OMP 유전자 서열의 분리 및 이용에도 적용될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 이같은 공급원은 선택된 OMP에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역학적 스크리닝으로 용이하게 확인될 수 있다.

OMP-암호화 DNA의 분리 및 이용에 대한 본 발명의 바람직한 적용은 일반적으로, (1) 모락셀라 게놈성 DNA의 분리; (2) 평균 길이가 예를 들어 6 내지 23kD인 DNA를 제공하기 위해 PstI과 같은 효소(선택된 제한 효소가 주요한 것은 아니다)를 사용한 게놈성 DNA의 부분적 제한 효소 절단; (3) 부분적으로 절단된 DNA의, 예를 들어 pBR322(다시 필요에 따라, 이 단계에서 다른 플라즈미드 또는 파아지 벡터가 사용될 수도 있다)와 같은 선택된 벡터내의 선택된 부위내로의 결합: (4) 재조합 벡터를 차용한 적절한 숙주세포, 예를 들어, 이.콜라이 세포의 형질 전환, 형질감염 및 전기 천공 처리 및 (5) 특별히 고안된 스크리닝 프로토콜의 적용을 통한 목적하는 OMP를 발현시키는 콜로니의 선별 단계를 포함한다. OMP 유전자를 함유하는 클론 동정후 외막 단백질 또는 이의 서열 변이체의 증강된 생성을 위해 유전자를 바람직한 숙주/벡터/프로모터 시스템내로 재조작할 수 있다.

전술한 일반적 단계의 적용을 통해, 본 발명자들은 상응하는 외막 단백질이 생성되게 하는 방식으로 엠. 카타랄리스 OMP 유전자를 함유하는 다수의 클론을 동정 및 선별해내는데 성공했다.

이런 기술의 바람직한 적용에서, 모락셀라 카타랄리스 군주 035E로부터의 게놈성 DNA는 SDS, 리보뉴클레아제 및 단백질 분해효소 K 처리, 폐놀/클로로포름/이소아밀 알콜 추출 및 에탄올 침전의 사용을 통해 세균으로부터 분리시킨다. 예를 들어 PstI과 같은 제한 효소를 사용하여 6 내지 23kb 길이의 단편이 제공되도록 하는 것과 같이 적절한 부분 제한 효소 분해를 성취하기 위한 조건을 결정한다. 크기 분획화 후, 부분적으로 분해된 선택된 크기 범위의 모락셀라 DNA 단편을, 예를 들어 게놈성 DNA 단편과 결합시키기 위한 적합한 부위를 생성시키기 위해 PstI으로 완전히 분해시킨 pBR322와 같은 완전히 분해시킨 벡터와 결합시킨다.

결합 후, DNA 단편 삽입물에 의해 암호화된 엠. 카타랄리스 단백질 종을 발현시키는 요소를 갖는 재조합 라이브러리를 제조하기 위해, 재조합 벡터를 사용하여 이.콜라이 RRI과 같은 적절한 숙주를 형질 전환시킨다. 이 재조합체 미생물 클론은, 바람직하게는 영양 아가의 표면에서 배양시켜 눈으로 확인되는 콜로니를 형성시킨다. 그후, 표면-노출된 엠. 카타랄리스 외막 단백질을 발현시키는 콜로니를 엠. 카타랄리스 OMP에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 콜로니 블롯 방사선면역분석으로 확인한다. 항-OMP 항체와 반응하는 에피토프를 갖는 단백질을 발현시키는 재조합 이.콜라이 클론을 목적하는 양으로 배양시킨다.

[숙주세포 배양 및 벡터]

물론, 일반적으로는 DNA 서열의 최초 클로닝과 본 발명에서 유용한 벡터 작제에는 원핵생물이 바람직하다. 예를 들어, 이.콜라이 균주 RRI이 특히 유용하다. 사용될 수 있는 다른 미생물 균주로는 이.콜라이 균주, 예를 들어, 이 콜라이 LE392, 이.콜라이 B 및 이.콜라이 X1776(ATCC No. 31537)이 포함된다. 이들 예는 물론 제한하려는 것이 아니고 설명하려는 것이다.

발현을 위해서도 또한 원핵생물이 바람직하다. 전술한 균주 이.콜라이 W3110(F^-, λ^-, 자가영양성, ATCC No. 273325) 뿐만 아니라 바실러스, 예를 들어 바실러스 서브틸리스 또는 다른 엔테로 박테리아, 예를 들어 살모넬라 티피뮤퓸 또는 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종이 사용될 수 있다.

일반적으로, 이들 숙주와 관련하여 숙주세포와 조화되는 종으로부터 유래한 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 플라즈미드 벡터가 사용된다. 벡터는 일반적으로 복제 부위 뿐만 아니라 형질전환 세포에서 표현형적 선택성을 제공할 수 있는 표지 서열을 포함한다. 이 콜라이는 전형적으로 이.콜라이 종으로부터 유래한 플라즈미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다[참조: Bolivar et at., 1977]. pBR322는 암피실린과 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 함유함으로써 형질전환 세포를 동정하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pER 플라즈미드 또는 다른 미생물적 플라즈미드 또는 파아지는 또한 프로모터를 함유하거나 미생물 자신의 단백질을 발현하기 위해 미생물에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하도록 변형시켜야만 한다.

또한, 숙주 미생물과 혼화성인 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 파아지 벡터가 이들 숙주와 관련하여 형질전환용 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 파아지 λGEM^TM-11은 숙주 세포, 예를 들어 이.콜라이 LE392를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.

재조합 DNA 작제에 가장 일반적으로 사용되는 프로모터로서는 β-락타마제(페니실린 분해 효소) 및 락토스 프로모터 시스템[참조: Chang et al., 1978: Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979] 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템[참조: Goeddel et al., 1980; EPO Appl. Publ. No. O036776)이 있다. 물론 이들이 가장 일반적으로 사용되지만 다른 미생물 프로모터가 발견되고 활용된 바 있으며, 이들의 뉴클레오타이드 서열에 관한 자세한 내용이 공개되어 있어서 당해 분야의 전문가라면 이들을 플라즈미드 벡터에 작용적으로 결합시킬 수 있다[참조; EPO Appl. Publ. No. 0036776].

원핵 세포외에, 효모 배양물과 같은 진핵세포성 미생물이 또한 사용될 수 있다. 물론 다른 여러가지 균주가 일반적으로 사용될 수도 있으나 진핵세포성 미생물체중 사카로마이세스 세레비지애 또는 제빵용 효모가 가장 일반적으로 사용된다. 사카로마이세스에서 발현시키기 위해 예를 들어, 플라즈미드 YRp7이 일반적으로 사용된다[참조: Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al, 1979: Tschemper et al, 1980]. 이 플라즈미드는 이미 트립토판중에서 생육할 수 있는 능력을 상실한 효모 돌연변이 균주, 예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1[참조: Jones, 1977]에 대해 선별 마커를 제공하는 trp1 유전자를 함유한다. 따라서 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1의 존재는 트립토판 부재하에서의 생육으로 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.

효모 벡터중 적절한 프로모터 서열에는 3-포스포글리세레이트 키나제[참조: Hitzeman et al, 1980] 또는 다른 해당 효소[참조: Hess et al., 1968: Holland et al, 1978], 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소, 헥소키나제, 피루베이트 탈탄산효소, 포스포프록토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이성화효소, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이성화효소, 포스포글루코스 이성화효소 및 글루코 키나제에 대한 프로머터가 포함된다. 적절한 발현 플라즈미드를 작제할 때, 또한 이들 유전자와 관련된 종결 서열을 mRNA의 플리아데닐화 및 종결을 제공하기 위해 발현시키고자 하는 서열의 발현 벡터 3'에 결합시킨다. 성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가 장점을 갖는 다른 프로모터는 알콜 탈수소효소 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사의 관련된 분해 효소, 전술한 글리세르알데하이드- 3-포스페이트 탈수소효소 및 말토스와 갈락토스 활용에 관련된 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모-혼화성 프로모터, 복제 기원 및 종결 서열을 함유하는 어떠한 플라즈미드 벡터라도 적절하다.

미생물 외에, 다세포 유기체로부터 유래된 세포의 배양물 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 원리상, 무척추 또는 척추 동물 배양체로부터의 어떠한 세포 배양물도 사용가능하다. 그러나, 척추동물 세포에 가장 큰 관심이 집중되고 있으며 척추동물 세포의 배양(조직 배양)중에서 증식은 최근들어 통상적인 공정이 되어 가고 있다[참조: Tissue Culture, 1973]. 이와같은 유용한 숙주 세포주의 예로는 VERO 및 HeLa 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포주, W138, BHK, COS-7,293 및 MDCK 세포주이다. 이 같은 세포에 대한 발현 벡터는 일반적으로 (필요에 따라) 복제 기원, 필요한 라이보좀 결합 부위와 함께 발현될 유전자 전반에 위치한 프로모터, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다.

포유동물 세포에서 사용하기 위해, 발현 벡터상의 조절 기능은 바이러스성 물질에 의해 제공되기도 한다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 유두종, 아데노바이러스 2 및 가장 빈번하게는 시미안 바이러스 40 (SV 40)으로부터 유래한다. SV4O 바이러스의 초기 및 말기 프로모터가 특히 유용한데, 이것은 이 둘다를 SV4O 바이러스성 복제 기원을 함유하기도 하는 단편으로서 바이러스로부터 용이하게 수득할 수 있기 때문이다[참조: Fiers et al., 1978]. 바이러스성 복제 기원내에 위치된 Hind III 부위로부터 Bg1I 부위까지 연장된 대략 250bp 길이의 서열이 포함된다면, 보다 작거나 보다 큰 SV4O 단편들이 사용될 수 있다. 또한, 조절 서열이 숙주세포 시스템과 혼화되기만 하면, 일반적으로 목적하는 유전자 서열과 관련된 프로모터 또는 조절 서열을 활용하는 것이 가능하거나 종종 바람직할 수 있다.

복제 기원은, 외래 기원인 예를 들어 SV4O 또는 다른 바이러스원(예: 유두종, 아데노, VSV, BPV)으로부터 유래된 것을 포함하는 벡터 작제물에 의해 제공되거나 숙주세포 염색체성 복제 기작으로 제공될 수 있다. 벡터가 숙주세포 염색체 내로 통합되는 경우, 후자가 종종 만족스러울 수 있다.

[OMP 유전자의 서열화]

선택된 OMP를 암호화하는 유전자를 클로닝시킨 후, 생거 등[Sanger et al., 1977]의 디데옥시법에 따라 제한 지도 작성 및 DNA 서열 분석을 수행하고자 할 것 이다. DNA 및 추론된 아미노산 서열은 공지된 단백질과의 상동을 측정하기 위해 공지된 서열과 비교할 수 있다. 단백질의 아미노산 서열은 여러가지 영역, 예를 들어, 세포질성, 막-경유 및 기질 결합 영역등의 성격을 밝혀주게 되며, 이로써 유전자 공학 기술을 통한 효소의 구조를 개선시키는 방법으로 중요한 정보를 제공하게 된다.

컴퓨터화된 펩타이드 서열 분석 프로그램을 통해(위스콘신 메디슨 소재의 DNAStar Inc. 제조의 DNAStar Software), OMP 항원의 특정 친수성 펩타이드 영역이 확인될 수 있는데, 이는 단백질의 특정 에피토프를 포함하는 에피토프성 코어 서열 뿐만 아니라, 다음에서 보다 상세하게 설명하는 바와 같이, 전술한 펩타이드의 생물학적으로 작용성인 등가물을 구성할 수도 있다.

[OMP 변이체의 작제]

부위-지시된 돌연변이 유발은 해당하는 DNA의 특이적 돌연변이 유발을 통한, OMP 항원 서열로부터 유래된, 개개의 펩타이드 또는 생물학적 작용성 등가물인 단백질 또는 펩타이드를 제조하는데 유용한 기술이다. 이 기술은 또한, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화를 DNA에 도입함으로써, 전술한 하나 또는 그 이상의 고려 사항을 병합할 서열 변이체를 제조 및 시험하는 손쉬운 능력을 제공한다. 부위-지시된 돌연변이 유발은, 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라 충분한 수의 이웃한 서열의 사용을 통한 돌연변이체 제조를 허용함으로써, 충분한 크기와 서열 복합성의 프라이머 서열을 제공하여 가로지르게될 결실 결합의 두 방향 모두에 안정한 듀플렉스를 형성한다. 전형적으로, 변경될 서열 연접의 양측상에 약 5 내지 10개 잔기를 갖는 약 17 내지 25 개 뉴클레오타이드 길이의 프라이머가 바람직하다.

일반적으로, 부위-지시된 돌연변이 유발 기술은 문헌으로 예증되는 바와 같이 널리 공지되어 있다[참조; Adelman et al, 1983]. 인지하게 되는 바와 같이, 이 기술은 전형적으로 일본쇄 및 이본쇄 형태 모두로 존재하는 파아지 벡터를 사용한다. 부위-지시된 돌연변이 유발에 유용한 전형적 벡터는 Ml3 파아지와 같은 것이다[참조: Messing et al., 1981]. 이들 파아지는 시판되어 용이하게 입수가능하며, 이들의 사용은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 부위-지시된 돌연변이 유발은 먼저 자체의 서열 중에 OMP 항원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 일본쇄 벡터를 수득함으로써 수행한다. 목적하는 돌연변이된 서열을 지닌 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로, 예를 들어 크레어 등[참조: Crea et al., (1978)]의 방법으로 합성적으로 제조한다. 그후 이 프라이머를 일본쇄 벡터와 어닐링시키고, 돌연변이-함유 쇄의 합성을 완료시키기 위해 이.콜라이 폴리머라제 I 클레나우 단편과 같은 DNA 폴리머라제로 처리한다. 이에 따라, 이형 듀플렉스가 형성되며, 여기에서 하나의 쇄는 최초의 비-돌연변이 서열을 암호화하고, 제2 쇄는 목적하는 돌연변이를 지니게 된다. 그후 이형 듀플렉스 벡터를 적절한 세포, 예를 들어, 이.콜라이를 형질 전환시키는데 사용하고 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별해 낸다.

부위-지시된 돌연변이 유발을 이용한 선택된 OMP 유전자의 서열 변이체 제조는 잠정적으로 유용한 OMP 종의 생성 수단으로서 제공되며 OMP의 서열 변이체가 수득될 수 있는 다른 방법을 한정하는 것을 의미하지는 않는다. 예를 들어, 목적하는 OMP 유전자를 암호화하는 재조합 벡터는, 하이드록실아민을 사용하는 플라즈미드 DNA의 돌연변이 유발을 위한 돌연변이제로 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다[참조: Eichenlaub, 1979].

[핵산 서열의 이용]

특정 측면에서, 이미 언급한 바와 같이, 본 발명으로 제공되는 DNA 서열 정보는, 선택된 OMP 항원 유전자의 유전자 서열과 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 능력을 가진 비교적 짧은 DNA(또는 RNA) 서열의 제조를 가능케한다. 이 같은 측면에서, 적절한 길이의 핵산 프로브를 천연 서열을 고려하여 제조하거나 또는 OMP 유전자의 플랭킹 영역, 예를 들어 플라즈미드 pBR322에서 발견되는 바와 같은 유전자의 하부 영역으로부터 유래된다. OMP 유전자 서열과 특이적으로 하이브리드 되기 위한, 상기 핵산 프로브의 능력은 다양한 양태에서 이들의 특정한 활용성을 부여한다. 무엇보다도 중요한 것은, 이 프로브가 주어진 샘플중에 병원성 생물체의 존재를 검출하기 위한 여러가지 진단 분석에 사용될 수 있다는 것이다. 그러나, 돌연변이종 프라이머 또는 다른 유전자 작제물을 제조하는데 사용하기 위한 프라이머 제조에 필요한 서열 정보의 이용을 포함하여, 다른 이용도 고려할 수 있다.

본 발명에 따른 특정 장점을 제공하기 위해, 하이브리드화 연구 또는 분석에 사용된 바람직한 핵산 서열은, 적어도 10 내지 20개 또는 그 이상이 서열의 뉴클레오타이드 스트레치와 상보적인 서열을 포함한다. 10개 이상의 뉴클레오타이드 길이는 이 단편이 안정하면서도 선택적인 듀플렉스 분자를 형성하기에 충분히 길도록 하는 것을 보장해준다. 하이브리드의 안정성과 선택성을 증가시키고 이로써 수득된 특이적 하이브리드 분자의 질과 수준을 증가시키기 위해서라면 10개 이상의 염기 길이로 스트레칭된 상보성 서열을 갖는 분자가 일반적으로 바람직하다. 따라서, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상의 스트레칭을 갖는 OMP 유전자-상보성 서열을 지닌 핵산을 디자인해내는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같은 단편은, 예를 들어, 핵산 제조 기술, 예를 들어 미합중국 특허 제4,603,102호의 PCR 기술을 적용하거나 또는 재조합체 형성을 위해 선택된 서열을 재조합 벡터에 도입하는 것과 같은 화학적 수단에 의해 단편을 직접 합성하여 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 OMP 항원이 병원성 모락셀라종의 징표로 여겨진다는 점에서, 본 발명은 임상적 샘플에서 OMP-특이적 RNA 또는 DNA를 검출하기 위한 진단적 하이브리드화 분석의 기본으로서 특정한 활용성을 제공한다. 따라서, 감염 진단에 사용 될 수 있는 예로들 수 있는 임상적 샘플은, 중이액, 타액, 기관지 폐포성액, 양뇨액 등과 같은 모락셀라 책산을 포함할 가능성이 있는 모든 샘플이다. 미합중국 특허 제4,358,535호(Falkow et al)에 기술된 것자 같은 진단적 분석을 포함하여, 본 발명의 하이브리드화 측면과 관련하여 사용될 수 있는 다수의 하이브리드화 기술 및 시스템이 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 상용하는 OMP 유전자의 상보성 스트레치와 듀플렉스 분자를 선택적으로 형성할 수 있는 이들의 능력 때문에 중요하다. 고려되는 적용에 따라서, 표적 서열에 대한 프로브의 다양한 선택도를 성취하기 위해 다양한 하이브리드화 조건이 이용될 수도 있다. 고도의 선택성을 필요로 하는 경우, 하이브리드를 형성하기 위해, 예를 들어. 50℃ 내지 70℃의 온도에서 0.02M- 0.15M NaCl을 제공하는 것과 같은 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도를 선택함으로써 비교적 엄격한 하이브리드 형성 조건을 사용해야 한다. 이들 조건은 특히 선택적이며 프로브와 주형 또는 표적 쇄 사이의 미스 매칭이, 존재한다고 해도, 매우 낮다.

물론, 일부의 적용에서는, 예를 들어, 존재하는 주형에 하이브리드될 돌연변이성 프라이머 쇄를 사용하여 돌연변이체를 제조하는 경우, 이형 듀플렉스의 형성을 허용하기 위해 비교적 덜엄격한 하이브리드화 조건이 요구된다. 이런 경우, 20 내지 55℃의 온도 범위에서, 0.15M-0.9M 염과 같은 조건을 이용한다. 이때, 증가량의 포름알데하이드를 가함으로써 조건이 보다 엄격하게 될 수 있음을 예측할 수 있으며, 이는 증가된 온도에서와 같은 방법으로 하이브리드 듀플렉스를 탈안정화시 키도록 한다. 따라서, 하이브리드화 조건은 용이하게 조작될 수 있으므로, 이는 목적하는 결과에 따른 선택 방법이 될 수 있다.

특정의 양태에서, 돌연변이된 클론을 함유하는 클론 뱅크로부터 변이체를 분리시키기 위해 핵산 프로브를 사용하는 것이 요구될 수 있다. 특정의 양태에서, OMP 서열의 변이체를 함유하는 고체 배지중에서 생육시킨 돌연변이체 클론은, 서열변이체를 함유하는 프로브와 특정 콜로니중에 함유된 핵산 서열 변이체 사이의 하이브리드화를 수득하기 위해서, 콜로니 블롯 분석에서 사용된 것과 같은 하이브리드화 조건 및 방법을 이용하여 복제 필터상에서 동정해낼 수 있다. 이 방법에서, OMP 유전자의 짧은 변이체 서열을 함유하는 작은 하이브리드화 프로브가, 전체 OMP 유전자의 서열 변이체를 함유하는 고체 배지상에서 생곡시킨 클론을 동정하기 위해 이용될 수 있다. 그후 이들 클론을 목적하는 양의 변이체 OMP 핵산 서열 또는 상응하는 OMP 항원을 수득하기 위해 생육시킬 수 있다.

임상적 진단 양태에서, 본 발명의 핵산 서열은 하이브리드화를 측정하기 위해 표지물과 같은 적절한 수단과 함에 사용될 수 있다. 방사능 물질, 효소 또는 다른 리간드, 예를 들어 아비딘/바이오틴과 같은 검출가능한 시그날을 생성시키는 여러가지 적절한 지시제 수단이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 바람직한 진단 양태에서, 방사능 물질 또는 다른 환경적으로 바람직하지 않은 시약 대신에 우레아제, 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제와 같은 효소 택(tag)을 사용함이 더 바람직하다. 효소 택의 경우, 비색 지시제 기질이 공지되어 있으며, 이는 병원성 핵산-함유 샘플과의 특이적 하이브리드 형성을 동정해내기 위해 사람의 눈에 가시화되거나 분광광학적으로 가시화되는 수단을 제공하는데 사용될 수 있다.

일반적으로, 본원에서 기술된 하이브리드화 프로브는 용액 하이브리드화 뿐만 아니라 고체상을 사용하는 양태에서 모두 유용한 시약으로서 사용될 수 있음을 추측할 수 있다. 고체상이 관련된 양태에서는, 예를 들어 삼출물, 체액(예: 양뇨액, 중이 유출물, 기관지 폐포성 액체) 또는 조직과 같은 의심되는 임상적 샘플로 부터의 시험 DNA(또는 RNA)를 선택된 매질 또는 표면상에 흡착시키거나 고정시킨다. 그후, 이들 고정된 일본쇄 해산은 목적하는 조건하에서 선택된 프로브를 써서 특이적 하이브리드화시킨다. 선택되는 조건은 목표로 하는 특정의 기준(예를 들어, G+C 함량, 표적 핵산의 타입, 핵산 공급원, 하이브리드화 프로브의 크기 등)에 따라 특정 조건으로 결정될 수 있을 것이다. 비특이적으로 결합한 프로브 분자를 제거하기 위해 하이브리드화 표면을 세척한 후 표지물로써 특이적 하이브리드화를 검출하거나 정량화한다.

다른 양태에서, OMP 서열 또는 이의 변이체는, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석에서 반응물로서 사용될 경우 엠. 카타랄리스에 대해 고도로 특이적이고 민감 한 검출을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 미합중국 특허 제4,60,102호에 기술된 PCR 기술을 적용함으로써, 샘플중에서 OMP 핵산의 한정된 부분의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브로서 다양한 OMP 서열의 부분을 활용할 수 있다. 그후 OMP 서열의 증폭된 부분을 상보성 서열을 포함하는 하이브리드화 프로브와 하이브리드시켜 검출할 수 있다. 이런 방법으로, OMP 서열을 활용하여 샘플중에서 극단적으로 낮은 농도의 엠 카타랄리스 핵산을 검출할 수 있다.

다른 양태로서, OMP 유전자의 선택된 부분들을 목적하는 양으로 시험관내에서 제조하기 위해 OMP 서열을 PCR 방식에 이용할 수 있다. 선택된 OMP 유전자의 선택된 유전자 부분들을 중폭시킨 다음 이들 부분들을 벡터내로 삽입시킴으로써 OMP 항원의 아단편을 포함한 OMP 변형체를 발현하는 재조합 클론을 제조할 수 있다. 이와 같은 방법으로, 외막 단백질의 항원 에피토프를 보유한 펩타이드를 제조하고 여러가지 목적에 사용할 수 있다.

[면역검정법]

주지된 바와 같이, 본 발명의 OMP 펩타이드는 예를 들면 백신개발과 관련하여 면역원으로서 사용한다거나 항-OMP 항원 반응성 항체를 검출하기 위해 면역검정법에서 항원으로서 사용할 수 있다. 우선 면역검정법에서의 이용 가능성을 언급해 볼때 이들의 가장 간단하고 직접적인 의미에서 본 발명의 바람직한 면역검정법에는 본 분야에 공지된 여러 유형의 효소-연결된 면역흡착검정법(ELISA)이 포함된다. 그러나, OMP 펩타이드가 이러한 검정법에만 이용되는 것은 아니며, 다른 유용한 양태들로서 RIA 및 다른 비-효소 연결된 항체 결합 검정법 또는 과정에 이용될 수 있다.

바람직한 ELISA 검정법에서, OMP 항원 서열을 보유한 펩타이드를 선택된 표면에, 바람직하게는 폴리스티렌 미소역가 평판의 웰과 같이 단백질 친화성을 나타내는 표면상에 고정시킨다. 불완전하게 흡착된 물질들을 세척하여 제거한 후, 시험 항혈청에 대하여 항원상 중성인 것으로 알려진 소혈청 알부민(BSA) 또는 카세인과 같은 비특이성 단백질을 웰상에 결합 또는 피복시키는 것이 바람직할 수 있다. 이렇게하면 고정된 표면상의 비특이성 흡착 부위가 차단되게 되며 이에 따라 표면 상에 항혈청이 비특이성으로 결합하여 발생하는 바탕값(background)을 줄일 수 있다.

항원물질을 웰에 결합시키고, 비-반응성물질로 피복시켜 바탕값을 줄이며, 비결합된 물질을 세척하여 제거한 후, 고정표면을 면역복합체(항원/항체)를 형성하는 방식으로 시험 항혈청 또는 임상적 또는 생물학적 추출물과 접촉시킨다. 이러한 상태에서 항혈청을 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 및 인산염 완층용액(PBS)/ 트윈으로 희석시키는 것이 바람직하다. 이들 첨가제는 또한 비특이성 바탕값을 줄이는 역할을 하기도 한다. 그런후, 항혈청층을 바람직하게는 25℃에서 27℃의 온도로 2 내지 4시간 동안 항온 처리한다. 항온처리후, 항혈청-접촉된 표면을 세척하여 면역 복합체를 형성하지 않은 물질을 제거한다. 바람직한 세척 공정은 PBS/트윈 또는 붕산염 완충액과 같은 용액으로 세척하는 것을 포함한다.

시험 샘플과 결합된 항원 사이의 특이적 면역복합체 형성추 세척 공정 후, 첫번째 항체에 대한 특이성을 갖는 두번째 항체에 동일하게 적용시킴으로써 면역복합체 형성의 빈도 및 양을 측정할 수 있다. 물론, 시험 샘플이 사람으로부터 얻어진 경우 제2항체는 일반적으로 사람 IgG에 대한 특이성을 갖는 항체가 바람직하다. 검출수단을 제공하기 위해 제2항체는 적절한 발색성 기질과 함께 항온 처리했을때 발색시키는 관련 효소를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들면, 항혈청-결합된 표면을 우레아제 또는 퍼옥시다제-결합된 항-사람 IgG와 면역 복합체 형성의 전개를 유리하게 하는 시간 및 조건(예; PBS- 트윈과 같은 PBS-함유 용액중에서 실온하에 2시간 동안 항온처리)하에 접촉 및 항온처리하는 것이 필요하다.

제 2 효소-결합된 항체와 함께 항온처리하고 이어서 세척하여 비결합된 물질들을 제거한 후, 효소 표지물로서 퍼옥시다제의 경우 우레아 및 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸- 벤즈티아졸린-6-설폰산) [ABTS] 및 H₂O₂와 같은 발색성 기질과 함께 항온처리하여 표지물의 양을 정량한다. 예를 들어, 가시 스펙트럼 분광 분석기를 사용하여 형성된 색도를 측정하여 정량 분석한다

[백신 제조 및 이용]

백신으로서 사용하기에 적합한 것으로 제시된 면역원성 조성물은 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 면역원성 OMP 단백질 및/또는 펩타이드로부터 용이하게 직접적으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 항원성 물질을 광범위하게 투석하여 목적하지 않는 작은 분자량의 분자들을 제거하고/하거나 즉석 조성을 위해 바람직한 비히클내로 동결건조시킨다.

활성성분으로서 펩타이드 서열을 함유하는 백신의 제법은 일반적으로 본 분야에 잘 알려져 있으며 참조문헌으로서 미합중국 특허 제4,608,251호, 제4,601,903호, 제4,599,231호, 제4,599,230호, 제4,596,792호 및 제4,578,770호를 예로 들 수 있고 이들 모두는 본원에 참조로 인용된다. 통상적으로, 이러한 백신들은 주사제로서 제조된다. 또한, 액제 또는 현탁제로서 사용하기 위하여 주사전에 액체중의 액제 또는 액체중의 현탁제에 적합한 고체 형태로도 제조할 수 있다. 또는, 이 제제를 유화시킬 수도 있다. 흔히, 활성 면역원성 성분을 약제학적으로 허용되며 활성 성분과 혼화성인 부형제와 혼합한다. 적합한 부형제는, 예를 들면 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 혼합물이다. 또한, 필요한 경우, 백신은 소량의 보조제(예, 습윤제, 유화제, pH 완충제, 또는 백신의 효능을 증강시키는 보강제)를 함유할 수 있다.

백신은 통상적으로 예를 들면 피하 또는 근육내로 주사하여 비경구적으로 투여한다. 다른 투여방식에 적합한 추가의 제형으로는 좌제 및, 일부 경우로서, 경구 제제가 포함된다. 좌제의 경우, 통상적인 결합제 및 담체로는 예를 들면 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드가 포함될 수 있다: 이러한 좌제는 활성성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 제제는 예를 들면 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘등과 같은 통상 사용되는 부형제를 함유한다. 이들 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슬, 서방성제제 또는 산제로 제형될 수 있으며 10 내지 95%, 바람직하게는 25 내지 70%의 활성 성분을 함유한다.

단백질은 중성형태 또는 염형태로 백신으로 제현될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가염(펩타이드의 유리 아미노 그룹으로 형성됨)을 포함하고, 이들은 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘. 프로카인등과 같은 유기염기로부터 유도될 수 있다.

백신은 투여제형과 조화되는 방식으로 및 치료학적으로 유효하며 면역성이 있는 양으로 투여된다. 투여량은 예를들어, 항체를 합성할 수 있는 개개 면역계의 능력을 포함한 치료 대상자 및 목적하는 방어정도에 의해 결정된다. 투여에 필요한 활성성분의 정확한 양은 의사의 판단에 좌우된다. 그러나, 활성성분의 적합한 용량 범위는 백신당 수백 ㎍ 정도이다. 또한 일차투여 및 추가 접종에 적합한 요법은 다양하나, 전형적으로 일차 투여한 후 추가접종 또는 다른 투여를 시도한다.

적용방식은 매우 다양할 수 있다. 백신을 투여하기 위한 통상의 어떠한 방법도 적용가능하다. 이들 방식으로서 생리학적으로 허용되는 고형 기재상의 경구적용 또는 주사등에 의한 생리학적으로 허용되는 분산제로의 비경구적 적용 등이 포함된다. 백신의 용량은 투여경로에 의해 결정되며 숙주의 크기에 따라 다양할 수 있다.

백신의 면역 보강 효과를 달성하기 위한 여러가지 방법중에는 수산화알루미늄 또는 인산(알루미늄)(통상 인산염 완충염수중의 0.05 내지 0.1% 용액으로 사용됨)과 같은 제제를 사용하거나, 0.25% 용액으로서 사용된 당의 합성중합체(Carbopol)와 혼합하거나, 70° 내지 101℃ 범위의 온도로 30초 내지 2분동안 가열하여 백신중의 단백질을 침전시키는 것이 포함된다. 알부민에 대한 펩신 처리된 항체(Fab)로 재활성화시켜 침전시키거나, 씨. 파르붐과 같은 세균 세포 또는 그람-음성 세균의 내독소 또는 지다당류 성분과 혼합하거나, 만니드 모노-올레이트(Aracel A)와 같은 생리학적으로 허용되는 오일 비히클중에 유화시키거나, 차단치환체로 사용된 퍼플루오로카본(Fluosol-DA)의 20% 용액으로 유화시키는 것도 이용 될 수 있다.

많은 경우에 있어서, 백신은 수회 투여하는 것이 바람직할 수 있으며 보통 백신접종의 횟수는 6회를 초과하지 않는다. 보다 더 통상적으로는 백신 접종은 4 회를 초과하지 않으며 바람직한 백신 접종 횟수는 1회 또는 그 이상이지만 보통 적 어도 약 3회이다. 백신접종은 보통 2 내지 12주의 간격을 두고 이루어지며 보다 통상적인 접종간 기간은 3 내지 5주이다. 1 내지 5년의 간격, 보통 3년의 간격을 두고 주기적인 추가 접종을 하는 것이 방어수준의 항체를 유지하는데 필요할 수 있다. 면역화의 과정은 상등물 항원에 대한 항체의 검정이 후속될 수 있다. 이러한 검정은 방사성핵종, 효소, 형광물질등과 같은 통상의 표지물로 표지화하여 수행할 수 있다. 이러한 기술들은 잘 알려져 있으며 많은 특허에서 찾아볼 수 있다. 예시될 수 있는 특허로는 미합중국 특허 제3,791,932호, 제4,174,384호 및 제3,949,064호이다.

[실시예 1]

[외막단백질 단편의 EDTA-기본된 추출]

OMP 항원에 대한 항체를 얻기위하여 엠. 카타랄리스 균주 035E의 외막 단편을 면역원으로서 제조하였다. 엠, 카타랄리스 균주 035E 세포를 뇌심장 침출 브로쓰를 사용하여 한천 평판상에서 성장시켰다. 평판을 양초 소진 자(jar)에서 37℃로 항온 처리하였다. 계속해서, 이들 세포로부터 문헌[참조 : Murphy et al., Microb. Path., 1989]에 기술된 EDTA-기본된 추출방법에 의해 외막 단편을 제조하였다.

[실시예 2]

[엠. 카타랄리스 OMP의 원리]

선택된 엠. 카타랄리스 OMP에 대해 특이적인 모노클로날 항체에 대한 본원에 개시된 동정에 비추어, 다음과 같은 일반적인 공정을 이용하여 상응하는 OMP 항원을 정제할 수 있다. 엠. 카타랄리스 세포를 음파분쇄하여 세포 엔벨로프를 제조하거나 엠. 카타랄리스 세포를 EDTA-기본 처리하여 외막 단편을 추출한다. 이들 막을 이온성 또는 비이온성 세제로 처리하여 목적하는 단백질을 분리시킨 다음 통상의 컬럼 크로마토고래피를 사용하거나, 또는 면역친화성 기술에 의하여 정제할 수 있다.

[실시예 3]

[엠. 카타랄리스 외막 단백질에 대한 특이적인 모노클로날 항체의 제조]

본 실시예는 본 발명의 특정 관점을 실시함에 있어 본 발명자들에 의해 사용된 단계들을 예시한다. 특히 본 실시예는 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP 항원에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조 및 동정에 관한 것이다. 일단, 엠. 카타랄리스의 표면-노출된 OMP 항원에 대한 모노클로날 항체를 분비하는 하이 브리도마를 동정한 다음, 이들 OMP 항원에 대한 항체를 생산하는 것으로 결정된 하이브리도마를 선별하고 배양하여, 엠. 카타랄리스의 폐동맥 정화를 수반하는 것과 같은 다른 연구에 사용하기 위해 항체를 생산하였다.

BALB/c 마우스에 EDTA-기본된 추출방법에 의해 제조된 엠. 카타랄리스 균주 035E의 외막 단편을 복강내 주사하여 BALB/c 마우스를 면역화시켰다. 각각의 동물을 프로인트 완전 보조제 0.1ml중의 50 내지 100㎍ 단백질로 면역화시켰다. 한달 후, 불완전 프로인트 보강제중의 동일 단백질 제제를 동일량으로 마우스에 추가접종하였다. 3주후, PBS중에 현탁된 동일한 외막 제제의 50㎍ 단백질을 마우스에 정맥내로 (꼬리정맥내로)주사하였다.

“팬케이크(Pancake)” 용합방법이 다음과 같이 이용되었다:

SP_2/0-Agl4 형질세포종 세포를 사용하였다. 이들 세포를 15% 태아 소혈청, 1% 펀지죤(Fungizone) 및 8-아자구아닌 함유된 DMEM (둘베코 변형된 이글 배지)/페니실린-스트렙토마이신-글루타민 중에서 유지시켰다. 융합 2주전에 세포 일부를 1% 펀지죤은 함유되어 있지만 8-아자구아닌은 없는 배지에 옮겼다. 이들 세포는 10일동안 1 내지 2×10⁵/ml이하의 밀도로 유지시켰다. 융합 3일전부터 SP_2/0세포를 24시간마다 아배양시키고 약 2 내지 3×10⁵/ml의 밀도로 유지시켰다. 융합 3일전 마우스에 약 50㎍의 단백질 면역원을 정맥내로 추가접종하였다. 융합 당일에 두마리의 마우스를 경부 탈구시켜 죽였다.

무균적으로 비장를 제거하고 침연시켰다. 비장 세포들을 10ml의 DMEM-HY 배지(60ml NCTC-109, 6개 튜브 하이포크산틴- 티미딘-글리신 저장액. 6개 튜브 옥살로아세트산-소 인슐린 저장액, 12ml 페니실린-스트렙토마이신-글루타민, 2.7㎖ 100mM Na 피루베이트 및 508ml DMEM)에서 보존하였다. 실온에서 SP_2/0세포 및 비장세포를 170xg로 11분간 원심분리시켜 각각의 튜브에 수거하였다. SP_2/0세포 및 비장세포를 각각 총 5ml의 DMEM-HY 배지에 재현탁시켰다.

하이포크산틴-티미딘-글리신 저장액은 136mg 하이포크산틴을 100ml 0.1M HCI에, 38.7mg티미딘을 100ml H₂O에 2.3mg 글리신을 20ml H₂O에 첨가하여 제조하였다. 이들 용액들을 별도로 용해시키고 배합한 다음 2.2ml 응적으로 분획화시켰다.

옥살로아세트산-소 인슐린 저장액은 80.3mg 소 인슐린을 100ml H₂중에 용해시키고, 1.32gm 옥살로아세트산을 첨가한 다음 1ml 용적으로 분획화시켜 제조하였다.

이어서 비장 세포를 2×10⁸개 세포/5ml로 희석시키고 SP_2/0세포를 2×10⁷개 세포/5ml로 희석시켰다. 비장 세포 대 SP_2/0세포의 비는 10:1이다. 그런다음 비장 세포를 SP_2/0세포와 1:1의 비율로 혼합하였다. 비장-SP_2/0혼합물을 3ml의 50% PEG/DMEM-HY 배지로 35초간 처리하였다. 융합된 비장-SP_2/0세포를 DMEM-HY로 즉시 세척하고 30% HY:HIFCS(35ml DMEM-HY, 15ml FBS, 필터)에서 37℃로 24시간 동안 항온 처리하였다. 융합후 24시간 경과하여, 배지 및 융합된 세포를 20% HY:HIFCS(80ml DMEM-HY, 20ml FBS 필터)에 170xg로 5분간의 원심분리에 의해 수거하였다. 그런 후, 융합세포를 100ml의 20% HAT:HIFCS에 재현탁시키고 96-웰 미소역가 평판에 100㎕/웰로 옮겼다. 융합 1주후, 각각의 웰에 100㎕의 20% HY:HIFCS를 첨가하였다. 융합 2주후, 증식하는 하이브리드 세포를 함유한 웰이 산성이 됐을때, 각각의 양성 웰을 24-웰 평판상의 2ml웰로 나누고 배양 상등액을 항체의 성상 확인을 위해 검정하였다.

이들 클론으로부터의 상등물을, ELISA을 대한 항원으로서 엠. 카타랄리스 균주 035E의 EDTA-추출된 외막 단편을 사용하고 웨스턴 블롯에 대한 항원으로서 이들 균주의 세포 용해질을 사용하여 ELISA 결합 및 웨스턴 블롯에 의해 엠. 카타랄리스에 대한 항체에 대해 스크리닝하였다. 이어서, 키무라[참조 : Kimura, 1985 및 1986]등에 의해 기술된 바와 같이 양성 상등액을 간접적인 항체 접근 RIA에 의해 시험하여 외막 항원의 표면노출을 연구하였다.

이어서, 양성 하이브리도마를 표준 DME에 배양시키고, 모노클로날 항체를 에이[참조 : Ey, 1978]등에 의해 기술된 바와 같이 프로테인 A-세파로즈 CL-48상에서 세포 상등액으로부터 정제하였다.

웨스턴 블롯 분석에서 엠.카타랄리스와 반응하는 것으로 동정된 각각의 Mab를 간접적인 항체 접근 검정에 사용하여 이들 Mab가 엠. 카타랄리스의 표면-노출된 결정소와 반응하는지를 결정하였다. 수행된 항체 접근 검정은 패트릭[참조 : Patrick, 1987]등에 의해 기술되었다.

웨스턴 블롯 분석에서 약 80,000의 겉보기 분자량을 갖는 항원과 반응한 Mab 10F3은 균주 035E의 전체 세포의 표면에 결합한 것으로 나타냈다. 이 Mab는 굴리그[참조 : Gulig, 1987]등의 방법에 의해 콜로니 볼롯-RIA 분석에서 시험된 10개의 상이한 엠. 카타랄리스 균주중 4개와 반응하였다.

Mab 17C7은 웨스턴 블롯 분석에서의 두개의 상이한 크기 밴드와 반응하였다. 이 Mab는 분산형태로 이동한 겔의 상부 근처에 있는 밴드와 반응하였고, 때때로 약 200 내지 약 700kD의 겉보기 분자량으로 이동한 두번째 밴드와 반응하였다. 좀더 명확히 하기 위한 목적으로 이 Mab는 “HMWP” 항원과 반응하는 것으로 정의된다. 이 Mab는 균주 035E의 표면에 결합하였고 콜로니 블롯 RIA에서 시험된 10개의 모든 상이한 엠.카타랄리스와 반응하였다.

Mab 8B6은 쉐스턴 블롯 분석에서 겉보기 분자량이 약 30,000인 항원과 반응하였다. 이 Mab는 또한 균주 035E의 표면과 반응하였고 콜로니 블롯-RIA에서 시험된 상이한 엠.카타랄리스 10개 모두와 반응하였다.

[실시예 4]

[30, 80 및 100kD OMP에 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 엠. 카타랄리스의 폐동맥 정화도]

본 실시예는 본 발명의 특정 측면을 실시함에 있어 본 발명자들에 의해 사용된 단계들을 예시한다. 본 실시예는 30kD, 80kD 및 HMWP OMP에 대한 모노클로날 항체가 뮤린 모델 시스템을 이용하는 엠. 카타랄리스의 폐동맥 정화를 증진시키는 능력을 증명해준다. 따라서, 본 실시예는 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP에 대한 항체가 수동 면역화에 유용할 수 있으며 이들 OMP를 함유한 백신은 엠. 카타랄리스 감염에 대한 능동 면역을 제공할 수 있다는 것을 증명한다.

[A. 항체투여]

세균 챌린지 18시간전에, 모노클로날 항체 17C7, 8B6 또는 10F7을 정맥내 투여하여 5마리 마우스의 그룹을 수동 면역시켰다. 대조 동물은 해모필러스 듀크레이(Haemophilus ducreyi)의 외막 단백질에 대한 2H11 항체로 면역시켰다. 각 동물은 150㎍의 전체 단백질에 상당하는 등량의 정제 항체를 접종받았다.

[B. 세균 접종 방법]

2mg의 케타민 HCL(아이오와주 포트 도지에 소재하는 Fort Dodge Lab로부터 입수) 및 0.2mg의 아세프로마진 말레이트(Fort Dodge Lab으로부타 입수)를 근육내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 각 마우스의 기관을 드러낸후 20게이지 정맥내 카테터를 반투명한 기관벽을 통해 가시화될때까지 경구적으로 삽관시켰다. 이어서, 5㎕의 세균 현탁액을 함유한 PE-10 폴리에틸렌 튜브를 카테터를 통해 폐속에 이르게하여 세균을 150㎕의 공기를 사용하여 부착시켰다. 이 기술은 접종물을 폐의 국부적 주변 절편으로 전달하였다. 모든 실험에서, 마우스를 엠. 카타랄리스 균주 035E로 챌린지시켰다.

[C. 폐동맥 정확도]

각 실험에서, 접종후 즉시(0시간) 0.75mg의 나트륨 펜토바르비탈(일리노이주 시카고 소재의 Abbott Labs로부터 입수)을 복강내 주사하여 5마리 마우스를 치사시키고 폐내의 세균 부착량을 측정하였다. 챌린지후 6시간 경과하여, 실험 그룹(17C7-, 8B6- 또는 10F3로 면역화됨) 및 대조 그룹(2H11로 면역화됨)을 치사시키고 폐에 남아있는 생균수를 다음과 같이 측정하였다: 각 마우스의 폐를 무균적으로 제거하고 조직 균질화기내의 2ml의 무균 BHI 브로쓰중에서 균질화한 다음 조직 분쇄기에서 연화될 때까지 분쇄시켰다. 균질물을 BHI 브로쓰에 연속하여 희석시키고, BHI 한천상에 플레이팅 다음 5% CO₂대기가 들은 공기 항온기에서 37℃로 24시간동안 항온 처리하였다. 폐로부터의 엠. 카타랄리스의 정화도는 동일실험에서 0시간에 폐에 존재하는 세균의 평균 cfu (콜로니 형성단위)와 비교하여 각 시간대에서 폐에 남아있는 cfu의 백분율로서 나타낸 것이다.

[결과]

0.98×10⁵내지 2.0×10⁵cfu의 엠. 카타랄리스 035E를 볼러스 부착후 면역된 마우스 및 대조 마우스의 폐에 남아있는 생균의 평균수를 측정하고 초기 접종물의 백분율로서 표시하였다.

[표 3]

표 3은 Mab 8B6에 대한 폐동맥 정화도 데이타를 포함하지 않고 있다. 이러한 Mab는 초기에는 양성으로 나타났으나 추가의 연구에서는 폐의 정화도에 관한 초기의 양성 발견을 재현하는데 실패했다. 후속 연구에서 Mab 8B6는 제한된 방어 효과를 갖고 있는 것으로 나타났지만 17C7 또는 10F3 만큼 방어적이지 못했다. 이들 후속 연구(2번의 실험)에서, 8B6는 6시간에 남아있는 평균 세균율(%)이 대조 Mab 2H11의 약 97에 비해 38로 나타났다

[실시예 5]

[엠. 카타랄리스의 80kD OMP(10F3-반응성)를 암호화하는 유전자의 클로닝]

본 실시예는 엠. 카타랄리스로부터의 80kD OMP를 암호화하는 유전자를 클로닝함에 있어 본 발명자에 의해 사용된 단계를 예시한 것이다. 본 실시예는 하기 공정에 의해 분리된 80kD OMP 항원을 발현하는 하나 이상의 바람직한 재조합 이.콜라이 클론을 기술한다.

[A. 게놈성 DNA의 분리]

본 연구에서 대표적인 모락셀라 병원균으로서 엠. 카타랄리스 균주 035E를 사용하였다. 엠. 카타랄리스 균주 035E로부터 게놈성 DNA를 다음과 같이 추출하고 정제하였다. 한천 평판으로부터 엠, 카타랄리스 세포(약 2g 습윤 중량)를 긁어모아 20ml PBS중에 재현탁시켰다. 이 현탁액에 3.2ml 10%(w/v) SDS와 1ml RNase(10mg/ml)를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 항온 처리한 다음 3mg 단백질 분해효소 K를 첨가한 후 55℃ 에서 밤새 추가로 항온 처리하였다. 이어서, 항온 처리된 혼합물을 페놀로 1회 추출하고, 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올로 2회 추출하며, 클로로포름:이소아밀 알코올로 3회 추출하였다. 생성된 DNA를 2 용적의 무수 에탄올로 침전시키고 파스테르 피펫으로 수거하였다.

[B. pBR322내 엠. 카타랄리스 게놈성 라이블러리의 제조]

약 1.5ml의 반응 용적으로 다양한 양의 제한효소 PstI와 함께 100㎍ 분량의 엠. 카타랄리스 게놈성 DNA를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리함으로써 게놈성 DNA의 일부 분해를 달성하였다. 이어서, 부분적으로 분해된 게놈성 DNA를 슈크로스 밀도 구배 원심분리하여 크기별로 분별하였다. 길이가 약 6kb 내지 23kb인 DNA 단편을 함유한 분획을 선택하고 투석하여 pBR322에 연결시키기 위한 게놈성 DNA 단편 정제물을 수득하였다.

pBR322 15㎍을 50 단위의 PstI와 100㎕ 반응용적으로 37℃에서 18시간동안 항온 처리시켜 플라스미드 벡터 pBR322를 PstI 으로 완전히 분해시켰다. 만니아티스등[참조 : Maniatis et al, 1982]에 의해 기술된 조건하에 300ng의 정제된 DNA 단편 및 PstI-분해된 pBR322를 ATP 및 T4 DNA 리가제와 함께 항온 처리하여 정제된 DNA 단편을 PstI- 분해된 pBR322 벡터내로 연결시켰다. 연결후, DNA를 10mM 트리스-HCI(pH 8.0)으로 1:5로 희석시키고 이를 사용하여 CaCl₂방법에 의해 컴피던트(competent) 이.콜라이 RRI을 형질전환시켰다

[C. 엠. 카타랄리스 OMP 발현에 대한 콜로니 블롯-방사성 면역검정법에 의한 형질 전환된 RR1 콜로니의 스크리닝]

일차 항체로서 모노클로날 항체 10F3을 사용하여 굴리그 등 [참조 : Gulig et al., 1987]에 의해 기술된 바와 같이 콜로니 블롯 RIA를 수행하였다.

[D. 엠. 카타랄리스 OMP 항원을 발현하는 재조합 이.콜라이 클론의 성상확인]

콜로니 블롯 RIA에서 모노클로날 항체 10F3과 반응한 클론을 항생물질 테트라사이클린(15㎍/ml)이 함유된 LB 배지를 사용하여 배양하였다. 엠. 카타랄리스 OMP 항원을 발현하는 재조합 이.콜라이 RR1의 전체 세포 용해질은 패트릭 등[참조 : Patrick et al., 1987]에 의해 기술된 바와 같이 제조하였다. 요약하면, 이들 전체 세포 용해질을 굴리그(1987)등에 기술된 바에 따라 SDS-PAGE한 다음, 쿠마시 블루로 염색하거나 웨스턴 블롯 분석을 위해 니트로셀를로즈에 옮겼다.

제1도에 나타낸 결과는 모노클로날 항체 10F3에 의해 동정된 클론에서 재조합 80kD OMP 유전자가 발현되었음을 가리킨다. 이 클론을 pMEH 100으로 명명하였다. 서열분석을 위해 pMEH 100의 2.5kb 아단편을 pBluescript SK+ 벡터내에 아클로닝시켰다(pMEH 120). 제2도는 pMEH 120의 예비적인 제한분석을 보여준다.

[실시예 6]

[엠. 카타랄리스의 30kD(8B6-반응성) 및 100kD(17C7-반응성) 외막 단백질을 암호화하는 유전자의 클로닝]

[A. 게놈성 DNA의 분리]

다른 클로닝 과정으로 엠. 카타랄리스 게놈성 DNA를 균주 035E로부터 분리하고 정제하여 100㎍ 샘플을 PstI에 대해 상기한 바와 같이 Sau3A(Promega Bisotech으로부터 입수)로 실온에서 부분적으로 분해시켰다.

[B. 박테리오파아지 벡터 λGEM-11를 사용한 엠. 카타랄리스 게놈성 DNA 라이브러리의 제조]

분해된 DNA를 슈크로스 밀도 구배로 크기별 분별하고 라이브러리의 작제에 사용하기 위하여 15kb 이상의 DNA 단편을 수거하였다. 이들 단편(1㎍)을 클레노우 공정(Promega)에 따라 14℃에서 90분간 충전시켰다. 이어서, 표준절차에 따라 단편을 세척하고 파아지 DNA 암상(arm)에 연결시킨 다음, BRL로부터의 T4 DNA 리가제를 사용한 것을 제외하고는 Promega에 의해 제공된 프로토콜 및 시약을 사용하여 λGEM-11^*Xho I Half-Site Arms 클로닝 시스템에서 패키징하였다. 패키징후 이.콜라이 LE 392를 사용하여 파아지-기본된 라이브러리를 역가 측정하였다. 이러한 게놈성 라이브러리는 50,000개의 재조합 클론을 함유하였다.

[C. 모노클로날 항체 17C7 및 8B6로 박테리오파아지-기본 게놈성 DNA 라이브러리의 선별]

클론 뱅크를 스크리닝하기 위하여, Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience)에 기술된 플라크 스크리닝 절차에 따라 플라크 물질에 결합된 Mab를 검출하기 위한 프로브로서 방사성 요오드화 처리된 염소 항-마우스 1g를 사용하여 20,000개의 플라크를 Mab 17C7 및 8B6와 면역반응시켰다. 종국적으로 각각의 Mab와 반응하는 1개의 재조합 파아지를 동정하였다.

[D. Mab 17C7 및 8B6와 반응하는 재조합 파아지의 성상확인]

Current Protocols in Molecular Biology에 기술된 표준방법에 따라 상기 재조합 파아지의 액체 용해 배양물을 제조하였다. 표준방법을 사용하여 DNA를 추출하였다. 액체 용해질로부터 수확된 파아지를 표준 SDS 분해 완충액에서 3분간 100℃로 가열한 다음 이를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 사용하여 이들 재조합 파아지가 적절한 엠. 카타랄리스 항원을 발현하였음을 검증하였다.

Mab 17C7과 반응하는 재조합 파아지(MEH 200)는 HMWP의 암호화 DNA를 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 제3도는 약 11kb 크기의 삽입체를 함유하고 있는 MEH 200의 예비제한 지도를 보여준다. pMEH 300으로 명명된 두번째 클론은 Mab 8B6-반응성 30kD 항원을 암호화하는 약 18kb 크기의 DNA 절편을 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다.

제4도는 30kD OMP 항원을 발현하는 이.콜라이 클론 LE 392/8B6으로부터의 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 이 연구에서는 여러 샘플을 PAGE하고, 니트초셀를로즈 막에 옮긴다음 30kD OMP-특이적 모노클로날 항체 8B6로 검출하였다. 제4도에서, 분자량이 약 30kD인 밴드가 LE 392/8B6 레인 (레인 C)에 나타나 있으며 유사한 밴드가 양성 대조 레인(레인 F)에 나타나 있다. LE 392/8B6 레인(레인 C)에 나타난 2개의 추가적인 밴드는 불명료하나 이들 밴드는 재조합 단백질의 프로쎄싱 또는 겔의 과부하 때문일 수 있다. 음성 대조 레인(레인 D 및 E)에 나타란 밴드는 레인 C 및 F로부터 과잉누출되었기 때문이다.

제5도는 모노클로날 항체 17C7로 검출되어 LE 392/17C7로 명명된 HMWP OMP를 발현하는 클론으로부터의 파아지 용해질의 유사한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 레인 C 내지 I는 클론 LE 392/ 17C7로부터의 파아지 용해 단백질을 함유한다. 이들 레인은 극히 고분자의 범위에서 약간의 반응성을 나타낸다.

본 발명은 본 발명을 실시하는데 바람직한 방식을 포함하는 것으로 본 발명자들에 의해 발견되었거나 제안된 특정 양태의 관점에서 기술되었다. 이러한 본 발명의 기술내용에 비추어 본 분야 전문가에게는 예시된 특정 양태로부터 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 많은 변형 및 변화가 이루어질 수 있음은 자명하다. 예를 들면, 코돈의 중복성 때문에 단백질 서열에 영향을 미치지 않고 기존 DNA 서열을 변형시킬 수 있다. 또한, 생물학적 작용상 등가로 인해 생물학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않고 단백질 구조에 변형을 가할 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 특허청구의 범위에 속한다 할 것이다.

하기 문헌들은, 본원에 설명된 예시적 절차 또는 기타 세부적인 보충사항을 제공하는 범위에서, 본원에 특별히 참조로 인용된다:

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Claims

8B6(ATCC HB 11091), 10F3(ATCC HB 11092) 및 17C7(ATCC HB 11093)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 모노클로날 항체와 면역 반응을 나타내는 에피토프를 갖는 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis) 세포외막 단백질 또는 펩타이드 항원을 포함하는 항원 조성물.
제1항에 있어서, 항원이 모락셀라 카타랄리스 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP로서 추가로 정의되는 조성물.
제1항에 있어서, 항원이 다른 모락셀라 카타랄리스 항원의 항원성 에피토프를 실질적으로 함유하지 않는 조성물.
제1항에 있어서, 항원이 상기한 에피토프를 갖는 펩타이드로서 추가로 정의되는 조성물.
제4항에 있어서, 항원이 15개 내지 50개 아미노산 길이의 펩타이드를 포함하는 조성물.
제5항에 있어서, 항원이 15개 내지 30개 아미노산 길이의 펩타이드를 포함하는 조성물.
제4항에 있어서, 펩타이드 항원이 모락셀라 카타랄리스 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP의 에피토프를 갖고 있는 조성물.
a) 8B6(ATCC HB 11091), 10F3(ATCC HB 11092) 및 17C7(ATCC HB 11093)으로 이루어진 그룹중에서 선택된 모노클로날 항체와 면역 반응을 나타내는 에피토프를 갖는 모락셀라 카타랄리스 세포외막 단백질 또는 펩타이드 항원을 발현할 수 있는 세포를 선별하는 단계; b) 항원의 발현을 유도하는데 효과적인 조건하에서 세포를 배양하는 단계; 및 c) 항원을 수거하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 조성물의 제조방법.
제8항에 있어서, 항원이 모락셀라 카타랄리스 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 세포가 모락셀라 카타랄리스 세포를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 세포가 상기 항원을 암호화하는 재조합 DNA 절편을 발현하는 재조합 숙주 세포를 포함하는 방범.
제11항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 세균 숙주 세포를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 세균 숙주 세포가 에스케리키아 콜라이, 해모필루스 인플루엔자애, 살모넬라, 마이코박테리움, 또는 바실러스 서브틸리스 새포를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 재조합 DNA 절편이 모락셀라 카타랄리스 30kD, 80kD 또는 HMWP OMP 또는 이의 항원성 아 단편을 암호화하는 방법.
제8항에 있어서, 모락셀라 카타랄리스의 외막 소포의 세제 추출을 포함하는 방법에 의해 항원을 정제함을 추가로 포함하는 방법.
제1항의 항원에 대한 항체.
제16항에 있어서, 모노클로날 항체로서 추가로 정의되는 항체.
제17항에 있어서, 모노클로날 항체 10F3과 동일한 항원과 교차-반응하는 모노클로날 항체로서 추가로 정의되는 항체.
제17항에 있어서, 모노클로날 항체 17C7과 동일한 항원과 교차-반응하는 모노클로날 항체로서 추가로 정의되는 항체.
제17항에 있어서, 모노클로날 항체 8B6과 동일한 항원과 교차-반응하는 모노클로날 항체로서 추가로 정의되는 항체.
a) 제16항에 따른 항체; b) 면역검출 시약; 및 c) 상기 항체 및 시약을 보유할 수 있는 수단을 포함하는, 샘플내의 제1항에 따른 항원의 존재 여부를 검출하는데 사용하기 위한 키트.
a) 제1항에 따른 항원; b) 면역검출 시약, 및 c) 상기 항원 및 시약을 보유할 수 있는 수단을 포함하는, 샘플내의 제16항에 따른 항체의 존재 여부를 검출하는데 사용하기 위한 키트.
제1항에 따른 항원을 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 보조제와 항께 포함하는 백신 조성물.
제16항에 따른 항체를 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 보조제와 합께 포함하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 동물에서 모락셀라 카타랄리스 챌린지에 대한 관용(tolerance)을 유도하기 위한 방법에 사용하기 위한 항체.
제16항에 있어서, 수동 면역치료법을 이용하여 동물에서 모락셀라 카타랄리스 챌린지에 대한 관용을 유도하기 위한 방법에 사용하기 위한 항체.
제25항 또는 제26항에 있어서, 항체가 제1항에 따른 항원에 반응하여 동물 자신의 면역계에 의해 생성된 항체.