JPS61186328A - 新規錯体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、多糖体成分および金属成分からなり、そして
細菌感染に対する保？Ｉを提供するワクチンにおける使
用に適当な新規複合体に関する。

ある種の細菌は、細胞外皮の境界音形成する外膜構造χ
所有することに加えて、莢膜（ｃａｐｓｕｌｅ　）とし
て知られる膜の外側に追加＋ａＹまた有している。それ
ら特徴７両方共有するダラム陰性細菌のｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉａ　）である。細胞外皮の外膜（ｏｕｔｅｒｍ
θｍｂｒａｎｃｅ　）はリボ多糖体、毛〔表面突出（５
ｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ　）　］　、犬
（高分子量）蛋白質、小（低分子量）蛋白質、脂質およ
びリポ蛋゛白質ン包含する多数の物質ン含有する。それ
らのうち最初の３つは主要抗原と同定されている。他の
重要な種類の抗原は、莢膜多糖体として知られる莢膜の
成分からなる。莢膜多糖体および外膜蛋白質は細菌の外
部の非共有複合体として存在するものと信じられる。生
長の間、該細Ｊは、それらの遊離および複合体化形にお
いて莢膜多糖体および外膜蛋白質ン連続的に脱落する。

両方の形における多糖体は、培地から適当な電解質の添
加により沈澱しえ、それはまた存在する最も負に帯電し
たポリマーを沈澱する。

髄膜炎菌の血清学は、結合した莢膜多糖体および外膜蛋
白質ン承認された命名法に従い分類することｔ可能とす
る。９種の承認された血清群Ａ、Ｂｓ　０％　Ｌ％　ｌ
　Ｙ−２％　”１５５および２９”があり、更に血清型
番号１〜１５に特徴づけられる〔たとえば、ワインシュ
タイ７　（Ｌ、　Ｗｅｉｎａｔｅｉｎ）およびフィール
ズ（Ｂ、Ｎ、　Ｆ’１ｅｌｄ８　）　（編集）、セミナ
ーズ・イン・インフエクシウス・デゾーズ（Ｓｅｍ１ｎ
ａｒｓ　ｉｎ工ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　
）　、ストラットン・インターコンチネンタル・メディ
カル・ブック・コーホｖ　−、：／　ヨン（８ｔｒａｔ
ｔｏｎ工ｎｔｅｒ−ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉ
ｃａｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏｒｐ、　）、１９７９：１０章
；フラッシュ（０，Ｆｉ、　Ｆｒａａｃｈ　）、ノンカ
ブスラー・サーフェイス・アンチゾエンズ・オプ・ナイ
セリア帳メニンギチジス（ＮｏｎｃａｐｓｕｌａｒＳｕ
ｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　Ｎ、　Ｍｅｎｉ
ｎｇｉｔｌｄｉｓ　）　、３Ｑ８〜ろ１０頁、参照〕。

１群内の各種菌株は同じ血清型蛋白質乞所有しえ、そし
て多数のグループ分けできない菌種がまた発見されてい
る、莢膜多糖体は特定血清群（群特異多糖体）に対し特
異であり、そして人外膜蛋白質は特定血清型（型特異蛋
白質）に対し特異である。しかしながら、血清型４．５
および８の決定因子は外膜蛋白質よりはむしろリボ多糖
体である。従って、莢膜多糖体は単忙それらの血清型特
異性（たとえば、Ｂ群多糖体）により、セして外膜蛋白
質はそれらの血清型特異性（たとえば、２型蛋白質）に
より示しうる。この協約ハ、りとえば、７５７　シュ（
０，Ｅ、　ＩＰｒａｓｃｈ　）〔上記〕、ツアイ（０−
Ｍ、　Ｔｓａｉ　）等〔シャーナル拳オデー２々クテリ
オロゾー（、Ｔｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇ７　）　、１４６巻（１９８１）６９〜７８頁〕、
フラッシュ（０，Ｂ、　Ｆｒａｓｃｈ　）等〔シャーナ
ル・オデ・バクテリオロゾー、１２７巻（１９７６）９
７３〜９８１〕、ベンドロス（Ｎ。

Ａ、Ｖｅｎｄｒｏｓ　）　（ベルがｙ　（Ｔ、　Ｂｅｒ
ｇａｎ　）およびプレス（Ｊ、　ＲｏＮｏｒｒｉｅ　）
　（編集）、メソオズ・イン・マイクロバイオロジー（
Ｍｅｔｈｏｉｓ　ｉｎＭｉＯｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　
、１Ｑ巻、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ　）　、ｏ　ｙトン：ｘＩ章、セロロゾー・
オブＯデΦメニンビコツカス（ｓｅｒｏｌｏｇｙｏｆ　
ｔｈｅ　Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ　）　）　、ある
いは次の文献：フラッシュ（０，Ｉ［１，Ｆｒａｓｃｈ
　）およびチャ７デ？　：／　（Ｓ、Ｓ−Ｏｈａｐｍａ
ｎ　）、インフエクション・アンド・インミュニテイ（
工ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ工ｍｍｕｎｉｔｙχ６巻、
（１９７２）６７４〜６８１；ゾールマン（Ｊ＋Ｔ−Ｆ
ｏｏｔｍａｎ　）、ホップ？　ｙ　（０，Ｔ、Ｐ。

Ｈｏｐｍａｎ　）およびデネｙ　（Ｈ，０，Ｚａｎｅｎ
　）、７１Ｍ８マイクロバイオロジー・レターズ（ＦＦ
ｔＭｌｌｌｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ　）、３巻（１９８２）、３３９〜３４８の１つに示
される如く、一般に承認されている。便宜のために、特
定血清型、即ちＡ−ＪたはＣの髄膜炎菌莢膜多糖体（Ｍ
ＰＳ　）は略語ＭＰＳ　（Ａ　）、ＭＰＳ　（Ｃ）等に
より示し、そして特定血清型、即ち２または６の髄膜炎
菌外膜蛋白質は略語Ｔ（２）、Ｔ（６）等として示しう
る。

エスシエリヒア・コリ（Ｋｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　０ｏ
ｌｉ（Ｅ！、　Ｃ０１１）　）株は通常に１として示さ
れ、コロミ＝　ｙ　ｒ１！（ｃｏｌｏｍｉ、ｎｉｃ　ａ
ｃｉｄ　）として知られている莢膜多糖体を含有してい
る。これは構造においてＭＰＳ　（Ｂ　）と実質的に同
一である。

ナイセリア・メニンギチジスは通常人間の鼻咽腔に所在
し、そして幼児が特におかされや丁い重篤なそしてしば
しば致命的な脳を髄膜炎を生じうる。エスシエリヒア・
コリに１はまた新生児における髄膜炎の若干の生成に責
を負っている。髄膜炎菌抗原を同定および単離する従来
の試みは上記に示した莢膜多糖体および外膜抗原、即ち
リボ多糖体、毛および大蛋白質（ｍａｊｏｒ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　）に集中していた。遊離の莢膜多糖体、ＭＰＳ
（Ａ）およびＭｐｓ　（ｃ　）は、血清群ＡおよびＣに
それぞれ属する髄膜炎菌株に対する免疫の賦与において
適度に成功をおさめている。血清群Ｂは、増加する幼児
の髄膜炎菌感染で最近同定され、そして群Ｂ髄膜炎菌株
による感染に対し有効なワクチンの欠除は国際保健機関
、たとえば世界保健機＠　（ＷｏｒｌａＨｅａｌｔｈ　
Ｏｒｇａｎｉｓａｔ４ｏｎ　）からのそのようなワクチ
ンに対する増加する要求を創り出した。群Ｂ株に対する
若干の免疫はＭＰＳ　（Ａ）またはＭＰＳ　（０）ワク
チンの接種で生じうるが、提供される保護は一般に幼児
に充分なもでなく、そしてＭＰＳ　（Ｂ　）のみに基く
ワクチンは群Ｂ株による感染に対し生きた免疫を与えな
い。遊離ＭＰＳ　（Ｂ　）に基〈従来提案されたワクチ
ンはそれらが不安定でありがちであるという付加欠点に
悩まされた。これはシアル酸、たとえばＭＰＳ　（Ｂ　
）およびコロミニン酸乞包含する莢膜多糖体が多糖体残
基間の分子内エステル化を生ずる傾向を有することによ
るものと信じられる〔ライフリー（Ｒ，Ｌ、　Ｌｉｆｅ
ｌｙ　）等、カー、セハイドレート・リサーチ（Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ　）、９４巻（１
９８１）　　１９３〜２０３、参照〕。

英国特許出願第８２３３３１７号中には、遊離ＭＦＳ　
（Ｂ　）の上記の不安定性の傾向がより少ないＭＰＳ　
（Ｂ　）およびある種の外膜蛋白質の複合体！含有する
免疫原性で実質的にパイロジエン不含の組成物が記載さ
れている。

我々は、遊離形または細菌外！！Ｘ蛋白質との複合体の
いずれかにおいてシアル酸を含有する多糖体の安定性が
金属との複合体形成により高められることを今や発見し
た。若干の金属が、キサントモｆｕｃａｎｓ　）　）に
より、それらが植物の根圏に所在するとき浸出される莢
膜多糖体と複合体化しうろことは知られている。鉄と非
細菌性多糖体との複合体（貧血の治療に使用される）の
薬物動態がロブステ（Ｒｏｂｕｓｔ、ｅ　）等によりジ
エン・アンド・インダストリアル・ファーマシ−（０１
ｅｎ、　ａｎｄ工ｎａ。

Ｆａｒｍ、）、９（１９７７）１５９〜１６３中に記載
されている。ペルヤー特許明細＝：ｉ第８８９，９７９
号は、多糖体それ自体の分離に先立ち、それχ不活性の
多孔質支持体たとえばケイ藻土の存在において有機第四
級アンモニウム塩との中間体複合体として培地から抽出
する髄膜炎直性および他の莢膜多糖体抗原の単離法を開
示している。上記文献は、シアル酸含有多糖体が金属と
の複合体形成により安定化されうろことについて何も指
摘していない。

従って、本発明は、１つの態様において金属成分および
細菌莢膜多植体成分からなり、その該組直莢膜多糖体成
分がシアル酸を含有する複合体を提供する。

シアル酸含有細菌莢膜多糖体は、たとえばコロミニン酸
またはナイセリア・メニンヤチゾスの血清群Ｂに特異の
莢膜多糖体でありうる。

望ましくは、該細菌多糖体成分は該金属成分で複合体化
され、そしてまた細＠（たとえば髄膜炎菌性）外膜蛋白
質からなる更に他の成分で複合体化される。そのよ５な
金属、多糖体および蛋白質の複合体を、以後三重複合体
（ｔｒｉｐｌｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ぶ。

金属成分は、たとえば周期律表の群■Ａ、ＩＢ、ＩＩＢ
および■Ｂの金属、同時にまた遷移金属特に群■のもの
から選択し５る。好ましい金属は、アルミニウム、ルテ
ニウム、亜鉛、鉄、ニッケルおよびカルシウム乞包含す
る。他の適当な金属はまた、それらの各種酸化状態のす
べてにおける次のものｔ包含する：リチウム、ナトリウ
ム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタニウ
ム、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガ
リウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジ
ウム、銀、インジウム、スズ、タングステン、レニウム
、白金、金およびかにリニウム。金属は好ましくは、イ
オン形（好ましくは適当な金属化合物に由来する）、た
とえばＡｌ”　、Ｒｕ”、ｚｎ　２　＋、ＩＦ５３　＋
、Ｎ１２＋、Ｏａ２＋イオンである。特に好ましい金属
は、特にそれぞれＭ３＋およびＲｕ　３　＋イオンの形
におけるアルミニウムおよびルテニウムである。そのよ
５な金属イオンは、複合体単独で、あるいはたとえば本
発明に従う複合体が製造される（以後に更に記載する如
く）金属塩から生じる他の無機イオンと一緒で存在しう
る。従って、たとえばルテニウムイオンは１種もしくは
それ以上の型のイオン、たとえばヒドロキシ、オキシク
ロライＰおよびアンモニウムイオンとの複合体において
存在しうる。

存在するとき、外膜蛋白質成分は、たとえばナイセリア
・メニンギチジスの任意の菌株、特に血清型１〜６．６
．７および９〜１５に特異のものおよびそれらの免疫学
的均等物の外膜中に見出される蛋白質の任意のものから
選択しうる。

ナイセリア・メニンイチゾス株の変異株に由来する外膜
蛋白質は、そのような変異株の外膜蛋白質のｒＡ／電気
泳動の特徴的パターンが他の承認された血清型における
変異微生物の類別ン必要とせず、そしてそれらの免疫学
的性質が実質的には変化されないとき、特定の髄膜炎菌
性血清型から単離されたものと６免疫学的均等”とみな
しうる。

そのような変異株は血清型２の変異株〔ゾールマン（Ｐ
ｏｏｌｍａｎ　）等、上記〕に見出された如く天然にお
いて見出しえ、あるいはこの技術分野において熟練して
いる者に知られた技術により誘導しうる。

特に好ましい外膜蛋白質は、ナイセリア・メニンギチジ
スの血清型６および２に特異のもの、特に分子量４２，
０００±３，０００　Ｙ有する単一主要成分を有する血
清型２蛋白質である。

便宜のために、本発明に従う特定の複合体または複合体
の種類についての以後の引用は、それら成分の略号によ
り示す。たとえば蛋白質成分を欠いた複合体は、金属−
Ｂ、アルミニウムーＢ、アルミニウムーＯｏ１等と命名
し、その１Ｂ′１はＭＰＥＩ（Ｂ）ｖ、そして＋００１
１はコロミニン酸ン示す。

本発明に従う三重複合体は、たとえば金属−Ｂ２、アン
モニウムーＢ６等と命名し、その数字は特定の多糖体成
分の髄膜炎菌血清型特異性を示し、そして先に限定した
如き免疫学的均等物を包含する。

数字１２１は、分子量４２．０００±３．０００χ有す
る単一主要成分ン有する髄膜炎血清型２蛋白質を包含す
る。莢膜多糖体および外膜蛋白質の複合体（本発明に従
うある種の複合体の製造における出発物質である）は、
単にＢ２、Ｂ６等として示される。

本発明に従う特に好ましい糖類の複合体は、抗原性複合
体、即ちそれを接種した哺乳動物に抗体を上昇させうる
複合体である。治療用ン意図するとき、そのような抗原
性複合体は細菌細胞およびＩＪ　、ｌ（多糖体を実質的
に含まない抗原組成物の形で提供しえ、そしてその金属
成分は好ましくは金属のイオンの如き薬理学的に受容し
うる金属からなる。そのような組成物は、所定量の組成
物を人体および動物体に投与するとき顕著な毒性効果を
導くのに不充分な重量幅のリポ多糖体を含有することに
おいて、リボ多糖体を実質的には含まない。

本組成物の通常な投与量では、重量幅は一般に１チもし
くはそれ以下である。リポ多糖体は遊鷹形において、あ
るいは組成物の他の成分たとえば多糖体蛋白質複合体と
の組合せで存在しうる。

抗原組成物中に含有される複合体の構成分としての上記
に示した薬理学的に受容しうる金属は、その本体、化学
形（たとえば、イオン）および量が受容者によりそれが
その体内に留まっている間耐えられうるものでなければ
ならないという意味において薬理学的に受容しうるもの
でなければならない。

我々は、実験動物を本発明に従う抗原性三重複合体を含
有する抗原組成物で免疫するとき、血清群−および血清
型−特異抗原の両方に関し抗体値が多糖体−蛋白質複合
体のみでの免疫により達成される抗体値と比較して増加
することｔ見出した。

これは、蛋白′質担体たとえば血清型特異性原に関して
のみ抗体値乞高めることが期待されるある種の金属塩（
水酸化物ヶ包含）のよく知られているアゾユパント効果
と対照的である。この観察は、三重複合体の金属成分が
多糖体および蛋白質成分で実際に複合体化されているこ
との証拠を提供する。我々はまた、アルミニウム−００
１複合体に対するＮＭＲおよび電気化学的測定により、
そしてアルミニウムの存在および不存在で時間の函数と
して溶液中のＭ］：ｌＳ　（Ｂ　）　濃度の対性免疫電
気泳動測定により金属と遊離莢膜多糖体との複合体形成
のしるしを得た。

我々は、本発明に従う複合体がセファロースＣＬ−２Ｂ
　（商標）上のクロマトグラフィにより決定するとき少
なくとも２×１０７の明らかな分子量ン通常有すること
を見出した。我々はまた、蛋白質成分ン有せずそして金
属成分がアルミニウムである本発明に従う複合体におい
てシアル酸対アルミニウムの比率が一般に１　：　０．
！ｔ　Ｗ／’Ｗより大であることを観察した。

蛋白質成分？有する本発明に従う複合体はｒルミ気泳動
、特にげデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ／ｌ／７ミ
ト）ｆ　ルミ気泳動（Ｓｎ２−　ＰＡＧ］ｌ［！　）　
［付てことができて、該蛋白質成分の構成の特徴的パタ
ーンを提供する。たとえば、レムリ（σ、Ｋ。

Ｌａｅｍｍｌｉ　）によりネーチュア（Ｎａｔｕｒｅ　
）　（＋：１７１ン）、２２７巻、（１９７０）６８０
〜６８５頁に記載されたＳＤＳ　−ＰＡＧＥ法乞使用し
５る。本発明に従う複合体中の髄膜炎菌蛋白質の血清型
特異性は、たとえばそのパターンを髄膜炎菌血清学およ
びその実幌的決定に関する上記引用文献〔たとえば７　
ラフ　シュ（０，ＦＸ、Ｆｒａｓｃｈ　）等、上記、Ｔ
ｏｕｒａｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　］に
与えられたものとの比較することにより証明しうる。

本発明に従う複合体の莢膜多糖体成分の血清型特異性は
、この技術分野において熟練している者に知られている
任意の適当な組成分析法により証明し５る。多糖体成分
のシアル酸含量は、比色法により決定しうる。多糖体成
分はまた核磁気共鳴により、あるいは特異抗血清で免疫
学的に決定しうる。

本発明に従う抗原組成物は、広い免疫スペクトル乞提供
するために、１種もしくはそれ以上の他の抗原性成分、
たとえば遊離ＭＰＳ　（Ａ　）およびＭＢ２　（Ｃ３）
　、そしてまた１種もしくはそれ以上の髄膜炎菌莢膜多
糖体および外膜蛋白質の他の複合体、たとえばＭＢ２　
（Ｂ　）　／Ｔ　（７）、ＭＢ２　（ｃ　）／Ｔ（２）
またはＭＰＥＩ（Ａ）／Ｔ（２）−＆随意に包含しうる
。抗原組成物は、１種より多い本発明に従う複合体、た
とえばアルミニウムーＢ２およびアルミニウムーＢ６’
ｌＫ同時に含有しうる。

他の態様においては、本発明はまた、シアル酸Ｚ含有す
る細菌莢膜多糖体および金属を組合せにもっていくこと
からなる、本発明に従う複合体の製造法を提供する。

所望生成物が三重複合体である場合、莢膜多糖体出発物
質は多糖体と細菌（たとえば髄膜炎菌）外膜蛋白質、た
とえば上記に示した任意の蛋白質との複合体の形で提供
しうる。金属はたとえば上記に示した任意のものであり
え、そして一般にその化合物（たとえば金属塩のイオン
）として使用される。金属および多糖体は溶液中で組合
せにもっていくのが望ましい。これは多糖体を含有する
ｉｌｌおよび金属（たとえば、その塩に由来する金属イ
オンとして）ン含有する溶液の混合を昧し、そして随意
に、もしも所望ならば生成した混合物をインキュベート
する。別途に、１方を他方に対し透析することにより２
つの溶液ン組合せにもっていくこともできる。好ましく
は、各々の場合における溶媒は水であり、随意に１種も
しくはそれ以上の可溶化剤を含有しうる。適当な金属塩
は水溶性塩、たとえば無機および有機酸アニオンに由来
するもの、たとえばハライド（即ち、フルオライド、ク
ロライげ、プロマイげおよびヨウダイげ）、スルファイ
ト、スルフェート、ナイトライド、ナイトレート、ホス
フェート、アルカノエート（たとえばアセテート）、フ
マレート、ペン・戸エート、サクシネート、フタレート
およびオキサレートン包含する。金属がルテニウムであ
るとき、塩は便宜には１ルテニウム・レツげ”、即ち通
常形またはアンモニア化形のいずれかにおけるルテニウ
ムオキシクロライドである。

本発明に従う方法において出発物質として使用される多
糖体または多糖体−蛋白質複合体は、たとえば上記文献
に記載され、あるいは英国特許出願第８２３３３１７号
中に開示された如きこの技術分野において熟練した者に
知られている任意の方法により１！！！造しうる。後者
の出願は細菌莢膜多糖体および細菌外膜蛋白質の複合体
の単離法を記載しており、その方法は次の工程からなる
：（１）　　外膜および莢膜を有する細菌を培地中で培
養し、そして細菌莢膜多糖体および細菌外膜蛋白質の複
合体ン包含する水性層を得； （ＩＩ）工程（１）で得た水性層ン第四級アンモニウム
塩、と混合して、該複合体ン含有する沈澱ン生じさせ：
（ｌｉ＋）　　工程（１）で得た沈澱を水性媒質中でカ
ルシウム（１ｖ）工程（ＩＩ＋）で得た水溶液χ低級ア
ルカノールと混合して、該複合体？含有する沈澱を生じ
させ：そして、 （Ｖ）　　工ａ　（ＩＶ）から生成した沈澱中に存在す
る任意の他の化合物から複合体乞分離する。

後者方法は、たとえば単離が意図されるもの以外の複合
体、υ式多糖体、脂質、核酸および他の不純物を実質的
に含まな（ニア比較的純粋な形で所望生成物を提供し、
そして複合体χ直接得ることを可能とする。

後者方法の遂行において、リボ多糖体の放出？最少とす
るために、培養が静止期に達する以前に水性層を直接得
る。水性１偕から組直細胞および細胞破片を水性層から
、工程（１）の沈澱を行う前に、たとえば遠心分離によ
り除去するのがまた有利であるけれども、そのような除
去は本方法の任意の適当な段階で行いうる。工程（１）
において、第四級アンモニウム塩は、望ましくはセチル
−トリメチルアンモニウムプロマイタ１即ちセタデロン
（０ｅｔａｖｘｏｎ　）　（商標）、またはセチルピリ
ゾニウムクロライドである。そのような塩は存在する遊
雌莢膜多糖体との不溶性複合体塩を形成するのに使用さ
れ、従ってそれらは工程（ｉｌｌ）およびＯｖ）におい
て容易に除去される。所望生成物と同時にまた、本方法
のこの°工程において形成した沈澱は、水性１中に存在
する最も負に帯電したポリマー、即ち蛋白質（外膜から
のものを包含）、リボ多糖体および部分的に分解した核
酸を含有する。セタデロンを使用するとき、工程（１）
の沈澱形成は、望ましくは１２から２５°Ｃまでの範囲
内の温度、最適には１８℃またはその付近で行う。塩が
セチルビリゾニウムクロライドであるとき、沈澱形成は
０〜１０°Ｃの範囲内の温度、最適には４℃またはその
付近で行いうる。いずれの場合も、塩は好ましくは約１
チｗ／ｖで存在する。

工＠（ｉｌｌ）で示される水溶性塩は、好ましくは塩化
カルシウムまたは塩化アルミニウムである。複合体と同
時に、工程（…）における静夜はまた、容質として工程
（ｎ）において形成した沈澱中に存在する他の成分を含
有するが、かく除去される莢膜多糖体複合体塩は含有し
ない。

後者方法の遂行において、アルカノールは工程（１ｖ）
で、存在する任意の多糖体／蛋白質複合体の解離が実質
的に生じないような量および濃度において使用する。好
ましくは、アルカノールは水溶液での混合のとき５０〜
９５４ｖ／ｖの範囲内の濃度を提供するように使用する
。特に好ましい濃度は約７５憾である。ここで使用する
１個級アルカノール”なる語は炭素原子１から４個まで
ｔ含有するアルカノール、たとえばエタノールまたはメ
タノールを意味する。複合体に加えて、工程Ｑｖ）で形
成する沈澱はまた若干の低分子量不純物たとえば非外膜
蛋白質、低分子量核酸断片および少量のリポ多種体ケ含
有する。それら不純物は工程（ｖ）における分離で実質
的に除去され、それは好ましくは、たとえばセファロー
スＣＩ、−２Ｂまたは同様な性質７有する任意の他の系
を使用するｒル濾過により行われる。

更に精製が、もしも必要ならば、工程Ｍの生成物に対し
、夾雑物たとえば分解した核酸および非複合体化多糖体
および蛋白質の存在を最少とするために行われうる。

本発明は更に、本発明に従う抗原組成物および少くとも
１種のアジュバンドおよび（または）担体からなるワク
チン製剤χ提供する。そのような製剤において、組成物
は更に上記抗原成分たとえば１種もしくはそれ以上の遊
離髄膜炎菌莢膜多糖体を包含しうる。血清群ＢおよびＡ
および（または）Ｃの髄膜炎菌に対する保護を提供する
ことｔ意図するワクチンは、それぞれ本発明に従う１種
もしくはそれ以上の複合体の混合物’＆、ＭＰ８　（Ａ
）および（または）　ＭＰ８　（ｃ　）と−緒で含有し
うる。

付加的または別途に、そのような製剤は、もしも所望な
らば、本発明に従う複合体、および１種もしくはそれ以
上の髄膜炎菌莢膜多糖体および外膜蛋白質の他の複合体
、たとえばＭＰＩＩＩＩ（Ｂ）／Ｔ（７）、ＭＰ＝（０
）／Ｔ（２）またはＭＰ８　（、Ａ　）／Ｔ（２）、同
時にまた１種より多い本発明に従う複合体、たとえばア
ルミニウムー３２およびアルミニウムー８６１ｆｌ含有
しうる。

本発明に従うワクチン製剤は、人間に対する投与に適用
であるような滅菌形において存在しうる。

それらの製剤においては、担体はたとえば水でありうる
。そのような製剤は、付加的または別途に、１種もしく
はそれ以上の適当な非金属成分たとえば１種もしくはそ
れ以上の金属塩（アジュバンドとして提供され、そして
複合体の形におけるものでない）、抗原安定剤として乳
糖、あるいはワクチンを血液と等張圧するための１種も
しくはそれ以上の塩たとえば塩化ナトリウムを含有しう
る。

好ましくは、適当なバッファーがまた包含される。

そのようなワクチンにおいては、本発明に従う複合体は
便宜に、０．１μｇから６１りまで、望ましくは１．０
から６００μｇまで、好ましくは約５０μｇの用量で投
与しうる。

本発明は更にワクチン製剤の製造法を提供し、その方法
は本発明に従う抗原組成物および少なくとも１種のその
アジュバンドまたは担体の混合からなる。本方法におい
ては、ワクチンは、たとえば洗浄剤援助濾過により無菌
となしうる。

他の態様においては、本発明は哺乳動物たとえば人間の
細菌（たとえば髄膜炎菌またはエツシエ使用のだめの本
発明に従う抗原複合体ヶ提供する。

たとえば、本抗原複合体は脳を髄膜炎の予防または治療
のために使用しうる。そのような使用においては、抗原
複合体はここに記載した任意の製剤において存在し５る
。本抗原複合体は１回もしくはそれ以上の投薬で投与し
うる。もしも１回より多い投薬で投与するときには、投
与は第２の免疫の利益χ得るために、適当な時間目盛り
で間隔を保つのが望ましい。本抗原複合体は、たとえば
１から６週間までの間隔で、２また３投薬で投与しうる
。適当な場合には、１回目に引続く投薬は、最初の投薬
中に含有される量より少ない量の抗原複合体を含有しう
る。本抗原複合体は任意の便宜な経路たとえば非経口（
たとえば、皮下、靜詠内、腹腔内）、経口、あるいは幼
児に望ましい鼻腔内経路により投与しうる。本発明はま
た、哺乳動物たとえば人間の細菌（たとえば髄膜炎菌ま
たはエツシエリヒア・コリ）疾病の予防または治療法χ
提供し、それは該哺乳動物に対する有効量の本発明に従
う抗原複合体の投与からなる。本抗原複合体は、本発明
に従う抗原組成物またはワクチン製剤の形において有利
に使用される。本発明は、上記の如き本発明の方法によ
り誘導される複合体を包含する。

以下の実施例で本発明を説明し、添付の図面を引用する
が、その中で：　　　・ 第１図は、２６０および２８０　！ｉｎにおける画分の
吸収を追跡することによる、およびし・戸ルシノールー
Ｈｏｌ比色法でのシアル酸決定による、セファロース０
Ｌ−２Ｂクロマトグラフイカラムからの典型的Ｂ２複合
体の溶出プロフィルを示す。

第２図は、２８０ｎｍにおける画分の吸収を追跡するこ
とによる、およびし・戸ルシノールーＨＯ’１比色法で
のシアル酸決定によるセファロース０Ｌ−２Ｂ、クロマ
トグラフィカラムからの典型的粗Ｂ２複合体の溶出プロ
フィルを示す。

第３図は、２８０ｎｍにおける溶出液の吸収乞追跡する
ことによる、およびし・戸ルシノールーＨ０Ｉ比色法で
のシアル酸決定による、精製した典型的Ｂ６複合体のセ
ファロース０Ｌ−２Ｂ再クロマトグラフイの際の溶出プ
ロフィルを示す。

第４図は、２８０ｎｍにおける溶出液の吸収χ追跡する
ことによる、およびし・戸ルシノールーＨＣ１比色法で
のシアル酸決定による精製した典型的Ｂ２複合体のセフ
ァロース０Ｌ−２Ｂクロマトグラフイの際の溶出プロフ
ィル暑示す。

第５図は、Ｂ２およびＢ６複合体、ならびに分子量標識
標準のＳＤＳ　−ＰＡＧＥから得られるパターンを示す
。

第６図は、アルミニウムおよびシアル酸を追跡すること
による、アルミニウムクー複合体および純ＭＰＳ　（Ｂ
　）のセファロースｃＬ−２Ｂ再クロマトグラフィの際
の溶出プロフィル７示す。

第７図は、コロミニン酸の存在でおよびなしでの溶液中
のｆｉＵ、”濃度における函数としてのピーク電流のボ
ーラログラフイＤＰＰプロットを示す。

第８図は、各種濃度のＭ３＋の存在および不存在での溶
液中のＭＰＳ　（Ｂ　）の時間依存性分解の対向免疫電
気泳動測定を示す。

例　　１ Ｂ６複合体の単離および精製 培地を示した量における次の成分の水溶液として製造し
、そして生成した溶液に水を加えて容量１６１に仕上げ
た。

Ｋ２Ｂｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　　３．６８
１１Ｌ−グルタミン酸　　　　　　　　　　２０．８ｇ
システィンＨａ１０．４８　ｆｌ ＮａＨＣＯ３１３−４７Ｊ９ トリシン、Ｎトリス （ヒドロキシメチル） メチルグリシン　　　　　　　　　　１１．４６ｇＦｅ
５０．７　Ｈ２Ｏ０，０４５１ ＮＨ，Ｃ！１　　　　　　　　　　　　　　　８．０　
９ｘ２ｓｏ４０．７７　ｆｌ ＯａＯｌ、２２　ＨＣ１溶液 ７．４ｍ９／１００１ｄ　　　　　　　　　　１６ｍ７
ＭｇＣ１□６　Ｈ，Ｏ１，７１ｇ 力ぜイン加水分解物　　　　　　　３２０　　　ｇ溶液
の−を７．２に調節し、そして２つの４００ｄ部分を２
つの１１容円錐フラスコに移した。溶液の残り’Ｙ１５
１容ピンに移した。サイフォンンーンおよび両方のフラ
スコに連結し、そしてビン’に１５ポンド／平方インチ
の圧力で１５分間オートクレーブした。ピンの内容乞つ
いで２０１容醗酵器に移し、そして滅菌５０係水性グル
コース６００ｄを加えて培地を形成させた。ナイセリア
・メニンギチジスの血清群Ｂ１血清型６株χ含有する培
地の１滴を４００ｒＬｌの容Ｍ、を含有する両方のフラ
スコに加えることにより接種物を製造した。

フラスコを振盪しつつ６７°Ｃで１２時間インキュベー
トすることにより種培地８００ｄを形成させ、その純度
はダラム染色技術によりチェックした。

種培地のすべてｔついで醗酵話中の培地に接種するため
に使用した。全培地をついで次の実験条件下に生育させ
た。

温度、一定３７℃。

−１一定、滅菌２　Ｎ　ＨＣ！１および２Ｎ　ＮａＯＨ
で７．２゜撹拌速度、１００〜７００ｒｐｍ、自動調節
。

溶解酸素、最低１０係飽和。

空気流、１〜５／／分、溶解酸素濃度乞維持するために
手動調節。

消泡、ポリプロピレングリコールを必要なときに手で加
える。

培地を最適密度的９゜Ｏが達成されるまで生育さ゛　せ
た。このＯ，Ｄ、は通常的６．５時間後に達成すること
が期待される。

培地をついで醗酵器から移し、そして連続流動遠心分離
に、はぼ澄明な上清液を導くのに充分な流速で通過させ
た。遠心分離に引続いて、上清液に水中１０　ｆ１ｗ／
ｖセタデロンの１０容量繋χ加えて懸濁液中の沈澱ン導
いた。懸濁液を４℃において２０００　ｒｐｍで遠心分
離した。ついで上清液？捨て、そして沈澱を水６００ゴ
に懸濁した。２Ｍ水性塩化カルシウム６００ｄ’につい
で加え、そして混合物を４°Ｃで１時間撹拌し、ついで
５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。

上清液に消泡剤としてカプリルアルコール１滴を加え、
セして上清液ヲ真空下、撹拌しつつ１０分間脱がスした
。脱ゴスした上清液を水浴中に入れ、そしてそれに無水
エタノール６容量χ連続攪拌しつつ０°Ｃで加えた。混
合物乞ついで浴中に２時間保ち、その後４℃の温度にお
いて１５分間５０００　ｒｐｍで遠心分離した。上清液
を捨て、そして沈澱を７５幅エタノールに再懸濁し、そ
して遠心分離して、−２０°Ｃで貯蔵しえあるいは次の
如く処理しうるペレットを形成させた。

このベレットを０゜０１係チオメルサレート含有０゜１
ｙＬ酢酸アンモニウム中に２０Ｉｎ９／ｄの割合で懸濁
した。懸濁液を１０分間超音波振盪に付し、そして３μ
ｍの膜に通して不溶物を除去した。上清液馨ついで４°
Ｃにおいてバッファーで平衡化したセファロース０Ｌ−
２Ｂの５１カラムに通した。

カラムＺバッファーで洗滌し、そして溶出液）ａ−波長
２６０および２８０　ｎｍにおけるＵＶ吸収、ならびに
し・戸ルシノールーＨ０Ｉシアル酸決定により追跡した
。２８０　ｎｍにおいて吸収ヶ示しセしてシアル酸を含
有（し・戸ルシノールーＴＩＣｊ１決定）する空容量画
分（ｖｏｌｄｖｏｌｕｍｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　）を
貯蔵した。ナトリウムデオキシコレ−）　’Ｙ　Ｏ，１
％　ｗ／ｖバッファーの最終濃度に、ＰＨ８〜９内に加
えた。

（他の濃度および一値がまた可能であり、たとえばＰＨ
１１に緩衝化した１　４　ｗ／ｖの最終濃度は膜に粘着
する物質の量を減少させることが認められた）。

生成した溶液を直ちに０．４５プレフィルタ−でサート
プラｙ　（＋３ａｒｔｏｂｒａｎ　）　０．２　’１カ
プセルに通して濾過した。濾！に無水エタノール６容量
で沈澱させた（溶液後の濃度約７５幅）。この濾過の後
、すべての操作は滅菌条件下に行った。遠心分離の後、
上清液χ捨て、そして沈澱を冷エタノール２００−に懸
濁してそれを洗滌した。懸濁液をついで遠心分離し、上
清液χ捨て、そして沈澱（実質的にＢ６複合体のみから
なる）を再び同じ洗滌工程に付し、その後冷水２００ゴ
に再溶解した。

（別途に、注射溶液は、たとえば５幅乳糖および０．０
１　Ｍ　Ｎａ３ＰＯ４；　ｐＨ７，３で製造しうる）。

例　　２ Ｂ２複合体の単離および精製 Ｂ２複合体を、例１の方法により、ナイセリアする培養
物から出発して製造した。

例　　３ 希釈した培地６１を、例１に使用したと同様の方法によ
り、同じ成分を使用して製造した。培地の１部分約２０
０〜５００ｍを非バッフル形フラスコに移し、そしてナ
イセリア・メニンギチジスの血清群Ｂ、血清型６株を含
有する培養物１滴を接種した。この接種物χ例１に特定
した如くにインキュベートし、ついで培地の残部に加え
、それ７例１に記載したと同様にして６．７５時間イン
キュベートした。培養物ンついで６Ｘ５０ＯＲ／とじて
遠心分離機に移し、セして７０００　ｒｐｍで２０分間
遠心分離した。

上清液に１Ｑ４Ｗ／マセタデロン１０容量優を加えた。

懸濁液を４℃で１６時間沈積させ、その後、上清液の大
部分をサイフオンで除去し、そして沈澱？含有する残部
ｔ４℃において２０分間２０００ｒｐｍで遠心分離した
。沈澱を蒸留水２０に／に再懸濁し、２　Ｍ　ＣａＣｌ
２２［］ｍＡ’を加え、そして混合物ｔ４°Ｃで１時間
撹拌し、ついで５０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離し
た。

粗沈澱を再溶解し、そして例１に記載した如くにセファ
ロース０Ｌ−２Ｂの５００　、ｎｌカラム上クロマトグ
ラフィにより部分精製した。シアル酸および２８０ｎｍ
Ｋ吸収を有する物質を含有する空容量画分ン貯蔵し、最
終容量７５４　Ｖ／Ｖ　１でエタノールの添加により沈
澱させ、ついで４　”Ｏにおいて１５．０００　ｇで２
０分間の遠心外扇により採取した。沈澱Ｚ無水エタノー
ルで洗滌し、そして５幅乳糖および０．０１　Ｍ　Ｎａ
５ＰＯ，（ｐＨ７，３）中で凍結乾燥した。

例　　４ Ｂ２複合体を、例３の方法により、ナイセリア・メニン
ヤチゾスの血清群Ｂ、血清型２株を含有する培養物から
出発して製造した。

例　　５ 例１〜４において形成した複合体χ、各々の場合、４°
Ｃにおいてセファロース０Ｌ−２Ｂ（分子ｔ２ｏｘ１０
ａ）上の空容量中に連出するピークとして、し・戸ルシ
ノールーＨ０１法によるシアル酸、ならびにＢ６複合体
の場合２６０および２８Ｑｎｍの吸収（第１図参照）、
セしてＢ２複合体の場合　−２８０ｎｍのみの吸収（第
２図参照）ン倹定することにより同定した。後者のプロ
ットは、シアル酸含量４８４および蛋白質含量３６．１
１　（比率１．５３：１）ａ−有するＢ２複合体の凍結
乾燥検体から得た。複合体は、セファロースＯＬ　−２
Ｂ（第１図において使用した複合体について第３図、お
よび第２図において使用した複合体について第４図）上
４℃における再クロマトグラフィに際し解離していない
（即ち、蛋白質および多糖体が空容量中に留まる）こと
が認められた。複合体のＳｎ２−　ＰＡＧＥは、例１お
よび例６の生成物について血清型６、そして例２および
例４の生成物について血清型２の特徴的な蛋白質成分パ
ターンχ与え；検体はＳＤａ中９５℃で６分間煮沸し、
ついでトラック（ｔｒａｃｋ　）当り１０μｇの検体χ
クーマシー青（Ｏｏｏｍａｓａｉｅ　ｂｌｕｅ　）で染
色し、上記レムＩＪ　（Ｌａｅｍｍｌｉ　）の方法に付
した。第５図において、トラック１は、分子量標識のバ
ンドを示す。トラック２は、Ｂ２複合体から得られた。

トラック２のパターンは４２，０００の領域に分子量を
有する優勢蛋白質成分に基く大ｌ々ンドを示す。小パン
ｒがまた３　２，０００付近に現われる。トラック３は
、１幅セタデロンでの沈澱により、そして精製前に得ら
れたＢ６複合体乞包含する粗沈澱から得た。

トラック４および５は、セチルピリジニウムクロライド
での沈澱Ｙ包含する単離工程から得られた凍結乾燥Ｂ６
ワクチン組成物の検体から得、トラックはそれぞれ滅萌
濾過の前および後からのものである。トラック４および
５０両方において、２つのベンｒは約３８．０００およ
び４３，０００の明らかな分子量を有する。複合体の化
学組成は、シアル酸（し・戸ルシノール−ＨＣ１）およ
び蛋白質（ウシ血清アルジミンの標準を使用するローリ
−（Ｌｏｗｒｙ　）法）につき比色法により決定した。

例　　６ アルミニウムーＢ６複合体の製造 （１）　　例１の方法により単離したＢ６複合体乞、ア
ルミニウムで、各々が５４乳糖中のＢ６複合体１００μ
！：ｐ）１７．４への０．０１　Ｍリン酸ナトリウム；
　０．００１　Ｍ　Ａｌ２（ＳＯ４）３を含有する０、
５Ｍ部分としての溶液の製造により複合体化した。

（１）　　例１の方法により単離したＢ６複合体を、ア
ルミニウムで、０℃においてＢ６複合体（３ｄ）の水溶
液の製造により複合体化し、それに２　Ｘ　１０−”　
Ｍ　Ａｌ−０１３’ｌ加えて１　：　０．１から１：６
までの間のシアル酸ニアルミニウムのモル比乞与えた。

０℃における１０分間のインキュベーションに引続いて
、溶液をＱ、１Ｍ　ｗ−ｒ、ｔ、、ＮａＣ１となし、そ
して無水エタノール６容量を加えた。沈澱暑遠心分離に
より採取し、無水エタノールに悪濁し、そして再遠心分
離し、そして最後に水（３Ｒｔ）に再溶解または再懸濁
した。等容量のＱ、Ｑ　２Ｍ　Ｎａ５ＰＯ４（ｐＨ７，
３）および１０チ乳糖バツフアーを加え、そして部分ず
つ凍結乾燥した。

例　　７ ルテニウム−Ｂ６複合体のｌ！造 例６に記載したと同様の方法で、表Ｍ複合体χ、５憾乳
糖：ｐＨ７，２への０．０１　Ｍリン酸ナトリウム；０
．００１　Ｍルテニウム赤（アンモニア化ルテニウムオ
キシクロライド）中のＢ６複合体１００μｌＺ使用して
製造した。

例　　８ ＭＰＳ（Ｂ）の単離および精製 希釈した培地の６つの１５／タンクを、例１に使用した
と同様の方法により、同じ成分を使用して製造した。各
タンフケ新たな培地８０　Ｑｄで接種し、種はナイセリ
ア・メニンギチジスの血清群Ｂ株を金回する培養物から
製造した。培地のタンクを例１に記載したと同様の方法
で約５．５時間インキュベートし、そして１５／容ビン
中に収獲した。それらビンの内容を４０〜５０，０００
　ｒｐｍで遠心分離し、速度は収穫物の密度に従い変化
させた。収獲の直後に、１０４セタデロン１５０１１１
７’ａ’上清液の各々の部分澄明化パッチに加え、それ
をついで４℃で放置して沈積させた。

２日後に、上清液の大部分を１５１容ビンからサイホン
除去し、そして残部を合せ、そして４つの１１！部分に
回転分離した。

回転分離した沈澱を一２０℃で貯蔵し、その後１／１．
飽和酢酸ｆ　）　ＩＪ　ｔム（ｐＨ７，０）　３００ｍ
１Ｖｃ懸濁し、２ＭＣ！ａｃ１□３００プを懸濁液に加
え、そして混合物ｙａ’４°０で１時間貯蔵した。つい
で無水エタノールを加えて２５１　Ｖ／Ｖの濃度を形成
させ、加えた総容量は２００ＩＩＬｔである。沈澱？遠
心分離し、セして上清液ケ保持した。上清液を４５０濾
紙に通して濾過してそれを清澄化した。かく濾過した上
清液は、視覚的に完全に澄明であった。

上清液中のエタノール濃度をついで、無水エタノール更
に１６００＋ｄの添加により７５４　ｖ／ｖに増加させ
た。

沈澱をついで４つの１１部分に遠心分離した。

上清液を捨て、そして沈澱ｔエタノールで２回およびア
セトンで２回洗滌した。湿重量収量は２．５ｇであった
。−２０°Ｃで貯蔵した浸、沈澱Ｙ　ｌ／、。

飽和中性酢酸ナトリウム６５０ゴに融解して、乳白色溶
液χ生成した。

沈澱溶液？溶かし、そして冷フェノール（結晶フェノー
ル１００．！ｉｉ’足丁１／ｌ、飽和中性酢酸ナトリウ
ム４［］ｄ）２つの０．５容量で２回抽出した。

抽出は約１分間手で振盪することにより行った。

層分離をポリゾロピレンボッ）中７．０００　ｒｐｍ（
９，４００Ｇ　）での遠心分離により行った。この方法
の間に温度は１０゛Ｃに上昇して、よい要分［４を与え
た。フェノールＩ！　Ｙ捨て、そして水性Ｉ−乞クりロ
ホルム／デタノール５：１でホモジナイズにより抽出し
た。要分ＪＹ上記の如く行うが、５８０　ｒｐｍ　（４
８８００Ｇ　）で３０分間の回転でガラスポットを使用
した。水溶液を除去し、そして−２０℃で貯蔵した。

上記で得られた僅かな乳白色物質ン融解し、そして肌１
Ｍ　ＣａＯ１２（５））に対して１８時間透析した。透
析後の容量は２５０ｄであった。これを５０　ｒｎｔ　
８　遠心分離管ニ分配シ、ソシて１００，０００Ｇで６
時間回転分離した。澄明な上清液乞生成したゼラチン様
沈澱（捨てた）と分離した。

無水エタノール７５０ゴを加えて髄膜炎菌群Ｂ多糖体を
沈澱させ、１時間邊に沈澱を完成させた。

多４体沈澱をエタノールで２回およびアセトンで２回洗
滌し、ついで乾燥した。乾燥重量収量は０．９８３であ
った。

例　　９ 血清群Ｂナイセリア・メニンギチジスの培養物からのＲ
ｙｅ使用し６．５時間の培養時間で例１〜４および８の
方法に従って、培養物１８００Ｉｎｌン製造し、それ乞
回転分雌して僅かに濁った上清液χ生成した。１０幅セ
タデロ／１８ｄを加え、そして４℃で１夜放置した。

かく形成した沈澱乞回転分離し、そして蒸留水約１００
４に再ｔｉ濁し、そして−２ｏ”Ｃで貯蔵した。生成し
た上清液への更にセタデロンの添加は更に沈澱を生成す
ることがなかった。セタデロン沈＄ｆ　２　Ｍ　ＣａＣ
ｌ２１００ｒｒｄｌで解離させた（４℃で１時間撹拌）
。

培養物の第２バツチ乞、６．２５時間の培養時間χ使用
して同様に製造した。収穫物の大部分を上記の如く抽出
し、そして回転分離して、上清液１５００−を生成した
。これン、１００，０００、躍カットオフχ選択して限
外濾過によりｊ濃縮しｔム最終容貴は約１５０ｗＬｔで
あり、そして濾過器は逆洗滌して１６２−の最終容ｔを
導いた。この乳白色液体Ｙ８，０ＯＯＧで回転分離して
清澄化乞達成した。０．９ｄＹ取り、モして１０ｃ６セ
タデロン０．１ｄｖ加えた。沈澱が直ちに生じた。更に
１．２ｄＹ：取り、そして無水エタノールＱ、４ｍｙ加
えて２５１　Ｖ／Ｖの総エタノール飛度χ達成した。沈
澱の増加はなく、そして無水エタノール更に６．２−？
　７５４　ｖ／ｖまで加え、それは非常に僅かの混濁の
みを生じた。

培養物Ｚ第１のパンチにおける如く回転分離した。乳白
色上清１１５００１ｄ’Ｙ４°Ｃで１夜貯蔵し、ついで
ｉ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏカットオフ膜ン使用してダイア
濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ　）　シ、レチンテート
１６２ｒｔｔｌ″Ｐ！：導いた。この物質ン８．［３０
Ｄ　（）で回転分丙１して清澄化し、ペレットは保持し
た。生成した液体啓液の−は７．４と認められた。得ら
れた沈澱のから０．１係セタプロンの添加により沈澱を
得た。

上清液１．２　ｍ　９取り、そして無水エタノール０．
４ゴを２５４　ｖ／ｖ　１で加えた。沈澱は生成せず、
培養物中に非常に小量の融解した蛋白性物質を示した。

無水エタノール６．２ｄの添加による７５憾Ｖ／Ｖへの
エタノール濃度の増加は非常に僅かの混濁ン示し、１０
０．０００ＭＷ以下の多糖体の多量の放出または低多糖
体生成のいずれかｔ示した。

第１の可能性を、限外濾過装置からの透析物へセタデロ
ンχ添加することによりチェックした。

沈澱は生成せず、上記の第２の可能性？示した。

レチンテートの残部（１５９，８ｄ）ｖ１夜真空透析に
より４４ｍ／に更に濃縮し、その１ゴを取り出した。濃
縮物は０．１　％セタデロンで容易に沈澱した。残りの
４２ＷＬｌを７５４　Ｖ／’Ｖへの無水エタノール１２
６−の添加により沈澱させた（認識しうる沈澱は２５４
において生成しなかった）。沈澱は放置により増加した
が、認めうる増加は酢酸アンモニウム１．２６１１の添
加によっては誘導されなかった。沈澱は徐々に凝集した
。

アンモニウム（０，２１１７）’Ｙ加え、そして溶液乞
総量をエタノールで２回およびアセトンで２回；充滴し
、ついで乾燥し；乾燥重量収量は４０ダであった。

例１０ 髄膜炎菌群Ｂ多糖体（シアル酸２０μ５）ｙｔＡｌ（’
ｌ、溶液（蒸留水２１中のＡ’１３”　　’ｌ　Ｑ　ｐ
ｇ　）に対し、４°Ｃで２４時間透析した。透析袋内の
溶液Ｙ　７５４　ｖ／ｖエタノールで沈澱させ、沈澱を
遠心分１惟し、モしてにレットＺ凍結乾燥した。シアル
酸、Ｃａ”＋およびＡ１３＋イオンについてのＢ多糖体
−アルミニウム複合体の分析は、モル比１−Ｄｏ：０．
０１　：　０．３４を与えた。金属イオンの分析は、原
子吸収分光分析により行った。

例１１ アルミニウムーＢの製造（インキュベーション法）群Ｂ
多糖体（シアル酸２０μｍ）ｖ、蒸留水（２ｄ）中のＡ
ｌＣｌ３　（Ａｌ”　　２〜２０　ｐｍ　）で、室温に
おいて１０分間インキュベートした。１芭酢酸７５％Ｖ
／Ｖエタノールで沈澱させた。沈澱を遠心分離し、そし
てペレットを凍結乾燥した。より高いＡ１３＋モル比（
即ちシアル酸：　Ａｌ”　１　：　１および１　：　０
．５　）　において、水不溶性複合体が得られ、他方よ
り低いＡ１３＋七ル比（即ちシアル酸：Ａｌ”１　：　
０．３．１　：　０．２および１　：　０．１　）にお
いて、複合体は水溶性であった。

例１２ 例１０および１１の方法により形成した金属複合体の分
子量を、セファロースＣＬ−ＩＢクロマトグラフィによ
り測定した。両方の場合において空容量ピーク（Ｖｏ　
）はシアル酸およびアルミニウムを含有した。しかしな
がら、たとえば後者の方法から得られた複合体は増加し
た分子量を有した（第６図参照）。

例１３ アルミニウムーコロミニン酸系のＮＭＲおよび゛電気化
学的測定を行って、特徴づけデーターおよび複合体形成
の証拠を提供した。アルミニウムの存在または不存在で
の？１Ｉｉｆｆｌ中のＭＰ８　（Ｂ　）の時間依存性分
解の対向免疫電気泳動測定χまた使用した。

それら実情の各々において、多糖体およびアルミニウム
は各種実検溶液の製造の間に組合せにもっていった。対
応の複合体がかくしてその場において形成した。

（ａ）電気化学的測定 ２つ（０，１２５ｍＭから１ｍＭ）ＡＩＩＴＩｋ度系列
を、１つは多機体の不存在において、他方は１圃航。

モノマー（ＮＡＮＡ　）または１０μＭ（８〜１６μＭ
）Ｗｒｔ、ポリマーの一定虚度におけるその存在におい
て、ボーラログラフイした。第７図に示したＤＰＰプロ
ットにより示される如＜、０．１３７　Ｍ−Ｎａ　Ｃ！
１０４中の：１　［１ｍＭ　：ｌｌ：Ｉミニン酸はｉｏ
ＯμＭ−Ａ’ｌの程度で結合することが認められて、こ
のアルミニウム濃度まで遊離金属イオンは混合物中に何
も存在しないと認められた。コロミニン酸希釈データー
は遊！１ｆＩＡ１データーに関し若干逸れン示している
ので、アルミニウムの第２の結合が示唆され、その範囲
は２つの曲線の傾斜（誘導体）の差により与えられる。

非緩衝化溶液においては、−はアルミニウムの加水分解
およびコロミニン酸の陽子転位平衡により制御された。

背景溶液の−が８．７２１であるのに対し、１ｍＭにお
ける硫酸アルミニウムはＰＨＹ４．１９１に減少させた
。−はついで１２５　ｎＭ　−Ａ１□（＋９０４）３に
おける希釈で指数的に４．８５７に増加した。コロミニ
ン酸はｌ　ｍＭ　（ｗｒｔ、　ＮＡＨＡ　）においてｐ
Ｈ６，７３９Ｙ与え、それは希釈で１２５ｎＭ（ｗｒｔ
、ＮＡＮＡ　）において６．７８４に非常に僅かに増加
した。各々１ｍＭ　（多糖体（ｗｒｔ、　ＮＡＮＡ　）
足すアルミニウム■〕の等モル混合物は、ＦＪ（３，９
２７を与えた。これは、コロミニン酸による増加した陽
子解離がアルミニウム結合から生じること（たとえば、
ヒドロキシル陽子の放出が金属−酸素結４合χ形成）、
あるいは非緩衝化混合物の酸性化がアルミニウムの少数
派種を結合する結果としてアルミニウムの加水分解から
生じることン示唆する。

（１：＋ｌＮＭＲ測定 １３０　ｎ、ｍ、ｒ、は、Ａｌ　（ＩＩＩ）が主にカル
ボキシレート基において複合体化するが、他の相互作用
が存在し、そしていくつかのゆっくりした交換種が水溶
夜中に存在することを示した。

（Ｃ）　　対向免疫電気泳動測定 Ａ１３＋の存在（１０−’、１０−４および１０−５Ｍ
）および不存在における時間の函数としてのＭＰＳ　（
Ｂ　）の溶液における持続性を対向免疫電気泳動（ｐＨ
４，０抗血清：家兎τメニンイ旦、ＢＳ、７７．１）に
より追跡した。結果を第８図に示す。観察されたＭＰＳ
　（Ｂ　）の安定化は、金属イオンとシアル酸繰返し単
位との複合体化の証拠であるＡ１３＋の存在である。

例　　Ａ 群Ｂおよび型６髄膜炎菌抗原のそれぞれに対し誘導され
た抗体の水準Ｙ、例乙の方法により製造明細書の浄書（
内容に変更なし） したアルミニウム結合複合体での第２の免疫の７日後に
マウスで測定した。マウスに、以下に指示する試験製剤
および対照製剤を腹腔内注射した。

免疫の７日後に１マウスから個々に採血した。

抗体水準を、精製した群Ｂ髄膜炎菌多糖体で感作したプ
レート中の固体層放射免疫検定により、血清のμ？／ｄ
として決定した。この方法において、マイクロタイター
軟プレートをポリＬ−リジン（シグマ、１００μ？／ｄ
）で前処理し、そして多糖体で感作した。多糖体とのイ
ンキュベーションの後、ウェルな計数し、そして計数値
と血清希釈の１０ｇ２との間の直線関係が得られた。血
清の”／ｓｏ希釈における外挿値を標準の直線関係と比
較した。

各々の場合における試験製剤および対照層剤は、次の如
く製造した： 製剤番号　　　　　　　　注　射　溶　液１）Ｂ６複合
体１０　ｐ’？、５％乳ｓｔ、０−０１　Ｍ　Ｎａ３Ｐ
Ｏ４Ｆ）１７．４　（０，５ｍ　）明細書の浄己（内容
に変更なし） 腹腔内 ２）５％乳糖、Ｑ、Ｑ　１Ｍ　Ｎａ３ＰＯ４ｐｌ（７，
４（０，５ｆｆｉｌ）腹腔内 ３）　　　　　　例６の溶液（０，５ｄ）腹腔内４）５
％乳糖、０．ＯＩ　Ｍ　Ｎａ３ＰＯ４ｐＨ７，４，０，
００１Ｍ　Ａ１２（８０４）３（０，５ｄ）腹腔内 各製剤に対する群Ｂ抗原について対応する抗体を、次表
忙示す。

製剤番号　　　　　血清中の抗−Ｂ応答μＶ１１１１抗
体（標準誤差） １）　　　　　　　　　１．６　　　（１，３８）２）
　　　　　　　　　０．４９　　（１，０４＞３）　　
　　　　　　　３．９２　　（１，１６）４）　　　　
　　　　　０．６５　　（１，２０）明細書の浄書（内
容に変更なし）　　特開昭６ｌ−１８ｔｉ３２８（１４
）上記例７で製造された複合体を、雌ＣＢＡマウス１群
５匹で、上記と同様な方法で試験した。個々の採血は免
液の７日後に行い、そして抗−Ｂ抗体血清水準を固体層
放射免疫検定により決定した。

各々の場合における試験製剤および対照製剤は、次の如
（製造した： １）　　　　　　Ｂ６複合体１０μ？、５％乳糖、０．
０１　Ｍ　Ｎａ３ＰＯ４ｐＨ７，２（０−２ｍ　）腹腔
内 ２）　　　　　　例６の溶液（０，２ｄ）腹腔内３）　
　　　　　例７の溶液（０，２ｄ）腹腔内結果 製剤番号　抗体応答（μ？〜）　　　統計的有意差１）
　　　　　４．３３　（１，１６）２）　　　　　７．
２９　（１，２４）　　　ｐ　＜　０．０５３）　　　
　　７．７６　（１，２７）　　　ｐ＜　０．０２５明
ｇ１言の浄ビ（内容に変更なしン ＊即ち、同じものにより掛算または割算する例Ｂ 例６．９および１０から得られた精製複合体を各々水性
滅菌リン酸ナトリウム（０，０１Ｍ、ｐＨ７，２）　Ｋ
　１．Ｏｍ９／　ｔｘｌとして分散した。生成した溶液
に、乳８５０■／ｄを攪拌しつつ加えた。溶液をついで
凍結乾燥し、そして使用するまで一２０℃で貯蔵した。

再構成は、融解した後、滅菌パイロジエン不含水中でも
との容量の溶液にすることにより達成した。

【図面の簡単な説明】

第１図は粗Ｂ６複合体のクロマトグラフィ溶出曲線を示
し；第２図は粗Ｂ２複合体のクロマトグラフィ溶出曲線
を示し；第３図は精製Ｂ６複合体の再クロマトグラフィ
溶出曲線を示し；第４図は精製Ｂ２複合体の再クロマト
グラフィ溶出曲線を示し；第５図は粒子構造を示す写真
であって、Ｂ２およびＢ６複合体の電気泳動図であり；
第６図はアルミニウムヨー複合体およびＭＰＳ　（Ｂ　
）の再クロマトグラフィ溶出曲線を示し、：第７図はＡ
１３＋のポーラログラフイを示し；そして第８図はＭＰ
Ｓ（Ｂ）の対向免疫電気泳動図である。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）細菌莢膜多糖体成分がシアル酸であることを特徴
   とする、金属成分および細菌莢膜多糖体成分からなる複
   合体。
2. （２）細菌莢膜多糖体成分がコロミニン酸または￥ナイ
   セリア￥・￥メニンギチジス￥の血清群Ｂに特異な莢膜
   多糖体であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項
   に従う複合体。
3. （３）該細菌多糖体成分が該金属成分そしてまた細菌外
   膜蛋白質からなる他の成分で複合体化されていることを
   特徴とする、特許請求の範囲第１項または第２項に従う
   複合体。
4. （４）金属成分がアルミニウムまたはルテニウムからな
   ることを特徴とする、特許請求の範囲上記各項のいずれ
   かに従う複合体。
5. （５）金属成分が随意に他の無機イオンと一緒でイオン
   形において存在することを特徴とする、特許請求の範囲
   上記各項のいずれかに従う複合体。
6. （６）複合体が少なくとも２×１０＾７の明らかな分子
   量を有することを特徴とする、特許請求の範囲上記各項
   のいずれかに従う複合体。
7. （７）金属成分がアルミニウムからなり、そしてシアル
   酸対アルミニウムの比率が１：０，３ｗ／ｗ以上である
   ことを特徴とする、特許請求の範囲上記各項のいずれか
   に従う複合体。
8. （８）金属成分および細菌莢膜多糖体成分がシアル酸を
   含有するものである細菌莢膜多糖体成分からなる複合体
   の製造法において、シアル酸を含有する細菌莢膜多糖体
   および金属を組合せにもっていくことを特徴とする方法
   。
9. （９）金属との組合せにもっていくのに先立ち、細菌莢
   膜多糖体が細菌外膜蛋白質との複合体の形におけるもの
   であることを特徴とする、特許請求の範囲第８項に従う
   方法。
10. （１０）そのための少くとも１種のアジュバンドおよび
    （または）担体と一緒での特許請求の範囲第１項〜第７
    項のいずれかに従う複合体からなることを特徴とするワ
    クチン製剤。
11. （１１）哺乳動物の細菌性疾病の予防または治療法にお
    ける使用のための特許請求の範囲第１項〜第７項のいず
    れかに従う複合体または第１０項に従うワクチン製剤。
12. （１２）哺乳動物が人間である、特許請求の範囲第１１
    項に従う複合体またはワクチン製剤。
13. （１３）細菌性疾病が脳を髄膜炎である、特許請求の範
    囲第１１項または第１２項に従う複合体またはワクチン
    製剤。