DK175788B1 - Vaccine imod meningococcussygdomme, deri indgående komponenter, disses anvendelse og rekombinanter, som eksprimerer dem - Google Patents

Description

i DK 175788 B1

Opfindelsens baggrund.

Bakteriel meningitis er en betændelsessygdom i centralnervesystemet, som forårsages af væksten af bakterier i og op til leptomeningerne. Meningitis er en akut smitsom 5 sygdom, som angriber børn og unge voksne, og som forårsages af bl.a. Neisseria meningitidis, men også andre bakterie-og viruspathogener.

Meningococci underinddeles i serologiske grupper afhængigt af tilstedeværelsen af enten kapsel- eller celle-10 vægsantigener. For tiden kendte serogrupper omfatter A, B, C, D, W-135, X, Y, 2 og 29E, som adskilt ved seroagglutine-ring. De polysaccharider, som er ansvarlige for serogruppe-, specificiteten af grupperne A, B, C, X, W-135 og Y, er blevet renset.

15 Antallet af personer, som bærer meningococci, er i langt højere end sygdomshyppigheden. Nogle personer er midlertidige bærere, medens andre er kroniske bærere, som spreder meningococci enten mere eller mindre kontinuert eller på en sporadisk måde. Meningococbærestadiet er en immunise-20 rende proces, og i løbet af 2 uger efter kolonisering kan produktionen af antistoffer imod meningococci identificeres.

Det ser ud til, at baktericide antistoffer er rettet imod både kapselpolysaccharidet og andre cellevægsantigener.

Studier har vist, at meningococydermembraner har 3-5 25 hovedproteiner, hvoraf de dominerende proteiner på 41.000Mr eller 38.000Mr bærer de serotypespecifikke determinanter.

På natriumdodecyl sul f at -polyacrylamid-elektroforesegeler (SDS-PAGE) er der en væsentlig grad af heterogenitet mellem stammerne i profilerne af ydermembranproteinerne. Som afgræn-30 set ved peptidkortlægningsstudier omfatter proteinerne fem klasser, betegnet 1 til 5, baseret på fælles peptidstrukturer. Der er blevet produceret baktericide, monoklonale antistoffer imod proteiner af klasse 1 på 46.000Mr, hvilke proteiner i en vis udstrækning deles blandt stammer af for-35 skellige serotyper, jvf. C.E. Frasch et al. (1985), side 633, "New Developments in Meningococcal Vaccines", i G.K.

I DK 175788 B1 I

I 2 I

Schoolnik et al. (udg.), The Pathogenic Nisseriae, American I

H Society for Microbiology, Washington, D.C. I

H Kapselpolysaccharidet fra meningococci fra grupperne I

A, C, W-135 og Y er blevet anvendt til udvikling af vacciner I

5 imod organismen. Selv om disse vacciner har været effektive I

kortvarigt, fremkalder de ikke immunologisk hukommelse, og I

H personerne skal revaccineres inden for ca. 3 år for at opret- I

: holde deres resistens. Polysaccharidet fra gruppe B er dår- I

i ligt immunogent, og resultatrige vacciner er ikke blevet I

10 fremstillet. En mulig forklaring på den lave aktivitet kan I

H være, at den skyldes, at polysaccharidet fra gruppe B bibrin- I

H ges tolerance fremkaldt af krydsreaktive antigener, som I

findes i humane væv, såsom hjernen. Endvidere viser studier, I

at de fleste af de baktericide antistoffer i rekonvalenscens- I

15 sera fra patienter, som har haft en meningococsygdom af I

gruppe B, er rettet imod ydermembranproteiner. I

Der er blevet udviklet vacciner til beskyttelse imod I

meningococsygdom af gruppe B, i hvilke vacciner der er blevet I

indgivet ikke-covalente komplekser af ydermembranproteiner I

20 (OMP) og polysaccharid fra gruppe B, jvf. Beuvery et al. I

I (1983), Infect. Immun. £0, 369-380. Det vides imidlertid, I

at B-polysaccharidet frembringer en forbigående IgM-anti- I

stofreaktion, som ikke giver immunobeskyttelse. Der er end- I

videre en stor antigenforskellighed og -variabilitet i menin- I

I 25 gococydermembranproteinerne fra stamme til stamme. Desuden I

er lipopolysaccharider til stede i OMP og udviser ligeledes I

antigenvariabilitet. I

Der findes et behov for sikre og effektive vacciner I

imod meningococsygdom, hvilke vacciner tilvejebringer im- I

30 munitet imod infektion, især hos børn og ældre mennesker. I

Resumé af opfindelsen. I

I et første aspekt af opfindelsen tilvejebringes en I

vaccine, som er effektiv mod meningococsygdom, omfattende I

35 en effektiv mængde af en ydermembranvesicel isoleret fra en I

gensplejset eller mutant meningococstamme, hvor vesiclen I

3 DK 175788 B1 omfatter mindst ét meningococ-klasse I-ydermembranprotein, et fragment deraf eller et oligopeptid indeholdende en epitop deraf, hvor proteinet, fragmentet deraf eller oligopeptidet er i stand til at fremkalde en baktericid immunreaktion i 5 værtsorganisme, og ikke omfattende et meningococ-klasse 2/3-ydermembranprotein, idet meningococ-klasse I-ydermembran-proteinet stammer fra en mutant meningococstamme, som er negativ for klasse 2/3-ydermembranprotein.

I et alternativt aspekt af opfindelsen tilvejebringes j 10 et i det væsentlige renset fragment af klasse I-ydermembranprotein af Neisseria meningitidis, hvor fragmentet har en | molekylvægt på ca. 25 kD eller mindre og indeholder kontinuerlige eller diskontinuerlige epitoper, som er reaktive ^ med baktericide antistoffer mod N. meningitidis, hvor epito-15 perne er lokaliseret i overfladesløjfer af meningococ-klasse I-ydermembranproteiner i området af aminosyrerne 24-34 og 176-187.

Der tilvejebringes ifølge et andet alternativt aspekt af opfindelsen isoleret nucleinsyre, som koder for fuldlæng-20 de-klasse I-OMP-protein, som har sekvensen Pi.15 eller sekvensen PI.7,16, som vist i tegningsfiguren, som ledsager eksempel 4.

Ifølge et andet alternativt aspekt af opfindelsen tilvejebringes isoleret oligonucleotid, som koder for en 2 5 epitop lokaliseret i overfladesløjfer af meningococ-klasse I- j

ydermembranproteiner i området af aminosyrerne 24-34 og 176-187. I

Ifølge et yderligere alternativt aspekt af opfindelsen tilvejebringes et præparat til fremkaldelse af en beskyttende 30 immunreaktion mod Neisseria meningitidis, omfattende a) liposom omfattende et eller flere meningococ-klasse I-ydermembranproteiner, men ikke omfattende et meningococ-klasse 2/3-ydermembranprotein eller fragment deraf, og eventuelt et adjuvans i en farmaceutisk acceptabel bærer, eller b) et 35 liposom omfattende mindst ét oligopeptid indeholdende en kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop af et klasse I-

I DK 175788 B1 I

I 4 I

ydermembranprotein, som er reaktivt med baktericide anti- I

stoffer mod N. meningitidis, men ikke omfatter en epitop af I

et klasse 2/3-ydermembranprotein, og eventuelt et adjuvans I

I i en farmaceutisk acceptabel bærer, idet klasse I-ydermem- I

5 bran-proteinet eller -proteinerne har sekvensen PI.15, se- I

kvensen eller sekvensen PI.7,16 som vist i figuren, som I

H ledsager eksempel 4. I

Ifølge yderligere alternative aspekter af opfindelsen I

tilvejebringes et antigent konjugat omfattende et bæreprotein I

10 eller epitop deraf, hvortil der er konjugeret et fragment

af meningococ-klasse I-ydermembranprotein, som har en mole- I

I kylvægt på 25 kD eller mindre, indeholdende en epitop valgt I

blandt I

I I QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, I

I 15 YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP og HYTRQNNTDVF, forudsat ' I

at bæreproteinet ikke er β-galactosidase, og et genetisk I

fusionspeptid eller -protein, omfattende et bæreprotein, I

I peptid eller epitop deraf, hvortil der er fusioneret et

I meningococ-klasse I-ydermembranprotein med en molekylvægt I

H 20 på 25 kD eller mindre indeholdende en epitop valgt blandt I

I QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, I

I YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP og HYTRQNNTDVF, forudsat I

I at bæreproteinet ikke er β-galactosidase. I

I Ifølge et andet alternativt aspekt af opfindelsen I

I 25 tilvejebringes et fusionsprotein omfattende et flagellin- j I

protein, som er har en aminosyresekvens for en epitop af et |

I meningococ-klasse I-ydermembranprotein indføjet deri. j I

I Ifølge endnu et andet alternativt aspekt af opfindel- ' I

I sen tilvejebringes endvidere en rekombinant mikroorganisme, I

I 30 som kan eksprimere et fragment af et klasse I-ydermembran- I

I protein af Neisseria meningitidis, som har en molekylvægt I

på 25 kD eller mindre, og som indeholder en kontinuerlig I

eller diskontinuerlig epitop, som er reaktiv med klasse I- I

OMP-specifikke antistoffer mod N. meningitidis. : I

I 35 Ifølge andre alternative aspekter af opfindelsen I

tilvejebringes en mutant meningococstamme, som ikke kan I

5 DK 175788 B1 ί t producere klasse 2- og 3-ydermembranprotein, og den mutante meningococstamme HIII5, CBS 636.89, som ikke kan producere klasse 2- og klasse 3-ydermembranprotein.

Ifølge et yderligere alternativt aspekt af opfindelsen 5 tilvejebringes en gensplejset Neisseria-stamme, som er negativ for klasse 2/3-ydermembranproteiner, og som kan ekspri-mere et intakt klasse I-ydermembranprotein af Neisseria meningitidis, et genetisk fusionsprotein deraf eller en kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop, som er reaktiv 10 med klasse I-OMP-specifikke antistoffer mod N. meningitidis.

Der tilvejebringes yderligere ifølge et andet alternativt aspekt af opfindelsen en gensplejset mikroorganisme bestående af en Neisseria-stamme, som kan eksprimere mere end ét klasse I-ydermembranprotein af Neisseria meningitidis, 15 hvor hvert protein individuelt omfatter mindst én kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop, som er reaktiv med klasse I-OMP-specifikke antistoffer mod N. meningitidis.

Ifølge et yderligere alternativt aspekt af opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til at eksprimere mindst ét 20 meningococ-klasse I-ydermembranprotein, som er i stand til at fremkalde en baktericid immunreaktion i en værtsorganisme, omfattende indføjelse af mindst ét gen, som koder for meningococ-klasse I-ydermembranprotein, i en rekombinant mikroorganisme valgt blandt a) en mutant meningococstamme, som 25 er .negativ for klasse 2/3-ydermembranprotein, eller b) en gruppe A-, B-, C-, W-135- eller Y-meningococcus, hvor mikroorganismen kan eksprimere det nævnte gen som intakt protein, som kan fremkalde en baktericid immunreaktion i en værtsorganisme .

30 Ifølge et andet alternativt aspekt af opfindelsen tilvejebringes en gensplejset Neisseria-stamme, som kan eksprimere et ikke-nativt intakt klasse I-ydermembranprotein af Neisseria meningitidis, et genetisk fusionsprotein deraf eller en kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop, som er 35 reaktiv med klasse I-OMP-specifikke antistoffer mod N. meningitidis .

I DK 175788 B1 I

I I

Opfindelsen angår også fragmenter af klasse I-yder- I

membranproteinet (OMP) af Neisseria meningitidis og oligo- I

H peptider afledt af klasse I-OMP, som indeholder kontinuerlige I

eller diskontinuerlige immunogene, og således muliggør klasse I

5 I-OMP, fragmenter og oligopeptider ifølge opfindelsen udvik- I

ling af vacciner for andre gramnegative patogener. I

Kortfattet beskrivelse af tegningen. I

Fig. 1 viser et skema til forstærkning af gener, som I

, 10 koder meningococydermembranprotein af klasse 1 ved PCR (poly- I

merasekædereaktion). I

Pig. 2 viser 5’-gensekvenser, som koder VRl (første I

I variable region) i ydermembranproteiner af klasse 1 fra I

I forskellige undertyper af N. meningitidis. I

15 Fig. 3 viser 3'-gensekvenser, som koder VR2 (anden I

variable region) i ydermembranproteiner af klasse 1 fra I

H forskellige undertyper af N. meningitidis. I

I Fig. 4 viser epitopskandering ved omsætning af mono- I

klonale antistoffer med fastfasedecapeptider, som spænder I

20 over de forudsagte aminosyresekvenser i proteiner af klasse I

1 fra stammerne PI.7,16, PI.16 og PI.15. Nabodecapeptider I

H afviger med 5 aminosyrerester. Notationer viser den stamme, I

I hvorfra sekvensen stammer, det anvendte mAb og dets under- I

H- typespecificitet. I

I 25 Fig. 5 viser reaktionen af de monoklonale antistoffer I

I med rækker af overlappende decapeptider, som svarer til de I

I variable regioner VRl og VR2, idet nabopeptider afviger med I

I en enkelt aminosyrerest. Notationer viser den stamme, hvorfra I

I sekvensen stammer, det anvendte mAb og dets undertypespeci- I

I 30 ficitet. I

I Fig. 6 viser konstruktion af rekombinantflagelliner, I

I som eksprimerer epitoper i den variable region i OMP af I

I klasse 1 fra N. meningitidis, undertype PI.6,16. I

I Fig. 7 viser strukturen af rekombinantflagelliner, I

I 35 som eksprimerer epitoper i den variable region i OMP af I

klasse 1 fra N. meningitidis, undertype PI.6,16. I

7 DK 175788 B1

Fig. 8 viser et repræsentativt chromatogram fra væske-chromatografi med høj ydeevne af et rekombinantflagellin.

Fig. 9 viser en repræsentativ analyse af rekombinant-flagellin ved SDS-PAGE.

5 Fig. 10 viser repræsentative Wester-pletanalyser af et konjugat omfattende en epitop af OMP af klasse 1 fra N. meningitidis konjugeret til CRM197.

Fig. 11 viser den formodede konformation af OMP af klasse 1 fra N. meningitidis, undertype PI.16.

10

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen. ·

Den foreliggende opfindelse angår vacciner omfattende isolerede OMV'er, meningococ-OMP af klasse 1, fragmenter af OMP (f.eks. fremstillet ved anvendelse af cyanogenbromid) 15 og oligopeptider, som bærer epitoper af OMP, fremstillingen af isolerede OMV'er, rene ydermembranproteiner af klasse 1 ved anvendelse af mutantstammer, som ikke eksprimerer yder-membranproteinet af klasse 2/3, fremstillingen af isolerede OMV’er og rene ydermembranproteiner af klasse 1 ved hjælp 20 af klonet DNA i rekombinant-DNA-ekspressionsvektorer. Den foreliggende opfindelse angår ligeledes anvendelsen af genetisk konstruktion med det formål at producere isolerede OMV'er, OMP af klasse 1 eller dele deraf, genetiske fusioner af OMP af klasse 1, dele eller epitoper deraf samt fremstil^ 25 lingen af multivalent ydermembranvaccine af klasse 1 ved peptidsyntese, da epitoperne med en kort peptidkæde kan fremstilles syntetisk.

Det har vist sig, at meningococydermembranproteiner af klasse 1 frembringer en stærk, baktericid immunreaktion 30 mod de stammer, som indeholder de rigtige undertypeepitoper, uanset om disse er fra stammer fra grupperne A, B, C, W-135 og Y. Polysaccharidvaccinen kan forstærkes eller erstattes af en vaccine ifølge opfindelsen som en vaccine med bred, ekstensiv virkning imod de fleste serotyper. De beskyttende, 35 baktericide, monoklonale antistoffer, som er specifikke for ydermembranproteinet af klasse 1, reagerer kraftigt med

I DK 175788 B1 I

I I

H fragmenter, som er blevet fraspaltet, og korte, syntetiske I

peptider, som er blevet fremstillet ved anvendelse af amino- I

syresekvensen i ydermembranproteiner af klasse l. Da meningo- I

H cocsygdom for tiden hovedsageligt forårsages af meningococci I

5 af gruppe B, og da ydermembranproteiner af klasse 1, som I

forekommer i meningococci af gruppe B, også forekommer i I

meningococci fra grupperne A, C, W-135 og Y, er vacciner I

ifølge opfindelsen, som omfatter én eller flere OMP-epitoper I

af klasse 1 stammende fra gruppe B af N. meningitidis, effek- I

10 tive til forhindring af sygdom forårsaget af gruppe A, C, I

W-135 og Y. Fortrinsvis starter fremstillingen af en sådan I

vaccine ud fra mindst to forskellige, immunogene og beskyt- I

tende epitoper, som er blevet udvalgt på grundlag af epide- I

miologiske grunde. Vacciner ifølge opfindelsen omfatter I

I 15 f.eks. mindst ét protein, som er opnået enten i OMV-formule- I

ring eller ved rensning ud fra mutantstammer, som producerer I

I ét eller flere OMP af klasse 1, eller mindst to fragmenter I

fremstillet ved en cyanogenbromidfragmentering eller mindst I

to syntetiske peptider, udvalgt blandt ca. 10 hovedepitoper, I

I 20 eller produkter, som er opnået ved genekspression via rekom- I

binant-DNA-teknologi, og som indeholder de ønskede epitoper. I

I Til maksimering af effektiviteten imod et bredt område af I

meningococstammer er vaccinen jo bedre, jo større antallet I

af forskellige beskyttelsesepitoper er. Desuden kan vac- I

I 25 cinerne ifølge opfindelsen med fordel indeholde polysac- I

charider fra meningococci A og C eller eventuelt W-135 og Y I

og/eller detergenter. Fortrinsvis er polysacchariderne A og I

I 'C covalent koblet til et protein- eller polypeptidbærestof. I

Disse bærestoffer omfatter f.eks. isoleret OMV, OMP-protein I

I 30 af klasse 1, T-hjælperepitoper, bakterietoxiner, toxoider, · I

ikke-toksiske mutanter (CRM'er), rekombinantflagellin fra I

I Salmonella og viruspartikler, såsom protein fra rotavirus I

I VP6, overfladeantigen fra hepatitis B eller proteiner fra I

parvovirus VP1 og VP2. Både zwitterionogene, kationogene, I

I 35 anionogene og ikke-ionogene detergenter kan anvendes. Ek- I

sempler på sådanne detergenter er "Zwittergent 3-10", "Zwit- I

9 DK 175788 B1 i | i tergent 3-14" (N-tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammoniak-l-propan-sulfonat), "Tween® 20", natriumdeoxycholat, natriumdecholat og octylglucosid. Vaccinerne ifølge opfindelsen kan også indeholde et adsorptionsmiddel, såsom aluminiumhydroxid, 5 calciumphosphat eller med fordel aluminiumphosphat. Fragmenterne, proteinerne og peptiderne kan også være behandlet i immunostimulerende komplekser (ISCOMS), liposomer eller mikrokugler til frigivelse og/eller anvendelse som et hjælpestof eller i forbindelse med andre hjælpestoffer, således 10 at der opnås større immunogenicitet.

Den foreliggende opfindelse angår isoleret OMV, praktisk taget rene meningococydermembranproteiner af klasse 1 (af en vilkårlig undertype) og fragmenter af proteinerne indeholdende epitoper deraf. Fragmenterne kan være vilkårlige 15 dele, som har en molekylvægt på 25kD eller derunder, og som indeholder epitoper, som bindes af beskyttende, baktericide antistoffer imod N. meningitidis. Disse omfatter proteolyti-ske -fragmenter og syntetiske oligopeptider, som udgøres af aminosyresekvenser, som i det mindste delvis svarer til 20 epitoper af et OMP af klasse 1.

De isolerede OMV'er, OMP af klasse 1, fragmenter i eller epitopholdige oligopeptider stammende derfra kan være j sammensat af aminosyresekvenser, som er forskellige, men som er praktisk taget biologisk ækvivalente til de naturligt 25 forekommende sekvenser. Disse sekvenser kan omfatte sekvenser, hvori funktionelt ækvivalente aminosyrerester erstatter rester i sekvensen, hvilket resulterer i en tavs ændring.

F.eks. kan én eller flere aminosyrerester i sekvensen være erstattet af en anden aminosyre med en tilsvarende polaritet, 30 som virker som et funktionelt ækvivalent, hvilket resulterer i en tavs ændring. Erstatninger for en aminosyre i sekvensen kan udvælges blandt andre medlemmer af den klasse, hvortil aminosyren hører. F.eks. omfatter de ikke-polære (hydrofobe) aminosyrer glycin, alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, 35 phenylalanin, tryptophan og methionin. De polære, neutrale aminosyrer omfatter serin, threonin, cystein, tyrosin, aspa-

I DK 175788 B1 I

I 10 I

ragin og glutamin. De ladede (basiske) aminosyrer omfatter I

arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) amino- I

syrer omfatter asparaginsyre og glutaminsyre. I

Desuden kan isolerede OMV'er, OMP af klasse 1, frag- I

5 menter eller oligopeptider være modificeret til konjugering I

til andre molekyler (f.eks. ved tilknytning af koblingsgrup- I

per, såsom aminosyrerne cystein og/eller lysin, eller andre I

forbindelsesgrupper og/eller afstandsgivende grupper), her- I

under et andet OMP af klasse 1 fra en forskellig undertype, I

10 T-celleepitoper, B-celleepitoper, bærestofpeptider eller I

-proteiner eller adjuvansmolekyler. I

Som detaljeret beskrevet i det følgende kan OMP af I

I klasse l, fragmenter eller oligopeptider anvendes i mange I

forskellige former (f.eks. alene, i blandinger eller som I

15 konjugater og genetiske fusioner produceret ud fra rekom- I

binant-DNA-vektorer) i vacciner. Til disse formål kan mate- I

rialerne fremstilles ved isolering fra N. meningitidis, ved I

proteolytisk digerering, ved kemisk syntese eller ved eks- I

I pression som rekombinantmolekyler. Fremstillingsmetoderne I

20 og anvendelsesmetoderne for det isolerede OMV'er, OMP af I

klasse 1 og fragmenterne og oligopeptiderne af OMP af klasse I

1 er beskrevet i det følgende. I

Proteinmodelanalyse og strukturanalyse af OMP'er af I

H klasse 1 er blevet gennemført ved anvendelse af principperne I

I 25 for adskillige ydermembranproteiner fra E. coli, jvf. Η. I

I Vogel et al., J. Mol. Bio., 190. 191 (1986); T. Ference et I

I al., J. Mol. Bio., 201. 493 (1988); J. Tommassen i "Membrane I

I Biogenesis", NATO ASI Series H16, side 351, Springer-Verlag,

NY (1988). De afledte aminosyresekvenser i OMP'er af klasse I

30 1 er blevet anvendt til modelstudierne og sammenligninger. I

Aminosyresekvenshomologd,en er blevet sammenlignet med pore- I

proteiner fra andre, gramnegative bakterier, og ligheden er I

blevet fastslået for proteinstrukturen. Blottede overflade-

sløjfer og transmembranstrukturen er meget ens for lig disse H

35 poreproteiner. Med den fremskaffede information angående H

beskyttende epitoper af N. meningitidis med variabel og H

» 11 DK 175788 B1 konstant region og deres struktur kan man baseret på aminosy-resekvensen forudsige, hvor beskyttende epitoper kan befinde sig for andre, patogene, gramnegative bakterier, som skal vurderes og medtages i vacciner imod disse bakterier.

5

Fremstilling af isolerede OMV'er.

OMV'er kan fremstilles ud fra den ovenstående kulturvæske eller ud fra bakteriecellerne efter fragmentering som beskrevet af Beuvery et al. (1983), loc. cit. OMV'er, som 10 bærer proteiner fra mere end én meningococcus, kan isoleres fra stammer, som er manipuleret til ekspression af heterologe proteiner.

Fremstilling og rensning af OMP af klasse 1 og CNBr-frag-15 menter deraf.

Ydermembranproteiner af klasse 1 og klasse 3 kan isoleres som beskrevet af E.C. Beuvery et al., Antonie wan Leeuvenhoek J. Microbiol. 52., 232 (1986). Fremstillingen af praktisk taget rent OMP af klasse 1, som er frit for OMP'er 20 af klasse 2 eller 3, opnås ved denne metode ved anvendelse af meningococmutantstammer, som ikke eksprimerer OMP af klasse 2/3. En foretrukket stamme til fremstilling af OMP ! af klasse 1 er stammen HIII5, deponeret som CBS 636.89.

Fragmenter kan fremstilles ved cyanogenbromidspaltning 25 som beskrevet af T. Teerlink et al., J. Exp. Med. 166. 63 (1987), for et gonococprotein. Det N-terminale fragment betegnes som CB-1, og det C-terminale fragment betegnes som CB-2. Disse CNBr-fragmenter kan renses via HPLC med omvendt fase på en kolonne med "Vydax C4" eller med "Aquapor R-300" 30 ved anvendelse af en vand/acetonitril-gradient. Alternativt kan fragmentet renses ved flere ganges udfældning med kold ' trichloreddikesyre. Disse metoder fjerner mere end 95% af indgribende urenheder (f.eks. puffersalte, detergenter og fragmenturenheder).

35

I DK 175788 B1 I

I 12 I

Fremstilling af fragmenter oa oligopeptider indeholdende I

epitoper af OMP af klasse 1. I

A. Fremstilling ved proteolytisk digerering. I

Oligopeptider indeholdende epitoper, som er reaktive I

5 med baktericide antistoffer imod N. meningitidis, kan frem- I

stilles ved digerering af OMP af klasse 1, CB-1- eller CB- I

2-fragmenter med proteinaser, såsom endoLys-C, endoArg-C, I

endoGlu-C og Staphylococcus V8-protease. De digererede frag- I

I menter kan f .eks. renses ved teknikken med væskechromatografi I

I 10 med høj ydeevne (HPLC). I

B. Fremstilling ved kemisk syntese. I

I Oligopeptider ifølge opfindelsen kan syntetiseres I

I ved standardpeptidsyntese i fast fase, jvf. G. Barany og I

I 15 R.B. Merrifield, The Peptides 2, 1-284, E. Gross og J. Meien- I

I hofer, udg., Academic Press, New York, ved anvendelse af I

I tert.-butyloxycarbonylaminosyrer og pheriylacetamidomethylhar- I

I pikser, jvf. A.R. Mitchell et al., J. Org. Chem. 43, 2845- I

I 2852 (1978), eller 9-fluorenylmethyloxycarbonylaminosyrer I

I 20 på en polyamidbærer, jvf. A. Dryland og R.C. Sheppard, J. I

I Chem. So. Perkin Trans. I, 125-137 (1986). Alternativt kan I

I syntetiske peptider fremstilles ved pepscansyntese, jvf. H.M. I

I Geysen et al., J. Immunol. Methods 03» 259 (1987); Proc. I

I Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998 (1984), Cambridge Research I

I 25 Biochemicals, Cambridge, GB, eller ved standardpeptidsyntese I

i væskefase. Udeladelsen eller ombytningen af aminosyrer I

I (herunder også forlængelser og tilføjelser til aminosyrer) I

I på andre måder, som ikke i væsentlig grad forringer oligopep- I

I tidets immunologiske egenskaber, er også anvendelige. I

I 30 C. Fremstilling ved rekombinant-DNA-teknik. | I

I OMP af klasse 1, fragmenter og oligopeptider, som ! I

I fremviser epitoper i OMP af klasse 1, kan fremstilles ved I

I rekombinant-DNA-teknik. Almindeligvis indebærer dette op- I

I nåelse af DNA-sekvenser, som koder de ønskede OMP-, jvf. I

I 35 Barlow et al., (1989) Mol. Micro., 3, 131, fragment- eller I

I oligopeptidsekvenser, og at én eller flere identiske eller I

I I

13 DK 175788 B1 ' forskellige DNA-sekvenser af OMP'er fra klasse l indføres i et hensigtsmæssigt vektor/vært-ekspressionssystem, hvor de eksprimeres. Denne DNA kan bestå af det gen, som koder OMP af klasse 1, eller et vilkårligt segment af genet, som koder 5 en funktionel epitop i OMP. Denne DNA kan være fusioneret til DNA, som koder andre antigener i N. meningitidis (såsom andre ydermembranproteiner fra enten samme eller en anden klasse) eller antigener fra andre bakterier, vira, parasitter eller svampe, til skabelse af genetisk fusionerede (der deler 10 en fælles peptidrygrad), multivalente antigener. F.eks. kan OMP-fragmenter af klasse 1 være fusioneret til et andet ydermembranprotein af klasse 1 fra en anden undertype (eller fragmenter eller epitoper derfra) af N. meningitidis til opnåelse af fusionsproteiner omfattende flere ydermembranpro-15 teinundertypedeterminanter af klasse 1.

: Genetisk konstruktionsteknik kan også anvendes til 1 karakterisering, modifikation og/eller tilpasning af de kodede peptider eller proteiner, f.eks. steddirigeret muta-genese til modifikation af et OMP-fragment i regioner uden 20 for de beskyttende domæner, f.eks. til forøgelse af underfragmentets opløselighed for at tillade lettere rensning.

DNA kan også være manipuleret til gennemførelse af superproduktion af OMP-fragmenter eller kombinationer deraf i forskellige organismer.

25 DNA, som koder et OMP af klasse 1, fragmenter eller oligopeptider, kan syntetiseres eller isoleres og sekvenseres som beskrevet af A.K. Barlow et al., Infect. Immune 55, 2734-40 (1987), Barlow et al., (1989) Mol. Micro., 3, 131.

OMP-gener af klasse 1 kan forstærkes ud fra bakterie-DNA 30 ved metoderne ifølge Mullis og Faloona, (1987) Method. Enzym.

155. 335-350, ved anvendelse af de her beskrevne primersekvenser. Beslægtede DNA-sekvenser for OMP af klasse 1 af andre undertyper kan opnås ved hjælp af de beskrevne metoder og de afledte aminosyresekvenser.

35 En mangfoldighed af vært-vektor-systemer kan anvendes til ekspression af oligopeptiderne ifølge opfindelsen. Pri-

DK 175788 B1 I

I I

H mært skal vektorsystemet være foreneligt med den anvendte I

H værtscelle. Vært/vektor-systemer omfatter, men er ikke be- I

, grænset til følgende: bakterier transformeret med bakterio- I

H fag-DNA, plasmid-DNA eller cosmid-DNA; mikroorganismer, I

H 5 såsom gær indeholdende gærvektorer,· pattedyrcel lesystemer I

H inficeret med virus (f.eks. vacciniavirus og adenovirus); I

insektcellesystemer inficeret med virus (f.eks. baculoviurs). I

H Ekspressionselementerne i disse vektorer varierer i deres I

styrke og specificiteter. Afhængigt af det anvendte vært- I

10 vektor-system kan et vilkårligt af en række egnede trans- I

skriptions- og translationselementer anvendes. I

H Til opnåelse af effektiv ekspression af den klonede I

DNA skal en promotor være til stede i ekspressionsvektoren. I

RNA-polymerase binder normalt til promotoren og initierer I

15 transskription af et gen eller en gruppe af forbundne gener I

og regulerende elementer (betegnet en operon). Promotorer I

varierer i deres "styrke", dvs. deres evne til at fremme I

transskription. Det er ønskeligt at anvende stærke promotorer I

til opnåelse af et højt transskriptionsniveau og derfor et I

20 højt DNA-ekspressionsniveau. Afhængigt af værtscellesystemet I

kan en vilkårlig af en række egnede promotorer anvendes. I

For E. coli, dens bakteriofager eller plasmider kan f.eks. I

sådanne promotorer som lac-promotoren, trp-promotoren, recA- I

promotoren, den ribosomale RNA-promotor og PR- eller PL- I

25 promotorer fra colifag-lambda og andre, herunder, men ikke I

I begrænset til f.eks. lacUV5, ompF, bla og lpp, anvendes til I

dirigering af høje transskriptionsniveauer af tilstødende I

I DNA-segmenter. Desuden kan en trp-lacUV5-hybridpromotor I

I (tac) eller andre promotorer for E. coli fremstillet ved I

I 30 rekombinant-DNA-teknik eller en anden teknik til syntese af I

H DNA anvendes til tilvejebringelse af transskription af den I

indsatte DNA. I

Der kan udvælges bakterieværtsceller og ekspressions- I

vektorer, som inhiberer promotorens virkning, medmindre de I

35 specifikt bliver tilskyndet. I visse operoner er tilsætningen I

af specifikke tilskyndere nødvendig til effektiv transskrip- I

3.5 DK 175788 B1 tion af den indsatte DNA, f.eks. tilskyndes lac-operonen ved tilsætningen af lactose eller IPTG (isopropylthio-beta-D-galactosid). En mangfoldighed af andre operoner, f.eks. trp, er under forskellige kontroller, trp-operonen tilskyn-5 des, når tryptophan mangler i vækstmediet, og PL-promotoren , fra lambda kan tilskyndes ved hjælp af en temperaturforøgelse i værtsceller, som indeholder en temperaturfølsom lambda-repressor, f.eks. cI857. På denne måde kan mere end 95% af den promotordirigerede transskription inhiberes i ikke-til-10 skyndede celler. Derved kan ekspression af rekombinantpep-tidet eller -proteinet kontrolleres. Dette er vigtigt, hvis ekspressionsproduktet af DNA er dødeligt eller skadeligt for værtscellerne. I sådanne tilfælde kan transformanter dyrkes under sådanne betingelser, at promotoren ikke tilskyn-15 des, hvorefter promotoren, når cellerne når en passende tæthed i vækstmediet, kan tilskyndes til produktion af proteinet.

Et sådant promotor/operator-system er "tac"- eller trp-lac-promotor/operator-systemet, jvf. Russell og Bennett, 20 1982, Gene 20, 2312-243; EP offentliggørelsesskrift nr.

67.540. Denne hybridpromotor er konstrueret ved kombination af de -35 basepar (regionen -35) i trp-promotoren og de -10 basepar (regionen -10 eller Pribnow-kassen) i lac-promotoren (de DNA-sekvenser, som er RNA-polymerasebindingsstedet).

25 Til opretholdelse af de stærke promotoregenskaber hos trypto-phanpromotoren er tac desuden også kontrolleret ved hjælp af lac-repressoren.

Ved kloning i en eukaryotisk værtscelle kan der til forøgelse af transskriptionseffektiviteten indsættes forstær-30 kersekvenser (f.eks. tandemgentagelsen på 72 bp i SV40-DNA eller de lange, terminale retrovirusgentagelser eller LTR'-er). Forstærkersekvenser er et sæt af eukaryotiske DNA-ele-menter, som ser ud til at forøge transskriptionseffektiviteten på en måde, som er relativt uafhængig af deres stilling 35 og orientering i forhold til et nærliggende gen. Til forskel fra de klassiske promotorelementer (f.eks. polymerasebin-

DK 175788 B1 I

dingsstedet eller Goldberg-Hogness "TATA"-kassen), som skal I

være placeret umiddelbart 5' i forhold til genet, har for- H

stærkersekvenser en bemærkelsesværdig evne til at fungere H

imod strømmen fra, inden i eller med strømmen fra eukaryoti- H

5 ske gener, og derfor er forstærkersekvensens stilling i H

forhold til den indsatte DNA mindre,kritisk. I

Specifikke initieringssignaler er også nødvendige H

til effektiv gentransskription og translation i prokaryotiske H

celler. Disse transskriptions- og translationsinitieringssig- H

10 naler kan variere i "styrke" som målt ved den syntetiserede H

mængde af henholdsvis genspecifik budbringer-RNA og protein. I

DNA-ekspressionsvektoren, som indeholder en promotor, kan H

ligeledes indeholde en vilkårlig kombination af forskellige, I

"stærke" transskriptions- og/eller translationsinitierings- I

15 signaler. F.eks. kræver effektiv translation i E. coli en I

Shine-Dalgarno-sekvens (SD) ca. 7-9 baser 5' i forhold til I

initieringscodonen (ATG) til tilvejebringelse af et ribosom- I

bindingssted. Der kan derfor anvendes en vilkårlig SD-ATG- I

kombination, som kan udnyttes af værtcelleribosomer. Sådanne I

20 kombinationer omfatter, men er ikke begrænset til SD-ATG- H

kombinationen fra cro-genet eller N-genet i colifag-lambda H

! eller tryptophangenerne E, D, C, B eller A fra E. coli. H

Desuden kan enhver SD-ATG-kombination, som er frem- H

stillet ved rekombinant-DNA-teknik eller andre teknikformer, H

25 som indebærer inkorporering af syntetiske nucleotider, anven- I

des.

Enhver af de metoder, som er beskrevet til indsættel- I

sen af DNA i en ekspressionsvektor, kan anvendes til ligate- H

ring af en promotor og andre, genetiske kontrolelementer

30 ind i specifikke steder i vektoren. Sekvenser fra N. meningi- I

tidis til ekspression kan ligateres ind i en ekspressionsvek- I

tor på et specifikt sted i relation til vektorpromotoren og I

kontrolelementerne, således at den fremmede, genetiske se- I

kvens, når rekombinant-DNA-molekylet indføres i en værtscel- H

35 le, kan eksprimeres (dvs. transskriberes og translateres) af H

værtscellen. H

17 DK 175788 B1

Rekombinant-DNA-vektoren kan indføres i hensigtsmæssige værtsceller (f.eks. bakterier, virus, gær eller pattedyrceller) ved transformation, transduktion eller transfek-tion (afhængigt af vektor/værtscelle-systemet). Værtsceller 5 indeholdende vektoren udvælges på basis af ekspressionen af ét eller flere hensigtsmæssige genmærkestoffer, som normalt er til stede i vektoren, såsom ampicillinresistens eller tetracyclinresistens i pBR322 eller thymidinkinaseaktivitet i eukaryotiske værtssystemer. Ekspressionsvektorer kan stamme 10 fra kloningsvektorer, som sædvanligvis indeholder en mærkestof funktion. Sådanne kloningsvektorer kan omfatte, men er ikke begrænset til følgende: SV40 og adenovirus, vaccinia-virusvektorer, insektvira, såsom baculovira, gærvektor, bakteriofagvektorer, f.eks. lambda-gt-WES-lambda-B, Charon 15 28, Charon 4A, lambda-gt-l-lambda-BC, lambda-gt-l-lambda-B, M13mp7, M13mp8 og M13mp9, eller plasmid-DNA-vektorer, f.eks. pBR322, pAC105, pVA51, pACYC177, pKH47, pACYC184, pUBHO, pMB9, pBR325, Col El, pSCIOl, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl, RP4 og pBR328.

20 Ekspressionsvektorer indeholdende DNA-indsætningerne kan identificeres ved tre almene metoder: (1) DNA-DNA-hybri-disering ved anvendelse af sonder omfattende sekvenser, som er homologe til det indsatte gen; (2) nærvær eller fravær af "mærkestof"-genfunktioner (f.eks. antibiotikaresistens, 25 transformationsphenotype og thymidinkinaseaktivitet) ; (3) ekspression af indsatte sekvenser baseret på de fysiske, immunologiske eller funktionelle egenskaber hos genproduktet.

Når først en formodet rekombinantklon, som eksprimerer en ønsket aminosyresekvens i OMP af klasse 1, er identifice-30 ret, kan genproduktet analyseres som følger. Immunologisk analyse er særligt vigtig, fordi slutmålet er at anvende genprodukterne i vaccineformuleringer og/eller som antigener ved diagnostiske immunoafprøvninger. Det eksprimerede peptid eller protein må være immunoreaktivt med baktericide anti-35 stoffer imod N. meningitidis. Denne reaktivitet kan påvises ved immunologisk standardteknik, såsom radioimmunoudfældning,

I DK 175788 B1 I

I I

radioimmunkonkurrence, ELISA eller immunopletter. I

Når først genproduktet er identificeret som et OMP- I

fragment af klasse 1 eller et oligopeptid indeholdende en I

funktionel epitop deri, kan det isoleres og renses ved stand- I

5 ardmetoder, herunder chromatografi (f.eks. ionbytnings-, af- I

finitets- og størrelseskolonnechromatografi), centrifuge- I

ring, forskellig opløselighed eller ved en vilkårlig anden I

standardteknik til rensningen af proteiner. Der eksisterer I

adskillige teknikformer til rensning af heterologt protein I

10 fra prokaryotiske celler, se f.eks. US patentskrifterne nr. I

I 4.518.526, 4.599.197 og 4.734.362. Det fremstillede, rensede I

præparat må imidlertid være praktisk taget frit for værtstox- I

I iner, som kunne være skadelige for mennesker. Især må det I

rensede peptid eller protein, når det er eksprimeret i gram- I

15 negative bakterieværtsceller, såsom E. coli eller Salmonella, I

I være praktisk taget frit for endotoxinforurening. I

OMP af klasse 1, fragmenter og oligopeptider ifølge I

I opfindelsen kan formuleres som univalente og multivalente I

I vacciner. Disse materialer kan anvendes, således som de er I

I 20 fremstillet eller isoleret ved de ovenfor beskrevne metoder. I

De kan være blandet, konjugeret eller fusioneret med andre I

antigener, herunder B- eller T-celleepitoper fra andre anti- I

I gener. Desuden kan de være konjugeret til et bærestofprotein I

I som beskrevet i det følgende for oligopeptider. I

25 Nar der anvendes et haptenisk oligopeptid {dvs. et I

I peptid, som reagerer med cognatantistoffer, men som ikke I

i . selv kan udløse en immunreaktion) , kan det være konjugeret ! .

I til et immunogent bærestofmolekyle. Konjugering til et im- j. I

munogent bærestof kan gøre oligopeptidet immunogent. Konju- I

I 30 geringen kan gennemføres ved standardmetoder. Foretrukne I

I bærestofproteiner for de hapteniske oligopeptider er toxiner, I

I toxoider eller vilkårligt krydsreaktivt mutantmateriale I

I ' (CRM) af toxinet fra Tetanus, Diphtheria, Pertussia, Pseudo- I

I monas, E. coli, Staphylcoccus og Streptococcus. Et især I

I 35 foretrukket bærestof er CRM197 fra diphtheriatoxin, stammende I

I fra stammen C7(E 197) af P. diphtheriae, som producerer I

19 DK 175788 B1 CRM1g7-protein. Denne stamme har ATCC accesionsnummer 53281.

Alternativt kan der anvendes et fragment eller en epitop af I

bærestofproteinet eller et andet immunogent protein. F.eks. kan haptenen være koblet til en T-celleepitop fra et bak-5 terietoxin, -toxoid eller CRM, se DK patentansøgning nr.

1829/90 med benævnelsen "T-celleepitoper og oligopeptider, deres anvendelse i immunogene konjugater og immunokonjugater i samt vacciner indeholdende disse konjugater", hvortil der i her skal henvises. Andre bærestoffer omfatter viruspartikler j 10 sammensat af rotavirus VP6, overfladeantigen fra hepatitis B eller parvovirus VP1 og VP2.

Peptiderne eller proteinerne ifølge opfindelsen kan indgives som multivalente underenhedsvacciner i kombination j med antigener fra N. meningitidis eller antigener fra andre i 15 organismer. Nogle af disse andre organismer omfatter f.eks. de pathogene bakterier H. influenzae, N. meningitidis, B. catarrhalis, N. gonorrheae, E. coli og S. pneumoniae. De kan f.eks. indgives i forbindelse med ol.igo- eller polysac-charidkapselkomponenter fra N. meningitidis. Kapselkomponen-20 terne kan stamme fra en vilkårlig af de serologiske grupper, herunder A, B, C, D, X, Y, Z, 29E og W135.

Ydermembranproteiner af klasse 1 af forskellige undertyper kan anvendes. Disse kan anvendes i kombination til fremkaldelse af baktericide antistoffer imod N. meningitidis.

25 F.eks. kan et fragment stammende fra et ydermembranprotein af klasse 1 fra undertypen Pi.7,16 anvendes sammen med ydermembranproteiner eller fragmenter af ydermembranproteiner fra andre undergrupper, såsom Pl.l, PI.1,16, pi.2, pi. 6, pi. 9, pi.15, pi.16 eller pi.4, jvf. H. Abdillahi et al., 30 1988, Micro. Pathog. 4, 27, eller sammen med meningococpoly- saccharider i blandinger eller som kemiske konjugater. Til kombineret indgivelse med epitoper fra andre ydermembranproteiner kan de indgives separat, som en blanding eller som et konjugat eller genetisk fusionspeptid eller -protein.

35 Konjugaterne kan dannes ved standardteknik til kobling af proteinholdige materialer eller teknik til kobling af sac- i

I DK 175788 B1 I

I 20 I

I charidpolymere til proteiner. Fusioner kan eksprimeres fra B

B fusionerede genkonstruktioner fremstillet ved rekombinant- B

DNA-teknik som beskrevet. B

B Som nævnt kan OMP af klasse 1, et fragment eller B

B 5 oligopeptider stammende derfra anvendes i forbindelse med B

B antigener (f.eks. polymerkapsler eller saccharidenheder, B

B hylster- eller overfladeproteiner) fra andre patogene or- B

B ganismer (f.eks. bakterier (indkapslet eller ikke-indkaps- B

B let), vira, svampe og parasitter). Yderligere eksempler på B

B 10 andre organismer omfatter respiratorisk syncytialt virus, B

B rotavirus, malariaparasitter og Cryptococcus neoformans. B

B Ved formulering af vaccinepræparaterne med peptidet B

B eller proteinet, alene eller i de forskellige, beskrevne B

B kombinationer, indstilles immunogenet på en hensigtsmæssig fl

B 15 koncentration og formuleres med et vilkårligt egnet vaccine- B

B hjælpestof. Egnede hjælpestoffer omfatter, men er ikke be- B

B grænset til overfladeaktive stoffer, f.eks. hexadecylamin, B

B octadecylamin, octadecylaminosyreestere, lysolecithin, dime- B

B thyldioctadecylammoniumbromid, methoxyhexadecylglycerol og B

B 20 pluroniske polyoler; polyaminer, f.eks. pyran, dextransul- B

B fat, poly IC og "Carbopol®" ,· peptider, f.eks. .muramyldipeptid B

B og derivater deraf, dimethylglycin, tuftsin; olieemulsioner B

B og mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroxid, aluminiumphosphat; B

B lymphokiner og immunstimulerende komplekser (ISCOMS). Im- B

B 25 monogenet kan også inkorporeres i liposomer, mikrokugler B

B eller konjugeres til polysaccharider og/eller andre polymere B

B til anvendelse i en vaccineformulering. B

B Vaccinerne kan indgives til et menneske eller dyr på B

B en mangfoldighed af måder. Disse omfatter intradermale, in- B

B 30 tramuskulære, intraperitoneale, intravenøse, subcutane, B

B orale og intranasale indgivelsesveje. B

B Levende vacciner« B

B Peptiderne og proteinerne ifølge opfindelsen kan B

B 35 indgives som levende vacciner. Med dette formål for øje B

B fremstilles rekombinantmikroorganismer, som eksprimerer B

21 DK 175788 B1 peptiderne eller proteinerne. Vaccinerecipienten podes med rekombinantmikroorganismen, som multiplicerer i recipienten, eksprimerer OMP af klasse 1, et fragment eller oligopeptid deraf og fremkalder en immunreaktion imod N. meningitidis.

5 Levende vaccinevektorer omfatter adenovirus, cytomegalovirus og fortrinsvis koppevira, såsom vaccinia {US patentskrift nr. 4.603.112) og svækkede Salmonella-stammer (US patentskrift nr. 4.550.081 og Curtiss et al.. Vaccine 6, 155-160 (1988)). Desuden kan OMP-epitoper af klasse 1 inkorporeres 10 i flagellerne i svækkede bakteriestammer.

Levende vacciner er særligt fordelagtige, fordi de fører til en langvarig stimulans, som kan give en i alt væsentligt langvarig immunitet. Når immunreaktionen beskytter imod efterfølgende infektion af N. meningitidis, kan den 15 levende vaccine anvendes som sådan i en præventiv vaccine imod N. meningitidis.

Multivalente, levende vacciner kan fremstilles ud fra en enkelt eller nogle få rekombinantmikroorganismer, som eksprimerer forskellige epitoper i N. meningitidis 20 (f.eks. andre ydermembranproteiner fra andre undertyper eller epitoper deraf) . Desuden kan epitoper fra andre, patogene mikroorganismer inkorporeres i vaccinen. F.eks. kan et vacciniavirus konstrueres, således at det indeholder kodesekvenser fra andre epitoper ud over dem fra N. meningitidis.

25 Et sådant rekombinantvirus kan i sig selv anvendes som im-munogenet i en multivalent vaccine. Alternativt kan en blanding af vacciniavirus eller andre vira, som hver især eksprimerer et forskelligt gen, som koder for forskellige epitoper i ydermembranproteiner fra N. meningitidis og/eller epitoper 30 fra andre, sygdomsforårsagende organismer, formuleres som en multivalent vaccine.

Der kan fremstilles en inaktiveret virusvaccine. Inaktiverede vacciner er "dræbt", dvs. smitsomheden er blevet ødelagt, sædvanligvis ved kemisk behandling, f.eks. formal-35 dehydbehandling. Ideelt ødelægges virusets smitsomhed uden påvirkning af de proteiner, som bærer virusets immunogenici-

I DK 175788 B1 I

I 22 I

I tet. Til fremstilling af inaktiverede vacciner dyrkes store I

mængder af det rekombinantvirus, som eksprimerer de ønskede I

epitoper, i kultur til tilvejebringelse af den nødvendige I

I mængde af relevante antigener. En blanding af inaktiverede I

I 5 vira, som eksprimerer forskellige epitoper, kan anvendes I

I til formuleringen af "multivalente" vacciner. I visse til- I

fælde kan disse "multivalente", inaktiverede vacciner være I

at foretrække frem for levende vaccineformuleringer på grund I

af potentielle vanskeligheder, som stammer fra gensidig I

10 interferens mellem levende vira, som indgives sammen. I I

hvert enkelt tilfælde kan det inaktiverede virus eller bian- I

dingen af vira formuleres i et egnet hjælpestof til forøgelse I

I af den immunologiske reaktion på antigenerne. Egnede hjælpe- I

I stoffer omfatter, men er ikke begrænset til overfladeaktive I

I 15 stoffer, f.eks. hexadecylamin, octadecylamin, octadecylami- I

nosyreestere, lysolecithin, dimethyldioctadecylammoniumbro- I

mid, N,N-dioctadecyl-N',N'-bis-(2-hydroxyethylpropanamin), I

methoxyhexadecylglycerol og pluroniske polyoler,· polyaminer, I

f.eks. pyran, dextransulfat, poly IC og "Carbopol®",·. pep- I

H 20 tider, f.eks. muramyldipeptid og derivater deraf, dimethyl- I

I glycin, tuftsin,· olieemulsioner og mineralgeler, f.eks. I

aluminiumhydroxid, aluminiumphosphat, og lymphokiner.

Eksemplificering. I

25 Eksempel 1. I

Monoklonale antistoffer imod OMP'er af klasse 1 og deres I

biologiske aktivitet.

Typespecifikke, monoklonale antistoffer fremstilles I

imod forskellige meningococydermembranproteiner af klasse I

H 30 1. Disse monoklonale antistoffer erkender følgende under- I

typer: Pl.l; PI.2; PI.6; PI.7; PI.9; PI.10; PI.15; PI.16 og I

PI.17 (nu betegnet PI.14). De monoklonale antistoffer er I

tilgængelige som "Monoklonal Kit Serotyping Meningococci" I

fra RIVM, Bilthoven, NL. Alle disse monoklonale antistoffer I

35 reagerer med protein denatureret med SDS (natriumdodecylsul- I

fat), når de afprøves ved Wester-pletdannelse. Det har også I

23 DK 175788 B1 vist sig, at en række af disse monoklonale antistoffer reagerer med et CNBr-fragment på 25kD fra ydermembranproteinet af klasse 1 på 42kD (se nedenfor). Dette resultat indebærer, at ydermembranproteinepitoperne af klasse 1 hovedsageligt 5 er af den lineære type, og de kan derfor kopieres med syntetiske peptider. De epidemiologiske resultater af forsøg gennemført af ansøgeren har vist, at de beskrevne, monoklonale antistoffer kan undertypebestemme de fleste meningococci fra grupperne A, B og C, hvilket antyder en begrænset hetero-10 genitet. Ethvert ydermembranprotein af klasse 1 ser også ud til at indeholde to individuelle, typespecifikke epitoper, jvf. H. Abdillahi et al., 1988, Micro. Pathog. 4, 27-32; idem, FEMS Microbiol. Immunol. 47., side 139-144.

Det rensede ydermembranprotein af klasse 1 (se neden- i 15 for), undertype PI.7,16, som stammer fra dyrkningen af mutanten fri for klasse 2/3 (HIII5) , ser ud til at tilskynde en j baktericid antistofreaktion i en serumfortynding på 1:64 i 1 en dosis på 2,5 /xg på mus. De monoklonale antistoffer imod ydermembranproteiner af klasse 1, ydermembranproteiner af 20 klasse 2/3 og lipopolysaccharider fra meningococci er blevet sammenlignet for baktericid virkning. De monoklonale antistoffer imod ydermembranproteinerne af klasse 1 ser ud til at have den stærkste baktericide aktivitet (se tabel I) .

Den bakterielle reaktion er blevet bestemt ifølge J.T. Pool- ; 25 man, (1985), i G.J. Schoolnick et al., udg., "The Pathogenic Neisseriae”, ASM Publications, Washington, D.C., side 562.

i 30 i 35

I DK 175788 B1 | I

I I

I Tabel I

I Baktericid aktivitet af en samling af monoklonale antistoffer I

I rettet imod klasse 1 (cl 1), klasse 2/3 (cl 2/3) og lipopoly- I

I 5 saccharider (LPS) fra meningococci. I

I Forsøgsstamme Baktericid aktivitet af antistofpulje I

I (titer) I

10

I Stamme (Gp:serotype: Cl 2/3- Cl 1- LPS- I

I -pulie- pulje- pulje

I undertype:LPS-type) I

I 3006 (B:26:PI.2:L2) 1000 8000 ND I

I . 15 M981 (B:4PI.- :L5) 10 ND 2000 I

I M990 (B:6:PI.6:L/) 10 2000 ND I

I M978 (B:8:PI.1:LI.8) ND 8000 1000 I

I M982 (B:9:PI.9:L3.7) 500 2000 1000 I

I H355 (B:15:PI.15:LI.8) 1000 8000 1000 I

20 H44/76 (B:15:PI.7.16:L3.7) 1000 8000 4000 I

I ND = ikke bestemt.

I Den baktericide aktivitet af disse monoklonale anti- I

I 25 stoffer ser ud til at korrelere godt med beskyttelsesak- I

I tiviteten in vivo som målt ved rottemeningitismodellen ifølge I

I Saukkonen et al., 1987, Microbial Pathogen 3, 261. I 1

Eksempel ΙΑ I

I 30 Konstruktion af meningococstammer. som bærer multipelgener I

af klasse 1. H

Erstatning af chromosomgener med kloner, svagt for- H

I skellige versioner, er blevet beskrevet for Neisseria gonor- I

rhoea, jvf. D.C. Stein, Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suppl.),

I 35 S146-S149 (1989) . Det har vist sig, at denne metode kan I

I anvendes på genet af klasse 1 i Neisseria meningitidis. Η

H Dette gennemføres på følgende måde: H

I (I) Genet af klasse 1 fra stamme 2996 (undertyppe PI.2) I

klones ind i vektoren pTZ19R, se D.A. Mead et al., I

I 40 Protein Engineering 1_, 67 (1986) . Det komplette gen I

25 DK 175788 B1 er placeret på et Xbal-fragment på 2,2 kb, som liga-teres til Xbal-digereret vektor-DNA.

(II) I det resulterende plasmid anvendes til transformation af stamme H44/76 (undertype PI.7,16) . Celler af accep-5 torstammen inkuberes med plasmid-DNA i nærvær af

Mg2+ 0g normalt meningococmedium. Derefter fortyndes og pletteres de, og de resulterende kolonier afprøves for deres evne til binding af PI. 2-specif ikt, monoklo-nalt antistof. Sådanne transformanter findes med en 10 frekvens på ca. 10"·^. Yderligere karakterisering har

vist, at ombytning af H44/76-genet af klasse 1 faktisk er indtrådt. Et essentielt træk ved metoden er tilstedeværelsen af donorgenet på et cirkulært plasmid-DNA-monokyle, som ikke er i stand til replikering i 15 N. meningitidis, da anvendelsen af lineariseret DNA

ikke har givet nogen transformanter overhovedet.

Konstruktion af en stamme med to gener af klasse 1 er blevet gennemført ved en modifikation af den ovenfor 20 beskrevne metode. Til dette formål er PI.2-genet af klasse 1 blevet indsat i et klonet gen af klasse 5. Genfamilien af klasse 5 har to træk, som gør dem særlig egnet til denne konstruktion, jvf. T.F. Meyer og J.P.M. Van Putten, Clin. Microbiol. Rev., 2 (Suppl.) S139-S145 (1989),: (i) der er 25 fire eller fem gener af klasse 5 til stede i meningococ-genomet, og (ii) ekspression af disse gener er ikke nødvendig til vækst under laboratoriebetingelser. Et gen af klasse 5 klones fra stammen H44/76, og PI.2-genet indsættes i et SphI-sted placeret i eller meget tæt ved genet af klasse 5.

30 Det resulterende hybridplasmid, pMC22, anvendes til transformation af stammen HIII5, en klasse 3-manglende mutant af H44/76. Kolonier, som reagerer med det PI.2-specifikke, monoklonale antistof, isoleres og karakteriseres. Ud af 10 sådanne transformanter har det vist sig, at ni har mistet 35 PI. 16-epitopen i acceptorstammen. Dette viser, at der i alle disse tilfælde kun er indtrådt rekombination mellem

I DK 175788 B1 I

I I

H generne af klasse 1, hvilket har resulteret i undertypeom- H

I bytning. Der er imidlertid blevet fundet én transformant, I

I som har udgjort begge undertyper af klasse 1, dvs. PI.7,16 H

H og PI.2, hvilket antyder, at der må være indtrådt rekombina-

5 tion mellem gensekvenserne af klasse 5 på plasmid og chromo- I

som. Dette er blevet bekræftet ved Wester-pletdannelse, som H

har afsløret tilstedeværelsen af begge typer af protein af H

klasse l, og ved Southern-pletdannelse, som har vist erhver- H

I velsen af et andet gen af klasse 1. I

10 Ved fortsættelse af denne konstruktion med andre H

I undertyper af klasse 1 er det muligt at fremstille en stamme H

med fire eller fem forskellige gener af klasse 1. Samme gen H

af klasse 5 kan anvendes i hvert enkelt efterfølgende trans- H

formationstrin, eller de forskellige gener af klasse 5 kan I

I 15 være kloner og anvendes separat. Disse rekombinantstammer H

I kan anvendes til fremstilling af blanding af forskellige, I

I rensede OMP'er af klasse l. I

Eksempel IB. H

I 20 Rensning af isolerede OMV'er fra bakteriologisk kultur- H

I Rensningen gennemføres ifølge Beuvery et al. (1983), H

H loc. cit.

I Denne kultur kan gennemføres med de ønskede vildtype- H

stammer, meningococmutantstammer uden ydermembranproteiner H

I 25 af klasse 2/3 og/eller homologe og heterologe rekombinantmi- H

kroorganismer, som eksprimerer ét eller flere af de ønskede H

I meningococydermembranproteiner af klasse 1 og/eller epitoper H

I ved overproduktion af vektorer enten gennem eller ikke gennem I

I eksisterende, åbne læserammer og/eller manipulerede læseram- I

I 30 mer, således at der kan fremstilles fusionsproteiner eller H

I proteiner med ombyttede epitoper. H

I Det tilgængelige vildstammer er: H44/76 (B:15:P1,7.16) H

I (E. Holten, NO, deponeret som CBS 635-89); 187 (B:4:P1,7) I

I (J. Etienne, FR); M1080 (B:1:P1,1.7) (C. Frasch, US); Swiss4 I

I 35 (B:4:PI,15) (B. Hirschel, CH); B2106I (B:4:P1,2) (U. Berger, I

I DE); 395 (B:NT:P1,9) (K. Jonsdottir, IS); M990 (B:6:P1,6) I

27 DK 175788 B1 (C. Frasch, US); 2996 (B:2b:Pl,2) (RIVM, NL); M982 (B:9:P1,9) (C. Frasch, US) ; S3446 (B:14:P1,6) (C. Frasch, US) ; H355 (B:15:PI,15) (E. Holten, NO); 6557 (B:17:P1,17) (W. Zollinger, US) og B40 {A:4:P.10) (M. Achtman, DE). Et eksempel 5 på en klasse 3-negativ mutant er HIII5 (B:-P.16), deponeringsnummer CBS 636.89.

Disse stammer er blevet podet fra forkulturer ved -70°C ned i rystekolber og derfra overført i fermenterings-kulturer på 40, 150 eller 350 liter. Det halvsyntetiske 10 medium har følgende sammensætning: L-glutaminsyre 1,3 g/li-ter, L-cystein-HCl 0,02 g/liter, Na2HP04.2H20 10 g/liter, KC1 0,09 g/liter, NaCl 6 g/liter, NH4C1 1,25 g/liter,

MgS04 . 7H20 0,6 g/liter, glucose 5 g/liter, Fe(N02)3 100 μΜ, gærdialysat.

15 Under dyrkning i fermenteringsbeholderen overvåges j pH-værdien og P02-indholdet og reguleres automatisk til en pH-værdi på 7,0-7,2 og en luftmætning på 10%. Cellerne dyrkes til den tidlige stationære fase, høstes ved centrifugering og vask med sterilt 0,1 M NaCl og opbevares ved -20°C eller 20 frysetørret.

Eksempel 2.

Rensning af vdermembranproteiner af klasse 1 fra bakteriologisk kultur.

25 Denne kultur kan gennemføres med de ønskede vildtype- stammer, meningococmutantstammer uden ydermembranproteiner af klasse 2/3 og/eller homologe og heterologe rekombinantmi-kroorganismer, som eksprimerer ét eller flere af de ønskede meningococydermembranproteiner af klasse 1 og/eller epitoper 30 ved overproduktion af vektorer enten gennem eller ikke gennem eksisterende, åbne læserammer og/eller manipulerede læserammer, således at der kan fremstilles fusionsproteiner eller proteiner med ombyttede epitoper.

Let tilgængelige vildstammer er: H44/76 (B:15:P1,7.16) 35 (E. Holten, NO, deponeret som CBS 635-89); 187 (B:4:P1,7) (J. Etienne, FR); M1080 (B:1:P1,1.7) (C. Frasch, US); Swiss4

I DK 175788 B1 I

I 28 B

I (B:4:PI,15) (B. Hirschel, CH); B2106I (B:4:PI,2) (U. Berger, I

I DE); 395 (B:NT:PI, 9) (K. Jonsdottir, IS); M990 (B:6:P1,6) I

I (C. Frasch, US); 2996 (B:2b:Pl,2) (RIVM, NL); M982 (B:9:P1,9) I

I (C. Frasch, US) ; S3446 (B:14:P1,6) (C. Frasch, US) ; H355 I

I 5 (B: 15: PI, 15) (E. Holten, NO); 6557 (B:17:P1,17) (W. Zol- ' I

I linger, US) og B40 (A:4:P.10) (M. Achtman, DE). Et eksempel H

I på en klasse 3-negativ mutant er HIII5 (B:-P.16), depone- H

I ringsnummer CBS 636.89. H

I Disse stammer er blevet podet fra forkulturer ved H

I 10 -70°C ned i rystekolber og derfra overført i fermenterings- H

I kulturer på 40, 150 eller 350 liter. Det halvsyntetiske H

I medium har følgende sammensætning: L-glutaminsyre 1,3 g/li- H

ter, L-cystein-HCl 0,02 g/liter, Na2HP04.2H20 10 g/liter, I

I KCl 0,09 g/liter, NaCl 6 g/liter, NH4C1 1,25 g/liter, I

I 15 MgS04 . 7H20 0,6 g/liter, glucose 5 g/liter, Fe^03)3 100 μΜ, I

I gærdialysat. H

I Under dyrkning i fermenteringsbeholderen overvåges H

I pH-værdién og P02-indholdet og reguleres automatisk til en H

I pH-værdi på 7,0-7,2 og en luftmætning på 10%. Cellerne dyrkes H

I 20 til den tidlige stationære fase, høstes ved centrifugering H

I og vask med sterilt 0,1 M NaCl og opbevares ved -20°C eller I

I frysetørret. H

I Bakteriemassen ekstraheres f.eks. ved hjælp af 0,5 Μ H

I CaCl2, 1%'s (vægt/vol) "Zwittergent 3-14" ("Zw 3-14") og H

25 0,14 M NaCl, pH 4,0, idet der anvendes 100 ml pr. gram fryse- H

tørret bakteriemasse. Suspensionen omrøres i 1 time ved H

stuetemperatur og centrifugeres derefter (1 time, 3000 x H

g), hvorefter den ovenstående væske opsamles på steril måde. H

20% ethanol (vol/vol) sættes til den ovenstående væske, og H

I 30 efter omrøring i 30 minutter centrifugeres produktet (30 H

I minutter, 10.000 x g) , hvorefter den ovenstående væske opsam- H

I les aseptisk. Derpå koncentreres den ovenstående væske ved H

I diafiltrering i et "Amicon®" hulfibersystem (HID x 50, afskæ- H

I ring 50.000), og CaCl2 og ethanol fjernes. Koncentratet H

I 35 fortyndes med 0,1 M natriumacetat, 25 mM EDTA, 0,05% "Zw 3- H

I 14" med en pH-værdi på 6,0 til det oprindelige volumen og H

29 DK 175788 B1 koncentreres derefter igen ved diafiltrering. Denne proces gentages fem gange. Slutkoncentratets pH indstilles på en værdi på 4,0. 20% ethanol (vol/vol) sættes til den ovenstående væske, og efter omrøring i 30 minutter centrifugeres 5 produktet (30 minutter, 10.000 x g). Helproteinerne renses ved hjælp af kolonnechromatografi i nærvær af detergent, f.eks. "Zw 3-1411 . Ofte anvendes der gelfiltrering over "Se-phacryl® S-300" samt ionbytning over DEAE-"Sepharose®", jvf. Beuvery et al. (1986), supra. Den ekstraktionsmetode, 10 de detergenter og den kolonnechromatografi, som er anvendt, er ikke den eneste anvendelige metode, men tjener kun som eksempel og må ikke betragtes som begrænsende.

Eksempel 3.

15 Fremstilling og karakterisering af OMP-peptidfraamenter af klasse 1.

i Cyanogenbromid anvendes til fremstilling af fragmenter af meningococydermembranproteiner af klasse 1. De rensede ydermembranproteiner af klasse 1 eller blandinger af klasse 20 1 og 3 optages i 70%'s (vol/vol) myresyre og behandles med 10 ganges overskud af CNBr i 16 timer ved stuetemperatur.

CNBr og myresyre fjernes ved hjælp af afdampning og erstattes af en opløsning af 0,2 M Tris.HCl, 6 M urinstof, pH 7,2.

Den ovenstående væske forrenses ved gelfiltrering over "Se-25 phacryl® S-200" og renses derefter med gelfiltrering med "TSK-2000" via HPLC, jvf. Beuvery et al., (1986), supra.

Enzymatisk dioererino af CB2-fragmenter.

Til yderligere afbildning af epitoperne underkastes 30 meningococfragmentet CB2 digerering med EndoArg-C, EndoGlu-C eller V-8, og de resulterende fragmenter isoleres ved HPLC. Kort fortalt digereres 20 nM CB2-fragment i 1 ml 25 mM phosphat/0,1 mM tris-puffer (pH 8,0) indeholdende 3M urinstof ved 37°C med 0,2 nM EndoArg-C (1 mg/ml i destilleret 35 vand) eller 0,22 nM EndoGlu-C eller V-8 (1 mg/ml i destilleret vand i 14-18 timer. De resulterende, digererede frag-

I DK 175788 B1 I

I I

I menter adskilles ved HPLC med omvendt fase ved anvendelse I

I af en "Vydac-C4"-kolonne og en trifluoreddikesyre-acetoni- I

I tril-gradient. Den hovedspids, som elueres fra EndoArg-C- I

I digereringen, har en tilsyneladende molekylvægt på 7-9 kD,

5 medens den hovedspids, som iagttages efter EndoGlu-C- eller I

V-8-digerering, har en tilsyneladende molekylvægt på 4-6 I

kD. De isolerede spidser viser sig derefter ved Wester-plet- I

H ning at reagere på en pulje af monoklonale antistoffer (Adam I

I I, 62-D12-8, MN5-C11G og MN14-C116), I

I 10 PI. 16-epitopen ser ud til at være til stede på det I

C-terminale CNBr-fragment af ydermembranproteinet af klasse I

Η 1 fra stamme K44/76 (B:15:PI.7,16). Yderligere karakterise- I

ring af PI.16-epitopen er blevet gennemført ved aminosyrese- I

kvensbestemmelse af CNBr-fragmenterne på 17kD (N-terminal) I

H 15 og 25kD (C-terminal). C-terminalen på 25kD fragmenteres I

I yderligere med V8-protease, EndoLys-C, EndoGlu-C og EndoArg- I

-C. Fragmenter, som er positive med de monoklonale PI.16- I

I antistof, sekvenseres så langt som muligt. De sekvenser, I

H som er opnået, er som følger: I

20 N-terminus i helprotein: I

DVSLYGEIKAGVEDRNYQLQLTEAQUAAGN. . . I

N-terminus i C-terminalt CNBr-fragment på 25kD: I

I (M) PVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIQNS- I

I 25 KSAYTPAYYTKDTNNN... I

Fragmenter, som reagerer med monoklonale P1.16-anti- ' I

H stoffer, isoleres ved anvendelse af V8-protease- og EndoArg- I

-C-fragmentering med en molekylvægt på hhv. 7-9kD og 4-6kD. I

H 30 De N-terminale sekvenser heraf er som følger: I

V8-Fragment på 7-9kD: FSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAYYTKDTN... I

Arg-C-Fragment på 4-6kD: PVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPI- I

QNSKSAYTPAYYTK... I

I 35 I

.

31 DK 175788 B1

Eksempel 4.

DNA-Sekvenser i OMP-oener af klasse 1.

Aminosyresekvenser for OMP af klasse 1 er blevet afledt ud fra nucleotidsekvensen i strukturgener i fire 5 meningococ-OMP'er af klasse 1 med forskellige undertyper. Sammenligning med fire aminosyresekvenser har muliggjort en forudsigelse af sammensætningen og placeringen af disse epitoper. Endvidere er epitoperne PI.7 og PI.16 blevet bekræftet ved hjælp af peptidsyntese og påvisning af bindingen 10 af de respektive, monoklonale antistoffer.

OMP-gener af klasse 1 er blevet klonet ind i lambda--gtll {som beskrevet for PI.16 i A.K. Barlow et al., Infect. Immune 55., 2734-40 (1987)) og underklonet i M13-sekvense- ringsvektorer, og DNA-sekvensen er blevet bestemt ved stan-15 dardteknik (dideoxynucleotidkædeafslutning).

Den komplette, afledte aminosyresekvens for proteinerne PI.16, PI.15, PI.7,16 og PI.2 er som følger: 20 10 20 30 40 50

Pl . 16: DVStVGEIRAOVESRKIOAQLTEQPQVTNGVQONQV—KVTlUUtSRXRTKIS

Pi. 15: DVSLYGEXKAGVEGRNrQLQLTEPP-SKSQP QV—KVTKAKSRlRTKIS

*·» + *** + ****#***« * **** ··»* + *·*» + »**

Pi .7 16 : DV5LYGEIKAGVEGWreQLQLTEAQA*NGGASGQV*VTKNrriU\KSRIRTKlS

25 PI.2: DVSIiYGEXKAGVEGRNXQLQLTEP&QNXQQPQ-------VTKAXSRIRTKIS

I DK 175788 B1 I

32 I

60 70 80 90 100 UO I

DFGSFIGFKGSEDLGEGLKAVWQLEQDVSVAGGGASQWGNR£SFIGLAGEFGTLRAGRVA I

I dfgsfigfkgsedlgeglkavwqleqdvsvagggatqwgnresfvglagefgtlragrva I

DFGSFIGFRGS£DLGDGLRAVWQLEQDVSVAGGGATQWGNR£5FIGLAGEFGTLRAGRVA I

*************** ******************* ******* *************** I

DFGSFIGFKGSEDLGEGLRAVKQLEQDVSVAGGGATRWGNRESFVGLAGEFGTLRAGRVA I

*************** ******************* ******* *************** I

I 120 130 140 150 160 170 I

I NQFDDASQAINPWDSNNDVASQLGIFKRHDDKPVSVRYDSFEFSGFSGSVQFVFAQNSKS | I ******* ** ****************************** ************ ***** I i

I NQFDDASQAIDPKDSNNDVASQLGIFRRHDDKPVSVRYDSFDFSGFSGSVQFVPXQNSKS I

******* ** ****************************** ************ ***** I

I NQFDDASQAIDPWDSNMDVAS0LGIFRRHDDMPVSVSYDSPEFSGF5GSV0FVPIQNSKS I

******* ** ****************************** **·**»»**·** *****

I nqfddaskaidpwdsnnvvasqlgifkrkddmpvsvrydspefsgfsgsvqfvpaqnsks I

H ******* ** »Λ**»»**··*·****************** ************ *****

I 180 190 200 210 220 230 I

AYKPAYYTKDTNNNLTLVPAWGRPGSDVYYAGLNYKNGGFAGNYAFKYARHANVGRNAF

*· ** ************************** ************* **

I aytpahytrqnntdv-fvpawgkpgsdvyyaglnyknggfagsyafkyarhanvgrdaf I

** ** ************************** ************* **

I AYTPAYYTKNTNKNLTLVPAWGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGNYAFKYARjBANVGRNAF · I

** ·* ************************** ************* **

AYTPAHFVQQTPQQPTLVPAWGKPGSDVYYAGLNyKNGGFAGNYAFKYAREANVGRDAP I

I s^* I

** ** ************************** ************* ** 33 DK 175788 B1 240 250 260 270 260 290 ELFLIGSATSDEAKGTDPLKNBOVTTRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKAKTKNSTT **** ** ** ************************************* * *******

ELFLLG5-TSDEAKGTDPLKNBQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKAXTKNSTT

**** ** ** ************************************* * ******* 5 ELFLIGS-GSDQAKGTDPLKNHQVBRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGD—KTKNSTT **** ** ** ************************************* * ******* ELFLLGS-GSDEARGTDPLKNHQVBRLTGGYEEGGLNLALAAQI.DLSENA©—KTKNSTT **** ** ** ************************************* * ******* 10 300 310 320 330 340 350

ElAATASYRFGNAVPRrSYABGFDLIERGKRGENTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAW ************************ *********************************** 15 EIAATASYRFGNAVPRlSYAHGFDLIEFGKKGENTSYDQIlAGVDrDFSKRTSAlVSGAW ************************ *********************************** EIAATASYRFGNAVFR1SYABGFDFIERGEKGEMTSYDQIIAGVDYDFSKRTSA1VSGAW ************************ *********************************** EIAATASYRFGNAVTRISYAHGFDFIERGKKGENTSYOQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAW ************************ *********************************** 20 360 370

LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF

LKRNTG1GNYTQI NAAS VGLRHK F ************************ 25 ;

LKRNTGXGNYTQINAASVGLREKF I

************************

LKRNTGIGNYTQINAASVGLRSKF

30 * Bemærk, at denne aminosyre 15 er placeret mellem aminosy-rerne 184 og 185 i denne sekvens.

! 35

I DK 175788 B1 I

I I

Eksempel 5. I

I DNA-sekvensering af OMP-aener af klasse 1 fra forskellige

I seroundertvper af N. meningitidis. I

Polymerasekædereaktionsteknikken (PCR) ifølge Mullis I

I 5 og Faloona, Methods in Enzymol. 155. 335-350 (1987), er I

blevet anvendt til forstærkning af hele OMP-genet af klasse I

1 og specifikke fragmenter ifølge det skema, som er vist i I

fig. 1 på tegningen. I

Primere er blevet syntetiseret på en Applied Biosy- I

H 10 stems 380B DNA-syntetisator og anvendt ved PCR 30 cyclus I

H standardforstærkningsreaktioner ved anvendelse af Taq-poly- I

H merase i en termisk cyclisator (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, I

I CT) i overensstemmelse med leverandørens anbefalinger. For-

I stærkede fragmenter på ca. 1300, 900 og 450bp er blevet I

I 15 frembragt ud fra genom-DNA-præparat et af hver enkelt serotype I

I ud fra de i fig. 1 viste primerkombinationer. De anvendte I

primere har haft følgende sekvenser: H

PR1: (41 baser med universel primerforlægnelse) I

I 20 TGT AAA ACG ACG GCC AGT TTG AAG ACG TAT CGG GRT TTT GC I

PR2: (42 baser med universel primerforlægnelse) I

I TGT AAA ACG ACG GCC AGT GGC GAA TTC GGT ACG CTG CGC GCC I

I 25 PR3: (42 baser med universel primerforlægnelse) I

I TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAT CAG GTA CAC CGC CTG ACG GGC I

I PR4: (40 baser med universel primerforlægnelse) I

I TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCA GAT TGG CAG TCA GAT TGC A I

I 30 I

I PR5: (40 baser med universel primerforlægnelse) I

I TGT AAA ACG ACG GCC AGT GGG ATC GGT ACC TTT GGC TTG A I

I PR6: (40 baser med universel primerforlægnelse) I

I 35 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AAC TGA TTC GCA ACG CGA CCG G I

35 DK 175788 B1 FWD; (24 baser) TTG AAG GAC GTA TCG GGT GTT TCG REV: (23 baser)

5 GCA GAT TGG CAG TCA GAT TGC TT

Overskydende, enkeltstrenget templat til sekvensering syntetiseres ved en "asymmetrisk PCR"-forstærkning ved anvendelse af et 100 ganges overskud af primer, som bærer en 10 forlængelse på 18 baser ved 5'-enden svarende til de universelle fluorescenssekvenseringsprimere, som anvendes med en automatisk DNA-sekvensator model 370A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Taq-polymerase anvendes ved en standardsekvenseringsreaktion med dideoxynucleotidkædeafslutning med 15 de PCR-frembragte, enkeltstrengede genfragmenter af klasse 1 som templater. Af ledede sekvenser for gensegmenter af stammerne H44/76 (PI.7,16), M1080 (PI.1,7), H355 (PI.15), 6940 (PI.6), 6557 (PI.14), 870227 (PI.10) ogB40 (PI.10) er vist i fig. 2 og 3 på tegningen.

20

Eksempel 6

Bekræftelse af aminosvresekvenser i OMP-undertvpeepitoper af klasse 1.

Ud fra disse gensekvenser, som er bekræftet ved direk-25 te sekvensering af OMP-gener af klasse 1, er det blevet udledt, at de sekvenser, som svarer til aminosyrerne 24-34 og 176-187 i PI.16, er bemærkelsesværdigt variable i de fire OMP-sekvenser af klasse 1. Tre aminosyresekvenser N-terminalt eller C-terminalt fra disse stillinger bør også 30 tages i betragtning til mulig medtagelse i disse epitoper, således at der tillades maksimering af epitopstabilitetspræ-sentering og uventede indsættelser eller udeladelser i den native proteinsekvens. Endvidere bør DNA- og aminosyre sekvensen i andre OMP'er af klasse 1 sammenlignes med sekvensen 35 PI.7,16, således at der tillades en maksimal placering på linie og epitopforudsigelse. Epitopen med den første variable Η

I DK 175788 B1 I

I I

I region og epitopen med den anden variable region betegnes H

I hhv. VRl og VR2. Disse regioner koder undertypeepitoperne, H

I således som det er blevet bekræftet ved hjælp af peptidsyn- H

I tese og omsætning af peptiderne med monoklonale antistoffer, H

I 5 som er specifikke for PI.2, PI.7, Pi.15 og PI.16. H

I Et komplet sæt af overlappende decapeptider forskudt H

I med 5 aminosyrer er blevet fremstillet ved anvendelse af

I PI.16-proteinsekvensen. Det monoklonale anti-Pl.16-antistof H

I omsat med decapeptidet YYTKDTNNNL fra PI.16, og intet andet H

I 10 decapeptid, har som forventet reageret (fig. 4).

I Af overlappende decapeptider forsynet med et aminosy- H

I resekvensskift i regionen 24-34 og 176-187 i OMP af klasse H

I 1 fra stammerne H44/76 (PI. 7,16), MC50 (PI. 16) og MC51 I

I (PI. 15) har mere end et peptid reageret med det undertypespe- H

I 15 cifikke, monoklonale antistof. I de fleste tilfælde har én H

I eller flere af gruppen af disse overlappende peptider reage- I

I ret stærkere end andre med det undertypespecifikke, monoklo- H

I nåle antistof (fig. 5). H

I Disse peptider betegnes som VRl- og VR2-epitoperne. H

I 20 I stammen PI. 7,16 er sekvensen YYTKNTNNNL til stede, og H

I ændringen af D til N ved rest 180 har faktisk en vis virkning H

I til nedsættelse af antistofbinding. Sekvensen HYTRQNNTDVF i H

I PI.15 er i samme relative stilling i proteinet som PI.16- H

I epitopen og er ansvarlig for binding til det monoklonale H

I 25 anti PI.15-antistof. AQAANGGASG viser nogen binding, og H

I peptiderne 1-3 aminosyrer med strømmen viser langt større H

I binding til det monoklonale PI.7-antistof. Sekvensen HFVQQ- H

I TPQSQP i VR2 er ansvarlig for binding til det monoklonale I

I anti-Pl. 2-antistof. Det er muligt, at sekvenserne QPQVTNGVQOi I

I 30 og PPSKSQP i proteinerne Pl-16 og PI.15 også repræsenterer H

I epitoper. H

I Eksempel 6B. H

I Identifikation af epitopen med konstant region i OMP af H

I 35 klasse 1. H

Peptider, som danner overfladesløjfer, fremstilles I

37 DK 175788 B1 og konjugeres til tetanustoxoid. En automatisk peptidsyn* tetisator "Biolynx 4170" (Pharmacia/LKB) anvendes til fastfa-: sesyntese med kontinuert strømning med følgende undtagelse, j · I sidste cyclus af syntesen kobles 0,5 mmol SAMA-OPfp (J.W.

1 5 Drijfhout (1989), doktordisputats, Leiden, NL) i nærvær af 0,5 mmol 1-hydroxybenzotriazol i 30 minutter ved anvendelse af en standardprotekol med udeladelse af piperidinbehandlingen {dvs. "Fmoc-afblokeringstrinnet", som i dette tilfælde ville bevirke uønskelig S-deacetylering). Disse betegnes 10 SAMA-peptider. Peptiderne og deres overfladeregionsplacering, som er konjugeret til TT, er som følger: !

I DK 175788 B1 I

I I

Navn Peptid Region I

I 176 185 I

LBV 017 XCCYTfTKDTNNNL PI. 16, sløjfe 4 I

I I

018 XGGAQAANGGASG PI.7, sløjfe 1 I

I 276 291 I

i 024 XGGLSENGDKAKTKNSTTE PI.16, sløjfe 6

I 245 I

025a XGGNAFELFLIGSATSDEARG PI.16, sløjfe 5

I I

025b XANVGRNAFELFLIGSATSDEAXG PI.16, sløjfe 5

I 124 137 I

026 XGGDSNNDVASQLQIFK PI.16, sløjfe 3

I 027 XADLNTOAERVAVNTANASFV Klasse 2, sløjfe 5 I

I I

^ 028a XGGGKRGENTSYDQ Klasse 1, sløjfe 7 317 i 02eb XGGERGRKGENTSYDQ Klasse 1, sløjfe 7

029 XGGYKBAGTYRAQGGRSKTATQ Klasse 2, sløjfe 1 I

I 78 I

030 XGGWSVAECGASQVGN PI. 16, sløjfe 2 I

I 352 366 I

031 XKRNTGICNYTQINAA PI.16, sløjfe 8

I 16 34 I

032 XGGNIQAQLTEQPQVTNGVQGN PI. 16, sløjfe 1 U

j DK 175788 B1 i 1 39

Konjugering af SAMA-peptider til tetanustoxoid gennemføres som følger. En opløsning af 4,7 mg (10 μπ»ο1) N-succinimidylbromacetat i 100 μliter DMF blandes med en opløsning af 2 0 mg tetanustoxoid (TT) i 3,5 ml 0,1 M natrium-5 phosphatpuffer, pH 7,8. Efter 1 time underkastes 1,8 ml af reaktionsblandingen gelfiltrering ved anvendelse af en "Se-phadex® PD-10"-kolonne (Pharmacia) aekvilibreret i 0,1 M natriumphosphat indeholdende 5 mmol EDTA (PE-puffer), pH

6,1. Det bromacetylerede tetanustoxoid elueres med samme 10 puffer og opsamles i 3,5 ml. 1,2 ml af opløsningen af brom-acetyleret tetanustoxoid sættes til 4,5 mg (3 μπιοί) SAMA-peptid og befries for luft med helium. Dernæst tilsættes . 150 μliter 0,2 M hydroxylamin (i PE-puffer, pH 6,1). Efter 16 timer blokeres tilbageværende bromacetylgrupper ved til-15 sætning af 4 μιηοΐ 2-aminoethanthiol-hydrochlorid i 150 puffer, pH 6,1. Efter et yderligere tidsrum på 16 timer renses peptid-TT-konjugatet ved gelfiltrering over en "PD-10"-kolonne ved anvendelse af PE-puffer, pH 6,1, som elue-ringsmiddel. De hensigtsmæssige fraktioner kombineres og 20 opbevares ved 4°C.

Til bestemmelse af den immunologiske aktivitet in- ^ jiceres 25 μg (totalt protein) pr. dosis af et peptid-TT- konjugat subcutant i ugerne 0 og 4 i 6-8 uger gamle udavlede NIH-mus. Det skal bemærkes, at vaccine LBV 017-TT og LBV 25 018-TT er blevet anvendt med 10 μg totalt protein/dosis.

Sera indsamles 6 uger efter første dosis og vurderes for antistofreaktion ved en ELISA-afprøvning, jvf . Beuvery et al.

·' (1983), Infect. Immun. 40, 369-380. Følgende antigener over- trækkes i mikrotiterhullerne: Ydermembranprotein (OMP), 30 renset OMP af klasse 1, jvf. J.T. Poolman et al., (1989),

Infect, and Immun. 57, 1005, og de ukonjugerede peptider.

Baktericid aktivitet (BC) af sera er også blevet målt, jvf.

J.T. Poolman et al. (1985), supra.

Resultaterne er vist i nedenstående tabel II.

I DK 175788 B1 I

Tabel II I

Syntetisk Baktericid H

Vaccine OMC Klasse 1-OMP peptid test

LBV 018-TT 1:900 (0,05)1 1:2700 ND <1:64 I

LBV 017-ΤΓ 1:900 (1) 1:900 ND <1:64 I

LBV 024-ΤΓ 1:100 1:100 1:900 (hortol.) <1:64 I

LBV 025a-TT - 1:100 1:2700 (homol.) <1:64 I

15 LBV 025b-TT 1:2700 (4) 1:300 1:8100 (homol.) <1:64 I

LBV 026-ΤΓ (homol.) <1:64 I

LSV 027-ΤΓ 1:300 1:300 (homol.) <1:64 I

LBV 028a-TT 1:100 - 1:2700 (homol.) <1:64 I

LBV 028b-TT 1:100 1:100 1:900 (homol.) <1:64

25 LBV 029-TT - 1:100 1:8100 (homol.) <1:64 H

LBV 030-TT - 1:100 1:2700 (homol.) <1:64 I

LBV 031-TT 1:100 (homol.) <1:64 I

LBV 032-TT - 1:100 1:900 (homol.) <1:64 I

tal i parentes angiver det O.D.-niveau, som udviser denne titer.

41 DK 175788 B1

Disse data antyder, at af de konstante overfladesløjfer, som er afprøvet i OMP'er af klasse 1 og 2 fra N. meningitidis, ser sløjfe 5 ud til at repræsentere mindst én region, som vil danne antistoffer, som vil krydsreagere med 5 OMP af klasse 1 og klasse 2 fra mange stammer af N. meningitidis.

Eksempel 7

Konstruktion af rekombinantflagelliner. som eksprimerer 10 meningococepi toper.

Til skabelse af hybridflageller, som indeholder epi-toper fra meningococepitoper af klasse 1, er der blevet i

konstrueret en række oligonucleotider baseret på primære proteinsekvensdata og epitopkortlægningsdata. To oligonucleo-15 tider baseret på VR1- eller VR2-epitoper i ydermembranen I

fra PI.7,16 er blevet konstrueret således, at de har kunnet klones i enkelte eller flere kopier ind i en kloningsregion i genet for flagellin fra S. muenchen. Translationstermine-ringssignaler er blevet medtaget på den ikke-kodende streng 20 af oligonucleotidet for at lette screening ved ekspression af de klonede indsætninger.

Plasmidvektoren pPX1650 indeholdende hele koderegionen 1 og promotorregioner for strukturgenet for flagellin Hl-d fra Salmonella muenchen (deponeret hos ATCC, accessionsnummer 25 67685) er blevet modificeret, således at den indeholder nogle særegne kloningssteder, som er egnet til indsættelse af enten oligonucleotider eller genfragmenter i hver enkelt af de tre læserammer i flagel lingenet (fig. 6) . Først er pPX1650 blevet digereret med EcoRV, som spalter pPX1650 to 30 gange, med en afstand på 48 basepar, og religateret til opnåelse af et plasmid, pPX1651, som har et særegent EcoRV-kloningssted, og som resulterer i en udeladelse på 16 aminosyrer i flagellinproteinet. pPX1651 er blevet identificeret ved screening af rekombinanter af E. coli på Western-pletter ' 35 sonderet med polyklonalt antistof rettet imod Hl-d-flagellin. pPX1651 er blevet identificeret blandt flere kandidater med

I DK 175788 B1 I

I 42 I

I flagelliner, som er mindre end i vildtypeflagellin (fra H

I 1650), og er blevet verificeret ved sekvensering. For det H

I andet er pPXl651 blevet begrænset med BamHI og regligateret H

I efter udfyldning af de udragende ender med Klenow-enzym til H

I 5 fjernelse af det særegne BamHI-restriktionsenzymsted i vek- I

I torens polylinkerregion. Som et afsluttende trin er den

I resulterende vektor blevet digereret med EcoRV, og følgende I

I oligonucleotidlinker er blevet indsat: I

I 5' ATG ATC GAT GGA TTC 3 ' I

I 10 3' TAG TAG CTA CCT AAG 5' I

I Kandidater er blevet screenet for de nyskabte BamH- I

I steder, og nogle kandidater med BamHI-steder er blevet scree- H

I net for linkerens orientering ved sekvenseringsmetodologi H

I 15 med dobbeltstrenget DNA. En kandidat med linkeren i oven- H

I nævnte orientering er tilbageholdt som pPX1647: I

5'... GAT ATC ATC GAT GGA TTC ATC.... I

I EcoRV Clal BamHI I 1

2 0 Plasmid pPX1647 (fig. 7) digereres med BamH, og oligo- H

nucleotider for enten VR1 eller VR2 klones ind i celler af I

E. coli. Screening for ønskede rekombinanter gennemføres I

ved digerering af plasmidminilysat-DNA med hensigtsmæssige, H

diagnostiske restriktionsenzymer og screening for ekspression H

25 ved sondering af hybridflageller for nedsat mobilitet på I

SDS-PAGE-geler med specifikt flagelantiserum (Hl-d).En I

I række af de resulterende kloner har udvist nedsat mobilitet I

I på SDS-PAGE, hvilket viser rigtig indsættelse af et eller I

flere af oligonucleotiderne for VR1 eller VR2. Nogle af I

I 30 begge typer tilbageholdes til analyse ved DNA-sekvensering. I

I Klon CB1-2 er resultatet af tandemindsættelse af to kopier I

I af VRl-oligonucleotidet, og klon CB1-4 er resultatet af I

I indsættelse af fire oligonucleotider. På samme måde har CB2 H

I P indeholdt en enkelt indsættelse af VR2-oligonucleotidet, I

I 35 og CB2 W har vist den forventede, trimere indsættelse. Klonen I

I CB2 P indeholder en enkelt baseparændring, som har resulteret H

43 DK 175788 B1 i en ændring fra Leu til Phe i det eksprimerede VR2-fusions-protein, og den er ikke blevet opretholdt til yderligere studium. Rekombinantflagellinklonerne i E. coli er blevet sonderet med monoklonale antistoffer, jvf. H. Abdillahi et 5 al., 1988, Micro. Pathog. 4, 27-32, 1988; RIVM, NL, som vides at reagere med enten VR1- eller VR2-epitoper. De monoklonale Adam-1 (PI.7) og Mnl4-Cll-6 (PI.7) reagerer med hybridf lagel -lin indeholdende 2 eller 4 tandemindsættelser af VR1, men reagerer ikke med kloner indeholdende VR2. Den svagere reak-10 tion af begge monoklonaler med CBl-2 end med CB1-4 skyldes sandsynligvis epitoptæhed. Ved samme tegn reagerer monoklonaler 62 (PI.16) og Mn5-cll-G (PI.16) med klonen CB2 W, men ikke med VR1- indsættelserne. Klonen CB2 P reagerer ikke med noget VR2-antistof, sandsynligvis på grund af ændringen af 15 Leu til Phe.

Til undersøgelse af funktionen af hybridflagellerne transformeres hver af disse kloner ind i en aroA-stamme af S. dublin (SL5927), som har en TnlO-indsættelse i Hl-d-ste-det. Hver af de fire kloner har resulteret i motile bak-20 terier, og motiliteten af transformanterne er blevet inhi-beret af det tilsvarende, monoklonale antistof, herunder klon CB2 P, hvilket viser affinitet af VR2-monoklonalen for i epitopen i intakte flageller. Dette resultat viser, at epito-per er blotlagt på celleoverfladen og er tilgængelige for 25 antistof.

Hybridf lagel lin indeholdende både VR1- og VR2-epitoper er blevet frembragt ved spaltning af enten CBl-2, CB1-4 eller CB2 W med BamHI og kloning af den heterologe epitop.

Kloner CB12-7 og CB12-10 er resultatet af indsættelsen i 30 ramme af en enkelt kopi af VR2-oligonucleotidet bagefter hhv. enten 2 eller 4 VRl-tandemindsættelser, og klon CB21-F er opstået fra indsættelsen af en kopi af VR1-epitopen bagefter 3 tandemkopier af VR2. CB12-7 og CB12-10 erkendes kun af monoklonalt VRl-antistof, og CB21-F erkendes kun af mono-35 klonalt VR2-antistof. Disse resultater viser, når de tages sammen med DNA-analyse, som afslører forudsagte sekvenser, i

I DK 175788 B1 I

I I

at epitoptætheden er for lav i de kombinerede hybrider. Til I

skabelse af et hybridflagellin med forøget tæthed af begge I

VRl- og VR2-epitoperne er CB12-10 blevet digereret med BamHI, I

og oligonucleotider, som koder VR2, er blevet indsat. Klon I

5 12-10-6 indeholder to yderligere taridemindsættelser af VR2- I

epitopen, hvilket resulterer i et hybridflagellinmolekyle, I

hvori fire tandemkopier af VRl efterfølges af tre kopier af I

I VR2. Som vist i fig. 3a og b har tre af hybridflagellinvac- I

cinekandidaterne de forventede molekylegenskaber. Flagellinet I

10 (pCBl x 4) indeholdende 4 kopier af VRl reagerer med monoklo- I

nåle anti-Hl-d- (anti-flagellin) og anti-VRl-antistoffer, I

men ikke med monoklonale anti-VR2-antistoffer. Flagellinet I

I (pCB2-W) indeholdende 3 tandemkopier af VR2 reagerer med I

I anti-Hl-d- og anti-VR2-antistoffer, men ikke med anti-VRl, I

15 og det kombinerede hybrid indeholdende kopier af VRl og 3 I

kopier af VR2 reagerer med både monoklonale anti-VRl- og I

anti-VR2-antistoffer. Det kombinerede hybrid har specificeret I

motilitet, når det indføres i en ikke-motil recipientstamme I

H af S. dublin. I

2 0 Som en underenhedsvaccine er målet at opnå egnede, I

I indledende vaccinekandidater i høj kvantitet og høj renhed. I

En egnet vaccinekandidat kan udvælges fra konstruktioner af I

ovenstående type baseret på reaktivitet for monoklonale I

I antistoffer og funktion af flageller i ikke-motile værtsstam- I

I 25 mer af Salmonella. En underenhedsflagellinvaccine behøver I

I ikke nødvendigvis at bibeholde alle funktionelle aspekter I

I hos et stamflagellin, men den bør i det mindst bibeholde I

I overfladelokalisering til rensningsformål. Adskillige under- I

enhedsflagellinmeningococvacciner er blevet udvalgt fra de I

I 30 ovenfor beskrevne hybridmolekyler baseret på reaktivitet I

mod monoklonale antistoffer og har indebåret overfladelokali- I

sering baseret på genoprettelse af bakteriemotilitet. Tre H

flagellinvaccinekandidater har indeholdt enten 4 tandemind- I

I sættelser af VRl, 3 tandemindsættelser af VR2 eller 4 VRl- I

I 35 indsættelser efterfulgt af 3 VR2-indsættelser. Da flagellin

er et hovedprotein i Salmonella, er det muligt let at rense I

I il

Η H

45 DK 175788 B1 tilstrækkeligt materiale til vaccinationsstudier ved anvendelse af teknik, som er veletableret til flagelrensning, jvf. Logan et al., J. Bacteriol. 169. 5072-5077 (1987).

5 Eksempel 8.

Indledende rensning af rekombinantflagellinmolekvler.

De tre hybridflagellinvaccinekandidater og en vildtype (stammende fra pPX1560) er blevet podet i fire liter Fern-bach-kolber med prelplader indeholdende 1 liter LB-nærings-10 suppe. Bakteriekulturerne inkuberes ved 37°C med omrystning (200 omdrejninger pr. minut) i 22-24 timer. Under disse dyrkningsbetingelser løsnes hovedmassen af flagellerne fra bakteriecelleoverfladen og lokaliseres i det ovenstående kulturmedium. Til opnåelse af egnet materiale isoleres fla-15 geller fra 6-8 liter kulturmedium. Til opnåelse af rensede flagellinpræparater til vaccinationsstudier høstes flagel-filamenter fra ovenstående bakteriekulturvæsker ved følgende metode: Ammoniumsulfat sættes til den ovenstående kulturvæske, således at slutopløsningen er 50% mættet, opløsningen 20 omrøres svagt ved 4°C i nogle timer, og det udfældede materiale opsamles ved centrifugering i en GSA-rotor ved 5000 omdrejninger pr. minut i 30 minutter. Det opsamlede, ammoniumsul fatudf ældede materiale rekonstitueres i PBS og dialyseres imod PBS ved 4°C i 12-15 timer. Det dialyserede 25 materiale underkastes centrifugering ved høj hastighed ved 100.000 x g i 1 time i en SW-27-rotor til pelletering af flagelfilamenterne. Det pelleterede materiale, som primært består af flagellin, underkastes yderligere rensning ved følgende metode.

30'

Eksempel 9.

HPLC-rensning af rekombinantflacrelliner.

Til fremstilling af højrensede flagelliner dyrkes Salmonella, som eksprimerer konstruktionerne, især pCB12-35 10-6, som ovenfor beskrevet, og cellerne pelleteres ved 10.000 G. Derefter udfældes den ovenstående kulturvæske med

I DK 175788 B1 I

I 46 I

I 50%'s ammoniumsulfat, centrifugeres ved 10.000 G og resuspen- ! I

deres i 30 ml PBS. Den resuspenderede pellet dialyseres

natten over ved 4°C imod lOmM Tris-puffer (pH 8,0) indehol- I

dende 6M urinstof, ImM PMSF, 2mM NEM og 5mM EDTA. Dialyseret ι I

5 materiale ledes derefter over to DEAE-"Sepharose®"-minikolon- I

ner (volumen 3,0 ml, 4,0 ml elueringsmiddel over hver). I

Kolonnerne elueres (5 gange) med 50mM NaCl i lOmM Tris (pH I

H 8,0) indeholdende 6M urinstof og derefter med 1M NaCl i

lOmM Tris (pH 8,0) indeholdende 6M urinstof. De fire første I

10 elueringsopsamlinger (2 0 ml) af 50mM NaCl slås sammen og I

dialyseres imod 1,0 liter lOmM acetatpuffer (pH 4,0) i 6M I

urinstof ved stuetemperatur. Derefter fyldes de dialyserede I

I fraktioner på en "TSK SP PW" HPLC-kationbytterkolonne (75 I

mm x 300 mm). Kolonnen elueres med en mobil fase bestående H

I 15 af lOmM acetat (pH 4,0) indeholdende 6M urinstof. En gradient I

af 0-300mM NaCl etableres i lOmM acetat (pH 4,0) indeholdende I

I 6M urinstof i løbet af perioden 5-30 minutter. Efter 30 I

I minutter går gradienten fra 300mM til 1M NaCl i lOmM acetat H

i 6M urinstof i løbet af de næste 5 minutter. Flagellinkon- I

20 struktionen opsamles ved ca. 24 minutter, hvilket svarer I

I til ca. 200mM NaCl. Fraktionen dialyseres imod PBS, og den I

på materialet bestemte renhed fastlægges ved Western-pletter I

ved anvendelse af anti-flagellin-antistof. En repræsentativ I

I HPLC-analyse og SDS-PAGE er vist i hhv. figurerne 8 og 9. I

I 25 . i i

Eksempel 10. I

I Fremstilling af meningdcocflagellinglvcokoniugat. I

Meningocockapselpolysaccharid af gruppe C (GCM CPS: I

portion nr. 86 NM 01) fremstilles i alt væsenligt ifølge I

I 30 3undle et al., J. Biol. Chem. 249. 4797-4801 (1974). I

I Stamme Cll af Neisseria meningitidis fås fra Walter I

I Reed Army Institute (Washington, DC) . Stammen fordyrkes to I

I gange på fåreblodsagarplader og anvendes derefter til podning - I

af et flydende podekulturmedium, kemisk defineret Neisseria- I

I 35 -medium (NCDM) , jvf. Kenney et al., Bull. W.H.O. 37,, 469- I

I 473 (1967). Til sidst podes 40 liter flydende medium (NCDM) I

47 DK 175788 B1 i en fermenteringsbeholder med den flydende forkultur. Stammens renhed kontrolleres på hvert enkelt trin. Efter centrifugering udfældes den ovenstående væske ved tilsætning af "Cetavlon®" til en slutkoncentration på 0,1%, og det uopløse-5 lige kompleks genopløses i koldt 1M calciumchlorid (CaCl2) , jvf. Gotschlich et al., J. Exp. Med. 129, 1349-65, (1969).

96%'s ethanol tilsættes til en slutkoncentration på 25% (vol/vol). Efter 1 time centrifugeres suspensionen (1 time, 50.000 g), den ovenstående væske opsamles, og dens ethanol-10 koncentration forøges til 80% (vol/vol). Efter 1 time giver centrifugering (20 minutter, 5000 g) et bundfald, som vaskes successivt med absolut ethanol, acetone og diethylether og derefter tørres i en vakuumekssikator over phosphorpentoxid (P205) til konstant vægt. Dette rå CPS opbevares ved -20°C.

15 Til opnåelse af et renere præparat opløses CPS deref ter i natriumacetatpuffer (1,10 fortynding af en mættet opløsning, pH 7,0) og ekstraheres fire gange med varmt phenol, jvf. Westphal et al., Z. Naturforsch. 7b, 148-155 (1952). Efter dialyse af de kombinerede vandige faser imod 20 0,1 M CaCl2 efterfulgt af centrifugering (3-5 timer, 100.000- g) gennemføres en ethanolslutudfældning på den klare, ovenstående væske, og det resulterende bundfald vaskes med organiske opløsningsmidler og tørres som ovenfor beskrevet. Derefter opbevares det rene CPS ved -20°C.

25 På hvert trin af rensningsprocessen analyseres CPS

for indholdet af carbonhydrat-N-acetylneuraminsyre (NANA), jfr. Svennerhold, Biochim. Biophys. Acta 24., 604 (1957), O-acetyl, jfr. Hestrin, J. Biol. Chem. 180. 249 (1949) , og protein (påvisning ved 260 nm) , og dets molekylvægt kontrol-30 leres ved gelfiltrering.

Meningocockapselpolysaccharid af gruppe C (GCM CPS) depolymeriseres og aktiveres samtidigt via natriumperiodat-oxidation (NalO,^) i vandig puffer, jvf. Anderson et al-, J. Immunol. 137, 1181-1186 (1986); Eby et al., Pediat. Res.

35 20, 308A, (1986); Anderson et al., J. Pediatr. 111(5), 644- 50 (1987); US patentskrift nr. 4.762.713. Reaktionen overvå-

I DK 175788 B1 I

I 48 I

ges ved gelpeermeringschromatografi med høj ydeevne (HPGPC) I

H i vandigt elueringsmiddel ved anvendelse af ultraviolet I

(UV) påvisning og påvisning ved brydningsindeks (RI) . Reak- I

tionen standses, og de aktiverede oligosaccharider (GCM OS) I

5 af sal tes ved lavtryksgelpermeering (GPC) i vand og lyofilise- I

res derefter. Derefter fremstilles der en opløsning i vand, I

H som derpå fryses til midlertidig opbevaring. GCM OS og fla- I

gellin pCB12-10-6 blandes i vandig, neutral puffer, og konju- I

geringen initieres ved'"tilsætning af natriumcyanoborhydrid I

10 (NaBH3CN), jvf. US patentskrifterne nr. 4.762.713, 4.673.574 I

og 4.761.283 (1988). Reaktionen gennemføres i 5 dage, medens I

den overvåges ved HPGPC. Den standses til sidst ved dialyse/- I

koncentrering på centrifugemikrokoncentratorer. Slutpræpara- I

tet opbevares i kulden, i nærvær af thimerosal til forhin- I

15 dring af bakterievækst. Det resulterende glycokonjugat til- I

vejebringer ikke alene en mekanisme til præsentering af de I

eksprimerede VR1- og VR2-meningococepitoper for immunsyste- I

H met, men tjener også som et bæres tof molekyle for præsenterin- I

gen af et meningococoligosaccharid. I

H 20 Ved fremstilling af konjugatet er der blevet anvendt I

I følgende betingelser. Renset flagellin pCB12-10-6 opløses i I

15%'s saccharose (3,5 mg/ml) og opbevares derefter ved I

20°C. 9,7 mg GCM CPS (slutkoncentration 5 mg/ml) oxideres I

I med lOOmM NaI04 i 0,05 M natriumphosphatpuffer (pH 6,2-6,5) I

I 25 ved stuetemperatur i mørke under omrøring. Portioner på 100 I

μϋίθΓ udtages med regelmæssige mellemrum, reaktionen stand- I

H ses ved tilsætning af 10 μliteτ ethylenglycol, og analyse I

gennemføres ved HPGPC på Waters (Milford, MA) "Ultrahydrogel I

I 250 + 120" (2 kolonner koblet, 2 x 300 mm x 7,8 mm) i 0,2 Μ I

I 30 phosphat-saltopløsning-puffer (PBS, 0,2 M natriumphosphat, I

I 0,9% NaCl, pH 7,8) ved en strømningshastighed på 0,8 ml/minut I

ved anvendelse af påvisning med UV (206 nm) og RI. Efter 2 I

I timer og 30 minutter standses reaktionen véd tilsætning af I

I ethylenglycol (1/10 af reaktionsvolumenet), og GCM OS afsal- I

I 35 tes ved GDC på Bio-Rad (Richmond, CA) "Bio-Gel® P-2" (0,038- I

I 0,074 mm, 30 cm x 1,5 cm) i vand med ca. 18 ml/time. Frak- 49 DK 175788 B1 tioner på 1,2 ml opsamles og analyseres for tilstedeværelsen af carbonhydrat-N-acetylneuraminsyre (NANA), jfr. Barry et al., J. Gen. Microbiol. 29_, 335-352 (1962), og aldehyder, jfr. Porro et al., Anal. Biochem 118. 301-306 (1981). Posi-5 tive fraktioner slås sammen og lyofiliseres. Afsaltet GCM OS (4,7 mg) opløses derefter i vand (10 mg/ml) og fryses ved -20°C.

Begge opløsninger af GCM OS og pCMl2-10-6 analyseres ved HPGPC (UV ved hhv. 206 og 280 nm) , før de fryses, og 10 før de konjugeres. Der sker ingen sønderdeling under opbevaring, således som det viser sig ved den nøjagtige ensartethed af elueringsprofilerne.

2 mg GCM OS (slutkoncentration 2,6 mg/ml) og 2,3 mg flagellin pCB12-10-6 (slutkoncentration 3 mg/ml) blandes i 15 et polypropylenglas i 0,4 M natriumphosphatpuffer (pH 7,0), og 12 μπιοί NaBH3CN tilsættes til initiering af konjugeringen, jvf. US patentskrifterne nr. 4.762.713, 4.673.574 og 4.761.283 (1988). Reaktionsblandingen henstår 1 dag ved stuetemperatur og derefter 4 døgn ved 35°C uden omrøring.

20 Reaktionen overvåges ved HPGPC (UV ved 280 nm) på forskellige stadier og standses til sidst ved dialyse/koncentrering på mikrokoncentratorer. Slutpræparatet analyseres for indhold af NANA, jfr. Barry et al., J. Gen. Microbiol. 29, 335-353 (1962) (0,09 mg; 0,12 mg/ml), og protein, jfr. Lowry et 25 al., J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951) (1,12 mg; 1,45 mg/ml) . Derefter opbevares det ved 4°C i nærvær af thimerosal (0,01%, vægt/vol) for at forhindre bakterievækst.

Konjugatpræparatet kontrolleres også ved analyse ved SDS-PAGE (sølvnitratfarvning) og Western-pletter. Der viser 30 sig flere bånd med høj molekylvægt på gelen over det rene pCB12-10-6-bånd og nær ved stablingshullet, idet sidstnævnte er et bevis for, at der er sket tværbinding under konjugeringen. Western-pletanalyse har vist, at hvert enkelt bånd er reaktivt med de anvendte antisera (anti-GCM, -VR1 og -VR2), 35 hvilket beviser covalens af konjugatbindingerne.

I DK 175788 B1 I

I 50 I

Eksempel 11. I

Koniugering af meninaococpeptider til CRM og okseserumal- I

bumin.

Peptider betegnet M20 og M21 fremstilles på en peptid-

5 syntetisator model ABI ved fastfasesyntese ved anvendelse I

af tBoc-kemi og kobles til CRM197 (fremstillet som beskrevet H

i US patentskrift nr. 4.762.713) ved anvendelse af et bifunk- I

H tionelt tværbindingsmiddel, sulfosuccinimidyl-(4-iodacetyl)- I

I -aminobenzoat (sulfo-SIAB; indkøbt fra Pierce), ved at følge H

I 10 en modifikation af en publiceret metode, jfr. J.K. Weltman I

I et al., (1983) Bio Techniques i, 148-152. Kort fortalt ak- H

I tiveres CRMig7 ved hjælp af SIAB, hvilket resulterer i dan- H

I nelsen af en amidbinding mellem SIAB og aminogrupper i I

I CRM197. Efter at uomsat tværbindingsmiddel er fjernet fra H

15 det aktiverede CRMig7 ved gelfiltrering, blandes peptid H

(M20 eller M21) indeholdende forbindende afstandsgiver (re- I

præsenteret ved understregede bogstaver) med carboxyterminal I

cysteinrest med aktiveret CRM og inkuberes ved stuetemperatur I

I i 2-4 timer. Efter omsætningen dialyseres det konjugerede H

I 20 materiale ekstensivt imod PBS ved 4°C. I

I Sekvensen i peptidet M20 (VR2-epitopen) er som følger: H

I H-Tyr-Tyr-Thr-Lys-Asp-Thr-Asn-Asn-Asn-Leu-Thr-Leu-Val-Pro- I

I -Ala-Glv-Ala-Cvs-OH. I

H 25 I

Sekvensen af peptidet M21 (VRl-epitopen) er som føl- I

I ger: H

I H-Ala-Gln-Ala-Ala-Asn-Glv-Glv-Ala-Ser-Glv-Gln-Val-Lvs-Ala- I

I 30 Glv-Ala-Cvs-OH. I

Konjugerede materialer underkastes SDS-PAGE, overføres I

I til PVDF-membraner (Immobilon, "Millipore®") og omsættes med I

specifikke monoklonaler, som erkender VRl- og VR2-epitoper. I

I 35 Fig. 10a og 10b viser Western-pletanalyse af M20- og M21- I

I CRM197-konjugater imod en pulje af VRl- og VR2-specifikke I

51 DK 175788 B1 monoklonaler (Adam I, G2-D12-8 (PI.7), MN5-C11-G (PI.16) og MN14-C11-6 (PI.7)).

Til afprøvning af antistofreaktionen mod peptidet M2 0 og M21 ved en enzymbundet immunoafprøvningsmetode er 5 der blevet fremstillet BSA-konjugater ved anvendelse af et andet bifunktionelt tværbindingsmiddel, N-succinimidylbrom-acetat, som beskrevet af Bernatowicz og Matsueda, Anal.

Biochem. 155. 95-102 (1986) . Covalent kobling af peptidet til proteinet er blevet bekræftet ved Western-pletdannelse 10 af elektroforeserede prøver som beskrevet for CRM197-kon-jugater.

Eksempel 12. '

Bibeholdelse af T-celleaktivitet af M20- og M21-CRM1a7-kon-15 iuqater.

For at bestemme, om konjugering af VR1- og VR2-epito-perne til CRM1g7 på uheldig måde påvirker T-celleerkendelsen af proteinet CRM197, er der blevet gennemført en T-celleformeringsafprøvning som tidligere beskrevet af Bixler og Atas-20 si, Immunol. Commun. 12, 593 (1983). Kort fortalt immuniseres SJL/j-mus med 50 μ<3 nativt CRM197 emulgeret i CFA. Syv døgn senere udtages lymfeknuderne, dyrkes i RPMI og anspores med forskellige koncentrationer af proteiner (0,05-100,0 μg/ml) og peptider.. Efter inkubering i 3 døgn pulseres kulturerne ' 25 med [3H]-thymidin i 16 timer og høstes derefter til tælling.

30 35

I DK 175788 B1 I

I I

I Tabel III I

T-cellereaktioner på konjugater af menihgococpeptid-CRM197. I

Infektion in vitro Maksimal observeret [3H] -inkorporering I

5 Mg/ml ÅCPM SI

I Diphtheriatoxoid 5 27.510 57 I

CRM197 50 108.631 221 I

I 10 CRM197 kunstigt konjugat 100 116.326 236 I

I M21-CRM197 100 182.499 370 I

M20-CRM197 10 89.972 183

I 15 CON A 1 34.316 70 I

LPS 50 61.579 126

Tetranustoxoid 10 515 2 I

Baggrund (cpm) 494 l I

20 “ ' I

I Som vist i tabel III viser en sammenligning af CRM197 I

med CRM!97-kunstkonjugatet, at konjugeringsprocessen i sig I

selv ikke ændrer proteinets T-celleerkendelse. Den T-celle- I

I 25 reaktion, som frembringes af M20- og M21-CRM197-konjugaterne, I

I er i alt vaesenligt ækvivalent med eller større end den reak- I

I tion, som udløses af selve CRM^97, hvilket viser, at erken- I

I delsen af T-celleepitoperne på CRM197 ikke påvirkes uheldigt I

af peptidkonjugeringen. Reaktionen på kontrolmaterialerne I

H 30 Con A, LPS og tetanustoxoid er som forventet. H

I Eksempel 13. I

Immunogenisitet af koniugat- og rekombinant-meningococ b-vac- I

I ciner. I

I 35 Rekombinantflagellin, som eksprimerer VRl- og/eller I

VR2-meningococepitoperne, fremstilles og renses som beskrevet I

I i eksempel 7, 8 og 9. Desuden syntetiseres syntetiske pep- i . I

I tider, som repræsenterer meningococepitoperne VRl og VR2, I kobles covalent til bærestofmolekylet CRM197, og renses som

I 40 beskrevet i eksempel 12. Vacciner formuleres med hvert enkelt I

I af disse materialer i proteinkoncentrationer på 10 eller I

I 100 Mg/ml for hver af komponenterne. Vaccinepræparaterne I

indeholder tillige aluminiumphosphat i en mængde på 1 mg/ml I

I I

53 DK 175788 B1 eller en anden mængde, hvor dette er angivet, compounderet med Freund's komplette adjuvans eller uden supplerende materiale.

Til vurdering af immunogeniciteten immuniseres udav-5 lede Swiss-Webster-mus intramuskulært i ugerne 0 og 2 med 1 eller 10 μg protein/dosis. Sera indsamles med to ugers mellemrum og slås sammen til afprøvning og screenes for antistofaktivitet ved ELISA mod ydermembrankompleks (OMC) , renset OMP (Pi.16), VR1-peptid koblet til okseserumalubmin (M21-10 BSA), VR2-peptid koblet til BSA (M20-BSA), vildtypeflagellin og CRM257. Resultaterne af ELISA gennemført på sera opnået efter 6 uger er vist tabel IV.

15 20 25 30 35

I DK 175788 B1 I

I I

I Tabel IV I

Immunogenisitet af rekombinant- eller CRM^97-konjugatvacciner indeholdende H

I meningococepitopeme VR1 og VR2 fra OMP PI. 16. H

5 Dosis, ELISA-TITERE 4 uger efter sekundær forstærkning^· H

I /ig OMC PI. 16 M21-BSA M20-BSA FLAGELLIN CRM I

pPxl650 (kontrol, vildtypeflagellin)2 H

I 1 <150 <100 171 100 427.781 ND I

I 10 10 <150 100 154 <100 468.385 ND I

I pCBl-4 I

I 1 532 4.376 4.525 ND 787.120 ND I

I 10 2.034 12.387 17.565 ND 887.861 ND H

I 15 I

I pCB2-W

I 1 150 308 ND 501 263.143 ND H

I 10 1.350 12.190 ND 5.476 1.493.216 ND H

I 20 pCB12-10-6 . I

I 1 615 3.374 4-651 824 299-889 ND I

I 10 1.423 3.666 3.882 2^253 497.622 ND H

H pCB12-10-6 uden aluminiumphosphat H

I 25 1 409 739 505 597 139.147 ND I

10 450 1.533 817 1.611 358.033 ND

I M20-CRM197 I

I 1 <150 <100 217 <100 ND 42,27 I

I 30 10 50 <100 150 <100 ND 95,31 I

I M21-CRM197 I

1 68 249 10.494 100 ND 17,41 I

I 10 110 311 26.807 191 ND 20,92 I

I 35 I

Blanding af M20- og M21-konjugater H

I 1 50 100 40.000 187 ND 37,32 I

I 10 50 227 15.539 132 ND 184,27 I

I 40 OMP PI.16 I

I 1-12.630 17.714 100 764 ND ND I

I 10 23.178 67.565 162 3.276 ND ND 'I

I pCBl-4 i CFA I

I 45 10 1.665 10.606 19.945 ND 1.841.852 ND

I pCB2-W i CFA I

I 10 1.157 6.869 ND 17.749 1.217.063 ND I

H 50 ^ Alle blodprøveværdier før immunisering er lig med eller under H

den nedre afprøvningsgrænse (fortynding 1/100). H

H 2 Alle vacciner er formuleret med 1 mg/ml aluminiumphosphat, med- H

H mindre andet er angivet. H

55 DK 175788 B1

Alternativt er de forskellige vacciner blevet vurderet for immunogenicitet i 6-8 uger gamle, udavlede NIH-mus.

Musene immuniseres med 100 μg (totalt protein)/dosis subcu-tant i ugerne 0 og 4, og vaccine og sera indsamles i uge 6.

5 Disse sera vurderes ved en ELISA-afprøvning og under anvendelse af antigener som beskrevet i eksempel 6. Den baktericide aktivitet måles som i eksempel 6 beskrevet. Resultaterne er vist i tabel V.

10 Tabel V

ELISA (titer >0.5 optisk tæthed)

Vaccine- Syntetisk Bakteri- flagellin OMC Klasse 1-OMP peptid cid test 15 pl650 - - - <1:64 pCB12.10.6 - 1:900 - <1:64 20 pCB2-W - 1:300 1:100 <1:64 pCBl-4 1:300 (0,25) 1:2700 - <1:64 CRM197 - - - <1:64 M20-CRM197 1:100 1:8100 - <1:64 25 M21-CRM197 1:300 (0,125) 1:8100 τ <1:64

Rekombinantflagellinerne indeholdende enten VR1, VR2 eller en kassette af både VR1 og VR2 er effektive til udløsning af en antistofreaktion, som er krydsreaktiv- med det 30 rensede PI. 16 og i mindre udstrækning med OMC. Sera fra dyr, som er immuniseret med 10 μg af enten pCBl-4 eller pCB2-W, har dannet antistoffer, som binder til deres respektive peptid-BSA-konjugater samt krydsreagerer med PI.16 og OMC. Tilsvarende resultater er opnået med det konstruerede 35 pCB12-10-6, som indeholder begge meningococepitoper. Desuden har hver enkelt konstruktion tillige frembragt signifikante anti-flagellintitere. I modsætning hertil har kontrolflagel-linet af vildtypen kun frembragt en antistofreaktion imod flagellin selv. Sera indsamlet før immunisering har ikke

I DK 175788 B1 I

56 I

vist nogen i forvejen eksisterende reaktion på de materialer, I

som er blevet vurderet. I

Disse data viser også fordelene ved formulering af I

rekombinantflagellinerne med alun eller andre adjuvanser, I

5 såsom CFA. Konstruktionen pCB12-10-6 er blevet formuleret I

med og uden tilsætningen af aluminiumphosphat. Som vist i I

I tabel V har pCB12-10-6 alene været i stand til at frembringe I

en antistofreaktion, som reagerer på peptidkonjugaterne og I

på det rensede PI. 16 samt på OMC. Til sammenligning har H 10 samme konstruktion, når den er formuleret med alun, været i

stand til at udløse større antistof reaktion ved en ækvivalent I

dosis. Tilsvarende er rekombinantflageliinerne pCBl-4 og I

I pCB2-W også blevet formuleret med CFA. Også her iagttages I

der ækvivalente eller højere antistoftitere i nærvær af CFA.

15 Resultaterne af immunogenicitetstudier med VR1- og I

I VR2-meningocockonjugater er også vist i tabel IV. Både M20-

I og M21-CRM197-konjugaterne samt en blanding indeholdende I

lige store mængder af begge konjugater har været i stand I

til at frembringe en anti-CRMj^-reaktion samt en anti-OMP-

20 -reaktion mod OMP af klasse 1. I

I Disse foreløbige data viser, at epitoper med variabel I

region fra OMP af klasse 1 enten kemisk konjugeret til et I

I bærestof eller genetisk fusioneret til et bærestof udløser

I en immunreaktion. Nye epitop-bærestof-konjugater kan frem- I

I 25 stilles ved anvendelse af standardteknik til forøgelse af I

vaccinens immunreaktion, f.eks. anvendelse af 1) større epi- I

toper, 2) peptider med flere epitopgentagelser og/eller 3) I

forskellige bærestoffer. I

30 Eksempel 14. I

Fremstilling af meninqococ - humant - seruma ] bi inri n-glvcoconi ugat. I

GCM CPS depolymeriseres ved sur hydrolyse, og det I

opnåede GCM OS aktiveres derefter via NaI04-oxidation i I

vandig puffer. Reaktionerne overvåges ved HPGPC i vandigt 35 elueringsmiddel ved anvendelse af UV- og RI-påvisning. Reak-

tionerne efterfølges hver især ved GPC-afsaltning i vand. I

57 DK 175788 B1 GCM OS og humant alubmin (HA) blandes og konjugeres i alt væsenligt som beskrevet i eksempel 10 for meningococ-flagel-lin-glycokonjugatet. Slutpræparatet opbevares i kulden i nærvær af thimerosal til forhindring af bakterievækst.

5 Ved fremstilling af konjugatet anvendes følgende forsøgsbetingelser. Humant albumin (HA; "Sigma®", St. Louis, MO) opløses i 15%'s saccharose (10 mg/ml) og opbevares derefter ved -20°C. GCM CPS (portion nr. 86 NM 01; 106 mg; slutkoncentration 10 mg/ml) hydrolyseres i 0,1 N HCl ved 10 50°C under omrøring. Portioner på 25 μϋίεΓ udtages med regelmæssige mellemrum, reaktionen standses ved tilsætning af natriumhydroxid (NaOH), og analyse gennemføres ved HPGPC som beskrevet. Efter 3 timer og 40 minutter standses reak- ! tionen ved tilsætning af NaOH, og GCM OS afsaltes ved GPC.

15 Fraktioner opsamles (1,2 ml) og analyseres som ovenfor beskrevet. Positive fraktioner slås sammen og lyofiliseres.

Derefter opbevares 89 mg af saltet GCM OS ved -20°C. Aktiveret OS fremstilles ved oxidation af 11,8 mg GCM OS (slutkon- ! i centration 5 mg/ml) med 2 mM NaI04 i 0,05 M natriumphosphat- j i 20 puffer (pH 6,2-6,5) ved stuetemperatur i mørke under omrøring. Reaktionen standses efter 30 minutter ved tilsætning af ethylenglycol. HPGPC-analyser viser ingen sønderdeling af molekylvægten af OS under aktivering. Afsaltning og kolo-rimetrianalyser gennemføres derefter som ovenfor beskrevet.

25 Det resulterende, aktiverede GCM OS (8,8 mg) opløses i vand (10 mg/ml) og fryses ved -20°C.

Begge opløsninger af GCM OS og HA analyseres ved HPGPC (UV ved hhv. 206 og 280 nm), før de fryses, og før de konjugeres. Der sker ingen sønderdeling under opbevaring, 30 således som det viser sig ved den nøjagtige ensartethed af elueringsprofilerne.

6 mg GCM OS (slutkoncentration 2,5 mg/ml) og 12 mg HA (slutkoncentration 5 mg/ml) blandes i et polypropylenglas i 0,4 M natriumphosphatpuffer (pH 7,0), og 60 μπιοί NaBHjCN 35 tilsættes til initiering af konjugeringen, jvf. US patentskrifterne nr. 4.762.713, 4.673.574 og 4.761.283 (1988).

I DK 175788 B1 I

I 58 I

Reaktionsblandingen henstår 1 dag ved stuetemperatur og I

derefter 4 døgn ved 15-35°C uden omrøring. Reaktionen over- I

våges ved HPGPC (UV ved 280 nm) på forskellige stadier og I

standses til sidst ved dialyse/koncentrering på mikrokoncen- I

5 tratorer. Slutpræparatet analyseres for indhold af NANA, H

I jfr. Barry et al., J. Gen. Microbiol. 29, 335-351 (1962) I

(2,07 mg; 0,86 mg/ml) , og protein, jfr. Lowry et al., J. I

I Biol. Chem. 193, 265-275 (1951) (9,51 mg; 3,96 mg/ml). Deref- I

I ter opbevares det ved 4°C i nærvær af thimerosal (0,01%, I

H 10 vægt/vol for at forhindre bakterievækst. I

Konjugatpræparatet kontrolleres også ved analyse ved I

SDS-PAGE (sølvnitratfarvning) og Western-pletter. På gelen I

viser der sig et diffust bånd, som dækker et signifikant I

bredere molekylvægtområde end det rene HA. Westem-pletanaly- I

15 se har vist, at dette bånd er reaktivt med de anvendte anti- I

sera (anti-GCM), hvilket beviser covalens af konjugatbindin-

I gerne. I

Eksempel 15. I

20 Immunoaenicitet af meningococoligosaccharid-rekombinantfla- I

I gellin-vacciner. I

En meningococol igosaccharid-rekombinantf lagellin- I

vaccine fremstilles som ovenfor beskrevet og formuleres med I

100 μg protein/ml. Der fremstilles ligeledes vaccinepræpara- I

I 25 ter, som indeholder aluminiumphosphat (1 mg/ml) eller

I Freund’s komplette adjuvans foruden glycokonjugatet. I

Til vurdering af immunogeniciteten immuniseres udavle- I

I de Swiss-Webster-mus intramuskulært med 10 μg protein i uge H

I 0 og 2. Sera indsamles i ugerne 0, 2 og derefter med ugent- I

30 lige mellemrum op til 6 uger. Efter indsamling afprøves de I

I forenede seraprøver for antistofaktivitet ved ELISA mod I

I meningococcus-oligosaccharid-konjugat til humant serumalbu-

I min-, OMC-, PI.16-, CB1- og CB2-BSA-konj ugat er og flagellin. I

I MenC-CB12-10-6-glycokonjugatet er effektivt til udløs- I

I 35 ning af en immunreaktion, som er reaktiv med både oligosac- I

I charid- og meningococcus B-OMP-epitoperne eksprimeret i I

59 DK 175788 B1 rekombinantflagellinet. Som vist i tabel VB har mus immuniseret med 1 μg af MenC-CB12-10-6-konjugatet i Freund's komplette adjuvans så lidt som 3 uger inde i studiet påviseligt antistof imod MenC-HSA, OMP og mod både CB1- og CB2 epitoper-5 ne. Endvidere har alle MenC-CB12-10-6-præparaterne, uanset adjuvans, udløst antistofreaktion imod MenC-HSA, som er større end den reaktion, som er iagttaget efter immunisering med MenC-CRM197>

Tabel VB

10

Immunogenicitet af meningococcus C-rekombinantflagellin-vaccine 1 uge efter sekunder immunisering.

ELISA-titere1

Immunogen Dosis MenC-HSA OMP CB1-BSA CB2-BSA Flagellin 15 ----------------------------------------------------------------------

MenC-CB12-10-6 CFA 10 24.530 608 5.240 432 541.467 1 5.069 5.614 5.375 12.685 526.593 20 alun2 10 11.845 253 835 673 472.766 1 4.415 136 242 244 214.263

Intet 10 11.497 920 626 2.382 233.307 1 4.920 483 1.123 1.210 135.625 25

MenC-CRM197 alun 10 4.905 ND ND ND ND

1 8.505 ND ND ND ND

OMP {PI.16) alun 10 ND 12.907 <100 <100 ND

30 1 ND 10.405 <100 3.377 ND

1 Titere for indledende prøver inden immunisering (uge 0) er <100.

2 Aluminiumphosphat er blevet anvendt som adjuvans i 1 mg/ml.

35

Eksempel 16.

T-celleepitODer af OMP af klasse 1 og deres identificering.

En effektiv vaccine skal indeholde én eller flere T-40 celleepitoper. T-celleepitoper i et protein kan forudsiges som beskrevet af Margalit et al., J. Immunol. 138. 2213 (1987); eller Rothbard og Taylor, EMBO J. 7, 93 (1988).

Disse forudsigelsesmetoder er blevet anvendt på aminosyrese-kvensen i OMP af klasse 1 fra stammerne PI.7,16, PI.16 og 45 Pi.15 af N. meningitidis. De segmenter i sekvensen, som

DK 175788 B1 I

indeholder potentielle T-celleepitoper identificeret ved H

disse me.toder, er vist i tabellerne VI og VII. H

Tabel VI I

5 Analyse af sekvensen i OMP fra N. meningitidis PI. 16 for H

tilstedeværelsen af amphipatiske α-spiraler ved metoden H

ifølge Margalit et al., J. Immunol. 138. 2213 (1987). H

Midtpunkter H

10 af blokke Vinkler AS I

P 47-50 85-105 9,4 I

69-74 105-135 16,0 I

15 K 79-88 90-120 23,0 I

127-135 100-120 22,4 I

* 199-202 90-120 8,4 I

P 208-211 85-95 8,7 I

260-263 90-125 8,8 I

20 P 265-269 90-120 11,3 I

274-277 105-120 9,8 I

297-300 100-135 9,1 I

P 320-324 80-100 10,9 I

* 338-342 105-135 12,3 I

25 * 346-351 80-115 11,9 I

* 376-379 85-120 9,5 I

-1 • i j ! DK 175788 B1 61

Tabel VII

Tilstedeværelsen af motiver (understregede regioner), som repræsenterer potentielle T-celleepitoper i sekvenserne i OMP fra N. meningitidis PI.16 som påvist ved metoden ifølge 5 Rothbard og Taylor, EMBO J. 7, 93 (1988) Ηλ X K LTALVL8ALFLAAVADV8LY0 C I KACVICINt QAQLTEQPQVTMOVQGNQV K V T « A Illtlttlltrc i M CriCUDlCICl K A V W 0 LEQDV8VA00GA8QWG κιμπ cue t r otu a c »va« ireotiotumi

15 N N D V A 8 0 L Gift U D 0 K > V I V U t 1 Τ I Μ 0 Π 0 I V Q

TVT AQHmAtUnn>0!IIIUinvrUV0M.0l DVYYAGLHYKNG OFAO N Y λ t ΙΤΑ» lAKVOIIAMU

20 ii outiDiAioTmimoviiiTcouiocmA

lAAOUimCDIAITIIIITT haat aiyiygnavf » m a h c r p t i 8 loitemiYDm ucvcnrm

T S A I V S CA>U IITC1CNYT0IKAAIVOUIIT

25 30 De forudsagte peptider er blevet syntetiseret ved FMOC-standardmetoder, renset ved standardmetoder og identificeret som vist i tabel VIII.

35 40 45

I DK 175788 B1 I

I I

I Tabel VIII I

Resumé af syntetiserede, forudsagte T-celleepitoper. I

I 5 Rest nr. Sekvens I

I 1. 16-34 NIQAQLTEQPQVTNGVQGN I

I 2. 47-59 TKISDFGSFIGFK . I

3. 57-71 GFKGSEDLGEGLKAV I

I 104. 78-90 VSVAGGGASQWGN I

I 5. 103-121 TLRAGRVANQFDDASQAIN I

I 6. 124-137 DSNNDVASQLGIFK I

I 7. 151-158 GGFSGFSG I

I 8. 176-185 YYTKDTNNNL I

I 15 9. 190-202 AWGKPGSDVYYA I

10. 215-228 YAFKYARNAHVGRN I

I 11. 223-245 ANVGRNAFELFLIGSATSDEAKG I

I 12. 241-261 DEAKGTDPLKNHQVHRLTGGY I

I 13. 276-291 LSENGDKAKTKNSTTE I

I 20 14. 304-322 VPRISYAHGFDLIERGKKG I

I 15. 317-329 ERGKKGENTSYDQ I

I 16. 352-366 KRNTGIGNYTQINAA

25 For at fastlægge hvilke af de forudsagte peptider, I

som faktisk indeholder T-celleepitoper, er deres evne til I

stimulering af humane, perifere blodlymfocyter (PBL) blevet I

afprøvet ved en lymfocytformeringsafprøvning. Kort fortalt I

indsamles perifert blod fra HLA-typebestemte, normale frivil- I

30 lige eller fra frivillige, som i forvejen er immuniseret H

med MPC-2, jvf. J.T. Poolman et al., Antonie van Leeuwenhoek I

I 53., 413-419 (1987), som indeholder PI. 16, 15, OMP af klasse I

4 og polysaccharid fra gruppe C. Lymfocyter isoleres fra H

I det perifere blod ved isolering på "Ficoll-Hypaque®" {Phar- H

I 35 macia Fine Chemicals AB, Uppsala, SE) og dyrkes med 1 x 10^ H

I celler/hul i suppleret RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Paisly, H

H Skotland) indeholdende 10% varmeinaktiveret, forenet, humant H

I AB-serum. Kulturerne tilskyndes med forskellige koncentratio- H

63 DK 175788 B1 ner af de forudsagte T-celleepitoper (0,05-10 μg/ml). Efter tilskyndelse in vitro inkuberes kulturerne i 6 døgn og pulseres derefter (18 timer) med 0,5 μϋί [-^H] -thymidin. Derefter høstes kulturerne og tælles ved væskescintillation. Data er 5 udtrykt som stimuleringsindeks, som er beregnet som forholdet mellem CPM opnået i nærvær af antigen og CPM opnået i fravær af antigen.

!

I DK 175788 B1 I

i 64 I

I il i

j U! I

Η Η I i +l I I i i I I I i i ^H

I il

I I

I

Hi'9'1 H

“j Η I I + + I 1 I I I I 1 + i H

Η H

I I I

δ :

Η H

i* <N I H

^H Tf Hl ^H

Η H

H 2 Hl +1+ +11+11+111 +) ++I H

^B -c in ^B

Ό

H h ή 1 Λ H

H H JJ o I

^B Y Q η I I I I I ιΗ ^B

I u s : w H

ft D

2 0\ I I I I I 1 1 +

H r ω _ H

H 2 ·η 1 σι

H En V CO I + + + + +IIII + I+ +I + ++I+I + 1 H

M M » JJ i i ·* ^B

H 21 q ' rn H 5 > 1 ' v

^B 2 '2 H f·* I i + i I i i i I i ' M ^B

H -9 2 i ' w

H £ 2 .λ i ‘ v H

^H M c q j (N ^H

V£> I + +1111+

H 2 a ' H

Η ·η H

I li: I

I ^ S «* ί +ii + i η H

Η H

^B *!S Hil ill H

ft

H i H

Η η I I a> H

^B r (N i I I + i i i i + cn ^B

^B ni ir-l ^B

2 d 1 s

TJ D> I I+J

H ti Η I +-HIIIIIII 1 _ H

-il η I E

fi h i o H

2 i 01 -Ή I to Π i t n cm > in i T I -ri m Η H Min i co f? ih smMxJjJu in? ·αι

X IH - 3 m +J E E E 3- - 1 K

^B “ m I Ή U) - in V (Ud) HM'HM i t) H

^B Ή fti> HHtNSdJJ-i rojJjJM hhmh η ιηιηΗΗ in Ό H

^B r K i *h insin-Oinojinioinin in in in m in 3 3 h 3 3 m oj >+ H

jj JJ i H n 3'3oa)<UinSfl)<l)3rMSS53 3 --3. - m m i 3 H

'“i lliwin -η-ΗμΛ3·ΛΛ-ιη-"·- - nid .ιοηηϊϊι>

^B u, < 1 3 rNHH3d)(U - aj ®MSPiMi/ihMMninSin?iiiri - ·· 1 H

^B J 1 ¢) - m3 - - in ft 10 ~ftPt'-min--ininin2 - 3 3 m n 1 ω ^B

“ S 1 Ό o ro 3 - Η h -ri >, 3 m KSmri33rom333 -mtOH -r-iHifi H

-+.I V H in 'VOHHCJJ -HJJJJHH - - HH - - - CD H H H -U>33l H H

B CniM33i^3333 h3 33γ-·:>·33γ·ϊμ·ι-3333η3··''4> E ·η i 6)......E<uh-<do}..... rnvoic

£ ΗΙΒ·β·ΜΗ(ΝΐηΐηΕΛ;3Μ.ϋ.ϋΝΐηΗηΗΜΗΜΗ'3,ΗΜΐηΗΗ32ιΟ H

Ξ -Η I CQQQDQQ 1 hDQmhQQQQQQDQQQQQQGQQQ i JJ

H K > 1 3 U ' X

·Η 1 g .¾ .....-.............. (D

^B kiE......J«! 'ΟΗηη + ιηιοηιροιοΗηπίΊηΐίΜΐι ' ti H

^B Cl, ΙΗΗΜΗ^ωίΟΗΓ-αΐσιΗΗΗΗΗΗΗΗΗΗίΝΙΝΜΜΜίΝΙΝΙΝΜ I « H ir> o m o in o tn η h cn (N m m 65 DK 175788 B1

Som vist i tabel IX har 10 af de 16 forudsagte peptider vist en evne til stimulering af T-celler. Disse omfatter peptider identificeret ved 16-34, 47-59, 78-90, 103,121, 124-137, 151-158, 176-185, 223-245, 276-291 og 304-322. I

5 visse tilfælde har peptider stimuleret en reaktion hos både immuniserede og ikke-immune individer. Reaktionen hos de ikke-immune individer kan måske tilskrives en forudgående, symptomfri infektion.

Hvor der er tale om den T-celleepitop, som er iden-10 tificeret som region 176-185, er der blevet iagttaget forøgelse af T-cellereaktionen efter tilsætning af det monoklo-nale antistof MN5C11G {PI.16). Kort fortalt tilskyndes PBL in vitro med et syntetisk peptid indeholdende regionen 175-185 eller med dette peptid blandet med varierende fortyn-15 dinger af MN5C11G. Som vist i tabel X er der iagttaget forøgelse af T-cellereaktionen efter tilsætning af MN5C11G, hvilket viser, at monoklonalt antistof har erkendt en B-celleepitop i regionen 176-185 og letter præsenteringen af peptidec for immunsystemet. Det er således blevet fastslået, 20 at T- og B-celleepitoperne enten er sammenfaldende eller findes på fortløbende sekvenser i OMP af klasse 1.

Tabel X

25 Præsentering af et syntetisk peptid for perifere blodlymfo-cyter forøges af et monoklonalt antistof, som erkender regionen 179-184 i meningococ-OMP af klasse 1.

In vitro infektion CPM

30 .........................................................- GGYYTKDTNNNL 3.017 GGYYTKDTNNNL* + MN5C11G (1:200) 22.836 35 GGYYTKDTNNNL + MN5C11G (1:1000) 12.608

Medier 330 *Den understregede region angiver en sekvens, som erkendes 40 af det monoklonale antistof MN5C11G. 1 flere tilfælde er der blevet etableret T-cellelinier og kloner ud fra individer, som reagerer på forskellige

I DK 175788 B1 I

I I

I peptider. Kort fortalt er T-cellelinier blevet opnået ved I

dyrkning af isolerede lymfocyter i plader med 24 huller med I

1 x 10^ celler/ml. Kulturmediet, suppleret RPMI-1640 med I

10% humant serum, har ligeledes indeholdt 12 enheder/ml I

5 rekombinant-IL-2 (Boehringer). Desuden er der til hvert hul I

I tillige blevet sat 5 x 104 homologe, bestrålede (3000 R) , I

I antigenpræsenterende celler (APC). I visse tilfælde er APC I

I blevet opnået ud fra HLA-forenelige donorer. Ud fra linierne

I er T-cellekloner blevet isoleret ved begrænsende fortynding I

H 10 ved en frekvens på 0,5 celler/hul. Klonerne opretholdes ved I

stimulering hver anden uge med antigen i nærvær af bestrå- I

let APC og IL-2 (2 enheder/ml) . Klonerne afprøves ved en I

lymfocytformeringsafprøvning i alt væsentligt som oven for- I

beskrevet, bortset fra at klonerne dyrkes med l x 104 cel- I

15 ler/hul i nærvær af bestrålet APC. I

Kloner opnået som beskrevet tilskyndes in vitro med I

OMP fra 7 forskellige meningococstammer. Som vist i tabel I

XI har klonerne erkendt én eller flere T-celleepitoper, som I

er fælles for de 7 undersøgte OMP'er. I

I 20 I

Tabel XI I

Erkendelse af OMP fra forskellige meningococstammer ved hjælp af humane I

H T-cellekloner.

25 ................................----------------------------------- I

Under- Reaktion af humane T-cellekloner (CPM x 10~3) I

I Stamme type 5-5 5-7 5-9 5-12 5-13 5-14 5-15 I

I ...............................................................— I I

I H44-76 PI.16 6,0 1,2 6,8 2,6 2,3 9,5 1,5 I

I 30

I Swiss 4 PI.15 4,9 1,0 10,1 6,9 3,6 10,5 1,4 I

395 PI.9 5,2 1,5 4,8 1,5 6,1 13,1 1,4 I

35 2996 PI.2 5,4 1,0 3,7 2,3 3,4 11,8 1,0 I

M990 PI.6 3,6 0,4 3,5 2,5 0,9 4,7 0,6 I

187 Pl.l 4,4 0,7 4,5 3,1 1,6 6,2 1,4 I

I 40 I

6557 PI.17 3,7 2,0 8,2 4,2 1,7 6,2 0,8 I

Medier --- <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 I 45 67 DK 175788 B1 !

Selv om reaktiviteten af disse kloner over for de forskellige peptider endnu mangler at blive bestemt, viser disse data ikke desto mindre fællespræget hos T-celleepitoper blandt de forskellige stammer. Da disse kloner nu er blevet 5 etableret og identificeret, vil deres peptidreaktivitet angive T-celleepitoper til vaccineanvendelse.

Eksempel 17.

Konstruktion af en proteinmodel for membrantopologi hos OMP 10 af klasse 1 og sammenligning med andre, patogene, gramnegative poreproteiner til vaccineudviklinq.

Der konstrueres en model ved anvendelse af de principper, som er erkendt for strukturen af nogle ydermembranproteiner fra Escherichia coli, jvf. H. Vogel et al. (1986), 15 supra; T. Ferenci et al. (1988), supra; J. Tommassen (1988), supra. Den centrale antagelse er, at proteinsegmenter, som spænder over ydermembranen, danner β-ark. Hvor der specifikt er tale om protein af klasse l, blotlægges opdelingen, og j der nås frem til transmembransegmenter på følgende måde: ' 20 1. En sammenligning mellem aminosyresekvenseme i protein af klasse 1 (undertype Pi.16) og sekvenserne i gono-cocproteinerne PIA og PIB, jvf. N.H. Carbonett et al. (1987), PNAS 84» 9084; N.H. Carbonetti et al.

(1988) PNAS 85, 6841; E.C. Gotschlich et al. (1987), 25 PNAS 84., 8135, afslører 34% identitet. I modellen danner de variable sekvenser de overfladeblotlagte dele, medens de bevarede regioner for det meste er placeret i ydermembranen og periplasmaet. De to sidstnævnte arealer består således for 58%'s vedkommende 30 af rester, som er bevaret blandt alle proteiner.

2. De hydrofile maksima som iagttages i en hydropathipro-fil, jvf. J. Kyte et al. (1982), J. Mol. Biol. 157.

105, svarer til blotlagte regioner.

3. Transmembransegmenterne bør fortrinsvis være i stand 35 til at danne amphipatiske beta-strenge på 9-12 rester, idet mindst den ene side består fuldstændigt af hydro-

I DK 175788 B1 I

I 68 I

I fobe rester. Disse betingelser er opfyldt i 12 af de H

I 16 segmenter, som spænder over membranen. I

4. Antallet af rester på den periplasmiske side er mini- H

I meret. I

I 5 Fig. 11 viser en model for foldningen af protein af H

I klasse 1 i ydermembranen. Den viste sekvens er for undertype I

I PI. 16. Den øverste del af figuren viser de overfladeblotlagte I

I regioner, medens midterdelen viser de formodede transmembran- I

I segmenter, hvis længde er sat til 10. Aminosyrer er vist I

I 10 alternerende, hvor de kan danne en amphipatisk beta-streng. I

Denne model indeholder 8 overfladesløjfer, idet den første I

og den fjerde sløjfe indeholder de typespecifikke og beskyt-

H tende epitoper med variabel region. Disse epitoper kan, H

I således som det er blevet vist, når de er formuleret til en H

I 15 vaccine, udløse en beskyttende immunreaktion. Sløjfe 5 er H

I konstant, og det er blevet vist, at den frembringer krydsre- H

aktive antistoffer mod andre OMP'er, og at den er anvendelig H

til vaccineformulering. H

I Den ene eller de to variable ep i topregi oner i de H

I 20 individuelle proteiner er placeret på såkaldte overfladesløj- H

I fer i disse membranproteiner. Sådanne poreydermembranprotei- I

I ner indeholder mere end 2 overfladesløjfer. Dette indebærer, H

H at der findes overfladesløjfer, som også har næsten identisk H

I aminosyresekvens i de forskellige ydermembranproteiner af H

25 klasse 1. Dette åbner vejen til anvendelse af fælles peptider H

i ydermembranproteinet af klasse 1 også til vaccineformål. H

Mere specifikt er der i fig. 11 vist en skematisk, todimen- I

I sionel model af meningococydermembranproteinet PI.16 af H

klasse 1. Denne model indeholder 8 overfladesløjfer, idet H

I 30 den første og den fjerde sløjfe indeholder de typespecifikke H

I epitoper som vist på basis af stammeundertypebestemmelses- H

I resultater. Den femte overfladesløjfe repræsenterer den H

I ovenfor beskrevne, konstante region. Antistof mod den kon- H

I stante region i sløjfe 5 ser ud til at reagere med OMP-kom- I

I 3 5 pleks fra N. meningitidis. Aminosyresekvensen i OMP af klasse H

I 1, som afledt, er blevet sammenlignet med klasse-OMP fra N.

69 DK 175788 B1 meningitidis, jvf. K. Murakami et al. (1989), Infect. Immun.

57. 2318, og poreproteinerne PIA og PIB fra N. gonorrhoeae.

Med et tilsvarende princip som anvendt for modellering af klasse 1 er sekvenserne blevet opstillet som følger:

S

I DK 175788 B1 I

I I

Sløjfe 1 I

I Klasse I DVSLYGEIRAG VEGRNIQAQLTEQPQVTNGVQGN I

** *** **** * I

Klasse IB DVTLYGAIKAG V--------QTYRSVEHT I

H ** *** **** * I

I Klasse IA DVTLYGTIKAG VEGRNIQAQLTEQPET5RSVAKH I

** *** **** · I

I Klasse II DVTLYGTIKAGV EGRNIQAQLTEQPEVSRVKDAG I

** *** ***** I

I QVKVTKARSRXRTKI SDFGSTXGFKGSEDLGEGL I

* * ** ***** **** **· I

DGKVSKVET—G5EZ ADFGSKIGFKGQEDLGNGX» I

H * ** ******* * ** I

I GAQADRVKT—ATEI ADLGSKIGfKGQEDLGNGL I

· * * ** ***** ***** I

TYKAQGGKSKTATQ lADFGSKIGFKGQEDLGNGL I

* * ** ***** ** * ** I

I Sløjfe 2 I

I KAVWQLEQD VSVAGGGA5QWGN RESFIGLAGEFG I

******* * ********** I

I kavwqleqg asvagtktg-wgn RQSFVGLRGGFG I

H ** ***** * *** ** ** * ** I

kaiwoleqk ayvsgtdtg^wgn rqsfiglkggfg I

** ***** * *** ** ***** I

I KAIWQLEQ KASIAGTNSG-WGNRQSFIGLKGGFG I

** ***** * *** ** ** * ** I

I sløjfe 3 I

I TLRAGRVANQFDD ASQAINFWDSNNDVASQLQI- I

I I

I TIRAGSLNSPLKN TGANVNAWESGKFTGNVLEIS I

I I

I kvrvgrlnsylkd tggfnpwegksyylplsniaq I

I I

tveagkentvlkdsgdkvnawesgsntedvlglg I

I

71 DK 175788 B1

Sløj fe 4 -FKRHDD KFV SVRYDSPEFSGFSGSVQFV PAQNS ******* ** * * ** GMAQREH RYL SVRYDSPEFAGFSGSVQYA PKDNS ******* ** * * **

PEEREV---SVRYDSPEFAGFRAV—QYV PNDNS I

******* ** * * ** I

i TIGRVESREI SVRYD5FVTAGFSGSVQ YVFRDNA ******* ** * * ** KSAYKPAYYTKDTNNNLTLVPAWGKPGS DVYYA 1 * ! GS-----------------UG ESYHV i * i

GK-----------' NES ESYHA

* ND------;----VDKYKHTKSSR ESYEA ! *

Sløjfe 5 GLNYKNGGFAGNYAFKYA RHANVGRNArELFLlG ****** **

GLNYQNSGFFAQYAGLFQ RYGEGTKK---IE

* ** * * * ** GFNYKNSGFFVQYAGFYK RESYTTEKHFELFL— ********

GLKYENAGFFGQYA GSFAKYADLNTD-----AE

****** **

N

satsdeakgtdplkh QVHRLTGGYEEGGLNLALA

***** **· * *

DDQTYSIFSLFVEKL QVERLVGGYDNNALYVSVA

***** *** * *

-----------L QVERLVGGYDHPALYASVA

***** *** * *

RVAVNTANABPVKDY QVBRWAGYDANLLYVSVA

***** *** * *

I DK 175788 B1 I

I 72 I

I sløjfe 6 I

I AQLD LSE—NGDKAXTKNSTTE XAATASYRFGNA I

* * **** ***** I

AQQQ DAKLYGAMSGNSENSQTE VAATAAYRFGNV I

* * **** ***** I

I VQQQ DÆLTWRND-NSHNSQTE VAATAAYRFGNV I

* * * **** **** I

I GQ YEAAKNNEVGSTKGKKBQTQ VAATAAYRFGNV I

H * . g * **** ***** I

I Sløj fe 7 I

VTRISYABGFDLI ERGKKGENTSYDQ IIAGVDYD I

H fr m κι·««*·. H

I tprvsyaegfkgt vdsantrdnt-ydq vwgaeyd I

** ****** *****

I TPRVSYAHGFKGS VYDADNDNT-YDQ VWGAEYD I

** ****** * * * ** I

I TPRVSYABGF KAKVNGVKDANYQQDQ VIVGAD YD I

H ** ****** * * ** H

I Sløjfe S I

-1 I

FSKRTSAIVSGAWL KRNTGIGNYTQIN AASVGLRBKF

******* ** ** * * ***** I

I FSKRTSALVSAGWL QGGKGADKIV-ST ASAWLRHRF I

******* ***** * ***** I

FSKRTSALVSAGWL QRGKGTEKFV-AT VGGVGLRHKF I

*********** * ******

_i I

I FSKRTSALVSAGWD KQGKGTGKVEQ-TASH VGLRHKF I

******* ***** * ***** DK 175788 B1 73

Strukturelle ligheder er angivet med transmembran-og overf ladesløj feregioner. Med den information, som nu er til rådighed for OMP af klasse 1, og information baseret på overfladesløjfestørrelse, placering, aminosyrehomologi eller 5 -heterologi mellem arterne for sløjferegionerne i det specielle poreprotein er forudsigelser af epitoper til inkorporering i vacciner imod andre patogene, gramnegative bakterier, herunder N. gonorrhoeae, mulige. Ved anvendelse af metoder, som er anvendt for OMP af klasse 1, kan disse epitoper vur- ' 10 deres til vaccineformål.

Deponering af mikroorganismer.

Stammen H44/76 (B:15:PI.7,16) af N. meningitidis er blevet deponeret den 11. december 1989 i Centraal Bureau 15 voor Schimmelculturen (CBS), Baarn, NL, og har deponeringsnummer CBS 635.89. Mutanten HIII-5 af N. meningitidis, som mangler OMP af klasse 2/3, er blevet deponeret den 11. december 1989 hos CBS, Baarn, NL, og har deponeringsnummer CBS 636.89.

20 Ækvivalenter.

Ved anvendelse af udelukkende rutinemæssig forsøgs- i virksomhed vil fagfolk på området erkende, eller være i stand til at fastlægge, mange ækvivalenter til de her be-25 skrevne, specifikke udførelsesformer for opfindelsen. Sådanne j ækvivalenter skal forstås som værende omfattet af de efterfølgende patentkrav.

30 35

Claims (36)

1. 74 I Patentkrav. I
2. 1. Vaccine, som er effektiv mod meningococsygdom, I I omfattende en effektiv mængde af en ydermembran-vesicel I isoleret fra en gensplejset eller mutant meningococstamme, I 5 hvor vesiclen omfatter mindst ét meningococ-klasse l-yder- I membranprotein, et fragment deraf eller et oligopeptid inde- I holdende en epitop deraf, hvor proteinet, fragmentet eller I oligopeptidet kan fremkalde en baktericid immunreaktion i I en værtsorganisme, og ikke omfattende et meningococ-klasse I 10 2/3-ydermembranprotein, idet meningococ-klasse 1-ydermembran- I proteinet stammer fra en mutant meningococstamme, som er I negativ for klasse 2/3-ydermembranprotein. I
3. 2. Vaccine ifølge krav l, hvor meningococ-klasse 1- I ydermembranproteinet er dannet ud fra en meningococ af gruppe I
4. 15 A, B, C, W-135 eller Y. I
5. 3. Vaccine ifølge krav 1, hvor fragmentet af menin- I gococ-klasse 1-ydermembranproteinet er opnået ved a) cyåno- I genbromidbehandling af et klasse 1-ydermembranprotein eller I b) proteolyse med et enzym valgt blandt endoLys-C, endo- I
6. 20 Arg-C, endoGlu-C og Staphylococcus-V8-protease. - I
7. 4. Vaccine ifølge krav l,hvor oligopeptidet omfatter I a) mindst én baktericidt antistof-bindende epitop af meningo- I coc-klasse 1-ydermembranproteiner eller b) mindst én amino- I H syresekvens valgt blandt QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, I H 25 YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQT- I H PQSQP og HYTRQNNTDVF. I
8. 5. Vaccine ifølge krav l, hvor epitopen er lokaliseret I i overfladesløjfer af meningococ-klasse 1-ydermembranprotei- I ner i området af aminosyrerne 24-34 og 176-187. I 30 6.1 det væsentlige renset fragment af klasse l-yder- I membranprotein af Neisseria meningitidis, hvor fragmentet I har en molekylvægt på ca. 25 kD eller mindre og indeholder kontinuerlige eller diskontinuerlige epitoper, som er reak- I tive med baktericide antistoffer mod N. meningitidis, og I 35 epitoperne er lokaliseret i overfladesløjfer af meningococ- I klasse 1-ydermembranproteiner i området af aminosyrerne 24- I 75 DK 175788 B1 34 og 176-187. !
9. 7. Fragment følge krav 6, hvor klasse 1-ydermembran -proteinet er af undertypen PI.7.16.
10. 8. I det væsentlige oprenset oligopeptid ifølge krav j 5 6, indeholdende en B-celleepitop af et klasse 1-ydermembran- protein, som varierer i aminosyresekvens mellem forskellige meningococ-porin-proteiner.
11. 9. Oligopeptid ifølge krav 8, indeholdende mindst én af aminosyresekvenserne valgt blandt QPQVTNGVQGN, PPSKSQP,
12. 10 QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTN-NNL, HFVQQTPQSQP og HYTRQKNTDVF.
13. 10. I det væsentlige renset oligopeptid ifølge krav | i 6 indeholdende en B-celle- eller T-celle-epitop af et klasse j l-ydermembranprotein, som er konserveret i aminosyresekvens ' 15 mellem forskellige meningococ-porin-proteiner. , 11. I det væsentlige renset oligopeptid ifølge krav 6, indeholdende en T-celleepitop af et meningococ-klasse 1-ydermembranprotein.
14. 12. Isoleret nucleinsyre, som koder for klasse 1-20 OMP-protein med fuld længde, som har én af følgende sekvenser: DVSLYGEIKAGVEGRNFQLQLTEPPSKSQPQVKVTKAKSRIRTKISDFGSFIGFKGSEDLG eglkavwqleqdvsvagggatqwgnresfvglagefgtlragrvanqfddasqaidp WDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYD S PDFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAHYTRQN 25 NTDVFVPAWGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGSYAFKYARHANVGRDAFELFLLGSTSD EAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKAKTKNSTTEIAATASYR FGNAVPRISYAHGFDLIERGKKGENTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAWLKRNTGIGN YTQINAASVGLRHKF; eller DVSLYGE IKAGVEGRNYQLQLTEAQAANGGASGQVKVTKVTKAKSR1RTKI SDFGS FIGF 30 KGSEDLGDGLKAVWQLEQDVSVAGGGATQWGNRESFIGLAGEFGTLRAGRVANQFDD ! ASQAIDPWDSNKDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPA YYTKNTNNNLTLVPAWGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGNYAFKYARHANVGRNAFEL FLIGSGSDQAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKTKNSTTEIAA TASYRFGNAVPRISYAHGFDFIERGKKGEMTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAWLKRN 35 TGIGNYTQINAASVGLRHKF. I DK 175788 B1 I
15. 76 I
16. 13. Isoleret oligonucleotid, som koder for epitop I I lokaliseret i overfladesløjfer af meningococ-klasse 1-yder- I I membranproteiner i området af aminosyrerne 24-34 og 176- H I I I 5 14. Præparat til fremkaldelse af en beskyttende immun- H I reaktion mod Neisseria meningitidis, omfattende a) et liposom I I omfattende et eller flere meningococ-klasse 1-ydermembran- proteiner, men ikke omfattende et meningococ-klasse 2/3- I ydermembranprotein eller fragment deraf, og eventuelt et I 10 adjuvans i en farmaceutisk acceptabel bærer, eller b) et I liposom omfattende mindst ét oligonucleotid indeholdende en I kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop af et klasse 1- I ydermembranprotein, som er reaktivt med baktericide antistof- I I fer mod N. meningitidis, men ikke omfatter en epitop af et H 15 klasse 2/3-ydermembranprotein, og eventuelt et adjuvans i I en farmaceutisk acceptabel bærer, hvor klasse 1-ydermembran- H I proteinet eller -proteinerne har én af de to følgende sekven- I ser: I I DVSLYGEIKAGVEGRNFQLQLTEPPSKSQPQVKVTXAKSRIRTKISDFGSFIGFKGSEELG I 20 E GLKAVWQLEQDVS VAGGGATQWGNRE S FVGLAGE F GTLRAGRVANQFDDASQAID P I WDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYDSPDFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAHYTRQN I I NIOVTVPAWGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGSYAFKYARHANVGRDAFELFLLGSTSD I I EAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLS ENGDKAKTKNSTTEIAATASYR I I FGNAVPRISYAHGFDLIERGKKGENTSYDQI IAGVDYDFSKRTSAIVSGAWLKRIiTGIGN I
17. 25 YTQI NAAS VGLRHKF; eller I I DVSLYGEIKAGVEGRNYQLQLTEAQAANGGASGQVKVTKVTKAKSRIRTKISDFGSFIGF I I KGSEDLGDGLKAVWQLEQDVSVAGGGATQWGNRESFIGLAGEFGTLRAGRVANQFDD I I ASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYDS PEFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPA I I YYTKNTNNNLTLVPAWGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAOTYAFKYARHANVGRNAFEL I I FLIGSGSDQAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKTKNSTTEI AA I I TASYRFGNAVPRI5YAHGFDFIERGKKGENTSYDQ11AGVDYDFSKRTSAIVSGAWLKRN I I TG IGNYTQINAASVGLRHKF - I
18. 15. Antigenisk konjugat, omfattende et bæreprotein I I 35 eller en epitop deraf, hvortil der er konjugeret et fragment H I af et meningococ-klasse 1-ydermembranprotein med en molekyl- H I I i 77 DK 175788 B1 vægt på 25 kD eller mindre indeholdende en epitop valgt ; blandt QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTK-NTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP og HYTRQNNTDVF, ! forudsat at bæreproteinet ikke er β-galactosidase. I i
19. 16. Antigenisk konjugat ifølge krav 15, hvor antigen- ! , bæreproteinet er et bakterielt toxin, CRM eller en epitop deraf.
20. 17. Genetisk fusionspeptid eller -protein, omfattende et bæreprotein, peptid eller epitop deraf, hvortil der er 10 fusioneret et fragment af et meningococ-klasse 1-ydermembran-protein med en molekylvægt på 25 kD eller mindre indeholdende en epitop valgt blandt QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP og HYTRQNNTDVF, forudsat at bæreproteinet ikke er S-15 galactosidase.
21. 18. Fusionsprotein omfattende et flagellin-protein, som har en aminosyresekvens for en epitop af et meningococ-klasse 1-ydermembranprotein indføjet deri.
22. 19. Fusionsprotein ifølge krav 18, hvor aminosyrese-20 kvensen er indføjet a) i flagellin-proteinet i et område, som er ikke-essentielt for funktionen af flagellin-proteinet, eller b) er indføjet i den hypervariable region af flagellin-proteinet.
23. 20. Fusionsprotein ifølge krav 18, yderligere omfat-25 tende meningococ-kapsel-oligo- eller -polysaccharid konjugeret dertil.
24. 21. Rekombinant gen, som koder for et fusionsprotein ifølge krav 17.
25. 22. Rekombinant mikroorganisme, som kan eksprimere 30 et fragment af et klasse 1-ydermembranprotein af Neisseria meningitidis med en molekylvægt på 25 kD eller mindre, som indeholder en kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop, som er reaktiv med klasse 1-OMP-specifikke antistoffer mod N. meningitidis. ;
26. 23. Mikroorganisme ifølge krav 22, hvor epitopen er valgt blandt QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, I DK 175788 B1 I I 78 I YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP og HYTR- I I QNNTOVF. I
27. 24. Mikroorganisme ifølge krav 22, som er et vac- I I ciniavirus, adenovirus, cytomegalovirus eller en bakterie I I 5 af slægten Salmonella. I
28. 25. Mikroorganisme ifølge krav 22, hvor epitopen af I I meningococ-klasse 1-ydermembranproteinet eksprimeres som et I rekombinant flagellin. I
29. 26. Mutant meningococstamme, som ikke er i stand til I I 10 at producere klasse 2- og 3-ydermembranprotein. I
30. 27. Mutant meningococstamme HIII5, CBS636.89, som 1 I ikke er i stand til at producere klasse 2- og klasse 3-yder- I I membranprotein. I
31. 28. Gensplejset Neisseria-stamme, som er negativ for I I 15 klasse 2/3-ydermembranproteiner, og som er i stand til at I eksprimere et intakt klasse 1-ydermembranprotein af Neisseria I I meningitidis, genetisk fusionsprotein deraf eller en kon- I I tinuerlig eller diskontinuerlig epitop, som er en reaktiv I I med klasse 1-OMP-specifikke antistoffer mod N. meningitidis. I I 20 29. Gensplejset mikroorganisme bestående af en Neis- I I seria-stamme, som er i stand til at eksprimere mere end ét I I klasse 1-ydermembranprotein af Neisseria meningitidis, hvor I I hvert protein individuelt omfatter mindst én kontinuerlig I I eller diskontinuerlig epitop, som er reaktiv med klasse 1- I I 25 OMP-specifikke antistoffer mod N. meningitidis. I
32. 30. Vaccine ifølge krav l, yderligere omfattende I flere klasse 1-ydermembranproteiner. I
33. 31. Vaccine ifølge krav l, yderligere omfattende H flere meningococ-klasse 1-ydermembranproteinfragmenter eller H 30 oligopeptider indeholdende en epitop deraf. . I
34. 32. Fremgangsmåde til ekspression af mindst ét menin- I gococ-klasse l-ydermembranprotein, som er i stand til at I fremkalde en baktericid immunreaktion hos en værtsorganisme, I omfattende indføjelse af mindst ét gen, som koder for menin- H 35 gococ-klasse 1-ydermembranprotein, i en rekombinant mikroor- I ganisme valgt blandt a) en mutant meningococstamme, som er I DK 175788 B1 79 , negativ for klasse 2/3-ydermembranprotein, eller b) en menin-gococ af gruppe A, B, C, W-125 eller Y, hvorved mikroorganismen er i stand til at eksprimere genet som intakt protein, , som er i stand til at fremkalde en baktericid immunreaktion 5 hos en værtsorganisme. , 33. Fremgangsmåde ifølge krav 32, hvor mikroorganismen er en Neisseria-stamme.
35. 34. Fremgangsmåde ifølge krav 33, hvor meningococ-stammen eksprimerer mere end ét meningococ-klasse l-yder- 10 membranprotein.
36. 35. Gensplejset Neisseria-stamme, som er i stand til at eksprimere et ikke-nativt intakt klasse 1-ydermembranprotein af Neisseria meningitidis, genetisk fusionsprotein deraf eller en kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop, 15 som er reaktiv med klasse 1-OMP-specifikke antistoffer mod N. meningitidis. 1 ------1^—