JPS58167517A - 免疫用グラム陰性菌トキソイド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 背景 ＡＤＰ−リボシル化トキシンの不活性化をホルムアルデ
ヒド及びグルターシしアルデヒド等の架橋剤を用いて検
討した。Ｃｒｙｚ等“シュードモナスアエルギノーサ（
Ｐ　ｓ　ｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　
トキシンＡに対するホルマリンのトキソイド化効果：生
物学的、化学的及び免疫化学的研究”（Ｅｆｆｅｃｔ　
ｏｆ　Ｆｏｒｍａｌｉｎｔｏｘｏｉｄｉｎｇ　ｏｎ　Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＴｏｘｉ
ｎ　Ａ　：　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ、　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｔｕｄ
ｉｅｓ　）　、　Ｉｎｆｅｃ　ａｎｄＩｍｍｕｎ　、　
３２巻、２号、７５９−７６８貝、１９８１年５月、は
そのようなトキソイドを記載している。成る種のそのよ
うなトキソイドについての２つの問題は、毒性型への転
換及び抗原性及び免疫原性の消失であった。そのような
トキソイドが毒性状態に戻る可能性があるために、これ
までそのようなトキソイドから人間の抗抑清を得ること
、或は活性ワクチンとして使用することが不可能であっ
た。

発明の概要 ピー、アエルキノーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　
）からのエキソトキシンＡの工うなＡＤＰ−リボシル化
トキシンは、ある種の光に不安定なアフィニティー試薬
によってトキソイドへ変換可能であるということが見出
された。この工程は非可逆的であり、トキソイドにもと
の毒素の抗原性及び免疫原性を保持している。

従って、このトキソイドはもとの毒素によってひきおこ
される特定の病気に対する免投原ド’を細菌のエンドト
キシンに対するワクチン、又はそれから調製した抗血清
と結合させ、ダラム陰性細菌に対してこれまで可能であ
ったよシも、よシ広範囲の保護憬能を付与することが可
能である。

本発明の１つの目的は、抗原性及び免疫原性を有し、毒
性状態に自発的に逆戻りしないＡＤＰ−リボシル化トキ
シンに由来する細菌トキソイドである。

本発明の他の１つの目的は、相当するトキシンを成る種
の光に不安定な親和性試薬（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｒｅａ
ｇｅｎｔ）と反応させることによってそのようなトキソ
イドを生産する方法に関するものである。

更にもう１つの本発明の目的は、ピー、アエルキノーサ
（Ｐａ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）からの特定のトキソ
イドを成る種のエンドトキシンワクチンと結合すること
である。このワクチンは咄乳動物に於て抗血清を綽導す
るために使用することが可能である。それから得た免疫
グロブリンは、急性のグラム陰性凶による敗血症を恢法
学的に治療するために、或は予防的に使用することが可
能であり、ビー、アエルキノーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉ
ｎｏｓａ　）細菌の場合には、この最も恐ろしい敗血症
を予防し、治療する助けとなる。別法として、本ワクチ
ンは免疫を活性化することによってこれらの感染を予防
するために使用することが可能である。

発明の詳細な記載 本発明で使用し得るＡＤＰ−リボシル化トキシンは、当
業界に於てＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性及
びＮＡＤ−グリコヒドロラーゼ活性を示すトキシン類で
ある。これらには、シュードモナスアエロキノーサ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの
エキソトキシン−Ａ１大腸凶（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　Ａ
ＴＣＣ３１３６１からの熱不安雉な（ＬＴ）エンテロト
キシン、ビブリオ　コレラ°（Ｖｉｂｒｉ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ　）　ＡＴＣＣ１４０３５からのコレ
ラエンテロトキシン、及びグラム陰性細困のｍ　Ｏには
、コリネバクテリウムジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ　　）　　Ａ
ＴＣＣ１９４０９からのエキソトキシンが含まれる。

これらのトキシンはすべて既知のものである。

工：、アエルギノーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　
）は、ダラム陰性細菌に共通なエンドトキシンだけでな
くエキソトキシンーＡと呼ばれるエキソトキシンも産生
ずる。このエキソトキシンは分子量約７０，０００の蛋
白質であり、細胞内に於てはＮＡＤに対する基質特異性
を有する酵素として作用、シ、エロンゲーションファク
ター２のＡＤＰ−リボシル化作用、これによって標的細
胞内での蛋白質合成を不可逆的に阻害するが、によって
その毒作用を発現する。本発明のトキソイドは酵素活性
が著しく減少しているが（つまり無毒である）、商い抗
原性及び抗免疫性を有する。この物質は哺乳類に於ける
抗体を高めるために使用さ扛る。生成した免疫プラズマ
は単価の、或はエンドトキシンに対する一般的な抗原に
苅して活性を強めた免疫血漿（又はそれから単離した抗
体）と併用して、ダラム陰性敗血症に対する２価の免疫
治療又は予防剤として使用される。

当該トキソイドをキーホールアオガイヘモシアニンのよ
うな蛋白に結合させることによシ、トキソイドの免疫応
答を高めることも本発明の範囲内に入る。

本発明の拳法に於ては、好ましくは水溶液中、１：１０
０から１　：　１０，０００の範囲のモル比でエンドト
キシンｆ：元に不安定なアフィニティー試薬と混合する
。１：１３００の割合が良いことが見出されている。反
応試薬容器を０℃に保ち、容器内に不活性ガス（例えば
Ｎｚ）’（ｉ＝満すことによってエキソトキシン及びト
キソイドの分解は最少限に抑えられる。この混合物を有
効量の非−変性化元、例えばそのスペクトルのＵ、　Ｖ
、部分が殆んどない元、にあつる。元による活性化の後
で反応９Ｊ質を浴出カラムを通過させることなどによっ
て祠製する。

好ましい元に不安定なアフィニティー試薬に８−７ジド
アデノシンである。本発明の範囲内に含まれる他のもう
１つのものは、８−７ジドアデニンであり、これはかな
り効率的であることが見出されている。本発明の方法に
於て、８−７ジドアデニン又は８−７ジドアデノシンは
、光照射した時に璧素をＮ２の型で失い、不安定なニト
レン中間体ｍを形成する。次いで当該二トレン’１ＡＤ
Ｐ−リボシル化トキシンと結合させ新規トキソイド：各
各８−アテニルアミノトキシン及び８−アテノシルアミ
ノトキシン（Ｕ）を形成させる。

にトレン） 式中、ＲＨはＡＤＰ−リボシル化トキシンである。従っ
てこの複合体は構造的には次のように表すことができる
。

Ｈ ８−７デニルアミノ　トキシン 式中、ＲはＡＤＰ−リボシル化トキシン基である。例え
ば、ピー、アエルギノーサ（Ｐ。

ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ及び８−アシ
ドアデニンから調装した本発明のトキソイドは、８−７
デニルアミノ　ピー、アエルキノーシ、８−７ジドアデ
ノシンから調製したものある。

本発明は以下の調製法及び実施例を引用することによっ
て、更に定義されるが、以下の調製法及び実施例は例示
的なものであシ、本発明に制限を加えるものではない。

（ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡｉ調
製し、単離、精製することが可能である。

調製法ｌ。

ピー、アエルキノーサ（Ｐ＠　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　
）ａ、過剰のＤＥ−５２（ワットマンＤＥ−５２ジエチ
ルアミノエチルセルロース、予め膨潤させておいたもの
、乾繰谷菫 で６００−７００Ｗ１１）の２バツチを２倍量の水に懸
濁して放置する。水全除 いてから、ＤＥ−５２を再懸濁する。

第２回めの処理によって微粒の量が著 しく減少するのがわかる。もしこの現 象が観察されなかったならば、この操 作をもう１度くり返す。

ｂ、このＤＥ−５２のバッチを粗いガラスフィルターに
のせ、３２００ｒｎｌの０．５Ｎ　ＮａＯＨ、次いで３
２００−の水、３２００−の０．５　Ｎ　Ｈα、３２０
０ｔｎｌの水、３２００ｍＡの０．５　Ｎ　ＮａＯＨそ
して最後にｐｌ（が８以下になるまで水で洗う。

Ｃ１このＤＥ−５２を数倍答の０．０１ＭＮａα、０．
０１Ｍトリス緩衝液で洗う。

ｄ、洗浄したＤＥ−５２１００ｒｎｌｆ：用いてＫ　１
６／４０カラム・全調製し、このカラムを室温に於て流
速１．４ｍＡ／分で流す。このカラムを平衡になるまで ０、０５　Ｍ　Ｎａα、０．０１Ｍ１Ｍトリスルｓ、　
０で洗う（１ないし２日）。

段階２：セファデツクスＧ−７５カラムの調製 ａ、１３６ｇのＧ−７５（７アルマシア）を３ｔの０．
５　Ｍ　Ｎａα、０．１ＭトリスｐＨ８，０中で再加水
し、煮沸して脱気し、次いで一晩かけて４℃に冷却する
。

ｂ、ファルマシアに５０／１００カラムにＧ−７５（約
６ｈどを４℃で充填し、 ０．０２１重量／容量係のナトリウムアジドを含有する
緩衝液で洗う。

Ｃ０このカラムを２０ｒｎＡの緩衝液中の４０■のブル
ーデキストラン２０００　（ファルマシア）を用いて、
流速０．５ｍｌ／分、頭部圧３７ｃｒｎに調節し、７．
６−づつの分画として集めてチェックする。

Ｖｏは７１４ｍ（ベッド容量の４０係）であシ、権釈フ
ァクターは５．３であった。このカラムを４°Ｃで保存
する。

段階３：ヒドロキシルアパルタイト（ＨＴＰ）ａ、乾燥
容量１２０−１５０ｍ７！のヒドロキシルアパルタイト
（バイオ−ゲルＨＴＰ。

パイオーランド１３０−０４２０番） を２倍容の０．００５　Ｍ　ＮａＨｚＰＯ４、０，１Ｍ
Ｎａα、　ｐＨ８，Ｑ緩衝液に懸濁する。

ｂ、ファルマシアに２６／４０カラムを、４°Ｃ１流速
１．５ｍｌ／分に於てＨＴＰで充填し、緩衝液で洗う。

段階４：醗酵 ａ、トリブチカーゼソイブロス（バルチモアバイオロジ
カルラボラトリー（ＢＢＬ）Ｎα１１７６８）を、４０
０メツシユ以下のものを除いた６００ｇのキレツク ス１００のナトリウム型（パイオーラ ッド１４２−２８５２番）と５４００ ｄの水中（濃ｔｗｑ勿×１０）、５ないし６時間攪拌す
ることに工り脱鉄する。

次いでワットマンの１番のＦ紙で濾過 し、使用するまで凍結しておく。

ｂ、キレート処理した培地（上述の１）を、アミコン社
ＤＣ−３０システム中のＨ １０ＰＩＯ中空ファイバーカートリッ ジを通過させることによってダイヤフ ィルトレージョンした。この濃縮物蒸 溜硫中でｘｘ（６０ｔ）稀釈し、濾過 して４０１のＴＳＢ−Ｄを得る。この 培地のｐＨは７．０から７゜５、塩素イオン濃度は約０
．１モルであシ、濾過滅菌 （０，４５μｍ）する。この培地を４°Ｃで保存する。

Ｃ０醗酵前日に２ｔのＴＳＢ−Ｄ全無菌的に取シだす。

この１６００−に３７４ Ｉのグルタミン酸１ナトリウム塩、 ４００ｍ７！のグリセリンを加え、溶解するまで室温で
攪拌し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過し、酵
醗槽に烏 栄養培地として加え、最終良度がグル タミン酸１ナトリウム堰０．０５Ｍ１ １．０係のグリセリンとなるようにする。

無添加の残りの４００−の培地をシー ドフラスコ用に保存する。

トリブチツク　ソイ寒天斜面 ａ、４０．９のＴＳＡを１ｔの水中で１５分間膨潤させ
る。この混合物を１分間煮 沸し、一定量（１，２Ｘ１２（７）のネジブタ付き試験
管当り８ｔ７りを１５分間、１２１　”０．１５　ｐｓ
ｉでオートクレーブ滅菌し、次いで１５°の角度に維持
して長い斜面をつくる。

培地 ａ、ピー、アエルキノーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）ＰＡ−１０３株（ＡＴＣＣ２９２６０）＊の凍結保
存物から４本のＴＳＡ　（トリブチツクソイ寒天）斜面
に各１白金耳 づつ接種し、３７℃で１８ないし２０ 時間培養する。

＊この株はＡＴＣＣよシ取得した。こ の株はルイスビル大学のＰ、　Ｖ、　Ｌｉｕによって１
９７６年２月１７日ＡＴＣＣ に寄託されたものである。ＡＴＣＣによればこの株は現
在入手可能であり、少 なくとも西暦２００２年まで入手可能 の状態が継続される。

ｂ、　　４本の斜面全部の生育物を、合計４−の培地で
洗い流す。この懸濁液１−づ つを用いて、１００−の無添加ＴＳＢ −Ｄ培地を含む２５０ｍ１のコブ付きフラスコ４本に接
種する。これを３２± １＠　に於て毎分２５０回の回転で５ないし６時間振盪
培養する。

ｃ、４００−のシード全部を用いて４０１の添加ＴＳＢ
−Ｄ培地に接種する。酸 酢培地を０２で飽和させる。３２°±１゜Ｃで攪拌しな
がら培養を行い、この間 ｐｈ＋　（範囲７．０−８．０）、光学密度（別席状態
生育期まで）全監視し続け、溶 存酸素量を飽オロ量の２５係以下に保つ。

旅酵は１８−２４時間かかる。

ｄ、この細菌をモデルＫｌ遠心分離機（工レフトロ一二
ュークレオニックス）ヲ 用いた遠心分離にＬ９除去し、上清液 を予備−濾過し、濾過滅菌（０，４５μｍ）する。

段階５：濃縮 ａ、ＨＩＯＰＩＯカートリッジを備えたアミコンＤＣ−
１０中空ファイバーシス テムを用いて上清液の容量を、ダイア フィルトレージョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に
よって４０１から３ないし４ｔに減 らす。

ｂ、保持された液に冷水を加えて１５ｔにし、ｐｌＩを
７．０から７．５、塩素イオン濃度が０．０２Ｍとなる
ようにする。もしα−の＠度が十分に減少しなかったな らば、許容範囲の濃度となるまでダイ アフィルトレージョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）
を続ける。

段階５：ＤＥ−５２バッチ分画 、・・　　　ａ、２ｔの洗浄したＤＥ−５２を怖釈した
保持液に加えてうすめ、室温で約２時 間、ｐＨを８．０に維持しながら撹拌する。

ｐＨが安定化したら、この懸濁液を４°Ｃに冷却し、−
晩装置する。

ｂ、約１４ｔから１５ｔの上清液をサイフオンで除き、
残ったセルロースヲ２．５ｔのガラスフィルター上に注
ぐ。減圧 して残った液体を除去し、湿ったセル ロースを得る。

Ｃ０このセルロースを濾過法によって、２．５ｔの０．
　ＯＩ　Ｍ　Ｎａα、０．０１Ｍ１Ｍトリスル８．０　
；　０．０５　ＭＮａα、０．０１Ｍトリスｐｔｔ　ｓ
、　ｏ　；及び０．２５　Ｍ　Ｎａα。

０．０１Ｍ１Ｍトリスルｓ、　ｏで洗う。このセルロー
スを廃棄する。

ｄ、下記の酵素検定法を行い、更に′ｔＲ製を進めるに
先立って毒素が０．２５　Ｍ　Ｎａα画分にあることを
確認する。

ｅ、　　０．２５　Ｍ　Ｎａα活性画分に、ｐｌｉ　ｆ
　８に維持しながら固体の硫安を加えて７０壬 飽和とし、沈澱させる。活性画分を一 晩放置し、沈ｐｊＬを完全にする。

し 段階７：Ｇ−７５脱塩 ａ、この沈澱画分を良く混合し、懸濁液の約１／３を除
去する。残りは４℃に保 存する。

ｂ、一部を４℃に於て１６，０ＯＯＸ、９で２０分間遠
心分離しくツルバールＲＣ ５Ｂ、ＧＳＡローター、１０，０００回転／分）、上清
液をすてる。

Ｃ，ペレット−ｉｏ、０２１のナトリウムアジドを含有
する３０ｍ１のＱ、　５　Ｍ　ＮａＣｇ　。

０．１Ｍトリスｐ＋ｌ　８．０緩衝液中にゆるやかに再
懸濁する。これを４°０．１７，０００×９で５分間遠
心分離して透明化する。

次いで予備濾過しく０．８μｍ　）次いで濾過滅菌（０
，４５μｍ　）する。

ｄ、この試料をＧ−７５のカラムにより１．５ｍｌ／分
の流速でクロマトグラフィーを行い、７．５−づつの分
画として集める。各分画を向流免疫′醒気泳動（ハイラ
ンドＣＥＰサプライパッケージ、 ハイランドラボラトリ−）によって毒 素の検定を行い、毒素を含有する自分 を集める。免疫電気泳動は、毒素に対 する１価特異的な馬の抗血清を用いて 使った（段階９−ｂ参照）。

ｅ、集めた両分を硫安の８０壬飽第１１．ｐＨ８によっ
て沈澱させ、４℃で保存する。

ｆ、残シのＤＥ−５２画分について段階ａからｅをもう
２回くり返す。次いで沈 澱を集める。

段階８：ＨＴＰ分画 ａ、Ｇ−７５の沈澱画分を上述したように遠心分離によ
って集める。

ｂ、ペレットを２０−の０．００５　Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ
４。

０、１　Ｍ　Ｎａαｐ）Ｉ　７．　Ｏの初発緩個液にゆ
るやかに溶かし、２ｔのｋ　ｆｉｉｉｉ　ｍに対して４
℃で一晩透栢する。

Ｃ１この試料をヒドロキシルアパルタイトバイオ−ゲル
ＨＴＰ　（パイオーラッド）カラムにより、流速１．５
ｍ／分、３ベツト容の０．１　Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４、０
，１Ｍ　Ｎａαｐｉｔ　７．０を用いてクロマトグラフ
ィーを行う。２８０　ｎｍの光学密度（０，Ｄ、）をベ
ックマン分光計モデル２６で測定 する。次の段階に移る。前にこのカラムから吸収を示さ
ない物質が完全に溶出 される。

ｄ、緩衝液を０．０６　Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４ｙ　０．　
Ｉ　ＭＮａＣｔｐＨ７，０に変え、７ｆｎｌうつの分画
として集める。０．Ｄ、ピークをＣＩＥによって検足す
る。

ｅ・　毒素画分を集め、飽和硫安に対し４°Ｃで一晩透
析することによって沈澱させ る。

１ｉ階ｇ：ＤＥ−５２勾配分画 ａ、　　４°Ｃに於て、１２，０００：）ｌ、１０分間
の遠心分離（ツルバール５８３４０ −ター、ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ回転／分）に工つて沈澱を
集める。次いでこれを５−の ０、０５　Ｍ　ＮａＣｔｘ　　Ｏ，ＯＩ　Ｍ　トリス１
口８．０（初発緩衝液）にゆるやかに再懸濁し、２０℃
に於て１ｔの初発緩衝液に対し て１８ないし２４時間透析する。

ｂ、０．０１Ｍ１Ｍトリスルｓ、　０中の０．０５Ｍか
う０．５　Ｍ　Ｎａαの直線グラジェントｌｔによって
ＤＥ−５２のクロマトグラフ ィーを行う。流速１．４ｍ／分で２．５−づつの分画を
集める。毒素のピーク （０，Ｄ、２８０ｎｒｎ）は約０．１５ＭＣ／！−付近
で浴出される。これを１価特異的 な馬抗血清を用い、免疫電気泳動 （ＣＩＥ）’ｋ　３０　ｍＡで６０分間行うことによシ
検定し、集めるべき自分を決 定する。

Ｃ０集めた画分のＯ，Ｄ、２８０ｎｍｉ測定し、蛋白濃
度を以下の式により計算す る： （１１溶液””２８０　ｎｍ　＝　”　”−５−］ｄ、
　　６−の容器に一部２５−を入れ、−７０°Ｃで保存
する。

次いで梢製したエキソトキシンＡを用いて、実施例１の
ピー、アエルギノーサ（Ｐ。

ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　トキソイドを調製する。

実施例１ ピー、アエルギノーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　
）トキソイドの調製 １２１ｒｕ／の一アジドアデノシン（Ｈｏｌｍｅａ等、
Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ、　８７巻、１７７２
頁（１９６５年）に従って調製）に１０ｒｎｌのｐＨ７
，４の緩衝液（９，５ミリモル　リン酸塩、１４０ミリ
モルＮａα）を加え、大部分が溶けるまで、つまり飽オ
■溶液となるまで振盪する。この懸濁液をカラスフィル
ターを通して濾過し、Ｐｇの濃度を紫外吸収スペクトル
で決定する。１１７５液を上述のｐＨ７，４のリン酸緩
衝液で１ないし５０倍にうすめ、λｒｎａｘ　２８２　
（ε＝１４，５００）によって矩量する。８−７ジドア
デノシンの濃度は２．９Ｘ１０３モルである。この浴液
７、５１１！７！を調製方法ｌからのピー、アエルギノ
ーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏａａ　）エキソトキシン
Ａ７、５　ｒｌｌｌと混合する。アジド化合物の毒素に
対する最終モル比は１３００：１である。

この溶液を、ポンプで氷水を通じているジャケットで取
シ囲んでいる１２−のパイレックス反応器内に入れる（
　２　Ｘ　７．５　ｒｎｌバッチ）。

照射する前に反応容器を血清キャップで栓をする。この
キャップを通して皮下注射針を差し込み、次いで容器内
の空気を除去し、璧累を導入する。容器から４インチ離
したところにおいた４５０Ｗのハノビア中圧ランプ（６
７９４０３６０）によって、冷却しながら光分解を進行
させる。

次いでこの溶液を６本のセファデックスＰＤＩＯカラム
（２，５−づつ添加し、３．５ｍ７！のｐｎ　７．４の
緩衝液で浴出）を通過させることによって脱塩する。溶
出液を６０ｃｍの東洋ソーダモレキュラーシーブカラム
金相いた尚速液体クロマトグラフィーによって’Ｈ’ｉ
ｔ　Ｔる。

この物質（８−７デノシルアミノ　ピー、アエルキノー
サ（Ｐａ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）エキソトキシンＡ
）は約６８，０００ダルトンの単一ピークであることが
判明し、ピーク面積によって決定した量は約５５±μ９
／ｍｌに相当した（純粋の毒素を基準とする）。比色蛋
白検定法によっても同じ値が得られた。

実施例２ 毒性の検定 実施例１で調製したエキソトキソイドを、細胞毒性、モ
ルモット反慮反応及び酵素活性についてエキソトキシン
Ａと比較した。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　の微量細胞毒性検定に於ては、我
々の研９ｅ室で継続的に維持している細胞ラインからの
マウスの線維芽砒胞又はＬ細胞を使用した。微量培養中
で生育しているこれらのし細胞を、ナノグラム蓋の精製
したエキソトキシンで処理した場合、顕微鏡的にこれら
の細胞が死亡したという証拠（つまシ、正常組織構造の
消失、パ球形成”及びプラスチック表面に対する付着性
の消失）が得られた。

これらの可視的な細胞毒性による変化は、青紫で処理し
た培養物による〔３Ｈ〕チミジン取込みの阻害に対応す
るものであり、この阻害率によって定量化することが可
能である。

５０壬阻害を示す力価は阻害係を、毒素の稀釈の対数の
関数としてグラフ表示することによって計算される。

モルモットの皮膚試験は、大人のハートレイ白色モルモ
ットの毛をそった場所及び脱毛した場所の２ケ所に、０
．１ｍｌの試験化合物を皮肉注射することによって行う
。注射３日後、反応部位の面積をｍｍ２の単位で測定す
る。

酵素検定法は、トレーサー（アデニン−１４Ｃ）−ＮＡ
Ｄ　のＴＣＡ沈澱生成物への取り込みを測定することに
よって、ＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化の程度を定量化
するものである。

検定条件下では以下の反応が生ずる： ←−−ナニコチンアミド＋Ｈ＋ エキソトキシンの存在はＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化
を促進するので、沈澱生成物中の放射能の量（毎分のカ
ウントからバックグランドの雑音を差し引いたもの）Ｆ
ｉ、試料中の毒素の量のものさしとなる。もし毒素の量
が一定ならば、ＥＦ−２へ取シ込まれた放射能の量は時
間の関数となる。種々の時間間隔で検定すると反応速度
が明らかとなる。実施例１で調製したエキソトキソイド
試料及びエキソトキシンＡを上述のようにして検定して
以下のデータが得られた。

表２−１ 毒素　　　　　　　４　　　　１５３　　　　　　１５
５トキソイド　　８８７　　　　　　７　　　　　　　
９誠少率　　　　９９壬　　　　９５係　　　　　　９
４係実施例３ 抗原性検定 エキソトキシン（調製ｌ）及びエキソトキソイド（実施
例１）の試料を１価も、異的馬抗血清を用いて、抗原生
の試験をした。以下のデータが得られた。

表３−１ ０ケツト免疫電気泳動 ロケットのピークの畠さく− これらのデータから、トキソイドはもとの毒素の抗原性
をはｙ１００係保持していると結論される。

実施例４ 力価検定（抗体応答） マウスに対しｍ１日に５μｓのミョウバンに吸収させた
トキソイド（ミョウバン−トキソイド）を腹腔内に；そ
して第２１日に５μｓの水性−トキソイドを静脈内にワ
クチン接種する。第２５日に３２匹の免疫化したマウス
から採血に、抗毒素力価をＥＬ′ＩＳＡ＠足法で決定す
る。

」Ｉ１１消を１：４０．１：１６０．１：６４０に稲沢
する。表４−１に於て以下のとシきめを使用している。

４０５　ｎｒｎでのＥＬＩＳＡ元学密度光学、Ｄ、）陰
性の応答　　　　＜２ＸＢＫｇ、＊　１：４０に於て低
い応答　　　　　）２ＸＢＫｇ、　　　１：４０に於て
＜２ｘｎＫｇ、　　　１：１６０に於て＾い応答　　　
　　ン４ＸＢＫｇ、　　　１：６４０に於て＊ＢＫｇ　
、＝血ｉｆ：含有しな一試料の０．　Ｄ。

のバックグランド（つまシ血清の コントロール） 表４−１ 応答のタイプ　　　　　試験したマウスの優陰性　　　
　　　　１２．５ 低　　　　　　　　　　　　６．２５ 中　　　　　　　　　　　　　　５９，４高　　　　　
　　　　　　　　２１．８これらの結果に基づき、最低
量１５μｙまでの投与に対し合計で約８７優の抗体応答
があると結論される。

実施例５ トキソイドの安定性 トキソイドが毒素の状態に逆戻りしないということを示
すために、トキソイド（実施例１）及び毒素（調製１）
を室温でＩ　Ｍ間すン酸緩衝液に対し徹底的に透析し、
次いでトキソイドを更に３週間、４″０で放置した。試
料を取シだし酵素活性を試験し、以下のデータを得た。

表５−１ 酵素活性（ｃｐｍ／μＩ蛋白） 毒素　　　　　　　　　９４７ トキソイド（０日）９０ トキソイド（１週間）　　　　　　　　９１トキソイド
（１ケ月）９２ これらの結果に基づき、トキソイドは安定であり少なく
とも１ケ月の期間内に毒素に逆戻りすることはないと結
論される。

実施例１の方法に従えば、大腸菌（」、シ巾、）、素の
ような、他のＡＤＰ−リボモル化毎素からトキソイドを
調製することが可能である。

本発明のトキソイドは咄乳動物に於て、相当する微生物
によってひきおこさｎる病気に対し予防的又は治療的に
、能動的又は受動的な光疫化の目的のために使用し得る
。受動的なワクチン化は、トキソイドで予めワクチン化
した■乳動物から得た抗血清全体又は免疫グロブリンの
どちらかを単独、又は薬学的に許容される担体と共に注
射することによって実行される。そのようなグロブリン
は標準的な技法によって全抗血清から得られる。

本発明の好ましい具体例に於ては、実施例１のエキソト
キソイドはワクチンと併用されるが、この組み合せはダ
ラム陰性細菌に対しよシ広範囲の防御作用を示す。ダラ
ム陰性細菌のエンドトキシンに対する抗体を上昇させる
ために、第２の成分を使用する。好ましい微生物はサル
モネラ　ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｍｉｎｎｅａ
ｏｔａ　）　Ｒｅ　　５９５及び大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ）０１１１Ｂ４のＪ−５突然変異株である。これらは
ダラム陰性エンドトキシレに共通な核グリコリピドに対
する抗体を高めるように思われ、従って単に単独の微生
物に特異旧な抗体を高めるだけの微生物ニジも、ニジ広
軛囲の防御スペクトルを与えるが故に、これら微生吻が
好ましい。Ｊ−５の使用はＢｒａｕｄｅ等、グラム隙性
菌の抗血消治４１、Ｓｃｈｗｅｉｚ、　Ｍｅｄ。

Ｗｓｃｈｒ＊　１０８巻、４８号、１８７２−１８７６
頁（１９７８年）によって教示された。本特許で使用し
たＪ−５大腸菌（上ｅ　ｃｏｌｉ　）微生９勿ｉＪ：、
１９８２年１月２１日にアメリカンタイプカルチャー　
コレクションに受理番号３９０４１番として制約をつけ
ずに永久を託した。本発明の実施に際し大腸菌（Ｅｓ　
ｃａｌｔ　）の他の株を使用し得るが、ＡＴＣＣ３９０
４１が好ましいものである。

この好ましい具体例の実施に際し、Ｂｒａｕｄｅ等１又
はＺｉｅｇｌｅｒ等、Ｔｒａｎｓ＠Ａｓ５ｏｃ　ｏｆ　
Ａｍｅｒ。

Ｐｈｙｓ、　９１巻、２５３−２５８頁（１９７８年）
Ｋよって教示されたようにして抗血清を上昇させる。次
いでこれらの抗血清をトキソイド抗血清と併合して、２
価の免疫治療又は予防物質とする。好まし７い別法とし
てこれら抗血７Ｈの免疫グロブリンを、全抗血清の代シ
に使用する。

従って本発明のトキソイドは相当する微生物によって惹
起される病気に対して、ｌ１ｍ乳動物を能動的に、予防
的に免疫化するための注射物として使用される。別法と
して当該トキソイドに由来する免疫グロブリンを、予防
的又は治療的な受動的免疫化のために使用することが可
能である。ピー、アエルキノーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉ
ｎｏａａ　）　トキソイドを使用する場会、細菌性エン
ドトキシンに対して力価を上昇させた抗体と併用する。

ピー、アエルキノーサ（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　
）　）キソイドをグラム陰性細菌エンドトキシンワクチ
ン又はその訪導体（抗血清又は免疫グロブリンなど）と
併用する時、注射し得る型のものはダラム陰性細菌に対
しよシ広範囲の防御作用を示す。本発明のトキソイドの
注射し得る型のものとは有効量の当該トキソイド、当該
トキソイドから由来する抗血清、ガンマグロブリン、又
は当該抗血清、当該トキソイド、抗血ｍの抗体含有画分
、又はそれ単独或はグラム陰性細菌エンドトキシンワク
チンと併用して使用される両分、当該エンドトキシンワ
クチン又はガンマグロブリンから得られる抗血清、又は
当該抗血清の両分−を含有する他の抗体を意味する。当
該の注射５し得る型のものは、更に好みによっては滅菌
食塩水のような薬学的に許容される担体とから成る。許
容される補助薬（例えばミョウバン）の使用もまた本発
明の範囲内であることを意図している。人間以外の咄乳
＠物に於て、先金な又ヒ不完全な補助薬（？ｌｌえばフ
ロイント補助薬）を使用することが可能である。

本発明のトキソイドは人間で試験していないが、実施例
４のマウスのデータは少なくとも５−２５μｇのトキソ
イドが１乳動物に於て抗体応答を誘起するのに有効であ
る、つまりそのような量は志願者に於て免疫化する、或
は抗血７゛Ｈを産生するための有効量であるということ
を示唆している。長期間にわたって抗血清を生産するた
めには、２週間母の補強注射が必要となるかも知れない
。同様に実施例６のデータから、グラム隘性細菌のエン
ドトキシンに対して体重７０に４の人間を防御するには
、細菌性エンドトキシンに対して高められ、最低ＰＨＡ
（受動血球凝集検足）力価がｌ：３２である人間の抗血
清約９０７（体重Ｉ　Ｋｇ当９１．２５−またはそれ以
上）が少なくとも必要であると計算される。

調製２ マウスの免疫抑制 実施例４で使用したマウスを実施例６でも使用した。臨
床的に関係した状況にニジ良く似たモデルを入手するた
めに、褐素に対する抗体を発達させた後、これらのマウ
スは免疫抑制された。

カエザリアン由来のバリヤ支持異系交配（ｂａｒｒｉｅ
ｒ−ａｕｓｔａｉｎｅｄ、　ｏｕｔｂｒｅｄ）アルビ（
ＣＦＩ）マウスをチャールスリバー社より求めて使用し
た。感作させた時マウスは退会５．５ないし７であった
（２０ないし２４クラム）。

感染１日前にマウスをサイクロホスファマイト（サイト
キサン、メアドジョンソン社）ＫＪ：つて免疫抑制する
。サイトキサンを滅菌した、ピローゲンを含まぬ蒸溜水
に２０ダ／−の＃度となるように溶解する（サイトキサ
ンは等張にするためにＮａαを含有している）。

この浴液の濃度を１ｔｎｌの減菌した、ピローゲンを含
まぬリン酸緩衝食塩水にニジ腹腔内注射で投与するのに
適した蓄（４００■／〜）に調節する。

調製３ ピー、アエルキノーサ（Ｐａ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　
）の感染 ピー、アエルギノーサ（Ｐａ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　
）の臨床単離株の凍結保存物を、感染１日前に融解し、
トリブチカーゼソイ寒天斜面上に接種し、３７“Ｃで一
晩培養する。翌日この細菌金２．５−のリン酸緩衝食塩
水に懸濁し、１０〇−のトリブチカーゼソイブロスに接
種し、振盪培養機中で培養する。細菌の生長が対数期の
中間点に達したら、これらをリン酸緩衝食塩水で３回洗
い、リン酸緩衝食塩水中に７×１０６細菌／ｍ／！とな
る濃度に懸濁する。この懸濁液０．１−をマウスに腹腔
内注射（つまりＬＤ＠、投与量）する。

実施例６ マウスの免疫化 実施例１で調製したトキソイドめ免疫原性を説明するた
めに、抗体力価分布が表４−１であるマウスを免疫抑制
し、腹腔内注射によってピー、アエルギノーサ（Ｐｅ　
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を感染させる（調製３）。偽薬
を用いての治療と共に正及び負のコントロールを用いる
。

当該トキソイド活性免疫法、及びＪ−５大腸＠　（Ｅ、
　ｃｏｌｉ　）をワクチン化した人間の志願者から得た
抗血清による受動的免疫法、を組み合せることによって
達成される、数置された効能もまた証明された。抗血清
はＺｉｅｇｌｅｒ等、　　Ｔｒａｎｓ＠Ａｓ５ｏｅ＋＋
　ｏｆ　Ａｍｅｒ、　Ｐｈｙｓ　０９１巻２５３−２５
８頁（１９７８年）に記載されである方法に従って得た
。使用したＪ−５大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）微生物は
、アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託番号
ＡＴＣＣ３９０４１として寄託しである。表６−１のデ
ータが得られた。

これらのデータは以下のことを示している。

１）治療しない感染動物は速かに死亡した（ＩＶ）。

２）治療しない非感染動物は、後になり自然感染によっ
て死亡した（Ｖ）。

３）Ｊ−５抗血清のみによっである防御効果が得られた
（Ｉ対■） ４）トキソイドによる治療と受動的Ｊ−５抗血清治療は
効果的である（ｌ対■）。

５）４の故にトキソイドは免疫原性である。

６）組付せ治療は自然感染に対して防御的に作＜（Ｉ対
Ｖ）。

第１頁の続き ０発　明　者　リン・チー・キャラハン・ザ・サード アメリカ合衆国ペンシルヴアニ ア・ノース・ウェールズ・ナム バー７一ケー・チャーチ・ロー ド１３１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　ＲがＡＤＰ−リボシル化トキシンラジカルであ
   る 又は υｉｔ　　（ＪＭ であるトキソイド。 からの熱不安定なエンテロトキシン、ビブキシンである
   特許請求の範囲第１項記載のトキソイド。 ０ ５．１）８−アシドアデノシン及び８−アシドアデニン
   から成る群から選ばれた元に不簀足な親第１性試薬とＡ
   ＤＰ−リボシル化トキシンを、０℃に於て不活性基１／
   ｒｌ気Ｆで混合し、 ２）第１段階の混会物を有効量の非変性光に照射し、 ３）好適には第２段階のトキソイド生成物を才青製する ことから成るトキソイドを製造する方法。 ６、トキシンがピー、アエルキノーサ（Ｐ。 シトアデノシンであり、エキソトキシンの尤に不安定な
   親和性試薬に対するモル比が１：１００ないしｌ：ｌＱ
   、０００である特許ｊ＋’４求の範囲第３項記載の方法
   。 ７、特許請求の範囲第５項又は第６項記載の方法によっ
   て製造したトキソイド。 ８、待計拍求の範囲第１項記載のトキソイドの汀射し得
   る型のもの。 ９．１）８−アデニルアミノピー、アエルキノーサ（Ｐ
   、　ａｅｒｕｇｉｎｏａａ　）エキソトキシン−Ａ又は
   ８−アデノシルアミノピー、アエルギノーサ（Ｐａ　ａ
   ｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）エキソトキシン−Ａ、及び ２）Ｊ−５大腸函（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　ＡＴＣＣ３９
   ０４１から得た抗血清、 の有効量から成る特許請求の範囲第８項記載の注射し得
   る型のもの。