PT728200E

PT728200E - Genes de receptores de transferrina de haemophilus

Info

Publication number: PT728200E
Application number: PT95900031T
Authority: PT
Inventors: Sheena Loosmore; Michel Klein; Yan-Ping Yang; Robin Harkness; Anthony Schryvers; Pele Chong; Scott Gray-Owen; Andrew Murdin
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 2006-12-29
Also published as: EP0728200A1; AU8102094A; CA2175332A1; RU2194757C2; WO1995013370A1; CN1267553C; CN1141060A; DE69434839D1; US5922323A; EP0728200B1; US5922841A; CN1990503A; AU705998B2; ATE338113T1; BR9408006A; US5922562A; US6008326A; US6262016B1; US5708149A; NZ275772A

Description

ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Genes de receptores de transferrina de Haemophilus"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a péptidos contendo uma sequência de aminoácidos conservada de uma proteína receptora da transferrina e a composições imunogénicas e anti-soros ou anticorpos deles derivados.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As estirpes de Haemophilus influenzae tipo b encapsuladas são a principal causa da meningite bacteriana e outras infecções invasivas em crianças pequenas. Contudo, as H. influenzae não encapsuladas ou não tipificáveis (NTHi) são responsáveis por uma ampla gama de doenças humanas incluindo otite média, epiglotite, pneumonia e traqueobronquite. As vacinas baseadas no polissacárido capsular de H. influenzae tipo b conjugado com o toxóide da difteria (Berkowitz et al., 1987. Ao longo deste pedido são referidas várias referências entre parêntesis para descrever mais completamente o estado da arte à qual pertence a presente invenção. A informação bibliográfica completa para cada citação encontra-se no final da descrição, imediatamente antes das reivindicações. O toxóide do tétano (Classon et ai., 1989 e Patente US 4 496 538), ou a proteína da membrana externa de Neisseria meningitidis (Black et al., 1991) têm sido eficazes na redução da meningite induzida por H. influenzae tipo b, mas não na doença induzida por NTHi (Bluestone, 1982). A otite média é a doença mais comum no início da infância com 60-70% de todas as crianças com menos de 2 anos de idade sofrendo entre uma e três infecções nos ouvidos. A otite média crónica é responsável por deficiências auditivas, da fala e cognitivas nas crianças. As infecções por H. influenzae são responsáveis por cerca de 30% dos casos de otite média aguda e cerca de 60% de otite média crónica. Só nos Estados Unidos, o tratamento da otite média custa entre 1 e 2 biliões de dólares por ano para antibióticos e procedimentos cirúrgicos tais como tonsilectomias, adenoidectomias e inserção de tubos de timpanostomia. Adicionalmente, muitos dos organismos 2 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ causadores de otite média estão a tornar-se resistentes ao tratamento com antibióticos. Uma vacina profiláctica eficaz contra a otite média é portanto desejável. As estirpes não tipificáveis de H. influenzae são também importantes patogénios responsáveis por pneumonia nos indivíduos mais idosos e noutros indivíduos que são particularmente susceptíveis a infecções respiratórias. Existe assim uma necessidade de antigénios de H. influenzae que sejam úteis como componentes em preparações imunogénicas que proporcionem protecção contra os muitos serótipos de H. influenzae. O ferro é um nutriente essencial para o crescimento de muitas bactérias. Vários patogénios humanos, tais como H. influenzae, Branhamella catarrhalis, N. meningitidis, N. gonorrhoeae e estirpes comensais de Neisseria não patogénicas, podem utilizar transferrina humana como fonte de ferro (Schryvers, 1988; Schryvers e Lee, 1989; Mickelsen e Sparling, 1981) . O receptor de transferrina bacteriano (TfR) é composto por duas cadeias, Tbpl e Tbp2. Em estirpes de H. influenzae, o peso molecular da Tbpl é de aproximadamente 100 000, enquanto o peso molecular da Tbp2 é variável, variando de 60 000 a 90 000, dependendo da estirpe (Schryvers e Gray-Owen, 1992; Holland et al., 1992). Pensa-se que a expressão do receptor de transferrina de H. influenzae ê regulada por ferro e/ou hemina (Morton et al., 1993) e o local de ligação fur putativo (Braun e Hantke, 1991) foi identificado a montante de tbp2. Esta sequência encontra-se na região promotora de genes que são regulados negativamente pelo ferro, incluindo o TfR de N. meningitidis (Legrain et al., 1993) . O promotor é seguido pelos genes tbp2 e tbpl, um arranjo encontrado noutros operões de TfR bacterianos (Legrain et al., 1993; Wilton et al., 1993). Anticorpos que bloqueiam o acesso do receptor de transferrina à sua fonte de ferro podem impedir o crescimento bacteriano. Em adição, anticorpos contra TfR que são opsonizantes ou bactericidas podem também proporcionar protecção através de mecanismos alternativos. Assim, o receptor de transferrina, seus fragmentos, suas cadeias constituintes, ou péptidos seus derivados, são candidatos a vacinas para proteger contra a doença de H. influenzae. Ratinhos imunizados com proteínas TfR de N. meningitidis em adjuvante de Freund foram protegidos da provocação homóloga e os anti-soros anti-TfR eram bactericidas 3 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ e protectores num ensaio de transferência passiva (Danve et al., 1993). Porcos imunizados com Tbp2 de A. pleuropneumoniae recombinante foram protegidos contra a provocação homóloga mas não contra a provocação heteróloga (Rossi-Campos et al., 1992). Estes resultados indicam a eficácia de vacinas baseadas em TfR na protecção contra a doença. Seria desejável proporcionar a sequência da molécula de ADN que codifica o receptor de transferrina e péptidos correspondentes a porções do receptor de transferrina e vectores contendo estas sequências, para o diagnóstico, a imunização e a produção de reagentes de diagnóstico e imunológicos. O poliovirus é um enterovírus, um género da família Picornaviridae. Existem três serótipos distintos do vírus, e múltiplas estirpes em cada serótipo. As estirpes virulentas são agentes causadores de poliomielite paralítica. As estirpes atenuadas, que possuem um reduzido potencial para causar a doença paralítica, e as estirpes virulentas inactivadas, são utilizadas como vacinas. A infecção com o vírus induz imunidade mucosa, protectora, duradoura. A inoculação com vacinas de poliovirus inactivado podem também induzir uma resposta imunitária mucosa. A estrutura do poliovirus é conhecida, e é altamente conservada entre estirpes e serótipos. As estruturas de vários outros picornavirus (vírus pertencentes a géneros da família Picornaviridae) foi também determinada e foi mostrado que se relacionava estreitamente com a estrutura do poliovirus. É possível expressar epítopos estranhos sobre a cápside ou os poliovirus (Murdin et al., 1992) e este trabalho foi estendido a outros picornavirus. Os epítopos que foram expressos são usualmente curtos, bem definidos, epítopos contíguos, e a maioria foram expressos no interior do local I antigénico de neutralização (NAgI) de poliovirus ou no local equivalente noutros picornavirus. Este local inclui as cadeias B e C beta de ligação em ansa (a ansa BC) da proteína da cápside de poliovirus VPl. A ansa BC de VP1 é uma ansa exposta na superfície de nove aminoácidos que pode ser substituída e alongada com pelo menos vinte cinco aminoácidos heterólogos (Murdin et al., 1991). Os poliovirus híbridos ou quiméricos que expressam epítopos de receptores de transferrina, que crescem até um título elevado e são imunogénicos, seriam úteis 4 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ como vacinas e como ferramentas para a produção de reagentes imunológicos.

Gray-Owen, S.D. et al. (1993), Microbial Pathogenesis, Vol. 14, páginas 389-398 descrevem anticorpos monoclonais específicos para a transferrina humana.

Stevenson, P. et al. (1992) Infection & Immunity Vol. 60, N°.6, páginas 2391-2396, descrevem um anti-soro contra TBP-2 purificado a partir de uma estirpe de N. meningitidis que reage cruzadamente com todos os isolados meningocócicos examinados e com TBP-2 de várias estirpes de H. influenzae, tipo b.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona péptidos possuindo não menos de sete aminoácidos e não mais de 150 aminoácidos e contendo uma sequência de aminoácidos que é conservada entre bactérias que produzem uma proteína receptora da transferrina compreendendo TBP-2, sendo essa sequência TBP-2 conservada: LEGGFYG (SEQ ID NO: 85) e contendo uma sequência de aminoácidos que é: LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74). O péptido pode incluir uma sequência de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 95 e SEQ ID NO: 74.

De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionada uma composição imunogénica que compreende um tal péptido como componente activo. A composição pode compreender pelo menos um péptido sintético, como aqui proporcionado, e um seu transportador farmaceuticamente aceitável. O pelo menos um componente activo produz uma resposta imunitária quando administrado a um hospedeiro.

As composições imunogénicas aqui proporcionadas podem ser formuladas na forma de uma vacina para administração in vivo para proteger contra doenças causadas por patogénios bacterianos que produzem receptores de transferrina. Para este fim, as composições podem ser formuladas na forma de uma preparação de micropartícuias, cápsulas ou lipossomas. 5 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Alternativamente, as composições podem ser proporcionadas em combinação com uma molécula de direccionamento para entrega a células específicas do sistema imunitário ou a superfícies mucosas. A composição imunogénica pode compreender uma pluralidade de componentes activos para proporcionar protecção contra uma doença causada por uma pluralidade de espécies de bactérias produtoras de receptores de transferrina. As composições imunogénicas podem ainda compreender um adjuvante.

As composições podem ser utilizadas num método para induzir protecção contra a infecção ou doença causadas por Haemophilus ou outras bactérias que produzem proteína receptora da transferrina, compreendendo o passo de administração a um hospedeiro susceptível, tal como um ser humano, de uma quantidade eficaz da composição imunogénica como atrás descrita.

De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado um anti-soro ou um anticorpo específicos para qualquer uma das sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 74 ou SEQ ID NO: 50.

Pode ser proporcionado um vector vivo para entrega do receptor de transferrina a um hospedeiro, compreendendo um vector contendo a molécula de ácido nucleico como descrita atrás. O vector pode ser seleccionado entre Salmonella, BCG, adenovírus, poxvírus, vaccinia e poliovírus. O vector pode ser especificamente um poliovírus e a molécula de ácido nucleico pode codificar para um fragmento de receptor de transferrina possuindo uma sequência de aminoácidos de LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74) ou LEGGFYG (SEQ ID NO: 85) . Descrevemos aqui os vectores pT7TBP2A, PT7TBP2B, pT7TBP2C e PT7TBP2D (designações ATCC Nos. 75931, 75932, 75933, 75934).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A presente invenção será mais compreendida a partir da seguinte descrição com referência aos desenhos, nos quais: A Figura IA mostra o mapa de restrição de dois clones plasmídicos (pBHTl e pBHT2) do operão do receptor de transferrina de Haemophilus influenzae tipo b, estirpe DL63. 6 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ A Figura 1Β mostra ο mapa de restrição dos clones S-4368-3-3 e JP-901-5-3 contendo genes de TfR de H. influenzae tipo b, estirpe Eagan. A Figura 1C mostra o mapa de restrição dos clones DS-712-1-3 contendo o gene do receptor de transferrina de H. influenzae tipo b, estirpe MinnA. A Figura 1D mostra o mapa de restrição do clone JB-1042-7-6 contendo o gene do receptor de transferrina de H. influenzae não tipificável, estirpe PAK 12085. A Figura 2 ilustra a organização e os mapas de restrição dos genes de Tbpl e Tbp2 clonados de estirpes identificadas e a organização genética do operão de TfR com dois genes (tbpl e tbp2) em tandem formando um operão sob a regulação da transcrição de um único promotor e representa também o fragmento de ADN de 3,0 kb de pBHIT2 usado para sondar bibliotecas quanto a genes de TfR das estirpes de Haemophilus. A Figura 3 mostra as sequências de nucleótidos dos genes de receptores de transferrina (SEQ ID NO: 1) e suas sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 5 - Tbpl e SEQ ID NO: 6 - Tbp2) de H. influenzae tipo b, estirpe DL63. As sequências de aminoácidos sublinhadas correspondem a péptidos de Tbpl identificados por sequenciação de aminoácidos. As sequências de sinal putativas estão indicadas por sublinhado duplo e correspondem aos residuos 1 a 17 para Tbpl e 1 a 25 para Tbp2. A Figura 4 mostra as sequências de nucleótidos dos genes de receptores de transferrina (SEQ ID NO: 2) e suas sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 7 - Tbpl e SEQ ID NO: 8 -Tbp2) de H. influenzae tipo b, estirpe Eagan. As sequências putativas -35, -10 e do local de ligação ao ribossoma estão sobrelinhadas. A Figura 5 mostra as sequências de nucleótidos dos genes de receptores de transferrina (SEQ ID NO: 3) e suas sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 9 - Tbpl e SEQ ID NO: 10 - Tbp2) de H. influenzae tipo b, estirpe MinnA. As sequências 7 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ putativas -35, -10 e do local de ligação ao ribossoma estão sobrelinhadas. A Figura 6 mostra as seguências de nucleótidos dos genes de receptores de transferrina (SEQ ID NO:: 4) e suas seguências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 11 - Tbpl e SEQ ID NO: 12 - Tbp2) de H. influenzae não tipificável, estirpe PAK 12085. As sequências putativas -35, -10 e do local de ligação ao ribossoma estão sobrelinhadas. A Figura 7 mostra as seguências de nucleótidos dos genes de receptores de transferrina (SEQ ID NO: 105) e suas sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 106 -Tbpl e SEQ ID NO: 107 - Tbp2) da estirpe de H. influenzae não tipificável SB33. A Figura 8 mostra a sequência de nucleótidos do gene de Tbp2 (SEQ ID NO: 108) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 109 - Tbp2) da estirpe não tipificável de H. influenzae, estirpe SB12. A Figura 9 mostra a sequência de nucleótidos do gene de Tbp2 (SEQ ID NO: 110) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 111 - Tbp2) da estirpe não tipificável de H. influenzae, estirpe SB29. A Figura 10 mostra a sequência de nucleótidos do gene de Tbp2 (SEQ ID NO: 112) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 113 - Tbp2) da estirpe não tipificável de H. influenzae, estirpe SB30. A Figura 11 mostra a sequência de nucleótidos do gene de Tbp2 (SEQ ID NO: 114) e a sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID NO: 115 - Tbp2) da estirpe não tipificável de H. influenzae, estirpe SB32. A Figura 12Ά mostra as sequências de nucleótidos das regiões promotoras e extremidade 5' dos genes tbp2 de H. influenzae, das estirpes Eagan (SEQ ID NO: 116), MinnA (SEQ ID NO: 117), PAK 12085 (SEQ ID NO: 118) e SB33 (SEQ ID NO: 119). O iniciador da cadeia de codificação utilizado para 8 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ amplificar os genes tbp2 por PCR está sublinhado (SEQ ID NO: 120) . A Figura 12B mostra a sequência de nucleótidos da região intergénica e da extremidade 5' dos genes tbpl de H. influenzae, das estirpes Eagan (SEQ ID NO: 121), MinnA (SEQ ID NO: 122), DL63 (SEQ ID NO: 123), PAK 12085 (SEQ ID NO: 124), SB12 (SEQ ID NO: 125), SB29 (SEQ ID NO: 126), SB30 (SEQ ID NO: 127), e SB32 (SEQ ID NO: 128). O iniciador da cadeia não codificante utilizado para amplificar os genes tbp2 por PCR está sublinhado (SEQ ID NO: 129). A Figura 13 mostra a análise em gel de agarose de genes tbp2 amplificados por PCR das estirpes não tipificáveis de H. influenzae, SB12, SB29, SB30, SB32 e SB33. A pista 1 é SB33, a pista 2 é SB12, a pista 3 é SB29, a pista 4 é SB30, a pista 5 é SB32. A Figura 14 mostra uma comparação das sequências de aminoácidos de Tbpl de H. influenzae, estirpes Eagan, DL63, PAK 12085 e SB33 (SEQ ID NOS: 7, 5, 11 e 106), de N. meningitidis, estirpes B16B6 e M982 (SEQ ID NOS: 94 e 95), e de N. gonorrhoeae, estirpe FA19 (SEQ ID NO: 96). A Figura 15 mostra uma comparação da sequência de aminoácidos de Tbp2 de H. influenzae, estirpes Eagan, DL63, PAK 12085, SB12, SB29, SB30 e SB32 (SEQ ID NOS: 8, 6, 12, 109, 110, 112, 114), de N. meningitidis, estirpes B16B6 e M982 (SEQ ID NOS: 97 e 98), de N. gonorrhoeae, estirpe FA19, e de Actinobacillus pleuropneumoniae, estirpes AP205 e AP37 (SEQ ID NOS: 99 e 100). A Figura 16A mostra a estrutura secundária prevista da proteína Tbpl de H. influenzae e a Figura 16B mostra a estrutura secundária prevista da proteína Tbp2 de H. influenzae. A Figura 17 mostra o esquema de construção do plasmídeo JB-1468-29 que expressa Tbpl de H. influenzae tipo b Eagan a partir de E. coli. 9 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ A Figura 18 mostra ο esquema de construção do plasmídeo JB-1424-2-8 que expressa Tbp2 de H. influenzae tipo b Eagan a partir de E. coli. A Figura 19 mostra os pares de oligonucleótidos (SEQ ID NOS: 130, 131) utilizados para construir o plasmideo JB-1424-2-8 . A Figura 20 mostra a sequência dos pares de oligonucleótidos A (SEQ ID NOS: 86, 87), B (SEQ ID NOS: 88, 89), C (SEQ ID NOS: 90, 91) e D (SEQ ID NOS: 92, 93) para a construção de plasmídeos de expressão de Tbpl e Tbp2. A Figura 21 mostra o esquema de construção do plasmídeo JB-1600-1 que expressa Tbp2 de H. influenzae, estirpe SB12, a partir de E. coli. A Figura 22 mostra géis de SDS-PAGE de produtos da expressão da proteína Tbpl de Haemophilus tipo b Eagan, proteína Tbp2 de Eagan, e proteína Tbp2 de H. influenzaea não tipificável SB12, a partir de E. coli. Na pista 1, JB-1476-2-1 (T7/Tbpl de Eagan) a t0; na pista 2, JB-1476-2-1 a t=4h de indução; na pista 3, marcadores de peso molecular de 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa e 31 kDa; na pista 4, JB-1437-4-1 (T7/Tbp2 de Eagan) a t0; na pista 5, JB-1437-4-1 a t=4h de indução; na pista 6, JB-1607-1-1 (T7/Tbp2 de SB12) a t0; na pista 7, JB-1607-1-1 a t=4h de indução. A Figura 23 mostra um esquema de purificação para Tbpl e Tbp2 recombinantes expressas a partir de E. coli. A Figura 24 mostra uma análise da pureza de Tbpl e Tbp2 recombinantes purificadas através do esquema da Figura 23. A pista 1 contém marcadores de peso molecular (106, 80, 49, 5, 32,5, 27,5 e 18,5 kDa), a pista 2 é lisado de células inteiras de E. coli. A pista 3 é corpos de inclusão solubilizados. A pista 4 é Tbpl ou Tbp2 purificadas. A Figura 25 mostra a imunogenicidade de rTbpl (painel superior) e rTbp2 (painel inferior) em ratinhos. 10 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ A Figura 26 mostra a reactividade de anti-soros anti-rTbpl de Eagan com várias estirpes de H. influenzae num

Western blot. Pista 1, BL21/DE3; pista 2, SB12-EDDA; pista 3, SB12 +EDDA; pista 4, SB29 - EDDA; pista 5, SB29 +EDDA; pista 6, SB33 -EDDA; pista 7, SB33 + EDDA; pista 8, Eagan -EDDA; pista 9, Eagan +EDDA; pista 10, B. catarrhalis 4223 - EDDA; pista 11, B. catarrhalis 4223 +EDDA; pista 12, N. meningitidis 608 - EDDA; pista 13, N. meningitidis 608 + EDDA; pista 14, JB-1476-2-1 induzida que expressa Tbpl de

Eagan recombinante; pista 15, marcadores de peso molecular. As bandas especificas de ~95 kDa reagiram com os anti-soros anti-Tbpl nas pistas 3, 4, 5, 7, 8 e 9, correspondentes às estirpes SB12, SB29, SB33 e Eagan de H. influenzae; as bandas de -110 kDa nas pistas 10 e 11, correspondentes à estirpe 4223 de B. catarrhalis; e as bandas de -80 kDa nas pistas 12 e 13, correspondentes a N. meningitidis 608. A Figura 27 mostra a reactividade de anti-soros anti-rTbp2 de Eagan com várias estirpes de H. influenzae num

Western blot. Pista 1, marcadores de peso molecular; pista 2, JB-1437-4-1 que expressa Tbp2 de Eagan recombinante, induzido; pista 3, SB12-EDDA; pista 4, SB12 +EDDA; pista 5, SB29 -EDDA; pista 6, SB29 +EDDA; pista 7, SB30 -EDDA; pista 8, SB30 +EDDA; pista 9, SB32 -EDDA; pista 10, SB33-EDDA; pista 11, SB33 +EDDA; pista 12, PAK -EDDA; pista 13, PAK +EDDA; pista 14,

Eagan -EDDA; pista 15, Eagan +EDDA. As bandas especificas de 60-70 kDa eram reactivas com os anti-soros anti-Tbp2 nas pistas 3, 6, 7, 8, 13, 14 e 15, i.e. estirpes SB12, SB29, SB30, PAK e Eagan. A Figura 28 mostra a construção dos plasmídeos pUHITIKFH e pUHITIKFP utilizados para produzir estirpes de H. influenzae que não produzem receptor de transferrina. A Figura 29 mostra a construção de plasmídeos que codificam poliovírus quiméricos que expressam um epítopo derivado da proteína receptora da transferrina que é conservado entre bactérias que produzem proteína receptora da transferrina. A Figura 30 é um Western blot que mostra a reactividade de anti-soros produzidos por imunização de coelhos com 11 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ quimeras de poliovírus que expressam um epítopo derivado da proteína receptora da transferrina que é conservado entre bactérias que produzem proteína receptora da transferrina. O painel A mostra um gel corado com Azul brilhante de Coomassie que mostra Tbp2 recombinante purificada da estirpe SB12 de H. influenzae expressa em E. coli (pista 1), Tbp2 purificada da estirpe 4223 de Branhamella catarrhalis (pista 2), um lisado de células inteiras da estirpe 4223 de B. catarrhalis limitada por ferro (pista 3), um lisado de células inteiras de E. coli JM109 crescida sob condições sem limitação por ferro (pista 5). O painel B mostra os resultados de um Western blot de um gel replicado utilizando um conjunto dos soros recolhidos no dia 27 de coelhos imunizados com PV1TBP2A (coelhos 40, 41 e 42). O painel C mostra os resultados para um conjunto de soros pré-sangria dos mesmos, que apresentava reactividade específica mínima.

Em algumas das Figuras anteriores, foram utilizadas as seguintes abreviaturas para designar locais particulares específicos de endonucleases de restrição: R, Eco RI; Ps, Pst I; H, Hind III; Bg, Bgl II; Nde, Nde I; Ear, Ear I; e Sau, Sau3A I.

Na Figura 28, utilizaram-se as seguintes abreviaturas para designar locais particulares específicos das endonucleases de restrição: A, Acc I; B Bam Hl; E, Eco RI; O, Xho I; H, Hind III; Ps, Pst I; V, Eco RV; X, Xba I, G, Bgl II; S, Sal I; K, Κρη I; e S*, Sac I.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO

Qualquer estirpe de Haemophilus pode ser convenientemente utilizada para proporcionar o ácido nucleico purificado e isolado que pode estar na forma de moléculas de ADN, compreendendo pelo menos uma porção do ácido nucleico que codifica para um receptor de transferrina como tipificado pelas concretizações da presente invenção. Estas estirpes estão geralmente disponíveis a partir de fontes clínicas e a partir de colecções de culturas bacterianas, tais como a American Type Culture Collection. 12 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

De acordo com um aspecto da invenção, a proteína receptora da transferrina pode ser isolada a partir de estirpes de Haemophilus pelos métodos descritos por Schryvers (1989), Ogunnaviwo e Schryvers (1992) e patente US 5 141 743. Embora sejam proporcionados os detalhes de um processo apropriado na patente US 5 141 743, segue-se um breve resumo de um tal processo. O isolamento do receptor de transferrina é conseguido através do isolamento de uma fracção membranar a partir de uma estirpe bacteriana que expressa actividade de ligação a transferrina e purificação do receptor de transferrina através de um método de afinidade envolvendo os passos sequenciais de pré-ligação de transferrina ao receptor de transferrina na fracção membranar, solubilização da membrana, imobilização da transferrina e separação do receptor de transferrina da transferrina imobilizada. Alternativamente, as proteínas receptoras podem ser isoladas através de uma modificação do método anterior em que o passo de pré-ligação é evitado e é incluída uma elevada concentração de sal no tampão de solubilização para permitir o isolamento directo com transferrina imobilizada como descrito em Ogunnariwo e Schryvers (1992).

No presente pedido, a expressão "receptor de transferrina" é utilizada para definir uma família de proteínas Tbpl e/ou Tbp2 que inclui as que possuem variações nas suas sequências de aminoácidos incluindo as que ocorrem naturalmente em várias estirpes de, por exemplo, Haemophilus. Outras fontes bacterianas de receptor de transferrina incluem, mas não se lhes limitam, espécies de Neisseria, Branhamella, Pasteurella e Actinobacillus. Algumas, senão todas, estas bactérias, contêm tanto Tbpl como Tbp2. As moléculas de ADN purificadas e isoladas compreendendo pelo menos uma porção que codifica para o receptor de transferrina da presente invenção incluem também as que codificam análogos funcionais de receptor de transferrina. No presente pedido, uma primeira proteína ou péptido é um "análogo funcional" de uma segunda proteína se a primeira proteína estiver imunologicamente relacionada com, e/ou tiver a mesma função que, a segunda proteína ou péptido. O análogo funcional pode ser, por exemplo, um fragmento da proteína ou um seu mutante de substituição, adição ou deleção. 13 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Numa concretização particular, ο receptor de transferrina foi isolado de H. influenzae tipo b, estirpe DL63, e purificado por métodos de cromatografia de afinidade, como descrito por Schryvers (1989), Ogunnariwo e Schryvers (1992) e na patente US 5 141 743. O receptor de transferrina isolado e purificado foi utilizado para gerar anti-soros anti-TfR em coelhos. O ADN cromossómico de H. influenzae tipo b, estirpe DL63, foi cortado mecanicamente, adicionaram-se ligantes EcoRI, e construiu-se uma biblioteca de expressão em λΖΑΡ. A biblioteca foi pesquisada com os anti-soros anti-TfR de coelho e obtiveram-se dois clones positivos (pBHITl e pBHIT2) que tinham mapas de restrição que se sobrepunham (Figura IA e Figura 2) . Os clones foram sequenciados e identificaram-se dois grandes quadros de leitura abertos (Figura 2) . As sequências de nucleótidos dos genes de receptores de transferrina Tbpl e Tbp2 (SEQ ID NO: 1) de H. influenzae DL63 e suas sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 5 -

Tbpl e SEQ ID NO: 6 - Tbp2) estão apresentadas na Figura 3. A análise de sequências mostrou que o operão de TfR consiste em dois genes (Tbpl e Tbp2) dispostos em tandem e transcritos a partir de um único promotor (como mostrado em particular na Figura 2 e na Figura 3) . A proteína Tbp2 tende a variar em peso molecular dependendo da espécie enquanto a proteína Tbpl tende a ter um peso molecular mais consistente com alguma variabilidade entre as várias bactérias que possuem genes de TfR. O peso molecular de Tbpl está usualmente na gama de 94 a 106 000 enquanto o peso molecular de Tbp2 varia consideravelmente de 58 a 98 000.

Realizou-se a sequenciação de aminoácidos dos terminais N e fragmentos de brometo de cianogénio de receptor de transferrina de H. influenzae DL63. O terminal N de Tbp2 foi bloqueado mas as sequências de aminoácidos foram identificadas por sequenciação de Tbpl e estão indicadas pelo sublinhado na sequência da proteína da Figura 3. Estas sequências peptídicas são Glu Thr Gin Ser Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Ile Ser Ser

Glu Vai Asp Thr (como mostrado na Figura 3, SEQ ID NO: 101) e

Leu Gin Leu Asn Leu Glu Lys Lys Ile Gin Gin Asn Trp Leu Thr

His Gin Ile Ala Phe (como mostrado na Figura 3; SEQ ID NO: 102) . A sequência de sinal de Tbpl e a sequência de sinal putativa de Tbp2 estão indicadas por sublinhado duplo na Figura 3. A sequência de sinal putativa para Tbpl é Met Thr 14 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Lys Lys Pro Tyr Phe Arg Leu Ser Ile Ile Ser Cys Leu Leu Ile

Ser Cys Tyr Vai Lys Ala (SEQ ID NO: 103). A sequência de sinal putativa para Tbp2 é Met Lys Ser Vai Pro Leu Ile Ser Gly Gly

Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ala (SEQ ID NO: 104) . A sequência de aminoácidos derivada da região N-terminal de Tbp2 indica que é uma lipoproteina.

Preparou-se o ADN cromossómico de H. influenzae tipo b, estirpe Eagan, e geraram-se bibliotecas. A primeira biblioteca foi construída a partir de ADN parcialmente digerido com Sau3A I, fraccionado por tamanhos para fragmentos de -5-10 kb, e clonado num plasmídeo à base de pUC. A segunda biblioteca foi construída a partir de fragmentos de ADN cromossómico obtidos por restrição com Eco RI, clonados em λΖΑΡ. Ambas as bibliotecas foram sondadas com um fragmento 5' do clone pBHIT como mostrado na Figura 2 e obtiveram-se os clones parciais dos genes de TfR de H. influenzae Eagan denominados S-4368-3-3 e JB-901-5-3. Assim, com referência à Figuras 1B e 2, ilustram-se, de acordo com aspectos adicionais da presente invenção, os clones plasmídicos S-4368-3-3 e JB-901-5-3 que codificam Tbpl e Tbp2 de H. influenzae tipo b, estirpe Eagan. As sequências de ADN dos genes de Tbpl e Tbp2 (SEQ ID NO: 2) de H. influenzae tipo b, estirpe Eagan, e suas sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NOS: 7 e 8) estão apresentadas na Figura 4, sendo a sequência de Tbp2 o primeiro gene no operão. Na Figura 4, as sequências putativas -35, -10 e do local de ligação ao ribossoma estão sobrelinhadas.

Preparou-se o ADN cromossómico de H. influenzae tipo b, estirpe MinnA, e o ADN foi parcialmente digerido com Sau3A I, fraccionado por tamanhos para fragmentos de 10-20 kb, e clonado no local BamHI de EMBL3. A biblioteca foi sondada com o fragmento 5' do clone pBHIT (Figura 2) e obteve-se um clone de comprimento completo que codifica TfR (DS-712-1-3). Com referência às Figuras 1C e 2, ilustra-se, de acordo com aspectos adicionais da presente invenção, o clone plasmídico DS 712-1-3 que codifica Tbpl e Tbp2 de H. influenzae tipo b, estirpe MinnA. As sequências de ADN de Tbpl e Tbp2 (SEQ ID NO: 3) e suas sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 9 -Tbpl e SEQ ID NO: 10 - Tbp2) de H. influenzae tipo b, estirpe MinnA, estão apresentadas na Figura 5 onde a sequência de Tbp2 é a primeira no operão. Na Figura 5, as sequências putativas 15 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ -35, -10 e do local de ligação ao ribossoma estão sobrelinhadas.

Preparou-se o ADN cromossómico da H. influenzae não tipificável, estirpe PAK 12085. O ADN foi parcialmente digerido com Sau3A I, fraccionado por tamanhos para fragmentos de 10-20 kb, e clonado no local BamE.1 de EMBL3. A biblioteca foi sondada com os fragmentos do clone pBHIT (Figura 2) e obteve-se um clone de comprimento completo que codifica TfR (JB-1042-7-6). O mapa de restrição do clone JB-1042-7-6 está apresentado nas Figuras 1D e 2 e as sequências de nucleótidos dos genes de Tbpl e Tbp2 (SEQ ID NO: 4) de H. influenzae PAK 12085 e suas sequências de aminoácidos deduzidas estão apresentadas na Figura 6 (SEQ ID NOS: 11, 12), com a sequência de Tbp2 primeiro. Na Figura 6, as sequências putativas -35, -10 e do local de ligação ao ribossoma estão sobrelinhadas.

Preparou-se o ADN cromossómico a partir de H. influenzae não tipificável, estirpe SB33, derivada de otite média. O ADN foi parcialmente digerido com Sau3A I, fraccionado por tamanhos para fragmentos de 10-20 kb e clonado no local BamHI de EMBL3. A biblioteca foi sondada com os fragmentos do clone pBHIT (Figura 2) e obteve-se um clone de comprimento completo que codifica TfR (JB-1031-2-9) . O mapa de restrição do clone JB-1031-2-9 está apresentado na Figura 2 e as sequências de nucleótidos dos genes de Tbpl e Tbp2 (SEQ ID NO: 4) de H. influenzae SB33 e suas sequências de aminoácidos deduzidas estão apresentadas na Figura 7 (SEQ ID NOS: 11, 12), com a sequência de Tbp2 primeiro. Verificou-se que o gene tbp2 de SB33 tinha uma deleção de uma única base que resultou num desvio de enquadramento no resíduo 126 e truncagem prematura da proteína resultante no resíduo 168.

Realizou-se a amplificação por PCR dos genes tbp2 das estirpes de NTHi derivadas de otite média SB12, SB29, SB30 e SB32 e sequenciaram-se os genes. A sequência de nucleótidos dos genes tbp2 das estirpes de H. influenzae não tipificável SB12 (SEQ ID NO: 105), SB29 (SEQ ID NO: 108), SB30 (SEQ ID NO: 110) e SB32 (SEQ ID NO: 112) estão apresentadas nas Figuras 8, 9, 10 e 11 respectivamente. 16 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Verificou-se que todos os genes tbp2 amplificados codificavam proteínas Tbp2 de comprimento completo, indicando que o gene tbp2 defectivo da estirpe SB33 era atípico.

As três estirpes de H. influenzae b tinham todas sequências intergénicas curtas idênticas de apenas 13 pb entre tbp2 e tbpl, mas as estirpes de NTHi PAK 12085 e SB33 tinham sequências intergénicas mais longas de 27 pb (Figura 12). A estirpe SB12 tinha uma sequência intergénica de 13 pb idêntica à encontrada nas estirpes de H. influenzae b enquanto as estirpes SB29, SB30 e SB32 continham sequências intergénicas mais longas (27-30 pb) como encontrado nas outras estirpes de NTHi PAK 12085 e SB33 (Figura 2B) . Todas as nove estirpes têm uma sequência nuclear em comum conservada de 13 pb entre os seus genes tbp2 e tbpl.

Foi identificada uma sequência pentapeptídica próxima do terminal amino de Tbpl de H. influenzae (Figura 12) que é similar à caixa TonB. O gene tonB de H. influenzae foi recentemente clonado e sequenciado (Jarosik et al., 1994).

As sequências de aminoácidos de Tbpl de H. influenzae das estirpes Eagan/MinnA, DL63, estirpes PAK 12085 e SB33 são comparadas na Figura 14. As proteínas Tbpl de Eagan e MinnA são idênticas e têm 912 aminoácidos de comprimento, a de DL63 tem 914 resíduos, a de PAK 12085 tem 914 resíduos, e a de SB33 tem 911 resíduos. As proteínas Tbpl de H. influenzae são altamente conservadas com 95-100% de identidade de sequências. As sequências de aminoácidos de Tbp2 de H. influenzae, estirpes Eagan/MinnA, DL63, PAK 12085 SB12, SB29, SB30 e SB32 estão comparadas na Figura 15. As proteínas Tbp2 de Eagan e MinnA são idênticas e contêm 660 aminoácidos, a de DL63 tem 644 resíduos, e a de PAK 12085 tem 654 resíduos. Há uma deleção de uma única base no gene tbp2 de SB33 que resulta num desvio de enquadramento no resíduo 126 e truncagem prematura da proteína resultante no resíduo 168. A base que falta foi confirmada por sequenciação directa de ADN cromosssómico amplificado por PCR. Com a excepção de Eagan e MinnA, em que são idênticas, as sequências da proteína Tbp2 são menos conservadas com apenas 66-70% de identidade, mas existem vários segmentos curtos de sequência conservada que podem ser 17 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ identificados na Figura 15. Verificou-se que os genes tbp2 amplificados por PCR das estirpes SB12, SB29, SB30 e SB32 codificam todos proteínas Tbp2 de comprimento completo. Havia heterogeneidade de sequência e tamanhos entre as proteínas Tbp2 deduzidas em que SB12 tinha 648 aminoácidos, SB29 tinha 631 resíduos, SB30 tinha 630 resíduos e SB32 tinha 631 resíduos.

Determinaram-se as estruturas secundárias putativas de Tbpl e Tbp2 de Eagan (Figuras 16A e 16B) . Ambas as proteínas possuem vários domínios transmembranares, com Tbpl a atravessar a membrana 20 vezes e Tbp2 atravessando-a 12 vezes. Identificaram-se três epítopos conservados expostos na região amino-terminal de Tbpl (DNEVTGLGK - SEQ ID NO: 43, EQVLN/DIRDLTRYD - SEQ ID NOS: 139 e 140, e GAINEIEYENVKAVEISK SEQ ID NO: 141) e um na região C-terminal (GI/VYNLF/LNYRYVTWE - SEQ ID NOS: 142 e 143). Apenas podem ser identificadas três pequenas regiões conservadas nas proteínas Tbp2 dos patogénios humanos: CS/LGGG (G) SFD - SEQ ID NOS: 75, 144 e 145 no terminal N, LE/SGGFY/FGP - SEQ ID NOS: 74 e 146 localizadas internamente e WFGAR/K - SEQ ID NOS: 83 e 84 no terminal C. A verificação de que a sequência de aminoácidos de Tbp2 varia entre estirpes de Haemophilus permite o agrupamento de Haemophilus em subgrupos definidos pela mesma sequência de aminoácidos de Tbp2. Esta verificação permite a selecção racional de um número mínimo de sequências de Tbpl e/ou Tbp2 ou de péptidos sintéticos representando epítopos partilhados por estes subtipos em estirpes de Haemophilus para utilização em composições imunogénicas para, por exemplo, imunização contra as doenças causadas por Haemophilus e outras bactérias que produzem receptor de transferrina com semelhanças de sequência relativamente a Tbpl e Tbp2 de espécies de Haemophilus. Assim, pode ser utilizado um número mínimo de receptor de transferrina, análogos, fragmentos e/ou péptidos, para imunizar contra muitas ou todas as estirpes de Haemophilus e outros patogénios bacterianos que produzem receptor de transferrina.

Adicionalmente, as sequências de aminoácidos do receptor de transferrina de uma gama de patogénios bacterianos 18 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ (Η. influenzae tipo b, Η. influenzae não tipificável, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae e Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae) foram comparadas como mostrado nas Figuras 14 e 15. Esta análise revelou regiões de Tbpl e Tbp2 que são conservadas entre todas estas bactérias. Algumas destas sequências conservadas estão contidas nos péptidos nas Tabelas 2 e 3. Em particular, as sequências DNEVTGLGK (SEQ ID: 43), EQVLNIRDLTRYDPGI (SEQ ID NO: 44), EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQG RGASSGYSIRGMD (SEQ ID NO: 45), GAINEIEYENVKAVEISKG (SEQ ID NO: 46) e GALAGSV (SEQ ID NO: 47) são conservadas em Tbpl (Tabela 1 e Figura 14). As sequências conservadas particulares em Tbp2 incluem LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74), CSGGGSFD (SEQ ID NO: 75), YVYSGL (SEQ ID NO: 76), CCSNLSYVKFG (SEQ ID NO: 77), FLLGHRT (SEQ ID NO: 78), EFNVOF (SEQ ID NO: 79), NAFTGTA (SEQ ID NO: 80), VNGAFYG (SEQ ID NO: 81), ELGGYF (SEQ ID NO: 82), VVFGAR (SEQ ID NO: 83) e VVFGAK (SEQ ID NO: 84) (Tabela 2 e Figura 15). A identificação de sequências conservadas no interior receptor de transferrina de uma gama de patogénios bacterianos permite a selecção de um número mínimo de antigénios possuindo sequências de aminoácidos particulares (incluindo na forma de péptidos sintéticos) para imunizar contra a doença causada por patogénios que possuem receptores de transferrina. Estas bactérias, em adição às atrás mencionadas, incluem outras espécies de Neisseria, tais como Neisseria gonorrhoeae, e Branhamella, incluindo Branhamella catarrhalis. Estas sequências de aminoácidos conservadas entre muitos patogénios bacterianos permitem a produção de anticorpos específicos de TfR, incluindo anticorpos monoclonais, que reconhecem a maioria, senão todos, os receptores de transferrina. Criou-se anti-soro contra péptidos correspondentes a porções conservadas do receptor de transferrina. Estes anti-soro reconheceu o receptor de transferrina em Branhamella catarrhalis. Estes anti-soros são úteis para a detecção e neutralização da maioria, senão todas, as bactérias que produzem a proteína TfR e são também úteis para a imunização passiva contra as doenças causadas por esses patogénios. Ensaios de diagnóstico e kits utilizando estas sequências de aminoácidos conservadas são úteis para detectar muitas, senão todas, as bactérias que produzem receptor de transferrina. 19 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Epítopos contendo as sequências de aminoácidos atrás mencionadas podem ser entregues a células do sistema imunitário através da utilização de péptidos sintéticos contendo estas sequências, ou através da utilização de vectores vivos que expressam estas sequências, ou através da administração directa de moléculas de ácido nucleico que codificam a sequência de aminoácidos.

Alguns péptidos contendo sequências de aminoácidos conservadas no interior das proteínas Tbpl das estirpes Eagan, MinnA, DL63 de H. influenzae tipo b e da estirpe não tipificável PAK 12085 estão apresentados na Tabela 2. Criaram-se anticorpos contra alguns destes péptidos em porquinhos-da-índia (Tabela 4). Os péptidos contendo sequências de aminoácidos conservadas no interior das proteínas Tbp2 de H. influenzae tipo b, estirpes Eagan, Minn A, DL63 e da estirpe não tipificável PAK 12085 estão apresentados na Tabela 3. Criaram-se anticorpos contra alguns destes péptidos em porquinhos-da-índia (Tabela 4).

As sequências de codificação dos genes de Tbpl e Tbp2 podem ser clonados em vectores de expressão apropriados para produzir proteínas recombinantes. As Tbpl e Tbp2 recombinantes foram expressas em E. coli utilizando o sistema de expressão de T7. O gene tbpl que codifica a proteína Tbpl de Eagan madura foi clonado em enquadramento por trás do promotor de T7 gerando o plasmídeo JB-1468-29, como mostrado na Figura 17. Quando introduzido em células BL21/DE3 e induzido com IPTG ou lactose, a proteína Tbpl de Eagan foi expressa como mostrado na Figura 22. O gene tbp2 que codifica a proteína Tbp2 madura foi clonado em enquadramento por trás do promotor de T7 gerando o plasmídeo JB-1424-2-8 como mostrado na Figura 18. Quando introduzido em células de E. coli e induzido como acima, a proteína Tbp2 foi expressa como mostrado na Figura 22. O gene tbp2 da estirpe SB12 de NTHi foi amplificado por PCR. O ADN amplificado resultante contém a sequência de sinal de Tbp2 de H. influenzae autêntica antes da proteína madura. O gene tbp2 de SB12 que codifica a sequência de sinal e a proteína madura foi clonado no sistema de expressão pT7-7 como 20 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ mostrado na Figura 21. Quando o plasmídeo resultante (JB-1600-1) foi introduzido em células de E. coli BL21/DE3 e induzido, a Tbp2 de SB12 foi expressa, como mostrado na Figura 22.

As proteínas Tbpl e Tbp2 recombinantes produzidas em E. coli na forma de corpos de inclusão foram purificadas através do esquema mostrado na Figura 23. As proteínas purificadas eram pelo menos cerca de 70% puras como mostrado na Figura 24. Realizaram-se estudos de imunogenicidade em ratinhos com as proteínas Tbpl e Tbp2 recombinantes purificadas. Ambas as proteínas eliciaram uma boa resposta imunitária em ratinhos em doses de 3-10 pg (Figura 25).

Os anti-soros criados contra Tbpl ou Tbp2 recombinantes derivadas de uma estirpe de H. influenzae são reactivos de forma cruzada com outras estirpes, o que os torna reagentes de diagnóstico potencialmente úteis (Figuras 26 e 27).

Os plasmídeos pUHITIKFH e pUHITKFP mostrados na Figura 28, contêm um marcador seleccionável de resistência a antibiótico clonado no operão do receptor de transferrina e foram construídos para inactivar por inserção o operão do receptor de transferrina. Estes plasmídeos foram utilizados para transformar Haemophilus para gerar estirpes que não produzem receptor de transferrina Tbpl e/ou Tbp2 como descrito no Exemplo 19. Estas estirpes são úteis como controlos negativos (uma vez que não produzem TfR) em concretizações de detecção e diagnóstico in vitro e in vivo. Espera-se também que estas estirpes sejam atenuadas para crescimento in vivo e sejam úteis como vacinas vivas para proporcionar protecção contra doenças causadas por Haemophilus.

Como descrito atrás, os epítopos de proteínas receptoras da transferrina podem ser entregues a células do sistema imunitário através da utilização de vectores vivos que expressam estas sequências de aminoácidos e o vector vivo pode ser poliovírus. Com referência à Figura 29, ilustra-se a construção de poliovírus híbridos que expressam um epítopo de proteína receptora da transferrina incluindo o epítopo conservado de Tbp2 LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74). Estes vírus eram reconhecidos por anticorpos criados contra um péptido que 21 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ incorpora a sequência de aminoácidos LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74) (Tabela 5) indicando que os vírus expressaram esta sequência numa forma antigenicamente reconhecível. PV1TBP2A e PV1TBP2B foram também neutralizados por anti-soros de coelho criados contra tbp2 de H. influenzae, estirpe DL63, indicando que pelo menos estes dois vírus expressaram a sequência numa forma reconhecível por anticorpos criados contra a proteína. Todos os vírus eram neutralizáveis por soros anti-PVl, indicando que as alterações no local I antigénico de neutralização de polio não tinham afectado significativamente outros locais antigénicos nos vírus. Adicionalmente, o anti-soro de coelho produzido por imunização com quimera de poliovírus PV1TBP2A ou PV1TBP2B reconheceu um péptido que incorpora a sequência de aminoácidos LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74) . Isto indica que as sequências expressas por PV1TB2A e PV1TBP2B são imunogénicas e eliciam anticorpos capazes de reconhecer a mesma sequência no contexto de um péptido sintético.

Com referência à Figura 30, o painel A mostra um gel de SDS-PAGE que mostra tbp2 recombinante purificado de H. influenzae, estirpe SB12, expresso em E. coli (pista 1), tbp2 de Branhamella catarrhalis, estirpe 4223 (pista 2), um lisado de células completas de B. catarrhalis, estirpe 4223 limitada por ferro (pista 3) , um lisado de células completas de E. coli JM109 limitada por ferro (pista 4), e um lisado de células completas de E. coli JM109 crescidas sob condições sem limitação por ferro (pista 5). O painel B mostra os resultados de um Western blot de um gel replicado utilizando um conjunto de soros de coelhos imunizados com PV1TBP2A. Houve uma forte reacção com as proteínas de ligação a transferrina purificadas nas pistas 1 e 2, e com uma banda de dimensão similar na pista 3. Não houve reacção significativa com nenhuma das proteínas de E. coli (pistas 4 e 5) . O painel C mostra os resultados para um conjunto de soros pré-sangria dos mesmos coelhos, que apresentava um mínimo de reactividade específica. Estes resultados mostram que PV1TBP2A é capaz de induzir anti-soros específicos para proteínas de ligação a transferrina de H. influenzae e B. catarrhalis, e que os anti-soros podem distinguir B. catarrhalis de E. coli, que não expressa uma proteína equivalente. 22 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

As moléculas de ADN purificadas e isoladas compreendendo pelo menos uma porção que codifica para um receptor de transferrina de uma espécie de Haemophilus tipificada pelas concretizações aqui descritas são vantajosas como: • sondas de ácido nucleico para a identificação especifica de estirpes de Haemophilus in vitro ou in vivo; • os produtos codificados pelas moléculas de ADN são úteis como reagentes de diagnóstico, antigénios para a produção de anti-soros específicos de Haemophilus, para vacinação contra as doenças causadas por espécies de Haemophilus e (por exemplo) detecção de infecção por Haemophilus; • péptidos correspondentes a porções do receptor de transferrina como tipificado pelas concretizações aqui descritas são vantajosos como reagentes de diagnóstico, antigénios para a produção de anti-soros específicos de Haemophilus, para vacinação contra as doenças causadas por espécies de Haemophilus e (por exemplo) para detecção de infecção por Haemophilus. 0 receptor de transferrina codificado pelas moléculas de ácido nucleico da presente invenção, seus fragmentos e análogos, e péptidos contendo sequências correspondentes a porções do receptor de transferrina que são conservadas entre vários isolados de Haemophilus e outras bactérias que produzem receptor de transferrina, são úteis no diagnóstico de, e na imunização contra, doenças causadas por qualquer estirpe bacteriana que produz receptor de transferrina. Em particular, péptidos contendo as sequências LEGGFYGP são conservados nas proteínas receptoras da transferrina de muitos patogénios bacterianos que produzem receptor de transferrina e são apropriados para o diagnóstico de, e imunização contra, doenças causadas por bactérias que produzem receptor de transferrina. Estas bactérias incluem, mas não se lhes limitam, espécies de Haemophilus, Neisseria (incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae) e Branhamella (incluindo B. catarrhalis). É claramente evidente para um perito na especialidade, que as várias concretizações da presente invenção têm muitas aplicações nos campos da vacinação, diagnóstico, tratamento de, por exemplo, infecções por Haemophilus, e infecções com 23 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ outros patogénios bacterianos que produzem receptor de transferrina e para a produção de reagentes imunológicos. Uma outra discussão não limitante destas utilizações é adicionalmente apresentada adiante. 1. Preparação e Utilização de Vacinas

As composições imunogénicas, adequadas para utilização como vacinas, podem ser preparadas a partir de receptor de transferrina imunogénico, seus análogos e fragmentos e/ou péptidos, como aqui descrito. A vacina elicia uma resposta imunitária que produz anticorpos, incluindo anticorpos anti-receptor de transferrina e anticorpos que são opsonizantes ou bactericidas. Se o indivíduo vacinado for provocado por Haemophilus ou outras bactérias que produzem um receptor de transferrina, os anticorpos ligam-se ao receptor de transferrina e desse modo impedem o acesso das bactérias a uma fonte de ferro que é necessária para a sua viabilidade. Adicionalmente, os anticorpos anti-TfR opsonizantes ou bactericidas podem também proporcionar protecção por mecanismos alternativos.

As vacinas contendo péptidos são geralmente bem conhecidas na especialidade, como exemplificado pelas Patentes U.S. 4 601 903; 4 599 231; 4 599 230; e 4 596 792. As composições imunogénicas, incluindo vacinas, podem ser preparadas em formas injectáveis, como soluções liquidas ou emulsões. O receptor de transferrina, seus análogos e fragmentos e/ou péptidos podem ser misturados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis que são compatíveis com o receptor de transferrina, fragmentos análogos ou péptidos. Estes excipientes podem incluir, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol e suas combinações. As composições imunogénicas e vacinas podem ainda conter substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH, ou adjuvantes para aumentar a eficácia das vacinas. As composições imunogénicas e as vacinas podem ser administradas parentericamente, por injecção subcutânea ou intramuscular. Alternativamente, as composições imunogénicas formadas de acordo com a presente invenção, podem ser formuladas e entregues de maneira a invocar uma resposta imunitária em superfícies mucosas. Assim, a composição 24 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ imunogénica pode ser administrada a superfícies mucosas, por exemplo, pelas vias nasal ou oral (intragástrica). A composição imunogénica pode ser proporcionada em combinação com uma molécula de direccionamento para entrega a células específicas do sistema imunitário ou a superfícies mucosas. Algumas destas moléculas de direccionamento incluem estirpe B12 e fragmentos de toxinas bacterianas, como descrito em WO 92/17167 (Biotech Australia Pty. Ltd.), e anticorpos monoclonais, como descrito na Patente U.S. 5 194 254 (Barber et al.). Alternativamente, podem ser desejáveis outros modos de administração incluindo supositórios e formulações orais. Para supositórios, podem-se incluir aglutinantes e transportadores, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos. As formulações orais podem incluir incipientes normalmente empregues tais como, por exemplo, qualidades farmacêuticas de sacarina, celulose e carbonato de magnésio. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação sustentada ou pós e contêm 10-95% do receptor de transferrina, fragmentos análogos e/ou péptidos.

As vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade tal que sejam terapeuticamente eficazes, protectoras e imunogénicas. A quantidade a administrar depende do indivíduo a tratar, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos, e se necessário, para produzir uma resposta imunitária mediada por células. As quantidades precisas de ingrediente activo que é necessário administrar dependem da opinião do profissional médico. Contudo, as gamas de dosagem adequadas são prontamente determináveis por um perito na especialidade e podem ser da ordem de microgramas do receptor de transferrina, seus análogos e fragmentos e/ou péptidos. Os regimes adequados para administração inicial e doses de reforço são também variáveis, mas podem incluir uma administração inicial seguida de administrações subsequentes. A dosagem da vacina pode também depender na via de administração e variará consoante o tamanho do hospedeiro.

As molécula de ácido nucleico que codificam o receptor de transferrina da presente invenção podem também ser utilizadas 25 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ directamente para imunização por administração do ADN directamente, por exemplo por injecção para imunização genética ou por construção de um vector vivo tal como Salmonella, BCG, adenovirus, poxvirus, vaccinia ou poliovírus. Uma discussão de alguns vectores vivos gue têm sido utilizados para o transporte de antigénios heterólogos para o sistema imunitário está por exemplo em O'Hagan (1992). Processos para a injecção directa de ADN em indivíduos de teste para imunização genética estão descritos em, por exemplo, Ulmer et al., 1993. A utilização de péptidos in vivo pode reguerer primeiro a sua modificação química pois os péptidos por si só podem não ter uma semivida suficientemente longa no soro e/ou no tecido e/ou suficiente imunogenicidade. Estes péptidos quimicamente modificados são aqui referidos como "análogos peptídicos". A expressão "análogo peptídico" estende-se a qualquer equivalente químico funcional de um péptido caracterizado pelas suas melhoradas estabilidade e/ou eficácia e imunogenicidade in vivo ou in vitro em relação à prática da invenção. A expressão "análogo peptídico" é também aqui utilizada estendendo-se a qualquer derivado de aminoácidos dos péptidos aqui descritos. Os análogos peptídicos aqui contemplados são produzidos através de procedimentos que incluem, mas não se lhes limitam, modificações nas cadeias laterais, incorporação de aminoácidos não naturais e/ou seus derivados durante a síntese peptídica e a utilização de reticulantes e outros métodos que impõem constrangimentos conformacionais nos péptidos ou seus análogos.

Os exemplos de modificações nas cadeias laterais contempladas na presente invenção incluem a modificação de grupos amino tal como por alquilação redutora por reacção com um aldeído seguida por redução com NaBH4; amidação com metilacetimidato; acetilação com anidrido acético; carbamilação de grupos amino com cianato; trinitrobenzilação de grupos amino com ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS); alquilação de grupos amino com anidrido succínico e anidrido tetra-hidroftálico; e piridoxilação de lisina com piridoxal-5'-fosfato seguida de redução com NaBH4. 26 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ Ο grupo guanidino de resíduos de arginina pode ser modificado através da formação de produtos de condensação heterocíclicos com reagentes tais como 2,3-butanodiona, fenilglioxal e glioxal. O grupo carboxilo pode ser modificado por activação de carbodiimida por via da formação de o-acilisoureia seguida de subsequente derivatização, por exemplo, numa amida correspondente.

Os grupos sulfidrilo podem ser modificados por métodos tais como carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida; oxidação de ácido perfórmico a ácido cisteico; formação de dissulfuretos mistos com outros compostos de tiol; reacção com maleimida; anidrido maleico ou outra maleimida substituída; formação de derivados de mercúrio utilizando 4-cloromercuriobenzoato, ácido 4-cloromercuriofenilsulfónico, cloreto de fenilmercúrio, 2-cloromercúrico-4-nitrofenol e outros compostos de mercúrio; carbamilação com cianato a pH alcalino.

Os resíduos de triptofano podem ser modificados, por exemplo, por oxidação com N-bromossuccinimida ou alquilação do anel índole com brometo de 2-hidroxi-5-nitrobenzilo ou halogenetos de sulfonilo. Os resíduos de tirosina podem ser alterados por nitração com tetranitrometano para formar um derivado de 3-nitrotirosina. A modificação do anel imidazole de um resíduo de histidina pode ser realizada por alquilação com derivados do ácido iodoacético ou N-carbetoxilação com dietilpirocarbonato.

Os exemplos de incorporação de aminoácidos não naturais e derivados durante a síntese peptídica incluem, mas não se lhes limitam, a utilização de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanóico, ácido 6-amino-hexanóico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, 4-amino-3-hidroxi-6-metil-heptanóico, 2-tienilalanina e/ou isómeros D de aminoácidos. A imunogenicidade pode ser significativamente melhorada se os antigénios forem co-administrados com adjuvantes, 27 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ vulgarmente utilizados na forma de uma solução de 0,05 a 1,0 porcento em solução salina tamponada com fosfato. Os adjuvantes aumentam a imunogenicidade de um antigénio mas não são, eles próprios, necessariamente imunogénicos. Os adjuvantes podem actuar retendo o antigénio localmente próximo do local de administração para produzir um efeito de depósito que facilita uma libertação lenta, sustentada, de antigénio nas células do sistema imunitário. Os adjuvantes podem também atrair células do sistema imunitário para um depósito de antigénio e estimular essas células para eliciar respostas imunitárias.

Os agentes imunoestimulantes ou adjuvantes têm sido utilizados há muitos anos para melhorar as respostas imunitárias do hospedeiro a, por exemplo, vacinas. Os adjuvantes intrínsecos, tais como lipopolissacáridos, normalmente são os componentes das bactérias mortas ou atenuadas utilizadas como vacinas. Os adjuvantes extrínsecos são imunomoduladores que estão tipicamente ligados de modo não covalente a antigénios e são formulados para aumentar as respostas imunitárias do hospedeiro. Assim, têm sido identificados adjuvantes que aumentam a resposta imunitária a antigénios entregues parentericamente. Alguns destes adjuvantes são contudo tóxicos, e podem causar efeitos secundários indesejáveis, o que os torna inadequados para utilização em seres humanos e muitos animais. De facto, apenas hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio (colectivamente referidos em comum como alúmen) são rotineiramente utilizados como adjuvantes em vacinas humanas e veterinárias. A eficácia de alúmen para aumentar as respostas de anticorpos aos toxóides da difteria e do tétano está bem estabelecida e, mais recentemente, uma vacina de HBsAg foi adjuvada com alúmen. Embora a utilidade do alúmen esteja bem estabelecida para algumas aplicações, tem limitações. Por exemplo, o alúmen é ineficaz para a vacinação contra a gripe e elicia inconsistentemente uma resposta imunitária mediada por células. Os anticorpos eliciados por antigénios adjuvados por alúmen são principalmente do isótipo IgGl no ratinho, que pode não ser óptimo para a protecção por alguns agentes de vacina.

Uma ampla gama de adjuvantes extrínsecos pode provocar respostas imunitárias potentes contra antigénios. Estes 28 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ incluem saponinas complexadas com antigénios de proteína de membrana (complexos estimulantes imunitários), polímeros

Pluronic com óleo mineral, micobactérias mortas e óleo mineral, adjuvante completo de Freund, produtos bacterianos, tais como dipéptido de muramilo (MDP) e lipopolissacárido (LPS), assim como lípido A e lipossomas.

Para induzir eficientemente respostas imunitárias humorais (HIR) e imunidade mediada por células (CMI), os imunogénios são emulsionados em adjuvantes. Muitos adjuvantes são tóxicos, induzem granulomas, inflamações agudas e crónicas (adjuvante completo de Freund, FCA), citólise (saponinas e polímeros Pluronic) e pirogenicidade, artrite e uveíte anterior (LPS e MDP). Embora o FCA seja um excelente adjuvante e amplamente utilizado em investigação, não está licenciado para utilização em vacinas humanas ou veterinárias devido à sua toxicidade.

As características desejáveis de adjuvantes ideais incluem: (1) ausência de toxicidade; (2) capacidade para estimular uma resposta imunitária duradoura; (3) simplicidade de fabrico e estabilidade na armazenagem a longo prazo; (4) capacidade para eliciar tanto CMI como HIR contra antigénios administrados por várias vias, se necessário; (5) sinergia com outros adjuvantes; (6) capacidade de interactuar selectivamente com populações de células apresentadoras de antigénios (APC); (7) capacidade para eliciar especificamente respostas imunitárias apropriadas específicas de células TH1 ou TH2; e (8) capacidade para aumentar selectivamente níveis de isótipos de anticorpos apropriados (por exemplo, IgA) contra antigénios. A Patente US 4 855 283 concedida a Lockhoff et al. em 8 de Agosto, 1989, ensina análogos glicolipídicos incluindo N-glicosilamidas, N-glicosilureias e N-glicosilcarbamatos, 29 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ cada um substituído no resíduo de açúcar por um aminoácido, como imunomoduladores ou adjuvantes. Assim, Lockhoff et al. 1991, relataram que análogos N-glicolipídicos apresentando similaridades estruturais com os glicolípidos de ocorrência natural, tais como glicoesfingolípidos e glicoglicerolípidos, são capazes de eliciar fortes respostas imunitárias tanto na vacina do vírus herpes simplex como na vacina do vírus da pseudo-raiva. Alguns glicolípidos foram sintetizados a partir de alquilaminas de cadeia longa e ácidos gordos que são ligados directamente aos açúcares através do átomo de carbono anomérico, para imitar as funções dos resíduos lipídicos de ocorrência natural. A Patente U.S. 4 258 029 concedia a Moloney, transmitida ao presente cessionário, ensina que cloridrato de octadeciltirosina (OTH) funciona como um adjuvante quando complexado com o toxóide do tétano e vacina de vírus da poliomielite do tipo I, II e III inactivado com formalina. Também, Nixon-George et al. 1990, relataram que ésteres de octadecilo de aminoácidos aromáticos complexados com um antigénio de superfície da hepatite B recombinante, aumentaram as respostas imunitárias do hospedeiro contra o vírus da hepatite B. A lipidação de péptidos sintéticos foi também utilizada para aumentar a sua imunogenicidade. Assim, Wiesmuller 1989, descreve um péptido com uma sequência homóloga a uma proteína virai da febre aftosa acoplado a um adjuvante de tripalmitil-s-gliceril-cisteinilserilserina, sendo um análogo sintético da parte N-terminal da lipoproteína de bactérias Gram-negativas. Adicionalmente, Deres et al. 1989, relataram a sensibilização in vivo de linfócitos T citotóxicos específicos do vírus com vacina de lipopéptido sintético que era constituída por péptidos sintéticos modificados derivados da nucleoproteína de vírus influenza por ligação a um lipopéptido, N-palmitil-s-[2,3-bis(palmitiloxi)-(2RS)-propil-[R]-cisteína (TPC). 2. Imunoensaios O receptor de transferrina, seus análogos e fragmentos e/ou péptidos da presente invenção são úteis como imunogénios, como antigénios em imunoensaios incluindo ensaios 30 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ imunossorventes com enzimas ligadas (ELISA), RIA e outros ensaios de ligação de anticorpos sem enzima ligada ou procedimentos conhecidos na especialidade para a detecção de anticorpos antibacterianos, de Haemophilus, TfR e/ou péptidos. Em ensaios ELISA, o receptor de transferrina, análogos, fragmentos e/ou péptidos correspondentes a porções de proteína TfR, são imobilizados sobre uma superfície seleccionada, por exemplo uma superfície capaz de ligar proteínas ou péptidos tal como os poços de uma placa de microtítulo de poliestireno. Após lavagem para remover receptor de transferrina, análogos, fragmentos e/ou péptidos, incompletamente adsorvidos, pode ser ligada à superfície seleccionada uma proteína não específica, tal como uma solução de albumina sérica bovina (BSA) ou caseína que se sabe serem antigenicamente neutras em relação à amostra de teste. Isto permite o bloqueio de locais de adsorção não específica sobre a superfície de imobilização e reduz assim o ruído de fundo causado por ligações não específicas de anti-soros sobre a superfície. Preferivelmente, os péptidos seleccionados são das regiões conservadas da Tabela 2 ou Tabela 3 para aumentar a detecção cruzada entre espécies a menos que se pretenda detectar uma espécie bacteriana particular. Nesse caso, é seleccionado um polipéptido que é único para o TfR dessa espécie particular. Normalmente, os péptidos estão na gama de 12 resíduos até, e preferivelmente, 14 a 30 resíduos. Entenda-se contudo, que pode ser utilizada uma mistura de péptidos quer como imunogénio numa vacina quer como agente de diagnóstico. Pode haver circunstâncias em que se utiliza uma mistura de péptidos das regiões conservadas e/ou das regiões não conservadas para proporcionar protecção cruzada entre espécies e/ou diagnóstico. Neste caso, a mistura de péptidos imunogénicos é vulgarmente referida como uma preparação de "cocktail" para utilização como vacina ou agente de diagnóstico. A superfície de imobilização é então colocada em contacto com uma amostra tal como materiais clínicos ou biológicos a testar de uma maneira condutora à formação de complexos imunitários (antigénio/anticorpo). Isto pode incluir a diluição da amostra com diluentes tais como BSA, gama-globulina bovina (BGG) e/ou solução salina tamponada com fosfato (PBS)/Tween. A amostra é então deixada a incubar durante de 2 a 4 horas, a temperaturas tais como da ordem de 31 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ 25° a 37°C. Após incubação, a superfície em contacto com a amostra é lavada para remover material não imunocomplexado. O procedimento de lavagem pode incluir a lavagem com uma solução tal como PBS/Tween ou um tampão de borato.

Após a formação de imunocomplexos específicos entre a amostra de teste e o receptor de transferrina, análogos, fragmentos e/ou péptidos, ligados, e subsequente lavagem, a ocorrência, e mesmo a quantidade, de formação de imunocomplexo podem ser determinadas submetendo o imunocomplexo a um segundo anticorpo possuindo especificidade para o primeiro anticorpo. Se a amostra de teste é de origem humana, o segundo anticorpo é um anticorpo possuindo especificidade para imunoglobulinas humanas e IgG em geral. Para proporcionar meios de detecção, o segundo anticorpo pode ter uma actividade associada tal como uma actividade enzimática que irá gerar, por exemplo, um desenvolvimento de cor por incubação com um substrato cromogénico apropriado. A quantificação pode então ser conseguida medindo o grau de produção de cor utilizando, por exemplo, um espectrofotómetro no espectro do visível. 3. Utilização de Sequências como Sondas de Hibridação

As sequências de nucleótidos da presente invenção, compreendendo a sequência do gene do receptor de transferrina, permitem agora a identificação e clonagem dos genes de receptor de transferrina a partir de qualquer espécie de Haemophilus e outras bactérias que possuam genes de receptor de transferrina.

As sequências de nucleótidos compreendendo a sequência dos genes de receptor de transferrina da presente invenção são úteis pela sua capacidade de formar selectivamente moléculas dúplices com trechos complementares de outros genes de TfR. Dependendo da aplicação, podem ser empregues uma variedade de condições de hibridação para conseguir vários graus de selectividade da sonda em relação aos outros genes de TfR. Para um elevado grau de selectividade, utilizam-se condições relativamente rigorosas para formar as dúplices, tais como condições de baixo teor de sais e/ou temperatura elevada, tal como proporcionadas por 0,02 M a 0,15 M de NaCl a temperaturas entre cerca de 50°C e 70°C. Para algumas aplicações, são 32 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ necessárias condições de hibridação menos rigorosas tais como 0,15 M a 0,9 M de sal, a temperaturas variando de entre cerca de 20°C e 55°C. As condições de hibridação podem também ser tornadas mais rigorosas pela adição de guantidades crescentes de formamida, para desestabilizar a dúplice híbrida. Assim, as condições de hibridação particulares podem ser prontamente manipuladas, e serão geralmente um método a escolher dependendo dos resultados desejados. Em geral, as temperaturas de hibridação convenientes na presença de formamida a 50% são: 42 °C para uma sonda que é 95 a 100% homóloga ao fragmento alvo, 37°C para 90 a 95% de homologia e 32°C para 85 a 90% de homologia.

Numa concretização de diagnóstico clínico, as sequências de ácido nucleico dos genes de TfR da presente invenção podem ser utilizadas em combinação com um meio apropriado, tal como um marcador, para determinar a hibridação. São conhecidos na especialidade uma ampla variedade de meios indicadores apropriados, incluindo ligandos radioactivos, enzimáticos ou outros, tais como avidina/biotina, que são capazes de proporcionar um sinal detectável. Em algumas concretizações de diagnóstico, pode ser utilizado um marcador enzimático tal como urease, fosfatase alcalina ou peroxidase, em vez de um marcador radioactivo. No caso de marcadores enzimáticos, são conhecidos substratos indicadores colorimétricos que podem ser empregues para proporcionar um meio visível ao olho humano ou espectrofotometricamente, para identificar a hibridação específica com amostras contendo sequências do gene de TfR.

As sequências de ácido nucleico dos genes de TfR da presente invenção são úteis como sondas de hibridação em hibridações em solução e em concretizações que empregam procedimentos em fase sólida. Em concretizações que envolvem procedimentos em fase sólida, o ADN (ou ARN) de teste das amostras, tais como amostras clínicas, incluindo exudados, fluidos corporais (e.g., soro, fluido amniótico, efusão do ouvido médio, esputo, fluido de lavagem broncoalveolar) ou mesmo tecidos, é adsorvido ou de outro modo fixado numa matriz ou superfície seleccionadas. O ácido nucleico de cadeia simples fixado é então submetido a hibridação específica com sondas seleccionadas compreendendo as sequências de ácido nucleico dos genes de TfR ou seus fragmentos da presente 33 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ invenção, sob as condições desejadas. As condições seleccionadas dependerão das circunstâncias particulares baseadas nos critérios particulares necessários dependendo de, por exemplo, os teores de G+C, o tipo de ácido nucleico alvo, a fonte de ácido nucleico, o tamanho da sonda de hibridação, etc. Após lavagem da superfície de hibridação de modo a remover moléculas de sonda ligadas de modo não específico, a hibridação específica é detectada, ou mesmo quantificada, por meio do marcador. Tal como com a selecção de péptidos, prefere-se seleccionar porções da sequência de ácido nucleico que são conservadas entre espécies de Haemophilus, tais como sequências de ácido nucleico que codificam a sequência peptídica conservada das Figuras 8, 9, 13 e 14 e particularmente enumeradas nas Tabelas 2 e 3. A sonda seleccionada pode ter pelo menos 18 pb e pode estar na gama de 30 pb a 90 pb de comprimento. 4. Expressão dos Genes do Receptor de Transferrina

Vectores plasmídicos contendo sequências de replicão e de controlo que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira, podem ser utilizados para a expressão dos genes de receptor de transferrina em sistemas de expressão. O vector normalmente é portador de um local de replicação, assim como de sequências marcadoras que são capazes de proporcionar selecção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. coli pode ser transformada utilizando pBR322 que contém genes para resistência a ampicilina e tetraciclina e assim proporciona um meio fácil para a identificação de células transformadas. O plasmídeo pBR322, ou outro plasmídeo microbiano ou fago, têm também que conter, ou ser modificados para conter, promotores que podem ser utilizados pela célula hospedeira para a expressão das suas próprias proteínas.

Em adição, vectores fágicos contendo sequências de replicão e de controlo que são compatíveis com o hospedeiro podem ser utilizadas como vector de transformação em relação a

TM estes hospedeiros. Por exemplo, o fago em lambda GEM -11 pode ser utilizado para preparar vectores fágicos recombinantes que podem ser utilizados para transformar células hospedeiras, tais como a E. coli LE392. 34 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Os promotores normalmente utilizados na construção de ADN recombinante incluem os sistemas promotores da β-lactamase (penicilinase) e da lactose (Chang et al., 1978: Itakura et al., 1977 Goeddel et al., 1979; Goeddel et al., 1980) e outros promotores microbianos tais como o sistema promotor de T7 (Patente U.S. 4 952 496). Os detalhes relativos às sequências de nucleótidos de promotores são conhecidos, permitindo a um perito ligá-los funcionalmente a genes. O promotor particular utilizado será geralmente uma matéria a escolher dependendo dos resultados desejados. Os hospedeiros que são apropriados para a expressão dos genes de receptor de transferrina, seus fragmentos, análogos ou variantes, incluem E. coli, espécies de Bacillus, Haemophilus, fungos, levedura ou pode-se utilizar o sistema de expressão de baculovirus.

De acordo com a presente invenção, prefere-se preparar a proteína por métodos recombinantes, particularmente quando a proteína TfR de ocorrência natural tal como purificada a partir de uma cultura de uma espécie de Haemophilus pode incluir quantidades vestigiárias de materiais tóxicos ou outros contaminantes. Este problema pode ser evitado utilizando proteína TfR produzida recombinantemente em sistemas heterólogos que podem ser isolados do hospedeiro de uma maneira que minimize os contaminantes no material purificado. Os hospedeiros particularmente desejáveis para a expressão, a este respeito, incluem bactérias Gram-positivas que não possuem LPS e são portanto isentas de endotoxinas. Estes hospedeiros incluem espécies de Bacillus e podem ser particularmente úteis para a produção de receptor de transferrina, seus fragmentos ou análogos, não pirogénicos. Adicionalmente, os métodos de produção recombinantes permitem o fabrico de Tbpl ou Tbp2 ou seus fragmentos, separados uns dos outros, o que é distinto das proteínas combinadas normais presentes em Haemophilus.

Depósitos Biológicos

Certos plasmídeos que contêm pelo menos uma porção que codifica para um receptor de transferrina de estirpes de Haemophilus influenzae que são aqui descritos e referidos, foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC) localizada em Rockville, Maryland EUA, segundo os termos do 35 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Tratado de Budapeste e antes da apresentação deste pedido. As amostras dos plasmídeos depositados ficarão disponíveis ao público após a concessão de uma patente baseada neste pedido de patente dos Estados Unidos. A invenção que se descreve e reivindica aqui não se pretende limitada em âmbito pelos plasmídeos depositados, pois a concretização depositada destina-se apenas a ilustração da invenção.

Sumário do Depósito

Clone Designação ATCC Data do Depósito DS-712-1-3 75603 4 de Novembro, 1993 JB-1042-7-6 75607 4 de Novembro, 1993 JB-1424-2-8 75937 27 de Outubro, 1994 JB-1600-1 75935 27 de Outubro, 1994 JB-14 68-2 9 75936 27 de Outubro, 1994 pT7TBP2A 75931 27 de Outubro, 1994 pT7TBP2B 75932 27 de Outubro, 1994 pT7TBP2C 75933 27 de Outubro, 1994 pT7TBP2D 75934 27 de Outubro, 1994

Estirpes de Haemophilus A estirpe Eagan de Hib está disponível em Connaught Laboratories Limited, 1755 Steeles Ave. W., Willowdale, Ontario, Canadá M2R 3T4. A estirpe MinnA de Hib foi obtida da colecção do Dr. Robert Munson, Department of Microbiology and Immunology, Washington University School of Medicine, Children's Hospital, St. Louis, Missouri 63110. A estirpe DL63 de Hib foi obtida da colecção do Dr. Eric Hansen, Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medicai Center, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, Texas 75235-9048. A PAK 12085 foi obtida da colecção do Dr. Robert Munson (supra). 36 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

As SB12, 29, 30, 32 e 33 foram obtidas da colecção do

Dr. Stephen Barenkamp, Department of Pediatrics, School of Medicine, Saint Louis University Medicai Centre, St. Louis, Missouri 63104.

EXEMPLOS A descrição anterior descreve genericamente a presente invenção. Pode-se ter um entendimento mais completo por referência aos seguintes Exemplos específicos. Estes Exemplos são descritos somente para fins de ilustração e não se destinam a limitar o âmbito da invenção. Alterações na forma e substituição de equivalentes estão contempladas conforme as circunstâncias o possam sugerir ou tornar expedito. Embora se tenham empregue aqui termos específicos, esses termos pretendem-se num sentido descritivo e não para fins de limitação.

Os métodos de genética molecular, bioquímica das proteínas, imunologia e tecnologia das fermentações, utilizados mas não explicitamente descritos nesta descrição e nestes Exemplos, estão amplamente relatados na literatura científica e estão bem dentro das capacidades dos peritos na especialidade.

Exemplo 1

Este Exemplo ilustra a preparação de ADN cromossómico de H. influenzae, estirpes DL63, Eagan, MinnA e PAK 12085, e SB33.

As estirpes de H. influenzae foram crescidas em ágar Mueller-Hinton ou em caldo de infusão de cérebro e coração como descrito por Harkness et al. 1992. A. Extracção de ADN cromossómico de Haemophilus influenzae tipo b DL63 O ADN cromossómico foi preparado como se segue. Duzentos e cinquenta ml de cultura foram sedimentados por centrifugação a 8 000 rpm num rotor Beckman J14 durante 15 minutos. A pelete foi lavada com 200 ml de Tris 50mM-HCl, pH 8,0, centrifugada 37 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ como anteriormente, ressuspensa em 12,5 ml de Tris 50mM-HCl, EDTA 50mM, pH 8,0 e congelada a -20°C. Depois, adicionaram-se 1,25 ml de uma solução de lisozima a 10 mg/ml em Tris 0,25M-HC1, pH 8,0, à pelete de células congelada. A pelete foi descongelada e incubada em gelo durante 45 minutos. Em seguida, adicionaram-se 2,5 ml de uma solução de proteinase K a lmg/ml em SDS a 0,5%, EDTA 0,4M, Tris 50mM-HCl, pH 7,5 e incubou-se a mistura a 50°C durante 1 hora com mistura ocasional. O lisado foi extractado uma vez com 15 ml de fenol tamponado com Tris, depois adicionaram-se 1,5 ml de acetato de sódio 3M e 30 ml de etanol para precipitar o ADN. O ADN foi enrolado numa vareta de vidro, depois foi dissolvido em 12,5 ml de Tris 50mM-HCl, EDTA lmM, pH 7,5 contendo ARNAse A a 0,2 mg/ml por rotação durante a noite. A amostra foi extractada uma vez com um volume igual de clorofórmio, precipitada e enrolada como anteriormente. O ADN foi dissolvido em 2 ml de Tris 50mM-HCl, EDTA lmM, pH 7,5 e armazenado a 4°C. B. Extracção de ADN cromossómico de Haemophilus influenzae tipo b Eagan

Cinquenta ml de cultura foram sedimentados por centrifugação, a pelete foi ressuspensa em 25ml de TE (Tris lOmM, EDTA lmM, pH 7,5), e utilizaram-se 2 aliquotas de 5ml para a preparação de ADN cromossómico. A cada alíquota adicionaram-se 0,6ml de sarcosilo a 10% e 0,15ml de proteinase K a 20mg/ml e incubaram-se as amostras a 37°C durante 1 hora. Extractou-se o lisado uma vez com fenol saturado com Tris e três vezes com clorofórmio:álcool isoamilico (24:1) . As fases aquosas foram reunidas até um volume final de 7ml. Depois, adicionaram-se 0,7ml de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 4,3 ml de isopropanol para precipitar o ADN que foi enrolado, enxaguado com etanol a 70%, seco, e ressuspenso em 1 ml de água. C. Extracção de ADN cromossómico de Haemophilus influenzae

Eagan, MinnA, PAK 12085 e SB33

As células foram sedimentadas a partir de 50 ml de cultura por centrifugação a 5000 rpm durante 15-20 minutos, a 4°C. Ressuspendeu-se a pelete de células em 10 ml de TE (Tris 38 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ 10mM-HCl, EDTA lmM, ρΗ 7,5), adicionaram-se pronase e SDS até concentrações finais de 500 pg/ml e 1%, respectivamente. A amostra foi incubada a 37°C durante 4 horas até se obter um lisado límpido. O lisado foi extractado uma vez com fenol saturado com Tris, uma vez com fenol saturado com Tris/clorof órmio (1:1) e uma vez com clorofórmio. A fase aquosa final foi dialisada durante 24 horas contra 2x 500 ml de NaCl 1M a 4°C, mudando o tampão uma vez, e durante 24 horas contra 2x 500 ml de TE a 4°C, mudando o tampão uma vez. O dialisado final foi dividido em alíquotas para utilização.

Exemplo 2

Este Exemplo ilustra a preparação de bibliotecas cromossómicas. A. Biblioteca de H. influenzae ϋΙι63-λΖΑΡ

Cortaram-se mecanicamente 100 pg de ADN cromossómico de H. influenzae DL63 em TE, numa seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 25. O ADN cortado foi tornado de extremidades lisas por adição de água até um volume final de 405 pl, 45 μΐ de tampão de nuclease SI lOx (NaCl 2M, NaOAc 500mM, pH 4,5, ZnSCq lOmM, glicerol a 5%), e 1,7 μΐ de nuclease SI a 100 U/μΙ e incubação a 37°C durante 15 min. A amostra foi extractada uma vez com fenol/clorofórmio e uma vez com clorofórmio e adicionou-se 1 ml de etanol para precipitar o ADN. A amostra foi incubada em gelo durante 10 min ou a -20°C durante a noite e o ADN foi recolhido por centrifugação numa microcentrífuga durante 30 minutos. O ADN foi lavado com etanol a 70% e seco. Os locais Eco RI na sequência de ADN foram metilados utilizando procedimentos Standard. A este ADN metilado adicionaram-se 5 μΐ de MgCl2 lOOmM, 8 μΐ de mistura de dNTP (2,5 mM de cada de dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , e 4 μΐ de Klenow a 5 U/μΙ. A mistura foi incubada a 12°C durante 30 minutos. Adicionaram-se 450 μΐ de STE (NaCl 0,1M, Tris lOmM-HCl, EDTA lmM, pH 8,0), e extractou-se a mistura uma vez com fenol/clorofórmio, e uma vez com clorofórmio, antes da adição de 1 ml de etanol para precipitar o ADN. A amostra foi incubada em gelo durante 10 min ou a -20°C durante a noite. O ADN foi recolhido por centrifugação numa microcentrífuga durante 30 minutos, lavado com etanol a 70% e seco. 39 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ Ο ADN foi ressuspenso em 7 μΐ de TE e adicionaram-se à solução 14 μΐ de ligantes Eco RI fosforilados (200 ng/μΐ), 3 μΐ de tampão de ligação lOx, 3 μΐ de ATP lOmM e 3μ1 de ADN-ligase de T4 (4 υ/μΐ) . Incubou-se a amostra a 4°C durante a noite, depois incubou-se a 68 °C durante 10 minutos para inactivar a ligase. Adicionaram-se à mistura 218 μΐ de H20, 45 μΐ de tampão Universal lOx e 7 μΐ de Eco RI a 30 U/μΙ. Após incubação a 37°C durante 1,5 horas, adicionaram-se 1,5 μΐ de EDTA 0,5M, e colocou-se a mistura em gelo. O ADN foi fraccionado por tamanhos num gradiente de sacarose, e reuniram-se as fracções contendo ADN de 6-10 kb. O ADN reunido foi precipitado com etanol e ressuspenso em 5 μΐ de tampão TE. Ligaram-se 200ng de ADN de inserção durante 2-3 dias a 4°C com 1 pg de vector ΖΑΡ II num volume final de 5μ1. Empacotou-se a mistura de ligação utilizando Gigapack II Gold (Stratagene) e plaqueou-se em células E. coli SURE em placas de NZY. Titulou-se a biblioteca, amplificou-se e armazenou-se a 4°C sob clorofórmio a 0,3%.

B. biblioteca de H. influenzae Eagan-pUC

ADN cromossómico preparado a partir de H. influenzae Eagan pelo método do Exemplo 1C foi digerido com Sau3A I durante 2, 5 e 10 minutos e submeteram-se amostras a electroforese num gel de agarose preparativo. Excisaram-se fatias de gel que incluíam fragmentos de ADN entre 3-10 kb de comprimento e extractou-se o ADN pelo procedimento de congelação-descongelação Standard. ADN plasmídico de pUC 8:2 (pUC 8 com os locais para as enzimas de restrição Bgl II e Xba I adicionais no local de clonagem múltipla) foi digerido com BamH I e Bgl II, e desfosforilado com fosfatase alcalina de vitelo (CAP) . Os fragmentos de ADN de H. influenzae Eagan foram ligados a pUC e a mistura foi utilizada para transformar células de E. coli JM109. C. Biblioteca de H. influenzae Eagan-λΖΑΡ ADN cromosssómico de H. influenzae Eagan preparado como no Exemplo 1B foi digerido com Eco RI e fraccionado por tamanhos num gel de agarose preparativo. Excisaram-se fatias 40 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ de gel correspondentes a fragmentos de ADN de 7-23 kb e submeteu-se o ADN a electroeluição durante a noite em tubagem de diálise contendo 3 ml de TAE (Tris 4 0mM-acetato, EDTA lmM) a 14V. O ADN foi precipitado duas vezes e ressuspenso em água antes de ser ligado durante a noite a ADN de λΖΑΡ II digerido com Eco RI. A mistura de ligação foi empacotada utilizando o kit de empacotamento Gigapack II (Stratagene) e plaqueada em células de E. coli XLl-Blue. A biblioteca foi titulada, amplificada e armazenada a 4°C sob clorofórmio a 0,3%. D. Bibliotecas de EMBL3 ADN cromossómico de H. influenzae MinnA (10 pg) foi preparado como no Exemplo 1C e digerido com Sau3A I (40 unidades) durante 2, 4 e 6 minutos, depois foi fraccionado por tamanhos num gradiente de sacarose a 10-30% em tampão TNE (Tris 20mM-HCl, NaCl 5mM, EDTA lmM, pH 8) . Reuniram-se as fracções contendo fragmentos de ADN maiores que 5 kb e precipitaram-se. Numa segunda experiência, o ADN cromossómico (2,6 pg) foi digerido com Sau3A I (4 unidades) durante 1, 2 e 3 minutos e fraccionado por tamanhos por electroforese em gel de agarose preparativo. Excisaram-se fatias de gel contendo fragmentos de ADN de 10-20 kb e extractou-se o ADN através de uma técnica Standard de congelação/descongelação. O ADN fraccionado por tamanhos das duas experiências foi reunido para ligação com braços BamH I de EMBL3 (Promega) . A mistura de ligação foi empacotada utilizando o kit de empacotamento

Gigapack II e plaqueada em células de E. coli LE392. A biblioteca foi titulada, depois foi amplificada e armazenada a 4°C sob clorofórmio a 0,3%.

ADN cromossómico de H. influenzae PAK 12085 ou SB33 preparado como no Exemplo 1C foi digerido com Sau3A I (0,5 unidades/10 pg de ADN) a 37°C durante 15 minutos e fraccionado por tamanhos por electroforese em gel de agarose. Excisaram-se fatias de gel correspondentes a fragmentos de ADN de 15-23 kb e o ADN foi electroeluido durante a noite em tubagem de diálise contendo 3 ml de TAE a 14V. O ADN foi precipitado duas vezes e ressuspenso em água antes da ligação, durante a noite, a braços BamH I de EMBL3 (Promega). A mistura de ligação foi empacotada utilizando o kit de empacotamento

Lambda in vitro (Amersham) de acordo com as instruções do 41 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ fabricante e plaqueada em células E. coli NM539. A biblioteca foi titulada, depois amplificada e armazenada a 4°C na presença de clorofórmio a 0,3%.

Exemplo 3

Este Exemplo ilustra a pesquisa das bibliotecas.

A. Biblioteca de expressão de H. influenzae DL63-ÀZAP

As proteínas Tbpl e Tbp2 foram purificadas por afinidade em transferrina humana em fase sólida (hTf). Resumidamente, preparou-se uma coluna de hTf-Sepharose de 20 ml de acordo com 0 protocolo do fabricante para acoplamento de ligandos de proteína a Sepharose activada por CNBr (Sigma). Lavou-se a matriz resultante com 3 volumes de coluna de Tris 50mM-HCl, NaCl 1M, guanidina 6M-HC1, pH 8,0 para remover hTf ligado não covalentemente. A coluna foi então equilibrada com Tris 50mM-HC1, pH 8,0 e o hTf ligado foi carregado com ferro utilizando 1 ml de FeCl3 lOmg/ml em tampão contendo lOOmM de cada um de citrato de sódio e bicarbonato de sódio, pH 8,6, seguidos de 2 volumes de coluna de Tris 50mM-HCl, NaCl 1M, pH 8,0.

Prepararam-se membranas bacterianas totais (300 mg de proteína total) de H. influenzae, estirpe DL63, crescida em meios deficientes em ferro como descrito previamente (Schryvers et al., 1989) . Diluíram-se as membranas para 2 mg/ml em Tris 50mM-HCl, NaCl 1M, pH 8,0 e solubilizaram-se pela adição de EDTA até 15mM e Sarcosilo NL97 até 1,5%. Após centrifugação a 40 000 x g durante 1 hora, aplicou-se o sobrenadante na coluna de hTf e lavou-se a coluna com 10 volumes de coluna de Tris 50mM-HCl, NaCl 1M, EDTA lOmM, Sarcosilo a 0,5%, pH 8,0. As proteínas receptoras foram eluídas utilizando GnHCl 2M no mesmo tampão e as fracções eluídas foram dialisadas extensamente contra tampão de bicarbonato de amónio 25mM (5 trocas de tampão), liofilizadas e armazenadas -20°C. Utilizaram-se proteínas isoladas para gerar anti-soros específicos de receptor de transferrina em coelhos New Zealand White utilizando técnicas Standard. Resumidamente, imunizaram-se os coelhos 3 vezes subcutaneamente, com intervalos de duas semanas, utilizando adjuvante completo de Freund para a primeira injecção e adjuvante incompleto de Freund para as injecções subsequentes. 42 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ A biblioteca de DL63-XZAP foi plaqueada em células de E. coli SURE e transferiram-se as placas fágicas para membranas de nitrocelulose que tinham sido pré-embebidas em IPTG lOmM para induzir a expressão a partir do promotor lacZ de pBluescript. Bloquearam-se os filtros utilizando leite desnatado a 0,5% em Tris 50mM-HCl, NaCl 150mM, pH 7,5, antes de serem sondados com os anti-soros anti-TfR policlonais e IgG anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano. Purificaram-se as placas fágicas através de 3 ciclos de pesquisa e recuperaram-se os plasmídeos pBluescript recombinantes (pBHITl e pBHIT2; Figuras IA e 2) pelo procedimento de excisão in vivo (Short et ai., 1988). B. Bibliotecas que não de expressão de Eagan, MinnA e PAK 12085

(i) Pesquisa da biblioteca de H. influenzae Eagan-pUC

Realizaram-se levantamentos de colónias para nitrocelulose utilizando técnicas Standard e sondaram-se os filtros com a sonda 5'pBHIT2 do gene do receptor de transferrina ilustrada na Figura 2. A sonda foi marcada com digoxigenina (dig, Boehringer Mannheim) seguindo as especificações do fabricante. Submeteram-se vários clones putativos a dot blot sobre nitrocelulose e submeteram-se a um segundo ciclo de pesquisa utilizando a mesma sonda 5'pBHIT2. Analisaram-se os putativos do segundo ciclo por mapeamento com enzimas de restrição e seleccionou-se o clone S-4368-3-3 (Figura 1B, Figura 2) para análise da sequência. (ii) Pesquisa da biblioteca de H. influenzae Eagan-λΖΑΡ

Plaqueou-se a biblioteca de fagos utilizando técnicas Standard em células XLI Blue (Stratagene) utilizando placas de LB e uma sobrecamada de agarose a 0,7%. Levantaram-se as placas fágicas para nitrocelulose utilizando protocolos Standard e cozeram-se os filtros a 80°C, durante 2 horas, sob vácuo, para fixar o ADN. A sonda 5'pBHIT2 do gene do receptor de transferrina (Figura 2) foi marcada com digoxigenina e os filtros foram pré-hibridados durante 4 horas a 42°C, e depois hibridados com a sonda marcada a 42°C, durante a noite. Lavaram-se os filtros a 68°C e após autorradiografia, seleccionaram-se várias placas fágicas para um segundo ciclo 43 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ de pesquisa. A excisão in vivo de ADN fagemídico dos putativos do segundo ciclo foi realizada de acordo com protocolos proporcionados com o sistema λΖΑΡ (Promega). Obtiveram-se quatro clones com inserções Eco RI de ~2,5 kb idênticas dos quais o JB-901-5-3 da Figura B, Figura 2 é um exemplo. As placas fágicas putativas foram também amplificadas e o ADN fágico foi purificado a partir de 500 ml de cultura. Excisou-se o ADN inserido por digestão com Xba I e clonou-se em pUC 8:2 (pUC 8 contendo locais Bgl II e Xba I adicionais no seu local de clonagem múltipla) que tinha sido digerido com

Xba I e desfosforilado. O clone JB-911-3-2 (Figura 17) contém a metade 3' do operão de TfR de H. influenzae Eagan. (iii) Pesquisa de bibliotecas de EMBL 3 A biblioteca de H. influenzae MinnA foi plaqueada sobre células LE392 em placas de NZCYM utilizando agarose a 0,7% no topo em NZCYM na forma de sobrecamada. Realizaram-se levantamentos de placas fágicas para filtros de nitrocelulose seguindo os procedimentos Standard e processaram-se os filtros e sondaram-se com a sonda 5.'pBHIT2 (Figura 2) marcada com digoxigenina. Plaquearam-se as placas fágicas putativas e submeteram-se a um segundo e um terceiro ciclos de pesquisa utilizando os mesmos procedimentos. Preparou-se ADN fágico a partir de 500 ml de cultura utilizando técnicas Standard, excisou-se o ADN inserido por digestão com Sal I e clonou-se em pUC para gerar o clone DS-712-1-3 (Figuras 1C e 2).

Plaqueou-se a biblioteca de H. influenzae PAK 12085 em células LE392 sobre placas de NZCYM utilizando agarose a 0,7% em NZCYM na forma de sobrecamada. Levantaram-se placas fágicas para nitrocelulose e processaram-se os filtros e sondaram-se com a sonda 5'pBHIT2 marcada com digoxigenina (Figura 2). Plaquearam-se as placas fágicas putativas e submeteram-se a um segundo ciclo de pesquisa utilizando o mesmo procedimentos. Preparou-se o ADN fágico a partir de culturas de 500 ml por técnicas Standard, excisou-se o ADN inserido por digestão com Sal I, e clonou-se em pUC para gerar o clone JB-1042-7-6 (Figura 1D e 2). A biblioteca de H. influenzae SB33 foi plaqueada em células LE392 sobre placas de NZCYM utilizando agarose a 0,7% em NZCYM na forma de sobrecamada. Levantaram-se placas fágicas 44 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ para nitrocelulose e processaram-se os filtros e sondaram-se com a sonda 5'pBHIT2 marcada com digoxigenina (Figura 2). Plaquearam-se as placas fágicas putativas e submeteram-se a um segundo ciclo de pesquisa utilizando os mesmos procedimentos. Preparou-se o ADN fágico a partir de culturas de 500 ml por técnicas Standard, excisou-se a inserção de ADN por digestão com Sal I, e clonou-se em pUC para gerar o clone JB-1031-2-9 (Figura 2).

Exemplo 4

Este Exemplo ilustra a sequenciação dos genes de Tbpl e Tbp2 do operão de TfR. ADN plasmidico dos clones pBHIT 1, pBHIT 2, S-4368-3-3, JB-901-5-3, DS-712-1-3, JB-1042-7-6 e JB-1031-2-9 foi preparado utilizando técnicas Standard. Sintetizaram-se iniciadores de sequenciação oligonucleotidicos de 17-25 bases de comprimento no sintetizador de ADN ABI modelo 380B e purificaram-se por cromatografia utilizando cartuchos OPC obtidos de Applied Biosystems Inc., e utilizaram-se de acordo com as recomendações dos fabricantes. Sequenciaram-se as amostras utilizando o sequenciador de ADN ABI modelo 370A e a quimica do terminador corante de acordo com os protocolos do fabricante. A sequência do operão de TfR da estirpe DL63 está ilustrada na Figura 3, a da estirpe Eagan na Figura 4, a da estirpe MinnA na Figura 5, a de PAK 12085 na Figura 6 e a de SB33 na Figura 7.

Exemplo 5

Este Exemplo ilustra a amplificação por PCR dos genes tbp2 de H. influenzae não tipificável estirpes SB12, SB29, SB30 e SB32. 0 ADN cromossómico de H. influenzae não tipificável, estirpes SB12, SB29, SB30 e SB32 foi preparado como descrito

atrás. Os genes de TfR estão dispostos na forma de um operão com tbp2 seguido de tbpl (vejam-se as Figuras 12A e 12B) . Sintetizaram-se oligonucleótidos para a extremidade 5' do tbp2 e o complemento inverso da extremidade 5' das sequências de codificação de tbpl. Os iniciadores eram: GGATCCATATGAAATCTGT 45 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ ACCTCTTATCTCTGGT (SEQ ID ΝΟ: 120) correspondente a MKSVPLISGS (SEQ ID NO: 147) da sequência de comando de Tbp2 e TCTAGAAGCTTTTTTAGTCATTTTTAGTATTCCAT (SEQ ID NO: 137) que é o complemento inverso da sequência de comando MTKK (SEQ ID NO: 138) de Tbpl e uma parte da sequência intergénica (Figuras 12A e 12B). A amplificação por PCR foi realizada em tampão contendo Tris lOmM/HCl, pH 8,3, cloreto de potássio 50 mM e cloreto de magnésio 1,5 mM. Cada mistura reaccional de 100 μΐ continha 5 ng de ADN cromossómico, 1 pg de cada iniciador, 5 unidades de ADN-polimerase amplitaq (Perkin Elmer Cetus) e 0,4 mM dos dNTP (Perkin Elmer Cetus). As condições dos ciclos foram de 25 ciclos de 94°C durante 1,0 min, 45°C durante 2,0 min e 72 °C durante 1,5 min. Amplificaram-se fragmentos específicos de 2 kb para cada amostra (Figura 13). Utilizou-se ADN de SB33 como controlo positivo (Pista 1) . O ADN cromossómico utilizado para a amplificação do gene de Tbp2 era, na pista 1, SB33; na pista 2, SB12; na pista 3, SB29; na pista 4, SB30; e na pista 5, SB32. Os fragmentos foram clonados no vector de clonagem TA (Invitrogen) e determinaram-se as suas sequências de nucleótidos. As sequências de ácido nucleico de Tbp2 das estirpes SB12 (SEQ ID NO: 108), SB29 (SEQ ID NO: 110), SB30 (SEQ ID NO: 112) e SB32 (SEQ ID NO: 114) estão apresentadas nas Figuras 8, 9 10 e 11 respectivamente.

Exemplo 6

Este Exemplo ilustra a comparação das sequências de aminoácidos de transferrina, a identificação de epítopos potencialmente expostos de proteínas receptoras da transferrina por análise da estrutura secundária.

Com referência à Figura 14, mostra-se uma comparação da sequência de aminoácidos de Tbpl de H. influenzae tipo b Eagan, DL63, H. influenzae não tipificável, estirpes PAK 12085 e SB33, N. meningitidis, estirpes B16B6 e M982 (Legrain et al., 1993) e N. gonorrhoeae FA19 (Cornelissen et al.r 1992). Esta análise revelou regiões de Tbpl que são conservadas entre todas estas bactérias.

Com referência à Figura 15, mostra-se uma comparação da sequência de aminoácidos de Tbp2 de H. influenzae tipo b, 46 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ estirpes Eagan, DL63, Η. influenzae não tipificável ΡΑΚ 12085, SB12, SB29, SB30 e SB32, N. meningitidis, estirpes B16B6 e M982, N. gonorrhoeae FA19 e Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae (Gerlach et al., 1992) 205 e 37. Esta análise revelou regiões de Tbp2 que são conservadas entre todas estas bactérias.

As análises da estrutura secundária das proteínas foram realizadas utilizando os algoritmos de Chou e Fasman (1978) e fizeram-se as representações gráficas de hidrofilicidade/hidrofobicidade utilizando o algoritmo de Hopp (1986). Os valores eram derivados das médias de janelas heptapeptídicas e estão representados no gráfico no ponto médio de cada fragmento. A Figura 16A ilustra a estrutura secundária prevista de Tbpl de H. influenzae tipo b Eagan e a Figura 16B ilustra a estrutura secundária prevista de Tbp2 de H. influenzae tipo b Eagan. As estruturas secundárias previstas representadas nas Figuras 16A e 16B foram obtidas utilizando os procedimentos atrás descritos. Contudo, os inventores ainda não foram capazes de verificar que a estrutura secundária é correctamente representada por essas Figuras.

Os epítopos conservados das proteínas Tbpl e Tbp2 de várias bactérias diferentes foram identificados por alinhamento de sequências como mostrado nas Figuras 14 e 15, respectivamente. Alguns destes epítopos conservados incluem: TBP1 DNEVTGLGK SEQ ID NO: 43 TBP1 EQVLNIRLTRYDPGI SEQ ID NO: 44 TBP1 GAINEIEYENVKAVEISKG SEQ ID NO: 45 TBP1 GALAGSV SEQ ID NO: 46 TBP2 LEGGFYGP SEQ ID NO: 74 TBP2 CSGGGSFD SEQ ID NO: 75 TBP2 YVYSGL SEQ ID NO: 76 TBP2 CCSNLSYVKFG SEQ ID NO: 77 TBP2 FLLGHRT SEQ ID NO: 78 TBP2 EFNVDF SEQ ID NO: 79 TBP2 NAFTGTA SEQ ID NO: 80 TBP2 VNGAFYG SEQ ID NO: 81 TBP2 LEGGYF SEQ ID NO: 82 TBP2 VVFGAR SEQ ID NO: 83 47 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Adicionalmente, em combinação com as estruturas secundárias previstas, identificaram-se quatro epítopos conservados expostos em Tbpl e identificaram-se dois em Tbp2. Estes são:

Tbpl DNEVTGLGK SEQ ID NO >: 43 Tbpl EQVLN/DIRDLTRYD SEQ ID : NOS: 139 e 140 Tbpl GA I NE IE YENVKAVEIS K SEQ ID NO: 141 Tbpl GI/VYNLF/LNYRYVTWE SEQ ID NOS:142 e 143 Tbp2 CS/LGGG(G)SFD SEQ ID NOS: 75, 144 e 145 Tbp2 LE/SGGFY/FGP SEQ ID NOS: 74 e 146 As proteínas, polipéptidos ou péptidos contendo as sequências de aminoácidos conservadas atrás mencionadas são particularmente úteis como meio de detecção em concretizações de diagnóstico e como imunogénios para detectar ou proteger de doenças causadas por bactérias que produzem a proteína receptora da transferrina. Para imunização, as sequências de aminoácidos particularmente indicadas podem ser apresentadas ao sistema imunitário na forma de proteínas ou péptidos ou pode-se utilizar um veículo de entrega vivo, tal como Salmonella, BCG, adenovírus, poxvírus, vaccinia ou poliovírus.

Exemplo 7

Este Exemplo ilustra a construção do plasmídeo JB-1468-29 que expressa Tbpl de Eagan a partir de E.coli.

Os plasmídeos S-4368-3-3 (Figuras 1B e 2) e JB-911-3-2 (Figura 17) contêm as partes a 5' e 3' do gene tbpl de Eagan, respectivamente. A Figura 17 ilustra o esquema de construção para o plasmídeo JB-1468-29. As sequências de oligonucleótidos utilizadas na construção de JB-1468-29 estão mostradas na Figura 20, (SEQ ID NOS: 86 e 87). O plasmídeo JB-1468-29 foi introduzido em E. coli, estirpe BL21/DE3, por electroporação, para gerar a estirpe JB-1476-2-1.

Cresceu-se JB-1476-2-1 em meio YT e induziu-se com IPTG seguindo protocolos Standard. Para a preparação de Tbpl para estudos de imunogenicidade e outros estudos, cresceu-se a estirpe JB-1476-2-1 durante a noite em meio NZCYM contendo glucose a 3%. Adicionou-se um inoculo de 1:40 a meio NZCYM 48 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ fresco sem glucose, e cresceu-se a cultura até A578=0,3 . Adicionou-se lactose até 1% e induziu-se a cultura durante 4 horas. A análise SDS-PAGE de lisados de células inteiras de JB-1476-2-1 está mostrada na Figura 22. Na pista 1, JB-1476-2-1 (T7/Tbpl de Eagan) a t0; na pista 2, JB-1476-2-1 a t=4h de indução; na pista 3, marcadores de peso molecular de 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa e 31 kDa; na pista 4, JB-1437-4-1 (T7/Tbp2 de Eagan) a t0; na pista 5, JB-1437-4-1 a t=4h de indução; na pista 6, JB-1607-1-1 (T7/Tbp2 de SB12) a t0; na pista 7, JB-1607-1-1 a t=4h de indução.

Exemplo 8

Este Exemplo ilustra a construção do plasmídeo JB-1424-2-8 que expressa Tbp2 de Eagan a partir de E. coli.

Com referência à Figura 18, mostra-se o plasmídeo S-4368-3-3 que contém a totalidade do gene tbp2 de H. influenzae tipo b Eagan. A Figura 18 ilustra o plasmídeo JB-1424-2-8 e a Figura 19 mostra os oligonucleótidos utilizados. O plasmídeo JB-1424-2-8 foi introduzido em E. coli estirpe BL21/DE3 por electroporação para gerar E. coli, estirpe JB-1437-4-1. Por indução com IPTG ou lactose, a Tbp2 foi expressa pela E. coli JB-1437-4-1 como mostrado na Figura 22. Na pista 1, JB-1476-2-1 (T7/Tbpl de Eagan) a t0; na pista 2, JB-1476-2-1 a t=4h de indução; na pista 3, marcadores de peso molecular de 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa e 31 kDa; na pista 4, JB-1437-4-1 (T7/Tbp2 de Eagan) a tQ; na pista 5, JB-1437-4-1 a t = 4h de indução; na pista 6, JB-1607-1-1 (T7/Tbp2 de SB12) a tQ; na pista 7, JB-1607-1-1 a t=4h de indução.

Exemplo 9

Este Exemplo ilustra a construção de plasmídeos que codificam uma sequência de comando de lipoproteína antes da sequência de Tbp2.

Os oligonucleótidos utilizados para a construção de plasmídeos com sequências de comando de lipoproteínas derivadas de E. coli lpp (SEQ ID NOS: 88 e 89), rlpB (SEQ ID 49 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ NOS: 90 e 91), e pal (SEQ ID NOS: 92 e 93) antes de Tbp2 estão mostrados na Figura 20. Os plasmídeos construídos e as estirpes geradas correspondentes estão ilustrados na Tabela 1 adiante.

Exemplo 10

Este Exemplo ilustra a construção do plasmídeo JB-1600-1 que expressa Tbp2 de SB12 a partir de E. coli. O plasmídeo DS-1047-1-2 (Figura 21) contém o gene tbp2 de SB12 amplificado por PCR. O gene tbp2 foi excisado na forma de um fragmento de restrição Nde I a EcoR I e inserido no vector de expressão pT7-7 para gerar o plasmídeo JB-1600-1. A electroporação em células BL21/DE3 originou a E. coli, da estirpe JB-1607-1-1 que expressa Tbp2 de SB12. Por indução com IPTG ou lactose, a Tbp2 de SB12 foi expressa, como mostrado na Figura 22. Na pista 1, JB-1476-2-1 (T7/Tbpl de Eagan) a t0; na pista 2, JB-1476-2-1 a t=4h de indução; na pista 3, marcadores de peso molecular de 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa e 31 kDa; na pista 4, JB-1437-4-1 (T7/Tbp2 de Eagan) a t0; na pista 5, JB-1437-4-1 a t=4h de indução; na pista 6, JB-1607-1-1 (T7/Tbp2 de SB12) a t0; na pista 7, JB-1607-1-1 a t=4h de indução.

Exemplo 11

Este Exemplo ilustra a extracção e a purificação de Tbpl e Tbp2. O esquema de purificação para Tbpl e Tbp2 é mostrado na Figura 23. Ambas as proteínas recombinantes são expressas na forma de corpos de inclusão em E.coli e os esquemas de purificação são idênticos. Células de uma cultura de 500 ml, preparada como descrito no Exemplo 7 para Tbpl e no Exemplo 8 para Tbp2, foram ressuspensas em 50 ml de Tris 50mM-HCl, pH 8,0, e rompidas com ultra-sons (3x 10 min, círculo de trabalho de 70%). O extracto foi centrifugado a 20 000 x g durante 30 min e o sobrenadante resultante que continha >95% das proteínas solúveis de E. coli foi rejeitado. 50 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ A pelete remanescente (Figura 23, ΡΡΤι) foi adicionalmente extractada em 50 ml de Tris 50 mM, pH 8,0 contendo Triton X-100 a 0,5% e EDTA 10 mM. Após centrifugação a 20 000 x g durante 30 min, o sobrenadante contendo proteínas solúveis residuais e a maioria das proteínas de membrana, foi rejeitado. A pelete resultante (Figura 23, PPT2) obtida após a extracção anterior, continha os corpos de inclusão. As proteínas Tbpl e Tbp2 foram solubilizadas em Tris 50 mM, pH 8,0, contendo SDS a 0,1% e DTT 5 mM. Após centrifugação, o sobrenadante resultante foi adicionalmente purificado numa coluna de filtração de gel Superdex 200 eguilibrada em Tris 50 mM, pH 8,0, contendo SDS a 0,1% e DTT 5mM. As fracções foram analisadas por SDS-PAGE e as gue continham Tbpl ou Tbp2 purificadas foram dialisadas durante a noite a 4°C contra Tris 50 mM, pH 8,0, e depois centrifugadas a 20 000 x g durante 30 min. A proteína permaneceu solúvel nestas condições e a Tbpl e a Tbp2 purificadas foram armazenadas a -20°C. A análise SDS-PAGE do processo de purificação é mostrada na Figura 24. Nas pistas 1, marcadores de peso molecular de proteínas pré-corados (106, 80, 49, 5, 32,5, 27,5, 18,5 kDa) ; nas pistas 2, lisados de células inteiras de E.coli; nas pistas 3, corpos de inclusão solubilizados; nas pistas 4, Tbpl ou Tbp2 purificadas.

Exemplo 12

Este Exemplo ilustra os estudos de imunogenicidade de Tbpl e Tbp2 recombinantes em ratinhos.

Grupos de cinco ratinhos Balb/c foram injectados subcutaneamente (s.c.) nos dias 1, 29 e 43 com rTbpl ou rTbp2 purificadas (1 pg a 10 pg) , preparadas como descrito no Exemplo 11, na presença de A1P04 (1,5 mg por dose).

Colheram-se amostras de sangue nos dias 14, 28, 42 e 56 para análise dos títulos de anticorpos anti-rTbpl e anti-rTbp2 por EIA. Os resultados dos estudos de imunogenicidade são ilustrados na Figura 25. 51 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

Exemplo 13

Este Exemplo ilustra o desenvolvimento dos EIA para determinação de anticorpos anti-rTbpl e anti-rTbp2 em soros de ratinhos.

Os títulos de anticorpos anti-rTbpl e anti-rTbp2 foram determinados essencialmente como descrito por Panezutti et al. (1993). Revestiram-se os poços de microtítulo com 0,5 pg de rTbpl ou rTbp2, preparadas como descrito no Exemplo 11, durante 16 h à temperatura ambiente, depois bloquearam-se com 0,1% (p/v) de BSA em PBS. Os soros foram diluídos em série, adicionados aos poços, depois incubados durante uma hora à temperatura ambiente. Utilizaram-se fragmentos F(ab')2 purificados por afinidade de anticorpo IgG de cabra anti-ratinho (específico para Fc) conjugados com peroxidase de rábano como segundo anticorpo. As reacções foram desenvolvidas utilizando tetrametilbenzidina (TMB/H202) e a absorvância foi medida a 450 nm (utilizando 540 nm como comprimento de onda de referência) num leitor de microplacas Flow Multiskan MCC. O título reactivo de um anti-soro foi definido como o recíproco da diluição que apresenta consistentemente um aumento de duas vezes na absorvância relativamente ao que é obtido com a amostra de soro pré-imune.

Exemplo 14

Este Exemplo ilustra a reactividade cruzada de anti-soros anti-Tbpl, produzidos por imunização com Tbpl de Eagan recombinante, com várias estirpes de H. influenzae.

Lisados de células inteiras de estirpes de H. influenzae crescidas em meios BHI suplementados com NAD e heme (Harkness et al., 1992) ± EDDA foram separados por gel de SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose e sondados com anti-soros anti-Tbpl de porquinho-da-índia criados contra Tbpl de Eagan recombinante purificada (Figura 26) . Na pista 1, BL21/DE3; na pista 2, SB12-EDDA; na pista 3, SB12 +EDDA; na pista 4, SB29 - EDDA; na pista 5, SB29 +EDDA; na pista 6, SB33 -EDDA; na pista 7, SB33 + EDDA; na pista 8, Eagan -EDDA; na pista 9, Eagan +EDDA; na pista 10, B. catarrhalis 4223 - EDDA; na pista 11, B. catarrhalis 4223 +EDDA; na pista 12, 52 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ Ν. meningitidis 608 - EDDA; na pista 13, Ν. meningitidis 608 + EDDA; na pista 14, JB-1476-2-1 induzida expressando Tbpl de

Eagan recombinante; na pista 5, marcadores de peso molecular. As bandas específicas de ~95 kDa reagiram com os anti-soros anti-Tbpl nas pistas 3, 4, 5, 7, 8 e 9, correspondentes a H. influenzae, estirpes SB12, SB29, SB33 e Eagan; as bandas de -110 kDa nas pistas 10 e 11, correspondentes a B. catarrhalis, estirpe 4223; e as bandas de -80 kDa nas pistas 12 e 13, correspondentes a N. meningitidis 608.

Exemplo 15

Este Exemplo ilustra a reactividade cruzada de anti-soros anti-Tbp2, produzidos por imunização com Tbp2 de Eagan recombinante, com várias estirpes de H. influenzae.

Lisados de células inteiras de estirpes de H. influenzae crescidas em meios BHI suplementados com NAD e heme (Harkness et al.r 1992) ± EDDA foram separados num gel de SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose e sondados com anti-soros anti-Tbp2 de porquinho-da-índia criados contra Tbp2 de Eagan recombinante purificada (Figura 27) . Na pista 1, marcadores de peso molecular; na pista 2, JB-1437-4-1 induzida expressando Tbp2 de Eagan recombinante; na pista 3, SB12-EDDA; na pista 4, SB12 +EDDA; na pista 5, SB29 -EDDA; na pista 6, SB29 +EDDA; na pista 7, SB30 -EDDA; na pista 8, SB30 +EDDA; na pista 9, SB32 -EDDA; na pista 10, SB33-EDDA; na pista 11, SB33 +EDDA; na pista 12, PAK -EDDA; na pista 13, PAK +EDDA; na pista 14, Eagan -EDDA; na pista 15, Eagan +EDDA. As bandas específicas de cerca de 60-70 kDa eram reactivas com os anti-soros anti-Tbp2 nas pistas 3, 6, 7, 8, 13, 14 e 15, correspondentes às estirpes SB12, SB29, SB30, PAK e Eagan de

Haemophilus.

Exemplo 16

Este Exemplo ilustra a síntese de péptidos sintéticos correspondentes a regiões conservadas em Tbp2 e Tbpl.

As sequências de aminoácidos deduzidas de Tbpl e Tbp2 foram comparadas como mostrado na Figuras 14 e 15, respectivamente. Esta comparação identificou regiões de 53 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ conservação de sequência de aminoácidos no interior do receptor de transferrina descrito atrás e, como mostrado nas Tabelas 2 e 3, foram sintetizados péptidos contendo uma porção do receptor de transferrina. Esta síntese pode ser efectuada por expressão num hospedeiro adequado de vectores recombinantes contendo ácido nucleico que codifica os referidos péptidos ou por síntese peptídica Standard.

Resumidamente, os péptidos foram sintetizados utilizando um sintetizador de péptidos ABI 430A e química do t-Boc optimizada utilizando as condições recomendadas pelo fabricante, e os péptidos foram clivados da resina utilizando ácido fluorídrico (HF) . Os péptidos foram purificados por cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa (RP-HPLC) numa coluna Vydac C4 semi-preparativa (1 x 30 cm) utilizando um gradiente de acetonitrilo de 15 a 55% em ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA), desenvolvida durante 40 minutos a um caudal de 2 ml/minuto. Todos os péptidos sintéticos utilizados em estudos bioquímicos e imunológicos eram >95% puros como avaliado por HPLC analítica. Realizaram-se análises da composição em aminoácidos num sistema Waters Pico-Tag e eram concordantes com as composições teóricas.

Exemplo 17

Este Exemplo ilustra a imunogenicidade de péptidos sintéticos em animais de teste.

Porquinhos-da-índia foram imunizados intramuscularmente com 100 pg de péptido, preparado como descrito no Exemplo 16, emulsionado em adjuvante completo de Freund no dia 0 seguido de reforços nos dias + 14 e + 28 utilizando a mesma quantidade de péptido emulsionado em adjuvante incompleto de Freund. Obtiveram-se amostras de soros no dia 42 + e determinaram-se os títulos de anticorpos por ensaio imunossorvente com enzima ligada (ELISA). Resumidamente, revestiram-se poços de microtítulo (Nunc-Immunoplate, Nunc, Dinamarca) com 500 ng de qualquer péptido particular em 50 pL de tampão de revestimento (Na2C03 15 mM, NaHC03 35 mM, pH 9,6) durante 16 horas à temperatura ambiente. As placas foram então bloqueadas com 0,1% (p/v) de BSA em tampão salino de fosfato (PBS) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os anti-soros foram diluídos 54 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ em série, adicionados aos poços e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. Após remoção dos anti-soros, lavaram-se as placas cinco vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,1% (p/v) e BSA a 0,1% (p/v). F(ab')2 de anticorpos IgG de cabra anti- porquinho-da-índia conjugados com peroxidase de rábano (Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA) foram diluídos (1/8 000) com tampão de lavagem, e adicionados a placas de microtítulo. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, lavaram-se as placas cinco vezes com o tampão de lavagem. Desenvolveram-se as placas utilizando o substrato tetrametilbenzidina (TMB) em H2C>2 (ADI, Toronto), parou-se a reacção com H2S04 IN e mediu-se a densidade óptica a 450 nm utilizando um Titretek Multiskan II (Flow Labs., Virgínia). Incluíram-se dois péptidos irrelevantes de 32 resíduos de aminoácido como controlos negativos nestes ELISA. Os ensaios foram realizados em triplicado, e o título reactivo de cada anti-soro foi definido como a diluição que apresentava consistentemente um aumento de 2 vezes no valor da absorvância relativamente aos obtidos com os controlos negativos. Os anti-soros criados em porquinhos-da-índia eram monoespecíficos para o péptido utilizado para imunização. Os títulos dos soros obtidos após a imunização estão apresentados na Tabela 4.

Os péptidos da presente invenção compreendem cópias únicas de quaisquer dos apresentados nas Tabelas 2 e 3 ou péptidos contendo múltiplas cópias de seus análogos. Um péptido pode ainda compreender múltiplos péptidos diferentes seleccionados entre os mostrados nas Tabelas 2 e 3 ou seus análogos e incluem moléculas transportadoras adequadas. Prefere-se que sejam utilizados péptidos de regiões conservadas para desenvolver os anticorpos porque um imunoensaio ou outro tipo de ensaio de ligação pode então ser utilizado para detectar várias espécies de Haemophilus. As Tabelas 2 e 3 apresentam portanto várias outras regiões conservadas do receptor de transferrina para identificar outros péptidos que seriam úteis em diagnóstico, imunização e tratamento médico.

Exemplo 18

Este Exemplo descreve a capacidade de anti-soro criado contra péptidos correspondentes a porções conservadas do 55 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ receptor de transferrina, para reconhecer o receptor de transferrina de Branhamella catarrhalis.

Imunizaram-se porquinhos-da-índia com péptido, correspondente a porções conservadas do receptor de transferrina, e os anti-soros obtidos estão descritos no Exemplo 17. Submeteu-se um extracto de células inteiras de Branhamella catarrhalis a immunoblot com o anti-soro específico do péptido que reconheceu especificamente o receptor de transferrina desta bactéria. 0 anti-soro anti-péptido de um porquinho-da-índia imunizado com o péptido N-terminal de Tbp2 e o péptido TBP2-25 reconheceu especificamente a proteína Tbp2 de Branhamella catarrhalis e a Tbp2 recombinante expressa pelo clone plasmídico pBHIT2 em E. coli. O clone pBHIT2 expressa uma versão truncada de Tbp2 que começa no aminoácido 80. (i.e. NKKFYSG SEQ ID NO:105).

Portanto, a proteína Tbp2 de pBHIT2 apenas pode ser reconhecida por anticorpos criados contra o segundo epítopo LEGGFYGP (TBP2-25). Esta análise mostra que péptidos correspondentes a sequências conservadas entre receptores de transferrina são úteis na detecção da maioria, senão todas, as bactérias que produzem receptor de transferrina, e como componentes em composições imunogénicas, incluindo vacinas para produzir uma resposta imunitária contra o receptor de transferrina e proteger contra doenças causadas por essas bactérias.

Os soros destes coelhos foram testados por ELISA contra um péptido que incorpora a sequência LEGGFYGP (SEQ ID NO:74) ou contra Tbp2 de H. influenzae, estirpe DL63. Placas de ELISA foram revestidas com o péptido ou a proteína e depois bloqueadas com leite desnatado a 5%. Incubaram-se diluições em série de duas vezes de soros em solução salina tamponada com fosfato, tween-20 a 0,05%, e leite seco a 1%, nas placas, durante duas horas a 37°C, após o que as placas foram lavadas cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de tween-20. Sondaram-se as placas lavadas com um IgG de burro anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRPO) durante 30 minutos à temperatura ambiente, e depois lavaram-se cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de tween-20. O substrato da HRPO foi adicionado a todos os poços durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro, depois 56 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ parou-se ο desenvolvimento de cor pela adição de 50 ul de ácido sulfúrico 1M. A cor foi medida por determinação da absorvância a 450nm.

Exemplo 19

Este Exemplo ilustra a produção de estirpes de H. influenzae que não produzem receptor de transferrina.

Um fragmento Eco RI de 2,55 da inserção de pBHITl foi subclonado no local Eco RI de pUC4K, resultando a remoção da cassete de resistência a canamicina (kan) Tn903 deste vector (pUHITl; Figura 28). Este passo de subclonagem facilitou a subsequente inserção de um fragmento HincII ou PstI de pUC4K contendo a cassete kan nos locais Hind III ou Pst I de pUHITl pois ambos são locais únicos nesta construção, para produzir pUHITIKFH e pUHITIKFP, Figura 28. Após digestão com Eco RI para remover as sequências génicas interrompidas, introduziram-se as construções no genoma de H. influenzae do tipo selvagem por transformação utilizando meios M-IV como descrito previamente (Barcak et al., 1991) e seleccionaram-se os transformantes em ágar BHINH contendo 20 pg/ml de canamicina.

Exemplo 20

Este Exemplo ilustra a construção de poliovírus que expressam um epitopo de um receptor de transferrina.

Um clone de ADNc das bases 1175 a 2956 do genoma do poliovírus do tipo 1, estirpe Mahoney (PV1-M) foi cortado com as enzimas de restrição Sau I e Hind III. Estas enzimas excisam um fragmento contendo as bases 2754 a 2786, que codifica os aminoácidos 1094 a 1102 de PV1-M, como mostrado na Figura 29. No presente pedido, utilizamos o código de quatro dígitos para os aminoácidos do poliovírus; por exemplo, 1095 é o aminoácido 95 da proteína da cápside VP1. Novos clones híbridos de ADNc que codificam sequências de aminoácidos tanto do poliovírus como de receptores de transferrina foram construídos substituindo o fragmento excisado por oligonucleótidos sintéticos que codificam para aminoácidos de Tbp2 de H. influenzae. Os novos clones de ADNc híbridos foram 57 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ cortados com as enzimas de restrição Nhe I e SnaB I, que excisam um fragmento híbrido, incluindo as sequências de ADN do receptor de transferrina, das bases 2471 a 2956 de poliovírus. Um clone de ADNc, por exemplo pT7XLD ou pT7CMCB, deste genoma completo de PVl-M foi cortado com NheI e SnaBI para excisar um fragmento das bases 2471 a 2956 de poliovírus. Este foi então substituído por um fragmento híbrido incluindo as sequências de ADN do receptor de transferrina para produzir um clone de ADNc híbrido do genoma de PVl-M com as bases 2754 a 2786 substituídas por bases que codificam uma ansa BC híbrida incluindo aminoácidos do receptor de transferrina, como mostrado na Figura 29. O plasmídeo pT7XLD e os clones derivados de pT7XLD, tais como pT7CMCB, contêm uma sequência promotora para a enzima ARN-polimerase de T7 na extremidade 5' do ADNc de PVl-M. Os transcritos de ARN do ADNc de PVl-M, incluindo quaisquer bases que codificam aminoácidos do receptor de transferrina, foram preparados utilizando ARN-polimerase de T7 como descrito por van der Werf et al. A transfecção de células Vero com estes transcritos de ARN produziu quatro vírus híbridos viáveis, designados PV1TBP2A, PV1TBP2B, PV1TBP2C e PV1TBP2D. A transfecção com transcritos de pT7CMCB originou um poliovírus do tipo selvagem derivado por transfecção designado por PV1XLD (Figura 2 9).

As características antigénicas de PV1TBP2A, PV1TBP2B, PV1TBP2C e PV1TBP2D estão apresentadas na Tabela 5. Todos foram neutralizados por anti-soros de porquinho-da-índia criados contra um péptido incorporando a sequência LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74), o que indica que os vírus expressaram esta sequência numa forma antigenicamente reconhecível. Para produzir os anti-soros, imunizaram-se IM porquinhos-da-índia fêmea com um volume de 500 ul contendo 200 ug de péptido formulado em fosfato de alumínio (3 mg/ml). Os animais foram imunizados nos dias 1, 14, 28 e 42 e sangrados nos dias 0, 28, 42 e 56. Os soros eram do dia 56 de sangria. PV1TBP2A e PV1TBP2B foram também neutralizados por anti-soros de coelho criados contra Tbp2 de H. influenzae, estirpe DL63, indicando que pelo menos estes dois vírus expressaram a sequência numa forma reconhecível por anticorpos criados contra a proteína. Todos os vírus eram neutralizáveis por soros anti-PVl, o que 58 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ indica que as alterações no local I antigénico de neutralização de polio não tinham afectado significativamente outros locais antigénicos nos virus.

Exemplo 21

Este Exemplo ilustra a utilização de poliovírus híbridos para induzir títulos elevados de anti-soros contra Tbp2.

Inocularam-se coelhos com PV1TBP2A purificado por CsCl (coelhos #40, 41, 42). Note-se que, embora os vírus utilizados estivessem vivos, o poliovírus não replica em coelhos e que qualquer resposta observada é efectivamente a resposta a um antigénio inactivado. No dia 1, os coelhos foram inoculados com 1 ug de vírus em adjuvante completo de Freund subcutaneamente no dorso, e, no dia 14, os coelhos receberam um reforço com 1 ug de vírus em adjuvante incompleto de Freund inoculado subcutaneamente no dorso. Os coelhos foram sangrados no dia 0 (pré-sangria) e no dia 27. A dose de vírus por inoculação foi de 2,5 x 108 pfu, que se determinou a partir dos valores de A26o ser de aproximadamente 3,0 x 1011 viriões. Isto equivalia a 0,5 pmol de vírus ou 30 pmol do epítopo LEGGFYG (SEQ ID NO: 74), pois cada virião expressa 60 cópias do epítopo.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

Em resumo desta descrição, a presente invenção proporciona moléculas de ADN purificadas e isoladas contendo genes de receptores de transferrina, as sequências destes genes de receptores de transferrina e as sequências de aminoácidos suas derivadas. A invenção também proporciona péptidos correspondentes a porções do receptor de transferrina. Os genes, as sequências de ADN, as proteínas e péptidos recombinantes, são úteis para o diagnóstico, a imunização e a produção de reagentes de diagnóstico e imunológicos. Vacinas baseadas em Tbpl e/ou Tbp2 recombinantes expressas, suas porções, ou péptidos derivados das sequências proporcionadas, podem ser preparados para a prevenção de doenças causadas por patogénios bacterianos que produzem receptor de transferrina. 59 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ TABELA 1 comando 1° resíduo plasmídeo estirpe E. coli lpp Cys JB-1360-1R-10 JB-1407-1-1 E. coli lpp Ser JB-1366-1R-7 JB-1407-3-1 E. coli pal Cys JB-1360-3-10 JB-1407-2-1 E. coli pal Ser JB-1366-3R-5 JB-1407-4-4 E. coli rlpB Cys JB-1399-1 JB-1437-1-1 E. coli rlpB Ser JB-1378-7 JB-1407-5-1 TABELA 2

PÉPTIDOS Tbpl ANTIGÉNICOS PREVISTOS SEQ ID NO:

PEPTIDO RESÍDUOS1

SEQUÊNCIAS TBP1-N 1-36 AETQSIKDTKEAISSEVDTQSTEDSELETISVTAEK 13 TBP1-2 31-66 SVTAEKVRDRKDNEVTGLGKIIKTSESISREQVLNI 14 TBP1-3 59-94 SREQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGM 15 TBP1-4 88-123 GY SIRGMDRNRVALLVDGLPQTQSYWQSP LVARS G 16 TBP1-5 117-152 PLVARSGYGTGAINEIEYENVKAVEISKGGSSSEYG 17 TBP1-6 147-182 SSSEYGNGALAGSVTFQSKSAADILEGDKSWGIQTK 18 TBP1-7 179-214 GIQTKNAYSSKNKGFTHSLAVAGKQGGFEGVAIYTH 19 TBP1-8 208-243 GVAIYTHRNSIETQVHKDALKGVQSYDRFIATTEDQ 20 TBP1-9 236-271 IATTEDQSAYFVMQDECLDGYDKCKTSPKRPATLST 21 TBP1-10 266-301 PATLSTQRETVSVSDYTGANRIKPNPMKYESQSWFL 22 TBP1-11 293-328 YESQSWFLRGGYHFSEQHYIGGIFEFTQQKFDIRDM 23 TBP1-12 322-357 KFDIRDMTFPAYLRPTEDKDLQSRPFYPKQDYGAYQ 24 TBP1-13 352-387 DYGAYQHIGDGRGVKYASGLYFDEHHRKQRVGIEYI 25 TBP1-14 383-418 GIEYIYENKNKAGIIDKAVLSANQQNIILDSYMRHT 26 TBP1-15 412-447 DSYMRHTHCSLYPNPSKNCRPTLDKPYSYYHSDRNV 27 TBP1-16 443-478 SDRNVYKEKHNMLQLNLEKKIQQNWLTHQIAFNLGF 28 TBP1-17 469-504 THQIAFNLGFDDFTSALQHKDYLTRRVIATASSISE 29 TBP1-M 498-534 TASSISEKRGEARRNGLQSSPYLYPTPKAELVGGDLC 30 TBP1-19 528-563 LVGGDLCNYQGKSSNYSDCKVRLIKGKNYYFAARNN 31 TBP1-20 558-593 FAARNNMALGKYVDLGLGMRYDVSRTKANESTISVG 32 TBP1-21 588-623 STISVGKFKNFSWNTGIVIKPTEWLDLSYRLSTGFR 33 TBP1-22 618-653 LSTGFRNPSFAEMYGWRYGGKDTDVYIGKFKPETSR 34 TBP1-23 648-683 KPETSRNQEFGLALKGDFGNIEISHFSNAYRNLIAF 35 TBP1-24 677-712 YRNLIAFAEELSKNGTTGKGNYGYHNAQNAKLVGVN 36 60 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

PÉPTIDOS Tbpl ANTIGÉNICOS PREVISTOS PÉPTIDO RESÍDUOS 1 SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: ΤΒΡ1-25 706-741 AKLVGVNITAQLDFNGLWKRIPYGWYATFAYNRVKV 37 TBP1-26 735-770 AYNRVKVKDQKINAGLASVSSYLFDAIQPSRYIIGL 38 TBP1-27 764-799 SRYIIGLDYDHPSNTWGIKTMFTQSKAKSQNELLGK 39 TBP1-28 794-829 NELLGKRALGNNSRNVKSTRKLTRAWHILDVSGYYM 40 TBP1-29 825-854 SGYYMVNRSILFRLGVYNLLNYRYVTWEAV 41 TBP1-30 843-865 LLNYRYVTWEAVRQTAQGAEFDI 42 TBP1-31 42-50 DNEVTGLGK 43 TBP1-32 61-76 EQVLNIRDLTRYDPGI 44 TBP1-33 61-95 EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQGRGASSGYSIRGMD 45 TBP1-34 128-146 GAINEIEYENVKAVEISKG 46 TBP1-35 155-161 GALAGSV 47 TBP1-1 1-14 AETQSIKDTKEAISC2 48 1. Número do resíduo da sequência de Tbpl de H. influenzae tipo b, estirpe Eagan (como mostrado na Figura 8) . 2. Cisteína adicionada para facilitar o acoplamento a transportadora, por exemplo KLH. uma proteína PÉPTIDO PÉPTIDOS RESÍDUOS1 TABELA 3 Tbp2 ANTIGÉNICOS CONSERVADOS PREVISTOS SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: TBP2-1 18-31 CSGGGSFDVDNVSN 49 TBP2-2 231-261 LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK 50 TBP2-3 358-380 TVGKKTYQVEACCSNLSYVKFGM 51 TBP2-4 527-549 ATVKGAFYGPKASELGGYFTYNG 52 TBP2-5 1-36 MKLAALNLFDRNKPSLLNEDSYMIFSSRSTIEEDV 53 TBP2-6 29-64 STIEEDVKNDNQNGEHPIDSIVDPRAPNSNENRHG 54 TBP2-7 57-92 SNENRHGQKYVYSGLYYIQSWSLRDLPNKKFYSGY 55 TBP2-8 85-120 KKFYSGYYGYAYYFGNTTASALPVGGVATYKGTWS 56 TBP2-9 113-148 TYKGTWSFITAAENGKNYELLRNSGGGQAYSRRSA 57 TBP2-10 141-176 AYSRRSATPEDIDLDRKTGLTSEFTVNFGTKKLTG 58 TBP2-11 169-204 GTKKLTGGLYYNLRETDANKSQNRTHKLYDLEADV 59 TBP2-12 197-232 YDLEADVHSNRFRGKVKPTKKESSEEHPFTSEGTL 60 TBP2-13 225-260 FTSEGTLEGGFYGPEGQELGGKFLAHDKKVLGVFS 61 61 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ

PÉPTIDOS Tbp2 ANTIGÉNICOS CONSERVADOS PREVISTOS PÉPTIDO RESÍDUOS1 SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: TBP2-14 253-288 KVLGVFSAKEQQETSENKKLPKETLIDGKLTTFKT 62 TBP2-15 281-316 KLTTFKTTNATANATTDATTSTTASTKTDTTTNAT 63 TBP2-16 309-344 DTTTNATANTENFTTKDIPSLGEADYLLIDNYPVP 6 4 TBP2-17 337-372 IDNYPVPLFPESGDFISSKHHTVGKKTYQVEACCS 65 TBP2-M 360-406 CSNLSYVKF GMYY EAP PKEEEKEKEKDKDKEKEKQA 66 TBP2-19 393-428 KEKDKDKEKEKQATTSIKTYYQFLLGLRTPSSEIP 67 TBP2-20 421-456 TPSSEIPKEGSAKYHGNWFGYISDGETSYSASGDK 68 TBP2-21 449-484 YSASGDKERSKNAVAEFNVNFAEKTLTGELKRHDT 69 TBP2-22 477-512 ELKRHDTQNPVFKINATFQSGKNDFTGTATAKDLA 70 TBP2-23 505-540 ATAKD LAID GKNTQGTSKVNFTATVNGAF YGP HAT 71 TBP2-24 533-559 FYGPHATELGGYFTYNGNNPTDKNSS 72 TBP2-C 553-581 CPTDKNSSSNSEKARAAVVFGAKKQQVETTK 73 TBP2-25 231-238 LEGGFYGP 74 TBP2-26 18-25 CSGGGSFD 75 TBP2-27 130-134 YVYSGL 76 TBP2-28 345-355 CCSNLSYVKFG 77 TBP2-29 401-407 FLLGHRT 78 TBP2-30 450-456 EFNVDF 79 TBP2-31 485-491 NAFTGTA 80 TBP2-32 516-522 VNGAFYG 81 TBP2-33 527-532 ELGGYF 82 TBP2-34 562-566 VVFGAR 83 TBP2-35 562-568 VVFGAK 84 TBP2-36 231-237 LEGGFYG 85 1. Número do resíduo da sequência de Tbp2 de H. influenzae estirpe Eagan (como mostrado na Figura 9). tipo 62 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ TABELA 4

Respostas de anticorpos de porquinho-da-india a péptidos de

Tbpl e Tbp2 PÉPTIDO SEQ ID SEQUÊNCIAS TÍTULO TBP1-N 13 AETQSIKDTKEAISSEVDTQSTEDSELETISVTAEK 500 TBP1-M 30 TASSISEKRGEARRNGLQSSPYLYPTPKAELVGGDLC 1562500 TBP1-1 48 AETQSIKDTKEAISC <100 TBP2-1 49 CSGGGSFDVDNVSN 2500 TBP2-2 50 LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK 12500 TBP2-3 51 TVGKKTYQVEACCSNLSYVKFGM 62500 TBP2-4 52 ATVKGAFYGPKASELGGYFTYNG <100 TBP2-M 66 CSNLSYVKF GMYY EAP PKEEEKEKEKDKDKEKEKQA 62500 TBP2-C 73 CPTDKNSSSNSE K AR AA WF G AKKQ Q VE T T K 312500 TABELA 5

Actividade de neutralização de soros anti-Tbp2 e anti-péptido contra vírus híbridos polio/Tbp2

Soros a Título de Neutralização v. Vírus b PVITBP2A PVITBP2B PVITBP2C PV1TBP2D PV1XLD Rb @PV1 >409600 25844 20480 16763 >40960 Rb 516 D0 <4 <4 <4 <4 <4 Rb 516 D42 40 20 <4 <4 <4 conjunto de GP561, 562, D0 <4 <4 <4 <4 <4 GP 561 D56 >2048 >2048 >2048 1164 <4 GP 562 D56 >2048 >2048 25 10 <4 Conjunto de GP558, 559, 560, D56 <4 <4 <4 <4 <4 a Rb @PV1 é o conjunto de soros imunes de coelho criados contra PV1XLD. 0 coelho (Rb) 516 foi imunizado com três doses sucessivas de 3 pg de proteína 2 de ligação a transferrina de H. influenzae DL63 recombinante nos dias 1, 14 e 28. O soro foi recolhido nos dias 0 (DO) e 42 (D42) . Os porquinhos-da-índia foram imunizados com quatro doses sucessivas de 200pg de péptido nos dias 1, 14, 28 e 42. Os soros foram recolhidos no dia 0 (DO) e no dia 56 (D56) . Os porquinhos-da-índia (GP) 561 e 562 receberam um péptido contendo a sequência LEGGFYGP (SEQ ID NO:74). Os porquinhos-da-índia (GP) 558, 559 e 556 receberam um péptido de controlo com uma sequência não relacionada. b O título é o inverso da diluição de soro que origina 50% do ponto final num ensaio de neutralização de vírus versus 100 TCID50 de vírus. 63 ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ TABELA 6 Títulos de IgG específica do péptido de coelhos imunizados com

PV1TBP2A ou PV1TBP2B COELHO (ANTIGÉNIO) TÍTULOS DE IgG ESPECÍFICA DO PÉPTIDO a PRÉ-SANGRIA DIA 27 40 (PV1TBP2A) <20 640 41 (PV1TBP2A) <20 640 42 (PV1TBP2A) <20 2560 43 (PV1TBP2B) <20 160 44 (PV1TBP2B) <20 1280 45 (PV1TBP2B) <20 1280 10 (PV1 Mahoney) <20b 11 (PV1 Mahoney) <20 a Os títulos são o recíproco da maior diluição de soros que origina uma A450 de pelo menos duas vezes o valor do ruído de fundo. O valor do ruído de fundo era a A450 média de poços ensaiados na ausência de soros de coelho. b Os títulos para os coelhos 10 e 11 referem-se a soros colhidos no dia 42 após três imunizações com PV1 Mahoney. Os coelhos 10 e 11 foram imunizados como os coelhos 40 a 45, excepto administrando uma dose de reforço adicional no dia 28.

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Patente U. S. 4 258 029 Patente U. S. 4 4 9 6 538 Patente U. S. 4 599 230 Patente U. S . 4 599 231 Patente U. S . 4 601 903 Patente U. S . 5 141 743 Patente U. S . 4 596 792 Patente U. S . 4 952 496 Patente U. S . 5 194 254 W0 92/17167

Lisboa,

Claims

ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido possuindo não menos de sete aminoácidos e não mais de 150 aminoácidos e contendo uma sequência de aminoácidos que é conservada entre bactérias que produzem uma proteína receptora da transferrina compreendendo TBP-2, sendo a referida sequência conservada de TBP-2: LEGGFYG (SEQ ID NO: 85).
2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 e contendo uma sequência de aminoácidos que é: LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74).
3. Péptido de acordo com a reivindicação 1, em que o referido péptido é: LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74) ou LEGGFYG (SEQ ID NO: 85).
4. Péptido de acordo com a reivindicação 1, em que o referido péptido é: LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK (SEQ ID NO: 50).
5. Composição imunogénica, compreendendo como componente activo um péptido de acordo com qualquer reivindicação anterior.
6. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 5, formulada na forma de uma vacina para administração in vivo para proteger contra doenças causadas por patogénios bacterianos que produzem proteínas receptoras da transferrina.
7. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 6, formulada na forma de uma composição de micropartículas, cápsulas ou lipossomas.
8. Composição imunogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, compreendendo uma pluralidade dos referidos componentes activos para proporcionar protecção contra uma doença causada por uma pluralidade de espécies de bactérias produtoras de proteínas receptoras da transferrina. ΕΡ Ο 728 200 /ΡΤ 2/2 sequência
9. Anti-soro ou anticorpo específicos para uma de aminoácidos LEGGFYG (SEQ ID NO: 85), LEGGFYGP (SEQ ID NO: 74), ou LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK (SEQ ID NO: 50). Lisboa,