JPH0720878B2

JPH0720878B2 - 改善された複合体、それらの製造法および該複合体を含有する製剤

Info

Publication number: JPH0720878B2
Application number: JP59245864A
Authority: JP
Inventors: モレノカルロス
Original assignee: ザウエルカムフアウンデ−シヨンリミテツド
Priority date: 1983-11-21
Filing date: 1984-11-20
Publication date: 1995-03-08
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: JPS61186328A; EP0145359B1; DE3483957D1; EP0145359A2; US4740589A; EP0145359A3

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、多糖体成分および金属成分からなり、そして
細菌感染に対する保護を提供するワクチンにおける使用
に適当な新規錯体に関する。

ある種の細菌は、細胞外皮の境界を形成する外膜構造を
所有することに加えて、莢膜（capsule）として知られ
る膜の外側に追加層をまた有している。それら特徴を両
方共有するグラム陰性細菌の１例はナイセリア・メニン
ギチジス（Neisseria meningitidis）である。細胞外皮
の外膜（outermembrance）はリポ多糖体、毛〔表面突出
（surface protrusions）〕、大（高分子量）蛋白質、
小（低分子量）蛋白質、脂質およびリポ蛋白質を包含す
る多数の物質を含有する。それらのうち最初の３つは主
要抗原と同定されている。他の重要な種類の抗原は、莢
膜多糖体として知られる莢膜の成分からなる。莢膜多糖
体および外膜蛋白質は細菌の外部の非共有複合体として
存在するものと信じられる。生長の間、該細菌は、それ
らの遊離および複合体化形において莢膜多糖体および外
膜蛋白質を連続的に脱落する。両方の形における多糖体
は、培地から適当な電解質の添加により沈澱しえ、それ
はまた存在する最も負に帯電したポリマーを沈澱する。

髄膜炎菌の血清学は、結合した莢膜多糖体および外膜蛋
白質を承認された命名法に従い分類することを可能とす
る。９種の承認された血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｌ、Ｘ、Ｙ、
Ｚ、W135および29Eがあり、更に血清型番号１〜15に特
徴づけられる〔たとえば、ワインシユタイン（L.Weinst
ein）およびフイールズ（B.N.Fields）（編集）、セミ
ナーズ・イン・インフエクシウス・デジーズ（Seminars
in Infectious Disease）、ストラツトン・インターコ
ンチネンタル・メデイカル・ブツク・コーポレーシヨン
（Stratton Intercontinental Medical Book Corp.）、
1979:10章；フラツシユ（C.E.Frasch）、ノンカプスラ
ー、サーフエイス・アンチジエンズ・オブ・ナイセリア
・メニンギチジス（Noncapsular Surface Antigens of
N. Meningitidis）、308〜310頁、参照〕。１群内の各
種菌株は同じ血清型蛋白質を所有しえ、そして多数のグ
ループ分けできない菌種がまた発見されている。莢膜多
糖体は特定血清群（群特異多糖体）に対し特異であり、
そして大外膜蛋白質は特定血清型（型特異蛋白質）に対
し特異である。しかしながら、血清型４、５および８の
決定因子は外膜蛋白質よりはむしろリポ多糖体である。
従つて、莢膜多糖体は単にそれらの血清群特異性（たと
えば、Ｂ群多糖体）により、そして外膜蛋白質はそれら
の血清型特異性（たとえば、２型蛋白質）により示しう
る。この協約は、たとえば、フラツシユ（C.E.Frasch）
〔上記〕、ツアイ（Ｃ−M.Tsai）等〔ジヤーナル・オブ
・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、146
巻（1981）69〜78頁〕、フラツシユ（C.E.Frasch）等
〔ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー、127巻（197
6）973〜981〕、ベンドロス（N.A.Vendros）〔ベルガン
（T.Bergan）およびノリス（J.R.Norris）（編集）、メ
ソオズ・イン・マイクロバイオロジー（Methods in Mic
robiology）、10巻、アカデミツク・プレス（Academic
Press）、ロンドン:XI章、セロロジー・オブ・ザ・メニ
ンゴコツカス（serology of the Meningococcus）〕、
あるいは次の文献：フラツシユ（C.E.Frasch）およびチ
ヤツプマン（S.S.Chapman）、インフエクシヨン、アン
ド・インミユニテイ（Infection and Immunity）、６
巻、（1972）674〜681;プールマン（J.T.Poolman）、ホ
ツプマン（C.T.P.Hopman）およびザネン（H.C.Zane
n）、FEMSマイクロバイオロジー・レターズ（FEMS Micr
obiology Letters）、３巻（1982）、339〜348の１つに
示される如く、一般に承認されている。便宜のために、
特定血清型、即ちＡまたはＣの髄膜炎菌莢膜多糖体（MP
S）は略語MPS（Ａ）、MPS（Ｃ）等により示し、そして
特定血清型、即ち２または６の髄膜炎菌外膜蛋白質は略
語Ｔ（２）、Ｔ（６）等として示しうる。

エスシエリヒア・コリ〔Escherichia Coli（E.Coli）〕
株は通常K1として示され、コロミニン酸（colominic ac
id）として知られている莢膜多糖体を含有している。こ
れは構造においてMPS（Ｂ）と実質的に同一である。

ナイセリア・メニンギチジスは通常人間の鼻咽腔に所在
し、そして幼児が特におかされやすい重篤なそしてしば
しば致命的な脳脊髄膜炎を生じうる。エスシエリヒア・
コリK1はまた新生児における髄膜炎の若干の生成に責を
負つている。髄膜炎菌抗原を同定および単離する従来の
試みは上記に示した莢膜多糖体および外膜抗原、即ちリ
ポ多糖体、毛および大蛋白質（major protein）に集中
していた。遊離の莢膜多糖体、MPS（Ａ）およびMPS
（Ｃ）は、血清群ＡおよびＣにそれぞれ属する髄膜炎菌
株に対する免疫の賦与において適度に成功をおさめてい
る。血清群Ｂは、増加する幼児の髄膜炎菌感染で最近同
定され、そして群Ｂ髄膜炎菌株による感染に対し有効な
ワクチンの欠除は国際保健機関、たとえば世界保健機構
（World Health Organisation）からのそのようなワク
チンに対する増加する要求を創り出した。群Ｂ株に対す
る若干の免疫はMPS（Ａ）またはMPS（Ｃ）ワクチンの接
種で生じうるが、提供される保護は一般に幼児に充分な
もでなく、そしてMPS（Ｂ）のみに基くワクチンは群Ｂ
株による感染に対し生きた免疫を与えない。遊離MPS
（Ｂ）に基く従来提案されたワクチンはそれらが不安定
でありがちであるという付加欠点に悩まされた。これは
シアル酸、たとえばMPS（Ｂ）およびコロミン酸を包含
する莢膜多糖体が多糖体残基間の分子内エステル化を生
ずる傾向を有することによるものと信じられる〔ライフ
リー（R.L.Lifely）等、カーボハイドレート・リサーチ
（Carbohydrate Research）、94巻（1981）193〜203、
参照〕。

英国特許出願第8233317号中には、遊離MPS（Ｂ）の上記
の不安定性の傾向がより少ないMPS（Ｂ）およびある種
の外膜蛋白質の複合体を含有する免疫原性で実質的にパ
イロジエン不含の組成物が記載されている。

我々は、遊離形または細菌外膜蛋白質との複合体のいず
れかにおいてシアル酸を含有する多糖体の安定性が金属
との錯体形成により高められることを今や発見した。若
干の金属が、キサントモナス（Xanthomonas）、アクロ
モバクター（Achromobacter）およびシユードモナス（P
seudomonas）属のある種の細菌〔たとえば、キサントモ
ナス・フユスカンス（Xanthomonas fucans）〕により、
それらが植物の根圏に所在するとき浸出される莢膜多糖
体と錯体形成しうることは知られている。鉄と非細菌性
多糖体との錯体（貧血の治療に使用される）の薬物動態
がロブステ（robuste）等によりシエン・アンド・イン
ダストリアル・フアーマシー（Cien.and Ind.Farm.）、
９（1977）159〜163中に記載されている。ベルギー特許
明細書第889,979号は、多糖体それ自体の分離に先立
ち、それを不活性の多孔質支持体たとえばケイ藻土の存
在において有機第四級アンモニウム塩との中間体複合体
として培地から抽出する髄膜炎菌性および他の莢膜多糖
体抗原の単離法を開示している。上記文献は、シアル酸
含有多糖体が金属との錯体形成により安定化されうるこ
とについて何も指摘していない。

従つて、本発明は、１つの態様においてイオン形態の金
属成分および細菌莢膜多糖体成分からなり、その該細菌
莢膜多糖体成分がシアル酸を含有する錯体を提供する。

シアル酸含有細菌莢膜多糖体は、たとえばコロミン酸ま
たはナイセリア・メニンギチジスの血清群Ｂに特異の莢
膜多糖体でありうる。

望ましくは、該細菌多糖体成分は該金属成分で錯体形成
され、そしてまた細菌（たとえば髄膜炎菌性）外膜蛋白
質からなる更に他の成分で複合体化される。そのような
金属、多糖体および蛋白質からなる錯体、以後錯体（tr
iple complex）と呼ぶ。

金属成分は、たとえば周期律表の群II A、I B、II Bお
よびIII Bの金属、同時にまた遷移金属特に群VIIIのも
のから選択しうる。好ましい金属は、アルミニウム、ル
テニウム、亜鉛、鉄、ニツケルおよびカルシウムを包含
する。他の適当な金属はまた、それらの各種酸化状態の
すべてにおける次のものを包含する：リチウム、ナトリ
ウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタニ
ウム、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、
ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラ
ジウム、銀、インジウム、スズ、タングステン、レニウ
ム、白金、金およびガドリニウム。金属は好ましくは、
イオン形（好ましくは適当な金属化合物に由来する）、
たとえばAl³⁺、Ru³⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ni²⁺、Ca²⁺イオンで
ある。特に好ましい金属は、特にそれぞれAl³⁺およびRu
³⁺イオンの形におけるアルミニウムおよびルテニウムで
ある。そのような金属イオンは、錯体に単独で、あるい
はたとえば本発明に従う錯体が製造される（以後に更に
記載する如く）金属塩から生じる他の無機イオンと一緒
で存在しうる。従つて、たとえばルテニウムイオンは１
種もしくはそれ以上の型のイオン、たとえばヒドロキ
シ、オキシクロライドおよびアンモニウムイオンととも
に、錯体に存在しうる。

存在するとき、外膜蛋白質成分は、たとえばナイセリア
・メニンギチジスの任意の菌株、特に血清型１〜３、
６、７および９〜15に特異のものおよびそれらの免疫学
的均等物の外膜中に見出される蛋白質の任意のものから
選択しうる。

ナイセリア・メニンギチジス株の変異株に由来する外膜
蛋白質は、そのような変異株の外膜蛋白質のゲル電気泳
動の特徴的パターンが他の承認された血清型における変
異微生物の類別を必要とせず、そしてそれらの免疫学的
性質が実質的には変化されないとき、特定の髄膜炎菌性
血清型から単離されたものと“免疫学的均等”とみなし
うる。そのような変異株は血清型２の変異株〔プールマ
ン（Poolman）等、上記〕に見出された如く天然におい
て見出しえ、あるいはこの技術分野において熟練してい
る者に知られた技術により誘導しうる。

特に好ましい外膜蛋白質は、ナイセリア・メニンギチジ
スの血清型６および２に特異のもの、特に分子量42,000
±3,000を有する単一主要成分を有する血清型２蛋白質
である。

便宜のために、本発明に従う特定の錯体または錯体の種
類についての以後の引用は、それら成分の略号により示
す。たとえば蛋白質成分を欠いた錯体は、金属−Ｂ、ア
ルミニウム−Ｂ、アルミニウム−Col等と命名し、その
‘Ｂ′’はMPS（Ｂ）を、そして‘Col'はコロミン酸を
示す。本発明に従う三重錯体は、たとえば金属−B2、ア
ルミニウム−B6等と命名し、その数字は特定の多糖体成
分の髄膜炎菌血清型特異性を示し、そして先に限定した
如き免疫学的均等物を包含する。数字‘2'は、分子量4
2,000±3,000を有する単一主要成分を有する髄膜炎血清
型２蛋白質を包含する。莢膜多糖体および外膜蛋白質の
複合体（本発明に従うある種の錯体の製造における出発
物質である）は、単にB2、B6等として示される。

本発明に従う特に好ましい糖類の錯体は、抗原性錯体、
即ちそれを接種した哺乳動物に抗体を高めることができ
る錯体である。治療用を意図するとき、そのような抗原
性錯体は細菌細胞およびリポ多糖体を実質的に含まない
抗原組成物の形で提供しえ、そしてその金属成分は好ま
しくは金属のイオンの如き薬理学的に受容しうる金属か
らなる。そのような組成物は、所定量の組成物を人体お
よび動物体に投与するとき顕著な毒性効果を導くのに不
充分な重量％のリポ多糖体を含有することにおいて、リ
ポ多糖体を実質的には含まない。本組成物の通常な投与
量では、重量％は一般に１％もしくはそれ以下である。
リポ多糖体は遊離形において、あるいは組成物の他の成
分たとえば多糖体蛋白質複合体との組合せで存在しう
る。

抗原組成物中に含有される錯体の構成分としての上記に
示した薬理学的に受容しうる金属は、その本体、化学形
（たとえば、イオン）および量が受容者によりそれがそ
の体内に留まっている間耐えられうるものでなければな
らないという意味において薬理学的に受容しうるもので
なければならない。

我々は、実験動物を本発明に従う抗原性三重錯体を含有
する抗原組成物で免疫するとき、血清群−および血清型
−特異抗原の両方に関し抗体値が多糖体−蛋白質複合体
のみでの免疫により達成される抗体値と比較して増加す
ることを見出した。これは、蛋白質担体たとえば血清群
特異抗原に関してのみ抗体値を高めることが期待される
ある種の金属塩（水酸化物を包含）のよく知られている
アジユバント効果と対照的である。この観察は、三重錯
体の金属成分が多糖体および蛋白質成分とともに実際に
錯体形成していることの証拠を提供する。我々はまた、
アルミニウム−Col錯体に対するNMRおよび電気化学的測
定により、そしてアルミニウムの存在および不存在で時
間の函数として溶液中のMPS（Ｂ）濃度の対行免疫電気
泳動測定により金属と遊離莢膜多糖体との錯体形成のし
るしを得た。

我々は、本発明に従う錯体がセフアロースCL−2B（商
標）上のクロマトグラフイにより決定するとき少なくと
も２×10⁷の明らかな分子量を通常有することを見出し
た。我々はまた、蛋白質成分を有せずそして金属成分が
アルミニウムである本発明に従う錯体においてシアル酸
対アルミニウムの比率が一般に1:0.3w/wより大であるこ
とを観察した。

蛋白質成分を有する本発明に従う錯体はゲル電気泳動、
特にドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（SDS−PAGE）に付すことができて、該蛋白質
成分の構成の特徴的パターンを提供する。たとえば、レ
ムリ（U.K.Laemmli）によりネーチユア（Nature）（ロ
ンドン）、227巻、（1970）680〜685頁に記載されたSDS
−PAGE法を使用しうる。本発明に従う錯体中の髄膜炎菌
蛋白質の血清型特異性は、たとえばそのパターンを髄膜
炎菌血清学およびその実験的決定に関する上記引用文献
〔たとえばフラツシユ（C.E.Frasch）等、上記Jouranal
of Bacteriology〕に与えられたものとの比較すること
により証明しうる。

本発明に従う錯体の莢膜多糖体成分の血清群特異性は、
この技術分野において熟練している者に知られている任
意の適当な組成分析法により証明しうる。多糖体成分の
シアル酸含量は、比色法により決定しうる。多糖体成分
はまた核磁気共鳴により、あるいは特異抗血清で免疫学
的に決定しうる。

本発明に従う抗原組成物は、広い免疫スペクトルを提供
するために、１種もしくはそれ以上の他の抗原性成分、
たとえば遊離MPS（Ａ）およびMPS（Ｃ）、そしてまた１
種もしくはそれ以上の髄膜炎菌莢膜多糖体および外膜蛋
白質の他の錯体、たとえばMPS（Ｂ）/T（７）、MPS
（Ｃ）/T（２）またはMPS（Ａ）/T（２）を随意に包含
しうる。抗原組成物は、１種より多い本発明に従う錯
体、たとえばアルミニウム−B2およびアルミニウム−B6
を同時に含有しうる。

他の態様においては、本発明はまた、シアル酸を含有す
る細菌莢膜多糖体および金属を組合せにもつていくこと
からなる、本発明に従う錯体の製造法を提供する。

所望生成物が三重複合体である場合、莢膜多糖体出発物
質は多糖体と細菌（たとえば髄膜炎菌）外膜蛋白質、た
とえば上記に示した任意の蛋白質との複合体の形で提供
しうる。金属はたとえば上記に示した任意のものであり
え、そして一般にその化合物（たとえば金属塩のイオ
ン）として使用される。金属および多糖体は溶液中で組
合せにもつていくのが望ましい。これは多糖体を含有す
る溶液および金属（たとえば、その塩に由来する金属イ
オンとして）を含有する溶液の混合を課し、そして随意
に、もしも所望ならば生成した混合物をインキユベート
する。別途に、１方を他方に対し透析することにより２
つの溶液を組合せにもつていくこともできる。好ましく
は、各々の場合における溶媒は水であり、随意に１種も
しくはそれ以上の可溶化剤を含有しうる。適当な金属塩
は水溶性塩、たとえば無機および有機酸アニオンに由来
するもの、たとえばハライド（即ち、フルオライド、ク
ロライド、ブロマイドおよびヨウダイド）、スルフアイ
ト、スルフエート、ナイトライト、ナイトレート、ホス
フエート、アルカノエート（たとえばアセテート）、フ
マレート、ベンゾエート、サクシネート、フタレートお
よびキサレートを包含する。金属がルテニウムであると
き、塩は便宜には“ルテニウム・レツド”、即ち通常形
またはアンモニア化形のいずれかにおけるルテニウムオ
キシクロライドである。

本発明に従う方法において出発物質として使用される多
糖体または多糖体−蛋白質複合体は、たとえば上記文献
に記載され、あるいは英国特許出願第8233317号中に開
示された如きこの技術分野において熟練した者に知られ
ている任意の方法により製造しうる。後者の出願は細菌
莢膜多糖体および細菌外膜蛋白質の複合体の単離法を記
載しており、その方法は次の工程からなる：（ｉ）外膜および莢膜を有する細菌を培地中で培養
し、そして細菌莢膜多糖体および細菌外膜蛋白質の複合
体を包含する水性層を得；（ii）工程（ｉ）で得た水性層を第四級アンモニウム
塩と混合して、該複合体を含有する沈澱を生じさせ；（iii）工程（ii）で得た沈澱を水性媒質中でカルシ
ウムまたはマグネシウムの水溶性塩と混合して該複合体
を、溶質として錯体を含有する水溶液を形成させ；（iv）工程（iii）で得た水溶液を低級アルカノール
と混合して、該錯体を含有する沈澱を生じさせ；そし
て、（ｖ）工程（iv）から生成した沈澱中に存在する任意
の他の化合物から錯体を分離する。

後者方法は、たとえば単離が意図されるもの以外の錯
体、リポ多糖体、脂質、核酸および他の不純物を実質的
に含まない比較的純粋な形で所望生成物を提供し、そし
て錯体を直接得ることを可能とする。

後者方法の遂行において、リポ多糖体の放出を最少とす
るために、培養が静止期に達する以前に水性層を直接得
る。水性層から細菌細胞および細胞破片を水性層から、
工程（ii）の沈澱を行う前に、たとえば遠心分離により
除去するのがまた有利であるけれども、そのような除去
は本方法の任意の適当な段階で行いうる。工程（ii）に
おいて、第四級アンモニウム塩は、望ましくはセチル−
トリメチルアンモニウムブロマイド、即ちセタブロン
（Cetavlon）（商標）、またはセチルピリジニウムクロ
ライドである。そのような塩は存在する遊離莢膜多糖体
との不溶性複合体塩を形成するのに使用され、従つてそ
れらは工程（iii）および（iv）において容易に除去さ
れる。所望生成物と同時にまた、本方法のこの工程にお
いて形成した沈澱は、水性層中に存在する最も負に帯電
したポリマー、即ち蛋白質（外膜からのものを包含）、
リポ多糖体および部分的に分解した核酸を含有する。セ
タブロンを使用するとき、工程（ii）の沈澱形成は、望
ましくは12から25℃までの範囲内の温度、最適には18℃
またはその付近で行う。塩がセチルピリジニウムクロラ
イドであるとき、沈澱形成は０〜10℃の範囲内の温度、
最適には４℃またはその付近で行いうる。いずれの場合
も、塩は好ましくは約１％w/vで存在する。

工程（iii）で示される水溶性塩は、好ましくは塩化カ
ルシウムまたは塩化アルミニウムである。錯体と同時
に、工程（iii）における溶液はまた、溶質として工程
（ii）において形成した沈澱中に存在する他の成分を含
有するが、かく除去される莢膜多糖体複合体塩は含有し
ない。

後者方法の遂行において、アルカノールは工程（iv）
で、存在する任意の多糖体／蛋白質複合体の解離が実質
的に生じないような量および濃度において使用する。好
ましくは、アルカノールは水溶液での混合のとき50〜95
％v/vの範囲内の濃度を提供するように使用する。特に
好ましい濃度は約75％である。ここで使用する“低級ア
ルカノール”なる語は炭素原子１から４個までを含有す
るアルカノール、たとえばエタノールまたはメタノール
を意味する。錯体に加えて、工程（iv）で生成される沈
澱はまた若干の低分子量不純物たとえば非外膜蛋白質、
低分子量核酸断片および少量のリポ多糖体を含有する。
それら不純物は工程（ｖ）における分離で実質的に除去
され、それは好ましくは、たとえばセフアロースCL−2B
または同様な性質を有する任意の他の系を使用するゲル
濾過により行われる。

更に精製が、もしも必要ならば、工程（ｖ）の生成物に
対し、夾雑物たとえば分解した核酸および非複合体化多
糖体および蛋白質の存在を最少とするために行われう
る。

本発明は更に、本発明に従う抗原組成物および少くとも
１種のアジユバントおよび（または）担体からなるワク
チン製剤を提供する。そのような製剤において、組成物
は更に上記抗原成分たとえば１種もしくはそれ以上の遊
離髄膜炎菌莢膜多糖体を包含しうる。血清群ＢおよびＡ
および（または）Ｃの髄膜炎菌に対する保護を提供する
ことを意図するワクチンは、それぞれ本発明に従う１種
もしくはそれ以上の錯体の混合物を、MPS（Ａ）および
（または）MPS（Ｃ）と一緒で含有しうる。付加的また
は別途に、そのような製剤は、もしも所望ならば、本発
明に従う錯体、および１種もしくはそれ以上の髄膜炎菌
莢膜多糖体および外膜蛋白質の他の複合体、たとえばMP
S（Ｂ）/T（７）、MPS（Ｃ）/T（２）またはMPS（Ａ）/
T（２）、同時にまた１種より多い本発明に従う錯体、
たとえばアルミニウム−B2およびアルミニウム−B6を含
有しうる。

本発明に従うワクチン製剤は、人間に対する投与に適用
であるような滅菌形において存在しうる。それらの製剤
においては、担体はたとえば水でありうる。そのような
製剤は、付加的または別途に、１種もしくはそれ以上の
適当な非金属成分たとえば１種もしくはそれ以上の金属
塩（アジユバントとして提供され、そして錯体の形にお
けるものでない）、抗原安定剤として乳糖、あるいはワ
クチンを血液と等張にするための１種もしくはそれ以上
の塩たとえば塩化ナトリウムを含有しうる。好ましく
は、適当なバツフアーがまた包含される。そのようなワ
クチンにおいては、本発明に従う錯体は便宜に、0.1μ
ｇから3mgまで、望ましくは1.0から300μｇまで、好ま
しくは約50μｇの用量で投与しうる。

本発明は更にワクチン製剤の製造法を提供し、その方法
は本発明に従う抗原組成物および少なくとも１種のその
アジユバントまたは担体の混合からなる。本方法におい
ては、ワクチンは、たとえば洗浄剤援助濾過により無菌
となしうる。

他の態様においては、本発明は哺乳動物たとえば人間の
細菌（たとえば髄膜炎菌またはエツシエリヒア・コリ）
疾病の予防または治療法における使用のための本発明に
従う抗原性錯体を提供する。たとえば、本抗原性錯体は
脳脊髄膜炎の予防または治療のために使用しうる。その
ような使用においては、抗原性錯体はここに記載した任
意の製剤において存在しうる。本抗原性錯体は１回もし
くはそれ以上の投薬で投与しうる。もしも１回より多い
投薬で投与するときには、投与は第２の免疫の利益を得
るために、適当な時間目盛りで間隔を保つのが望まし
い。本抗原性錯体は、たとえば１から３週間までの間隔
で、２また３投薬で投与しうる。適当な場合には、１回
目に引続く投薬は、最初の投薬中に含有される量より少
ない量の抗原性錯体を含有しうる。本抗原性錯体は任意
の便宜な経路たとえば非経口（たとえば、皮下、静脉
内、腹腔内）、経口、あるいは幼児に望ましい鼻腔内経
路により投与しうる。本発明はまた、哺乳動物たとえば
人間の細菌（たとえば髄膜炎菌またはエツシエリヒア・
コリ）疾病の予防または治療法を提供し、それは該哺乳
動物に対する有効量の本発明に従う抗原性錯体の投与か
らなる。本抗原性錯体は、本発明に従う抗原組成物また
はワクチン製剤の形において有利に使用される。本発明
は、上記の如き本発明の方法により誘導される錯体を包
含する。

以下の実施例で本発明を説明し、添付の図面を引用する
が、その中で：第１図は、260および280nmにおける画分の吸収を追跡す
ることによる、およびレゾルシノール−HCl比色法での
シアル酸決定による、セフアロースCL−2Bクロマトグラ
フイカラムからの典型的粗B6複合体の溶出プロフイルを
示す。

第２図は、280nmにおける画分の吸収を追跡することに
よる、およびレゾルシノール−HCl比色法でのシアル酸
決定によるセフアロースCL−2Bクロマトグラフイカラム
からの典型的粗B2複合体の溶出プロフイルを示す。

第３図は、280nmにおける溶出液の吸収を追跡すること
による、およびレゾルシノール−HCl比色法でのシアル
酸決定による、精製した典型的B6複合体のセフアロース
CL−2B再クロマトグラフイの際の溶出プロフイルを示
す。

第４図は、280nmにおける溶出液の吸収を追跡すること
による、およびレゾルシノール−HCl比色法でのシアル
酸決定による精製した典型的B2複合体のセフアロースCL
−2Bクロマトグラフイの際の溶出プロフイルを示す。

第５図は、B2およびB6複合体、ならびに分子量標識標準
のSDS−PAGEから得られるパターンを示す。

第６図は、アルミニウムおよびシアル酸を追跡すること
による、アルミニウムＢ−錯体および純MPS（Ｂ）のセ
フアロースCL−2B再クロマトグラフイの際の溶出プロフ
イルを示す。

第７図は、コロミニン酸の存在でおよびなしでの溶液中
のAl³⁺濃度における函数としてのピーク電流のポーラロ
グラフイDPPプロツトを示す。

第８図は、各種濃度のAl³⁺の存在および不存在での溶液
中のMPS（Ｂ）の時間依存性分解の対向免疫電気泳動測
定を示す。

例１ B6複合体の単離および精製培地を示した量における次の成分の水溶液として製造
し、そして生成した溶液に水を加えて容量16に仕上げ
た。

16当り K₂HPO₄ 3.68g Ｌ−グルタミン酸 20.8 ｇシステインHCl 0.48g NaHCO₃ 13.47g トリシン、Ｎトリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン 11.46g FeSO₄7H₂O 0.045g NH₄Cl 8.0 ｇ K₂SO₄ 0.77g CaCl₂2H₂O溶液7.4mg/100ml 16 ml MgCl₂6H₂O 1.71g カゼイン加水分解物 320 g 溶液のpHを7.2に調節し、そして２つの400ml部分を２つ
の１容円錐フラスコに移した。溶液の残りを15容ビ
ンに移した。サイフオンをビンおよび両方のフラスコに
連結し、そしてビンを15ポンド／平方インチの圧力で15
分間オートクレーブした。ビンの内容をついで20容醗
酵器に移し、そして滅菌50％水性グルコース300mlを加
えて培地を形成させた。ナイセリア・メニンギチジスの
血清群Ｂ、血清型６株を含有する培地の１滴を400mlの
溶液を含有する両方のフラスコに加えることにより接種
物を製造した。

フラスコを振盪しつつ37℃で12時間インキユベートする
ことにより種培地800mlを形成させ、その純度はグラム
染色技術によりチエツクした。

種培地のすべてをついで醗酵器中の培地に接種するため
に使用した。全培地をついで次の実験条件下に生育させ
た。

温度、一定37℃。

pH、一定、滅菌2N HClおよび2N NaOHで7.2。

攪拌速度、100〜700rpm、自動調節。

溶解酸素、最低10％飽和。

空気流、１〜５／分、溶解酸素濃度を維持するために
手動調節。

消泡、ポリプロピレングリコールを必要なときに手で加
える。

培地を最適密度約9.0が達成されるまで生育させた。こ
のO.D.は通常約6.5時間後に達成することが期待され
る。

培地をついで醗酵器から移し、そして連続流動遠心分離
に、ほぼ澄明な上清液を導くのに充分な流速で通過させ
た。遠心分離に引続いて、上清液に水中10％w/vセタブ
ロンの10容量％を加えて懸濁液中の沈澱を導いた。懸濁
液を４℃において2000rpmで遠心分離した。ついで上清
液を捨て、そして沈澱を水600mlに懸濁した。2M水性塩
化カルシウム600mlをついで加え、そして混合物を４℃
で１時間攪拌し、ついで5000rpmで20分間遠心分離し
た。

上清液に消泡剤としてカプリルアルコール１滴を加え、
そして上清液を真空下、攪拌しつつ10分間脱ガスした。
脱ガスした上清液を氷浴中に入れ、そしてそれに無水エ
タノール３容量を連続攪拌しつつ０℃で加えた。混合物
をついで浴中に２時間保ち、その後４℃の温度において
15分間5000rpmで遠心分離した。上清液を捨て、そして
沈澱を75％エタノールに再懸濁し、そして遠心分離し
て、−20℃で貯蔵しえあるいは次の如く処理しうるペレ
ツトを形成させた。

このペレツトを0.01％チオメルサレート含有0.1M酢酸ア
ンモニウム中に20mg/mlの割合で懸濁した。懸濁液を10
分間超音波振盪に付し、そして３μｍの膜に通して不溶
物を除去した。上清液をついで４℃においてバツフアー
で平衡化したセフアロースCL−2Bの５カラムに通し
た。カラムをバツフアーで洗滌し、そして溶出液を波長
260および280nmにおけるUV吸収、ならびにレゾルシノー
ル−HClシアル酸決定により追跡した。280nmにおいて吸
収を示しそしてシアル酸を含有（レゾルシノール−HCl
決定）する空容量画分（void volume fractions）を貯
蔵した。ナトリウムデオキシコレートを0.1％w/vバツフ
アーの最終濃度に、pH8〜９内に加えた。（他の濃度お
よびpH値がまた可能であり、たとえばpH11に緩衝化した
１％w/vの最終濃度は膜に粘着する物質の量を減少させ
ることが認められた）。生成した溶液を直ちに0.45プレ
フイルターでサートブラン（Sartobran）0.22カプセル
に通して濾過した。濾液を無水エタノール３容量で沈澱
させた（溶液後の濃度約75％）。この濾過の後、すべて
の操作は滅菌条件下に行つた。遠心分離の後、上清液を
捨て、そして沈澱を冷エタノール200mlに懸濁してそれ
を洗滌した。懸濁液をついで遠心分離し、上清液を捨
て、そして沈澱（実質的にB6複合体のみからなる）を再
び同じ洗滌工程に付し、その後冷水200mlに再溶解し
た。（別途に、注射溶液は、たとえば５％乳糖および0.
01M Na₃PO₄;pH7.3で製造しうる）。

例２ B2複合体の単離および精製 B2複合体を、例１の方法により、ナイセリア・メニンギ
チジスの血清群Ｂ、血清型２株を含有する培養物から出
発して製造した。

例３ B6複合体の単離および精製小規模方法希釈した培地３を、例１に使用したと同様の方法によ
り、同じ成分を使用して製造した。培地の１部分約200
〜500mlを非バツフル形フラスコに移し、そしてナイセ
リア・メニンギチジスの血清群Ｂ、血清型６株を含有す
る培養物１滴を接種した。この接種物を例１に特定した
如くにインキユベートし、ついで培地の残部に加え、そ
れを例１に記載したと同様にして6.75時間インキユベー
トした。培養物をついで６×500mlとして遠心分離機に
移し、そして7000rpmで20分間遠心分離した。

上清液に10％w/vセタブロン10容量％を加えた。懸濁液
を４℃で16時間沈積させ、その後、上清液の大部分をサ
イフオンで除去し、そして沈澱を含有する残部を４℃に
おいて20分間2000rpmで遠心分離した。沈澱を蒸留水20m
lに再懸濁し、2M CaCl₂20mlを加え、そして混合物を４
℃で１時間攪拌し、ついで5000rpmで20分間遠心分離し
た。

粗沈澱を再溶解し、そして例１に記載した如くにセフア
ロースCL−2Bの500mlカラム上クロマトグラフイにより
部分精製した。シアル酸および280nmに吸収を有する物
質を含有する空容量画分を貯蔵し、最終容量75％v/vま
でエタノールの添加により沈澱させ、ついで４℃におい
て15,000gで20分間の遠心分離により採取した。沈澱を
無水エタノールで洗滌し、そして５％乳糖および0.01M
Na₃PO₄（pH7.3）中で凍結乾燥した。

例４ B2複合体の単離および精製：小規模方法 B2複合体を、例３の方法により、ナイセリア・メニンギ
チジスの血清群Ｂ、血清型２株を含有する培養物から出
発して製造した。

例５ B2およびB6複合体の特徴づけ例１〜４において形成した複合体を、各々の場合、４℃
においてセフアロースCL−2B（分子量20×10⁶）上の空
容量中に溶出するピークとして、レゾルシノール−HCl
法によるシアル酸、ならびにB6複合体の場合260および2
80nmの吸収（第１図参照）、そしてB2複合体の場合280n
mのみの吸収（第２図参照）を検定することにより同定
した。後者のプロツトは、シアル酸含量48％および蛋白
質含有36.1％（比率1.33:1）を有するB2複合体の凍結乾
燥検体から得た。複合体は、セフアロースCL−2B（第１
図において使用した複合体について第３図、および第２
図において使用した複合体について第４図）上４℃にお
ける再クロマトグラフイに際し解離していない（即ち、
蛋白質および多糖体が空容量中に留まる）ことが認めら
れた。複合体のSDS−PAGEは、例１および例３の生成物
について血清型６、そして例２および例４の生成物につ
いて血清型２の特徴的な蛋白質成分パターンを与え；検
体はSDS中95℃で３分間煮沸し、ついでトラツク（trac
k）当り10μｇの検体をクーマシー青（Coomassie blu
e）で染色し、上記レムリ（Laemmli）の方法に付した。
第５図において、トラツク１は、分子量標識のバンドを
示す。トラツク２は、B2複合体から得られた。トラツク
２のパターンは42,000の領域に分子量を有する優勢蛋白
質成分に基く大バンドを示す。小バンドがまた32,000付
近に現われる。トラツク３は、１％セタブロンでの沈澱
により、そして精製前に得られたB6複合体を包含する粗
沈澱から得た。トラツク４および５は、セチルピリジニ
ウムクロライドでの沈澱を包含する単離工程から得られ
た凍結乾燥B6ワクチン組成物の検体から得、トラツクは
それぞれ滅菌濾過の前および後からのものである。トラ
ツク４および５の両方において、２つのバンドは約38,0
00および43,000の明らかな分子量を有する。複合体の化
学組成は、シアル酸（レゾルシノール−HCl）および蛋
白質（ウシ血清アルブミンの標準を使用するローリー
（Lowry）法）につき比色法により決定した。

例６アルミニウム−B6複合体の製造（ｉ）例１の方法により単離したB6錯体を、アルミニ
ウムで、各々が５％乳糖中のB6複合体100μg;pH7.4への
0.01Mリン酸ナトリウム;0.001M Al₂（SO₄）_３を含有す
る0.5ml部分としての溶液の製造により複合体化した。

（ii）例１の方法により単離したB6複合体を、アルミ
ニウムで、０℃においてB6複合体（3ml）の水溶液の製
造により錯体形成し、それに２×10^-2M AlCl₃を加えて
1:0.1から1:3までの間のシアル酸：アルミニウムのモル
比を与えた。０℃における10分間のインキユベーシヨン
に引続いて、溶液を0.1M w.r.t.NaClとなし、そして無
水エタノール３容量を加えた、沈澱を遠心分離により採
取し、無水エタノールに懸濁し、そして再遠心分離し、
そして最後に水（3ml）に再溶解または再懸濁した。等
容量の0.02M Na₃PO₄（pH7.3）および10％乳糖バツフア
ーを加え、そして部分ずつ凍結乾燥した。

例７ルテニウム−B6錯体の製造例６に記載したと同様の方法で、表題錯体を、５％乳
糖;pH7.2への0.01Mリン酸ナトリウム;0.001Mルテニウム
赤（アンモニア化ルテニウムオキシクロライド）中のB6
複合体100μｇを使用して製造した。

例８ MPS（Ｂ）の単離および精製希釈した培地の３つの15タンクを、例１に使用したと
同様の方法により、同じ成分を使用して製造した。各タ
ンクを新たな培地800mlで接種し、種はナイセリア・メ
ニンギチジスの血清群Ｂ株を含有する培養物から製造し
た。培地のタンクを例１に記載したと同様の方法で約5.
5時間インキユベートし、そして15容ビン中に収獲し
た。それらビンの内容を40〜50,000rpmで遠心分離し、
速度は収獲物の密度に従い変化させた。収獲の直後に、
10％セタブロン150mlを上清液の各々の部分澄明化バツ
チに加え、それをついで４℃で放置して沈積させた。

２日後に、上清液の大部分を15容ビンからサイホン除
去し、そして残部を合せ、そして４つの１部分に回転
分離した。

回転分離した沈澱を−20℃で貯蔵し、その後1/10飽和酢
酸ナトリウム（pH7.0）300mlに懸濁し、2M CaCl₂300ml
を懸濁液に加え、そして混合物を４℃で１時間貯蔵し
た。ついで無水エタノールを加えて25％v/vの濃度を形
成させ、加えた総容量は200mlである。沈澱を遠心分離
し、そして上清液を保持した。上清液をNo.50濾紙に通
して濾過してそれを清澄化した。かく濾過した上清液は
視覚的に完全に澄明であつた。

上清液中のエタノール濃度をついで、無水エタノール更
に1600mlの添加により75％v/vに増加させた。

沈澱をついで４つの１部分に遠心分離した。上清液を
捨て、そして沈澱をエタノールで２回およびアセトンで
２回洗滌した。湿重量収量は2.5gであつた。−20℃で貯
蔵した後、沈澱を1/10飽和中性酢酸ナトリウム350mlに
融解して乳白色溶液を生成した。

沈澱溶液を溶かし、そして冷フエノール（結晶フエノー
ル100g足す1/10飽和中性酢酸ナトリウム40ml）２つの0.
5容量で２回抽出した。抽出は約１分間手で振盪するこ
とにより行つた。層分離をポリプロピレンポツト中7,00
0rpm（9,400G）での遠心分離により行つた。この方法の
間に温度は10℃に上昇して、よい層分離を与えた。フエ
ノール層を捨て、そして水性層をクロロホルム／ブタノ
ール5:1でホモジナイズにより抽出した。層分離を上記
の如く行うが、580rpm（4,800G）で30分間の回転でガラ
スポツトを使用した。水溶液を除去し、そして−20℃で
貯蔵した。

上記で得られた僅かな乳白色物質を融解し、そして0.1M
CaCl₂（５）に対して18時間透析した。透析後の容量
は250mlであつた。これを50ml容遠心分離管に分配し、
そして100,000Gで３時間回転分離した。澄明な上清液を
生成したゼラチン様沈澱（捨てた）と分離した。

無水エタノール750mlを加えて髄膜炎菌群Ｂ多糖体を沈
澱させ、１時間後に沈澱を完成させた。多糖体沈澱をエ
タノールで２回およびアセトンで２回洗滌し、ついで乾
燥した。乾燥重量収量は0.983であつた。

例９ MPS（Ｂ）の単離および精製：小規模方法血清群Ｂナイセリア・メニンギチジスの培養物からの種
を使用し6.5時間の培養時間で例１〜４および８の方法
に従つて、培養物1800mlを製造し、それを回転分離して
僅かに濁つた上清液を生成した。10％セタブロン18mlを
加え、そして４℃で１夜放置した。

かく形成した沈澱を回転分離し、そして蒸留水約100ml
に再懸濁し、そして−20℃で貯蔵した。生成した上清液
への更にセタブロンの添加は更に沈澱を生成することが
なかつた。セタブロン沈澱を2M CaCl₂100mlで解離させ
た（４℃で１時間攪拌）。

培養物の第２バツチを、6.25時間の培養時間を使用して
同様に製造した。収獲物の大部分を上記の如く抽出し、
そして回転分離して、上清液1500mlを生成した。これ
を、100,000MWカツトオフを選択して限外濾過により濃
縮した。最終容量は約150mlであり、そして濾過器は逆
洗滌して162mlの最終容量を導いた。この乳白色液体を
8,000Gで回転分離して清澄化を達成した。0.9mlを取
り、そして10％セタブロン0.1mlを加えた。沈澱が直ち
に生じた。更に1.2mlを取り、そして無水エタノール0.4
mlを加えて25％v/vの総エタノール濃度を達成した。沈
澱の増加はなく、そして無水エタノール更に3.2mlを75
％v/vまで加え、それは非常に僅かの混濁のみを生じ
た。

培養物を第１のバツチにおける如く回転分離した。乳白
色上清液1500mlを４℃で１夜貯蔵し、ついで100,000カ
ツトオフ膜を使用してダイア濾過（diafiltered）し、
レテンテート162mlを導いた。この物質を8,000Gで回転
分離して清澄化し、ペレツトは保持した。生成した液体
から0.1％セタブロンの添加により沈澱を得た。上清液
1.2mlを取り、そして無水エタノール0.4mlを25％v/vま
で加えた。沈澱は生成せず、培養物中に非常に小量の融
解した蛋白性物質を示した。無水エタノール3.2mlの添
加による75％v/vへのエタノール濃度の増加は非常に僅
かの混濁を示し、100,000MW以下の多糖体の多量の放出
または低多糖体生成のいずれかを示した。

第１の可能性を、限外濾過装置からの透析物へセタブロ
ンを添加することによりチエツクした。沈澱は生成せ
ず、上記の第２の可能性を示した。レテンテートの残部
（159.8ml）を１夜真空透析により44mlに更に濃縮し、
その1mlを取り出した。濃縮物は0.1％セタブロンで容易
に沈澱した。残りの42mlを75％v/vへの無水エタノール1
26mlの添加により沈澱させた（認識しうる沈澱は25％に
おいて生成しなかつた）。沈澱は放置により増加した
が、認めうる増加は酢酸アンモニウム1.26gの添加によ
つては誘導されなかつた。沈澱は徐々に凝集した。

溶液のpHは7.4と認められた。得られた沈澱の総量をエ
タノールで２回およびアセトンで２回洗滌し、ついで乾
燥し；乾燥重量収量は40mgであつた。

例10 アルミニウム−Ｂ錯体の製造（透析法）髄膜炎菌群Ｂ多糖体（シアル酸20μｍ）をAlCl₃溶液
（蒸留水２中のAl³⁺ 20μｍ）に対し、４℃で24時間
透析した。透析袋内の溶液を75％v/vエタノールで沈澱
させ、沈澱を遠心分離し、そしてペレツトを凍結乾燥し
た。シアル酸、Ca²⁺およびAl³⁺イオンについてのＢ多糖
体−アルミニウム錯体の分析は、モル比1.00:0.01:0.34
を与えた。金属イオンの分析は、原子吸収分光分析によ
り行つた。

例11 アルミニウム−Ｂの製造（インキユベーシヨン法）群Ｂ多糖体（シアル酸20μｍ）を、蒸留水（2ml）中のA
lCl₃（Al³⁺ 2〜20μｍ）で、室温において10分間インキ
ユベートした。1M酢酸アンモニウム（0.2ml）を加え、
そして溶液を75％V/Vエタノールで沈澱させた。沈澱を
遠心分離し、そしてペレツトを凍結乾燥した。より高い
Al³⁺モル比（即ちシアル酸:Al³⁺1:1および1:0.5）にお
いて、水不溶性錯体が得られ、他方より低いAl³⁺モル比
（即ちシアル酸:Al³⁺1:0.3、1:0.2および1:0.1）におい
て、錯体は水溶性であつた。

例12 アルミニウム−Ｂ錯体の特徴づけ例10および11の方法により形成した金属錯体の分子量
を、セフアロースCL−4Bクロマトグラフイにより測定し
た。両方の場合において空容量ピーク（V₀）はシアル酸
およびアルミニウムを含有した。しかしながら、たとえ
ば後者の方法から得られた錯体は増加した分子量を有し
た（第６図参照）。

例13 アルミニウム−Colおよびアルミニウム−Ｂ複合体のそ
の場での製造、および特徴づけアルミニウム−コロミン酸系のNMRおよび電気化学的測
定を行つて、特徴づけデーターおよび錯体形成の証拠を
提供した。アルミニウムの存在または不存在での溶液中
のMPS（Ｂ）の時間依存性分解の対向免疫電気泳動測定
をまた使用した。それら実験の各々において、多糖体お
よびアルミニウムは各種実験溶液の製造の間に組合せに
もつていつた。対応の錯体がかくしてその場において形
成した。

（ａ）電気化学的測定２つ（0.125mMから1mM）Al^III濃度系列を、１つは多糖
体の不存在において、他方は1mM wrt.モノマー（NANA）
または10μＭ（８〜16μＭ）wrt.ポリマーの一定濃度に
おけるその存在において、ポーラログラフイした。第７
図に示したDPPプロツトにより示される如く、0.137M−N
aClO₄中の10mMコロミン酸は100μＭ−Alの程度で結合
することが認められて、このアルミニウム濃度まで遊離
金属イオンは混合物中に何も存在しないと認められた。
コロミン酸希釈データーは遊離Alデーターに関し若干逸
れを示しているので、アルミニウムの第２の結合が示唆
され、その範囲は２つの曲線の傾斜（誘導体）の差によ
り与えられる。

非緩衝化溶液においては、pHはアルミニウムの加水分解
およびコロミン酸の陽子転位平衡により制御された。背
景溶液のpHが8.721であるのに対し、1mMにおける硫酸ア
ルミニウムはpHを4.191に減少させた。pHはついで125nM
−Al₂（SO₄）_３における希釈で指数的に4.857に増加し
た。コロミン酸は1mM（wrt.NANA）においてpH6.739を与
え、それは希釈で125nM（wrt.NANA）において6.784に非
常に僅かに増加した。各々1mM〔多糖体（wrt.NANA）＋
アルミニウムIII）の等モル混合物は、pH3.927を与え
た。これは、コロミン酸による増加した陽子解離がアル
ミニウム結合から生ずること（たとえば、ヒドロキシル
陽子の放出が金属−酸素結合を形成）、あるいは非緩衝
化混合物の酸性化がアルミニウムの少数派種を結合する
結果としてアルミニウムの加水分解から生ずることを示
唆する。

（ｂ） NMR測定¹³ C n.m.r.は、Al（III）が主にカルボキシレート基に
おいて錯体形成するが、他の相互作用が存在し、そして
いくつかのゆつくりした交換種が水溶液中に存在するこ
とを示した。

（ｃ）対向免疫電気泳動測定 Al³⁺の存在（10^-3、10^-4および10^-5M）および不存在に
おける時間の函数としてのMPS（Ｂ）の溶液における持
続性を対向免疫電気泳動（pH4.0抗血清：家兎メニン
ゴＢ、ES.77.1）により追跡した。結果を第８図に示
す。観察されたMPS（Ｂ）の安定化は、金属イオンとシ
アル酸繰返し単位との錯体化の証拠であるAl³⁺の存在で
ある。

例Ａ金属−B6錯体でのマウスの免疫（ａ）アルミニウム−B6 群Ｂおよび型６髄膜炎菌抗原のそれぞれに対し誘導され
た抗体の水準を、例６の方法により製造したアルミニウ
ムB6錯体での第２の免疫の７日後にマウスで測定した。
マウスに、以下に指示する試験製剤および対照製剤を腹
腔内注射した。

免疫の７日後に、マウスから個々に採血した。抗体水準
を、精製した群Ｂ髄膜炎菌多糖体で感作したプレート中
の固体層放射免疫検定により、血清のμg/mlとして決定
した。この方法において、マイクロタイター軟プレート
をポリＬ−リジン（シグマ、100μg/ml）で前処理し、
そして多糖体で感作した。多糖体とのインキユベーシヨ
ンの後、ウエルを計数し、そして計数値と血清希釈のlo
g₂との間の直線関係が得られた。血清の1/50希釈におけ
る外挿値を標準の直線関係と比較した。

各々の場合における試験製剤および対照製剤は、次の如
く製造した：各製剤に対する群Ｂ抗原について対応する抗体を、次表
に示す。

上記例７で製造された錯体を、雌CBAマウス１群５匹
で、上記と同様な方法で試験した。個々の採血は免液の
７日後に行い、そして抗−Ｂ抗体血清水準を固体層放射
免疫検定により決定した。

各々の場合における試験製剤および対照製剤は、次の如
く製造した：結果例Ｂワクチン製剤の製造例６、９および10から得られた精製錯体を各々水性滅菌
リン酸ナトリウム（0.01M、pH7.2）に1.0mg/mlとして分
散した。生成した溶液に、乳糖50mg/mlを撹拌しつつ加
えた。溶液をついで凍結乾燥し、そして使用するまで−
20℃で貯蔵した。再構成は、融解した後、滅菌パイロジ
エン不含水中でもとの容量の溶液にすることにより達成
した。

【図面の簡単な説明】

第１図は粗B6複合体のクロマトグラフイ溶出曲線を示
し；第２図は粗B2複合体のクロマトグラフイ溶出曲線を
示し；第３図は精製B6複合体の再クロマトグラフイ溶出
曲線を示し；第４図は精製B2複合体の再クロマトグラフ
イ溶出曲線を示し；第５図は粒子構造を示す写真であつ
て、B2およびB6複合体の電気泳動図であり；第６図はア
ルミニウムＢ−錯体およびMPS（Ｂ）の再クロマトグラ
フイ溶出曲線を示し；第７図はAl³⁺のポーラログラフイ
を示し；そして第８図はMPS（Ｂ）対向免疫電気泳動図
である。

フロントページの続き (56)参考文献特開昭58−162531（ＪＰ，Ａ) 特開昭50−24432（ＪＰ，Ａ) 特開昭54−46893（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−176214（ＪＰ，Ａ) 欧州特許公開72513（ＥＰ，Ａ) Ｃｈｅｍ．Ａｂ．94（20）要約番号 157409ｄＣｈｅｍ．Ａｂ．88（23）要約番号 168225ｔ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細菌莢膜多糖体成分がシアル酸を含有する
ことを特徴とする、イオン形態の金属成分および細菌莢
膜多糖体成分からなる錯体。
【請求項２】細菌莢膜多糖体成分がナイセリア・メニン
ギチジスの血清群Ｂに特異な莢膜多糖体またはコロミン
酸であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項の錯
体。
【請求項３】細菌多糖体成分が金属成分およびまたは細
菌外膜蛋白質からなる他の成分で錯体化されていること
を特徴とする、特許請求の範囲第１項または第２項の錯
体。
【請求項４】金属成分がアルミニウムまたはルテニウム
からなることを特徴とする、特許請求の範囲第１項〜第
３項のいずれか一つの錯体。
【請求項５】金属成分が他の無機イオンと一緒にイオン
の形態において存在することを特徴とする、特許請求の
範囲第１項〜第４項のいずれか一つの錯体。
【請求項６】錯体が少なくつも２×10⁷の見掛けの分子
量を有することを特徴とする、特許請求の範囲第１項〜
第５項のいずれか一つの錯体。
【請求項７】金属成分がアルミニウムからなり、そして
シアル酸対アルミニウムの比率が1:0.3w/wより大である
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項〜第６項のい
ずれか一つの錯体。
【請求項８】イオンの形態の金属成分および細菌莢膜多
糖体成分がシアル酸を含有するものである細菌莢膜多糖
体成分からなる錯体の製造方法において、シアル酸を含
有する細菌莢膜多糖体および金属イオンを溶液中で会合
させることを特徴とする方法。
【請求項９】金属イオンとの会合に先立ち、溶液中の細
菌莢膜多糖体が細菌外膜蛋白質との複合体の形態にある
ことを特徴とする、特許請求の範囲第８項の方法。
【請求項１０】細菌莢膜多糖体成分がシアル酸を含有す
る、細菌莢膜多糖体成分およびイオンの形態の金属成分
からなる錯体の少なくとも一種を、アジュバントおよび
（または）担体の少なくとも１種とともに含有すること
を特徴とするワクチン製剤。
【請求項１１】哺乳動物の細菌性疾病の予防または治療
法における使用のための特許請求の範囲第１項〜第７項
のいずれか一つの錯体または特許請求の範囲第10項のワ
クチン製剤。
【請求項１２】哺乳動物がヒトである、特許請求の範囲
第11項の錯体またはワクチン製剤。
【請求項１３】細菌性疾病が脳脊髄膜炎である、特許請
求の範囲第11項または第12項のいずれか一つの錯体また
はワクチン製剤。