PT1077999E - Proteínas de moraxella catarrhalis. - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 077 999 /PT
DESCRIÇÃO "Proteínas de Moraxella catarrhalis" O presente invento refere-se a uma nova proteína de Branhamella catarrhalis, sequências de ADN que codificam tais proteínas, assim como à sua utilização em diagnósticos e como base para vacinas. A Branhamella catarrhalis (também conhecida como Moraxella catarrhalis) é uma bactéria aeróbica Gram-negativa que provoca infecções no tracto respiratório em seres humanos. A B. catarrhalis pode existir como parte da microflora do tracto respiratório humano, particularmente em crianças. A bactéria provoca infecções no tracto respiratório inferior em adultos e otite média nas crianças (Klein J. 0., Clin. Infect. Dis. 19: 823-833 (1994); Murphy T.F., Microbial. Rev. 60: 267— 279 (1996); Nicotra et al., Arch. Intern. Med. 146: 890-893). Aproximadamente 30% das exacerbações purulentas nos adultos com doença pulmonar obstrutiva crónica do pulmão eram devidas a B. catarrhalis num estudo (Verghese et al., Antimicrob. Agents Chemother., 34: 1041-1044 (1990)). Estudos que utilizam culturas de fluido do ouvido médio revelaram que 15 a 20% dos episódios da otite média são provocados por B. catarrhalis (Klein 1994), supra).
As infecções provocadas pela B. catarrhalis induzem uma resposta imunológica contra antigénios da membrana externa da bactéria (Chapman et al., J. Infect. Dis. 151: 878-882 (1985); Faden et al., Infect. Immun., 60: 3824-3829 (1992); Sethi et al., Infect. Immun., 63: 1516-1520 (1995)). O anticorpo contra a B. catarrhalis está presente em secreções do tracto respiratório superior (Fadden (1992), supra·, Stenfors, L.E. e Raisanen, S. Acta Otolaryngol. 113: 191-195 (1993)). A resposta imunológica mucosa específica da estirpe pode ser importante na protecção contra a otite média provocada pela B. catarrhalis (Fadden (1992), supra e Stenfors e Raisanen (1993), supra).
Um certo número de publicações de patentes descrevem a proteína d isolada da B. catarrhalis, e a sua potencial 2
ΕΡ 1 077 999 /PT utilização como antigénio. Exemplos incluem WO90/12591, WO93/03761, W095/09025, W095/31215, W096/12733 e W097/41731.
Existe, contudo, uma necessidade continuada de proporcionar uma gama de antigénios de B. catarrhalis de modo a proporcionar vacinas melhores e mais eficazes, por exemplo. Isolou-se agora uma gama de tais proteínas que podem ser utilizadas para eliciar respostas imunológicas, assim como serem utilizadas como ferramentas de diagnóstico.
Deste modo, num primeiro aspecto, o presente invento proporciona uma proteína que é um antigénio de B. catarrhalis e que tem uma massa molecular aparente de cerca de 30 kDa, determinada por SDS-PAGE, e tendo a seguinte sequência N-terminal: N WT N T G AT WD G T RTIF S T L VKP AAWAAV ;
Tal como aqui discutido, as proteínas e polipéptidos do invento são úteis como material antigénico. Tal material pode ser "antigénico" e/ou "imunogénico". De um modo geral, "antigénico" pretende significar que a proteína ou o polipéptido é susceptível de ser utilizado para criar anticorpos ou, na verdade, que é capaz de induzir uma resposta de anticorpos num indivíduo. "Imunogénico" pretende significar que a proteína ou o polipéptido é capaz de eliciar uma resposta imunológica protectora num indivíduo. Deste modo, neste último caso, a proteína ou o polipéptido pode ser capaz de não apenas gerar uma resposta de anticorpos como adicionalmente respostas imunológicas com base não em anticorpos.
Um perito na especialidade notará que os homólogos ou derivados das proteínas ou polipéptidos do invento também têm utilização no contexto do presente invento, i.e. como material antigénico/imunogénico. Deste modo, por exemplo, as proteínas ou polipéptidos que incluem uma ou mais adições, deleções, substituições ou outros do género, estão englobados no presente invento. Adicionalmente, pode ser possível substituir um aminoácido por outro de "tipo" similar. Por exemplo, substituir um aminoácido hidrófobo por outro. Pode-se utilizar um programa, tal como o programa CLUSTAL para comparar as 3
ΕΡ 1 077 999 /PT sequências de aminoácidos. Este programa compara as sequências de aminoácidos e encontra o alinhamento óptimo inserindo espaços nas sequência conforme adequado. É possível calcular a identidade ou a semelhança de aminoácido (identidade mais conservação do tipo de aminoácido) para um alinhamento óptimo. Um programa, tal como o BLASTx alinhará a porção mais longa de sequências semelhantes e atribuirá um valor à correspondência. É assim possível obter uma comparação em que existem várias regiões de semelhança, possuindo, cada uma, diferentes classificações. Ambos os tipos de análise estão contemplados no presente invento.
No caso de homólogos e derivados, o grau de identidade com uma proteína ou um polipéptido, tal como aqui descrito, é menos importante do que o facto de que o homólogo ou derivado deve reter o seu Streptococcus pneumoniae para antigenicidade ou imunogenicidade. Contudo, de modo adequado, são proporcionados homólogos ou derivados possuindo, pelo menos, 60% de semelhança (tal como discutido acima) com as proteínas ou polipéptidos aqui descritos. Preferencialmente, são proporcionados homólogos ou derivados que possuem, pelo menos, 70% de semelhança, mais preferencialmente, pelo menos, 80% de semelhança. Muito preferencialmente, são proporcionados homólogos ou derivados que possuem, pelo menos, 90% ou mesmo 95% de semelhança.
Numa abordagem alternativa, os homólogos ou derivados podem ser proteínas de fusão, incorporando porções que tornam a purificação mais fácil, por exemplo, marcando eficazmente a proteína ou o polipéptido desejados. Pode ser necessário remover o "marcador" ou pode acontecer que a proteína de fusão retenha ela própria suficiente antigenicidade para ser útil.
Podem ser utilizadas técnicas de clonagem de genes para proporcionar uma proteína do invento numa forma substancialmente pura. Estas técnicas são descritas, por exemplo, em j. Sambrook et ai. Molecular Cloning 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Deste modo, as sequências N-terminais das proteínas aqui descritas podem, por seu lado, ser utilizadas como base para sondas para isolar os genes que codificam para as proteínas individuais. Deste modo, noutro aspecto, o presente invento proporciona uma molécula de 4
ΕΡ 1 077 999 /PT ácido nucleico compreendendo, ou consistindo em, uma sequência que é: (i) uma sequência de ADN que codifica para uma proteína ou um polipéptido, tal como aqui descrito, ou os seus equivalentes de arn (ii) uma sequência que é complementar a qualquer das sequências de (i); (iii) uma sequência que tem uma identidade substancial com qualquer uma das de (i) e (ii); (iv) uma sequência que codifica para um homólogo, derivado ou fragmento de uma proteína, tal como aqui definida.
As moléculas de ácido nucleico do invento podem incluir uma pluralidade de tais sequências e/ou fragmentos. 0 perito na especialidade notará que o presente invento pode incluir novas variantes das novas moléculas de ácido nucleico particulares que são aqui exemplificadas. Tais variantes estão englobadas pelo presente invento. Estas podem ocorrer naturalmente, por exemplo, devido a variação da estirpe. Por exemplo, estão incluídas adições, substituições e/ou deleções. Adicionalmente, e particularmente quando se utilizam sistemas de expressão microbianos, pode-se pretender manipular a sequência de ácido nucleico utilizando codões preferidos conhecidos no organismo particular utilizado para a expressão. Deste modo, as variantes sintéticas ou que não ocorrem naturalmente estão também incluídas dentro do domínio do invento. O termo "equivalente de ARN" quando utilizado acima, indica que uma dada molécula de ARN tem uma sequência que é complementar à de uma dada molécula de ADN (permitindo o facto de no ARN "U" substituir "T" no código genético).
Quando se comparam sequências de ácidos nucleicos com o fim de determinar o grau de homologia ou de identidade podem utilizar-se programas, tais como o BESTFIT e o GAP (ambos do pacote de programas do Wisconsin Genetics Computer Group (GCG)). Por exemplo, o BESTFIT compara duas sequências e produz um alinhamento óptimo dos segmentos mais similares. O GAP permite que as sequências sejam alinhadas ao longo de todo o seu comprimento e encontra o alinhamento óptimo inserindo 5
ΕΡ 1 077 999 /PT espaços em qualquer das sequências conforme adequado. Adequadamente, no contexto do presente invento, quando se discute a identidade das sequências de ácido nucleico, a comparação é feita por alinhamento das sequências ao longo de todo o seu comprimento.
Preferencialmente, as sequências que possuem uma identidade substancial possuem, pelo menos, uma identidade de sequência de 50%, desejavelmente, pelo menos, uma identidade de sequência de 75% e mais desejavelmente, pelo menos, uma identidade de sequência de 90 ou, pelo menos, 95% com as referidas sequências. Nalguns casos a identidade de sequência pode ser de 99% ou superior.
Desejavelmente, o termo "identidade substancial" indica que a referida sequência possui um maior grau de identidade com qualquer uma das sequências aqui descritas do que com as sequências de ácidos nucleicos da arte anterior.
Deve contudo ser notado que quando uma sequência de ácido nucleico do presente invento codifica, pelo menos, parte de um novo produto génico, o presente invento inclui no seu âmbito todas as sequências possíveis que codifiquem para o produto génico ou para uma sua nova parte. A molécula de ácido nucleico pode estar sob forma isolada ou recombinante. Pode ser incorporada num vector e o vector pode ser incorporado num hospedeiro. Tais vectores e hospedeiros adequados são ainda outros aspectos do presente invento.
Em consequência, por exemplo, ao utilizar sondas desenhadas com base nas sequências de aminoácidos N-terminais aqui descritas, podem ser identificados genes de B. catarrhalis. Estes podem então ser excisados utilizando enzimas de restrição e clonados num vector. O vector pode ser introduzido num hospedeiro adequado para expressão.
As moléculas de ácido nucleico do presente invento podem ser obtidas a partir de B. catarrhalis através da utilização de sondas apropriadas complementares a partes das sequências das moléculas de ácido nucleico. Enzimas de restrição ou 6
ΕΡ 1 077 999 /PT técnicas de ultra-sons podem ser utilizadas para obter fragmentos com dimensões apropriadas para sondas.
Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas de PCR para amplificar uma desejada sequência de ácido nucleico. Deste modo, os dados da sequência aqui proporcionados podem ser utilizados para projectar dois iniciadores para utilização em PCR de modo a que uma sequência desejada, incluindo genes completos ou seus fragmentos, possa ser alvo e então amplificada em alto grau. Um iniciador mostrará normalmente um elevado grau de especificidade em relação a uma primeira sequência localizada numa cadeia da molécula de ADN, e o outro iniciador apresentará normalmente um elevado grau de especificidade relativamente a uma segunda sequência localizada na cadeia complementar da sequência de ADN e estando espaçada da sequência complementar em relação à primeira sequência.
Tipicamente, os iniciadores terão, pelo menos, 15- 25 nucleótidos de comprimento.
Como outra alternativa pode ser utilizada síntese química. Esta pode ser automatizada. Sequências relativamente curtas podem ser sintetizadas quimicamente e ligadas umas às outras para proporcionar uma sequência mais longa. O perito na especialidade reconhecerá que a determinação por SDS-PAGE da massa molecular origina resultados que estão sujeitos a algo como uma variação na ordem de + 10%. Deste modo, qualquer peso molecular aparente aqui descrito que tenha sido assim determinado estará sujeito a tal variação.
Um perito na especialidade notará que fragmentos de proteínas antigénicas do invento podem ser também utilizados, com a condição de que, evidentemente, esses fragmentos retenham uma antigenicidade suficiente para serem eficazes. Técnicas de rastreio de tais fragmentos são bem conhecidas pelos peritos na especialidade. Deste modo, num segundo aspecto, o presente invento proporciona um ou mais fragmentos antigénicos de uma proteína tal como aqui descrito. 7
ΕΡ 1 077 999 /PT
Tal como mencionado acima, uma das utilizações principais dos antigénios (incluindo fragmentos antigénicos) do presente invento é na eliciação de uma resposta imunológica. Deste modo, num terceiro aspecto, o presente invento proporciona uma composição imunogénica, preferencialmente uma composição de vacina, que compreende um ou mais dos antigénios do invento (incluindo fragmentos antigénicos) . A composição pode ser formulada com transportadores, excipientes, diluentes e outros do género, farmaceuticamente aceitáveis. Adicionalmente, esta pode incluir um ou mais adjuvantes, úteis para reforçar qualquer resposta imunológica. As composições de vacinas do invento podem incluir um ou mais adjuvantes. Exemplos de adjuvantes bem conhecidos na arte incluem géis inorgânicos, tais como hidróxido de alumínio ou emulsões de água-em-óleo, tais como um adjuvante de Freund incompleto. Outros adjuvantes úteis serão bem conhecidos dos peritos na especialidade.
Num quarto aspecto, o presente invento proporciona a utilização de uma ou mais proteínas, tal como aqui definidas, ou um ou mais seus fragmentos antigénicos, na preparação de uma composição imunogénica. Preferencialmente, a composição imunogénica é uma vacina. Nas concretizações preferidas, a vacina é para utilização na profilaxia ou tratamento de infecções respiratórias ou na profilaxia ou tratamento da otite média.
Em particular, a proteína seguinte, homólogos, derivados ou um ou mais seus fragmentos antigénicos, é/são utilizados na preparação da composição imunogénica: (v) uma proteína possuindo uma massa molecular aparente de cerca de 30 kDa, tal como determinada por SDS-PAGE, e possuindo a seguinte sequência terminal: N WTN T GAT VVD GTRTIF S T L VKP AAWAAV;
As proteínas antigénicas, seus derivados, homólogos ou fragmentos, aqui descritos, podem ser proporcionados sós, sob a forma de uma preparação purificada ou isolada, ou como parte de uma mistura com outras proteínas antigénicas de B. catarrhalis. 8
ΕΡ 1 077 999 /PT
Em consequência, num quinto aspecto, o invento proporciona uma composição de antigénio compreendendo uma ou mais proteínas do invento, um ou mais homólogos ou derivados ou um ou mais fragmentos antigénicos destes, opcionalmente em conjunto com, pelo menos, um outro antigénio de B. catarrhâlis, ou um ou mais seus fragmentos antigénicos.
Adicionalmente, as proteínas do presente invento, ou seus fragmentos antigénicos, podem ser utilizados na criação ou selecção de anticorpos.
Num outro aspecto, em consequência, o presente invento proporciona anticorpos criados contra, pelo menos, uma proteína do invento, ou contra um ou mais seus fragmentos antigénicos. Os anticorpos preferidos ligam-se especificamente a proteínas do presente invento e podem, por isso, ser utilizados para purificar tais proteínas (e.g. estas podem ser imobilizadas e utilizadas para se ligarem a proteínas do presente invento. As proteínas podem ser então eluídas por lavagem com um eluente adequado sob condições adequadas).
Os anticorpos dentro do âmbito do presente invento podem ser monoclonais ou policlonais.
Os anticorpos policlonais podem ser criados estimulando a sua produção num animal hospedeiro adequado (e.g. um ratinho, rato, cobaia, coelho, ovelha, cabra ou macaco) quando uma proteína do presente invento é injectada no animal. Se desejado, pode ser administrado um adjuvante em conjunto com uma proteína do presente invento. Podem ser utilizados adjuvantes bem conhecidos, tais como os descritos acima. Os anticorpos podem ser então purificados através da sua ligação a uma proteína do presente invento.
Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos a partir de hibridomas. Estes podem ser formados através da fusão de células de mieloma e de células de baço que produzem o anticorpo desejado de modo a formar uma linha de células imortal. Deste modo, pode ser utilizada a técnica bem conhecida de Kohler & Milstein (Nature 256 (1975)) ou variações subsequentes desta técnica. 9
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As técnicas para produzir anticorpos monoclonais e policlonais que se ligam a uma proteína particular estão agora bem desenvolvidas na especialidade. Estas são discutidas em livros de texto de imunologia Standard, por exemplo, em Roitt et al., Immunology segunda edição (1989), Churchill Livingstone, Londres.
Adicionalmente aos anticorpos completos, o presente invento inclui seus derivados que são capazes de se ligarem às proteínas do presente invento. Deste modo, o presente invento inclui fragmentos de anticorpo e construções sintéticas. Exemplos de fragmentos de anticorpo e de construções sintéticas são dados em Dougall et ai. em Tibtech 12 372-379 (Setembro 1994) .
Os fragmentos de anticorpos incluem, por exemplo, fragmentos Fab, F(ab')2 e Fv, que são discutidos em Roitt et al. [supra]. Os fragmentos Fv podem ser modificados para produzir construções sintéticas bem conhecidas na forma de uma molécula de cadeia única Fv (scFv). Isto inclui um ligante peptidico que une covalentemente as regiões Vh e Vi, o que contribui para a estabilidade da molécula. Outras construções sintéticas que podem ser utilizadas incluem péptidos CDR. Estes são péptidos sintéticos que compreendem determinantes de ligação ao antigénio. Podem ser também utilizados miméticos peptidicos. Estas moléculas são usualmente anéis orgânicos conformacionalmente restringidos que mimam a estrutura de uma ansa CDR e que incluem cadeias laterais interactivas com o antigénio.
As construções sintéticas incluem moléculas quiméricas. Deste modo, por exemplo, anticorpos humanizados (ou primatizados), ou seus derivados, estão dentro do âmbito do presente invento. Um exemplo de um anticorpo humanizado é um anticorpo possuindo regiões estruturais humanas, mas regiões hipervariáveis de roedor. As vias de produção de anticorpos quiméricos são discutidas, por exemplo, por Morrison et al. em PNAS, 81, 6851-6855 (1984) e por Takeda et al. na Nature 314, 452-445 (1985).
As construções sintéticas incluem também moléculas compreendendo uma porção adicional que proporciona à molécula 10
ΕΡ 1 077 999 /PT alguma propriedade desejável adicionalmente à ligação ao antigénio. Por exemplo, a porção pode ser um marcador (e.g. um marcador fluorescente ou radioactivo).
Os anticorpos ou seus derivados do presente invento encontrarão também utilização na detecção/diagnóstico de B. catarrhalis.
Num sétimo aspecto, o presente invento proporciona um método para a detecção e/ou o diagnóstico de B. catarrhalis que compreende: (a) colocar em contacto um ou mais anticorpos do invento, com uma amostra a testar; e (b) detectar a presença de uma ou mais proteinas antigénicas do invento, ou um ou mais seus fragmentos antigénicos.
Alternativamente, as proteinas antigénicas do presente invento podem ser utilizadas para detectar anticorpos contra B. catarrhalis, que podem estar presentes numa amostra biológica obtida de um indivíduo. Deste modo, ainda noutro aspecto, o presente invento proporciona um método para a detectar e/ou diagnosticar B. catarrhalis, que compreende: (a) colocar em contacto uma ou mais proteínas antigénicas do invento, ou um ou mais seus fragmentos antigénicos, tal como aqui definido, ou uma composição imunogénica do invento, com uma amostra a testar; e (b) detectar a presença de anticorpos contra B. catarrhalis.
Num aspecto adicional, o invento proporciona a utilização de uma proteína antigénica, de um seu fragmento antigénico ou de uma composição imunogénica do presente invento na detecção e/ou diagnóstico de B. catarrhalis. Preferencialmente a detecção e/ou o diagnóstico são realizados in vitro.
As proteínas antigénicas, os seus fragmentos antigénicos ou a composição de antigénios do invento podem ser proporcionados como parte de um kit para utilização na detecção e/ou diagnóstico in vitro de B. catarrhalis. Deste modo, noutro aspecto, o presente invento proporciona um kit para utilização na detecção e/ou diagnóstico de B. catarrhalis, compreendendo, pelo menos, uma proteína 11
ΕΡ 1 077 999 /PT antigénica, um seu fragmento antigénico, uma composição de antigénios do invento ou, pelo menos, um anticorpo do invento.
Tal como discutido acima, as proteínas antigénicas ou os seus fragmentos antigénicos, podem ser utilizados para induzir uma resposta imunológica contra a B. catarrhalis. Deste modo, num outro aspecto, o presente invento proporciona a utilização do antigénio, um seu fragmento ou uma composição antigénica do invento em medicina.
Em aspectos adicionais, o presente invento proporciona: (a) a utilização de uma proteína antigénica, um seu fragmento antigénico ou uma composição imunogénica, tal como aqui descritos, na indução de uma resposta imunológica num indivíduo; (b) um método para o tratamento da profilaxia de infecções respiratórias num indivíduo, que compreende o passo de administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de, pelo menos, uma proteína, pelo menos, um seu fragmento antigénico ou uma composição imunogénica do invento, preferencialmente sob a forma de uma vacina; e (c) um método para o tratamento ou a profilaxia da otite média num indivíduo, que compreende o passo de administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de, pelo menos, uma proteína, pelo menos, um seu fragmento antigénico ou uma composição imunogénica do invento, preferencialmente sob a forma de uma vacina.
Um método adequado para a produção da proteína antigénica aqui descrita (ou na verdade de seus fragmentos) é através da utilização de técnicas de ADN recombinante. O presente invento será agora descrito com referência aos exemplos seguintes, que não são construídos para limitar de nenhum modo o invento. Os exemplos referem-se às figuras, em que: FIGURA 1: mostra uma representação de um diagrama de fluxos para o isolamento das proteínas de 30 kDa e 71 kDa aqui descritas; 12
ΕΡ 1 077 999 /PT FIGURA 2: mostra uma representação de um diagrama de fluxos para o isolamento das proteínas de 14 kDa, 14,5 kDa e 15 kDa aqui descritas; FIGURA 3: mostra um gel de SDS-PAGE mostrando proteínas purificadas a seguir a coloração com prata; e FIGURA 4: mostra os resultados da taxa de depuração para ratinhos infectados com B. catarrhalis com ou sem imunização com os antigénios do invento. EXEMPLO 1: Purificação de proteínas (i) 30 kDa e 71 kDa
Inocularam-se 20 ml de caldo de infusão de cérebro e coração com 4-5 colónias de B. catarrhalis da estirpe K65 (um isolado clínico de esputo recolhido no Sir Charles Gardiner Hospital, Perth, Austrália; a estirpe K65 produz uma β-lactamase) e incubou-se durante a noite a 37°C num incubador com agitação. Adicionaram-se 2 ml da cultura a cada balão de 4x 500 ml de caldo BHI e incubou-se durante a noite a 37°C num incubador com agitação. Sedimentaram-se as bactérias e lavaram-se três vezes com PBS a 10 000 rpm durante 15 min a 4°C numa centrífuga Beckman JA-2 utilizando um rotor JA-14. As proteínas foram extractadas utilizando um método de extracção de Zwittergent e precipitação com etanol, com a excepção de que não houve ajuste do pH após a adição do acetato de sódio/p-mercaptoetanol. O produto final foi dialisado contra água destilada originando 40 ml a 15,35 mg/ml, um total de 614 mg de proteína. As preparações foram criodessecadas. O extracto de proteína foi ressuspenso até aproximadamente 60 mg/ml num Tampão A (tris-HCl 25 mM, pH 8,1) antes de ser carregado para uma coluna de permuta iónica BioRad Q2. Alíquotas de 1 ml foram carregadas para cada experiência. A coluna foi lavada com Tampão A durante 5 min a 1 ml/min. As proteínas foram eluídas utilizando uma combinação de gradientes contínuos e em passos de 100% de Tampão A a 100% de
Tampão B (Tris-HCl 25 mM + NaCl 0,5M, pH 8,1) ao longo de 5- 10 min. O gradiente foi seguido por uma lavagem de 4 min com 100% de Tampão B seguida de uma lavagem de 1 min com 100% de 13
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Tampão A. As fracções 2, 3 e 4 foram reunidas, dessalinizadas numa coluna PD-10 para mudar para um tampão Tris diluído e depois criodessecadas. O volume foi ajustado para 600 μΐ com água destilada, misturou-se com 2,4 ml de tampão de redução (Tris 62,5 mM, pH 6,8, glicerol a 10% v/v, SDS a 2% p/v, β-mercaptoetanol a 5% v/v, azul de bromofenol a 1,2 x 10~3% p/v) e incubou-se a 37°C durante 30 min. Realizou-se uma SDS-PAGE preparativa para purificar as proteínas, utilizando o equipamento Prep Cell Modelo 491 da Bio-Rad utilizando 40 ml de um gel de separação de 9% de T-l, 42% C acrilamida/BIS (Ν,Ν'-metilenobis-acrilamida) com 10 ml de um gel de sobreposição polimerizado de 4% de t-0,36% C acrilamida/BIS numa coluna de 37 mm
(diâmetro interno [d.i.]). As fracções foram eluídas da coluna com Tris-HCl 0,025 M, foram concentradas por liofilização e analisou-se o teor de proteínas por SDS-PAGE analítico. A proteína de 71 kDa estava nas fracções 57-80. Estas foram reunidas, criodessecadas e reconstituídas em 2,5 ml de água destilada. A preparação foi dessalinizada por permuta do tampão utilizando PBS diluído e reconcentrou-se de modo a que a concentração do PBS de tamponamento da proteína fosse isotónica. A partir desta mesma experiência preparativa com células, as fracções 26-34, contendo proteínas de 55-65 kDa, e as fracções 4-17, contendo proteínas de 20-35 kDa, foram também reunidas. As fracções 4-17 foram adicionalmente purificadas utilizando um gel de separação 145 T-l,42% C acrilamida/BIS com um gel de sobreposição de 4% de t-0,36% C acrilamida/BIS (ver figura 1 do diagrama de fluxos). As fracções foram avaliadas quanto ao teor de proteínas, tal como descrito atrás, as gamas de fracções adequadas foram reunidas e as proteínas purificadas foram dessalinizadas e concentradas. (ii) Purificação de outras proteínas
Inocularam-se 20 ml de um caldo de infusão de cérebro e coração com 4-5 colónias de B. catarrhalis da estirpe K65 e incubou-se durante a noite a 37°C num incubador com agitação. Adicionaram-se 2 ml da cultura a cada balão de 4x 500 ml de caldo BHI e incubou-se durante a noite a 37°C num incubador 14
ΕΡ 1 077 999 /PT com agitação. Sedimentaram-se as bactérias e lavaram-se três vezes com PBS a 10 000 rpm durante 15 min a 4°C numa centrífuga Beckman JA-2 utilizando um rotor JA-14. As proteínas foram extractadas utilizando um método de extracção de Zwittergent e precipitação com etanol, com o pH de acetato de sódio/β-mercaptoetanol ajustado para pH 4. O extracto de proteína foi ressuspenso até aproximadamente 60 mg/ml num Tampão A antes de ser carregado para uma coluna de permuta iónica BioRad Q2, utilizando o protocolo descrito acima. Os picos da coluna foram avaliados quanto ao teor de proteínas, as fracções adequadas foram reunidas e sujeitas a purificação adicional por electroforese preparativa em gel (utilizando colunas tal como indicado na figura 2 e os protocolos descritos acima). Todas as purificações de proteínas que envolveram electroforese preparativa utilizando SDS tinham este detergente removido por precipitação com fosfato de potássio.
Resultados Várias proteínas foram purificadas a partir de outros extractos de membranas de B. catarrhalis em quantidades que variam de 10 pg a 300 pg a partir de um único procedimento de extracção. A Figura 3 mostra uma análise por SDS-PAGE analítica de proteínas variando de 23 a 71 kDa.
Identificação da sequência de aminoácidos
Sequenciação N-terminal
Esta pode ser realizada de acordo com protocolos fornecidos pela Applied Biosystems. Contudo, adicionalmente, um perito na especialidade pode também realizar esta sequenciação de acordo com os métodos descritos em Matsudaira, J. Biol. Chern., 262: 10035-10038 (1997).
Sequenciação do péptido interno A sequenciação foi realizada utilizando o método da S-2-carboxamidotilação compatível com SDS-PAGE. A reacção de alquilação foi realizada na proteína numa solução de glicerol a 10% (vol/vol), SDS a 5% (p/v), TrisHCl 0,025 M, 1,4-DTT 100 mM, pH 8,3. A proteína foi reduzida inicialmente incubando 15
ΕΡ 1 077 999 /PT esta mistura a 90°C durante 15 minutos. A amostra foi então arrefecida a 37°C, adicionou-se acrilamida até uma concentração final de 2M e a mistura foi incubada sob árgon na ausência de luz, durante 30 a 60 minutos. Foi adicionado um tampão redutor de SDS, a amostra foi sujeita a SDS-PAGE, a proteína foi visualizada através de coloração com Coomassie e excisada do gel. Este procedimento foi realizado com uma proteina de 71 kDa que não pôde ser sequenciada N-terminalmente. EXEMPLO 2: Regimes de imunização A imunização intra-placas de Peyer (IPP) foi uma modificação de um método descrito para ratos (Kyd et al., Infect. Immun., 63: 2931-2940 (1995)). O inoculo de imunização foi preparado por emulsão da proteina com adjuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma, St. Louis, MI) numa razão de 1:1 para permitir dosagens que variam de 2,5 pg a 10 pg. Ratinhos BALB/c machos isentos de agentes patogénicos específicos (SPF) com idades de 6 a 8 semanas, mantidos sob condições de SPF foram anestesiados através de uma injecção subcutânea de 0,25 ml de cetamina/xilazina em PBS (5 mg/ml de cloridrato de cetamina [Troy Laboratories, Smithfield, NSW, Austrália]; 2 mg/ml de cloridrato de xilazina [Bayer, Pymble, NSW, Austrália]. O intestino delgado foi exposto através de uma incisão na linha média de 1 cm na parede abdominal e volumes de inoculo de aproximadamente 1 pl foram administrados sub-serosalmente a cada emplastro de Peyer utilizando uma agulha 26G. Os intestinos foram enxaguados com PBS estéril e a cavidade abdominal foi suturada. Os ratos imunizados com placebo foram sujeitos ao mesmo procedimento cirúrgico com injecção de uma emulsão de IFA e PBS.
Um reforço intra-traqueal (IT) foi dado no dia 14 após IPP. Os ratinhos foram sedados através de anestesia com Saffan intravenoso (0,15 ml; 20 mg de alfadona em PBS/kg de peso corporal; Pitman-Moore, Nth Ryde, NSW, Austrália). Um volume de 20 pl de proteína em PBS (a mesma quantidade que foi administrada IPP) foi administrado nos pulmões através de um cateter 22,5G (Terumo, Tóquio, Japão) inserido oralmente na traqueia. O inoculo foi disperso com dois volumes de 0,3 ml de ar. 16
ΕΡ 1 077 999 /PT
Provocação bacteriana
Cresceu-se B. catarrhalis durante a noite em placas de ágar de infusão de cérebro e coração (BHI) suplementado com 50 ml por litro de sangue de cavalo desfibrinado (Amadeus International, Brooklyn, Vic, Austrália). As placas foram incubadas durante a noite a 37°C em 5% de C02, as bactérias foram recolhidas e lavadas três vezes em PBS. A concentração foi estimada medindo a densidade óptica a 405 nm e foi confirmada por contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) do plaqueamento durante a noite de diluições em série do inoculo. Os ratinhos foram sedados com Saffan administrado intravenosamente. Um bolus de inoculo de 20 μΐ de B. catarrhalis vivo em PBS foi introduzido nos pulmões, tal como descrito para os reforços IT. Os ratinhos foram mortos através de uma injecção intra-peritoneal de pentobarbital de sódio 4 horas após a infecção ou como indicado. O sangue foi obtido por punctura do coração e deixado a coagular para recolha de soro. A traqueia foi exposta através do pescoço e obteve-se lavagem broncoalveolar (BAL) instilando e recuperando 0,5 ml de PBS nos pulmões através de cânula. Após obtenção da BAL os pulmões intactos foram excisados, colocados num volume de 2 ml de PBS e homogeneizados num homogeneizador de tecidos (9500 rpm; Heidolph DIAX 600, Electro GmbH & Co, Kelheim, Alemanha). A BAL e o homogenato de pulmão foram avaliados relativamente à depuração de bactérias por plaqueamento de diluições em série para a determinação de CFU. O soro foi separado por centrifugação a 4°C e 450 x g durante 10 min (Juoan BR3.11, St. Nazaire, França) e armazenado a -80°C.
Resultados
Os ratinhos foram imunizados IPP e receberam reforços IT com proteína purificada. Os dados mostrados na figura 4 mostram a percentagem de depuração aumentada de bactérias quer na lavagem broncoalveolar (BAL) quer no tecido do pulmão, em comparação com a recolha de bactérias não imunizadas.
Uma proteína com uma massa molecular aparente de 71 kDa foi muito eficaz no aumento da depuração na BAL, mas a resposta imunológica a esta proteína foi menos eficaz na depuração no tecido de pulmão. 17
ΕΡ 1 077 999 /PT A resposta imunológica após imunização com uma proteína com uma massa molecular aparente de 44 kDa foi eficaz na depuração de bactérias quer em bal quer no tecido de pulmão. A imunização com proteínas de 15 e 30 kDa mostrou mais do que 50% de aumento da depuração quer em BAL quer no pulmão, enquanto que uma proteína de 14,5 kDa que apresentava isto para depuração na BAL, não conseguiu a mesma protecção no pulmão. Uma proteína de 14 kDa não foi eficaz na depuração de bactérias na BAL mas foi capaz de aumentar ligeiramente a depuração no pulmão.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Cortecs (UK) Limited Allan W Cripps Jennelle Kyd <120> Proteínas
<130> PWC/P2069SWO <140> PCT/GB99/01473 <141> 1999-05-11 <150> GB 9810084.5 <151> 1998-05-11 <160> 9 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis <400> 1
Ala Ile Ser Tyr Gly Asn Ser Ala Asp Ala Gin Pro Tyr Vai Gly Ala 1 S io is
Lys Ile Gly Gin Vai Asp Ala Lyg Gin Ile Asn Asn Lys Asn Thr 20 25 30
<210> 2 <211> 31 < 212 > PRT <213> Branhamella catarrhalis 18 ΕΡ 1 077 999 /PT <400> 2
Asn Vai Vai Thr Asn Thr Gly Ala Thr Vai Vai Asp Gly Thr Arg Thr 15 10 15
Ile Phe Ser Thr Leu Vai Lys Pro Ala Ala Vai Vai Ala Ala Vai 20 25 30 < 210 > 3 <211> 21 < 212 > PRT Λ co t—1 CM V Branhamella catarrhalís < 2 2 0 > < 2 21 > LOCAL < 2 2 2 > (19) < 2 2 3 > Xaa é qualquer aminoácido < 4 0 0 > 3
Thr Pro Thr Vai Tyr Gly Lys Ala Phe Leu Thr He Asp Ala Asn Asn 15 10 15
Thr Asp Xaa Thr Tyr 20 <210> 4 <211> 20
< 212 > PRT <213> Branhamella catarrhalís < 4 0 0 > 4
Ala Gly Leu Asp Arg Ser Gly Gin Asp Vai Thr Ala Ser Leu Gin Asp 15 10 15
Gly Thr Tyr Ala 20
<210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalís < 4 0 0 > 5
Gly Glu Leu ser Ser Asn Leu Gin Asp Arg His Lys 15 10
<210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalís 19
ΕΡ 1 077 999 /PT < 4 0 0 > 6
Ala Asp lie His Gly Asn Arg Phe Arg Gly Ser Ala Ala Ile Ala Ser 15 10 is
<210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis < 4 0 0 > 7
Asn Phe Glu Tyr Leu Lya 1 5-
<210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis <400> 8
Phe Gly Glu Leu Ser Vai Gly Asp Ser His Ser Vai Phe Leu Gin 15 10 15
<210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Branhamella catarrhalis < 4 0 0 > 9
Asp Ala Asp Vai Thr Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Thr Glu Met 15 10 15
Gly Gly
Lisboa
Claims (21)
- ΕΡ 1 077 999 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína que é um antigénio de B. catarrhalis e que tem uma massa molecular aparente de cerca de 30 kDa, tal como determinado por SDS-PAGE e possuindo a seguinte sequência N-terminal: NWTNTGATWDGTRTIFSTLVKPAAWAAV;
- 2. Fragmento antigénico de uma proteína tal como definida na reivindicação 1.
- 3. Molécula de ácido nucleico compreendendo, ou consistindo em, uma sequência que é: (i) uma sequência de ADN que codifica para uma proteína tal como definida na reivindicação 1 ou seus equivalentes de ARN; (ii) uma sequência que é complementar a qualquer uma das sequências de (i) (iii) uma sequência que tem, pelo menos, 75% ou, pelo menos, 90% de identidade com qualquer de (i) e (ii); (iv) uma sequência que codifica para um fragmento antigénico definido na reivindicação 2.
- 4. Vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico tal como definida na reivindicação 3.
- 5. Célula hospedeira transformada ou transfectada com um vector tal como definido na reivindicação 4.
- 6. Método para a produção de uma proteína antigénica compreendendo a expressão de uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 3 pela célula hospedeira da reivindicação 5.
- 7. Composição imunogénica compreendendo a proteína tal como definida na reivindicação 1 ou um ou mais fragmentos antigénicos, tal como definidos na reivindicação 2.
- 8. Composição imunogénica tal como reivindicada na reivindicação 7 que é uma vacina. ΕΡ 1 077 999 /PT 2/3
- 9. Utilização de uma proteína tal como definida na reivindicação 1 ou um ou mais fragmentos antigénicos, tal como definidos na reivindicação 2, na preparação de uma composição imunogénica.
- 10. Utilização tal como reivindicada na reivindicação 9, em que a composição imunogénica é uma composição de vacina para a profilaxia ou o tratamento de infecções respiratórias.
- 11. Utilização tal como reivindicada na reivindicação 9, em que a composição imunogénica é uma vacina para a profilaxia ou o tratamento da otite média.
- 12. Composição de antigénio compreendendo uma proteína, tal como definida na reivindicação 1 e/ou um ou mais fragmentos antigénicos, tal como definidos na reivindicação 2, opcionalmente em conjunto com, pelo menos, outro antigénio de B. catarrhalis, ou um seu fragmento antigénico.
- 13. Anticorpo criado contra uma proteína tal como definida na reivindicação 1 ou um seu fragmento antigénico tal como definido na reivindicação 2.
- 14. Método para detectar e/ou diagnosticar B. catarrhalis, que compreende: a) a colocação em contacto de um ou mais anticorpos, tal como definidos na reivindicação 13, com uma amostra a testar; e b) detecção da presença de um ou mais antigénios, tal como definidos na reivindicação 1.
- 15. Método para detectar e/ou diagnosticar B. catarrhalis, que compreende: a) a colocação em contacto de uma ou mais proteínas antigénicas, tal como definidas na reivindicação 1, um ou mais seus fragmentos antigénicos, tal como definidos na reivindicação 2, ou uma composição de antigénio, tal como definida na reivindicação 12, com uma amostra a testar; e b) detecção da presença de anticorpos contra B. catarrhalis.
- 16. Utilização de uma proteína tal como definida na reivindicação 1, um fragmento antigénico, tal como definido na ΕΡ 1 077 999 /PT 3/3 reivindicação 2, ou uma composição de antigénio, tal como definida na reivindicação 12, na detecção/diagnóstico de B. catarrhalis in vitro.
- 17. Kit para utilização na detecção/diagnóstico de B. catarrhalis compreendendo, pelo menos, uma proteína antigénica, tal como definida na reivindicação 1, pelo menos, um fragmento antigénico, tal como definido na reivindicação 2, uma composição de antigénio, tal como definida na reivindicação 12 ou um anticorpo, tal como definido na reivindicação 13.
- 18. Proteína tal como definida na reivindicação 1, fragmento antigénico, tal como definido na reivindicação 2, ou composição imunogénica, tal como definida na reivindicação 7, para utilização em medicina.
- 19. Utilização de uma proteína tal como definida na reivindicação 1, um fragmento antigénico, tal como definido na reivindicação 2, ou uma composição imunogénica, tal como definida na reivindicação 7, no fabrico de um medicamento para utilização na indução de uma resposta imunológica num indivíduo contra B. catarrhalis.
- 20. Utilização de uma proteína tal como definida na reivindicação 1, um fragmento antigénico, tal como definido na reivindicação 2, ou uma composição imunogénica, tal como definida na reivindicação 7, no fabrico de um medicamento para utilização na profilaxia de infecções respiratórias.
- 21. Utilização de uma proteína tal como definida na reivindicação 1, um fragmento antigénico, tal como definido na reivindicação 2, ou uma composição imunogénica, tal como definida na reivindicação 7, no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento ou na profilaxia da otite média. Lisboa,
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