JP2002514657A - モラクセラ・カタラリス蛋白質 - Google Patents
モラクセラ・カタラリス蛋白質Info
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Abstract
Description
新規な蛋白質、この蛋白質をコードしたDNA配列、並びにそれらの同定及びワ
クチン用基質としての使用に関するものである。
ス(Moraxella catarrhalis)としても知られており、人に呼吸器系感染症を引
き起こすグラム陰性好気性菌である。B. catarrhalisは、人、特に児童の呼吸器
系細菌叢の一部として生存可能な菌である。この菌は成人における下位呼吸器系
感染症及び児童における中耳炎を引き起こす(Klein J.O., Clin. Infect. Dis.
, 19: 823-833 (1994); Murphy T.F., Microbial. Rev., 60:267-279 (1996); N
icotra他, Arch. Intern. Med., 146:890-893)。或る研究によれば、成人で慢
性的な阻害性肺炎症を伴う化膿性の悪化症状の約30%はB. catarrhalisによるも
のであることが確認されている(Verghese他, Antimicrob. Agents Chemother.,
34:1041-1044 (1990))。中耳液の培養を利用した研究では、中耳炎の段階の15
〜20%はB. catarrhalisによって引き起こされていることが明らかとなっている
(上記Klein (1994))。
免疫応答を誘発する(Chapman他, J. Infect. Dis., 151: 878-882 (1985); Fad
en他, Infect. Immun., 60: 3824-3829 (1992); Sethi他, Infect. Immun., 63:
1516-1520 (1995))。B. catarrhalisに対する抗体は上位呼吸器系内の分泌液中
に存在する(上記Fadden (1992); Stenfors, L.E.及びRaisanen, S., Acta Otol
aryngol., 113: 191-195 (1993))。B. catarrhalisによって引き起こされる中
耳炎に対する防御には系特異的粘膜免疫応答が重要である(上記Fadden (1992);
上記Stenfors及びRaisanen (1993))。
多くの特許公報、例えば国際公開公報WO90/12591, WO93/03761, WO95/09025, WO
95/31215, WO96/12733及びWO97/41731に開示されている。
えば一層良好で効果的なワクチンを提供するために引き続き要求されているとこ
ろである。本発明者は、免疫応答の誘起に使用可能な係る特定範囲の蛋白質の分
離を果たし、同定ツールとしての利用を見い出したものである。
)抗原である蛋白質を提供するものであり、この蛋白質はSDSゲル電気泳動法
で測定される約14〜71kDaの見掛け分子量をもつものである。
ずれか一種のものである。
記蛋白質。
上記蛋白質。
記蛋白質。
下記のN末端配列 AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT を有する上記蛋白質。
下記のN末端配列 NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV を有する上記蛋白質。
下記のN末端配列 TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY を有する上記蛋白質。
下記のN末端配列 AGLDRSGQDVTASLQDGTYA を有する上記蛋白質。
以下の内部ペプチド配列 残基350〜361 GELSSNLQDRHK 残基366〜380 ADIHGNRFRGSAAIAS 残基528〜533 NFEYLK 残基542〜556 FGELSVGDSHSVFLQ 残基665〜682 DADVTGGFYGPNATEMGG を有する上記蛋白質。
「抗原性」及び/又は「免疫性」である。ここで、一般的に「抗原性」であると
言うことは、係る蛋白質又はポリペプチドが抗体増加用に使用可能であるか、或
いは実際に患者に免疫応答を誘発可能であると言うことを意味する。また「免疫
性」であると言うことは、係る蛋白質又はポリペプチドが患者の防御免疫応答の
誘発に使用可能であることを意味する。従って、免疫性である場合には係る蛋白
質又はポリペプチドは免疫応答だけでなく付加的に抗体に因らない免疫応答の生
起にも寄与可能である。
例えば抗原性又は免疫性物質としても使用できることは当業者であれば理解でき
ることである。即ち、本発明は、例えば一つ以上の相加、欠失、置換などを含む
係る蛋白質又はポリペプチドも包含するものである。更に、一つのアミノ酸を別
の類似タイプのアミノ酸に置換することも可能である。例えば一つの疎水アミノ
酸を別のものに置換することが可能である。アミノ酸配列の比較にはCLUSTALプ
ログラムなどのソフトウエアプログラムを用いることができる。このプログラム
はアミノ酸配列同士を比較し、いずれか適切なほうの配列にスペースを挿入して
最適な整合を見出すものである。最適整合に対するアミノ酸の同一性や相似度(
同一性プラスアミノ酸タイプの保存性)を計算することができる。また、BLASTx
のようなプログラムで相似配列間の最長ストレッチを揃え、適合する相似値を付
すことができる。従って、比較結果を得てそれぞれ異なるスコアを有する幾つか
の相似領域を見出すことが可能である。本発明では、これら両タイプの分析を考
慮に入れている。
は、この相同体又は誘導体がレンサ球菌肺炎抗原性又は免疫原性を残していなけ
ればならないことよりも重要ではない。但し、上述の蛋白質又はポリペプチドに
対して少なくとも60%の相似度(上記の通り)を有する相同体又は誘導体とする
ことが好ましい。好適には少なくとも70%の相似度、更に好適には少なくとも80
%の相似度を有する相同体又は誘導体が好ましい。最適には少なくとも90%又は
95%の相似度を有する相同体又は誘導体とするのがよい。
効果的にタグ付けすることにより精製を容易にする部分を結合した融合蛋白質と
することもできる。この場合、「タグ」を除去することは必要であり、或いは融
合蛋白質自体が有用な抗原性を充分に残している必要がある。
ことができる。これらの技術については、例えばジェイ・サムブルック(J. Sam
brook)他による文献「分子クローニング(Molecular Cloning)第2版、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社(Cold Spring Harbor Lab
oratory Press) 1989年」に述べられている。即ち、前記蛋白質のN末端配列を
プローブ基質として用いて個々の蛋白質をコードする遺伝子を分離することがで
きる。従って、本発明は、別の態様として、特定の配列、すなわち (i) :前記蛋白質又はポリペプチドをコードするDNA配列又はそれに等価
なRNA配列、 (ii) :(i)の配列のいずれかに対して相補的な配列、 (iii) :(i)及び(ii)の配列のいずれかに対して実質的な同一性を有する配列
、又は (iv) :前記蛋白質の相同体、誘導体又はフラグメントをコードする配列、 を含むか或いは該特定配列のみからなる核酸分子を提供する。
できる。本発明は、当業者に明らかなように、ここに例示した特別新規な核酸分
子の新規変異体を含むことができる。このような変異体は本発明に包含されるも
のである。これら変異体は、例えば菌株の変異により実在するものである。例え
ば、相加、置換及び/又は欠失などが含まれる。加えて、特に微生物発現システ
ムを利用する際は、発現に用いる特定組織に既知の適正なコドン使用法を利用す
ることによって核酸配列を扱うことが望ましい。従って、合成、即ち非天然由来
の変異体も本発明の範疇に含まれるものである。
て相補的な配列を有する或る与えられたRNA分子を意味する(RNA中では遺
伝子コードにおけるTがUで置き換えられていても良い)。
APなどのソフトウエアプログラム(両プログラム共にウィスコンシン・ジェネテ
ィクス・コンピュータ・グループ(GCG: Wisconsin Genetics Computer Group)
のソフトウエア・パッケージで入手可能)を利用することができる。このうち、
例えばBESTFITは二つの配列を比較して最も相似するセグメント同士の最適な整
合を生成する。また、GAPは両配列をそれらの全長に沿って整合させることがで
き、いずれか適切なほうの配列にスペースを挿入することによって最適な整合を
検出可能である。尚、核酸配列の同定における比較に関しては、本発明の理念の
範疇で各配列の全長に沿って整合をとることにより比較することが好ましい。
好ましく、要すれば少なくとも75%、更に要すれば少なくとも90%又は少なくと
も95%の配列とするとよい。或る場合には配列間の同一性は99%以上のこともあ
る。
に対して従来技術の核酸配列よりも高い同一性の度合いを有していることを意味
する。
のである場合、そのような遺伝子製品又はその新規な一部分をコードすることの
できる全ての配列は本発明の技術的範疇に包含されるものである。
取り込まれ、このベクターが宿主に取り込まれる。このようなベクター及び適合
する宿主は本発明の更に別の態様を構成するものである。
いることにより、B. catarrhalis中の遺伝子を同定することができる。同定され
た遺伝子は次いで制限酵素を用いて切り出すことができ、ベクター中にクローニ
ングすることができる。このベクターは発現用の適正な宿主に導入することが可
能である。
を用いることによりB. catarrhalisから得ることができる。プローブ用の適切な
サイズのフラグメントを得るためには制限酵素又は超音波処理技術を用いること
ができる。
って、前述のようにして得られる配列データはPCRで用いるための二つのプラ
イマーの設計に用いることができ、それにより全遺伝子又はそのフラグメントを
含む所要の配列をターゲットにして高度に増幅することができる。この場合、一
方のプライマーはDNA分子の或るストランド上に位置する第1配列に対して高
い特異性を定常的に示し、他方のプライマーは該DNA分子の相補的なストラン
ド上で第1配列に相補的な配列から間隔を開けて位置する第2配列に対して高い
特異性を示すものであればよい。
ても良い。比較的短い配列は化学的に合成及び連結反応させて長い配列とするこ
とができる。
結果が得られることは当業者に認識されているところである。従って、本明細書
で述べている分子量の表示値も同様にして測定されるものである限り同様の変動
率を含むものであることは述べるまでもない。
な抗原性を充分に残しているという条件付きで使用可能であることは当業者の理
解するところである。このようなフラグメントをスクリーニングする技術は当業
者に周知である。従って、本発明は第2の態様として前述蛋白質の一種以上の抗
原フラグメントを提供するものである。
用途の一つは免疫応答の誘発にある。従って、第3の態様として本発明は免疫原
性組成物、好ましくはワクチン組成物を提供するものであり、この組成物は本発
明による一種以上の抗原蛋白質(その抗原フラグメントを含む)を含有するもの
である。係る組成物は、標準的な調合用担体物質、賦形剤、希釈剤などと共に処
方可能である。また免疫応答を刺激するのに有用な一種以上のアジュバントを含
有しても良い。本発明のワクチン組成物は一種以上のアジュバントを含有するこ
とができる。周知のアジュバントとしては、水酸化アルミニウムなどの無機物の
ゲルや、フロイント不完全アジュバントなどの油中水型エマルジョンがある。そ
の他の有用なアジュバントも当業者に周知である。
る一種以上の蛋白質またはその一種以上の高下フラグメントの使用を提供する。
この免疫原性組成物は好ましくはワクチンである。好適な実施形態においては、
係るワクチンは呼吸器系感染症の予防又は治療、或いは中耳炎の予防又は治療向
けのものである。
の抗原フラグメントが免疫原性組成物の調製に用いられる。
白質。
蛋白質。
白質。
下記のN末端配列 AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT を有する蛋白質。
下記のN末端配列 NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV を有する蛋白質。
下記のN末端配列 TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY を有する蛋白質。
下記のN末端配列 AGLDRSGQDVTASLQDGTYA を有する蛋白質。
以下の内部ペプチド配列 残基350〜361 GELSSNLQDRHK 残基366〜380 ADIHGNRFRGSAAIAS 残基528〜533 NFEYLK 残基542〜556 FGELSVGDSHSVFLQ 残基665〜682 DADVTGGFYGPNATEMGG を有する蛋白質。
又は分離された製剤として単独で、或いは他のB. catarrhalis由来の抗原蛋白質
との混合物として提供可能である。
質、その一種以上の相同体もしくは誘導体、或いはその一種以上の抗原フラグメ
ントを、付加的な少なくとも一種の他のB. catarrhalis抗原もしくはその一種以
上のフラグメントと共に含有する抗原組成物を提供するものである。
的な調製に用いることができる。
いはその一種以上の抗原フラグメントに対して増強された抗体を提供するもので
ある。好適な抗体は本発明の蛋白質に特異的に結合し、従って係る蛋白質を高純
度にすることができるものである(例えば、係る抗体は本発明の蛋白質に固定化
し、結合して用いることができる。その後、蛋白質は適正な条件下において好適
な溶出液で溶出される)。
体とすることができる。
ット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、或いはサル)に注射し、宿主動物に
おける抗体産生を刺激することにより増強することができる。要すれば、本発明
の蛋白質と共にアジュバントを投与しても良い。前述のような公知のアジュバン
トをこの目的で用いることが可能である。かくして得られた抗体は次いで本発明
の蛋白質に結合させることにより高純度に精製することができる。
ノクロナール抗体は、成長細胞を形成するために所要の抗体を産生する骨髄腫細
胞及び脾臓細胞を融合させることで形成することができる。従って、これには周
知のケーラー及びミルシュタイン技法(Kohler & Milstein technique, Nature
256 (1975)参照)もしくはこの技法の変形手法を利用することが可能である。
する技術は本技術分野では今や充分に開発されている。このような技術は標準的
な免疫学教本、例えばロイト(Roitt)他による「免疫学(Immunology) 第2版、
1989年、チャーチルリビングストン社(Churchill Livingstone) ロンドン発行」
に詳述されている。
質に結合可能な誘導体を包含するものである。従って、本発明には抗体フラグメ
ント及び合成抗体が含まれる。抗体フラグメントと合成抗体の例は、例えばドー
ガル(Dougall)他により「ティブテック(Tibtech) 12, 372-379頁, 1994年09月」
に述べられている。
えばFabフラグメント、F(ab)2フラグメント、及びFvフラグメントなどが含
まれる。Fvフラグメントは、単鎖Fv(scFv)分子として知られている合成
抗体を生成するように修飾することができる。これには、Vh及びVl領域を共
有結合して分子の安定性を増すペプチドリンカーが含まれる。使用可能な他の合
成抗体にはCDRペプチドがある。これらは抗原結合性決定基を含む合成抗体で
ある。模擬ペプチドも使用可能である。通常、これらの分子はCDRループ構造
を模擬して抗原相互反応性の側鎖を含む構造的に限定された有機物リングである
。
化)抗体またはその誘導体は本発明の技術的範疇に属するものである。ヒト化抗
体の一例は、ヒト・フレームワーク領域を有し、齧歯類高度可変領域は持たない
抗体である。キメラ型の抗体の生成手法は、例えばモリソン(Morrison)他により
「PNAS, 81, 6851-6855頁,(1984)」に、またタケダ(Takeda)他により「Nature,
314, 452-454頁,(1985)」に述べられている。
分子(蛍光又は放射線標識など)を提供する付加部分を備えた分子を含んでいて
もよい。
用にも有用である。
のであり、この方法では、 a) 本発明による一種以上の抗体を供試サンプルと接触せしめ、 b) 本発明による一種以上の抗原蛋白質又は一種以上のその抗原フラグメント
存在を検出することからなるものである。
いることも可能であり、このような抗体は患者から得た生化学サンプル中に存在
する可能性がある。従って、本発明は、更に別の態様として、 a) 本発明による一種以上の抗原蛋白質、その一種以上の抗原フラグメント、
又は本発明による抗原組成物を供試サンプルと接触せしめ、 b) B. catarrhalisに対する抗体の存在を検出する、 ことからなるB. catarrhalisの検出又は同定方法を提供するものである。
の抗原蛋白質とその抗原フラグメント或いは抗原組成物の使用を提供するもので
ある。この検出又は同定は試験管内(in vitro)で行うことが好ましい。
述のB. catarrhalisの試験管内検出及び/又は同定用のキットの一部として提供
することができる。従って、本発明は、更に別の態様として、本発明による少な
くとも一種の抗原蛋白質とその抗原フラグメント又は抗原組成物、或いは本発明
による少なくとも一種の抗体を備えたB. catarrhalis検出及び/又は同定用キッ
トを提供する。
て、医薬における本発明の抗原蛋白質とそのフラグメント又は本発明による免疫
原性組成物の使用を提供するものである。
メント又は本発明による免疫原性組成物の使用、 (b) 本発明による少なくとも一種の蛋白質、又はその少なくとも一種の抗原フ
ラグメント、又は本発明による免疫原性組成物の有効量を、好ましくはワクチン
として患者に投与することからなる呼吸器感染症の治療又は予防法、及び (c) 本発明による少なくとも一種の蛋白質、又はその少なくとも一種の抗原フ
ラグメント、又は本発明による免疫原性組成物の有効量を、好ましくはワクチン
として患者に投与することからなる中耳炎の治療又は予防法、 をも提供するものである。
法はDNA組換え技術を利用した方法である。
本発明を限定するものではない。
5コロニーのB. catarrhalisK65株(オーストラリア、パースのサー・チャール
ス・ガーディナー病院で採取された喀痰からの臨床分離株、K65株はβラクタマ
ーゼを生じる)を接種し、これを振盪培養器中で37℃にて一晩培養した。この培
養株を各2mLずつ4本の500 mLフラスコのBHIブロスに添加し、これらを振盪
培養器中で37℃にて一晩培養した。この細菌をペレットにし、JA−14型ローター
を用いたベックマンJA−2型遠心器により4℃、10000rpmにて15分ずつ3回にわ
たりPBS中で洗浄した。蛋白質は、ツヴィッタージェント(Zwittergent)抽出法及
び酢酸ナトリウム/βメルカプトエタノール添加後のpH調整を省いたエタノー
ル沈殿法を用いて抽出した。この最終生成物を蒸留水で透析し、15.35mg/mLで40
mL、即ち合計614mgの蛋白質を得た。この蛋白質を凍結乾燥した。
から BioRad Q2型イオン交換カラムに装填した。各ランにつき1mLの注入量とし
た。カラムはバッファーAで1mL/1分にて5分間洗浄した。蛋白質は、連続勾
配溶出法と、100%バッファーAから100%バッファーB(25mMのトリスHCl+0.5
MのNaCl、pH8.1)への段階勾配溶出法との組み合わせを用いて5〜10分にわたり
溶出した。段階溶出に続き100%バッファーBにより4分間の洗浄を行い、その後
更に100%バッファーAによる1分間の洗浄を行った。得られたフラクション2,
3及び4を蓄えてPD−10カラム上で脱塩し、希釈トリスバッファーに変えてから
凍結乾燥した。
6.8、10%(vol/vol)グリセロール、2%(wt/vol)SDS、5%(vol/vol)βメル
カプトエタノール)と混合し、37℃で30分インキュベートした。バイオラッド491
型プレップ・セル(Bio-Rad Model 491 Prep Cell)を使用して予備SDSゲル
電気泳動を実行したが、これには、40mLの9%T-1.42%Cアクリルアミド/BIS
(N,N'-メチレンビス・アクリルアミド)分離ゲルを重合した10mLの4%T-0.36
%Cアクリルアミド/BISスタッキングゲルと共に内径37mmのカラム内で用いた。
0.025MのトリスHClでカラムからフラクションを溶出して凍結乾燥により濃縮し
、分析用SDSゲル電気泳動により蛋白質含有量を分析した。71kDaの蛋白質は
フラクション57〜80中に存在した。これらを蓄えて凍結乾燥し、2.5mLの蒸留水
で再構成した。更に希釈PBS(リン酸緩衝食塩水)でバッファー交換して脱塩
し、蛋白質を緩衝するPBSの濃度が等浸透圧となるように再構成した。
び20〜35kDaの蛋白質を含むフラクション4〜17も収集した。フラクション4〜1
7は更に14%T-1.42%Cアクリルアミド/BIS分離ゲルを4%T-0.36Cアクリル
アミド/BISスタッキングゲルと共に用いて精製した(図1の流れ図参照)。これ
らのフラクションを前述と同様に蛋白質含有量の分析に付し、適合する範囲のフ
ラクションを集めて精製蛋白質を脱塩及び濃縮した。
を振盪培養器中で37℃にて一晩培養した。この培養株を各2mLずつ4本の500 mL
フラスコのBHIブロスに添加し、これらを振盪培養器中で37℃にて一晩培養し
た。この細菌をペレットにし、JA−14型ローターを用いたベックマンJA−2型遠
心器により4℃、10000rpmにて15分ずつ3回にわたりPBS中で洗浄した。蛋白
質は、ツヴィッタージェント(Zwittergent)抽出法及び酢酸ナトリウム/βメル
カプトエタノールのpHをpH4に調整したエタノール沈殿法を用いて抽出した。
ルを用いる BioBad Q2型イオン交換カラムに装填した。カラムから得たピークを
蛋白質含有量の分析に付し、適合する範囲のフラクションを集め、予備ゲル電気
泳動(図2に示すカラムと前述プロトコルを使用)により更に精製した。SDS
を使用した予備電気泳動を含む全ての蛋白質精製操作は上記洗浄剤をリン酸カリ
ウムによる沈殿で除去して行った。
範囲の量で幾つかの蛋白質を精製した。図3に23〜71kDaの範囲の蛋白質の分析
SDSゲル電気泳動による分析結果を示す。
から供給されたプロトコルに従って行った。但し、この他にも、文献:松平、J.
Biol. Chem., 262; 10035-10038頁(1997)に述べられている方法に従って同様の
配列決定を行うこともできる。
ミド化法を用いて行った。10%グリセロール(vol/vol)と、5%(wt/vol)SDS
、0.025MのトリスHCl、及び100mMの1,4-DTTからなるpH8.3の溶液中で蛋白質に対
するアルキル化反応を実行した。先ず、この混合物を90℃で15分間インキュベー
トすることにより蛋白質を還元した。得られたサンプルを37℃に冷却してアクリ
ルアミドを最終濃度2Mまで添加し、該混合物をアルゴン雰囲気の暗所中で30〜60
分間にわたりインキュベートした。SDS還元バッファーを加えてサンプルをS
DSゲル電気泳動にかけ、ゲルを染色して取り出されるクーマシーにより蛋白質
を可視化した。この操作は71kDaの蛋白質に対しても行われたが、この蛋白質は
N末端の配列が決定できなかった。
mun., 63; 2931-2940 (1995)参照)の変形である。免疫接種材料は、前記蛋白質
を不完全フロイントアジュバント(IFA:ミシガン州セントルイスのシグマ社
(Sigma)製)に1:1の比率で乳化させて投与量が2.5μg〜10μgの範囲となるよ
うに準備した。特定行減退除去(SPF)環境に維持したSPF雄BALB/cマウス
に0.25mLのケタミン/キシラジン含有PBS(塩酸ケタミン[オーストラリア国
ニューサウスウェールズ州スミスフィールドのトロイ・ラボラトリーズ製]5mg
/mL、塩酸キシラジン[オーストラリア国ニューサウスウェールズ州ピンブルの
バイエル社製]2mg/mL)を皮下注射することにより麻酔した。マウス腹壁に1
cmの中央切開部を形成してそこから小腸を露出させ、26Gニードルを使用して約
1μLの接種量を漿膜下組織の各パイエル板に送り込んだ。小腸を無菌PBSで
リンスし、腹腔を縫合した。偽免疫処理マウスには同様の手術でIFA及びPB
Sの乳液を注射した。
麻酔薬サッファン(Saffan:全量1kg当たり20mgのアルファドンを含有。0.15mL
;オーストラリア国ニューサウスウェールズ州エヌス・ライドのピットマン・ム
ーア社製)で鎮静させた。蛋白質含有PBS20μL(IPPに投与したのと同量)を
気管に経口挿入した22.5Gカテーテル(日本国東京のテルモ社製)を介して肺に
送り込んだ。この接種材料は0.3mLずつ二回の空気で拡散させた。
てB. catarrhalisを一晩培養した。培養基板を37℃にて5%CO2雰囲気内で一
晩インキュベートして菌を採取し、PBS内で三回洗浄した。濃度は405nmにお
ける光学的濃度測定で評価し、上記の一晩経過した培養基板における接種物系列
希釈のコロニー形成単位(CFU)を計数することで確認した。マウスはサッフ
ァンの静注で鎮静させた。生きたB. catarrhalisを添加したPBSの丸薬状接種
物を前述の気管内刺激と同様にして肺に送り込んだ。マウスを汗腺から時間後又
は必要とされるときのいずれかにペントバルビタールソーダの腹膜内注射で殺し
た。心臓穿刺により血液を採取し、血清採取のために凝固させた。喉部を切開し
て気管を露出させ、カニューレを介して肺に0.5mLのPBSを点滴及び回収する
ことによって気管支肺胞洗浄液(BAL)を採取した。BAL液を採取した後、
完全な肺を取り出して2mLのPBS中に置き、組織ホモジナイザー(9500rpm; H
eidolph DIAX 600, ドイツ国ケルハイムのエレクトロ社製)で均質化した。BA
L液と均質化肺組織をCFU識別用平板系列希釈による細菌浄化値の分析にかけ
た。血清は、4℃、450×gで10分間遠心分離機(Juoan BR3.11型、フランス
国のサン・ナゼール社製)にかけて分離し、−80℃で保管した。
に示すデータはBAL液と肺組織のそれぞれにおける細菌浄化値の増加率(%)を
非免疫処置のものとの比較で示している。
であるが、この蛋白質に対する免疫応答は肺組織の浄化値では有効性が低い。
L液及び肺組織の双方について細菌浄化に有効である。15kDa及び30kDaの各蛋白
質による免疫処置はBAL液及び肺組織の双方について50%以上高い浄化率の向
上を示したが、BAL液について同等の浄化率を示した14.5kDaの蛋白質は肺組
織には同じ防御効果をもたらすものではなかった。14kDaの蛋白質はBAL液に
おける細菌浄化には有効ではないが、肺組織に対しては浄化率を若干向上できる
ものであった。
ある。
す流れ図である。
と行わなかった場合の浄化率データを示す線図である。
Claims (29)
- 【請求項1】 ブランハメラ・カタラリス(Branhamella catarrhalis)抗
原であり、且つSDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約14〜71kDa
であることを特徴とする蛋白質。 - 【請求項2】 SDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約14kDa
であることを特徴とする請求項1に記載の蛋白質。 - 【請求項3】 SDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約14.5kD
aであることを特徴とする請求項1に記載の蛋白質。 - 【請求項4】 SDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約15kDa
であることを特徴とする請求項1に記載の蛋白質。 - 【請求項5】 SDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約20kDa
であり、下記のN末端配列 AISYGNSADAQPYVGAKIGQVDAKQINNKNT を有することを特徴とする請求項1に記載の蛋白質。 - 【請求項6】 SDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約30kDa
であり、下記のN末端配列 NVVTNTGATVVDGTRTIFSTLVKPAAVVAAV を有することを特徴とする請求項1に記載の蛋白質。 - 【請求項7】 SDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約35kDa
であり、下記のN末端配列 TPTVYGKAFLTIDANNTDXTY を有することを特徴とする請求項1に記載の蛋白質。 - 【請求項8】 SDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約44kDa
であり、下記のN末端配列 AGLDRSGQDVTASLQDGTYA を有することを特徴とする請求項1に記載の蛋白質。 - 【請求項9】 SDSゲル電気泳動法で測定される見掛け分子量が約71kDa
であり、以下の内部ペプチド配列 残基350〜361 GELSSNLQDRHK 残基366〜380 ADIHGNRFRGSAAIAS 残基528〜533 NFEYLK 残基542〜556 FGELSVGDSHSVFLQ 残基665〜682 DADVTGGFYGPNATEMGG を有することを特徴とする請求項1に記載の蛋白質。 - 【請求項10】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の蛋白質の相同体もし
くは誘導体。 - 【請求項11】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の蛋白質の一種以上の
抗原フラグメント。 - 【請求項12】 特定の配列、すなわち (i) :請求項1〜9のいずれか1項に記載の蛋白質をコードするDNA配列
又はそれに等価なRNA配列、 (ii) :(i)の配列のいずれかに対して相補的な配列、 (iii) :(i)及び(ii)の配列のいずれかに対して実質的な同一性を有する配列
、又は (iv) :請求項1〜9のいずれか1項に記載の蛋白質の相同体、誘導体又はフ
ラグメントをコードする配列、 を含むか或いは該特定配列のみからなることを特徴とする核酸分子。 - 【請求項13】 請求項12に記載の核酸配列を含むベクター。
- 【請求項14】 請求項13に記載のベクターで形質転換又はトランスフェ
クションされた宿主細胞。 - 【請求項15】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の一種以上の蛋白質、
請求項10に記載の一種以上の相同体又は誘導体、又は請求項11に記載の一種
以上の抗原フラグメントを含む免疫原性組成物。 - 【請求項16】 ワクチンであることを特徴とする請求項15に記載の免疫
原性組成物。 - 【請求項17】 免疫原性組成物の調製における、請求項1〜9のいずれか
1項に記載の一種以上の蛋白質、請求項10に記載の一種以上の相同体又は誘導
体、又は請求項11に記載の一種以上の抗原フラグメントの使用。 - 【請求項18】 免疫原性組成物が呼吸器系感染症の予防もしくは治療用の
ワクチン組成物であることを特徴とする請求項17に記載の使用。 - 【請求項19】 免疫原性組成物が中耳炎の予防もしくは治療用ワクチンで
あることを特徴とする請求項17に記載の使用。 - 【請求項20】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の一種以上の蛋白質、
及び/又は請求項10に記載の一種以上の相同体又は誘導体、及び/又は請求項
11に記載の一種以上の抗原フラグメントを、付加的な少なくとも一種の他のブ
ランハメラ・カタラリス(B. catarrhalis)抗原もしくはその一種以上のフラグ
メントと共に含有する抗原組成物。 - 【請求項21】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の蛋白質、請求項10
に記載の相同体又は誘導体、又は請求項11に記載の抗原フラグメントに対して
増強された抗体。 - 【請求項22】 a)請求項21に記載の一種以上の抗体を供試サンプルと接
触せしめ、 b)請求項1〜9のいずれか1項に記載の一種以上の抗原の存在を検出すること
を特徴とする、ブランハメラ・カタラリス(B. catarrhalis)の検出及び/又は
同定方法。 - 【請求項23】 a)請求項1〜9のいずれか1項に記載の一種以上の抗原蛋
白質、請求項10に記載の一種以上の相同体又は誘導体、請求項11に記載の一
種以上の抗原フラグメント、又は請求項20に記載の抗原組成物を供試サンプル
と接触せしめ、 b)ブランハメラ・カタラリス(B. catarrhalis)に対する抗体の存在を検出す
ることを特徴とする、ブランハメラ・カタラリス(B. catarrhalis)の検出及び
/又は同定方法。 - 【請求項24】 ブランハメラ・カタラリス(B. catarrhalis)の検出又は
同定における、請求項1〜9のいずれか1項に記載の蛋白質、請求項10に記載
の相同体又は誘導体、請求項11に記載の抗原フラグメント、又は請求項20に
記載の抗原組成物の使用。 - 【請求項25】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の少なくとも一種の抗
原蛋白質、請求項10に記載の少なくとも一種の相同体又は誘導体、請求項11
に記載の少なくとも一種の抗原フラグメント、請求項20に記載の抗原組成物、
又は請求項21に記載の抗体を備えたことを特徴とするブランハメラ・カタラリ
ス(B. catarrhalis)の検出及び/又は同定用のキット。 - 【請求項26】 医薬における、請求項1〜9のいずれか1項に記載の蛋白
質、請求項10に記載の相同体又は誘導体、請求項11に記載のフラグメント、
又は請求項15に記載の免疫原性組成物の使用。 - 【請求項27】 患者の免疫応答の誘発における、請求項1〜9のいずれか
1項に記載の蛋白質、請求項10に記載の相同体又は誘導体、請求項11に記載
の抗原フラグメント、又は請求項15に記載の免疫原性組成物の使用。 - 【請求項28】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の少なくとも一種の蛋
白質、請求項10に記載の少なくとも一種の相同体又は誘導体、請求項11に記
載の少なくとも一種の抗原フラグメント、又は請求項15に記載の免疫原性組成
物の有効量を投与することからなる呼吸器感染症の治療又は予防法。 - 【請求項29】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の少なくとも一種の蛋
白質、請求項10に記載の少なくとも一種の相同体又は誘導体、請求項11に記
載の少なくとも一種の抗原フラグメント、又は請求項15に記載の免疫原性組成
物の有効量を投与することからなる中耳炎の治療又は予防法。
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