JPH0662432B2 - 複数株の腺毛菌による感染症の単一株ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 何年も前から或る種の微生物に腺毛が存在することは観
察されており、かゝる腺毛を初めて分離した報告は1959
年にネイチヤー誌（Ｎature）183号、pp782〜786にブリ
ントンにより行われた。それ以来多くの腺毛を有する微
生物が発見されている。例として以下をあげる。

ナイセリア ゴノリア （淋菌） エスケリキア コリ （大腸菌） シユードモナス アエルギノサ （緑濃菌） ナイセリア メニンジヤイテイデイス ラクタミカ（髄
膜炎菌） プロテウス ヴアルガリス （プロテウス属尋常
変形菌） モラクセラ 属 （モラクセラ属） ビブリス コレラ （コレラ菌） サルモネラ属 （サルモネラ属） ボルダテラ ペルタシス （百日咳菌） ヲラボバクテリウム 属 （フラボバクテリウ
ム属） クレブシエラ属 （クレブシエラ属） セラシア属 （セラシア属） エンテロバクター属 （エンテロバクター
属） コリバクテリウム ジフテリア （ジフテリア菌） コリネバクテリウム レナーレ （牛腎盂腎炎菌） アクテイネオバクター属 （放腺菌） フラボバクテリウム属 （フラボバクテリウ
ム属） アエロモナス属 （アエロモナス属） シゲラ フレツキシネリ （赤痢菌） 上記の微生物の腺毛は細胞や細胞残屑から分離すること
が出来、免疫応答機構に注射すると腺毛材料に対する抗
体を生成する様な腺毛材料を提供するものである。

現在迄の所免疫学上交差反応を生じる腺毛を有する微生
物の特定のグループの構成員の免疫学的な関係は解明さ
れていない。各株について特有の固有決定子又は決定群
の存在や共通の抗源因子の存在があるのではないかと考
える理由があるが、現在迄の所この関係の性質について
は解明は行われていない。

免疫学的に交差反応が可能な腺毛を有する菌のグループ
の構成員の間に、定義づけが容易な上位、下位関係分類
を行うことが出来る旨が発見されている。即ち、菌が腺
毛を有しており、その腺毛を分離、精製、利用して該腺
毛に対する抗体を含む抗血清を産生できるものとして分
類出来るという事である。本研究においてかゝる免疫学
上交差反応を生じるグループ内では、第一の株の抗血清
と第二の株の腺毛との間の交差反応の度合は、該第二の
株の腺毛に対する抗血清と該第一の株に対する抗体を生
じる腺毛との間の交差反応の度合とは同じではないとい
う驚くべき事実を見出した。

この驚くべき相違により明確な順位をつけることの出来
る免疫学的グループの構成の仕方が発見された。

この方法の実施にあたつては腺毛を有する菌グループの
腺毛から細胞材料と細胞屑を除去して製生する。腺毛を
次に、例えばマウスや兎の如き免疫応答生体に与え、該
腺毛に対する抗体を含む該腺毛に対する抗血清を通常の
やり方で分離する。

公知の交差反応実験、例えばELISAテストを腺毛と抗血
清について実施する。適当にはこれらの結果をマトリツ
クスの形式で表にするが、縦には抗血清を、横には、対
応する腺毛を記入する。かゝる分類によつて特定の腺毛
とこれに対応する抗血清との同種反応を対角線上に読み
取ることが出来る。対角線上の数字は同じ所定の値に標
準化し、これに従って各抗血清に対する非対応腺毛全て
について対応する力価を調整する。その結果を示す表は
段階的関係を示す。

この標準化表を上位から順に書き直すと、抗血清と腺毛
の力価の間に著しく且つ首尾一貫した非対称が存在する
ことが明らかとなる。より上位の株の腺毛とより下位の
株の腺毛の間に得られる力価は該上位株の腺毛と該下位
株の腺毛に対する抗血清の間に得られた力価より常に大
きい。この関係は免疫学的に関連する腺毛の科内でも存
在する。

この驚くべき結果から得た結論は、かゝるグループ内で
は上位の菌が分類中同位又は下位にある全ての微生物に
対して免疫応答を与える免疫因子を含み、従つてこれか
ら発生する感染症に対する予防ワクチンを提供出来ると
いうものである。逆に言えば、最下位の菌は分類上それ
より上位にある全ての菌に共通の要因を含むものであ
り、従つて最下位の菌をこれより上位の科に属する抗体
を検出する目的で使用することが出来る。

実 験 実施例Ｉ 微生物増殖方法−一般 メニンゴコツカス（髄膜炎菌）を通常の方法でＧＣ寒天
培地(Difco)＋１０％DSF（規定の鉄補足物、３１％グル
コース溶液、0.78％Ｌ(+)−グルタミン、0.039％硝酸第
二鉄）と1.5×10^-5％チアミンピロ燐酸（Ｂrinton等、1
978）上で増殖させた。

腺毛産生のためメニンゴコツカスを増殖させる場合、上
述した補足ＧＣ寒天培地からチアミンピロ燐酸を省いた
培地の上に菌を接種した。約500mlの培地を滅菌アルミ
ニウム製ふたつきの３９cm×２６cm×２．３cmの滅菌ア
ルミニウム・トレイに流しこんだ。トレイの接種材料は
ペトリ皿から採取した２０時間から２４時間増殖させた
所望のメニンゴコツカスのコロニイを０．７％カサミノ
酸(Difco)と0.02％チアミンピロ燐酸に懸濁させ、１ト
レイ当り約１０９細胞の細胞密度で長い把手つきのガラ
ス製延展機でＧＣ寒天表面に延展して製造した、ペトリ
皿には四象限の各々に所望タイプのコロニイを５から１
０個接種した。接種材料、産生皿共に８０％湿度−５％
二酸化炭素インキユベータ（フオルマ・サイエンテイフ
イツク社）内で３５℃で２０時間から２４時間にわたつ
て培養した。

実施例II 腺毛精製 上述した方法でメニンゴコツカスを増殖させた。約２０
時間から２４時間培養した後、採取、処理した。処理方
法は厳密には株によつて違い、全てのメニンゴコツカス
に適用可能な一般腺毛精製方法はない。しかしながら、
以下に記載の精製方法は全て、或る溶剤条件下では腺毛
杆が縦方向の集合体（パラクリスタル、グリントン、19
65）を形成し、別の条件下では集合体はほぐれるという
強い傾向を有する事実を利用している。

a)Ｎ．メニンジヤタイデイス（髄膜炎菌）ATCC 13090 寒天表面を３HCl緩衝食塩水0.05Ｍ、pH９．０少量で洗
滌してメニンゴコツカスを採集した。それから懸濁増殖
菌を真空フラスコ内へ吸引した。トレイの増殖菌は全て
プールした。ソルヴオール社のオムニミキサー４５０ml
入りカツプで２００mlずつ２分間4000 r.p.m.で懸濁液
を混合して後、細胞を３０分間13,000ｇの遠心分離にか
けて除去した。上澄み液を更に１時間23,000ｇで清澄さ
せ、前回の遠心分離工程での細胞ペレツトを再抽出し
た。二種類の上澄み液をあわせてpH６．８の１５×０．
１Ｍ燐酸緩衝液を２度変えて透析した。腺毛集合体の結
晶化は透析用サツク内で流動複屈折の渦を生じた時明ら
かとなる。集合体は１時間13,000ｇで遠心分離にかけて
除去し、上澄み液を廃棄した。ペレツトを約４５分にわ
たり磁性かく拌を行いながらライツ暗視野顕微鏡下で32
0×の培率で観察した時極くわずか又は全然結晶がみえ
ないような極少量の３HCl緩衝食塩水内で再懸濁した。
溶液はそれから１時間にわたり23,000ｇで清澄した。ペ
レツトを廃棄し、上澄み液をpH９．０の０．１Ｍ燐酸緩
衝液を使用して透析した。通常は溶融化、結晶化のサイ
クルを４回から５回繰り返すだけでSDS−PAGEで判定さ
れる可成り純すいの精製品を得ることが出来た。精製し
た腺毛クリスタルは集合体の状態で0.02％アジ化ナトリ
ウムで貯蔵した。

b)Ｎ．メニンジヤイタイデイス NRC 1597 ATCC 13090の場合の精製方法の採取方法、混合、遠心分
離の速度、持続時間と同じ様にしたが以下の通りの変更
を加えた。採取緩衝液、pH６．８の0.02Ｍ燐酸緩衝食塩
水、結晶化条件、０．１MMg⁺⁺へ４ＭMgCl₂原液を添加；
溶解用緩衝液、pH６．８の0.03Ｍ燐酸緩衝食塩水。

c)Ｎ．メニンジヤイタイデイス NRC 1667 細胞をpH６．８の燐酸緩衝食塩水で増殖採取した。懸濁
液を２００mlずつ4000 r.p.m.で２分間混合した。13,0
00ｇ×30分回転させて得た上澄み液を更に１時間にわた
つて23,000ｇで遠心分離にかけ清澄した。固体の硫酸デ
キストランナトリウム2000（フマルマシア）を溶液に加
え最終濃度を１％とした。４℃で１時間放置して後、溶
液１ml当り３Ｍ原液KClを0.15ml添加し、デキストラン
硫酸塩を析出した。濁つた懸濁液を低速（2000ｇで１５
分）と高速（23,000ｇで１時間）で遠心分離した。その
結果得た上澄み液をPEG−6000の５％濃度に調整した。
結晶が直ちに出現したが、結晶化作用を数時間にわたつ
て進行させた。それから13,000ｇで１時間遠心分離にか
けて結晶を採取し、極少量の緩衝液に再溶解し、23,000
ｇで１時間処理して清澄化した。このサイクルを２度繰
り返した後は、製剤はSDS−PAGEで判断したところ全く
まじり気がなかつた。しかしながらUV吸光光度法では核
酸の存在が明らかとなつた。混入した核酸を除去するた
め、調製用CsCl密度こう配平衡遠心分離を行つた。実験
の最後に遠心分離用チユーブの底に穴をあけて分画を採
取した、1.32gm／cc密度での蛋白ピークのまわりの分画
をプールし、pH６．８の燐酸緩衝食塩水を数回換えて透
析し、３％PEG濃度で再結晶化した。精製腺毛を0.02％
アジ化ナトリウムpH６．８の燐酸緩衝食塩水内に貯蔵し
た。

その後行つた研究によればナトリウムデキストランによ
る一時分画は結晶化の前に溶液を０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムに調整すれば省略してもよい。

d)Ｎ．メニンジアイタイデイス NRC 1700 ATCC 13090、NRC 1597メニンゴコツカス腺毛の産生の場
合と同じ採取、混合、遠心分離工程を使用した。緩衝シ
ステムは淋金腺毛産生方法と同じであつた。採取、溶解
緩衝液はpH10.5の0.63モノエタノールアミン塩化水素を
使用した、結晶化緩衝液は１０％飽和硫酸アンモニウム
と１．７％PEG−6000を含有する。

実施例III 密度勾配平衡遠心法 本研究では二種類のCsCl密度遠心法を使用した。分析法
と調整法である。

腺毛蛋白の浮力密度を測定するため分析法を実施した。
約０．７mgの腺毛蛋白をpH９．０の３−HCl緩衝食塩水
に溶解した。固体のCsClを溶液に加え溶液の平均濃度が
約１．３gm／mlとなる様にした。その後溶液はSW 41 Ti
ローターで４℃で35,000 r.p.m.、40時間にわたつて遠
心分離にかけた。操作の終りに遠心分離用チユーブの底
に穴を開け、分画を一滴ずつ集めた。ツアイス・アベ式
屈折計を使用して室温での屈折率を測定し、各分画の蛋
白含有量を蛋白−染料結合アツセイ又は280nmでの吸収
により測定した。４℃での蛋白ピーク濃度を国際臨界表
（Ｉnternational Ｃritical Ｔables）（第３巻第94ペ
ージ1928）のデータに基いて作製した屈折率−CsCl密度
換算表から推定した。

実施例IV 調整密度勾配平衡 調製CsCl密度遠心法をNRC 1667メニンゴコツカス腺毛の
精製における中間手段として行つた。CsClの前もつて形
成した６段階勾配を使つた。各段階ではCsCl３．０mlを
含み密度は1.18gm／ccから1.28gm／cc1.18、（1.20、1.
22、1.24、1.26、1.28）であつた。遠心分離用管１本当
り１９ml迄の部分的に精製した腺毛溶液を処理すること
が可能であつた。溶液をSW 27ローターに入れ４℃で速
度22,000 r.p.m.、４０時間にわたつてスピンした。分
画の採取、アツセイは分析遠心法の場合と同様であつ
た。

実施例V 抗原と抗血清の生成 抗血清の生成にまじりけのない腺毛を使用するため、生
成メニンゴコツカス腺毛をCsCl密度勾配遠心法の最終精
製工程にかけた。この高品質精製品を体重３ポンドから
５ポンドのニユージーランドホワイトラビツトを前もつ
て採血した上で、首の背後に皮下注射で投与した。兎に
は腺毛とフロインド不完アジユバンド（デイフイコ社）
１：１の懸濁液中に約３００〜５００μｇの腺毛蛋白を
入れたものを投与した。注射は約１０日間の間隔をおい
て３度くりかえした。最後の注射の後で耳から採血し
た。

兎には麻酔をかけずに耳の中心動脈から採血した。耳の
後の毛をそり、皮膚をキシレンでこすり動脈を一時的に
拡張させた。血液を２５ゲージ針を装着した消毒済注射
器にとつたが、このやり方では１０〜２０mlの血液の採
取が可能であつた。

それから血液を滅菌遠心分離用管に移し、３０分間室温
で凝集させた。凝塊をくずして容器の壁面から除去し、
全試料を４℃で一晩冷蔵した。それからチユーブで4000
ｇで３０分スピンし、血清を除去した。

この抗血清製剤を少量ずつに分け、液体窒素で凍結し、
−２０℃で貯蔵した。

実施例VI エンザイム・リンクド・イムノソルベント・アツセイ 本アツセイの説明、結果の解釈についてはブリントン等
（1978）が詳細に論じている。第一の抗体は精製腺毛に
より免疫接種をうけた兎から得た。第二の抗体は山羊の
抗兎IgG（Ｌ鎖、Ｈ鎖）をワサビペロキシダーゼ（チヤ
ペル社）と結合させたものであつた。ヒトの血清をアツ
セイする時に山羊抗ヒトIgG配合体を使用した。

血清価を吸光度、希釈度から計算し、最後に血清対照群
と比較して標準化した。標準曲線は吸光度と、血清標準
をいく通りかで希釈して同種抗原と反応して得た比較血
清濃度と対比してかいたものである。０．１と１．０の
間の吸光度で計算した。報告された力価は２度の工程の
幾何学的平均であつた。全てのアツセイシリーズに標準
値を含めたのでテスト試薬中の変動による力価のばらつ
きがなくなつた。

兎の血清価の計算 兎の血清のELISA力価の兎の標準血清（抗GC３〜２）を
幾通りかに希釈して同種抗原（GC３−２腺毛）との反応
に基いた標準曲線から計算した。この血清は力価10,000
となる様に任意に決めた。

血清標準の一次線形回帰線から未知の血清の力価を得
た。これらの力価を希釈因子で乗じると、未希釈血清の
力価が得られた。

実施例VII メニンゴコツカス腺毛の免疫学上確認 1.メニンゴコツカス腺毛の抗原性 兎に腺毛抗原で高度免疫を与えたところ、エンザイム・
リンクド・イムソルベント・アツセイ（第１表）を使用
した抗血清内の特定抗体レベルの上昇がみられた。（第
１表） 2.メニンゴコツカス腺毛間の交差反応 第１ａ表では精製メニンゴコツカス腺毛に対する高度免
疫を有する兎の体内に生成した抗腺毛血清の同種と異種
のELISA力価を示す。可成りの交差反応がみられた。４
種のメニンゴコツカス腺毛間の交差反応は約20.1±２．
９（第２ｂ表）であつた。メニンゴコツカス腺毛につい
て左右非対称の交差反応がみられた。

3.他の菌体腺毛との交差反応 高度免疫を有する兎の抗メニンゴコツカス腺毛血清と他
の種類の菌体腺毛に対する抗血清との交差反応をテスト
した。第２ａ表により４種のメニンゴコツカスと４種の
ゴノリアに対する兎の体内に生成した抗血清の同種なら
びに異種のELISA力価を標準化したものを示す。

ここでテストした三種類の菌体腺毛の中では、ゴリノア
とメニンゴコツカス腺毛とが交差反応する抗体を有する
ことがわかつた。

メニンゴコツカスとゴノリア種の腺毛の平均交差反応は
各々12.8±２．４％と20.1±２．９％であつた。メニン
ゴコツカス菌とゴリノア菌腺毛の間の左右非対称交差反
応も同様にみられた。（グループ・データ、第２ｂ
表）。メニンゴコツカス腺毛に対するゴノリア腺毛抗血
清の平均標準化異種力価は約５．５±１．１％であり、
抗メニンゴコツカス腺毛血清の平均異種力価は約16.9±
２．３％であつた。

4.交差吸収実験 徹底的な吸収実験を行つてN.メニンジヤイテイデイスと
N.ゴリノアの腺毛が共通の抗原決定子を有することを確
認した。第３ａ表に異種にメニンゴコツカス腺毛で吸収
された腺毛抗血清のELISA力価を示し、第３ｂ表にゴノ
リア腺毛で吸収された同じ抗血清の力価を示す。抗腺毛
抗血清と異種のゴリノア腺毛との吸収は異種力価の大き
さを可成り減少させた。

実施例IX 腺毛ワクチンの最終精製物の一実施例としてN.メニンジ
ヤイテイデイス1597から腺毛ワクチンを精製する方法を
以下に記す。再結晶化した腺毛は、pH６．８・イオン強
度0.15の、腺毛結晶を溶解した燐隣緩衝食塩水で透析す
る。ワクチンは0.45ミクロンの純すい局所膜フイルター
を過して滅菌する。この様にして得た腺毛は米国連邦
食品薬品局応用生物学部の一般安全性、無菌性、発熱原
性基準に合格する品質を有する。

ワクチンは皮下又は皮内注射により非経口的に投与され
る。腺毛が固体であるので、薬学的に使用可能な懸濁剤
を使用してもよい。担体内の腺毛の濃度は重要ではな
い。唯一の条件としては腺毛を十分細かくわけて注射器
へ注入が可能であるという通常許容される基準に合致す
る懸濁物を提供することにある。懸濁剤１ml当り腺毛蛋
白０．１から２．０mg、好ましくは約１．０mgの濃度が
特に適当である。

ワクチン組成物を所定時間により一回以上に分服するの
が好ましい。この時間因子は注射をうけた被験者内に腺
毛に対する抗体の適当な力価を形成させる様に選択す
る。

ワクチン注射により局所的又は全身的毒性効果が生れる
わけではないので投与量の上限はない様である。しかし
ながら体重１kg当り腺毛１〜1000マイクログラム、適当
には各注射一回当り、体重１kg当り６０マイクログラム
を投与するのが適当であることが見出された。

上記の処理方法を利用して、N.メニンジヤイテイデイ
ス、N.ラクタミカより得た腺毛、特にN.メニンジヤイテ
イデイスより得た腺毛を利用して、同種である例えばN.
メニンジヤイテイデイスの感染症ばかりではなくN.ゴノ
リア感染症に対しても脊椎動物を保護することが出来
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｎ．メニンジャイティディス株ＡＴＣＣ１
   ３０９０，ＮＲＣ１５９７，ＮＲＣ１６６７またはＮＲ
   Ｃ１７００から選ばれた実質的に非ピリ細胞および細胞
   屑を含まず、かつ、実質的に純粋なピリを含むことを特
   徴とするＮ．メニンジャイティディスおよびＮ．ゴノリ
   アからなる群から選ばれた菌による感染症に対して有効
   なワクチン組成物。
2. 【請求項２】ピリ化Ｎ．メニンジャイティディス菌によ
   る感染症に対する保護ワクチンにおいて、薬学的に使用
   可能な担体と予めその他のＮ．メニンジャイティディス
   菌成分から単離されたワクチンピリと称する全Ｎ．メニ
   ンジャイティディスピリとを抗体レベルを該感染症の保
   護に十分なレベルにまで上昇させる量を含んでなり、こ
   こでワクチンピリが誘導されるピリ化微生物の全細胞と
   感染を発生させる微生物の全細胞は株ＡＴＣＣ１３０９
   ０，ＮＲＣ１５９７，ＮＲＣ１６６７およびＮＲＣ１７
   ００よりなる少なくとも１つから誘導された抗血清によ
   って凝集可能であることを特徴とするワクチン。
3. 【請求項３】該指定されたグループの株の１以上から誘
   導されたピリを含む特許請求の範囲第２項に記載のワク
   チン。