JPH09503210A

JPH09503210A - ブランハメラ・カタラリスに対するワクチン

Info

Publication number: JPH09503210A
Application number: JP7510417A
Authority: JP
Inventors: マーフィー，ティモシー，エフ．
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1993-09-29
Filing date: 1994-09-27
Publication date: 1997-03-31
Also published as: DK0737085T3; ATE321585T1; CA2172728A1; AU701340B2; PT737085E; ES2259792T3; FI961407A; DE69434681D1; FI961407A0; US5712118A; EP0737085A1; AU7959394A; DE69434681T2; FI117789B; WO1995009025A1; EP0737085B1; EP0737085A4; US5725862A

Abstract

(57)【要約】ブランハメラ・カタラリスの外膜蛋白質“ＣＤ”、及びそのペプチド類及びオリゴペプチド類を含む組成物が記載されている。更に、この蛋白質、ペプチド又はオリゴペプチドをコード化するヌクレオチド配列が開示されており、これらの配列を含む組換えベクターも開示されている。蛋白質、ペプチド又はオリゴペプチドは、これらの組換えベクターを含む宿主細胞系から製造することかできる。又、ペプチド類及びオリゴペプチド類は化学的にも合成することができる。この蛋白質、ペプチド類及びオリゴペプチド類の、ワクチン製剤用の抗原としての使用、及び診断イムノアッセイにおける抗原としての使用も開示されている。このヌクレオチド配列は、組換え細菌性ワクチンを構築する際に弱毒化された細菌の中へ挿入するための、及び、組換えウイルスワクチンを構築する際にウイルスベクターの中へ挿入するためのワクチンとして使用するベクターを構築するのに有用である。又、ビー・カタラリスを検出するための分子診断アッセイにおけるプライマー及び／又はプローブとして、ＣＤをコード化する遺伝子に関連したヌクレオチド配列の使用も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】ブランハメラ・カタラリスに対するワクチン本発明は、米国国立衛生研究所より与えられた助成金 A128304号の政府援助によってなされたものである。米国政府は本発明に特定の権利を有している。本願は、1993年９月29日付けで出願した私の同時係属中の先願である米国特許願第08/129,719号の一部継続出願である。尚、この出願は本願明細書に援用するものである。発明の技術分野本発明は、ブランハメラ・カタラリス(カタル球菌、Branhamella catarrhalis )の外膜に関連する蛋白質及びそのペプチド類とオリゴペプチド類を含有する組成物に関する。更に詳しくは、本発明は、ビー・カタラリスに見られる見掛け分子量が約５５，０００〜６０，０００ダルトンの外膜蛋白質“ＣＤ”に関連する蛋白質及びそのペプチド類とオリゴペプチド類に関する。又、組換えＤＮＡ及び／又は生化学的方法を用いてＣＤ及びＣＤペプチド類を製造する方法も開示する。又、これらに関連して、ＣＤをコードするＤＮＡ配列、ＣＤ及びＣＤのペプチド類とオリゴペプチド類を発現させるのに有用な組換えベクター、並びにこのような組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を開示する。これらの蛋白質類、ペプチド類及びオリゴペプチド類は、能動免疫化に用いるワクチン製剤の免疫原として用いられ、及び受動免疫化に有用な蛋白質特異的抗血清とペプチド特異的抗血清を生成させるために用いることができ、並びに診断アッセイ用試薬として用いることができる。本願明細書に開示するヌクレオチド配列は、ビー・カタラリス(B.catarrhalis)の遺伝物質の検出を行う診断アッセイに試薬として用いることが可能で、かつ遺伝ワクチン製剤として用いる発現ベクター中に組み込むことができる対応するオリゴヌクレオチドの合成に用いられる。発明の背景ブランハメラ・カタラリス（モラクセラ・カタラリス(Moraxella catarrhalis )としても知られている）は、ヒトの気道の有力な病原体である。ビー・カタラリスは、発症因子を確認するため鼓室穿刺術が用いられている研究で立証されているように、ストレプトコッカス・ニウモニエ(Streptococcus pneumoniae)と型別不能のヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)に次いで３番目に最も普通の、幼児と小児の中耳炎の原因である（Murphy，Pediatr．Infect ．Dis．J.，８巻、S75-S77，1989年）。ビー・カタラリスは、小児と成人の両者の静脈洞炎と結膜炎の普通の原因であり（例えばBluestone，Drugs，31巻、S132 -S141，1986年; Brorson等，Scand．J．Infect．Dis.，８巻、151-155頁、1976 年；及びRomberger等，South．Med．J.，80巻、926-928頁、1987年参照）、そして、慢性気管支炎と慢性の閉鎖性肺疾患の成人の下気道感染症の有力な原因である（Murphy等，Am．Rev．Respir．Dis.，146巻、1067〜1083頁，1992年；Catlin ，Clin．Microbiol．Rev.,３巻、293-320頁、1990年）。その上に、ビー・カタラリスは、易感染性宿主に肺炎、心内膜炎、敗血症及び髄膜炎を起こすことがある（Cocchi等，Acta Paediatr．Scand.，57巻、451-453頁、1968年；Douer等，A nn．Intern．Med.，86巻、116-119頁、1977年；McNeely等，Am．Rev．Respir．D is.，114巻、399〜402頁，1976年）。反復性中耳炎はかなりの罹患率であるから、このような感染症を予防する戦略を明らかにすることに関心がある。その方法の一つはワクチンの開発である。細菌性中耳炎を予防するのに有効なワクチンは、エス・ニウモニエ、型別不能のエイチ・インフルエンゼ及びビー・カタラリスによる感染に対して防護する抗原を含有している必要がある。実際に、肺炎球菌と型別不能のエイチ・インフルエンゼに対するワクチンの開発が進行中であり、可能性がある防御抗原が確認されて現在試験中である（例えば、Murphy等の米国特許第 5,173,294号及びVella等，I nfect．Immun.，60巻、4977〜4983頁、1992年参照）。これらのワクチンが開発されて一層広く使用されると、ビー・カタラリスの中耳炎の原因としての相対的な重大性が、次の１０年間に増大するであろう。ビー・カタラリスが起こす中耳炎を予防するワクチンから利益を受ける幼児と小児だけでなく、慢性閉鎖性肺疾患の成人及び易感染性の小児と成人もビー・カタラリスが起こす感染症を予防するワクチンから利益を受けるであろう。可能性があるワクチン抗原として研究されている細菌の成分としては、多糖類、リポ多糖類又はその修飾体及び外膜蛋白質類がある。一般に、エイチ・インフルエンゼのｂ型莢膜多糖によって代表されるように、多糖類の抗原は１８箇月未満の年齢の小児の場合、不充分な免疫原であることが分かっている。リポ多糖類（ＬＰＳ）による能動免疫化は、その固有の毒性のため許容できない。ＬＰＳの病態生理学的な作用としては、発熱、白血球減少症、白血球増加症、シュワルツマン反応、播種性血管内凝固、及び多量投与時のショックと死亡が挙げられる。一般に蛋白質は、年齢が約３箇月の幼児の場合、免疫原性を有している。従って、外膜蛋白質は、可能性があるワクチン抗原として研究されている。ビー・カタラリスの外膜蛋白質を中心にして細菌研究が開始されているが、これら蛋白質の抗原構造と分子構造についてはほとんど分かっていない。ＳＤＳ− ＰＡＧＥによる精製外膜の試験によって、ビー・カタラリスの菌株中にかなり均一なパターンで存在することが明らかになっている（Bartos及びMurphy，J．Inf ect．Dis.，158巻、761〜765頁、1988年）。Ａ−Ｈのアルファベット文字で呼ばれる８種の主外膜蛋白質が同定されている（Murphy等，Microbial Pathogen.,６巻、159〜174頁、1989年；Bartos等，J．Infect．Dis.，158巻、761〜765頁、19 88年）。外膜蛋白質ＣとＤは見掛けの分子量の差がわずかなので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法でダブレットとして出現する。ビー・カタラリスに対するモノクローナル抗体を発生させて２種のモノクローナル抗体７Ｄ６と５Ｅ８が得られているが、これらの抗体は蛋白質ＣとＤの両者を認識した（Sarwar等，Infect．Im mun.，60巻、804〜809頁、1992年）。本発明が開発される前は、このダブレットが二つの安定な立体配座を有する単一の蛋白質（ＣＤ）を表すのかどうか、又はＣとＤが異なる遺伝子によってコードされる２種の密接な類縁関係にある蛋白質であるのかどうか知られていなかった（Sarwar等の上記文献）。蛋白質ＣとＤは、無傷のビー・カタラリスの表面上に少なくとも一つの保存エピトープを発現するので、特にワクチンを開発するのに重要である（Sarwar等の1992年の上記文献）。従って、ビー・カタラリスが重大な細菌病原であるという認識が高まって、小児と成人にとって免疫原性であるワクチンが要望されている。このようなワクチンは、無傷の細菌上に表面露出エピトープを有する細菌成分に関連するものでなければならず、そのエピトープはビー・カタラリスの菌株中に保存されている。発明の要約本発明は、見掛け分子量が約５５，０００〜６０，０００ダルトンであるビー・カタラリスの外膜蛋白質に関連する蛋白質とペプチド類に関する。なお、この外膜蛋白質は以前は２種の類縁蛋白質Ｃ及びＤであると考えられていたが、本明細書に開示する組換えＤＮＡ法によって、現在は１種の蛋白質ＣＤであることが分かっており、この蛋白質は熱によって一時的に変異し（heat modifiable）、ＳＤＳゲル中の泳動が異なる２種の蛋白質の外観を示す。本発明のＣＤ蛋白質、及びそのペプチド類（本明細書では“ＣＤペプチド類”と呼ぶ）とオリゴペプチド類（本明細書では“ＣＤオリゴペプチド類”と呼ぶ）は、予防及び／又は治療用のワクチン製剤中の免疫原として、又はビー・カタラリス特異的抗体の血清力価の増大を測定することによってビー・カタラリス感染症を検出する診断イムノアッセイにおける抗原として使用できる。又、本発明のＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類及びＣＤオリゴペプチド類は、受動免疫化を行うのに有用なＣＤ特異的抗体を生成させるのに使用できるし、臨床試料中にビー・カタラリスが存在するのを検出する診断アッセイ用の試薬としても使用できる。ＣＤペプチド類又はＣＤオリゴペプチド類は、化学的に合成するか、ビー・カタラリスから精製するか、又は本明細書に開示の核酸配列を用いて組換えベクター発現系から産生させることによって得ることができる。本発明の一つの実施態様は、プラスミドＤＮＡ；並びに発現された蛋白質又はペプチド類を精製できる適当な宿主細胞内でＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類又はＣＤオリゴペプチド類を発現させるのに使用できるヒトウイルス、動物ウイルス、昆虫ウイルス、又はバクテリオファージのようなウイルスのＤＮＡとを含む新規なＤＮＡ配列とベクターの構築に関する。又、本発明の他の実施態様は、ＣＤをコード化する遺伝子、及びＣＤペプチド類又はＣＤオリゴペプチド類をコード化する遺伝子フラグメントの分子クローン化を行う方法を提供するものである。本発明の核酸配列は、核酸を増幅し、その増幅された核酸を検出する際のプライマー及び／又はプローブとして使用するＣＤ配列特異的オリゴヌクレオチドの合成を含めて、核酸のハイブリット形成によるビー・カタラリス遺伝物質の分子診断アッセイに用いることができる。その上、ＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類及びＣＤオリゴペプチド類は、免疫原が、化学的に合成されたもの、ビー・カタラリスから精製したもの、又は組換え発現ベクター系から精製したものであっても、ビー・カタラリスの病原菌株に対する予防及び又は治療のワクチンにおける免疫原として使用できる。あるいは、ＣＤコード化する遺伝子又はＣＤペプチド類もしくはＣＤオリゴペプチド類をコード化する一つ以上の遺伝子フラグメントは、それ自体で又は他の病原微生物の免疫原性エピトープと組合わせてＣＤの免疫原性エピトープを一つ以上産生するよう製造された組換えの細菌又はウイルスを含有する細菌性又はウイルス性のワクチンに組み込むことができる。さらに、一つ以上の調節要素に有効に連結された、ＣＤをコード化する遺伝子又はＣＤペプチド類もしくはＣＤオリゴペプチド類をコード化する一つ以上の遺伝子フラグメントは、ヒトに直接導入され、蛋白質ＣＤ、ＣＤペプチド類、又はＣＤオリゴペプチド類を発現して防御免疫応答を誘発することができる。図面の簡単な説明図１は、ｐＥＴ１１ｂと、ＣＤをコード化する遺伝子を含有する２．４ｋｂのフラグメントとから構築したプラスミドｐＣＤ−１の地図を示す。陰影をつけた領域はＤＮＡ挿入断片を示し、太くした陰影領域はＣＤ遺伝子を示す。使用されている略語は次のとおりである。Ａｐ：アンピシリン耐性のコーティング領域；Ｌａｃ：Ｌａｃオペロン；ｂｐ：塩基対。図２は、ｐＧＥＭ７ｚｆと、ＣＤをコード化する遺伝子を含有する１．５ｋｂのフラグメントとから構築したプラスミドｐＣＤ−２の地図を示す。陰影をつけた領域はＤＮＡ挿入断片を示し、太くした陰影領域はＣＤをコード化する遺伝子を示す。使用されている略語は次のとおりである。Ａｐ：アンピシリン耐性のコーティング領域；Ｌａｃ：Ｌａｃオペロン；ｂｐ：塩基対。図３は、以下のものの全細胞溶解物の免疫ブロット検定の結果を示す。すなわち、レーンａ：ｐＧＥＭ７ｚｆで形質転換されたイー・コリＨＢ１０１；レーンｂ：ＣＤをコード化する遺伝子を含有するするｐＣＤ−２で形質転換されたイー・コリＨＢ１０１；及びレーンｃとｄ：ビー・カタラリス菌株２５２４０。レーンｂとｃは類似の量の蛋白質（約２０μｇ）を含有し、一方、レーンｄは蛋白質の含有量が少なく、ＣＤの特徴的なダブレットを示す。諸試料は、０．０６Ｍトリス、１．２％ドデシル硫酸ナトリウム、１２％グリセリン及び５．８％β−メルカプトエタノールを含有する試料緩衝液中で１００℃にて１０分間インキュベートした。その免疫ブロットを、ＣＤ蛋白質上のエピトープを認識する抗体５Ｅ８で展開した。分子量のマーカーを左側にダルトンの千位の数値で示してある。図４は、ビー・カタラリスの１３種の菌株の精製ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、ＣＤ遺伝子配列に対応する二つの標識オリゴヌクレオチドでプローブしたサザンブロット検定の結果を示す。３．７キロ塩基のバンドを示す矢印はＣＤをコード化する遺伝子内のＥｃｏＲＩ部位の上流のフラグメントを示し、そして、３２５個の塩基対のバンドを示す矢印は上記Ｅｃｏｒｉ部位の下流のフラグメントを示す。レーンは、左から右へ、以下の菌株：１０５、１１２、１３５、３、６、１０、２０、２７、３１、４０、４２、４５、５６由来のＤＮＡを含有している。図５は、ビー・カタラリスの１４種の菌株の精製ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、ＣＤをコード化する遺伝子内のＥｃｏＲＩ部位とＰｓｔＩ部位の間の配列に対応する標識オリゴヌクレオチドでプローブしたサザンブロット検定の結果を示す。レーンは、左から右へ以下の菌株：５５５、５５６、５８５、３５８３、３６１４、４２２３、４６２９、５１９３、６９５１、９９２８、２５２４０、Ｍ３、Ｍ３、Ｍ９由来のＤＮＡを含有している。図６は、クーマシーブルーで染色したトリシン−ドデシル硫酸ナトリウムゲルを示す。レーンＡ：精製ＣＤ；臭化シアンによる切断で生成したフラグメントを示す（これらフラグメントの計算された大きさは表２に示す）。レーンｂの大きなフラグメントの下方の二重バンドは、ＣＤについて観察されることが多い蛋白質の非特異的な蛋白質分解の結果である。分子量のマーカーを右側にダルトンの千位の数値で示してある。発明の詳細な説明本発明は、“ＣＤ”と呼ばれる、ビー・カタラリスの細菌外膜蛋白質及びそのペプチド類の組成物に関する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いると、ＣＤ蛋白質は、熱で一時的に変異する蛋白質の特徴である２バンドのダブレットとして泳動し、見掛けの分子量は５５，０００〜６０，０００ダルトンである。本発明の一つのヌクレオチド配列（配列番号１４）で分かるように、ＣＤをコード化する遺伝子は、成熟ＣＤ蛋白質の予想アミノ酸配列は計算分子量が約４５，７８８ダルトンであることを示している。本発明のＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類、及びＣＤオリゴペプチド類は本明細書に述べる組換えＤＮＡ法を用いて製造するか、又は本発明で開示するアミノ酸配列から化学的に合成することができる。さらに、ペプチド類は成熟蛋白質を酵素によって切断するか、又は化学的に切断することによって製造することができる。免疫原性エピトープを有するＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類、及びＣＤオリゴペプチド類は、ビー・カタラリスが起こす中耳炎、静脈洞炎、結膜炎、及び下気道感染症を予防する場合の各種ワクチン性剤の免疫原として用いることができる。更に、本発明によって製造されるＣＤ蛋白質とＣＤペプチド類は、ビー・カタラリスによって起こる感染症に対する受動免疫化に有用なビー・カタラリス特異的抗血清を生成させるのに使用できる。本発明は更に、ＣＤをコード化する遺伝子のヌクレオチド配列並びに単離された遺伝子から推定されるアミノ酸配列を提供するものである。本発明の一つの実地態様によれば、組換えＤＮＡ法を用いて、ＣＤをコード化する遺伝子、又は一つの免疫原性エピトープを有する一つ以上のＣＤペプチドをコード化する遺伝子フラグメントを発現ベクター中に組み込み、次いで、その組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入して、その特定の宿主細胞内がこれらの配列を発現させる。その発現系は、宿主細胞に導入された組換えベクターを含有しているが、（ａ）精製してワクチン製剤の免疫原として使用できるＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類、及びＣＤオリゴペプチド類を製造するのに使用でき；（ｂ）診断イムノアッセイ又は治療値及び／又は診断値のビー・カタラリス特異的抗血清の生成に用いる抗原として使用されるＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類、及びＣＤオリゴペプチド類を製造するのに使用でき；又は（ｃ）組換え発現ベクターがワクシニアウイルスのような生ウイルスである場合、そのベクター自体が、ＣＤ又は免疫原性のＣＤペプチド類もしくはＣＤオリゴペプチド類を発現させるため宿主細胞中に導入される生ワクチン製剤又は不活化ワクチン製剤として使用可能であり；（ｄ）ＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類、もしくはＣＤオリゴペプチド類を発現させて個体に予防接種するのに使用される生きている弱毒細菌細胞中に導入するのに用いられ；又は（ｅ）個体に直接導入して、コード化されて発現されるＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド、又はオリゴペプチドに対して免疫化するのに使用される。上記目的を達成するため、本発明の方法と化合物を以下の実施態様で説明する。実施態様Ａ−ＣＤをコード化する遺伝子及びＣＤエピトープを発現するベクターの分子クローン化と配列決定。実施態様Ｂ−ビー・カタラリス菌株における、ＣＤをコード化する遺伝子の保存。実施態様Ｃ−ビー・カタラリスを検出するための分子診断アッセイでＣＤ特異的ヌクレオチド配列を使用する方法。実施態様Ｄ−ＣＤペプチド類の生成を含むＣＤの特性決定。実施態様Ｅ−診断イムノアッセイにおけるＣＤ又はＣＤペプチド類の使用方法。実施態様Ｆ−ＣＤとのＣＤペプチド類に関連するワクチン製剤に用いる方法と化合物。実施態様ＡＣＤをコード化する遺伝子及びＣＤエピトープを発現するベクターの分子クローン化と配列決定。使用する方法は次のとおりであった。すなわち、ビー・カタラリスからゲノムＤＮＡを単離し、その単離されたＤＮＡを切断してフラグメントとし、そのフラグメントを発現ベクター中に挿入してゲノムライブラリーを構築し、その組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入し、次いで、ＣＤ特異的抗血清を用いて、ＣＤ特異的エピトープを発現する宿主細胞クローンを免疫選別する方法である。Am erican Type Culture Collection（ATCC）から入手したグランハメラ・カタラリス菌株２５２４０を細菌ゲノムＤＮＡの起源として使用した。ビー・カタラリスは、３７℃にて５％ＣＯ₂雰囲気下チョコレート寒天プレート上、又はプレーンハートインフュージョン（brain heart infusion）ブロス中で増殖させた。エシエリキア・コリ（イー・コリ）〔Escherichia coli(E.coli)〕Ｙ１０９０を、バクテリオファージλｇｔ１１ゲノムライブラリー用の宿主菌株として用いた。環境によって、イー・コリはＬＢブロス中又は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天中上で増殖させた。クローンを免疫選別するのに用いたモノクローナル抗体は、ビー・カタラリスのＣＤ外膜蛋白質の異なるエピトープを認識する５Ｅ８と７Ｄ６であった（Sarwar等の前記文献）。抗体５Ｅ８はＩｇＭであり、無傷の細菌の表面に露出しているエピトープを認識する。抗体７Ｄ６はＩｇＧ２ａであり、細菌の表面では近づけないエピトープで捕捉する。 λｇｔ１１ライブラリーは、すでに報告されている方法（Nelson等，Infect． Immun.，56巻、128〜134頁、1988年）を利用してビー・カタラリス２５２４０のゲノムＤＮＡで構築した。大きさが２〜８キロ塩基（ｋｂ）のゲノムＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから溶出させ、ファージのアームに連結した。そのライブラリーの一部をイー・コリＹ１０９０中に導入し、得られたプラークをニトロセルロースのディスク上に移し、次いでモノクローナル抗体５Ｅ８と７Ｄ６によって免疫選別を行った。このモノクローナル抗体と共に一夜インキュベートした後、そのディスクを、プロテインＡペルオキシダーゼと抗マウスＩｇＭペルオキシダーゼの接合体とともにインキュベートし、次に基質の展開（substrate de velopment）を行って免疫反応性プラークを同定する。合計約５５４，０００のプラークを選別して、抗体７Ｄ６と５Ｅ８が認識するエピトープを発現する３８７塩基対の挿入断片を含有するクローンを得た。このクローン内に含有されている挿入断片のヌクレオチド配列を分析したところ、出発コドンも停止コドンも含有していない読み取り枠を示した（配列番号１）。このクローンのヌクレオチド配列は、ＣＤをコード化する全遺伝子配列を含有する配列番号１４のヌクレオチド７７５〜１１６０に相当する。このクローンによって産生されるペプチドは、配列番号１に示すように、配列番号１４に示す成熟蛋白質のアミノ酸２０３〜３３１に相当する。上記λｇｔ１１ゲノムライブラリーを数回選別して小フラグメントのＣＤ遺伝子を得た後、挿入断片の大きさが約９〜２３ｋｂで、ビー・カタラリス２５２４０のゲノムＤＮＡを用いてＥＭＢＬ３ライブラリーを構築した。このライブラリーをモノクローナル抗体５Ｅ８と７Ｄ６で免疫選別を行った。上記ＥＭＢＬ３ゲノムライブラリーは当該技術分野で公知の方法を用い（Ausubel等著，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sonns社、1989年発行）、かつメーカーの指示（米国カリフォルニア州ラホーヤ所在のStratagene社）に従って構築した。要約すると、ビー・カタラリス２５２４０のゲノムＤＮＡをＳＤＳ，プロテイナーゼＫ及びＣＴＡＢを用いて精製した。その精製ゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分的に消化して異なる大きさのフラグメントを生成させた。そのＤＮＡフラグメントを、１０〜４０％のスクロース勾配液を用いるスクロース勾配遠心分離に付して分離した。大きさが約９〜２３キロ塩基のフラグメントを含有する画分を仔ウシアルカリ性ホスファターゼを用いて脱リン酸化を行い、次いでエタノールで沈澱させて、ＥＭＢＬ３のアームへの連結用に調製した。これらゲノムＤＮＡフラグメント約０．７μｇを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＥＭＢＬ３のアーム１μｇに連結した。連結されたファージアームと挿入断片をファージ中にパッケージし、そのライブラリーの力値を、イー・コリＰ２３９２すなわちλＥＢＬ３ゲノムライブラリーの宿主菌株上にプレートして測定した。そのＥＭＢＬ３ゲノムライブラリーを、上記のようにしてモノクローナル抗体５Ｅ８と７Ｄ６で免疫選別した。上記ＥＭＢＬライブラリーから約３５００個のプラークを免疫選別して、クローン５と呼称する単一の反応性プラークを得た。その精製クローンは、５Ｅ８と７Ｄ６で個々に検定したところ両方の抗体と反応性であった。対照試験は、プロテインＡと抗マウスＩｇＭペルオキシダーゼの接合体はクローン５のプラークに結合しないことを示した。クローン５由来のファージＤＮＡを精製し、次にＳａ１１で消化して挿入断片を切り取った。アガロースゲル電気泳動によって、クローン５が１３ｋｂの挿入断片を含有していることが分かった。その挿入断片をいくつもの制限酵素で消化し、次にサザンブロット検定を実施した。そのブロットを、λｇｔ１１ライブラリーから回収されたＣＤ遺伝子の３８７ｂｐのフラグメント由来のＤＮＡ配列に相当するオリゴヌクレオチドでプローブした。ＣＤをコード化する遺伝子は、２．４ＫＧのＮｃｏ１−Ｓａｌ１フラグメントに局在していることが確認された。この２．４ｋｂのフラグメントを、その両端をクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑にした後、ＢａｍＨＩリンカーを連結することによってｐＥＴ１１ｂ（米国ウイスコンシン州マディソン所在のNovagen社）のＢａｍＨＩ部位中にサブクローン化した。得られたプラスミドは２．４ｋｂの挿入断片を含有していたが、ｐＣＤ１と呼称した（図１）。プラスミドｐＥＴ１１と組換えｐＣＤ１を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天上でイー・コリＨＢ１０１中に増殖させた。ｐＣＤ−１を含有する形質転換体の全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗体７Ｄ６と５Ｅ８による免疫ブロットアッセイに付した。試験結果は、ｐＣＤ１が両方の抗体と反応性の全長のＣＤ蛋白質をコード化していることを示している。ｐＣＤ１の２．４ｋｂの挿入断片の１７２７ｂｐの両ストランドのジデオキシ配列決定を、配列番号２〜１３で表されるような挿入断片内に適当な間隔をおいて存在する配列に対応するように合成された追加のオリゴヌクレオチドを利用して実施した。４８，２７７ダルトンの部分を示す４５３個のアミノ酸の読み取り枠（配列番号１４）を同定した。極力な転写ターミネーターが存在し、停止コドンの下流５４ｂｐから始まっていた。成熟蛋白質の計算分子量（４５，７８８ダルトン）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察されたＯＭＰＣＤのの見掛け分子量（６０，０００又は５５，０００ダルトン：それぞれ還元形又は非還元形の見掛け分子量）と著しく異なっていた。従って、下流の配列なしの読み取り枠を含有するプラスミドを構築して、その読み取り枠を発現させてフルサイズのＣＤ蛋白質が得られるどうかを確認した。ＣｌａＩ部位が読み取り枠の４８ｂｐ下流に配置されている。推定ＣＤ遺伝子を含有する１５５８ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ７ｚｆ（米国ウイスコン州マディソン所在のPromega Corp.社）中にサブクローン化して新しいプラスミドｐＣＤ２（図２）を構築した。図３（レーンｂ）に示す免疫ブロット検定結果によれば、ｐＣＤ２を含有するイー・コリ形質転換体はフルサイズのＣＤ蛋白質を発現している。更に、この免疫ブロット検定結果は、ＣＤ遺伝子産物がダブレットとして泳動しているが（レーンｂ）、このことは、両方のバンドが、それぞれの遺伝子が産生する２種の類縁蛋白質を示すのではなくて、単一の遺伝子の産物を表していることを示している。従って、この実施態様は、ＣＤ又はその一部分をコード化するヌクレオチド配列は、ファージベクター及びプラスミドを含む各種ベクター中に挿入して発現させることができることを示している。ＣＤ蛋白質及びＣＤペプチド類の発現を成功させるには、遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを含有する挿入断片又はベクター自体が、発現のために用いられる特定の宿主系と相容性でかつ該宿主が認識する、転写と翻訳のため必要な要素を含有している必要である。ＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類、又はＣＤオリゴペプチド類をコード化するＤＮＡは、本明細書の実施態様Ａ、Ｂ、及びＤに示すような方法とプライマー配列を用いて、合成するか、又は単離して配列を決定することができる。ＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類、又はＣＤオリゴペプチド類を発現するのに各種の宿主系を利用できるが、これら宿主系としては、限定されないが、バクテリオファージベクター、プラスミドベクター、又はコスミドＤＮＡで形質転換された細菌；酵母ベクターを含有する酵母；真菌ベクターを含有する真菌；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；及びプラスミドもしくはウイルス発現ベクターでトランスフェクトされているか、又は組換えウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなど）に感染した哺乳類細胞系がある。上記の方法を始めとして分子生物学の技術分野で公知の方法を用いて、各種のプロモーター及びエンハンサーを、ＣＤアミノ酸配列すなわち組換え外膜蛋白質ＣＤ、ＣＤペプチド、又はＣＤオリゴペプチドをコード化するベクター又はＤＮＡ配列中に組み込んでＣＤアミノ酸配列の発現を増大することができる。但し、ＣＤアミノ酸配列の発現が増大しても使用される特定の宿主細胞系に対して相容性である（例えば宿主細胞系に対して非毒性である）ことが必要条件である。従って、ＤＮＡ配列が、ＣＤ蛋白質をコード化する遺伝子、又はＣＤ蛋白質の機能エピトープをコード化する遺伝子の任意のセグメントで構成されていることが重要である。更に、そのＤＮＡは、他の抗原類、例えば他の細菌外膜蛋白質又は他の細菌、真菌、寄生体、もしくはウイルスの抗原をコード化するＤＮＡに融合させて、改良ワクチン組成物として用いられる遺伝的に融合された（共通のペプチド骨格を共有する）多価抗原を創製することができる。プロモーターの選択は使用される発現系によって決まる。プロモーター類は強度すなわち転写を容易にする性能がさまざまである。一般に、クローン化遺伝子を発現させるには、高レベルの遺伝子転写と遺伝子産物の発現を得るため、強力なプロモーターを使用することが望ましい。例えば、イー・コリを含む宿主細胞系に高レベルの転写が観察されている当該技術分野で公知の細菌、ファージ、又はプラスミドのプロモーターとしては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、Ｐ_Rプロモーター、及びＰ_Lプロモーターがあり、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐなどがＣＤアミノ酸配列をコード化する挿入ＤＮＡ配列を転写させるのに使用される。さらに、ＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類又はＣＤオリゴペプチド類が宿主細胞に対して致死的か、又は有害である場合、宿主の細胞菌株／細胞系及び発現ベクターは、プロモーターの作用が特異的に誘発されるまで阻害されるように選択される。例えば、特定のオペロンの場合、挿入ＤＮＡを有効に転写するには特異的な誘発物質を添加する必要がある（例えばｌａｃオペロンはラクトース又はイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドを添加することによって誘発される）。ｔｒｐオペロンのような各種のオペロンは異なる制御機構下にある。ｔｒｐオペロンは、増殖培地中にトリプトファンが存在していないときに誘発される。Ｐ_Lプロモーターは、温度感受性入りプレッサーを含有する宿主細胞の温度を上げることによって誘発することができる。このようにして、プロモーターは特異的転写の９５％以上が未誘発細胞内で阻害される。従って、組換え体のＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類又はＣＤオリゴペプチド類の発現は、ＣＤアミノ酸配列をコード化する挿入ＤＮＡの発現を制御するプロモーターが誘発されないような条件下で形質転換細胞又はトランスフェクト細胞を培養することによって制御され、そしてこれら細胞が増殖培地内で適切な密度に到達したとき、プロモーターが誘発されて挿入ＤＮＡが発現される。有効な遺伝子転写又はメッセージ翻訳を行うのに用いる他の制御要素としては、エンハンサーと調節シグナルがある。エンハンサー配列は、近傍の遺伝子に対するその位置と配向とは比較的独立した方式で転写の効率を増大すると考えられるＤＮＡ成分である。従って、使用される宿主細胞発現ベクター系によって、エンハンサーは、ＣＤアミノ酸配列をコード化する挿入ＤＮＡ配列の上流又は下流に配置して転写効率を増大することができる。この実施態様において先に述べたように、ＣＤをコード化する遺伝子の発現を行うことができる他の特異的な調節配列が確認されている。これらの又は他の調節部位、例えば転写、もしくは翻訳の開始シグナルは、ＣＤをコード化する遺伝子又はその遺伝子フラグメントの発現を調節するのに使用できる。このような調節要素は、ＤＮＡ配列の挿入について本明細書に記載されている組換えＤＮＡを使用して、ＣＤアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列又は近傍のベクターＤＮＡ配列中に挿入することができる。従って、ＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド類又はＣＤオリゴペプチド類をコード化する領域を含有するビー・カタラリスのヌクレオチド配列は、組換えベクターが宿主細胞中に導入されたとき、ビー・カタラリスＣＤ特異的ＤＮＡ配列が宿主細胞内で発現できるように、ベクターのプロモーター、制御要素、及び調節要素に対して特定の部位で発現ベクターに連結することができる。例えば、それ自体の調節要素を含有するＣＤ特異的ＤＮＡ配列は、ベクタープロモーターに配向して発現ベクターに連結され、ＣＤアミノ酸配列を発現させる要素を制御する。次に、この組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入し、次いでその宿主細胞は選択され、組換えベクターを含有するこれら細胞が選別される。選択と選別は当該技術分野で公知の方法で達成することができる。これらの方法としては、プラスミド中に存在するマーカー遺伝子（例えば医薬耐性マーカー）の発現の検出；ＣＤ特異的エピトープに生成した抗血清を用いるＣＤ特異的エピトープの産生の免疫選別；及び一つ以上のオリゴヌクレオチド及び本明細書の実施態様Ｃに記載の方法を用いて行う；ＣＤ特異的ヌクレオチド配列に対する宿主細胞のＤＮＡのプロービングがある。又、遺伝子工学の技術を用いて、コード化されているＣＤペプチド類又はＣＤ蛋白質の特性を決定し、修飾し、及び／又は適応させることができる。例えば防御ドメインの外側の領域の外膜蛋白質フラグメントを変異させる部位特異的突然変異誘発法は、サブフラグメントの溶解性を増大して一層容易に精製できるようにするのに望ましい方法である。更に、遺伝子工学の技術を用いてＣＤのアミノ酸配列の一部分をコード化するＤＮＡ配列を生成させることができる。例えば、配列番号１４として開示されている配列から、ＣＤペプチド類又はＣＤオリゴペプチド類をコード化する配列を生成させるのに、どの制限酵素又は制限酵素のどの組合せを用いることができるかを決定することができる。制限酵素の選択は、得られたペプチド又はオリゴペプチドの免疫効力（immunopotency）を破壊しないように行われる。蛋白質の抗原部位は大きさが様々であるが、約７〜約１４個アミノ酸で構成されている。従って、ＣＤの大きさの蛋白質は多数の分離した抗原部位を含有しているので、多くの部分遺伝子配列がＣＤの抗原エピトープをコード化するであろう。従って、例えば配列番号：１４をガイドとして利用し制限酵素の組合せを用いて、適当なベクターに挿入すると、一つ以上の抗原エピトープを含有するＣＤ特異的アミノ酸配列（蛋白質、ペプチド類、又はオリゴペプチド類）を産生することができるＤＮＡ配列を生成させることができる。実施態様ＢＣＤをコード化する遺伝子のビー・カタラリス菌株中での保存。免疫検定に有用な本発明のヌクレオチド配列の場合、ＣＤをコード化する遺伝子はビー・カタラリスの菌株中に高度に保存されていなければならない。更に、高度に保存されている遺伝子は、その蛋白質配列も高度に保存されていることを示している。ビー・カタラリスによって起こる感染症に対するサブユニットワクチン製剤中の抗原として有用な細菌の蛋白質又はペプチドの場合、その蛋白質又はペプチドは、免疫原性でかつビー・カタラリスの菌株中に保存されているエピトープを含有していなければならい。ＣＤ遺伝子のビー・カタラリス菌株中での保存度を測定するため、多様な臨床起源と地理的起源から回収した３０個の分離菌株からゲノムＤＮＡを精製し分析した（表１）。分析は、ＤＮＡを切断してフラグメントとし、次に限定されないが、配列番号：２〜１３で表される配列が含まれている配列のオリゴヌクレオチドでプローブして行った。ビー・カタラリスの３０個の菌株（２５２４０を含む）由来のゲノムＤＮＡを精製した。３０ｍｌ容積のブレーンハートインフュージョンブロスに単コロニーを接種し、次いで３７℃で振盪しながら一夜インキュベートした。２２００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離することにより細胞を収穫した。ペレット化した細胞を７ｍｌのＴＥ緩衝液中（０．０１ＭトリスｐＨ８、０．００１ＭＥＤＴＡｐＨ８．０）に懸濁させた。ＥＤＴＡを０．００５Ｍの濃度まで添加し、次にＳＤＳを０．５％の濃度まで添加した。得られた懸濁液を６０℃で３０分間インキュベートした。プロテイナーゼＫを２００μｇ／ｍｌの濃度まで添加し、続いて３７℃で約２４時間インキュベートした。得られた試料を、等容積の、フェノール、続いて１：１比のフェノール／クロロホルム、続いてクロロホルムで逐次抽出した。１０％容積の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を添加し、続いて８０％容積に等しい冷エタノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。ゲノムＤＮＡが沈澱し、それをパスツールピペットを用い、“スプーリング（spooling） ” で取り出した。得られたＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、０．０５Ｍトリス、ｐＨ８．０に溶解した。ＲＮアーゼを最終濃度４０μｇ／ｍｌまで添加し、その試料を３７℃で３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを０．００１Ｍの濃度まで添加した。その試料を、フェノールとクロロホルムで逐次抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。精製したＤＮＡを０．０１Ｍトリス、０．１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０に溶解した。１０μｇのＤＮＡに相当する部分を、０．５ｍｌの反応容積を利用しＥｃｏＲＩ又はＰｓｔＩで消化した。得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動法で分離し、次いでサザンブロット法で荷電ニトロセルロース膜に移した。そのサザンブロットを、ＣＤをコード化する遺伝子内のＥｃｏＲＩ部位の上流と下流の配列に相当する二つのオリゴヌクレオチドプローブでプローブした（このＥｃｏＲＩ部位は図１に示してある）。これらのオリゴヌクレオチドは、プローブとして使用する前に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、末端に〔³²Ｐ〕ＡＴＰで標識を付けた。ハイブリッド形成を３７℃で実施し、次に洗浄を４８ ℃で行った。ハイブリッド形成及び洗浄緩衝液については先に述べた（Nelson等の前記文献）。オートラジオグラフィを−７０℃で実施した。３０個の菌株はすべて、ＣＤ遺伝子内のＥｃｏＲＩ部位とＣＤ遺伝子のすぐ下流の部位との間のフラグメントを表わす３２５ｂｐのバンドを含めて、同一パターンのバンドを生成した。更に、３０個の菌株はすべてＣＤ遺伝子の上流のフラグメントを示す３．７ｋｂのバンドを示した。このパターンは１３個の菌株のサザンブロット検定の結果を示す図４に例示してある。ＣＤ遺伝子の分子保存を更に分析するために、同じ３０個の菌株由来のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、次いでオリゴヌクレオチドでプローブした。図１は、菌株２５２４０から分離したＣＤをコード化する遺伝子がその中心の近くにＰｓｔＩ部位を有し、かつＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化すると３３７塩基対のＤＮＡフラグメントが得られることを示している。サザンブロット検定結果は、ビー・カタラリスの３０個の菌株のうちの３０個由来のゲノムＤＮＡが、菌株２５２４０から分離したＣＤをコード化する遺伝中の配列に相当するオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成した同一の３３７ｂｐのフラグメントを生成することを示した。このパターンは、１３個の菌株のサザンブロット検定の結果を示す図５に例示してある。これら知見は、ＣＤをコード化する遺伝子がビー・カタラリスの菌株中に高度に保存されているので、本明細書に記載のヌクレオチド配列には診断とワクチンに用いる用途があることを示している。実施態様Ｃビー・カタラリスを検出するための分子診断アッセイにＣＤ特異的ヌクレオチド配列を使用する方法。ＣＤをコード化する遺伝子は実施態様Ｂに開示したように保存されているので、本発明の核酸配列は、ビー・カタラリスの遺伝物質を検出する分子診断アッセイに用いることができる。とりわけ、ＣＤ配列特異的オリゴヌクレオチドは合成して、ビー・カタラリス由来の核酸を増幅し、及び増幅された該核酸を検出する際のプライマー及び／又はプローブとして使用できる。分子生物学の細菌の進歩によって、核酸配列を酵素で増幅する手段がいくつか提供されている。現在最も普通に用いられている方法であるＰＣＲ（商標）（ポリメラーゼ連鎖反応、Cefu s Corporation社）は、プライマーとして公知の配列であるTaq Polymeraseを用い、複製するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ストランドを分離する加熱サイクルを行って、対象の遺伝子を幾何級数的に増幅する。現開発中の他の増幅法としては、ＤＮＡリガーゼ及び増幅すべきＤＮＡの配列に相補的なＤＮＡ２個のハーフ（ two half）からなるプローブを用いるＬＣＲ（商標）〔リガーゼ連鎖反応（liga se chain reaction）、Biotechnica International社〕；酵素ＱＢレプリカーゼ（Gene-Trak Systems社）及び相補的ＲＮＡを幾何級数的に産生させるためのＤＮＡ鋳型を作るのに用いられる、コピーすべきＤＮＡに相補的なプローブに連結されるリボ核酸（ＲＮＡ）配列鋳型；並びに増幅すべき核酸配列としてＲＮＡ又はＤＮＡに実施できるＮＡＳＢＡ（商標）（核酸配列ベースの増幅、Cangene Co poration社）がある。特異的遺伝子配列とハイブリッドを形成できる核酸プローブは、約１０³〜１０⁴生物／試料の感度レベルで、生物学的試料中の特異的病原体を検出するのに用いて成功している（Macario及びdeMacario編集“Gene Probes for Bacteria” 1990年、Academic Press社）。特異的な標的ＤＮＡ配列を増幅させることができる方法と組み合わせると、種特異的核酸プローブは、臨床試料中の生物を検出する際の感度を大きく高めることができる。これらのプローブを使用すると、事前の培養及び／又は従来の生化学的同定法に依存することなく、直接検出することができる。本発明のこの実施態様は、ビー・カタラリスのＣＤをコード化する遺伝子の種特異的配列を増幅するプライマー、及びこれらの増幅されたフラグメントと特異的にハイブリッドで形成するプローブに関する。本発明の核酸配列を用い、本発明の方法に従って、一つという少ないビー・カタラリス微生物を、１０ μｇ／ｍｌの外来ＤＮＡの存在下で検出することができる。この実施態様は、中耳液、痰、血液、並びに上咽頭、眼及びアデノイドからの液体を含む臨床試料から抽出したＤＮＡから、ビー・カタラリスＤＮＡの配列を、これが存在しているとき増幅させ、続いて増幅が起こったかどうかを確認するのに使用できる種特異的オリゴヌクレオチドに関する。本発明の一実施態様で、一対のビー・カタラリス特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、臨床試料から抽出したＤＮＡ中に存在しているビー・カタラリスゲノムＤＮＡとハイブリッドを形成させ、次に両隣りに連結している二つのプライマーの間のゲノムＤＮＡの特異的セグメントを、酵素合成法及び温度サイクリング法を用いて増幅させる。各対のプライマーは、それらが相補的であるように合成されている本発明のビー・カタラリスのヌクレオチド配列にのみ、二本鎖ＤＮＡの各ストランドに対して一つずつハイブリッドを形成するよう設計されている。従って、この反応はμｇ量の異種ＤＮＡが存在している場合でも特異的である。このことを表示するため、ＤＮＡの正の（遺伝子）ストランドの配列由来のプライマーを“ 正のプライマー（positive primer）”と呼称し、負の（相補的）ストランドの配列由来のプライマーを“負のプライマー（negative primer）”と呼称する。ＤＮＡの増幅は市販されている方法のいずれか一つによって達成することができる。例えばポリメラーゼ連鎖反応はＤＮＡを増幅するのに使用できる。プライマーを標的ＤＮＡの向かいあったストランドとハイブリッドを形成させたならば、温度を上げて耐熱性のＤＮＡポリメラーゼによって２種のプライマー間の領域を横切るＤＮＡの特異的セグメントを複製させる。次いでこの反応は、熱サイクルされ（thermocycle）、各サイクル毎に２種のプライマー間の配列を示すＤＮＡの量が２倍になり、ビー・カタラリスＤＮＡ配列が存在している場合その特異的増幅が起こる。ビー・カタラリスＤＮＡから誘導される場合、増幅されたＤＮＡフラグメントのその後の同定は液中ハイブリッド形成によって実施することができる。この試験では、ビー・カタラリスＤＮＡの増幅セグメントと特異的にハイブリッドを形成するプローブとして一つ以上の標識オリゴヌクレオチドを使用する。配列特異的増幅ＤＮＡの存在の検出は、当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれか一つ、例えばオートラジオグラフィーを用いるゲルリターデーションアッセイを用いて達成することができる。従って、本発明のヌクレオチド配列は、ビー・カタラリスの検出に用いる診断キットに商業的用途があるオリゴヌクレオチドを合成するのに用いる主成分を提供する。関連する実施態様において、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは直接に標識を付けるか、又は合成して標的を組み込んでもよい。使用されるラベルによって、増幅産物はアフィニティーマトリックスに結合させた後、同位体又は比色による検出法で検出することができる。ＤＮＡは、当該技術分野で公知の方法を用いて、ビー・カタラリスを含有する臨床試料から抽出することができる。例えば、試料中に含有されている細胞は、ＴＥ緩衝液で洗浄し、次いで遠心分離によってペレット化する。次にその細胞を、界面活性剤とプロテイナーゼＫを含有する増幅反応緩衝液１００μｌ中に再懸濁させる。ポリメラーゼ連鎖反応を用い、得られた試料は、１０ｍＭトリス；ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、０．４５％ＮＰ４０（商標）、０．０４５％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）、及び６０ μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中の細胞で構成されている。その試料を５５℃の湯浴で１時間インキュベートし、次いで９５℃で１０分インキュベートしてプロテイナーゼＫを熱で失活させる。次に試料を、以下に述べるポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルに従って増幅させる。ビー・カタラリスＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応によって核酸を増幅するいくつものプロトコルのいずれか一つを用いて増幅することができる。この実施態様の一つのモードで、ＣＤをコード化する遺伝子を、以下の条件を用いてビー・カタラリスの２５個の臨床分離菌株から増幅した。増幅すべきＤＮＡ（約１μｇのゲノムＤＮＡ）を０．５ｍｌのマイクロフュージチューブ（microfuge tube）中に分分配し、次いで次のものを添加して容積を５０μｌに調節した。すなわち０．２ｍＭｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．２５μｇずつの正及び負のオリゴヌクレオチドプライマー、１単位のＴａｑＩポリメラーゼ、ＴａｑＩ１０×緩衝液（５μｌ）、１ｍＭＭｇＣｌ₂（最終濃度）を含有する反応混合液を加え、次に減菌蒸留水を加えて上記の合計容積にした。ＴａｑＩポリメーラゼは使用する直前に反応混合物に添加し、渦を生じないように緩やかに混合する。約２滴の鉱油の層を各チューブに添加し、次いでこれらのチューブを熱サイクラー（thermal cycler）中に入れる。細菌ＤＮＡを増幅させるには一般に３０〜３５サイクルで充分である。１サイクルは９５℃で１分間、３７℃で１分間、及び７２℃で１分間で構成されている。最初のサイクルには、完全な変性を保証するための９５℃で１．５分間のインキュベーションが含まれている。ビー・カタラリスのＣＤをコード化する遺伝子と特異的にハイブリッドを形成するプライマー又はプローブとして有用であり、かつＤＮＡの増幅及び／又は検出に用いられるオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で公知の方法を用い、本発明に開示されているヌクレオチド配列から生化学的に合成することができる。これらオリゴヌクレオチド類のビー・カタラリスに対する特異性は、個々の各配列に対する遺伝子バンクデータベース（Genbank）をサーチして検査することができる。一般に、これらオリゴヌクレオチドは低ＧＣ含量のものを選択しなければならない。ＣＤをコード化する全遺伝子を増幅するためこの実施態様で使用されたプライマーの対としては、配列番号：１５（負のプライマー）と配列番号：１６（正のプライマー）がある。５Ｅ８と７Ｄ６のエピトープをコード化する遺伝子の部分を増幅するのに用いるプライマーの対としては、配列番号：１７（負のプライマー）及び配列番号：１８（正のプライマー）がある。検出の目的を達成するため、本発明のオリゴヌクレオチドは、放射性同位元素で末端に標識をつけてもよい。遺伝子配列の増幅に用いられる二つのプライマーに対しインターナルのプローブ配列は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとγ³²ＰＡＴＰを用いて末端に標識をつけてもよい。キナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍＭスペルミジン−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０）中２０ｐＭｏｌのプローブＤＮＡを、１２０μＣｉのγ32ＰＡＴＰと混合し、３７℃で１時間インキュベートする。室温でＴｒｉｓＢｏｒａｔｅＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中、８％アクリルアミド上で２００ボルトにて１時間泳動させて、標識をつけたプローブを、取り込まれていない標識から分離した。標識をつけたプローブは、最初に、上記アクリルアミドゲルをＸ線フィルムに対し３分間露出することによって位置を確認した。得られたオートラジオグラムを上記ゲルの下側に置いて、標識をつけたプローブを含有するバンドをゲルから切り取った。そのゲルスライスを１ｍｌの滅菌蒸留水中で粉砕し、次いでそのプローブを３７℃で一夜、振とう器によるインキュベーション(shaker incubation)によって溶出させる。溶出したプローブを、クロマトグラフィープレップカラム(prep column)を用いる遠心分離によってゲルフラグメントから分離する。そのプローブの放射能を、ガラス繊維フィルター上の標識プローブ１μｌを液体シンチレーションで計数することによって測定する。このようなプローブ配列は、配列番号２〜１３として確認された配列のいずれかから選択できるが、但しそのプローブ配列は本発明に開示されている望ましいヌクレオチド配列の増幅に用いられる二つのプライマーに対しインターナルのプローブ配列である。当該技術分野で公知の他の方法も、本発明の組成物と方法に従って増幅された標的配列の検出を改善するのに使用できる。増幅されたＤＮＡ配列の検出感度はその配列を液中ハイブリッド形成法に付すことによって改善することができる。ゲル電気泳動法並びにサザンハイブリッド形成法とオートラジオグラフィーを組み合わせたゲル電気泳動法に加えて、本発明の組成物と方法とともに使用できる当該技術分野で公知の別の検出方法としては、ゲル電気泳動法を用いる制限酵素消化法；標識オリゴヌクレオチドプローブを用いるスロット−ブロットハイブリッド形成法；ゲル電気泳動法を用いる放射能標識プライマーによる増幅法；サザンハイブリッド形成法とオートラジオグラフィー；ドットブロットとオートラジオグラフィーを用いる放射能標識プライマーによる増幅法；親和性標識を有するオリゴヌクレオチド（例えばビオチン、又はビオチンを取り込んでいるプライマー及びＤＮＡ結合蛋白質に対し特異的な配列を有する他のプライマー）によって増幅し続いてアフィニティーに基づいた検定法（ＥＬＩＳＡ法）で検出する方法；並びに発螢光団を有するオリゴヌクレオチドによって増幅し次いで螢光を検出する方法がある。非同位体検出法の一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーへのビオチンの組み込みが行われる。本発明のプライマー類の５’−アミノ基がスルホ−ＮＨＳ−ビオチンによってビオチニル化されるか、又はビオチン標識ｄＮＴＰ類の存在下でプライマーを合成することによってビオチンがプライマー中に直接組み込まれる。次いでこれらの非同位体標識プライマーを、臨床試料からＤＮＡを増幅する際に使用する。増幅された標的配列を有無の検出は、アビジンが結合されているアフィニティーマトリックスを用いて、増幅された標的配列を捕捉し、次にその後の基質展開(substrate development)によって複合体を可視化するのに使用できる酵素を含有するアビジン接合体とともにインキュベートすることによって行われる。あるいは、増幅された標的配列は、この配列の対応するプローブがマトリックスに固定されている場合、該プローブとハイブリッドを形成させることによって固定することができる。検出は、その後の基質展開によって複合体を可視化するのに使用できる酵素を含有するアビジン接合体を用いて達成することができる。実施態様ＤＣＤペプチドの発生を含むＣＤの特性化ＣＤをコード化する遺伝子を確認するため、ＣＤ蛋白のアミノ末端を決定した。ＣＤ蛋白のアミノ末端を同定するために、ビー・カタラリス 25240の精製外膜をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付しそして電気泳動ブロッティングでポリビニリデンジフルオライド膜へ転移させた。ＣＤバンドを除去し、蛋白のアミノ末端配列をマイクロシーケンサーで分析したアミノ酸でのエドマンド分解で決定した。Ｇ−Ｖ− Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｐ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｇのアミノ端末配列はｐＣＤ１の読みとり枠の２７から３６までのアミノ酸に対応しており、これはＣＤが２６のアミノ酸リーダーペプチドを持つことを示す。疎水性の２６アミノ酸リーダーペプチドは、シグナルペプチダーゼＩで分裂するリーダーペプチドの細菌性ＯＭＰに特異的である（ Oliver，1985，Ann．Rev．Microbiol．39巻：615-648頁）。ＣＤをコード化する遺伝子が同定されたことを更に確認するため、遺伝子配列から導かれたアミノ酸配列を、蛋白のシアノゲンブロマイド分解の結果を予言するためにメチオニン残基の存在を分析した。成熟蛋白に対応する読みとり枠は４コのメチオニンを含有し、これはシアノゲンブロマイド分解は５コのフラグメントを与えるであろうことを示す。ＣＤのシアノゲンブロマイド分解は外膜を精製し（Murphy等，1989年，Infect．Immun．57巻：2938-2941頁）その外膜生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付することによって達成された。ゲルをアミドブラックで染色してＣＤバンドを可視化させゲルから除去した。このゲル切片（長さ３−４ｍｍ）を０．０５Ｍ重炭酸アンモニウム、０．１％ＳＤＳと共に電気溶出管に入れた。蛋白を、ゲル切片からアミドブラックが完全になくなるまで（約５時間）１管あたり１０ｍＡで溶出した。溶出蛋白を集め、０．６ｍｌのアリコットに２ｍｌの冷エタノールを加えて沈澱させた。標品を遠心分離しペレットを風乾させた。ペレットに７０％ギ酸中２００ｍｇ／ｍｌのシアノゲンブロマイド溶液０．４ｍｌを加え、標品を暗所において室温で一晩培養した。同時作成の対照標品を同じ条件のもとに７０％ギ酸中で培養した。翌日に水１ｍｌを加え標品を凍結乾燥した。凍結乾燥ペプチドを標品緩衝液に懸濁し、トリシンゲル電気泳動に付した。表２は読みとり枠中のメチオニン部位により予測したフラグメント（ＣＤペプチド）のサイズを示す。図６は Lesse等（1990年，J．Immunol．Methods 126巻: 109-117頁）のトリシンポリアクリルアミドゲル系で決定された精製ＣＤのシアノゲンブロマイド処理から得られた現実のフラグメントを示す。シアノゲンブロマイドで切断したフラグメントの予測と現実のサイズは、蛋白のアミノ末端領域からの大きなフラグメントを除いてよく一致していた（表２）。すなわちｐＣＤ１で同定した読みとり枠はＣＤをコード化する全遺伝子を表し、蛋白はＳＤＳ−ＰＡＧＥで異常を示す。予測分子質量とＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された分子質量との間のこの不一致は、他のプロリンの豊富な蛋白の変種がこの特性を示すように、蛋白のアミノ末端領域中の大きなシアノブロマイドフラグメント中のプロリン豊富な領域に起因するものであろう（Postle等，1983年，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 50巻:5235-5239頁；Woods等，1989年，Mol．Microbi ol．3(1):43-48頁；及びThole等，1990年，Infect．Immun．58巻:80-87頁）。配列データベースの研究は、ＣＤ遺伝子の配列はシュドモナス種のＯｐｒＦ遺伝子との相同性を開示した。ＣＤ蛋白は、プロリン、アラニンおよびバリンに富む領域（アミノ酸２４０−２８０）を含む。この配列はE．coli及びSerratia ma rcescensのＴｏｎＢ蛋白との相同性を示す。実施態様Ｅ診断免疫検定でのＣＤまたはＣＤペプチドの使用方法ＣＤ蛋白、ＣＤペプチド及びＣＤオリゴペプチドはワクチン処方における免疫原として、並びに治療的および／または診断的価値のあるビー・カタラリス特異的な抗血清の生成のためや診断検定のための抗原として使用するために精製することができる。ビー・カタラリス由来のＣＤ蛋白もしくはそのオリゴペプチドやペプチドまたは発現ベクター系から生産される組換えＣＤ蛋白、組換えＣＤペプチドもしくは組換えＣＤオリゴペプチドは、洗剤抽出、クロマトグラフィー（たとえばイオン交換、アフィニティー、免疫アフィニティーまたはサイジングカラム）、分画遠心分離、分画溶解またはその他の蛋白精製に標準的な技術を含むところの当業者に公知の方法で精製することができる。１）例えば、一次細菌外膜蛋白を含む部分精製品は、次のようにして作成できる。３０のチョコレート寒天平板からのビー・カタラリス培養物をｐＨ７．２のＰＢＳ２５ｍｌ中へ掻き入れ、４℃で２０分間１２，０００ｘｇで遠心分離して培養した。細菌のペレットを、１Ｍ酢酸ソーダ−０．００１Ｍβ−メルカプトエタノール（ｐＨ４．０）１０ｍｌに再懸濁した。５％の Zwittergent Z 3-14 (C albiochem-Behring)及び０．５％Ｍの塩化カルシウムを含有する溶液の９０ｍｌ容量を加え、懸濁液を室温で１時間混合した。冷エタノール２５ｍｌを加え、次いで４℃において１０分間１７，０００ｘｇで遠心分離して核酸を沈澱させた。残った蛋白は冷エタノール３７５ｍｌを加えて沈澱させ、４℃で２０分間１７，０００ｘｇで遠心分離して採取した。ペレットを乾燥させ、次いで０．０５％の Zwittergent、０．０５Ｍトリス、０．０１ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する洗剤緩衝液１０ｍｌに懸濁し、室温で１時間混合した。細菌の外膜蛋白は、４℃で１０分間１２，０００ｘｇで遠心分離後の洗剤緩衝液の可溶性分画中に存在する。外膜蛋白製品からのＣＤ蛋白の免疫精製は、免疫アフィニティークロマトグラフィーにおける公知の方法を用いて達成できる。５Ｅ８や７Ｄ６のようなＣＤ特異的モノクローナル抗体は、クロマトグラフィックなマトリックスと結合してアフィニティーマトリックスを形成できる。次いでこの外膜蛋白製品をアフィニティーマトリックスと培養して、抗体をＣＤと結合させる。次ぎにアフィニティーマトリックスを洗浄して未結合のマトリックスを除去し、さらにＣＤをアフィニティーマトリックスから溶離するとＣＤ蛋白の精製製品が得られる。この精製ＣＤは診断のためのアッセイ用の抗原として用いることができ、または実施態様Ｄに示したように化学的または酵素的に切断してペプチドとすることができる。またはＣＤペプチドは、参照としてのＣＤをコード化する遺伝子からの推測アミノ酸配列を用いて合成することもできる。２）この実施態様の別の例においては、組換えＣＤはポリヒスチジン発現プラスミドから精製された。この方法で組換えＣＤを精製するために、ＣＤをコードする遺伝子を、例えば発現によりいくつかのヒスチジン残基（ポリヒスチジン尾部）がＣＤ蛋白のアミノ末端に付加するようなプラスミドｐＲＳＥＴＡ（Invitr ogen Corporation）のようなポリヒスチジン発現ベクター中へクローンされた。ＣＤをコード化する遺伝子を含有するＢａｍＨＩフラグメントは、予めＢａｍＨＩで制限され次いでコウシの腸フォスファターゼで処理した発現ベクターの中へ結合された。この結合混合物は大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株細胞のエレクトロポレーションのために用いられ、そして形質転換細胞はプラスミドプロモータに関して適切な位置にＣＤをコード化する遺伝子を含む組換えプラスミドの分析のために用いた。ｐＣＤＳＡと呼ばれる一つのそのようなクローンが単離され、そして大腸菌宿主株中へ導入したときにＣＤ蛋白を発現することが示された。組換えＣＤを次ぎのようにして精製した。ｐＣＤＳＡを含む形質転換体の培養物の１５ｍｌ容量を３７℃でＬＢアンピシリンブロス中で一晩成長させた。翌朝にブロス１３５ｍｌを、一晩培養したものに接種し３７℃で１時間成長させた。４℃で１０分間５，０００ｘｇで遠心分離して細胞を回収した。細胞をグアニジウム溶解緩衝液（６Ｍ水酸化グアニジウム、２０ｍＭ燐酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム；ｐＨ７．８）１０ｍｌに再懸濁した。懸濁液を室温で１０分間混合した。次いで細胞を、＃４にセットしたソニケータを用いて各５秒ずつ３回バーストして超音波処理した。混合物を４℃で１５分間３，０００ｘｇで遠心分離し、上澄み液を保存した。ついで上澄み液を、樹脂上のニッケルを用い組換えＣＤ蛋白のポリヒスチジン尾部に結合させた樹脂（たとえばProBond「商標名」Invitrogen）１．６ｍｌと室温で１０分間混合した。ついでこの樹脂を遠心分離で単離した。ＣＤ蛋白はまず樹脂を変性洗浄緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭ燐酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８）４ｍｌで２回洗浄して溶離した。次いで樹脂をｐＨ６．０で変性洗浄緩衝液の４倍容量で２回洗浄した。これをｐＨ４．０で変性洗浄緩衝液の４倍容量でカラムを２回洗浄した。フラクションの各１ｍｌを採取し、洗剤（０．１％トリトンＸ−１００）を含有する燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。ゲル電気泳動とクマシーブルー(Coomassie Blu e)染色でこの溶離ＣＤ蛋白を分析したところ単一のバンドであった。この方法は、９５％精製されたＣＤ蛋白の製品を与えることが予想される。得られた精製組換えＣＤ蛋白は、天然のＣＤ蛋白を認識するモノクローナル抗体と免疫的に活性である。３）この実施態様の他の例においては、天然のＣＤ蛋白はビー・カタラリスから精製された。ビー・カタラリス単離物Ｏ３５Ｅはミューラー−ヒントンブロス中３６℃で２４時間成長させた。次いで細菌は２０分間４，０００ｘｇで遠心分離して取り出した。細菌ペレットを、０．０１Ｍ燐酸塩と０．６４Ｍ塩化ナトリウム含有のｐＨ７．０の緩衝液中へ懸濁させた。再懸濁させた細菌は２分間激しく撹拌し、次いで２０分間３０，０００ｘｇで遠心分離した。外膜ベシクルを含有する上澄み液を保存し、１０ｍＭトリス、１０ｍＭ塩化ナトリウム及び１ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液に対して透析した。透析後、洗剤（トリトンＸ−１００）を１．０％になるように添加し、透析液を室温で１時間培養して蛋白を溶解した。不溶物を１０分間１０，０００ｘｇで遠心分離して除去した。上澄み液をイオン交換カラムの上へ置いた。このカラムを１０ｍＭトリス、１％トリトンＸ −１００（ｐＨ８．０）の緩衝液で洗浄し、蛋白を５０ｍＭのＮａＣｌまたは１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶離した。溶離した蛋白製品を、緩衝液で平衡化しておいたゲル濾過カラム上を通過させると、クーマシーブリリアントブルーで検出可能な他の蛋白やＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色によるリポオリゴサッカライドを含まない蛋白製品を得た。４）本明細書を通じて使用されたように、ＣＤオリゴペプチドとは一つのものとして合成されまたは化学的結合され、配列番号１４として開示されているＣＤ蛋白のアミノ酸配列の一部分に対応する一連のペプチドとしてここに定義される。そのようなペプチドまたはオリゴペプチドは、ペプスカン合成（Geysen等，1987 年，J．Immunol．Methods 03巻: 259頁; 1974年，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81巻:3998頁）、標準的液相ペプチド合成または組換え発現ベクター系により、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ酸（Mitchell等，1978年，J．Org．Chem．43 巻:2845-2852頁）やポリアミドに保持された９−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸（Dryland 等，1986年，J．Chem．So．Perkin Trans．I，125-13 7 頁）を用いる標準的固相ペプチド合成を含む当業者に公知のペプチド合成法の一つを用いて合成可能である。例えばアミノ酸の除去や置換（及びアミノ酸の延長や付加をも含め）そしてその他の方法によるペプチドやオリゴペプチドの修飾は、ペプチドやオリゴペプチドの免疫的性質を実質的に低下させないように行われ得る。特にＣＤ蛋白やそのペプチドもしくはオリゴペプチドのアミノ酸配列は、一つまたはそれより多いアミノ酸を機能的均等なアミノ酸と置換して変化させることができ、蛋白やペプチドやオリゴペプチドの物理化学的性質における相違の観察という点では無視できる変化を生じる。機能的に均等なアミノ酸は、関連性があるか及び／または類似の極性または電荷をもつアミノ酸として公知である。すなわちここにおける配列表に示したアミノ酸配列は、蛋白やペプチドやオリゴペプチドの一次的な生物学的機能の変化なしの機能的に均等なアミノ酸による置換を含むアミノ酸配列に関連する。５）ＣＤのエピトープを含むＣＤペプチドの生産の説明において、ＣＤ蛋白の定義された領域は、プラスミド発現ベクター（ｐＧＥＸ２Ｔ）がSchistosoma ja ponicum 由来の２６キロダルトンの蛋白であるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合ペプチドとして大腸菌中の異種ポリペプチドの合成を行う発現系中に発現された。この場合の実施態様においてそしてｐＣＤ２をテンプレートとして使用することにより、ＣＤをコード化する遺伝子の選択された領域は、表３に示す配列に対応するオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。表３はまたペプチド構築物によってコード化されるような配列番号１４に示す成熟ＣＤ蛋白に関連するペプチドのアミノ酸の位置を示す。オリゴヌクレオチドは、得られる増幅遺伝子フラグメントがその５’−末端にＢａｍＨ１制限部位をまた３’−末端にＥｃｏＲ１制限部位を含むようにデザインされ、そのようにして増幅フラグメントがｐＧＥＸ２Ｔの中へ指向的にクローン化され得る。各組換えプラスミドの配列はジデオキシ配列法によって確認された。各々の組換えＣＤペプチドを精製するために、遺伝子フラグメントを含む対応組換えプラスミドは大腸菌ＪＭ１０９の中へ形質転換された。この形質転換体は、３６０ｍｌのブロスに対し４０ｍｌの一晩培養したものを添加しそして振盪しながら３７℃で１時間培養して、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス４００ｍｌの中で成長させた。ＩＰＴＧを０．０１ｍＭになるように添加し、培養物を更に３時間培養した。細胞を５０００ｘｇで遠心分離し、細胞ペレットを５ｍｌのＰＢＳ中へ再懸濁した。細胞を超音波処理し、混合物を１０分間１０，０００ｘｇで遠心分離した。上澄み液を、予め膨潤させたグルタチオン −アガローズのビーズと混合した。室温で２分間混合後、このビーズ（融合ペプチドがグルタチオンと結合している）を、１％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳで２回洗浄した。次いでこのビーズを０．０５Ｍのトリス（ｐＨ８．０）で１回洗浄した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼからＣＤビーズを切断するために、洗浄ビーズを室温で１時間トリス緩衝液中で０．２５％（最終濃度）のヒトトロンビンの中で培養した。プロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦを、１００μｇ／ｍｌ濃度になるように添加した。ビーズを遠心分離で除去すると上澄み液は精製ＣＤペプチドを含有していた。イムノブロットアッセイの結果、融合ペプチドは免疫的に活性であることが確認されたが、その程度はＣＤ特異的ウサギポリクローナル抗血清に応じて変化した。精製したＣＤ蛋白、ＣＤペプチド及びＣＤオリゴペプチドは、ビー・カタラリスに起因する感染症の疑いのある個人の体液中に存在するビー・カタラリス特異的の抗血清の検出のためのイムノアッセイでの抗原として用いることが出来る。体液としては中耳液、唾液、血液ならびに鼻咽頭、目およびアデノイドからの液を含むがこれらに限定されるものではない。イムノアッセイにおける抗原としてのＣＤやＣＤペプチドの検出は、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドウィッチアッセイ、沈澱反応、凝固アッセイ、蛍光イムノアッセイ及び化学発光に基づくイムノアッセイのような公知の如何なるイムノアッセイをも含むものであるが、但しこれらに限定されるものではない。実施態様ＦＣＤ及びペプチドに関連するワクチン処方のための方法と化合物本発明のこの実施態様は、ビー・カタラリスに起因する感染症の予防または治療に活性な免疫のための予防および／または治療ワクチンの免疫原として用いられるＣＤ蛋白および／またはそのペプチドもしくはオリゴペプチドを提供することである。ワクチンの目的のためには、細菌蛋白から成るビー・カタラリスの抗原が免疫原性であるべきで、かつ完全な細菌上の一つまたはそれより多い表面露出のエピトームに向けられた機能的抗体を誘導すべきであり、ここにエピトームはビー・カタラリスの株の中で保存される。ワクチン抗原に望ましい性質をもつＣＤ蛋白の一つの例において、その蛋白は実施態様Ｅ、例３に記載の方法を用いてビー・カタラリスから精製された。マウスを、４週間間隔で２回アジュバント（２０μｇのＱＳ２１）と精製したＣＤ蛋白（２５μｇ）で免疫した。免疫マウスからの血液は最後の免疫から３２日後に採取し、免疫血清を保存する。保存した免疫血清は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により全細菌（ビー・カタラリスの０３５Ｅ株）に対してアッセイを行った。全細胞ＥＬＩＳＡのために、細菌の一晩の培養物を綿棒で採取し、６００ｎｍで０．１の吸光度となるまでＰＢＳ中に懸濁した。細菌懸濁液のアリコット（１００μｌ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに添加し、室温で一晩中乾燥させた。プレートを、ＰＢＳ中０．１％（ｗ／ｖ）のゼラチン１００μｌでブロックした。これと全ての残りに培養物を、別記しない限り室温で一時間放置した。ブロックした溶液を除去し、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンでＰＢＳ中で希釈した免疫血清の１００μｌをウェルに添加し培養した。ＰＢＳで３回洗浄後、結合抗体をアルカリ性フォスファターゼ複合組換え蛋白Ｇ（０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンでＰＢＳ中で１：１５００）の１００μｌでの培養によって検出した。プレートを洗浄し、発色を１００μｌ／ウェルのｐ −ニトロフェニルホスフェート（ジエタノールアミン中２ｍｇ／ｍｌ）の添加によって促進した。３０分後に３ＭのＮａＯＨを５０μｌ添加して反応を停止させた。ＥＬＩＳＡ測定機を使って４９２ｎｍでの吸光度を読みとった。最終点力価は、吸光度がブランクのウェルのそれよりも大である希釈度の逆数として求めた。表４に示す結果はＣＤ蛋白による免疫化は、完全なビー・カタラリス上の一つまたはそれより多い表面露出エピトームに結合できる抗体を誘出できることを示す。ＣＤ蛋白の免疫原性を支持する付加的な証拠は、ビー・カタラリスに起因する病歴の明瞭な感染症１３名の患者のうち１１名が快復期の血清中にＣＤへのＩｇＧを保持していたところのビー・カタラリスの外膜蛋白に対するヒト免疫反応の研究に由来する（未発表）。これら１３名の患者はビー・カタラリスによる気管支肺感染症の７名の成人と中耳炎の６名の子供を含む。ＣＤ蛋白はワクチン抗原の所望の性質を所有する他の例において、ＣＤ蛋白はＣＤ蛋白による免疫から生成する細菌抗体の標的であることが示された。例えばＣＤ蛋白に対するポリクローナル抗血清は、ＣＤ蛋白で皮下的に免疫されたウサギにおいて増大した。ビー・カタラリスの外膜製剤をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＣＤに対応するゲル中のバンドを切りとり、そしてＣＤ蛋白をポリアクリルアミドゲル切片からの溶離によって精製した。ウサギを第０日に不完全フロインドアジュバント中ＣＤ蛋白４０μｇで免疫させ、第１４日に不完全フロインドアジュバント中ＣＤ蛋白９０μｇで免疫させ、そして第２８日に不完全フロインドアジュバント中ＣＤ蛋白６０μｇで免疫させた。得られた抗血清のビー・カタラリスの４２２３ＮＣ株に対する殺菌活性を試験した。細菌は脳−心臓インフュージョン（ＢＨＩ）ブロス中で対数期的に成長した。この細菌培養物のアリコットを、平衡塩類溶液中で１０％コウシ血清アルブミン中ｍｌあたり５ｘ１０⁴ コロニー形成単位（ＣＦＵ）まで希釈した。殺菌アッセイ反応は細菌、ＣＤ蛋白に対するポリクローナル抗血清、抗体除去のため蛋白Ｇに吸収させた正常のヒト血清から成る補体源および平衡塩類溶液を含有していた。すべての試薬を反応に添加して２５０μｌ容量とした。反応の２５μｌのアリコットを除去し、第０分と第６０分の時間にＢＨＩ寒天上に３回塗布した。塗布物を培養し、コロニーを翌日に計数した。殺菌百分率を２回の時間における３つの３倍値の平均を用いて算出した。殺菌アッセイで得られたデータの代表例を表５に示す。この結果は、ＣＤ蛋白で得られたポリクローナル抗血清はビー・カタラリスに殺菌的であることを示す。表５に示すように、対照においては抗血清が補体の不存在下で細菌を死滅させないこと及び補体源が抗血清の不存在下で細菌を死滅させないことを示しており、これは殺菌活性は抗体に指向されそして補体で仲介されていることを表す。ＣＤ蛋白がワクチン抗原の望ましい性質を持っていることを更に説明するために、Ｏ３５Ｅ株から得た保存免疫血清が異種の株と交差反応性を持っていることが示された。上述のようにＣＤ蛋白に対して作成された保存免疫血清が、いろんな臨床的および地理的の源からの９つのビー・カタラリス株での交差反応性について試験された。これらのものは例えば中耳や上部呼吸管のような臨床的の源や、例えばニューヨーク州、マサシューセッツ及びテネシーのような地理的の源から単離された菌株を包含している。アッセイは、菌株をミューラー−ヒントン寒天培地で一晩培養することにより行われた。各培養からの細菌は綿棒で採取し、６００ｎｍで１．０の光学的吸収を示すようにＰＢＳ中に懸濁した。各懸濁液の１マイクロリットルをニトロセルローズ膜に塗布し乾燥させた。膜をＰＢＳ中５％の無脂肪の乾燥牛乳溶液の中で室温で１時間培養し、膜の残りの結合部位をブロックした。膜をＰＳＢで２回洗浄し、１：１０００に希釈した免疫血清を含有するブロック溶液へ浸した。膜を緩やかに振盪しながら４℃で一晩抗体と一緒に培養した。膜をＰＢＳで３回洗浄し、アルカリ性フォスファターゼ複合組換え蛋白Ｇ（５％の無脂肪乾燥牛乳と共にＰＢＳ内で１：１５００）で室温で２時間培養した。膜をＰＢＳで３回洗浄し、基質（ＫＰＩＢＣＩＰ／ＮＢＴフォスファターゼ基質系；Kirkegaard and Perry，Inc.）を添加して結合抗体を検出した。免疫血清はＯ３５Ｅ株と同じ程度かまたはそれよりも強力に６つの株と反応した。一方では免疫血清は３つの株に対してＯ３５Ｅ株よりも僅かに弱い反応性を示した。すなわちＯ３５Ｅ株から単離されたＣＤ蛋白の免疫により誘出された抗体は、テストした全ての異種株と交差反応した。ワクチンの開発のために、ＣＤ特異性のアミノ酸配列はビー・カタラリスから精製するか、またはＣＤもしくはＣＤペプチドを発現する組換えベクターを含有する宿主から精製することができる。そのような宿主は細菌変異体、酵母変異体、糸状菌変異体およびＣＤアミノ酸配列をコード化するベクターで変異されるか感染された培養細胞を含むが、ただしこれらに限定されるものではない。ＣＤ蛋白の部分に対応するペプチドまたはオリゴペプチドはＣＤ蛋白の化学的または酵素的切断で製造することが出来る（たとえば実施態様Ｄを参照のこと）し、または当業者に公知の方法で参照としてＣＤをコード化した遺伝子のヌクレオチド配列から導いたアミノ酸配列で化学的に合成も出来る。ＣＤペプチドはまた組換えベクターからも製造出来る（たとえば実施態様Ａを参照のこと）。蛋白、ペプチドまたはオリゴペプチド免疫原は、免疫反応を誘発するために治療的有効量でワクチン処方において関連する免疫材料として含まれている。ワクチン接種されるべきヒトや動物の中へワクチン処方を導入するために多くの方法が知られている。これらは皮内、筋肉内、腹腔内、血管内、皮下、眼内、経鼻および経口投与を包含するが但しそれらに限定されるものではない。ワクチンは更に溶液、ポリーマーやリポソームのような生理的担体、アジュバントまたはその組み合わせを含んでいてもよい。種々のアジュバントがワクチン処方と共に使用される。アジュバントは免疫反応を調節することによって、そしてもしワクチン抗原が単独投与された場合よりも少量のワクチン抗原またはより少ない用量を用いて更に持続的および高いレベルの免疫性を得ることを助ける。アジュバントの例は不完全フロインドアジュバント、アジュバント６５（落花生油、モノオレイン酸マンナイド及びモノステアリン酸アルミニウムを含有する）、油のエマルジョン、リビ（Ribi）アジュバント、プルロニックポリオール、ポリアミン、アブリジン（Avridine）、クイルＡ（Quil A）、サポニン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１並びに水酸化アルミニウム及び燐酸化アルミニウムのようなミネラルゲルを包含する。本発明のこの様式の別の実施態様は、ハプテンすなわちそれ自体では免疫反応を誘導できない分子としてのＣＤ特異的アミノ酸配列の生産を包含する。そのような場合にハプテンは、免疫系に露出されたときに結合ハプテンに免疫原性を与えるであろう他の免疫原的分子や担体に共有的に結合することができる。すなわち担体分子と結合したそのようなＣＤ特異的ハプテンは、ワクチン処方において免疫原であり得る。この実施態様の他の様式はビー・カタラリスに起因する感染症に用いられる不活性化された組換えウィルスワクチンまたは生の組換えウイルスワクチン、組換え細菌ワクチン、組換え弱毒化ワクチンを提供する。ワクチンウイルスは、他の生体から誘導されるワクチン抗原を発現するのに工夫された感染ウイルスの、当業者にとって最良の公知例である。それ自体で疾病を生じないように弱毒化するか他の手段で処理した組換え生ワクチンウイルスは、宿主の免疫化に使用される。次の宿主内での組換えウイルスの複製は、ＣＤ蛋白またはＣＤペプチドのようなワクチン抗原による免疫系の連続的刺激を提供し、長時間持続の免疫をもたらす。これ以外の生のワクチンベクターはアデノウイルス、サイトメガロウイルス及び好ましくはポックスウイルス例えばワクシニア（Paoletti及びPanicall：米国特許第 4,603,112号）及び弱毒化した Salmonella 株（Stocker 等，米国特許第 5,201,035号、第 4,837,151号並びに 4,735,801号；及び Curtiss等，1988年，Vaccine 6 巻:155-160頁）を含む。生のワクチンは特に有利である。何故ならばそれらは、実質的に長時間持続性の免疫を与え得る免疫系を連続的に刺激するからである。免疫反応が次のビー・カタラリス感染に対して予防的であれば、生のワクチンそれ自体がビー・カタラリスに対する予防ワクチンに使用できる。実施態様Ａで述べたような分子生物学的技術を用いての本実施態様のこの様式を説明するために、ＣＤをコード化する遺伝子または一つもしくはそれより多いＣＤペプチドをコード化する遺伝子フラグメントが、ＣＤエピトームの発現を許容するが但しワクシニアウイルスベクターの成長や複製に負の影響を与えないような部位でワクシニアウイルスゲノムＤＮＡ中へ挿入できる。得られた組換えウイルスはワクチン処方における免疫原として使用できる。同じ方法は、組換えウイルスを免疫原として使う前に発現免疫原の免疫原性に実質的に影響せぬように例えば公知の化学的方法で不活性化する場合を除いて、不活性化組換えウイルスワクチン処方の構築に用いることができる。異なるエピトームを発現する不活性化ウイルスの混合物は、多価不活性化ワクチンの処方に用いることができる。いずれの場合においても不活性化組換えワクチンまたは不活性化ウイルス混合物は、ワクチン抗原に対する免疫学的反応をたかめるために、適当なアジュバントと共に処方することができる。この実施態様の別の変形においては、遺伝子材料は直接にワクチン処方として使用される。一つまたはそれより多い調節要素と作動的に結合したＣＤ蛋白、ＣＤペプチドまたはＣＤオリゴペプチドをコード化する配列を含む核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ビー・カタラリスの病原株に対して個体をワクチン接種するために直接に導入することができる（直接遺伝子転写）。主な臓器組織と同様に血管内皮細胞のようなワクチン投与された個体の細胞による遺伝子材料の発現をもたらすところのワクチン投与個体への直接遺伝子転写は、たとえば発現プラスミド：カチオン性リポソーム複合体（Zhu等，1993年，Science 261巻:209-211頁）の静脈内注射のような当業界での技術によって示されている。これ以外の標的細胞内へのベクターＤＮＡの効果的な伝達方法は当業界において公知である。一つの例において、ウイルス遺伝子を含む精製組換えプラスミドＤＮＡは、予防的免疫反応を誘発するためにワクチンを接種する（非経口、経粘膜または遺伝子銃免疫化のいずれかによって）のに用いられてきた（Fynan等，1992年，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 90 巻:11478-11482頁）。他の例においては、個体から除去した細胞は当業界で公知の標準的方法でトランスフェクトするかまたはエレクトロポレートすることができ、標的細胞の中への組換えベクターＤＮＡの導入をもたらす。次いで組換えベクターＤＮＡを含む細胞は、ベクター内で発現した選択的マーカー経由のような当業界で公知の方法を用いて選択することができ、そして選択された細胞はＣＤ蛋白、ＣＤペプチドまたはＣＤオリゴペプチドを発現するために個体へ再導入することができる。遺伝子材料でワクチン接種する一つの好ましい方法は、ＣＤ蛋白、ＣＤペプチドまたはＣＤオリゴペプチドの一つまたはそれ以上をコード化する核酸配列から成る核酸分子を個体に投与する工程から成り、そこにおいて核酸は発現に必要な一つまたはそれより多い調節配列に作動的に結合する。核酸分子は直接投与するか、または先ずウイルスベクターに導入しそしてベクター経由で投与することもできる。核酸分子は薬学的に許容される担体または希釈剤で投与することができ、ワクチンの効果を高め得る化合物を含有していてもよい。これらの付加的な化合物は次ぎのものを含むがそれらに限定されるものではない。すなわち免疫反応を高めるアジュバント並びに免疫反応を調節する化合物、例えば一括して「免疫調節剤」として参照されるサイトカインまたは「核酸摂取エンハンサー」として参照される細胞による核酸の摂取を増大するような他の化合物。核酸分子での免疫化はいかなる非経口的経路（静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）や鼻咽頭、気管もしくは胃腸管の粘膜表面との接触でおこなうことができる。免疫弱体化された個体がビー・カタラリスに起因する潜在的に生命を脅かす感染症にかかったような場合における活性免疫の別法として、免疫は受動的、すなわちＣＤエピトームに対する抗体を含有する精製ヒトイムノグロブリンの投与から成る免疫であってもよい。本発明はここに詳細に既述した通りであるが、これらの例は単に説明の目的のためのみであると理解されるべきである。分子生物学、医療診断学および関連する分野の当業者に明白な本発明のこれ以外の実施態様の修正は、ここに添付した請求範囲の範囲内にあると意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ 33/569 Ｆ 33/569 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＵ，ＵＡ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＣＤの１以上のエピトープを有した実質的に純粋なペプチド、オリゴペプチド、又は蛋白質を免疫学的に有効量含有するワクチン製剤であって、ＣＤが、約５５，０００〜約６０，０００ダルトンの見掛け分子量をもつブランハメラ・カタラリス(Branhamella catarrhalis)の外膜蛋白質であり、しかも、配列番号１４において読み取り枠として示されているヌクレオチド配列によってコード化されていることを特徴とするワクチン製剤。２．ＣＤの１以上のエピトープを有する前記蛋白質が、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸残基１〜４２７のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のワクチン製剤。３．ＣＤの１以上のエピトープを有する前記蛋白質が、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸残基−２６〜４２７のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のワクチン製剤。４．前記ペプチド、オリゴペプチド、又は蛋白質が、ＣＤエピトープをコード化しているＤＮＡ配列の発現を制御するヌクレオチド配列を含むベクターを含むように遺伝学的に処理された宿主細胞系から培養された細胞より組み換え的に製造されたものであり、前記宿主細胞が、バクテリア、酵母、糸状カビ、昆虫細胞系、及び哺乳類細胞系からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項１記載のワクチン製剤。５．前記ペプチド又はオリゴペプチドが、ＣＤ蛋白質の化学的又は酵素的開裂によって製造されることを特徴とする請求項１記載のワクチン製剤。６．前記ペプチド又はオリゴペプチドが、化学合成によって製造されることを特徴とする請求項１記載のワクチン製剤。７．更に製薬学的に受容可能なキャリヤー又は希釈剤を含むこと特徴とする請求項１記載のワクチン製剤。８．更に免疫モジュレーターを含むこと特徴とする請求項７記載のワクチン製剤。９．１以上のＣＤエピトープを有する前記ペプチド又はオリゴペプチドが、配列番号１、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４７、及び配列番号５０からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項１記載のワクチン製剤。 10．ＣＤエピトープをコード化する前記ヌクレオチド配列が、配列番号１及び配列番号１４からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項４記載のワクチン製剤。 11．前記培養細胞がバクテリアであることを特徴とする請求項４記載のワクチン製剤。 12．前記培養細胞が酵母であることを特徴とする請求項４記載のワクチン製剤。 13．前記培養細胞が糸状カビであることを特徴とする請求項４記載のワクチン製剤。 14．前記培養細胞が昆虫細胞系であることを特徴とする請求項４記載のワクチン製剤。 15．前記培養細胞が哺乳類細胞系であることを特徴とする請求項４記載のワクチン製剤。 16．ＣＤの１以上のエピトープを有した実質的に純粋な抗原ペプチド、オリゴペプチド、又は蛋白質であって、ＣＤが、約５５，０００〜約６０，０００ダルトンの見掛け分子量をもつブランハメラ・カタラリスの外膜蛋白質で、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸配列を有することを特徴とする、実質的に純粋な抗原ペプチド、オリゴペプチド、又は蛋白質。 17．ＣＤの１以上のエピトープを有する前記蛋白質が、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸残基１〜４２７のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１６記載の蛋白質。 18．ＣＤの１以上のエピトープを有する前記蛋白質が、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸残基−２６〜４２７のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１６記載の蛋白質。 19．１以上のＣＤエピトープを有する前記ペプチド又はオリゴペプチドが、配列番号１、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４７、及び配列番号５０からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項１６記載のペプチド又はオリゴペプチド。 20．前記ペプチド、オリゴペプチド、又は蛋白質が、ＣＤエピトープをコード化しているＤＮＡ配列の発現を制御するヌクレオチド配列を含むベクターを含むように遺伝学的に処理された宿主細胞系から培養された細胞より組み換え的に製造されたものであり、前記宿主細胞が、バクテリア、酵母、糸状カビ、昆虫細胞系、及び哺乳類細胞系からなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項１６記載のペプチド、オリゴペプチド又は蛋白質。 21．前記培養細胞がバクテリアであることを特徴とする請求項２０記載のペプチド、オリゴペプチド又は蛋白質。 22．前記培養細胞が酵母であることを特徴とする請求項２０記載のペプチド、オリゴペプチド又は蛋白質。 23．前記培養細胞が糸状カビであることを特徴とする請求項２０記載のペプチド、オリゴペプチド又は蛋白質。 24．前記培養細胞が昆虫細胞系であることを特徴とする請求項２０記載のペプチド、オリゴペプチド又は蛋白質。 25．前記培養細胞が哺乳類細胞系であることを特徴とする請求項２０記載のペプチド、オリゴペプチド又は蛋白質。 26．ＣＤの１以上の抗原決定基又はエピトープをコード化しているＤＮＡ配列を含む組み換えベクターであって、ＣＤが、約５５，０００〜約６０，０００ダルトンの見掛け分子量をもつブランハメラ・カタラリスの外膜蛋白質で、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸配列を有することを特徴とする組み換えベクター。 27．ＣＤが、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸残基１〜４２７のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２６記載の組み換えベクター。 28．ＣＤの１以上のエピトープを有する前記蛋白質が、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸残基−２６〜４２７のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２６記載の組み換えベクター。 29．前記ベクターが、プラスミドベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、及びウイルスベクターからなる群より選ばれたものであることを特徴とする請求項２６記載の組み換えベクター。 30．ブランハメラ・カタラリスによって引き起こされる感染にかかった個体を受動的に免疫するのに有用な組成物であって、前記組成物が、ＣＤの１以上のエピトープを認識する精製された抗血清を含み、ＣＤが、約５５，０００〜約６０，０００ダルトンの見掛け分子量をもつブランハメラ・カタラリスの外膜蛋白質で、実質的に配列番号１４において示されているアミノ酸残基１〜４２７のアミノ酸配列を有することを特徴とする組成物。 31．約５５，０００〜約６０，０００ダルトンの見掛け分子量をもつブランハメラ・カタラリスの外膜蛋白質ＣＤのエピトープをコード化する、分離された遺伝子又はそれらのフラグメントであって、前記遺伝子が、配列番号１４の１３５９塩基対読み取り枠を含むことを特徴とする、分離された遺伝子又はそれらのフラグメント。 32．前記ＣＤ蛋白質をコード化する核酸分子、又は、１以上のＣＤペプチド又はＣＤオリゴペプチドをコード化する１以上の遺伝子フラグメントを含むワクチン製剤であって、前記核酸分子が、調節配列に有効に結合されていることを特徴とするワクチン製剤。 33．更に製薬学的に受容可能なキャリヤー又は希釈剤を含むこと特徴とする請求項３２記載のワクチン製剤。 34．更に免疫モジュレーターを含むこと特徴とする請求項３３記載のワクチン製剤。 35．更に核酸摂取エンハンサーを含むこと特徴とする請求項３３記載のワクチン製剤。 36．ブランハメラ・カタラリスのＣＤ蛋白質、ＣＤペプチド又はＣＤオリゴマーを発現することが可能な伝染性組み換え微生物。 37．ワクシニアウイルス、アデノウイルス、又はサイトメガロウイルスであることを特徴とする請求項３６記載の微生物。 38．サルモネラ属のバクテリアであることを特徴とする請求項３６記載の微生物。 39．個体の体液中のブランハメラ・カタラリス−特異抗血清の検出するための方法で、前記体液中のブランハメラ・カタラリス−特異抗血清と相互作用して検出を行うために、免疫学的検定において抗原として、ＣＤの１以上のエピトープを有するペプチド又は蛋白質を使用することを含むものにおいて、ＣＤが、約５５，０００〜約６０，０００ダルトンの見掛け分子量をもつブランハメラ・カタラリスの外膜蛋白質であることを特徴とする、ブランハメラ・カタラリス−特異抗血清の検出方法。 40．前記の免疫学的検定が、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、「サンドイッチ」アッセイ、沈澱反応、凝固アッセイ、螢光イムノアッセイ、及び化学発光に基づくイムノアッセイからなる群より選ばれたアッセイであることを特徴とする請求項３９記載の方法。 41．ブランハメラ・カタラリスの検出において有用なオリゴヌクレオチド類であって、前記オリゴヌクレオチド類が、配列番号１４のヌクレオチド配列又はこれに対応する相補鎖の範囲内に含まれる遺伝子の保存領域に補足し、かつ特異的にハイブリッド形成する核酸配列から本質的に成ることを特徴とするオリゴヌクレオチド類。 42．前記オリゴヌクレオチド類が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、又は配列番号１８からなる群より選ばれた核酸配列から本質的に成ることを特徴とする請求項４１記載のオリゴヌクレオチド類。 43．臨床検体中のブランハメラ・カタラリスの存在又は不在を検出するための方法であって、前記方法が下記の工程（ａ）〜（ｄ）：（ａ）細菌性遺伝物質を放出させるために検体中の細胞を溶解する工程；（ｂ）前記遺伝物質と２つのオリゴヌクレオチドとを、前記遺伝物質に対して前記オリゴヌクレオチド類のハイブリッド形成を可能とする適切な条件の下で接触させる工程で、この際、一方のオリゴヌクレオチドが、配列番号１４のヌクレオチド配列の範囲内に含まれる遺伝子の領域にハイブリッド形成し、しかも、もう一方のオリゴヌクレオチドが、対応する相補鎖における領域にハイブリッド形成する；（ｃ）プライマーとして前記工程（ｂ）のオリゴヌクレオチド類を用いて、前記遺伝子及びこれに対応する鎖を含む前記遺伝物質の配列の特異領域を酵素的に増幅する工程；及び（ｄ）前記遺伝子及びこれに対応する鎖の増幅された配列の存在を検出する工程で、この際、これらの増幅された配列の存在が、検体中のブランハメラ・カタラリスの存在に関連している；を含むことを特徴とするブランハメラ・カタラリスの検出方法。 44．前記の検出が、増幅されるべき配列の特異領域における領域に相当するヌクレオチド配列からなる標識づけされたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、増幅された配列のハイブリッド形成によって更に促進され、前記標識が、オリゴヌクレオチド類に混合されることが知られている標識で、³²Ｐ等の放射性標識、及びビオチン等の酵素性標識の中から特に選ばれたものであることを特徴とする請求項４３記載の方法。 45．前記検体が、中耳液；痰；血液；及び鼻咽頭又は目又はアデノイドからの流体からなる群より選ばれた体液であることを特徴とする請求項４３記載の方法。 46．臨床検体中のブランハメラ・カタラリスを検出するための方法であって、前記方法が下記の工程（ａ）〜（ｄ）：（ａ）体液の検体を採得する工程；（ｂ）細菌性遺伝物質を放出させるために検体中の細胞を溶解する工程；（ｃ）前記遺伝物質を、前記遺伝物質に対して前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成を可能とする適切な条件の下で、配列番号１４のヌクレオチド配列の範囲内に含まれる遺伝子の領域又はこれに対応する相補鎖における領域に相当するように合成されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程；及び（ｄ）前記検体と前記プローブとの間の相互作用を検出する工程で、前記相互作用が、ブランハメラ・カタラリスの遺伝物質と前記プローブとの間のものである；を含むことを特徴とするブランハメラ・カタラリスの検出方法。 47．前記検体が、中耳液；痰；血液；及び鼻咽頭又は目又はアデノイドからの流体からなる群より選ばれた体液であることを特徴とする請求項４６記載の方法。