NO305463B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meningitidis, klasse 2/3 minusmutant av Neisseria Neisseria meningitidis stamme, samt mikroorganisme som uttrykker et fusjonsprotein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler fremgangsmåte for fremstilling av Neisseria meningitidis vaksine omfattende i det minste ett klasse 1 yttermembranprotein eller immunogen del derav, eventuelt en bakterielt antistoff-bindende epitop eller et fusjonsprotein eller peptid omfattende en epitop av et meningokokk klasse 1 yttermembranprotein, og ikke omfattende et miningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein.

Bakteriell meningitt er en betennelsessykdom i det sentrale nervesystem forårsaket av bakterievekst i og i nærheten av den bløte hjernehinne (leptomeninges). Meningitt er en akutt infeksjonssykdom som angriper barn og unge voksne, og forårsakes av Neisseria meninaitidis. blant andre årsaker omfattende andre bakterielle og virale patogener.

Meningokokker inndeles i serologiske grupper avhengig av tilstedeværelsen av enten kapsulære eller celleveggantigener. For tiden anerkjente serogrupper omfatter A, B, C, D, W-135, X, Y, Z og 29E som segregeres ved seroagglutinasjon. De poly-sakkarider som er ansvarlige for serogruppespesifisiteten av gruppen A, B, C, X, W-135 og Y er blitt renset.

Bærerhyppigheten for meningokokker er mye høyere enn fore-komsten av sykdommen. Noen personer er midlertidige bærere, mens andre er kroniske bærere som gir fra seg meningokokker enten mer eller mindre kontinuerlig eller bare sporadisk. MeningokokkbærertUstanden er en immuniseringsprosess, og i løpet av to uker etter kolonisering kan det påvises fremstilling av antistoffer mot meningokokker. Det synes som om baktericide antistoffer er rettet mot både det kapsulære polysakkarid og andre celleveggantigener.

Studier har vist at meningokokk yttermembraner har tre til fem hovedproteiner, med de dominerende 41.000 Mr eller 38.000 Mr proteinene som bærere av de serotypespesifikke determinantene. Mellom stammene er det en betydelig grad av heterogenitet i profilene av yttermembranproteinene på natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-elektroforesegeler (SDS-PAGE). Som definert ved peptidkartleggingsstudier omfatter proteinene 5 klasser, betegnet 1 til og med 5, basert på vanlige peptidstrukturer. Baktericide monoklonale antistoffer er blitt fremstilt mot 46.000 Mr klasse-l-proteinene, som i en viss utstrekning er felles blant stammene av forskjellige serotyper. (Frasch, CE. et al., (1985) p. 633, "New Developments in Meningococcal Vaccines", i G.K.Schoolnik et al., (utgivere) The Pathogenic Nisseriae, American Society for Microbiology, Washington, D.C.).

Det kapsulære polysakkaridet i gruppene A-, C-, W-13 5- og Y-meningokokker er blitt anvendt til utvikling av vaksiner mot denne organisme. Selv om disse vaksiner har vært effektive for en kort tid, vil de ikke indusere immunologisk hukommelse, og individer må revaksineres etter ca. 3 år for å opprettholde sin motstand. Gruppe B-polysakkaridet er bare dårlig immunogent, og vellykkede vaksiner er ikke blitt fremstilt. En mulig forklaring for den lave aktivitet kan skyldes at det induseres toleranse for gruppe B-polysakkaridet av kryssreaktive antigener som finnes i humant vev, som i hjernen. Dessuten viser studier at de fleste av de baktericide antistoffer i rekonvalesenssera fra pasienter som hadde hatt gruppe B-meningokokksykdom, er rettet mot yttermembranproteiner.

Vaksiner for beskyttelse mot gruppe B-meningokokksykdom er blitt utviklet, hvor det ble administrert ikke-kovalente komplekser av ytter-membranproteiner (OMP) og gruppe B-polysakkarid, Beuvery, et al., (1983) Infect. Immun. 40 :369-380. B-polysakkaridet er imidlertid kjent for å indusere transient IgM-antistoffrespons, som ikke gir immunbeskyttelse. Dessuten er det høy antigenmangfoldighet og -variabilitet i meningo-kokkenes ytter-membranproteiner fra stamme til stamme. Dessuten finnes det også lipopolysakkarider i OMP, og de har også antigenvariabilitet.

Tsai et al. CM. et al., Journal of Bacteriology, 141nr. 1, s. 169-176, 1980 og Tsai CM. et al. CA : 94 : 205111z (1981) analyserer yttermembranproteinene av gruppe B meningokokker som produserer hele komplementet av villtype yttermembranproteiner.

De beskriver separasjonen av denaturert klasse 1, 2/3, 4 og 5 yttermembranproteiner ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese.Tsai et al. rapporterer ikke ytterligere isolering eller rensing av klasse 1 yttermembranprotein (OMP) i noe målbart utbytte eller noen ytterligere studier på klasse 1 yttermembranprotein. Tsai et al. rapporterer heller ikke fragmenter av klasse 1 yttermembranproteiner eller oligonukleotider basert på aminosyresekvensen av klasse 1 yttermembranprotein, fordi de ikke hadde noen informasjon om aminosyresekvensen. Heller ikke kunne de definere overflatelekkene (loops) av proteinet. De beskriver ingen fremgangsmåte som kunne benyttes til å fremstille en vaksine, de produserte ingen mutantstamme av Neisseria meningitids som mangler ett av yttermembranproteinene slik som foreliggende oppfinnere.

Wang, L.Y. og CE. Frash, Infection and Immunity, 46 : 408-414 (1984), US 4 601 903 og NO 88 36 47 beskriver fremstilling av yttermembranvesikkel-vaksiner. I alle disse referansene starter forfatterne eller oppfinnerne med stammer av Neisseria meninaitidis som produserer alle yttermembranproteinene, inkludert klasse 2/3 yttermembranprotein. Denne blanding er ikke anriket med hensyn på klasse 1 yttermembranprotein slik som vaksinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse.

EP 145 359 beskriver fremstillingen av vaksiner omfattende primært kapsulære polysakkarider kompleksert med en metall-konstituent. EP 145 359 beskriver ikke bruken av en klasse 2/3-manglende mutantstamme eller noen annen mutant av Neisseria meninaitidis i fremstillingen av en vaksine. Vaksinene som beskrevet i EP 145 359 inneholder derfor klasse 2 eller klasse 3 yttermembranproteiner i motsetning til vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Beuvery, E.C et al., Infection and Immunity, 40 : 369-380

(1983) beskriver fremstillingen av yttermembranprotein-komplekser. Imidlertid er de første trinnene i fremstillingen som beskrevet av Beuvery et al. å dyrke vi11typestammer av Neisseria meningitidis som produserer alle yttermembran-proteinene. Derfor inneholder kompleksene til Beuvery et al. klasse 2/3 yttermembranproteiner i motsetning til kompleksene som kan fremstilles ved anvendelser av den klasse 2/3-manglende stammen ifølge oppfinnelsen. Beuvery et al. foreslår ikke noen vaksine med en forandret sammensetning av yttermembranproteiner.

Barlow, A.K. et al., Infection and Immunity 55 : 2734-2740

(1987) beskriver konstruksjonen av et derivat av Agtll, benevnt

AA, som inneholder et omtrentlig 3.4 kb EcoRI fragment inneholdende den kodende sekvens for den C-terminale del av klasse1yttermembranprotein. Imidlertid var det ikke mulig å fastslå hvor mye av genet som koder for det C-terminale klasse1ytter-membranproteinet som ble kodet for av 3.4 kb EcoRI fragmentet. Barlow et al. (1987) presenterer hverken DNA- eller aminosyre-sekvensdata som beskriver OMP klasse 1 genet.

Det er behov for sikre og effektive vaksiner mot meningokokksykdom, som gir immunitet mot infeksjon, spesielt hos barn og eldre.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en yttermembranvesikkel-vaksine mot Neisseria meninaitidis omfattende i det minste ett klasse 1 yttermembran-protein eller immunogen del derav og ikke omfattende et meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein, kjennetegnet ved å dyrke en klasse 2/3 minus stamme av Neisseria meninaitidis. isolere vesikler fra kulturen for derved å fremstille ytter-membranvesikler, og tilsette yttermembranvesiklene til en farmasøytisk akseptabel bærer for derved å fremstille en vaksine.

Foretrukket er klasse 2/3 minusmutanten av Neisseria meninaitidis avledet fra en gruppe A, B, C, W-135 eller Y meningokokkus, også foretrukket kan den uttrykke mer enn en subtype av meningokokk klasse 1 yttermembranprotein.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meninaitidis omfattende i det minste ett renset klasse 1 yttermembranprotein eller fragmenter derav og ikke omfattende en meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein, kjennetegnet ved å dyrke en klasse 2/3 minus stamme av Neisseria meninaitidis. rense klasse 1 yttermembranprotein fra kulturen for derved å fremstille renset klasse 1 yttermembranprotein, tilsette lipider eller andre komponenter av farmasøytisk akseptable bærere til det rensede klasse 1 yttermembranproteinet som konserverer den antigene konformasjonen av klasse 1 yttermembranprotein, spalte det rensede klasse 1 yttermembranprotein med CNBr eller med en protease for derved å fremstille proteinfragmenter av klasse 1 yttermembranprotein, rense ett eller flere proteinfragmenter og tilsette til ett eller flere rensede proteinfragmenter, lipider eller andre komponenter av en farmasøytisk akseptabel bærer som konserverer den antigene konformasjonen til klasse 1 ytter-membranprotein .

I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse dekkes en fremgangsmåte for fremstilling av vaksine mot Neisseria meninaitidis omfattende minst en bakterielt antistoff-bindende epitop av meningokokk klasse 1 yttermembranprotein og ikke omfattende et meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein, kjennetegnet ved kjemisk syntese av en eller flere oligopeptider korresponderende til ett eller flere bakterielle antistoff-bindende epitoper av meningokokk klasse 1 yttermembranprotein, rensing av oligopeptidene, tilsette til de rensede oligopeptidene, lipider eller andre komponenter av en farmasøytisk akseptabel bærer som konserverer den antigene konformasjon av oligopeptidene.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av vaksine mot Neisseria meninaitidis omfattende et fusjonsprotein eller peptid omfattende en epitop av et meningokokk klasse 1 yttermembranprotein og ikke omfattende et meningokokk klasse 2/3 •.yttermembranprotein, fusjonert til et bærerprotein eller peptid, kjennetegnet ved å konstruere en ekspresjonsvektor som koder for et fusjonsprotein eller peptid, forutsatt at bærerproteinet ikke er jS-galaktosidase, innsette ekspresjonsvektoren i en passende vertscelle, dyrke vertscellen under betingelser som er egnet for ekspresjon av fusjonsproteinet eller peptidet, rensing av det uttrykte fusjonsproteinet eller peptidet og tilsette det rensede fusjonsproteinet eller peptidet til lipider eller andre komponenter av en farmasøytisk akseptabel bærer som konserverer den antigene konformasjon av fusjonsproteinet eller peptidet.

Også dekket av oppfinnelsen er fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meninaitidis omfattende i det minste ett meningokokk klasse 1 yttermembranprotein eller immunogen del derav og ikke omfattende et meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein, kjennetegnet ved å innsette DNA som koder for en eller flere epitoper av et klasse 1 yttermembranprotein, i leseramme, inn i et gen som koder for flagellinprotein av en attenuert stamme av Salmonella, dyrke den resulterende modifiserte stamme og tilsette den modifiserte stamme til en farmasøytisk akseptabel bærer for å formulere en levende vaksine.

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meningitidis omfattende et inaktivert virus som omfatter minst en epitop av klasse 1 yttermembranprotein eller immunogen del derav og ikke omfattende epitoper av meningokokk klasse 2/3 ytter-membranprotein, kjennetegnet ved å konstruere et virus som uttrykker en eller flere epitoper av en eller flere klasse 1 yttermembranproteiner, inaktivering av de resulterende virus og tilsetting av viruset til en farmasøytisk akseptabel bærer for å formulere en attenuert virusvaksine.

Foreliggende oppfinnelse omhandler også klasse 2/3 minusmutant av Neisseria ifølge kravene 3 og 6 som uttrykker meningokokk klasse 1 yttermembranprotein av mer enn en subtype, samt Neisseria meningitidis stamme ifølge kravene 1 og 4, kjennetegnet ved at den ikke er i stand til å produsere klasse 2/3 yttermembranprotein. Foretrukket er Neisseria menin<g>itidis-stammen H1115, CBS 636.89.

Omfattet av oppfinnelsen er også en mikroorganisme ifølge krav 22 eller 26, som uttrykker et fusjonsprotein omfattende et flagellin og meningokokk klasse 1 yttermembranprotein.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. 1. Skjema for amplifisering av gener som koder for meningokokk-klasse-I-ytter-membranprotein ved PCR (polymerase-kjedereaksjon). Fig. 2. 5 '-gensekvenser som koder for VRI (første variable region) av klasse-I-ytter-membranproteiner i flere undertyper av N. meningitidis. Fig. 3. 3'gensekvenser som koder for VR2 (andre variable region) av klasse-I-ytter-membranproteiner i flere undertyper av N. meningitidis. Fig. 4. Epitopskanning ved omsetning av monoklonale antistoffer med fastfasedekapeptider omfattende de predikerte amino syresekvenser i klasse-I-proteiner fra stammene Pl.7.16, Pl.16 ogPl.15.Nærliggende dekapeptider adskiller seg med fem aminorester. Merknadene viser den stamme som sekvensen ble avledet fra, den anvendte mAb og dens undertypespesifisitet. Fig. 5. Omsetning av de monoklonale antistoffer med serier av overlappende dekapeptider tilsvarende de variable regionene VRI og VR2, med nærliggende peptider som er forskjellige med en enkelt aminosyrerest. Merknadene viser den stamme som sekvensen ble avledet fra, den anvendte mAb og dens subtypespesifisitet. Fig. 6. Konstruksjon av rekombinante flagelliner som uttrykker variable regionepitoper av N. meninaitidis klasse-I-OMP undertype Pl.6.16. Fig. 7. Struktur av rekombinante flagelliner som uttrykker variable regionepitoper av N. menin<g>itidis klasse-I-OMP undertype Pl.6.16. Fig. 8. Representativt kromatogram fra høytrykksvæske-kromatografi av et rekombinant flagellin. Fig. 9. Representativ analyse ved SDS-PAGE av rekombinant flagellin. Fig. 10. Representative Western blotting-analyser av et konjugat omfattende en epitop av N. menin<g>itidis klasse-I-OMP konjugert til CRM197. Fig. 11. Putativ konformasjon av N. meningitidis klasse-I-OMP undertype Pl.16.

Denne oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for fremstilling av vaksiner omfattende isolerte OMV'er (yttermembranvesikler), meningokokk-klasse-l-OMP, fragmenter av OMP (fremstilt f.eks. ved anvendelse av bromcyanid) og oligopeptider bærende epitoper av OMP; fremstilling av isolerte OMV'er, rene klasse-l-ytter-membranproteiner, ved anvendelse av mutante stammer som ikke uttrykker klasse-2/3-ytter-membranprotein; fremstilling av isolerte OMVers rene klasse-1-ytter-membranproteiner ved hjelp av klonet DNA i rekombinante DNA-ekspresjonsvektorer. Denne oppfinnelse omfatter også anvendelse av genetisk engineering med det formål å fremstille vaksiner som inneholder isolert OMV, klasse-I-OMP eller proteiner derav, genetiske fusjoner av klasse-I-OMP, deler eller epitoper derav; og fremstilling av flerverdig klasse-l-ytter- membranvaksine ved peptidsyntese, ettersom epitopene med kort peptidkjede kan fremstilles syntetisk.

Det har vist seg at meningokokk-klasse-l-ytter-membranproteiner induserer en sterk baktericid immunrespons på de stammer som inneholder den korrekte undertype av epitoper, uten hensyn til hvorvidt disse er fra gruppe A-, B-, C-, W-135- eller Y-stammen. Polysakkaridvaksinen kan forbedres eller erstattes av en vaksine fremstilt ifølge oppfinnelsen som en vaksine med bred, utstrakt virkning mot de fleste serotyper. De beskyttende baktericide monoklonale antistoffer som er spesifikke for klasse-l-ytter-membranproteinet, reagerer kraftig med fragmenter som er spaltet av og med korte syntetiske peptider som er fremstilt ved anvendelse av aminosyresekvensen i klasse-1-ytter-membranproteiner. Siden meningokokksykdom for tiden hovedsakelig forårsakes av gruppe-B-meningokokker og fordi klasse-1-ytter-membranproteiner som forekommer i gruppe B-meningokokker også forekommer i gruppe A-, C-, W-135- og Y-meningokokker, skulle vaksiner fremstilt ifølge denne oppfinnelse som omfatter én eller flere klasse-l-OMP-epitoper avledet av N. menin<g>itidis gruppe B, være effektive til å forhindre sykdom forårsaket av gruppe A, C, W-13 5 og Y. Fortrinnsvis begynner fremstillingen av en slik vaksine med minst to forskjellige immunogene og beskyttende epitoper som er blitt utvalgt på epidemiologisk grunnlag. Vaksiner fremstilt ifølge oppfinnelsen omfatter f.eks. minst ett protein som er oppnådd enten i OMV-formulering eller ved rensing av mutante stammer som frembringer ett eller flere klasse-I-OMP eller minst to fragmenter fremstilt ved bromcyanidfragmentering eller minst to syntetiske peptider, valgt fra ca. 10 hovedepitoper, eller produkter oppnådd ved genekspresjon via rekombinant DNA-teknologi, som inneholder de ønskede epitoper. Jo høyere antallet er av forskjellige beskyttende epitoper i vaksinen, jo bedre er det å maksimalisere effektiviteten overfor et bredt område av meningokokkstammer. Dessuten kan vaksinene fremstilt ifølge oppfinnelsen fordelaktig inneholde meningokokk A og C eller eventuelt W-13 5 og Y-poly-sakkarider og/eller tensider. Fortrinnsvis er A- og C-poly-sakkaridene kovalent koblet til en protein- eller polypeptidbærer. Disse bærere omfatter f.eks. isolert OMV, klasse-I-OMP-proteinet, T-hjelpereptitoper, bakterietoksiner, toksoider, ikke-toksiske mutanter (CRM'er), rekombinant Salmonella flagellin og virus-partikler såsom rotavirus-VP6-protein, Hepatitis B overflateantigen eller parvovirus VPl- og VP2-proteiner. Både Zwitter-ionogene, kationogene, anionogene og ikke-ionogene tensider kan anvendes. Eksempler på slike overflateaktive stoffer er Zwittergent 3-10, Zwittergent 3-14 (N-tetradecyl-N,N-dimetyl-3-ammoniakk-l-propansulfonat), Tween 20, natriumdeoksycholat, natriumcholat og oktylglukosid. Vaksinene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også inneholde et adsorbsjonsmiddel såsom aluminiumhydroksyd, kalsiumfosfat; eller fordelaktigvis aluminiumfosfat. Fragmentene, proteinene og peptidene kan oså bearbeides til immunostimulerende komplekser (ISCOMS), liposomer eller mikrokuler for avgivelse og/eller anvendelse som hjelpemiddel eller i forbindelse med andre hjelpemidler slik at det oppnås høyere immunogenisitet.

Det beskrives isolert OMV, i alt vesentlig rene meningokokk-klasse-l-ytter-membranproteiner (av en hvilken som helst undertype) og fragmenter av proteinene som inneholder epitoper derav. Fragmentene kan være hvilke som helst deler med molekylvekt på 25 kD eller mindre som inneholder epitoper som er bundet av beskyttende baktericide antistoffer mot N. meningitidis. Disse omfatter proteolytiske fragmenter og syntetiske oligopeptider som omfattes av aminosyresekvenser som tilsvarer, i det minste delvis, epitoper av et klasse-I-OMP.

De isolerte OMV'ene, klasse-I-OMP, fragmenter eller epitop-holdige oligopeptider avledet derav, kan omfattes av aminosyresekvenser som er forskjellige, men i alt vesentlig biologisk ekvivalente med de naturlige sekvenser. Disse sekvenser kan omfatte sekvenser hvori funksjonelt ekvivalente aminosyrerester er substituert for rester inne i sekvensen som fører til en "stille" forandring. F.eks. kan én eller flere aminosyrerester i sekvensen substitueres med en annen aminosyre av lignende polaritet som virker som en funksjonell ekvivalent som fører til en "stille" forandring. Substitutter for en aminosyre i sekvensen kan velges fra andre medlemmer av den klasse som aminosyren tilhører. F.eks. omfatter de ikke-polare (hydrofobe) aminosyrer glycin, alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan og metionin. De polare nøytrale aminosyrer omfatter serin, treonin, cystein, tyrosin, asparagin og glutamin. De ladede (basiske) aminosyrer omfatter arginin, lysin og histidin. De negativt ladede (sure) aminosyrer omfatter aspartin- og glutaminsyrer.

Dessuten kan isolerte OMV'er, klasse-I-OMP, fragmenter eller oligopeptidene modifiseres for konjugering til andre molekyler (f.eks. ved tilknytning til koblingsgrupper såsom aminosyrene cystein og/eller lysin eller andre bindingsgrupper og/eller avstandsgrupper) omfattende andre klasse-l-OMP av forskjellig undertype, T-celleepitoper, B-celleepitoper, bærerpeptider eller

-proteiner eller hjelpemolekyler.

Som beskrevet i detalj nedenfor kan klasse-I-OMP, fragmenter eller oligopeptider anvendes i mange forskjellige former (f.eks. alene, i blanding, eller som konjugater og genetiske fusjoner fremstilt av rekombinante DNA-vektorer) i vaksiner. For disse formål kan stoffene fremstilles ved isolasjon fra N. meningitidis. ved proteolytisk spalting, ved kjemisk syntese, eller ved ekspresjon som rekombinante molekyler. Metodene for fremstilling og anvendelse av de isolerte OMV'er, klasse-I-OMP og fragmentene og oligopeptidene av klasse-l-OMP er beskrevet i det følgende.

Proteinmodellering og strukturanalyse av klasse-I-OMP'ene ble utført ved anvendelse av prinsippene for flere E. coli-ytter-membranproteiner. (Vogel, H. et al., J. Mol. Bio., 190:191

(1986); Ference, T. et al.. J. Mol. Bio.. 201 -.493 (1988) og Tommassen, J. i "Membrane Biogenesis", NATO ASI Series H16. pp 351, Springer-Verlag, NY (1988). Den avledede aminosyresekvens av klasse-I-OMP'ene ble anvendt for modelleringsstudier og sammenligning. Aminosyresekvensens homologi ble sammenlignet med andre gram negative bakterielle porinproteiner, og likhet ble fastslått for proteinstrukturen. Eksponerte overflatesløyfer og transmembranstruktur var svært like for disse porinproteinene. Med den åpenbare informasjon vedrørende variabel og konstant region beskyttende epitoper av N. meningitidis og deres struktur kan man på basis av aminosyresekvensen forutsi hvor beskyttende epitoper kan finnes for andre patogene gram negative bakterier som skal evalueres og innbefattes i vaksinene for samme.

FREMSTILLING AV ISOLERTE OMVER

OMV'er kan fremstilles enten fra kultursupernatanten eller fra bakteriecellene etter fragmentering som beskrevet av Beuvery et al. (1983) Inf ect. Immun. 4.0:369-380. OMV'er som bærer proteiner fra mer enn en meningokokk kan isoleres fra stammer manipulert til å uttrykke heterologe proteiner.

FREMSTILLING OG RENSING AV KLASSE-I-OMP OG CNBR-FRAGMENTER DERAV

Yttermembranproteiner av klasse-1 og klasse-3 kan isoleres som beskrevet av Beuvery, E.C. et al., Antonie wan Leeuvenhoek J.Microbiol.. 52:232 (1986). Fremstilling av i alt vesentlig rent klasse-I-OMP fritt for klasse-2- eller 3-OMP'er oppnås ved denne fremgangsmåte ved anvendelse av mutante meningokokkstammer som ikke uttrykker klasse-2/3-OMP. En foretrukket stamme for fremstilling av klasse-I-OMP er HII15-stammen, deponert som CBS 636.89.

Fragmenter kan fremstilles ved bromcyanidspalting som beskrevet av Teerlink T. et al., J. Ex<p>. Med., 166:63 (1987) for et gonokokkprotein. Det N-terminale fragment refereres til som CB-1 og det C-terminale fragment refereres til som CB-2. Disse CNBr-fragmenter kan renses via reversfase HPLC på en Vydax™C4-eller en Aquapor™R-300-kolonne ved anvendelse av en vann/aceto-nitrilgradient. Alternativt kan fragmentet renses ved flere utfellinger fra kald trikloreddiksyre. Disse fremgangsmåtene fjerner mer enn 95% av forstyrrende forurensninger (f.eks. buffersalter, tensider og fragmentforurensninger).

FREMSTILLING AV FRAGMENTER OG OLIGOPEPTIDER INNEHOLDENDE EPITOPER AV KLASSE-I-OMP

A. Fremstilling ved proteolytisk spalting.

Oligopeptider inneholdende epitoper som er reaktive med baktericide antistoffer mot N. meningitidis, kan fremstilles ved spalting av klasse-I-OMP, CB-1- eller CB-2-fragmenter med proteinaser såsom endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C og stafylokokkin V8-protease. De avspaltede fragmenter kan renses ved f.eks. høytrykksvæskekromatografiske (HPLC) teknikker.

B. Fremstilling ved kjemisk syntese.

Oligopeptider kan syntetiseres ved standard fastpeptidsyntese (Barany, C. og Merrifield, R.B. The Peptides 2:1-284, Gross, E. og Meienhofer, J., utgivere, Academic Press, New York) ved anvendelse av tert-butyloksykarbonylaminosyrer og fenylacetamidometyl-harpikser (Mitchell, A.R. et al.. J. Org. Chem. 43 :2845-2852

(1978) eller 9-fluorenylmetyloksykarbonylaminosyrer på en polyamid-bærer (Dryland, A. og Sheppard, R.C., J. Chem. So. Perkin Trans. I. 125-137 (1986)). Alternativt kan syntetiske peptider fremstilles ved pepskansyntese (Geysen, H.M. et al., J. Immunol. Methods 03:259

(1987); Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:3998 (1984)), Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, U.K. eller ved standard peptidsyntese i flytende fase. Fjerning eller substitusjon av aminosyrer (og innbefattet forlengelser og addisjoner til aminosyrer) på andre måter som ikke vesentlig nedsetter oligopeptidets immunologiske egenskaper.

C. Fremstilling ved rekombinant DNA-teknikker.

Klasse-I-OMP, fragmenter og oligopeptider som fremviser epitoper av klasse-I-OMP, kan fremstilles ved rekombinant DNA-teknikk. Vanligvis omfatter denne å oppnå DNA-sekvenser som koder for det ønskede OMP, (Barlow et al.. (1989) Mol. Micro.. 3:131) fragment eller oligopeptidsekvenser og innføring i et egnet vektor/ vertekspresjonssystem av en eller flere lignende eller forskjellige DNA-sekvenser av klasse-I-OMP'er hvor den blir uttrykt. Denne DNA kan bestå av det gen som koder for klasse-I-OMP eller hvilket som helst segment av det gen som koder for en funksjonell epitop avOMP'et. Denne DNA kan sammensmeltes med DNA som koder for andre antigener av N. meninaitidis (såsom andre ytter-membranproteiner enten av den samme eller en forskjellig klasse) eller antigener av andre bakterier, virus, parasitter eller sopp for å danne genetisk sammensmeltede (som deler en felles peptidkjede), flerverdige antigener. F.eks. kan klasse-I-OMP-fragmenter sammensmeltes med et annet klasse-l-ytter-membranprotein av en annen undertype (eller fragmenter eller epitoper derav) av N. menin<g>itidis til å gi sammensmeltede proteiner omfattende flere klasse-1-ytter-membranprotein -undertypede terminant er .

Genetisk engineering-teknikk kan også anvendes til å karakterisere, modifisere og/eller tilpasse de innkodede peptider eller proteiner. F.eks. seterettet mutagenese til å modifisere et OMP-fragment i regioner på utsiden av de beskyttende domener, f.eks. til å øke løseligheten av underfragmentet for å tillate lettere rensing. DNA kan også manipuleres til å gjennomføre superproduksjon av OMP-fragmenter eller kombinasjoner derav i forskjellige organismer.

DNA som koder for et klasse-I-OMP, fragmenter eller oligopeptider kan syntetiseres eller isoleres og sekvenseres som beskrevet av Barlow, A.K. et al. , Inf ect. Immune 5_5:2734-40 (1987) og Barlow, A.K. et al., Mol. Micro. 3:131 (1989). Klasse-I-OMP-gener kan amplifiseres fra bakteriell DNA ved metodene til Mullis og Faloona, (1987) Method. Enzym. 155:335-350, ved anvendelse av de primære sekvenser beskrevet heri. Beslektede DNA-sekvenser for klasse-l-OMP av forskjellige undertyper kan oppnås ved de beskrevne fremgangsmåter og de utledede aminosyresekvenser.

Forskjellige vert-vektorsysterner kan anvende til å uttrykke oligopeptidene som beskrives. For det første må vektorsystemet være forlikelig med den anvendte vertscelle. Vert-vektorsysterner omfatter, men er ikke begrenset til følgende: bakterier transformert med bakteriofag-DNA, plasmid-DNA eller kosmid-DNA; mikroorganismer såsom gjær inneholdende gjærvektorer; pattedyr-cellesysterner infisert med virus (f.eks. kukoppevirus, adenovirus, etc); insektcellesystemer infisert med virus (f.eks. bakulo-virus). Ekspresjonselementene i disse vektorene varierer i styrke og spesifisitet. Avhengig av det anvendte vert-vektorsystem kan det anvendes hvilket som helst av flere egnede transkripsjons- og translasj onselementer.

For å oppnå effektiv ekspresjon av den klonede DNA må en promotor være tilstede i ekspresjonsvektoren. RNA-polymerase binder seg vanligvis til promotoren og initierer transkripsjon av et gen eller en gruppe av sammenbundede gener og regulerings-elementer (som kalles et operon). Promotorer varierer i "styrke", dvs. sin evne til å befordre transkripsjon. Det er ønskelig å anvende sterke promotorer for å oppnå et høyt transkripsjonsnivå og følgelig et høyt DNA-ekspresjonsnivå. Avhengig av vertscelle- systemet kan det anvendes hvilken som helst av flere egnede promotorer. For E. coli, dens bakteriofager eller plasmider, kan det f.eks. anvendes promotorer såsom lac-promotoren, trp-promotoren, recA-promotoren, den ribosomale RNA-promotor, og PR-eller PL-promotorer av kolifage lambda og andre omfattende, men ikke begrenset til lacUV5, ompF, bla, lpp og lignende til å gi høyt transkripsjonsnivå i nærliggende DNA-segmenter. Dessuten kan det anvendes en hybrid trp- lacUV5- (tac) promotor eller andre E. coli-promotorer fremstilt ved rekombinant DNA eller andre syntetiske DNA-teknikker til å sørge for transkripsjon av den innsatte DNA.

Det kan velges bakterievertsceller og ekspresjonsvektorer som inhiberer virkningen av promotoren dersom de ikke induseres spesielt. I visse operoner er det nødvendig med tilsetning av spesifikke indusere for effektiv transkripsjon av den innsatte DNA; f.eks. induseres lac-operonet ved tilsetning av laktose eller IPTG (isopropyltio-beta-D-galaktosid). Forskjellige andre operoner, såsom trp osv., er under forskjellige kontroller. trp-operonet induseres når tryptofan er fraværende i vekstmediet; og PL-promotoren av lambda kan induseres ved en temperaturøkning i vertscellene som inneholder en temperatursensitiv lambdarepressor, f.eks. cI857. På denne måte kan mer enn 95% av den promotor-rettede transkripsjon inhiberes i ikke-induserte celler. Således kan ekspresjon av det rekombinante peptid eller protein kontrolleres. Dette er viktig dersom ekspresjonsproduktet av DNA er dødelig eller skadelig for vertscellene. I slike tilfeller kan transformantene dyrkes under slike betingelser at promotoren ikke blir indusert; når cellene deretter oppnår en egnet tetthet i vekstmediet, kan promotoren induseres for fremstilling av proteinet.

Et slikt promotor/operatorsystem er "tac"- eller trp- lac-promotor/operatorsystemet (Russell og Bennett, 1982, Gene 20:2312-243; DeBoer, europeisk patentsøknad 67.540 inngitt 18. mai 1982). Denne hybride promotor konstrueres ved å kombinere -35 b.p. (-35 regionen) i trp-promotoren og -10 b.p. (-10 regionen eller Pribnow boksen) i lac-promotoren (de sekvenser av DNA som er bindingssetet for RNA-polymerase). I tillegg til å opprettholde de sterke promotoregenskapene for tryptofanproraotoren blir tac også kontrollert av lac-repressoren•

Ved kloning i en eukaryotisk vertscelle kan det innsettes enhancersekvenser (f.eks. 72 bp tandemrepetisjonen av SV40-DNA eller de retrovirale lange terminale repetisjoner eller LTR'er, osv.) for å øke transkripsjonseffektiviteten. Enhancersekvenser er et sett av eukaryotiske DNA-elementer som synes å øke transkripsjonseffektiviteten på en måte som er relativt uavhengig av deres posisjon og orientering i forhold til et nærliggende gen. Ulikt de klassiske promotorelementene (f.eks. polymerasebindings-setet og Goldberg-Hogness "TATA"-boksen) som må være lokalisert umiddelbart 5' til genet, har enhancersekvensene en bemerkelses-verdig evne til å fungere oppstrøms fra, inne i, eller nedstrøms fra eukaryotiske gener; posisjonen for enhancersekvensen i forhold til den innsatte DNA er derfor mindre kritisk.

Spesifikke initieringssignaler er også nødvendige for effektiv gentranskripsjon og -translasjon i prokaryotiske celler. Disse transkripsjons- og translasjonsinitieringssignaler kan variere i "styrke" som målt ved henholdsvis mengden av genspesifikk «budbærer-RNA og syntetisert protein. DNA-ekspresjonsvektoren, som inneholder en promotor, kan også inneholde hvilken som helst kombinasjon av forskjellige "sterke" transkripsjons- og/eller translasjonsinitieringssignaler. F.eks. krever effektiv translasjon i E. coli en Shine-Balgarno (SD) sekvens på ca. 7-9 baser 5' til initieringskodonet (ATG) for å tilveiebringe et ribosombindingssete. Således kan det anvendes en hvilken som helst SD-ATG-kombinasjon som kan anvendes av vertscelleribosomene. Slike kombinasjoner omfatter, men er ikke begrenset til SD-ATG-kombinas jonen fra cro-genet eller N-genet i kolifage lambda, eller fra E. coli-tryptofan E-, D-, C-, B- eller A-genene.

Dessuten kan det anvendes en hvilken som helst SD-ATG-kombinas jon fremstilt ved rekombinant DNA- eller andre teknikker omfattende inkorporering av syntetiske nukleotider.

Hvilken som helst av de metoder som er beskrevet for innsetting av DNA i en ekspresjonsvektor kan anvendes til ligering av en promotor og andre genetiske kontrollelementer i spesifikke seter i vektoren. N. meninqitidis-sekvenser for ekspresjon kan ligeres inn i en ekspresjonsvektor i et bestemt sete i forhold til vektorpromotoren og kontrollelementer, slik at når det rekombinante DNA-molekyl blir innført i en vertscelle, kan den fremmede genetiske sekvens bli uttrykt (dvs. transkribert og translatert) av vertscellen.

Den rekombinante DNA-vektor kan innføres i egnede vertsceller (bakterier, virus, gjær, pattedyrceller eller lignende) ved transformasjon, transduksjon eller transfeksjon (avhengig av vektor/vertscellesystemet). Vertsceller som inneholder vektoren blir valgt basert på ekspresjonen av én eller flere egnede gen-markører som vanligvis er tilstde i vektoren, såsom ampicillin-resistens eller tetracyklinresistens i pBR322, eller tymidinkinaseaktivitet i eukaryotiske vertssystemer. Ekspresjonsvektorer kan avledes fra kloningsvektorer, som vanligvis inneholder en markørfunksjon. Slike kloningsvektorer kan omfatte, men er ikke begrenset til følgende: SV40 og adenovirus, kukoppevirus-vektorer, insektvirus såsom baculovirus, gjærvektor, bakteriofage vektorer såsom lambda gt-WES-lambda B, Charon 28, Charon 4A, lambda gt-l-lambda BC, lambda gt-l-lambda B, Ml3mp7, Ml3mp8, Ml3mp9 eller plasmid-DNA-vektorer såsom pBR322, pAC105, pVA5l,PACYC177, pKH47, pACYC184, pUBllO, pMB9, pR325, ColEl, pSClOl,PBR313, pML2l, RSF2124, pCRl, RP4, pBR328 og lignende.

Ekspresjonsvektorer som inneholder DNA-innskuddene kan identifiseres ved tre generelle metoder: (1) DNA-DNA-hybridise-ring ved anvendelse av prober omfattende sekvenser som er homologe med det innsatte gen; (2) tilstedeværelse eller fravær av "markør"-genfunksjoner (f.eks. resistens mot antibiotika, transformasjonsfenotype, tymidinkinaseaktivitet, osv.); og (3) ekspresjon av innsatte sekvenser basert på de fysiske immunologiske eller funksjonelle egenskaper av genproduktet.

Når det er identifisert en putativ rekombinant klon som uttrykker en ønsket klasse-I-OMP-aminosyresekvens, kan genproduktet analyseres som følger. Immunologisk analyse er spesielt viktig fordi det endelige mål er å anvende genproduktene i vaksineformuleringer og/eller som antigener i diagnostiske immunoassays. Det uttrykte peptid eller protein bør være immunoreaktivt med baktericide antistoffer mot N. meningitidis. Denne reaktivitet kan demonstreres ved standard immunologiske teknikker, såsom radioimmunoutfelling, radioimmunkonkurranse, ELISA eller immunoblotting.

Når genproduktet er identifisert som et klasse-I-OMP-fragment eller et oligopeptid inneholdende en funksjonell epitop derav, kan det isoleres og renses ved standardmetoder omfattende kromatografi (f.eks. ionebytting, affinitet, og sizing-kolonnekromatografi), sentrifugering, forskjell i løselighet, eller ved en hvilken som helst annen standardteknikk for rensing av proteiner. Det finnes flere teknikker for rensing av heterologe proteiner fra prokaryotiske celler. Se f.eks. Olson, U.S. patent nr. 4.518.526, Wetzel, U.S. patent nr. 4.599.197 og Hung et al., U.S. patent nr. 4.734.362. Uansett fremstillingsmåte bør det rensede preparat være i alt vesentlig fritt for vertstoksiner som kan være skadelige for mennesker. Spesielt når de er uttrykt i gram negative bakterievertsceller såsom E. coli eller Salmonella, skal det rensede peptid eller protein være i alt vesentlig fritt for endotoksinforurensning.

Klasse-I-OMP, fragmenter og oligopeptider kan formuleres som:enverdige og flerverdige vaksiner. Disse stoffer kan anvendes som fremstilt eller isolert ifølge de metoder som er beskrevet ovenfor. De kan blandes, konjugeres eller sammensmeltes med andre antigener, omfattende B- eller T-celleepitoper av andre antigener. Dessuten kan de konjugeres til et bærerprotein som beskrevet nedenfor for oligopeptider.

Når det anvendes et haptenisk oligopeptid (dvs. et peptid som reagerer med beslektede antistoffer, men ikke selv kan fremkalle immunrespons), kan det konjugeres til et immunogent bærermolekyl. Konjugering til en immunogen bærer kan gjøre oligopeptidet immunogent. Konjugeringen kan gjennomføres ved standard fremgangsmåter. Foretrukne bærerproteiner for de hapteniske oligopeptidene er toksiner, toksoider eller et hvilket som helst mutant kryssreaktivt materiale (CRM) av toksinet fra tetanus, difteri, pertussis, Pseudomonas. E. coli. Staphylococcus og Streptococcus. En spesielt foretrukket bærer er CRM197av difteritoksin, avledet av P. diphtheriae-stammen C7(S 197) som frembringer CRM197-protein. Denne stamme har ATCC-adgangsnummer 53281. Alternativt kan det anvendes et fragment eller en epitop av bærerproteinet eller et annet immunogent protein. F.eks. kan haptenet kobles til en T-celleepitop av et bakterietoksin, toksoid eller CRM. Se U.S. patentsøknad serienummer 150.688, inngitt 1. februar 1988, med tittelen "Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines", hvilken beskrivelse er inkorporert heri. Andre bærere omfatter virale partikler sammensatt av Rotavirus VP6, Hepatitis B overflateantigen eller parvovirus VPl og VP2.

Peptidene eller proteinene ifølge denne oppfinnelse kan administreres som flerverdige underenhetsvaksiner i kombinasjon med antigener av N. menin<g>itidis eller antigener av andre organismer. Noen av de andre organismer omfatter de patogene bakterier H. influenzae, N. meningitidis, B. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae.osv. F.eks. kan de administreres i forbindelse med oligo- eller polysakkaridkapsulære komponenter av N. menin<g>itidis. De kapsulære komponentene kan avledes fra hvilken som helst av de serologiske gruppene, omfattende A, B, C, D, X, Y, Z, 29E og W135.

Klasse-1-yttermembranproteiner av forskjellige undertyper kan anvendes. Disse kan anvendes i kombinasjon for å fremkalle baktericide antistoffer mot N. meningitidis. F.eks. kan det anvendes et fragment avledet fra klasse-l-ytter-membranprotein av Pl.7.16-undertypen sammen med ytter-membranproteiner eller fragmenter av ytter-membranproteiner av andre undertyper, såsom Pl.l, Pl.1.16; Pl.2; Pl.6; Pl.9; Pl.15; Pl.16; eller Pl.4 (Abdillahi, H. et al., 1988 Micro. Pathog. 4:27) eller med meningokokkpolysakkarider i blandinger eller som kjemiske konjugater. For kombinert administrasjon med epitoper av andre ytter-membranproteiner, kan de administreres separat, som en blanding eller som et konjugat eller genetisk fusjonspeptid eller -protein. Konjugatene kan dannes ved standardteknikker for kobling av proteinholdige stoffer eller teknikker for kobling av sakkaridpolymerer til proteiner. Fusjoner kan uttrykkes fra sammensmeltede genkonstrukter fremstilt ved rekombinant DNA-teknikker som beskrevet.

Som nevnt kan klasse-I-OMP, fragment eller hvilke som helst oligopeptider avledet derifra anvendes i forbindelse med antigener (f.eks. polymerkapsler eller sakkaridenheter, omhyllings- eller overflateproteiner) av andre patogene organismer (f.eks. bakterier (innkapslede eller ikke-innkapslede), virus, sopp og parasitter). Ytterligere eksempler på andre organismer omfatter respiratorisk syncytialvirus, rotavirus, malariaparasitter, og Cryptococcus neoformans.

Ved formulering av vaksineblandingene med peptidet eller proteinet, alene eller i de forskjellige beskrevne kombinasjoner, blir immunogenet justert til en passende konsentrasjon og formulert med hvilke som helst egnede vaksinehjelpemidler. Egnede hjelpemidler omfatter, men er ikke begrenset til: overflateaktive stoffer, f.eks. heksadecylamin, oktadecylamin, oktadecylaminosyreestere, lysolecitin, dimetyldioktadecylammoniumbromid, metoksyheksadecylglycerol, og pluroniske polyoler; polyaminer, f.eks. pyran, dekstransulfat, poly IC, karbopol; peptider, f.eks. muramyldipeptid og derivater, dimetylglycin, tuftsin; oljeemulsjoner; og mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat, osv.; lymfokiner og immunstimulerende komplekser (ISCOMS). Immunogenet kan også inkorporeres i liposomer, mikrokuler eller konjugeres til polysakkarider og/eller andre polymerer for anvendelse i et vaksinepreparat.

Vaksinene kan administreres til et menneske eller et dyr på forskjellige måter. Disse omfatter intradermale, intramuskulære, intraperitoneale, intravenøse, subkutane, orale og intranasale administrasj onsmåter.

LEVENDE VAKSINER

Vaksinene som fremstilles ifølge denne oppfinnelse kan administreres som levende vaksiner. For dette formål fremstilles rekombinante mikroorganismer som uttrykker peptidene eller proteinene som inngår i vaksinen. Vaksinemottageren blir innpodet med den rekombinante mikroorganisme som formerer seg i mottageren, uttrykker klasse-I-OMP, fragmentet eller oligopeptidet derav og fremkaller immunrespons mot N. meningitidis. Levende vaksine-vektorer omfatter: adenovirus, cytomegalovirus og fortrinnsvis koppevirus såsom kukopper (Paoletti og Panicali, U.S. patent nr. 4.603.112) og svekkede Salmonella-stammer (Stocker, U.S. patent nr. 4.550.081 og Curtiss et al., Vaccine 6:155-160 (1988)). Dessuten kan klasse-I-OMP-epitoper inkorporeres i flagella av svekkede bakteriestammer.

Levende vaksiner er spesielt fordelaktige fordi de fører til en forlenget stimulering som kan gi betydelig langvarig immunitet. Når immunresponsen virker beskyttende mot påfølgende infeksjon av N. meningitidis, kan selve den levende vaksine anvendes i en forebyggende vaksine mot N. menin<g>itidis.

Flerverdige levende vaksiner kan fremstilles utifrå en enkelt eller noen få rekombinante mikroorganismer som uttrykker forskjellige epitoper av N. menin<g>itidis (f.eks. andre yttermembranproteiner fra andre undertyper eller epitoper derav). Dessuten kan epitoper av andre patogene mikroorganismer inkorporeres i vaksinen. F.eks. kan et kukoppevirus omdannes genetisk til å inneholde kodende sekvenser for andre epitoper i tillegg til dem fra N. meningitidis. Et slikt rekombinant virus kan selv anvendes som immunogenet i en flerverdig vaksine. Alternativt kan en blanding av kukoppe- eller andre virus, som alle uttrykker et forskjellig gen som koder for forskjellige epitoper av yttermembranproteiner av N. menin<g>itidis og/eller epitoper av andre sykdoms-forårsakende organismer, formuleres som en flerverdig vaksine.

Det kan fremstilles en inaktivert virusvaksine. Inaktiverte vaksiner er "drept" dvs. at smitteevnen er blitt ødelagt, vanligvis ved kjemisk behandling (f.eks. formaldehydbehandling). Ideelt blir smitteevnen av viruset ødelagt uten å påvirke de proteiner som bærer virusets immunogenisitet. For å fremstille inaktiverte vaksiner blir store mengder av de rekombinante virus som uttrykker de ønskede epitoper, dyrket i kultur for å tilveiebringe den nødvendige mengde av relevante antigener. En blanding av inaktiverte virus som uttrykker forskjellige epitoper kan anvendes for formulering av "flerverdige" vaksiner. I visse tilfeller kan disse "flerverdige" inaktiverte vaksiner være å foretrekke for levende vaksineformulering, p.g.a. potensielle vanskeligheter som skriver seg fra gjensidig interferens av levende virus som administreres sammen. I alle fall kan det inaktiverte virus eller virusblandingen formuleres i et egnet hjelpemiddel for å øke den immunologiske respons på antigenene. Egnede hjelpemidler omfatter: overflateaktive substanser, f.eks. heksadecylamin, oktadecylaminosyreestere, oktadecylamin, lysolecitin, dimetyl-dioktadecyl-ammoniumbromid, N,N-dioktadecyl-N', N'bis(2-hydroksyetyl-propandiamin), metoksyheksadecylglycerol og pluroniske polyoler; polyaminer, f.eks. pyran, dekstransulfat, poly IC, karbopol; peptider, f.eks. muramyldipeptid og derivater derav, dimetylglycin, tuftsin; oljeemulsjoner; og mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat, og lymfokiner.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1: Monoklonale antistoffer mot klasse-I-OMP1 er

og deres biologiske aktivitet

Typespesifikke monoklonale antistoffer ble fremstilt mot forskjellige meningokokk-klasse-1-ytter-membranproteiner. Disse monoklonale antistoffer gjenkjenner følgende undertyper: Pl,1; Pl,2; Pl,6; Pl,7; Pl,9; Pl,10; Pl,15; Pl,16; og Pl,17 (som nå kalles Pl,14). De monoklonale antistoffer er tilgjengelige som "Monoklonal Kit Serotyping Meningococci" Fra RIVm, Bilthoven, Nederland. Alle disse monoklonale antistoffer reagerer med SDS (natriumdodecylsulfat) denaturert protein når de testes med Western-blotting. Det kom også frem at flere av disse monoklonale antistoffer reagerte med et 25 Kd CNBr-fragment av 42 Kd klasse-1-ytter-membran-proteinet (se nedenfor). Dette resultat medførte at klasse-l-ytter-membranproteinepitopene hovedsakelig er av lineær type og derfor kan kopieres med syntetiske peptider. De epidemiologiske resultater av disse tester utført av søkerne, viser av de beskrevne monoklonale antistoffer kan subtype de fleste av gruppe A-, B-, C-meningoklokkene, hvilket antyder begrenset heterogenitet. Hvert klasse-l-ytter-membranprotein synes også å inneholde to individuelle typespesifikke epitoper (Abdillahi og Poolman, Microb. Pathogen, 1988, 4: sidene 27-32; idem FEMS Microbiol. Immunol. 47: sidene 139-144).

Det rensede klasse-l-ytter-membranprotein (se nedenfor), undertype Pl,7.16, som skriver seg fra kulturen av klasse 2/3 fri mutant (HIII5) syntes å indusere en baktericid antistoffrespons på 1:64 serumfortynning i en dose på 2,5 p. g hos mus. De monoklonale antistoffer mot meningokokk-klasse-1-ytter-membranproteiner, klasse-2/3-ytter-membranproteiner og lipopolysakkarider ble sammenlignet med hensyn til baktericid virkning. De monoklonale antistoffer mot klasse-l-ytter-membranproteiner syntes å ha den sterkeste baktericide virkning (se Tabell 1). Bakterieresponsen ble bestemt som ifølge Poolman, J.T. (1985), i Schoolnick, G.J. et al., utgivere "The Pathogenic Neisseriae" ASM Publications, Washington, D.C., side 562.

Den baktericide virkning av disse monoklonale antistoffer synes å korrelere godt med den in vivo-beskyttende virkning som målt i rottemeningittmodellen til Saukkonen et al., 1987, Microbial Pathogen 3:261.

EKSEMPEL IA: Konstruksjon av meningokokkstammer som bærer multiple klasse-l-gener

Ved utbytting av kromosomale gener med kloner er det beskrevet noe forskjellige versjoner for Neisseria<q>onorrhoeae.

(Stein, D.C., Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suppl.), S146-S149 (1989). Vi har funnet at denne metode kan anvendes på klasse-1-genet i Neisseria menin<g>itidis. Dette ble gjort på følgende måte: (i) Klasse-l-genet av stamme 2996 (undertype Pl.2) ble klonet inn i vektoren pTZl9R. (Mead, D.A. et al., Protein Engineering 1, 67 (1986). Det fullstendige gen plasseres

på et 2,2 kb Xbal-fragment som blir ligert til Xbal-

spaltet vektor-DNA.

(ii) Det resulterende plasmid ble anvendt til transformasjon av stammen H44/76 (undertype Pl.7.16). Celler fra akseptorstammen ble inkubert med plasmid-DNA i nærvær avMg<2+>og vanlig meningokokkmedium; de ble deretter fortynnet og utplatet, og de resulterende kolonier ble testet for sin evne til å binde Pl.2-spesifikt monoklonalt antistoff.

Slike transformanter ble funnet med en frekvens på ca. IO"<3>. Ytterligere karakterisering viste at utbytting av H44/76 klasse-l-genet virkelig hadde foregått. Et essensielt trekk ifølge metoden er tilstedeværelsen av donorgenet på et sirkulært plasmid-DNA-molekyl som ikke er i stand til å replikere i N. meningitidis, siden anvendelsen av lineærisert DNA ikke ga noen transformanter i det hele tatt.

Konstruksjon av en stamme med to klasse-l-gener ble utført ved en modifikasjon av fremgangsmåten beskrevet ovenfor. For dette formål ble Pl.2-klasse-l-genet innsatt i et klonet klasse-5-gen. Klasse-5-genfamilien har to trekk som gjør den spesielt egnet for denne konstruksjon. (Meyer, T.F. og Van Putten, J.P.M., Clin. Microbiol. Rev., 2 (Suppl.) S139-S145 (1989): (i) det er fire eller fem klasse-5-gener tilstede i meningokokkgenomet, og (ii) ekspresjon av disse gener er ikke nødvendig for vekst under laboratoriebetingelser. Et klasse-5-gen ble klonet fra stamme H44/76 og Pl.2-genet ble., innsatt i et Sphl-sete lokalisert i eller svært nær til klasse-5-genet. Det resulterende hybride plasmid, pMC22, ble anvendt til transformering av stamme HIII5, en klasse-3-fattig mutant av H44.76. Kolonier som reagerer med det Pl. 2-spesifikke monoklonale antistoff, ble isolert ogkarakterisert.

Ut av ti slike transformanter ble ni funnet å ha mistet Pl. 16-epitopen fra akseptorstammen. Dette viser at i alle disse tilfeller hadde rekombinasjon forekommet bare mellom klasse-1-genene, hvilket førte til utbytting av undertype. Det ble imidlertid funnet en transformant som laget både klasse-1-undertyper, dvs. Pl.7.16 og Pl.2, hvilket antyder at det må ha forekommet rekombinasjon mellom klasse-5-gensekvensene på plasmid og kromosom. Dette ble bekreftet ved Western-blotting som åpenbarte tilstedeværelse av begge typer av klasse-l-protein og ved Southern-blotting som viste opptak av et andre klasse-l-gen.

Ved å fortsette denne konstruksjon med andre klasse-1-undertyper, er det mulig å lage en stamme med fire eller fem forskjellige klasse-l-gener. Det samme klasse-5-gen kan anvendes i hvert påfølgende transformasjonstrinn, idet de forskjellige klasse-5-gener kan klones og anvendes separat. Disse rekombinante stammer kan anvendes til fremstilling av blandinger av forskjellige rensede klasse-I-OMP'er.

EKSEMPEL IB: Rensing av isolerte OMV<1>er fra bakteriologisk kultur

Rensingen utføres ifølge Beuvery et al., (1983) Infect. immun. 40:369-380.

Denne kultur kan lages med de ønskede vill-typestammer, mutante meningokokkstammer uten klasse-2/3-ytter-membranproteiner og/eller homologe eller heterologe rekombinante mikroorganismer som uttrykker ett eller flere av de ønskede meningokokk-klasse-1-ytter-membranprotein og/eller epitoper ved overproduksjon av vektorer enten gjennom eller ikke-gjennom eksisterende åpne leserammer og/eller manipulerte leserammer slik at fusjons-proteiner eller proteiner med forandrede epitoper kan fremstilles.

Lett tilgjengelige ville stammer er:

H44/76 (B:15: Pl,7.16) (Holten, E., Norge, deponert som CBS 635-89); 187 (B:4:Pl,7) (Etienne J., Frankrike); M1080 (B:1:P1,1.7)

(Frasch C., USA); Swiss4 (B:4:P1,15) (Hirschel B., Sveits); B2106I (B:4:P1,2) (Berger U., Vest-Tyskland); 395 (B:NT:P1,9) (Jonsdottir K., Island); M990 (B:6:P1,6) (Frasch C., USA); 2996 (B:2b:Pl,2) RIVM, Nederland; M982 (B:9:P1,9) (Frasch C, USA); S3446 (B:14:P1,6) (Frasch C, USA); H355 (B:15:P1,15) (Holten E.,Norge); 6557 (B:17:P1,17) (Zollinger W., USA) og B40 (A:4:Pl,10)

(Achtman M., Vest-Tyskland). Et eksempel på en klasse-3- negativ mutant er HIII5 (B:-:P1.16) deponering nr. CBS 636.89.

Disse stammer ble inokulert fra forkulturer ved -70°C til rysteflasker og overført fra disse til 40, 150 eller 350 liter fermentorkulturer. Det halvsyntetiske medium hadde følgende sammensetning: L-glutaminsyre 1,3 g/l, L-cystein.HCl 0,02 g/l, Na2HP04.2H20 10 g/l, KCl 0,09 g/l, NaCl 6 g/l, NH4Cl 1,25 g/l, MgS04.7H20 0,6 g/l, glukose 5 g/l, Fe(N03)3100 \ M, gjærdialysat.

Under dyrkingen i fermentoren ble pH og P02overvåket og automatisk regulert til en pH på 7,0-7,2 og en luftmetning på 10%. Cellene ble dyrket til tidlig stasjonær fase, høstet ved hjelp av sentrifugering og vasking med steril 0,1 M NaCl og lagret ved - 20°C eller frysetørket.

EKSEMPEL 2: Rensing av klasse-1-ytter-membranproteiner fra bakteriologisk kultur

Denne kultur kan lages med de ønskede villtypestammer, mutante meningokokkstammer uten klasse-2/3-ytter-membranproteiner og/eller homologe og heterologe rekombinante mikroorganismer som uttrykker ett eller flere av de ønskede meningokokk-klasse-1-ytter-membranproteiner og/eller epitoper ved overproduksjon av vektorer enten gjennom eller ikke-gjennom eksisterende åpne leserammer og/eller manipulerte leserammer slik at fusjons-proteiner eller proteiner med forandrede epitoper kan fremstilles.

Lett tilgjengelige ville stammer er:

H44/76 (B:15:Pl,7,16) (Holten E., Norge, deponert som CBS 635-89);

187 (B:4:P1,7) (Etienne J., Frankrike); M1080 (B:1:Pl,1,7) (Frasch C, USA); Swiss4 (B:4:Pl,l5) (Hirschel B., Sveits); B2106I (B:4:P1,2) (Berger ., Vest-Tyskland); 395 (B:NT:P1,9) (Jonsdottir K., Island); M990 (B:6:P1,6) (Frasch C, USA); 2996 (B:2b:Pl,2) RIVM, Nederland; M982 (B:9:P1,9) (Frasch C. , USA); S3446 (B:14:P1,6) (Frasch C., USA); H355 (B:15:P1,15) (Holten E., Norge); 6557 (B:17:P1,17) (Zollinger W., USA) og B40 (A:4:P1,10)

(Achtman M., Vest-Tyskland). Et eksempel på en klasse-3-negativ mutant er HIII5 (B:-:P1.16) deponeringsnummer CBS 636.89.

Disse stammer ble inokulert fra forkulturer ved -70°C i rysteflasker, og overført fra disse i 40, 150 eller 350 liter fermentorkulturer. Det halvsyntetiske medium hadde følgende sammensetning: L-glutaminsyre 1,3 g/l, L-cystein.HCl 0,02 g/l, Na2HP04.2H20 10 g/l, KCl 0,09 g/l, NaCl 6 g/l,NH4C1 1,25 g/l, MgS04.7H20 0,6 g/l, glukose 5 g/l, Fe(N03)3100/zM, gjærdialysat.

Under dyrkingen i fermentoren ble pH og P02overvåket og automatisk regulert til en pH på 7,0-7,2 og en luftmetning på 10%. Cellene ble dyrket til tidlig stasjonær fase og høstet ved hjelp av sentrifugering og vasking med steril 0,1 M NaCl og lagret ved

-20°C eller frysetørket.

Bakteriemassen ble f.eks. ekstrahert ved hjelp av 0,5 M CaCl2, 1% (w/v) Zwittergent 3-14 (Zw 3-14) og 0,14 M NaCl, pH4,0, ved anvendelse av 100 ml pr. gram av frysetørket bakteriemasse. Oppslemmingen ble omrørt i 1 time ved romtemperatur og deretter sentrifugert (1 time, 3000 x g), hvoretter supernatanten ble oppsamlet på steril måte. 20% etanol (v/v) ble tilsatt til supernatanten, og etter omrøring i 30 minutter ble produktet sentrifugert (30 min., 10.000 x g), hvoretter supernatanten ble oppsamlet aseptisk. Supernatanten ble deretter konsentrert ved hjelp av diafiltrering i et Amicon hulfibersystem (HID x 50, grense 50.000) og CaCl2og etanol ble fjernet. Konsentratet ble fortynnet med 0,1 M natriumacetat, 25 mM EDTA, 0,05% Zw 3-14 som har en pH på 6,0 til det opprinnelige volum og deretter konsentrert igjen ved hjelp av diafiltrering. Denne fremgangsmåte ble gjentatt fem ganger. pH for sluttkonsentratet ble justert til en verdi på 4,0. 20% (v/v) etanol ble tilsatt til konsentratet, og etter omrøring i 3 0 min. ble produktet sentrifugert (30 min., 10.000 x g). De hele proteinene renses ved hjelp av kolonnekromatografi i nærvær av tensid, f.eks. Zw 3-14. Ofte anvendes gelfiltrering over Sephacryl S-300 samt ionebytting over DEAE Sepharose (Beuvery et al. (1986) supra). Den anvendte ekstraksjonsmetode, tensider, kolonnekromatografi er ikke den eneste anvendbare metode, men tjener bare som eksempel og skal ikke betraktes som begrensende.

EKSEMPEL 3: Fremstilling og karakterisering av klasse-I-OMP -peptidfragmenter

Bromcyanid ble anvendt til å fremstille fragmenter av meningokokk-klasse-l-ytter-membranproteiner. De rensede klasse-1 eller blandinger med klasse-1- eller 3-ytter-membranproteiner ble tatt opp i 70% (v/v) maursyre, og behandlet med et 10 ganger overskudd av CNBr i 16 timer ved romtemperatur. CNBr og maursyren ble fjernet ved hjelp av inndamping og erstattet med 0,2 M Tris.HCl, 6 M urealøsning, pH 7,2. Supernatanten ble forrenset ved hjelp av gelfiltrering over Sepharyl S-200 og deretter renset ved hjelp av TSK-2000 gelfiltrering via HPLC. Beuvery et al. ,

(1986) supra.

ENZYMATISK SPALTING AV CB2-FRAGMENTER

For ytterligere å beskrive epitopene ble meningokokk CB2-fragmentet underkastet spalting med EnoArg-C, EndoGlu-C eller V-8, og de resulterende fragmenter isolert ved HPLC. I korthet ble 2 0 nMol av CB2-fragment i 1 ml av 25 mM fosfat/0,1 mM Tris buffer (pH 8,0) inneholdende 3M urea spaltet ved 3 7°C med 0,2 nMol av EndoArg-C (1 mg/ml i destillert vann) eller 0,22 nMol av EndoGlu-C eller V-8 (1 mg/ml i destillert vann) i 14-18 timer. De resulterende avspaltede fragmenter ble separert ved reversfase HPLC ved anvendelse av en Vydac-C4 kolonne og trifluoreddiksyre-acetonitrilgradient. Hovedtoppen eluert fra EndoArg-C-spaltingen hadde en tilsynelatende molekylvekt på 7-9 Kdal, mens den observerte hovedtopp som fulgte EndoGlu-C eller V-8 hadde en tilsynelatende molekylvekt på 4-6 Kdal. Ved Western-blott ble de isolerte toppene deretter vist å reagere på en pool av monoklonale antistoffer (Adam I, 62-D12-8, MN5-C11G og MN14-C116).

Pl.16-epitopen synes å være tilstede på det C-terminale CNBr-fragmentet i klasse-l-ytter-membranproteinet av stammen H44/76 (B:15:Pl,7.16) . Ytterligere karakterisering av Pl,16-epitopen ble utført ved aminosyresekvensbestemmelse av de

17 Kd (N-terminale) og 25 Kd (C-terminale) CNBr-fragmentene. Den C-terminale 25 Kd fragmenteres ytterligre med V8-protease, endoLys-C, endoGlu-C og endoArg-C. Fragmenter som var positive med det Pl,16-monoklonale antistoff, ble sekvensert så langt som mulig. Den sekvens som ble oppnådd er som følger:

Fragmenter som reagerer med Pl,16-monoklonale antistoffer ble isolert ved anvendelse av V8-protease og endoArg-C-fragmentring med en molekylvekt på henholdsvis 7-9 Kd og 4-6 Kd. De N-terminale sekvenser herav er som følger:

EKSEMPEL 4: DNA-SEKVENSER I KLASSE-I-OMP-GENER

Aminosyresekvenser i klasse-I-OMP ble avledet av nukleotid-sekvensen i de strukturelle gener i fire meningokokk klasse-l-OMP 'er med forskjellige undertyper. Sammenligning med fire aminosyresekvenser muliggjorde forutsigelse av sammensetningen og lokaliseringen av disse epitopene. Dessuten ble Pl, 7- og Pl,16-epitopene bekreftet ved hjelp av peptidsyntese og demonstrasjon av binding av de respektive monoklonale antistoffer.

Klasse-I-OMP-gener ble klonet inn i lambda gtll (som beskrevet for Pl,16 i Barlow et al., (1987) Infect.. Immun. 55.: 2743-2740) og subklonet i Ml3-sekvenserende vektorer, og DNA-sekvensen ble bestemt ved standardkjede-terminerings-dideoksy-nukleotidteknikk.

Den fullstendige utledede aminosyresekvens for Pl,16-; Pl,15-Pl,7.16-; og Pl,2-proteiner er som følger:

+ Bemerk at denne aminosyre 15 er plassert mellom A.A.S.184 og 185 i denne sekvens.

EKSEMPEL 5: DNA-sekvensering av klasse-I-OMP-gener fra forskjellige N. Meningitidis seroundertyper

Polymerasekjede-reaksjonsteknikken (PCR) til Mullis og Faloona (Methods in Enzymol. 155:335-50, 1987) ble anvendt til å amplifisere hele klasse-I-OMP-genet og spesifikke fragmenter ifølge det skjema som er vist i figur 1.

Primere ble syntetisert på en Applied Biosystems 38OB DNA-synthesizer og anvendt i standard PCR 3 0 syklus amplifiserings-reaksjoner ved anvendelse av Taq-polymerase i en Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) ifølge leverandørens anbefal-inger. Amplifiserte fragmenter med ca. 1300, 900 og 450 bp ble dannet av hvert seroundertype genomiske DNA-preparat utifrå primerkombinasjonene vist i Figur 1. De anvendte primere hadde følgende sekvenser:

Overskudd av enkelttrådet templat for sekvensering ble syntetisert i en "asymmetrisk PCR" amplifisering ved anvendelse av 10 0 gangers overskudd av primer bærende en 18 basers forlengelse i5'-halen tilsvarende de anvendte universelle fluorescerende sekvenseringsprimere med en automatisert DNA-sekvenser Modell 370A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Taq-polymerase ble anvendt i en standard dideoksynukleotid-kjedetermineringssekvenserings-reaksjon med de PCR-dannede enkelttrådede klasse-I-genfragmenter som templater. Avledede sekvenser for gensegmenter av stammeneH44/76 (Pl.7.16), M1080 (Pl.1.7), H355 (Pl.15), 6940 (Pl.6), 6557 (Pl.14), 870227 (Pl.10), og B40 (Pl.10) er vist i Figurene 2 og 3.

EKSEMPEL 6: Bekreftelse av aminosyresekvenser av klasse-I-OMP -undertypeepitoper

Utifrå disse gensekvenser bekreftet ved direkte sekvensering av klasse-I-OMP-gener, ble det utledet at sekvensene tilsvarende aminosyrene 24-34 og 176-187 i Pl.16 er utpreget variable i de fire klasse-I-OMP-sekvenser. Tre aminosyresekvenser N-terminalt eller C-terminalt fra disse posisjoner bør også tas i betraktning for mulig innbefatning i disse epitoper for å tillate maksimalisering av epitop stabilitetspresentasjon og uventede innskudd eller delesjoner i den naturlige proteinsekvens. Dessuten bør DNA- og aminosyresekvensene i andre klasse-I-OMP'er sammenlignes med Pl.7.16-sekvensen for å tillate maksimal innretting og epitop forutsigelse. Den første variabel regionepitopen og den andre variabel regionepitopen kalles henholdsvis VRI og VR2. Disse regioner koder for undertypeepitopene som ble bekreftet ved hjelp av peptidsyntese og reaksjonen av petidene med Pl.2; Pl.7; Pl.15 og Pl.16 spesifikke monoklonale antistoffer.

Et fullstendig sett av overlappende dekapeptider forskjøvet med 5 aminosyrer ble fremstilt ved anvendelse av Pl.16-protein- sekvensen. Det anti-Pl.16-monoklonale antistoff omsatt med dekapeptidet YYTKDTNNNL fra Pl.16 reagerte som ventet og intet annet dekapeptid (Figur 4).

Av overlappende dekapeptider utstyrt med et en (1) aminosyresekvens-shift i regionen 24-34 og 176-187 i klasse-I-OMP'et av stammene H44/76 (Pl.7.16), MC50 (Pl.16) og MC51 (Pl.15) reagerte mer enn ett peptid med det undertypespesifikke monoklonale antistoff. I de fleste tilfeller reagerte ett eller flere av gruppen av disse overlappende peptider med det undertypespesifikke monoklonale antistoff sterkere enn andre (Figur 5).

Disse peptider betegnes som VRI- og VR2-epitopene. I Pl.7.16-stammen er sekvensen YYTKNTNNNL tilstede, forandringen D til N ved rest 180 har en viss virkning på reduksjon av antistoff-bindingen. Sekvensen HYTRQNNTDVF i Pl.15 er i den samme relative posisjon i proteinet som Pl.16-epitopen, og er ansvarlig for bindingen til det anti-Pl.15-monoklonale antistoff. AQAANGGASG har en viss binding og peptidene 1-3-aminosyrer nedstrøms viser langt større binding til det Pl.7-monoklonale antistoff. Sekvensen HFVQQTPQSQP i VR2 er ansvarlig for binding til det anti-Pl . 2 -monoklonale antistoff. Det er sannsynlig at sekvensene QPQVTNGVQGN og PPSKSQP i Pl.16- og Pl.15-proteinene også representerer epitoper.

EKSEMPEL 68: Identifikasjon av klasse-I-OMP konstant regionepitop

Peptider som danner overflateløkker ble fremstilt og konjugert med tetanustoksoid. En Biolynx 4170 automatisert peptidsyntesizer (Pharmacia/LKB) ble anvendt til fastfasesyntese i kontinuerlig strøm med følgende unntak. I den siste syklus av syntesen ble SAMA-OPfp (0,5 mmol) (Drijfhout, J.W. (1989), Ph. D. Thesis, Leiden, Nederland) koblet i nærvær av 1-hydroksy-benzotriazol (0,5 mmol) i 3 0 minutter, ved anvendelse av en standard protokoll med utelatelse av piperidinbehandlingen (dvs. "Fmoc-deblokkeringstrinnet" som i dette tilfellet ville forårsake uønsket S-deacetylering). Disse refereres til som SAMA-peptider.

Peptidene og deres overflateregion-lokalisering som ble konjugert med TT er som følger:

Konjugering av SAMA-peptider med tetanustoksoid ble gjennomført som følger: En løsning av N-sukcinimidylbromacetat (4,7 mg, 10/xmol) i DMF (100fil) ble blandet med en løsning av tetanustoksoid (TT) (20 mg) i 0,1 M natriumfosfatbuffer pH 7,8 (3,5 ml). Etter 1 time ble 1,8 ml av reaksjonsblandingen underkastet gelfiltrering ved anvendelse av en Sephadex PD-10 kolonne (Pharmacia) ekvilibrert i 0,1 M natriumfosfat, inneholdende 5 mM EDTA (PE-buffer) pH 6,1. Det bromacetylerte tetanustoksoidet ble eluert med den samme buffer og oppsamlet i 3,5 ml. Løsningen av bromacetylert tetanustoksoid (1,2 ml) ble tilsatt til SAMA-peptidet (4,5 mg, 3/zmol) og avluftet med helium. Deretter ble tilsatt 150/il av 0,2 M hydroksylami (i PE-buffer, pH6,1). Etter 16 timer ble gjenværende bromacetylgrupper blokkert ved tilsetning av 2-aminoetantiolhydroklorid (4/xmol) i buffer, pH6,1 (150 ul). Etter en ytterligere periode på 16 timer ble peptid TT-konjugatet renset ved gelfiltrering over en PD-10 kolonne ved anvendelse av PE-buffer, pH 6,1, som elueringsmiddel. De relevante fraksjoner ble slått sammen og lagret ved 4°C.

For å bestemme den immunologiske aktivitet ble 25/zg (totalprotein) pr. dose av et peptid TT-konjugat injesert subkutant ved uke 0 og 4 i 6-8 uker gamle NIH-avlede mus.

(Bemerkning: Vaksine LBV 017-TT og LBV 018-TT ble anvendt ved 10 Hg totalprotein/dose). Sera ble oppsamlet 6 uker etter den første dose og evaluert for antistoffrespons i en ELISA assay (Beuvery, E.C. et al. (1983) Infect. and Immun. 40:3690380). Følgende antigener ble pålagt i mikrotiterveggene: Ytter-membranprotein (OMP), renset klasse-I-OMP (Poolman, J.T. et al., (1989) Infect. and Immun. 57:1005) og de ikke-konjugerte peptider. Baktericidaktivitet (BC) av sera ble også målt (Poolman, J.T. et al., (1985) supra).

Resultatene er gitt i Tabell 2 nedenfor.

Disse data antyder at av de testede løkker med konstant overflate av klasse-1- og -2-OMP'er av N. menin<g>itidis synes løkke 5 å representere minst én region som vil frembringe antistoffer som vil kryss-reagere med klasse-1- og klasse-2-OMP fra en hvilken som helst stamme av N. meningitidis.

EKSEMPEL 7: Konstruksjon av rekombinante flagelliner

som uttrykker meningokokkepitoper

For å danne hybride flageller som inneholder epitoper av klasse-I-meningokokkepitoper ble det utformet en serie oligonukleotider basert på primære proteinsekvensdata og epitop-kartleggingsdata. To oligonukleotider basert på VRI- eller VR2-epitoper av yttermembran-Pl.7.16 ble utformet slik at de kunne klones til enkelt eller flere kopier i en kloningsregion innenfor genet for S. muenchen-fla<g>ellin. Translasjonsterminasjonssignaler ble innbefattet på den ikke-kodende tråd av oligonukleotidet for å lette skreening ved ekspresjon av de klonede innskudd.

Plasmidvektoren pPXl650 som inneholdt hele den kodende region og promotorregionene for det strukturelle genet for flagellin Hl-d i Salmonella muenchen (deponert i ATCC, adgangsnummer 67685) ble modifisert til å inneholde flere unike kloningsseter som egner seg for innsetting av enten oligonukleotider eller genfragmenter i hver av de tre leserammer i flageIlingenet (Figur 6). Først ble pPX1650 spaltet med EcoRV, som kløver pPX1650 to ganger, 48 basepar fra hverandre, og religert til å gi et plasmid, pPX1651, som har et unikt EcoRV-kloningssete og som fører til en 16 aminosyredelesjon i flagellinproteinet. pPXl65l ble identifisert ved skreening av E. coli-rekombinanter på Western-blots, probet med polyklonalt antistoff rettet mot Hl-d-flagellin. pPXl651 ble identifisert blant flere kandidater som har flagelliner mindre enn villtype-flagellin (i 1650) og ble verifisert ved sekvensering. Deretter ble pPX165l kuttet med BamHl og religert etter utfylling av de overhengende haler med Klenow-enzym for å fjerne det unike BamHl-restriksjonsenzymsetet i vektorens polylinkerregion. Som slutt-trinn ble den resulterende vektor spaltet med EcoRV og følgende oligonukleotidlinker ble innsatt:

Kandidater ble screenet for de ferskt dannede BamH-seter, og flere kandidater med BamHl-seter ble screenet for orientering av linkeren ved dobbelt-trådet DNA-sekvenseringsmetodologi. Én kandidat med linkeren i orienteringen ovenfor ble beholdt somPPX1647:

Plasmid pPX1647 (Figur 7) ble spaltet med BamH og hver av oligonukleotidene for VRI eller VR2 ble klonet inn i E. coli-celler. Screening for ønskede rekombinanter ble gjennomført ved spalting av plasmid minilysat-DNA med egnede diagnostiske restriksjonsenzymer, og screening for ekspresjon ved probing av hybridflagella for nedsatt mobilitet på SDS-PAGE-geler med spesifikt flagellært antiserum (Hl-d). Noen av de resulterende kloner viste nedsatt mobilitet på SDS-PAGE, hvilket angir korrekt innsetting av et eller flere av oligonukleotidene for VRI eller VR2. Flere av hvert ble beholdt for analyse ved DNA-sekvensering. Klon CBl-2 skriver seg fra tandeminnsetting av to kopier av VRl-oligonukleotidet, og klon CBl-4 skriver seg fra innsetting av fire oligonukleotider. På lignende måte inneholdt CB2 P et enkelt innskudd av VR2-oligonukleotidet, og CB2 W viste seg å ha det ventede trimere innskudd, CB2 P klon inneholdt en enkelt baseparforandring som førte til en forandring fra Leu til Phe i det uttrykte VR2-fusjonsprotein, og ble ikke holdt tilbake for videre studium. De rekombinante flagellinkloner i E. coli ble probet med monoklonale antistoffer (Abdillahi og Poolman, Microbiol. Pathogenesis 4:27-32, 1988; RIVM, Nederland) kjent for å reagere med enten VRI- eller VR2-epitoper. Monoklonalene Adam-1 (Pl.7) og Mnl4-Cll-6 (Pl.7) reagerer med hybrid-flagellin inneholdende 2 eller 4 tandeminnskudd av VRI, men reagerer ikke med kloner som inneholder VR2. Den svakere reaksjon av begge monoklonaler med CBl-2 enn med CBl-4 skyldes sannsynligvis epitop tetthet. Av samme grunn reagerer monoklonalene 62 (Pl.16) og Mn5-Cll-G (Pl.16) med CB2 W klon, men ikke med VRI-innskuddene. CB2 P klonet unngår å reagere med noe som helst VR2-antistoff, sannsynligvis på grunn av Leu- til Phe-forandringen.

Hver av disse kloner ble transformert inn i en aroA S. dublin-stamme (SL5927), som hadde et TnlO-innskudd på Hl-d-stedet, for å undersøke hvordan den hybride flagella funksjonerer.

Hver at de fire kloner resulterte i bevegelige bakterier; bevegeligheten av transformantene ble hemmet av det tilsvarende monoklonale antistoff, omfattende klon CB2 P, som angir affinitet av VR2-monoklonalen for epitopen i intakt flagella. Dette resultat viser at epitopene er eksponert på cellenes overflate og er tilgjengelige for antistoff.

Hybrid flagellin inneholdende både VRI- og VR2-epitoper ble dannet ved spalting av enten CBl-2, CBl-4 eller CB-2 W med BamHl og kloning av den heterologe epitop. Klonene CB12-7 og CB12-10 blir resultatet av innsetting i rammen av en enkelt kopi av VR2-oligonukleotidet bak enten henholdsvis 2 eller 4 VR1-tandeninnskudd; klon CB21-F fremkom ved innsetting av en kopi avVRl-epitopen bak 3 tandemkopier av VR2. CB12-7 og CB12-10 blir gjenkjent bare av VRI-monoklonalt antistoff, og CB21-F blir gjenkjent bare av VR2-monoklonal. Disse resultater, sammen med DNA-analyse som åpenbarer forutsagte sekvenser, viser at epitoptettheten er for lav i de sammenkoblede hybrider. For å danne et hybrid flagellin med øket tetthet av både VRI- og VR2-epitoper, ble CB12-10 spaltet med BamHl, og VR2-kodende oligonukleotider ble innsatt. Klon 12-10-6 inneholder to ytterligere tandeminnskudd av VR2-epitopen, som fører til et hybrid flagellin-molekyl hvori fire tandemkopier av VRI blir etterfulgt av tre kopier av VR2. Som vist i Figur 3a og b har tre av hybrid flagellinvaksinekandidatene de forventede molekylære egenskaper.Flagellinet (pCBl x 4) inneholdende fire kopier av VRI reagerer med anti-Hl-d (anti-flagellin) og anti-VRI-monoklonale antistoffer, men ikke med anti-VR2-monoklonale antistoffer; flagellinet (PCB2-W) inneholdende tre tandemkopier av VR2 reagerer med anti-Hl-d- og anti-VR2-antistoffer, men ikke med anti-VRl; det sammenkoblede hybrid inneholdende kopier av VRI og tre kopier av VR2 reagerer med både anti-VRl- og anti-VR2-monoklonale antistoffer. Det sammenkoblede hybrid spesifiserte bevegelighet når det ble innført i en ikke-bevegelig mottager S. dublin-stamme.

Som underenhetsvaksine er målet å oppnå egnede initial-vaksinekandidater i stor mengde og høy renhet. En passende vaksinekandidat kan velges fra konstruksjonstypene ovenfor basert på reaktivitet med monoklonale antistoffer og funkjson av flagella i ikke-bevegelige Salmonella-vertsstammer. En underenhets-flagellinvaksine behøver ikke nødvendigvis å beholde alle funksjonelle trekk fra et parentalt flagellin, men bør i det miste beholde overflatelokalisering for renseformål. Flere underenhets-flagellin-meningokokkvaksiner ble valgt fra de ovenfor beskrevne hybride molekyler basert på reaktivitet med monoklonale antistoffer og medførte overflatelokalisering basert på gjenvinning av bakteriebevegelighet.

Tre flagellinvaksine-kandidater inneholdt enten 4 tandeminnskudd av VRI, 3 tandeminnskudd av VR2, eller 4 VRI-innskudd etterfulgt av 3 VR2-innskudd. Fordi flagellin er et hovedprotein i Salmonella er det mulig ganske lett å rense tilstrekkelig materiale for vaksinasjonsstudier ved bruk av teknikker etablert for flagella-rensing. (Logan et al., J. Bacteriol. 169:5072-5077, 1987).

EKSEMPEL 8: Initiell rensing av rekombinante flagellin-molekyler

De tre hybrid flagellinvaksine-kandidater og en vill type (avledet av pPXl650) ble inokulert i fire liters "baffled" Fernbach flasker inneholdende 1 liter LB-substrat. Bakterie-kulturer ble inkubert ved 37°C under rysting (200 opm) i 22-24 timer. Under disse dyrkingsbetingelser ble mesteparten av flagellene løsnet fra bakteriecelleoverflaten og ble lokalisert i det supernatante dyrkingsmedium. For å oppnå egnet materiale ble flagella isolert fra 6-8 liter kulturmedium. For å oppnå rensede flagellin-preparater for vaksinasjonsstudier ble flagellære filamenter høstet fra bakteriekultursupernatanter ved følgende fremgangsmåte: Ammoniumsulfat ble tilsatt til dyrkings-supernatanten slik at sluttløsningen ble 50% mettet; løsningen ble omrørt forsiktig ved 4°C i flere timer, og det utfelte stoff ble oppsamlet ved sentrifugering i en GSA-rotor ved 5000 opm i 30 minutter. Det oppsamlede ammoniumsulfatutfelte materialet ble rekonstituert i PBS og dialysert mot PBS ved 4°C i 12-15 timer. Det dialyserte materialet ble underkastet høyhastighetssentri-fugering ved 100.000 x g i 1 time i en SW-27-rotor for å pelletere de flagellære filamenter. Det pelleterte materialet som besto hovedsakelig av flagellin, ble underkastet ytterligere rensing ved følgende metode.

EKSEMPEL 9: HPLC-rensing av rekombinante flagelliner

For å fremstille høyt rensede flagelliner ble Salmonella som uttrykte konstruksjonene, spesielt pCBl2-l0-6, dyrket som beskrevet ovenfor og cellene pelletert ved 10.000G. Kultursupernatanten ble deretter felt med 50% ammoniumsulfat, sentrifugert ved 10.000G og slemmet opp igjen i 30 ml PBS. Den resuspenderte pellet ble dialysert mot 10 mM Tris buffer (pH=8,0) inneholdende 6 M urea, 1 mM PMSF, 2 mM NEM og 5 mM EDTA over natten ved 4°C. Dialysert materiale ble deretter ledet over to DEAE-sefarose minikolonner (3,0 ml volum, 4,0 ml elueringsmiddel over hver). Kolonnene ble eluert (5X) med 50 mM NaCl i 10 mM Tris (pH=8,0) inneholdende 6 M urea og deretter med 1 M NaCl i 10 mM Tris (pH=8,0) inneholdende 6 M urea. De første fire elueringsopp-samlingene (20 ml) av 50 mM NaCl ble oppsamlet og dialysert mot 1,0 liter 10 mM acetatbuffer (pH=4,0) i 6 M urea ved romtemperatur. De dialyserte fraksjoner ble deretter fylt på en TSK SP PW kationbytter HPLC-kolonne (75 mm x 300 mm). Kolonnen ble eluert med en mobil fase bestående av 10 mM acetat (pH=4,0) inneholdende6M urea. En gradient på 0-300 mM NaCl ble etablert i 10 mM aceat (H=4,0) inneholdende 6 M urea over intervaller på 5-3 0 minutter. Etter 30 minutter gikk gradienten fra 300 mM til 1 M NaCl i 10 mM acetat i 6 M urea over de neste 5 minutter. Flagellinkonstruktet ble oppsamlet ved ca. 24 minutter som tilsvarer ca. 200 mM NaCl. Fraksjonen ble dialysert mot PBS og renheten bestemt på stoffet ble etablert ved Western-blotting ved anvendelse av anti-flagellin-antistoff. En representativ HPLC-analyse og SDS-PAGE er vist henholdsvis i Figurene 8 og 9.

EKSEMPEL 10: Fremstilling av meningokokk-flagellin-glykokonjugat

Gruppe C meningokokk kapsulært polysakkarid (GCM CPS: parti nr. 86 NM 01) ble fremstilt i alt vesentlig ifølge Bundle et al., J. Biol. Chem. 249:4797-801, 1974).

Neisseria meningitidis stamme Cll ble levert fra the Walter Reed Army Institute (Washington, DC). Stammen ble fordyrket to ganger på saueblodagarplater, deretter anvendt for inokulering av et flytende kim-kulturmedium Neisseria kjemisk definert medium, (NCDM) Kennev et al.. Bull, W.H.O. 37, 469-73, 1967). Til slutt ble 40 liter flytende medium (NCDM) i en fermentor inokulert med den flytende forkultur. Stammens renhet ble undersøkt på hvert trinn. Etter sentrifugering ble supernatanten utfelt ved tilsetning av Cetavlon til en sluttkonsentrasjon på 0,1%, og det uløselige kompleks oppløst igjen i kald 1 M kalsiumklorid (CaCl2)

(Gotschlich et al., J. Exp. Med. 129:1349-65.1969). Etanol (96%) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 25% (v/v). Etter 1 time ble oppslemmingen sentrifugert (1 time, 50.000 g), supernatanten ble oppsamlet, og dens etanolkonsentrasjon ble økt til 80% (v/v). Etter 1 time ga sentrifugering (20 minutter, 5000 g) et bunnfall som ble vasket i rekkefølge med absolutt etanol, aceton og dietyleter, og deretter tørket i en vakuumeksikator over fosfor-pentoksyd (P205) til konstant vekt. Dette rå CPS ble lagret ved - 20°C.

For å oppnå et renere preparat ble CPS deretter løst i natriumacetatbuffer (1:10) fortynning av en mettet løsning, pH 7,0) og ekstrahert fire ganger med varm fenol (Westphal et al.. Z.Naturforsch. 7b:148-55, 1952). Etter dialyse av de sammenslåtte vandige fasene mot 0,1 M CaCl2, etterfulgt av sentrifugering (3-5 timer, 100.000 g), ble det gjennomført en endelig etanolutfelling på den klare supernatant, og det resulterende bunnfall ble vasket med organiske løsningsmidler og tørket som beskrevet ovenfor. Det rene CPS ble deretter lagret ved -20°C.

Ved hvert trinn i renseprosessen ble CPC analysert for karbohydrat N-acetylneuraminsyre (NANA) (Svennerhold, Biochim. Bio<p>hys. Acta 24:604, 1957), O-acetyl (Hestrin, J. Biol. Chem. 180:249. 1949), og proteininnhold (260 nm påvisning), og dets molekylvekt undersøkt ved gelfiltrering.

Gruppe C meningokokk kapsulært polysakkarid (GCM CPS) ble samtidig depolymerisert og aktivert via natriumperiodatoksydasjon (NaJ04) i vandig buffer (Anderson et al., J. Immunol. 137:1181-6, 1986; Eby et al.. Pediat. Res. 20:308A, 1986, Anderson et al., J. Pediatr. 111 (5) : 644-50, 1987; Anderson, U.S. patent 4.762.713; 1988). Reaksjonen ble overvåket ved høytrykksgel-permeasjons-kromatografi (HPGPC) i vandig elueringsmiddel, ved anvendelse av ultrafiolett (UV) og brytningsindeks (RI) påvisning. Reaksjonen ble stanset, og de aktiverte oligosakkarider (GCM OS) ble avsaltet ved lavtrykksgelpermeasjon (GPC) i vann, og deretter lyofilisert. En løsning ble deretter fremstilt i vann og deretter frosset for midlertidig lagring. GCM OS og flagellin pCBl2-lO-6 ble blandet i vandig nøytral buffer, og konjugasjonen ble initiert ved tilsetning av natriumcyanoborhydrid (NaBH3CN) (Anderson, U.S. patent 4.762.713, 1988; U.S. patent 4.673.574, 1987; U.S. patent 4.761.283, ,1988) . Reaksjonen ble utført i 5 døgn, mens den ble overvåket ved HPGPC. Den ble til slutt stanset ved dialyse/ konsentrasjon på sentrifugale mikrokonsentratorer. Sluttpreparatet ble lagret kaldt, i nærvær av timerosal for å forhindre bakterievekst. Det resulterende glykokonjugat gir ikke bare en mekanisme til å presentere de uttrykte VRI- og VR2-meningokokkepitopene for immunsystemet, men tjener også som bærermolekyl for presentasjon av et meningokokk-oligosakkarid.

Ved fremstilling av konjugatet ble følgende betingelser anvendt. Renset flagellin pCBl2-lO-6 ble løst i 15% sukrose (3,5 mg/ml) og deretter lagret ved -20°C. GCM CPS (9,7 mg; sluttkonsentrasjon: 5 mg/ml) ble oksydert med 100 mM NaJ04i 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 6,2-6,5) ved RT, i mørke under omrøring. Alikvoter (100/il) ble trukket av ved regulære mellomrom, reaksjonen stanset ved tilsetning av etylenglykol (10 fil) , og analysen gjennomført ved HPGPC på Waters (Milford, MA) Ultrahydrogel™ 250 + 120 (2 kolonner sammenkoblet; 2 x

300 mm x 7,8 mm) i 0,2 M fosfatsaltløsningsbuffer (PBS; 0,2 M natriumfosfat, 0,9% NaCl, pH 7,8), ved en strømningshastighet på 0,8 ml/min. ved anvendelse av UV (206 nm) og RI-bestemmelse. Etter 2 timer og 3 0 minutter ble reaksjonen stanset ved tilsetning av etylenglykol (1/10 av reaksjonsvolumet), og GCM OS ble avsaltet ved GPC på Bio-Rad (Richmond, CA) Bio-Gel<R>P-2 (200-400 mesh, 30 cm x 1,5 cm) i vann, ved ca. 18 ml/time. Fraksjoner ble oppsamlet (1,2 ml) og analysert på tilstedeværelse av NANA karbohydratet N-acetyl-neuraminsyre (NANA) (Barry et al., J. Microbiol. 29:335-52, 1962) og aldehyder (Porro et al.. Anal. Biochem. 118:301-306, 1981). Positive fraksjoner ble slått sammen og lyofilisert. Avslatet GCM OS (4,7 mg) ble deretter løst i vann (10 mg/ml) og frosset ved -20°C.

Både GCM OS og pCB12-10-6 løsningene ble analysert ved HPGPC (UV ved henholdsvis 206 og 280 nm) før de ble frosset, og før konjugeringen. Ingen nedbrytning foregikk under lagringen, som fastslått ved den eksakte likhet av elueringsprofilene.

GCM OS (2 mg; sluttkonsentrasjon: 2,6 mg/ml) og flagellin pCBl2-lO-6 (2,3 mg; sluttkonsentrasjon: 3 mg/ml) ble blandet i et polypropylenrør i 0,4 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0), og NaBH3CN ble tilsatt (12/zmol) for å initiere konjugeringen (Andersom, U.S. patent 4.762.713, 1988; U.S. patent 4.673.574; U.S. patent 4.761.283). Reaksjonsblandingen ble etterlatt et døgn ved RT, deretter 4 døgn ved 35°C uten omrøring. Reaksjonen ble overvåket ved HPGPC (UV ved 280 nm) ved forskjellige trinn, og tilslutt stanset ved dialyse/konsentrering på mikrokonsentratorer. Sluttpreparatet ble analysert for NANA (Barry et al., J. Gen. Microiol. 29:335-353, 1962) (0,09 mg ved 0,12 mg/ml) og proteininnhold (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193:265-275, 1951)

(1,12 mg; 1,45 mg/ml). Det ble deretter lagret ved 4°C i nærvær av timerosal (0,01%, w/v) for å forhindre bakterievekst.

Konjugatpreparatet ble også undersøkt ved SDS-PAGE (sølvnitratfarging) og Western blottinganalyse. Flere høymole-kylære bånd kom til syne på gelen over det rene pCB12-lO-6-båndet og nær stablebrønnen, slik at sistnevnte var et tegn på at det foregikk tverrbinding under konjugeringen. Western blotting-analyser viste at hvert bånd var reaktivt med de anvendte antisera (anti-GCM, -VRI og -VR2), som beviste at konjugatbindingene var kovalente.

EKSEMPEL 11: Konjugering av meningogokkpeptider til CRM og bovlnt serumalbumin

Peptider betegnet som M20 og M21 fremstilt på peptid-synthesizer av ABI modell ved fastfasesyntese ved anvendelse av tBoc-kjemi, ble koblet til CRM197(fremstilt som beskrevet av Andersen, U.S. patent nr. 4.762.713) ved anvendelse av et bifunksjonelt tverrbindingsmiddel, sulfosukcinimidyl (4-jod-acetyl)aminobenzoat (Sulfo SIAB; kjøpt fra Pierce) ifølge modifikasjon av en publisert fremgangsmåte (Weltman, J.K. et al. ,

(1983) Bio Techniques 1, 148-152). Kort fremstilt ble CRM197aktivert med sulfo SIAB, hvilket førte til dannelse av en amidbinding mellom SIAB og aminogruppene i CRM197. Etter fjerning av uomsatt tverrbinder fra det aktiverte CRM197ved gelfiltrering, ble det peptidholdige (M20 eller M21) forbindingsstykke (represen-tert ved understrekede bokstaver) med karboksyterminal cystein-rest, blandet med aktivert CRM og inkubert ved romtemperatur i 2-4timer. Etter omsetningen ble det konjugerte materialet dialysert inngående mot PBS ved 4°C.

Sekvensen for M20-peptidet (VR2-epitopen) er som følger:

Sekvensen for M21-peptidet (VRl-epitopen) er:

Konjugerte stoffer ble underkastet SDS PAGE, overført til PVDF-membraner (Immobilon, Millipore) og omsatt med spesifikke monoklonaler som gjenkjenner VRI- og VR2-epitoper. Figur 10a og 10b viser Western blot analyse av M20 og M21 CRM197konjugater, mot en pool av VRI og VR2 spesifikke monoklonaler (Adam I, G2-D12-8(Pl.7), MN5-C11-G (Pl.16) ogNMl4-Cll-6 (P1.7)).

For å bestemme antistoffresponsen på M2 0- og M21-peptidet ved "enzyme linked immunoassay" fremgangsmåte (ELISA), ble det fremstilt BSA-konjugater ved anvendelse av et anderledes bifunksjonelt tverrbindingsmiddel, N-sukcinimidylbromacetat som beskrevet av Bernatowicz og Matsueda (Anal. Biochem. 155, 95-102 (1986).

Kovalent kobling av peptid til proteinet ble bekreftet ved Western blotting av elektroforesebehandlede prøver som beskrevet for CRM197-konjugater.

EKSEMPEL 12: Retensjon av T-celleaktivitet av M20- og M21 - CRM197 - konj uga ter

For å bestemme hvorvidt konjugering av VRI- og VR2-epitopene til CRM197vil påvirke T-cellegjenkjenningen av CRM197<->proteinet på skadelig måte, ble det gjennomført en T-celleproliferativ under-søkelse som tidligere beskrevet av Bixler og Atassi (Imunol. Commun. 12:593, 1983). Kort fortalt ble SJL/j-mus immunisert med 50 iiq av naturlig CRM197 emulgert i CFA. 7 døgn senere ble lymfeknuter fjernet, dyrket i RPMI og utfordret med forskjellige konsentrasjoner av proteiner (0,05-100,0/zg/ml) og peptider. Etter 3 døgns inkubasjon ble kulturene pulset med [<3>H]-tymidin i 16 timer og deretter høstet for telling.

Som vist i Tabell 3 viser en sammenlignig av CRM197med CRM197-narrekonjugatet at konjugeringsfremgangsmåten i seg selv ikke forandrer T-cellegjenkjenningen av proteinet. T-celle-responsene som induseres av M20- og M2l-CRM197konjugatene var i alt vesentlig ekvivalente med eller større enn den respons som ble fremkalt av selve CRM197, hvilket viste at gjenkjenningen av T-celleepitopene på CRM197ikke påvirkes skadelig av peptid-konjugeringen. Responsene på kontrollstoffene Con A, LPS og tetanustoksoid var som ventet.

EKSEMPEL 13: Immunogenisitet av konjugat og rekombinante meningokokk-b-vaksiner

Rekombinant flagellin som uttrykker meningokokk VRI- og/eller VR2-epitoper ble fremstilt og renset som beskrevet i Eksemplene7, 8 og 9. Dessuten ble det syntetisert syntetiske peptider som representerer meningokokkepitopene VRI og VR2, kovalent koblet til bærermolekylet CRM197og renset som i Eksempel 12. Vaksiner ble formulert med hvert av disse stoffer ved proteinkonsentrasjoner på 10 eller 100/xg/ml for hver av komponentene. Vaksineblandingene innbefattet også aluminiumfosfat ved 1 mg/ml, eller unntatt som bemerket ble de sammensatt med Freund's komplette hjelpemiddel eller uten tilsetningsstoffer.

For å evaluere immunogenisiteten ble avlede sveitsiske Webster mus immunisert intramuskulært ved uke 0 og 2 med 1 eller 10 fig protein/dose. Sera ble oppsamlet med to ukers mellomrom, sammenslått for analyse, og skreenet for antistoffaktivitet ved ELISA på ytter-membrankompleks (OMC), renset OMP (Pl.16), VR1-peptid koblet til bovint serumalbumin (M21-BSA), VR2-peptid koblet til BSA (M20-BSA) , villtype flagellin, og til CRM197. Resultatene av ELISA gjennomført på sera oppnådd ved 6 uker er vist i Tabell 4.

Alternativt ble de forskjellige vaksiner evaluert for immunogenisitet i 6-8 uker gamle NIH-avlede mus. Musene ble immunisert med 100^g (total protein/dose subkutant ved uke 0 og 4 med vaksine, og sera ble oppsamlet på uke 6. Disse sera ble evaluert i en ELISA-undersøkelse og ved anvendelse av antigener som beskrevet i Eksempel 6. Baktericidaktivitet ble målt som i Eksempel 6. Resultatene finnes i Tabell 5.

De rekombinante flagellinene inneholdende enten en VRI, VR2 eller en kassett av både VRI og VR2 var effektive til å fremkalle en antistoffrespons som var kryssreaktiv med den rensede Pl.16 og i mindre utstrekning med OMC. Sera fra dyr immunisert med 10 p. g av enten pCBl-4 eller pCB2-W, induserte antistoffer som bandt seg til sine respektive peptid-BSA-konjugater samt kryssreagerte med Pl.16 og OMC. Lignende resultater ble oppnådd med det konstruerte pCBl2-lO-6 som inneholder begge meningokokkepitoper. Dessuten induserte hver konstruksjon også signifikante anti-flagellin-titere. I motsetning induserte kontroll-villtype flagellinet bare en antistoffrespons til selve flagellinet. Sera oppsamlet før immuniseringen viste ingen foruteksisterende respons på de stoffer som ble evaluert.

Disse data viser også fordelene ved å formulere de rekombinante flagelliner med alun eller andre hjelpemidler såsom CFA. Konstruksjonen pCBl2-lO-6 ble formulert med og uten tilsetning av alumniumfosfat. Som vist i Tabell 2 var pCBl2-lO-6 alene i stand til å indusere antistoffrespons som reagerer på peptidkonjugatene samt på det rensede Pl.16 så vel som på OMC. Til sammenligning, når den samme konstruksjon ble formulert med alun, var den i stand til å fremkalle større antistoffrespons ved en tilsvarende dose. På lignende måte ble de rekombinante flagellinene pCBl-4 og pCB2-W også formulert med CFA. Igjen ble det observert ekvivalent eller høyere antistofftitere i nærvær av

CFA.

Resultatene av immunogenisitetsstudiene med meningokokk VRl-og VR2-konjugatene er også vist i Tabell 4. Både M20- og M21-CRM197-konjugatene så vel som en blanding inneholdende like mengder av begge konjugater, var i stand til å indusere anti-CRM197-respons så vel som anti-klasse-I-OMP-respons.

Disse foreløpige data viser at en klasse-I-OMP variabel regionepitop enten kjemisk konjugert til en bærer eller genetisk fusjonert til en bærer, vil fremkalle immunrespons. Nye epitopbærerkonjugater kan lages ved anvendelse av standardteknikk for å øke immunresponsen på vaksinen, f.eks. anvendelse av 1) større epitoper, 2) peptider med flere epitoprepetisjoner og/eller 3) forskjellige bærere.

EKSEMPEL 14: Fremstilling av meningokokk-humant serumalbumin-glykokonj ugat

GCM CPS ble depolymerisert ved syrehydrolyse og det oppnådde GCM OS ble deretter aktivert via NaJ04oksydasjon i vandig buffer. Reaksjonene ble overvåket ved HPGPC i vandig elueringsmiddel, ved anvendelse av UV- og RI-bestemmelse. Reaksjonene ble alle etterfulgt av GPC-avsalting i vann. GCM OS og humant albumin (HA) ble blandet og konjugert i alt vesentlig som beskrevet i Eksempel 10 for miningokokkflagellinglykokonjuatet. Sluttpreparatet ble lagret kaldt, i nærvær av timerosal for å forhindre bakterievekst.

Ved fremstilling av konjugatet ble anvendt følgende eksperimentelle betingelser: Humant albumin (HA; Sigma<R>, St. Louis, MO) ble løst i 15% sukrose (10 mg/ml) og deretter lagret ved -20°C. GCM CPS (lot nr. 86 NM 01; 106 mg; sluttkonsentrasjon: 10mg/ml ble hydrolysert i 0,1 N HCl ved 50°C under omrøring.Alikvoter (25/il ble trukket ut ved regulære mellomrom, reaksjonen stanset ved tilsetning av natriumhydroksyd (NaOH) og analyse ble gjennomført ved HPGPC som beskrevet. Etter 3 timer og 40 minutter ble reaksjonen stanset ved tilsetnng av NaOH, og GCM OS ble avsaltet med GPC. Fraksjoner ble oppsamlet (1,2 ml) og analysert som beskrevet foran. Positive fraksjoner ble slått sammen og lyofilisert. Avslatet GCM OS (89 mg) ble deretter lagret ved -20°C. Aktivert OS ble fremstilt ved oksydasjon av GCM OS (11,8 mg; sluttkonsentrasjon: 5 mg/ml) med 2 mM NaJ04i 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 6,2-6,5) ved RT, i mørke under omrøring. Reaksjonen ble stanset etter 3 0 minutter ved tilsetning av etylenglykol. HPGPC-analyse viste ingen nedbrytning av molekylvekten for OS under aktiveringen. Avsalting og kolorimetrisk analyse ble deretter gjennomført som beskrevet ovenfor. Det resulterende aktiverte GCM OS (8,8 mg) ble løst i vann (10 mg/ml) og frosset ved -20°C.

Både CM OS og HA-løsningene ble analysert ved HPGPC (UV ved henholdsvis 206 og 280 nm) før frysing, og før konjugeringen. Ingen nedbrytning foregikk under lagringen, som fastslått ved den eksakte likhet mellom elueringsprofilene.

GCM OS (6 mg; sluttkonsentrasjon: 2,5 mg/ml) og HA (12 mg; sluttkonsentrasjon: 5 mg/ml) ble blandet i et polypropylenrør i0,4M natriumfosfatbuffer (pH 7,0), og NaBH3CN ble tilsatt (60/zmol) for å initiere konjugeringen (Anderson, U.S. patent4.762.713, 1988; U.S. patent 4.673.574, 1987; U.S. patent 4.761.283, 1988). Reaksjonsblandingen ble etterlatt et døgn ved RT, deretter 4 døgn ved 15-35°C, uten omrøring. Reaksjonen ble overvåket ved HPGPC (UV ved 280 nm) ved forskjellige trinn, og til slutt stanset ved dialyse/konsentrasjon på mikrokonsentratorer. Sluttpreparatet ble analysert på NANA (Barry et al., J. Gen. Microbiol. 29, P335-51, 1962) (2,07 mg ved 0,86 mg/ml) og proteininnhold (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265-75, 1951)

(9,51 mg ved 3,96 mg/ml). Det ble deretter lagret ved 4°C i nærvær av timerosal (0,01%, w/v) for å hindre bakterievekst.

Konjugatpreparatet ble også undersøkt ved SDS-PAGE (sølvnitratfarging) og Western blotting-analyse. Et diffust bånd kom til syne på gelen som dekket et signifikant bredere molekylvektområde enn den rene HA. Western blotting-analyse viste at dette bånd var reaktivt med det anvendte antiserum (anti-GCM), som beviste at konjugatbindingene var kovalente.

EKSEMPEL 15: Immunogenisitet av meningokokkvaksiner av oligosakkarid-rekombinant flaggelin

En meningokokkvaksine av oligosakkarid-rekombinant flagellin ble fremstilt som beskrevet ovenfor og formulert ved 100/ig protein/ml. Vaksineblandinger ble også fremstilt som inneholdt aluminiumfosfat (1 mg/ml) eller komplett Freund's hjelpemiddel i tillegg til glykokonjugatet.

For å evaluere immunogenisiteten ble avlede sveitsiske Webster mus immunisert intramuskulært med 10fxq protein ved uke 0 og 2. Sera ble oppsamlet ved ukene 0, 2 og deretter ukentlige intervaller, deretter ved 6 uker. Etter oppsamling ble sammenslåtte seraprøver undersøkt på antistoffaktivitet med ELISA på meningokokk C oligosakkaridkonjugat, på humant serumalbumin, OMC, Pl. 16, CB1 og CB2-BSA konjugater og flagellin.

MenC-CBl2-10-6-glykokonjugatet var effektivt til å frembringe en immunrespons som var reaktiv med både oligosakkaridet og meningokokk B OMP-epitopene uttrykt i det rekombinante flagellin. Som vist i Tabell 5B, så lite som tre uker inn i studien, hadde mus immunisert med 1 fig av MenC-CBl2-lO-6-konjugatet i komplett Freund's hjelpemiddel, påvistbart antistoff mot MenC-HSA, OMP og mot både CBl- og CB2-epitopene. Dessuten frembragte alle MenC-CBl2-l0-6-preparatene, uansett hjelpemiddel, antistoffrespons mot MenC-HSA som var større enn responsen observert etter immunisering med MenC-CRMl97.

EKSEMPEL 16: T-celle-epitoper av klasse-I-OMP og deres identifikasjon

En effektiv vaksine må inneholde en eller flere T-celle-epitoper. T-celle-epitoper i et protein kan forutsies som beskrevet av Margalit et al.. J. Immunol. 138 :2213. (1987) eller Rothbard og Taylor, EMBO J. 7:93, (1988). Disse forutsigelses-metoder ble anvendt på aminosyresekvensen i klasse-I-OMP av N. meningitidis-stammene Pl.7.16, Pl.16 og Pl.15. Segmentene i den sekvens som inneholder potensielle T-celle-epitoper identifisert ved disse metoder, er vist i Tabellene 6 og 7. De forutsagte peptider ble syntetisert ved standard FMOC-fremgangsmåter, renset ved standardmetoder og ble identifisert som vist i Tabell 8.

For å bestemme hvilken av de forutsagte peptider som virkelig inneholder T-celleepitoper, testet man deres evne til å stimulere humane perifere blodlymfocytter (PBL) ved lymfocyttproliferativ assay. Kort berettet ble perifert blod oppsamlet fra HLA-typede normale frivillige eller fra frivillige som tidligere var blitt immunisert med MPC-2 (Poolman, J.T. et al.. Antonie vanLeeuwenhoek. 5_3:413-419, 1987) som inneholdt Pl.16, 15, klasse-4-OMP og gruppe C-polysakkarid. Lymfocytter ble isolert fra det perifere blod ved isolasjon på Ficoll-Hypaque (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) og dyrket ved 1 x IO<5>celler/brønn i supplementert RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Paisly, Skottland) inneholdende 10% varmeinaktivert sammenslått humant AB-serum. Kulturer ble utfordret med forskjellige konsentrasjoner av de forutsagte T-celleepitoper (0,05-10 ptg/ml) . Etter in vitro-utfordring ble kulturene inkubert i seks døgn og deretter pulset (18 timer) med 0,5/xCi av [H<3>]-tymidin. Kulturer ble deretter høstet og tellet ved væskeskintillasjon. Data er uttrykt som stimuleringsindekser som ble beregnet som forholdet mellom den CPM som ble oppnådd i nærvær av antigen og den CPM som ble oppnådd i fravær av antigen.

Som vist i Tabell 9 viste 10 av de 16 forutsagte peptider en viss evne til å stimulere T-celler. Disse omfatter peptidene identifisert ved 16-34, 47-59, 78-90, 103-121, 124-137, 151-158, 176-185, 223-245, 276-291 og 304-322. I noen tilfeller stimulerte peptidene en respons i både immuniserte samt ikke-immuniserte individer. Responsen i de ikke-immune individer kan skyldes en tidligere asymptomatisk infeksjon.

Når det gjelder T-celleepitopen identifisert som regionen 176-185 ble det observert en forsterkning av T-celleresponsen etter tilsetning av det monoklonale antistoff MN5C11G (Pl.16). Kort fortalt ble PBL utfordret in vitro med et syntetisk peptid inneholdende regionen 175-185 eller med dette peptidet blandet med varierende fortynninger av MN5C11G. Som vist i Tabell 10 ble forsterkning av T-celleresponsen observert ettr tilsetning av MN5C11G, hvilket viste at monoklonalt antistoff gjenkjente en B-celleepitop i regionen 176-185 og letter presentasjonen av peptidet for immunsystemet. Det ble således fastslått at T- og B-celleepitopene enten faller sammen med eller finnes på tilstøtende sekvenser i klasse-I-OMP'et.

I flere tilfeller ble T-cellelinjer og kloner skaffet fra individer som responderte på forskjellige peptider. Kort fortalt ble T-cellelinjer oppnådd ved dyrking av isolerte lymfocytter i 24brønners plater ved 1 x IO<6>celler/ml. Kulturmediet, supplementert RPMI-1640 med 10% human serum, inneholdt også 12 U/ml rekombinant IL-2 (Boehringer). Dessuten ble 5 x IO<4>homologe, bestrålte (3000 R) antigenpresenterende celler (APC) også tilsatt til hver brønn. I noen tilfeller ble APC opnådd fra HLA-kompatible donorer. Fra linjene ble T-cellekloner isolert ved begrensende fortynning med en frekvens på 0,5 celler/brønn. Kloner ble holdt ved to ukers stimulering med antigen i nærvær av bestrålt APC og IL-2 (2 U/ml). Kloner ble testet ved lymfocyttformeringsanalyse i alt vesentlig som beskrevet ovenfor, med unntak av at klonene ble dyrket ved 1 x 10<4>celler/brønn i nærvær av bestrålt APC.

Kloner oppnådd som beskrevet ble utfordret in vitro med OMP fra 7 forskjellige stammer av meningokokker. Som vist i Tabell 11 gjenkjente klonene en T-celleepitop eller epitoper felles for de syv undersøkte OMP'er. Selv om det gjenstår å bestemme reaktiviteten av disse kloner overfor de forskjellige peptider, viser disse data allikevel hvor vanlige T-celleepitopene er blant de forskjellige stammene. Nå som disse kloner er blitt etablert og identifisert, vil deres peptidreaktivitet angi T-celleepitoper for vaksineanvendelse.

EKSEMPEL 17: Konstruksjon av proteinmodell for membrantopologi av klasse-I-OMP og sammenligning med andre patogene gram negative porinproteiner for vaksineutvikling.

Det ble konstruert en modell ved anvendelse av de anerkjente prinsipper for strukturen av flere Escherichia coli ytter-membranproteiner (Vogel, H. et al., (1986) supra, Ferenci, T. et al.,

(1988) supra og Tommassen, J. (1988) supra). Den sentrale antagelse er at proteinsegmenter som omspenner ytter-membranen, danner beta-folier. Spesifikt, i tilfelle klasse-I-protein, kom man frem til oppdelingen i eksponerte og transmembrane segmenter på følgende måte: 1. En sammenligning at aminosyresekvensen i klasse-I-protein (undertype Pl.16) med dem i gonokokk PIA- og PIB-proteinene (Carbonetti, N.H. et al.. (1987) PNAS 84:9084; Carbonetti, N.H. et al.. (1988) PNAS 85:6841; og Gotschlich, E.C. et al.. (1987) PNAS 84:8135) åpenbarer 34% identitet. I modellen danner de variable sekvenser de overflateeksponerte deler, mens de bevarte regioner er plassert for det meste i ytter-membranen og periplasma. De to sistnevnte områdene består således til 58% av rester som er bevart blant alle proteiner. 2. De hydrofile maksima ble observert i en hydropatiprofil (Kyte, J. et al.. (1982) J. Mol. Biol. 157:105) og tilsvare eksponerte regioner. 3. Transmembransegmentene bør fortrinnsvis være i stand til å danne amfipatiske beta-tråder med 9-12 rester, med minst én side bestående fullstendig av hydrofobe rester. Disse betingelser tilfredsstilles i 12 av de 16 membranomspennende segmenter. 4. Antallet rester på den periplasmiske side blir minimalisert.

Figur 11 viser modellen for foldingen av klasse-I-protein i ytter-membranen. Den viste sekvens er for undertype Pl.16. Den øvre delen av figuren viser de overflateeksponerte regioner, mens den sentrale del angir de antatte transmembrane segmenter, hvis lengde er satt til ti. Aminosyrene er vist alternerende hvor de kan danne en amfipatisk beta-tråd. Denne modell inneholder åtte overflateløkker, hvorved den første og den fjerde løkke inneholder de typespesifikke og beskyttende variabel regionepitopene. Disse epitoper, som det er blitt vist når de formuleres til en vaksine, kan fremkalle en beskyttende immunrespons. Løkke 5 er konstant og er blitt vist å utløse kryssreaktive antistoffer til andre OMP'er og er nyttig for vaksineformulering.

Den ene eller to variabel epitopregioner i de individuelle proteiner er lokalisert på såkalte overflateløkker på disse membranproteiner. Slike porin-ytter-membranproteiner inneholder mer enn to overflateløkker. Dette innebærer at det er overflatelekker som har nær identisk aminosyresekvens i de forskjellige klasse-1-ytter-membranproteiner også. dette åpner veien for anvendelse også av vanlige peptider av klasse-l-ytter-membranprotein for vaksineformål. Mere spesielt illustreres det i Figur 11 en skjematisk todimensjonal modell av meningokokk-klasse-1-ytter-membranproteinet Pl.16. Denne modell inneholder 8 overflatelekker, hvorved den første og den fjerde løkke inneholder de typespesifikke epitoper som vist på basis av stammeundertypingsresultater. Den femte overflateløkke represente rer den konstante region beskrevet ovenfor. Antistoff til den konstante region i løkke 5 synes å reagere med N. meningitidis OMP-kompleks. Aminosyresekvensen i klasse-l-OMP, som avledet, ble sammenlignet med klasse-I-OMP'et i N. meningitidis (Murakami, K. et al., (1989), Infect. Immun., 57:2318) og porin PIA og PIB-prote inene i N.<g>onorrhoea. Med lignende prinsipp som anvendt for klasse-I-OMP-modellering ble sekvensene innrettet som følger:

Strukturelle likheter er vist ved transmembran- og overf lateløkkeregioner. Med den informasjon som nå er tilgjengelig for klasse-I-OMP og informasjon basert på overflateløkkestørrelse, lokalisering, homologi eller heterologi mellom aminosyreartene i løkkeregionene i det spesielle porinprotein, er det mulig å gjøre forutsigelser angående epitoper for inkorporering i vaksiner for andre patogene gram negative bakterier omfattende N. gonorrhoeae. Ved anvendelse av de samme metoder som anvendes for klasse-I-OMP kan disse epitoper evalueres for vaksineformål.

DEPONERING AV MIKROORGANISMER

N. menincritidis-stammen H44/76 (B : 15 : Pl. 7 .16) ble deponert 11. desember 1989 i Centraal Bureau voor Schimmelculturen (CBS), Baarn, Nederland og har deponeringsnummer CBS 635.89. Mutanten HIII-5 fattig på N. menin<g>itidis klasse 2/3 OMP ble deponert 11. desember 1989 i CBS, Baarn, Nederland og har deponeringsnummer CBS 636.89.

EKVIVALENTER

Spesialister på dette området vil anerkjenne, eller være i stand til å sikre anvendelse av ikke mer enn rutineeksperimenter, mange ekvivalenter til de spesielle utførelser av oppfinnelsen beskrevet heri. Slike ekvivalenter er ment å være omfattet av følgende krav.

Claims (32)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en yttermembranvesikkel-vaksine mot Neisseria meningitidis omfattende i det minste ett klasse 1 yttermembranprotein eller immunogen del derav og ikke omfattende et meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein,karakterisert vedå dyrke en klasse 2/3 minus stamme av Neisseria meningitidis, isolere vesikler fra kulturen for derved å fremstille yttermembranvesikler og tilsette yttermembranvesiklene til en farmasøytisk akseptable bærer for derved å fremstille en vaksine.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat klasse 2/3 minus mutanten av Neisseria meningitidis er avledet fra en gruppe A, B, C, W-135 eller Y meningokokkus.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat klasse 2/3 minus mutanten av Neisseria meningitidis uttrykker mer enn en subtype av meningokokk klasse 1 yttermembranprotein.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meningitidis omfattende i det minste ett renset klasse 1 ytter-membranprotein eller fragmenter derav og ikke omfattende en meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein,karakterisert vedå dyrke en klasse 2/3 minus stamme av Neisseria meningitidis , rense klasse 1 yttermembran-protein fra kulturen for derved å fremstille renset klasse 1 yttermembranprotein, tilsette lipider eller andre komponenter av farmasøytisk akseptable bærere til det rensede klasse 1 ytter-membranproteinet som konserverer den antigene konformasjonen av klasse 1 yttermembranprotein, spalte det rensede klasse 1 ytter-membranprotein med CNBr eller med en protease for derved å fremstille proteinfragmenter av klasse 1 yttermembranprotein, rense ett eller flere proteinfragmenter og tilsette til ett eller flere rensede proteinfragmenter, lipider eller andre komponenter av en farmasøytisk akseptabel bærer som konserverer den antigene konformasjonen til klasse 1 yttermembranprotein.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat klasse 1 yttermembranproteinet har aminosyresekvens tilsvarende SEKV. ID. NR. 5, 6, 7 eller 8.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat klasse 2/3 minus stammen av Neisseria meningitidis uttrykker mer enn en subtype av klasse 1 yttermembranprotein.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat det ytterligere tilsettes renset kapsulært polysakkarid av Neisseria meningitidis til det rensede klasse 1 yttermembranprotein eller til de rensede proteinfragmentene.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert veden ytterligere kjemisk konjugering av det rensede klasse 1 yttermembranprotein til et annet antigen eller til et bærerprotein eller til en epitop derav.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert vedat bærerproteinet er tetanus toksoid eller CRM197av difteritoksin.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedden ytterligere kjemiske konjugering av renset klasse 1 yttermembranprotein eller rensede protein-fragmenter til et meningokokk polysakkarid.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat proteasen er valgt fra gruppen endoproteinase Lys-C, endoproteinase Arg-C eller endoproteinase Glu-C.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat klasse 1 yttermembranproteinet er av subtype Pl.7.16.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meningitidis omfattende minst en bakterielt antistoff-bindende epitop av meningokokk klasse 1 yttermembranprotein, og ikke omfattende et meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein,karakterisert vedkjemisk syntese av en eller flere oligopeptider korresponderende til ett eller flere bakterielle antistoff-bindene epitoper av meningokokk klasse 1 yttermembranprotein, rensing av oligopeptidene, tilsette til de rensede oligopeptidene, lipider eller andre komponenter av en farmasøytisk akseptabel bærer som konserverer den antigene konformasjon av oligopeptidene.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedat en eller flere oligopeptider har aminosyresekvensen QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, AQAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP eller HYTRQNNTDVF.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedat epitopen eller epitopene er lokalisert i overflateløkker av meningokokk klasse 1 yttermembranproteiner i området av aminosyrene 24-34 og 176-187.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedat en eller flere oligopeptider inneholder en epitop av et meningokokk klasse 1 yttermembranprotein som er konservert i aminosyresekvensen mellom ulike meningokokk porinproteiner.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedat en eller flere oligopeptider inneholder en epitop av et meningokokk klasse 1 yttermembranprotein som varierer mellom ulike meningokokk porinproteiner.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedat lipider tilsettes for å danne liposomer.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedytterligere kjemisk konjugering av ett eller flere rensede oligopeptider til rensede kapsulære polysakkarider av Neisseria meningitidis.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedytterligere kjemisk konjugering av ett eller flere rensede oligopeptider til et annet antigen, bærerpeptid eller bærerprotein, forutsatt at bærerproteinet ikke er p-galaktosidase.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert vedat bærerproteinet eller peptidet er et bakterielt toksin eller en epitop derav.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meningitidis omfattende et fusjonsprotein eller peptid omfattende en epitop av et meningokokk klasse 1 yttermembran-protein og ikke omfattende et meningokokk klasse 2/3 ytter-membranprotein, fusjonert til et bærerprotein eller peptid,karakterisert vedå konstruere en ekspresjonsvektor som koder for et fusjonsprotein eller peptid, forutsatt at bærerproteinet ikke er p-galaktosidase, innsette ekspresjonsvektoren i en passende vertscelle, dyrke vertscellen under betingelser som er egnet for ekspresjon av fusjonsproteinet eller peptidet, rensing av det uttrykte fusjonsproteinet eller peptidet og tilsette det rensede fusjonsproteinet eller peptidet til lipider eller andre komponenter av en farmasøytisk akspeptabel bærer som konserverer den antigene konformasjonen av fusjonsproteinet eller peptidet.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert vedat bærerproteinet er et Salmonella flagellin.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert vedat epitopen er valgt fra gruppen ; QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, AQAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP eller HYTRQNNTDVF.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert vedytterligere konjugering av meningokokk kapsel- oligo- eller polysakkarid til det rensede fusjons-proteinet eller peptidet.

26. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meningitidis omfattende i det minste ett meningokokk klasse 1 yttermembranprotein eller immunogen del derav og ikke omfattende et meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein,karakterisert vedå innsette DNA som koder for en eller flere epitoper av et klasse 1 yttermembranprotein, i leseramme, inn i et gen som koder for flagellin protein av en attenuert stamme av Salmonella, dyrke den resulterende modifiserte stamme og tilsette den modifiserte stamme til en farmasøytisk akseptabel bærer for å formulere en levende vaksine.

27. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot Neisseria meningitidis, omfattende en inaktivert virus som omfatter minst en epitop av klasse 1 yttermembranprotein eller immunogen del derav og ikke omfattende epitoper av meningokokk klasse 2/3 yttermembranprotein,karakterisert vedå konstruere et virus som uttrykker en eller flere epitoper av en eller flere klasse 1 yttermembranproteiner, inaktivering av de resulterende virus og tilsetting av viruset til en farmasøytisk akseptabel bærer for å formulere en attenuert virusvaksine.

28. Klasse 2/3 minusmutant av Neisseria ifølge kravene 3 og 6,karakterisert vedat den uttrykker meningokokk klasse 1 yttermembran-protein av mer enn en subtype.

29. Neisseria meningitidis stamme ifølge fremgangsmåtene i kravene 1 og 4,karakterisert vedat den ikke er istand til å produsere klasse 2/3 yttermembranprotein.

30. Neisseria meningitidis stamme ifølge krav 29,karakterisert vedat den er HIII5, CBS 636.89.

31. Neisseria meningitidis stamme ifølge krav 29,karakterisert vedat den er istand til å utrykke et intakt klasse 1 yttermembranprotein av Neisseria meningitidis, genetisk fusjonsprotein derav eller en kontinuerlig eller diskontinuerlig epitop reaktiv med klasse 1 OMP spesifikke antistoffer mot Neisseria. meningitidis.

32. Mikroorganisme ifølge fremgangsmåten i krav 22 eller 26,karakterisert vedat den uttrykker et fusjonsprotein omfattende et flagellin og et meningokokk klasse 1 yttermembranprotein.