FI98269C - Menetelmä olennaisesti puhtaan tulehdusta estävän tekijän eristämiseksi maidosta - Google Patents

Description

98269

Menetelmä olennaisesti puhtaan tulehdusta estävän tekijän eristämiseksi maidosta

Keksinnön tausta 5 Keksinnön ala Tämä keksintö koskee menetelmää olennaisesti puhtaan tulehdusta estävän tekijän, (AF) eristämiseksi maidosta, joka tekijä käsittää oligomeerisen hiilihydraatin, jonka karbonyylifunktio on sidottu alayksikkösidoksiin, ja 10 joka sisältää karboksylaatti-ioneiksi hapettuneita sivu-ketjuja, muodostaa kompleksin kalsium-ionien kanssa ja alifaattisten happojen kanssa ja johon on liittyneenä typpipitoisia yhdisteitä, fosforipitoinen yhdiste ja kompleksinen lipidi ja jossa ei ole oleellisesti rikkiyhdistettä. 15 Tekniikan tason kuvaus

Dorlandin lääketieteellisen sanakirjan määritelmän mukaan tulehdus on "paikallinen suojaava kudosvaurion tai kudosten tuhoutumisen synnyttämä reaktio, jossa vaurion aiheuttaja ja vaurioitunut kudos häviää, vähenee tai pois-20 tuu". Sen luonteenomaisena piirteenä on hiussuoniston seinämien huokosten avartuminen, veren ainesosien pääsy kudosten soluvälitiloihin ja leukosyyttien vaellus tulehtuneeseen kudokseen. Makroskooppisessa mittakaavassa tähän tavallisesti liittyy tunnetut kliiniset punoituksen, 25 turvotuksen, arkuuden (hyperalgesian) ja kivun merkit.

« * Tämän monimutkaisen reaktion aikana vapautuu paikallisesti kemiallisia välittäjäaineita, kuten histamiinia, 5-hydrok-sitryptamiinia, useita eri kemotaktisia tekijöitä, brady-kiniiniä, leukotrieenejä ja prostaglandiineja. Alueelle 30 vaeltaa fagosytoottisia soluja ja solujen lysosomien kal-vot voivat hajota, mistä seuraa hajottavien entsyymien vapautuminen. Kaikki nämä tapahtumat voivat olla osallisena tulehdusreaktiossa.

Nivelreumapotilailla esiintyvä tulehdus käsittää 35 luultavasti antigeenin (gammaglobuliinin) liittymisen vas- . · 2 98269 ta-aineeseen (reumatekijä) ja komplementtiin, mistä aiheutuu leukosyyttejä puoleensa vetävien kemotaktisten tekijöiden vapautuminen paikallisesti. Leukosyytit fagosytoi-vat antigeeni-vasta-aineen ja komplementin muodostamia 5 komplekseja ja vapauttavat useita lysosomiensa sisältämiä entsyymejä. Näistä lysosomaalisista entsyymeistä aiheutuu sitten ruston ja muiden kudosten vaurioita, ja tämä pahentaa tulehdusastetta. Tässä yhteydessä voi myös esiintyä soluvälitteisiä immuunireaktioita. Myös prostaglandiineja 10 vapautuu tässä tapahtumaketjussa.

Prostaglandiinit, joiden syntyminen tulehduksessa on todennäköistä, aiheuttavat punoitusta ja lisäävät paikallisesti verenkierron nopeutta. Prostaglandiinien kahta tärkeää verisuonistoon kohdistuvaa vaikutusta - pitkävai-15 kutteista verisuonia laajentavaa vaikutusta ja vastavaiku- tuskykyä sellaisten aineiden, kuten norepinefriinin ja angiotensiinin, verisuonia supistavaa vaikutusta kohtaan -ei yleensä esiinny muilla tulehdusreaktiota välittävillä aineilla.

20 Jotkin tulehdusreaktiota välittävät aineeet lisää vät verisuonten läpäisevyyttä (läpivuotoa) hiuslaskimoon johtavissa ja keräävissä hiuslaskimoissa. Lisäksi leukosyyttien vaellus tulehdusalueelle on tulehdustapahtuman tärkeä piirre. Kun prostaglandiinit eivät todennäköisesti 25 ole suoraan liittyneet kemotaktiseen vasteeseen, on taas leukotrieeni, yksi arakidonihappometabolian muista tuotteista, hyvin vahva kemotaktinen aine.

Tulehdusta estävä reaktio on mikä tahansa reaktio, jonka luonteenomaisena piirteenä on edellä olevalla taval-30 la määritelty tulehdus. Kokeneet lääketieteen harjoittajat tietävät, että tulehdusreaktio aiheuttaa suuren osan niistä fyysisistä vaivoista, s. o. kivusta ja toimintakyvyn huononemisesta, jotka on totuttu liittämään eri sairauksiin ja vammoihin. Tämän mukaisesti on lääketieteessä 35 yleisenä käytäntönä antaa tulehdusreaktiota neutraloivasti 98269 3 vaikuttavia farmakologisia aineita. Tällaisia ominaisuuksia omaavat aineet luokitellaan tulehdusta estäviksi lääkeaineiksi. Tulehdusta estäviä lääkeaineita käytetään hoidettaessa suurta määrää erilaisia häiriöitä ja näitä lää-5 keaineita käytetään erilaisten sairauksien hoitoon. Tulehdusta estävien aineiden avulla tapahtuva hoito ei kohdistu sairauteen, vaan useimmin oireeseen, s.o. tulehdukseen.

Tulehdusta estävät, kipua lievittävät ja kuumetta alentavat lääkeaineet ovat usein kemiallisesti toisiaan 10 muistuttamattomien yhdisteiden heterogeeninen ryhmä, jolla tästä huolimatta on yhteisinä tekijöinä tietyt hoidolliset ja sivuvaikutukset. Kortikosteroidit edustavat laajinta tulehdusreaktion hoidossa käytettyjen yhdisteiden ryhmää. Proteiineja hajottavat entsyymit edustavat toista yhdiste-15 ryhmää, jolla väitetään olevan tulehdusta estäviä vaikutuksia. Hormonit, jotka suoraan tai epäsuorasti saavat lisämunuaisen kuorikerroksen tuottamaan ja erittämään steroideja, edustavat vielä yhtä tulehdusta estävää yhdiste-ryhmää. On kuvattu myös joitakin ei-hormonaalisia tuleh-20 dusta estäviä aineita. Näistä laajimmassa käytössä ovat salisylaatit. Asetosalisyylihappo eli aspiriini kuuluu lääkemääräyksissä laajimmin käytettyihin kipua lievittäviin ja kuumetta alentaviin aineisiin ja tulehdusta estäviin aineisiin. Esimerkkejä steroideihin kuuluvista ja 25 näihin kuulumattomista tulehdusta estävistä aineista on • luetteloitu teoksessa "Physicians Desk Reference, 1987 (ks. näiden valmisteiden sisällysluettelo sivuilta 27 ja 208).

Luonnolliset ja synteettiset kortikosteroidival-30 misteet aiheuttavat eräitä vakavia sivuvaikutuksia, mu- - « kaanluettuna verenpaineen nousu, suolan ja nesteen keräytyminen ja kaliumin ja kalsiumin eritys. Kortikosteroidit voivat sitäpaitsi peittää tartunnan merkit ja edistää tarttuvien mikro-organismien leviämistä. Näiden hormonien 35 käyttöä raskaana oleville naisille ei pidetä turvallisena 4 98269 ja pitkäaikaiseen kortikosteroidihoitoon liittyy mahan yliaktiivisuus ja/tai mahahaavat. Näillä yhdistellä hoidettaessa myös sokeritauti voi pahentua, jolloin tarvitaan suurempia insuliiniannoksia, ja voi syntyä psykoottisia 5 häiriöitä. Hormonaalisilla tulehdusta estävillä aineilla, jotka epäsuorasti lisäävät endogeenisten kortikosteroidien tuotantoa, on sama kyky aiheuttaa haitallisia sivuvaikutuksia.

Ei-hormonaaliset tulehdusta estävät aineet ovat 10 synteettisiä biokemiallisia yhdisteitä, jotka suurina an noksina voivat olla myrkyllisiä ja niiden käyttöön voi liittyä suuri joukko ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Esimerkiksi salisylaateilla on osuus vakavissa happo-emästa-sapainohäiriöissä, jotka ovat luonteenomaisia tämän yh-15 disteryhmän aiheuttamille myrkytyksille. Salisylaatit kiihdyttävät hengitystä suoraan tai epäsuorasti. Myrkylliset annokset salisylaatteja aiheuttavat hengityshalvauksen sekä verisuonten laajenemisesta johtuvan verenkierron pysähtymisen. Salisylaattien nauttimisesta voi seurata 20 närästys, pahoinvointi tai oksennus. Salisylaattien ai heuttama verenvuoto ruoansulatuskanavaan on hyvin tunnettu. Salisylaatit voivat aiheuttaa maksavaurioita ja niiden käyttö voi johtaa veren hyytymisajan pitenemiseen. Aspiriinia olisi vältettävä potilailla, joilla on vakava • 25 maksavaurio, protrombiinin vajaus, K-vitamiinin puutos tai hemofilia, koska salisylaateista johtuva verihiutalehemos-taasin estyminen voi aiheuttaa verenvuotoa. Salisylaatti-myrkytys on yleinen, ja vuosittain tavataan Yhdysvalloissa yli 10 000 vakavaa salisylaattimyrkytystapausta, joista 30 jotkut johtavat kuolemaan ja joista monet sattuvat lapsille. Ks. teos Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. painos 1985. Huolimatta nykyisin tarjolla olevien tulehdusta estävien aineiden suuresta määrästä tarvitaan edelläesitetyn mukaisesti vielä sel-35 laista turvallista ja tehokasta tulehdusta estävää tuotet- 98269 5 ta, jolla ei ole sivuvaikutuksia ja haitallisia reaktioita.

Jos voitaisiin saada käyttöön ravintoaineesta peräisin oleva tuote, kuten esimerkiksi sellainen maidosta 5 valmistettu tuote, jolla olisi tulehdusta estäviä ominaisuuksia, tästä tulisi helposti annettavissa oleva, helposti käytettävissä oleva ja turvallinen valmiste hoitokäyt-töön.

Useiden eri hoidollisesti vaikuttavien maitotyyp-10 pien tuotanto on entuudestaan tunnettua. Esimerkiksi Beck on kuvannut Streptococcus mutans -bakteeriin kohdistuvan vasta-ainetta sisältävän maidon, jolla on hammasmätää estävä vaikutus (US-patentti no. 4 324 782). Tämä maito saadaan syntymään immunisoimalla lehmä S. mutans -antigeenillä la kahdessa vaiheessa ja ottamalla tästä saatu maito talteen.

Stolle ja muut ovat kuvanneet eläimessä esiintyvien tupakointiin liittyvien verisuoni- ja keuhkosairauksien hoitoon käytettävän menetelmän, joka käsittää hyperimmuu-20 nitilassa pidettävästä lehmästä talteenotetun maidon antamisen kyseiselle eläimelle (US-patentti no. 4 636 384). Beck on kuvannut eläinten tulehdusten hoitoon tarkoitetun menetelmän, joka käsittää tulehdusta estävää tekijää tuottavassa tilassa olevasta lehmästä talteenotetun maidon 25 antamisen eläimelle tulehdusta estävältä teholtaan rittä-vissä määrin (US-patentti no. 4 284 623). Heinbach, US-patentti no. 3 128 230, on kuvannut globuliinien alfa-, beeta- ja gammakomponentteja sisältävän maidon, joka on saatu rokottamalla lehmä antigeenisillä seoksilla. Peter-30 son ja muut (US-patentti no 3 376 198), Holm (US-hakemus (julkaistu) sarjanumero 628 987), Tunnah ja muut (GB-pa- * · tentti no. 1 211 876) ja Biokema S.A. (GB-patentti 1 442 283) ovat kuvanneet vasta-aineita sisältäviä maitoja· 6 98269

Yksikään edellämainituista viittauksista ei kuitenkaan kuvaa hoidollisesti vaikuttavien maitojen sen ainesosan tai niiden ainesosien identiteettiä, jotka tuottavat halutut hoidolliset vaikutukset. Esimerkiksi Beck'in, US-5 patentti no. 4 284 623, ollessa kyseessä, hoidollisiin tarkoituksiin käytetyt maitotuotteet koostuvat joko nestemäisestä kokomaidosta, nestemäisestä rasvattomasta herasta, tai kokomaitojauheista. Vaikka jokaisella näistä maitotuotteista on tulehdusta estäviä ominaisuuksia, sitä 10 tekijää tai niitä tekijöitä, joihin hoidollinen hyöty varsinaisesti liittyy, ei ole vielä eristetty tai tunnistettu.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö perustuu ajatukseen, että eristetty 15 ja puhdistettu tulehdusta estävä maidosta peräisin oleva tuote olisi kaikkein hyödyllisin hoidettaessa eläimen tulehduksen estämistä vaativia sairauksia.

Tämä mielessään tämän keksinnön tekijät puhdistivat ja luonnehtivat lehmän maidosta peräisin olevan tulehdusta 20 estävän tekijän, jota jäljempänä kutsutaan maidon tulehdusta estäväksi tekijäksi (MAIF).

Jatkotutkimukset osoittivat, että tämä maidosta saatu tuote esti tai lievitti tulehduksen kliinisiä oireita. Tämän mukaan tiettyjä monitehoisia antigeenejä vastaan • 25 edeltäkäsin hyperimmunisoiduista eläimistä saadusta mai dosta eristetty tulehdusta estävä tekijä on tehokas tulehduksen estoa vaativissa tiloissa, kun mainittua eristettyä ja puhdistettua tekijää annetaan sellainen määrä ja sellaisissa hoito-olosuhteissa, että nämä ovat riittäviä ai-30 kaansaamaan tulehdusta estävät vaikutukset. Tämä havainto *: on erityisen hämmästyttävä siinä valossa, että monitehoi nen antigeenirokote ei itsessään sisällä MAIF:a. Aktiivisen tekijän eristäminen hyperimmunisoitujen lehmien maidosta johti siihen odottamattomaan havaintoon, että MAIF 35 esiintyy pienissä määrissä normaalien lehmien maidossa.

> IM:l illki li* rt* 98269 7 Tämä löytö oli peittynyt sen seikan alle, että MAIF:n pitoisuus tavallisessa lehmän maidossa on liian alhainen aiheuttaakseen maidolle havaittavia tulehdusta estäviä ominaisuuksia. Tavallisessa lehmänmaidossa oleva MAIF voi-5 daan kuitenkin väkevöidä tämän keksinnön eristysmenetel-mällä jonka jälkeen sitä voidaan tehokkaasti käyttää tulehduksen hoitoon. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Piirrosten lyhyt kuvaus 10 Keksinnöstä ja siihen liittyvistä monista muista hyötynäkökohdista saa vaivattomammin täydellisemmän käsityksen ja sen ymmärtää paremmin tarkastelemalla seuraavaa yksityiskohtaista kuvausta yhdessä liitteenä olevien piirrosten kanssa.

15 Kuvio 1. MAIF:n eristys ioninvaihtokromatografiäl lä DEAE-selluloosapylväässä, etusijalla olevan menetelmän vaiheessa 2.

Kuvio 2. DEAE-selluloosakromatografiästä saadun MAIF:n huipun (toisen huipun) fraktiointi Sephadex G-10 20 molelyylisuodatuspylväässä etusijalla olevan menetelmän vaiheessa 3.

Etusijalla olevien keksinnön kattamien kohteiden yksityiskohtainen kuvaus.

Keksintö käsittää MAIF:n eristyksen ja puhdistuk-' 25 sen. Kuvataan myös MAIF:n antaminen eläimelle tulehduksen estoa vaativien häiriöiden hoitamiseksi.

Ilmaisulla "maidon tulehdusta estävä tekijä" tarkoitetaan tekijää, joka saadaan joko hyperimmuunista maidosta tai tavallisesta lehmänmaidosta. Ilmaisulla "olen-30 naisesti puhdas MAIF" tarkoitetaan tämän keksinnön yhtey-*; dessä tulehdusta estävää tekijää, joka eluoituu yhtenä huomattavan suurena symmetrisenä huippuna HPLC kromatogra-fiassa suurimolekyylisten (>10 000 daltonia) aineden poiston ja pienimolekyylipainoisten negatiivisen varauksen 35 omaavan yhdisteiden ryhmän eristyksen jälkeen. Sekä taval- 98269 8 linen maito että hyperimmuuni maito voidaan käsitellä tässä esitettyjen menetelmien avulla MAIF:n saamiseksi talteen.

Ilmaisulla "hyperimmuuni maito" tarkoitetaan tämän 5 keksinnön yhteydessä maitoa, joka on saatu pidettäessä maitoa tuottavia eläimiä hyperimmuunissa tilassa jäljempänä seuraavan hyperimmunisoinnin tarkempien yksityiskohtien kuvauksen mukaisella tavalla.

Ilmaisulla "kuorittu maito" tarkoitetaan tässä kek-10 sinnössä maitoa, josta kerma on poistettu.

Ilmaisulla "hera" tarkoitetaan tässä keksinnössä maitoa, josta kerma ja kaseiiniaines on poistettu.

Ilmaisulla "tavallinen maito" tarkoitetaan tässä keksinnössä maitoa, joka on saatu maitoa tuottavista eläi-15 mistä tavanomaisin keinoin ja meijereissä vallitsevan käytännön mukaisesti.

Ilmaisulla "maitoa tuottava eläin" tarkoitetaan tässä keksinnössä nisäkkäitä, jotka tuottavat maitoa taloudellisesti käyttökelpoisessa määrin, ensisijaisesti 20 suvun Bos lehmiä (lehmänsukuiset), ja erityisesti niitä rotuja, jotka tuottavat eniten maitoa, kuten Holstein.

Ilmaisulla "bakteeriantigeeni" tarkoitetaan tässä keksinnössä lämmöllä tapettuja kylmäkuivattuja bakteeriso-luvalmisteita.

' 25 Ilmaisulla "mikrokapseloitu muoto" tarkoitetaan tässä keksinnössä polymeerisiä mikropartikkeleita, jotka pitävät sisällään yhtä tai useampaa bakteeriantigeenia annettavaksi maitoa tuottaviin eläimiin.

Ilmaisulla "tulehdus" tarkoitetaan tässä keksinnös-30 sä paikallista suojaavaa kudosvaurion tai kudosten tuhou-*: tumisen synnyttämää reaktiota, jossa vaurion aiheuttaja ja vaurioitunut kudos häviää, vähenee tai poistuu ja jonka luonteenomaisena piirteenä akuutissa vaiheessa on klassinen kivun, kuumotuksen, punoituksen, turvotuksen ja toi-35 mintakyvyn huononemisen käsittävä tapahtumasarja, ja joka • 98269 9 käsittää monimutkaisen kudosopillisen tapahtumasarjan, mukaanlukien hiusvaltimoiden, -suonten ja -laskimoiden avartumisen ja tähän liittyvän läpäisevyyden ja verenkierron nopeuden lisääntymisen, tulehdusnesteiden kerääntymi-5 sen plasman proteiinit mukaanluettuna ja valkosolujen vaelluksen tulehduspesäkkeeseen.

Ilmaisulla "hoitaminen" tarkoitetaan tässä yhteydessä, että sairauden oireet ja/tai sairauden patogeeninen aiheuttaja on parannettu tai hävinnyt kokonaan.

10 Ilmaisulla "antaa" tarkoitetaan tässä yhteydessä mitä tahansa keinoa käsittelyn kohteena olevan käsittelemiseksi aineella kuten suun, nenän, ruoansulatuskanavan ulkopuolisen annostelutien (suonen, lihaksen tai ihon) tai peräsuolen kautta tapahtuva käsittely.

15 Ilmaisulla "eläin" tarkoitetaan tässä keksinnössä mitä tahansa elävää oliota, jossa voi syntyä tulehdus, mukaanluettuna ihmiset, karja, kotieläimet tai eläintarhan eläimet.

Esimerkkejä tulehduksen estoa vaativista tiloista, 20 joita voidaan hoitaa tämän keksinnön mukaisesti eristetyllä ja puhdistetulla maidosta peräisin olevalla tuotteella ovat seuraavat: äkillinen ja viivästynyt limapussin tulehdus, äkillinen epäspesifinen jännetulehdus, systeeminen punahukka, systeeminen iho- ja lihastulehdustauti, äkilli-25 nen reumaattinen sydäntulehdus, rakkulaihottuma, rakkulainen ihotulehdus, rokahdusihottuma, vakava punoittuma, monimuotoinen kesivä ihotulehdus, kovettumatauti, kausiluon-teinen nuha, keuhkoastma, atooppinen ekseema, seerumitauti, sarveiskalvon tulehdus, värikalvon tulehdus, diffuusi 30 ureitis, äänihuulten tulehdus, näköhermon tulehdus, sym-paattinen silmätulehdus, oireellinen sidekudoskyhmytauti, Loefflerin oireyhtymä, berylliummyrkytys, punasoluhajoane-mia, rintarauhasen tulehdus, kartiolisäkkeen tulehdus, kosketusekseema, allerginen sidekalvon tulehdus, reumahil-35 settymä, selkärankareuma, äkillinen kihti ja vyöruusu.

98269 10

Lisäksi eristettyä ja puhdistettua maitoperäistä tuotetta voidaan käyttää sellaisten yksilöiden hoitoon, jotka ovat alttiina mahdollisille tulehdusta aiheuttaville aineille.

Tämä keksintö perustuu osaltaan siihen löytöön, 5 että kun lehmä tai siihen rinnastettava maitoa tuottava eläin saatetaan erityiseen hyperimmunisaatiotilaan, tämä eläin tuottaa maitoa, jossa erittäin hyödyllisenä pidettävän MAIF:n tasot ovat normaalia korkeammat, mainitun MAIFrn osoittaessa ei ainoastaan kykyä hillitä ihmisen ja 10 muiden eläinten tulehdusoireita, vaan myös kykyä toimia ennaltaehkäisevänä tekijänä siltä varalta, että tuledusta aiheuttavat tekijät pääsevät vaikuttamaan kohteeseensa. Ilmaisulla "normaalia korkeammat tasot" tarkoitetaan tasoja, jotka ylittävät tasot sellaisten eläinten maidossa, 15 joita ei ole hyperimmunisoitu. Immuuniherkkyyden syntyminen ei sinänsä riitä MAIF:n normaalia suurempien tasojen esiintymiseen maidossa, mistä on osoituksena se, että normaali lehmän maito ei sisällä normaalia suurempia tasoja, vaikka lehmät ovat herkistyneet useita eri antigeenejä 20 kohtaan lehmien sairauksia kohtaan suoritetuissa immunisoinneissa ja normaalin ympäristöstä tulevan altistuksen alaisena. Maidossa on halutut normaalia suuremmat tasot vain erityisissä hyperimmuunitiloissa.

Tämä erityinen tila voidaan saavuttaa suorittamalla 25 alkuimmunisointi ja aikavälein annetut tehosterokotteet, joissa käytetään riittävän suuria määriä spesifisiä antigeenejä. Tehosterokotteen annos on ensisijaisesti yhtä suuri tai suurempi kuin 50 % siitä annoksesta, joka tarvitaan tuottamaan lehmän ensi-immunisoituminen. On siten 30 olemassa tehosteannoksen rajataso, jonka alapuolella mai-toon ei kyseisiä ominaisuuksia synny, vaikka lehmä muutoin on tilassa, jota tavallisesti kutsuttaisiin immuunitilak-si. Jotta haluttu hyperimmuunitila saavutettaisiin, on olennaista testata hyperimmuuni maito ensimmäisen tehoste-35 rokotesarjan jälkeen. Jos maidosta ei löydy hyödyllisenä 98269 11 pidettäviä tekijöitä, annetaan suuren annoksen sisältäviä lisätehosterokotuksia, kunnes nämä ominaisuudet alkavat ilmetä maitoon.

Normaalia suurempien MAIF- tasoja sisältävän hyper-5 immuunimaidon tuotantomenetelmä on kuvattu samanaikaisesti jätetyissä US-hakemuksissa. Yhteenvetona esitettynä, yksi normaalia korkeammat MAIF:n tasot sisältävän maidon valmistusmenetelmä käsittää seuraavat vaiheet: (1) antigeenin valinnan; (2) lehmän alkuimmunisoinnin; (3) seerumin tes-10 tauksen herkkyyden syntymisen varmistamiseksi; (4) sopivan annoksen sisältävillä tehosterokotteilla suoritetun hyper-immunisoinnin; ja valinnaisesti, (5) tulehdusta estävien ominaisuuksien testauksen maidosta; (6) maidon keräämisen talteen hyperimmunisoidusta lehmästä; ja (7) maidon käsit-15 tely MAIF:n eristämiseksi.

Vaihe 1: Mitä tahansa antigeeniä tai antigeenien yhdistelmää voidaan käyttää. Antigeenit voivat olla bakteeri-, virus-, alkueläin-, sieni- tai soluperäisiä tai mitä tahansa muita aineita, joita kohtaan maitoa tuottavan 20 eläimen immuunijärjestelmä antaa vasteen. Tämän vaiheen ratkaiseva piirre on, että antigeeni(e)n tulee maitoa tuottavassa eläimessä pystyä ei vain herättämään immuuni-ja hyperimmuunitilat, vaan myös tuottamaan normaalia korkeammat MAIF- tasot. Yksi etusijalla oleva rokote on moni-25 tehoisten bakteeriantigeenien seos, jota nimitetään 100 -sarjan rokotteeksi, joka kuvataan yksityiskotaisesti jäljempänä esimerkissä IA.

Vaihe 2: Antigeenitt) voidaan antaa millä tahansa herkistymisen aiheuttavalla menetelmällä. Yhdessä mene-30 telmässä määrältään lxlO6 - lxlO20, ensi sijassa 108 - 1010, : eniten ensisijaisesti 2 x 108 lämmöllä tapettua bakteeria annetaan ruiskeena lihakseen. Voidaan kuitenkin käyttää muita menetelmiä, kuten ruisketta suoneen, vatsaonteloon, peräsuolisuppositoriota tai suun kautta tapahtuvaa annos-35 telua.

f 98269 12

Vaihe 3: On tarpeen määrittää, onko maitoa tuottava eläin herkistynyt antigeeniä kohtaan. Immunologisen ammattitaidon hallitsevien piirissä tunnetaan useita herkisty-neisyyden testimenetelmiä (Methods in Immunology and Immu-5 nochemistry, William, C.A., ja Chase, W.M. Academic Press, New York, osat 1-5 (1975)). Etusijalla oleva menetelmä on käyttää monitehoista rokotetta, joka käsittää useita antigeeneinä olevia bakteerilajeja ja testata eläimen seerumista agglutinoivat vasta-aineet ennen altistusta rokot-10 teelle ja tämän jälkeen. Vasta-aineiden ilmestyminen maitoon rokotteella tehdyn immunisoimisen jälkeen osoittaa herkistymisen; tässä kohdassa on mahdollista edetä vaiheeseen 4.

Vaihe 4. Tähän sisältyy herkistyneen eläimen hyper-15 immuunin tilan herättäminen ja ylläpito. Tämä saadaan aikaan antamalla samanpituisin aikavälein toistuvissa tehosterokotuksissa samaa monitehoista rokotetta, jota käytettiin alkuherkistymisen aikaansaamiseksi. Monitehoisten bakteeriantigeenien kyseessäollessa on kahden viikon väli 20 tehosterokotuksissa optimaaalinen. On kuitenkin tarpeen varmistua siitä, että eläin ei siirry hyperimmuunitilasta antigeeniä kohtaan syntyvään immuunisietotilaan.

Edullisen suoritusmuodon mukaan lehmien hyperimmu-nisointi voidaan aikaansaada suorittamalla kertarokotus * 25 mikrokapseloidulla rokotteella, jonka valmistus on kuvattu yksityiskohtaisesti jäljempänä olevassa esimerkissä IB. Hyperimmunisoinnin säännellyn vapautumismuodon etuna on se, että antigeenille tapahtuva jatkuva altistuminen varmistaa eläimen pysymisen hyperimmuunissa tilassa.

30 Vaihtoehtoisen suoritusmuodon mukaan on myös mah dollista yhdistää erilaisia immunisoinnin suoritustapoja, esim. antamalla yhtä aikaa mikrokapseloitua ja nestemäistä antigeeniä, tai suorittamalla alkuimmunisointi ruiskeena lihakseen ja antamalla tehosteannokset suun kautta tai 35 ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta käyttäen mikrokapselei- « 98269 13 den yhteydessä käytettäviä keinoja. Monet eri alku- ja hyperimmunisoinnin yhdistelmät tunnetaan tavanomaisen ammattitaidon omaavien piirissä.

Vaihe 5: On tarpeen testata maidosta tulehdusta es-5 tävien aktiivisuuksien tasot. Tämä voidaan tehdä millä tahansa tutkimusmenetelmällä, joka testaa joko hyperimmuu-nin maidon tai tästä peräisin olevien tuotteiden vaikutuksia tulehdukseen. Kemikaalin aiheuttama käpälän tulehdus rotalla on tulehdusta estävien aineiden vakiotesti.

10 Vaihe 6. Tämä käsittää maidon talteenoton ja käsit telyn. Maito voidaan ottaa talteen tavanomaisin menetelmin. Maidon käsittely MAIFrn eristämiseksi on kuvattu jäl-j empänä.

Yksinkertaisin menetelmä MAIF:n eristämiseksi, puh- 15 distamiseksi ja testaamiseksi käsittää seuraavat vaiheet: 1. Rasvan poisto hyperimmuunista maidosta kuoritun maidon aikaansaamiseksi; 2. kaseiinin poisto kuoritusta maidosta heran aikaansaamiseksi ; 20 3. molekyylipainoltaan suurempien kuin noin 10 000 daltonia olevien makromolekyylien poisto herasta ultrasuo-datuksella; 4. vaiheesta 3 saadun tuotteen fraktiointi ionin-vaihtopylvästä käyttäen molekyylipainoltaan pienemmän kuin . 25 noin 10 000 daltonia olevan negatiivisesti varautuneen MAIF:n eristämiseksi; 5. vaiheesta 4 saatujen molekyylilajien erottamisen molekyy1isuodatuskromatografialla; ja 6. vaiheesta 5 saadun MAIF:n biologinen määritys 30 7. maidosta peräisin olevan tekijän tulehdusta es tävä vaikutus testataan karrageeniliuosinjektiosta rotan käpälään aiheutuneen turvotuksen avulla. Käpäläkoe rotilla on tulehdusta estäville aineille suoritettava vakioeläin-koe. Winter, C.A., Risley, G.A., Nuss, A.W., "Carragee- 35 nin-induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an assay 98269 14 for Anti-inflammatory Drugs," Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3:544 (1967). Lukuisia muita kokeita on myös käytettävissä. Wetnick, A.S. and Sabin, C., The effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-induced Arthritis and Ex-5 perimental Allergic Encephalomyelitis in Rats," Jap. J. Pharm. 22:741 (1972). Käpälätesti rotilla on kuitenkin kaikista käytettävissä olevista kokeista yksinkertaisin ja suorin, ja sen on osoitettu soveltuvan tyydyttävästi kaikkien tulehdusta estävien lääkeaineiden testaukseen. Tämä 10 koe on kuvattu yksityiskohtaisesti patenttijulkaisussa Beck, US-patentti 4 284 623, joka liitetään tähän hakemukseen viittauksella siinä määrin, kuin se kuvaa käpälätes-tiä rotilla. Lyhyesti kuvattuna testi käsittää pienen kar-rageenimäärän ruiskutuksen aikuisten valkeiden rottien 15 polkuanturaan. Tämän tiedetään aiheuttavan tulehdusreak tion. Siitä syntyvän turvotuksen määrä voidaan mitata. AF:a sisältäviä näytteitä annetaan rotalle sopivalla annostelutavalla, mieluimmin ruiskeena vatsaonteloon, ja tulehdus tapahtuman estyminen tai lieventyminen määritetään 20 joko tilavuutta tai painoa mittaavilla menetelmillä.

Yhteenvetona voidaan esittää, että tulehdusta estävä tekijä voidaan eristää hyperimmunisoinnin seurauksena saadusta maidosta käyttäen menetelmää, jossa maito kuoritaan ja siitä poistetaan kaseiini ja molekyylipainoltaan 25 yli 10 000 daltonin suuruiset makromolekyylit, ja jossa puhdistusta jatketaan ioninvaihto- ja molekyylisuodatus-kromatografiaa käyttäen. Tulehdusta estävän aineen asianmukaisten valmisteiden biologinen aktiivisuus voidaan testata rotilla tehtävällä annos-vastekokeella tässä kuvatul-30 la tavalla.

Tämä keksintö perustuu osin siihen odottamattomaan havaintoon, että MAIF voidaan eristää ja puhdistaa, ja että sillä on tehokkuutta hoidettaessa ihmisillä ja eläimillä esiintyviä tulehdusilmiöitä. Edullisen suoritusmuo-35 don mukaan MAIF tuotetaan käyttämällä bakteeriantigeeni- 15 98269 rokotetta vastaan hyperimmunisoituja maitoa tuottavia eläimiä. Eläinten hyperimmunisointiin käytetty rokote ei sisällä tulehdusta estävää aktiivisuutta. Sentähden on hämmästyttävää, että sekabakteeriantigeenia vastaan immu-5 nisoiduista eläimistä eristetyllä ja puhdistetulla tekijällä suoritettu hoito tehoaa tulehdusilmiöiden lievittämiseen tai ehkäisemiseen.

Kun tätä keksintöä on edellä kuvattu yleisellä tasolla, sitä kuvataan vielä erityisten esimerkkien valossa, 10 jotka esitetään tässä vain selitykseksi olematta keksintöä rajoittavia, ellei toisin ole mainittu.

Maitojen valmistus

Esimerkki IA

S-100 rokotteen valmistus 15 Jäljempänä olevassa taulukossa 1 esitetystä baktee rien seoksesta koostuva, laitoksesta American Type Culture Collection hankittu bakteeriviljelmä rekonstituoitiin 15 ml:11a ravintoliuosta ja inkuboitiin yön yli 37 °C lämpötilassa. Kun kasvu oli hyvää, käytettiin noin puolet bak-20 teerisuspensiosta ymppinä litraan lihalientä, ja ympättyä liuosta inkuboitiin 37 °C lämpötilassa. Loput suspensiosta siirrettiin steriileihin glykoliputkiin ja varastoitiin -20 ®C lämpötilassa korkeintaan kuuden kuukauden ajan.

Kun viljelmässä oli näkyvissä hyvä kasvu, bakteeri-25 solut kerättiin talteen sentrifugoimalla suspensio 20 minuutin ajan ravintoliuoksen poistamiseksi. Saatu bakteeri-sakka suspensoitiin steriiliin suolaliuokseen ja bakteeri-näyte sentrifugoitiin kolmesti ravintoliuoksen pesemiseksi soluista. Kolmannen steriilisuolaliuospesun jälkeen sen-30 trifugoinnista saatu bakteerisakka suspensoitiin pieneen määrään kahdesti tislattua vettä.

Ravintoliuoksesta puhdistettu bakteerisuspensio tapettiin lämmöllä asettamalla lasipullossa oleva suspensio yön yli 80 °C lämpöhauteeseen. Lihaliemiviljelmän elinkyky 35 testattiin pienestä määrästä lämmöllä tapettuja bakteerei- • 98269 16 ta. Lämmöllä tapettuja bakteereita ympättiin lihaliemeen, inkuboitiin 5 päivää 37 °C lämpötilassa ja tarkastettiin päivittäin kasvun varalta, sillä rokotteena käytettävien bakteerien tulee olla tapettuja.

5 Lämmöllä tapetut bakteerit kylmäkuivattin kuiviksi asti. Kuivat bakteerit sekoitettiin sitten steriiliin suolaliuokseen pitoisuuteen 2,2 x 10® bakteerisolua/ml suolaliuosta (optisen tiheyden lukema 1,0 660 nm:ssa).

98269 17

Taulukko 1 S-100 bakteeriluettelo

Nimi Ravinto- Gram ATCC # 5 liuos + tai - 1. Staph, aureus BHI + 11631 2. Staph, epidermidis BHI + 155 3. Strep, pyogenes, A. Type 1 APT + 8671 4. Strep, pyogenes, A. Type 3 APT + 10389 10 5. Strep, pyogenes, A. Type 5 APT + 12347 6. Strep, pyogenes, A. Type 8 APT + 12349 7. Strep, pyogenes, A. Type 12 APT + 11434 8. Strep, pyogenes, A. Type 14 APT + 12972 9. Strep, pyogenes, A. Type 18 APT + 12357 15 10. Strep, pyogenes, A. Type 22 APT + 10403 11. Aerobakter aerogenes BHI - 884 12. Escherichia coli BHI - 26 13. Salmonella enteritidis BHI - 13076 14. Pseudomonas aeruginosa BHI - 7700 20 15. Klebsiella pneumoniae BHI - 9590 16. Salmonella typhimurium BHI - 13311 17. Haemophilus influenzae BHI - 9333 18. Strep, mitis APT + 6249 19. Proteus vulgaris BHI - 13315 25 20. Shigella dysenteriae BHI - 11835 21. Diplococcus pneumoniae APT + 6303 22. Propionibacter acnes

Actinomyces (anaerobi) Lihaliemi + 11827 23. Strep, sanguis APT + 10556 30 24. Strep, salivarius APT + 13419 25. Strep, mutans BHI + 25175 26. Strep, agalactiae APT + 13813 98269 18

Lehmille annettiin päivittäin ruiskeina 5 ml:n eriä monitehoista nestemäistä rokotetta. Ruiskeita saaneen karjan vasta-ainetiitterien (IgG) tasot määritettiin aikavälein käyttäen monitehorokotteeseen kohdistuvaa vasta-5 ainetta mittaavaa entsyymi-immunomääritystä.

Esimerkki IB

Valmistettiin lämmöllä tapettuja bakteereja edellä esitetyllä tavalla. Erä näin saatua monitehoista antigeeniä mikrokapseloitiin tavanomaisella faasienerottumismene-10 telmällä monitehoisen antigeenejä sisältävän mikropartik- kelituotteen valmistamiseksi. Antigeenejä sisältävät tietyn muotoiset matriisimateriaalit muodostuvat yleensä biologisesti yhteensopivien materiaalien, ensisijaisesti biologisesti hajoavien tai biologisesti kuluvien aineiden 15 polymeereistä, ensisijaisesti polymaitohaposta, polyglyko- lihaposta, maito- ja glykolihappojen kopolymeereistä, po-lykaprolaktonista, kopolyoksalaateista, proteiineista, kuten kollageenista, glyserolin rasvahappoestereistä ja selluloosaestereistä. Nämä polymeerit ovat entuudestaan 20 tunnettuja ja ne on kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa numero 3 773 919; 3 887 699; 4 118 470; 4 076 798; kaikki nämä liitetään viittauksella tähän hakemukseen. Käytetty polymeerinen matriisimateriaali oli biologisesti hajoava maitohappo-glykolihappokopolymeeri.

25 Lämmöllä tapetut bakteeriantigeenit kapseloidaan tällaisiin materiaaleihin ensisijaisesti mikropallosina, jotka ovat läpimitaltaan 1 - 500 pm, mieluummin 10 - 250 pm. Kapselointimenetelmät ovat tavanomaisia ja ne koostuvat faasien erottumismenetelmistä, kohtauspinnoilla tapah-30 tuvista reaktioista ja fysikaalisista menetelmistä. Voidaan käyttää monia matriisiyhdistelmiä ja monia antigeeni-valikoimien pitoisuuksia antamaan optimaaliset bakteerian-tigeenien vapautumisnopeudet mikropartikkeleista isännän ruumiiseen. Tavanomaisen ammatitaidon omaaville näiden 98269 19 yhdistelmien määritys on mahdollista ilman kohtuutonta kokeilua.

Esimerkissä olevat mikropartikkelit olivat läpimitaltaan pienempiä kuin 250 pm. Noin 750 mg 22 % (16,5 mg) 5 monitehoista antigeeniä sisältäviä mikropartikkeleita sus-pentoitiin noin 3 cm3 kantajaa (1 paino-% Tween 20 ja 2 paino-% karboksimetyyliselluloosaa vedessä).

Suuremmasta karjalaumasta valittiin pieni ryhmä karjaa. Näistä satunnaisesti valikoiduista nautaeläimistä 10 valittiin viisi verrokeiksi. Neljään nautaeläimeen annettiin lihaksensisäinen ruiske monitehoista antigeeniä sisältäviä mikropartikkeleita. Mikropartikkelinäytteet steriloitiin 2,0 mRad gammasäteillä. Vasta-aine- (IgG) tiit-teritasot määritettiin rokotetuista lehmistä sekä verrok-15 kilehmistä aikavälein.

Esimerkki 2 MAIF -tekijän eristäminen hyperimmuunimaidosta

Vaihe 1: Maitosuodoksen valmistus

Kaksikymmentä litraa hyperimmunisoiduista lehmistä 20 saatua tuoretta maitoa ajettiin kermaseparaattorin (DeLa- vaOl malli 102) läpi rasvan poistamiseksi.

Saadut kuusitoista litraa kuorittua maitoa ultra-suodatettiin suurimolekulaaristen yhdisteiden (yli 10 000 daltonia) poistamiseksi käyttäen onttokuitudiafiltrointi/ 25 väkevöintilaitetta (Amicon DL-10L). Väkevöintilaite on varustettu kahdella 10 000 daltonin rajäävillä patruunoilla (Amicon H5P10-43). Kuorittu maito ajettiin pumpun mittarin nopeudella 80 tulo- ja menopaineiden ollessa 2,1 kg/cmz ja 1,8 kg/cm2.

30 Patruunoista neljän litran virtaustuntinopeudella saadut kaksitoista litraa suodosta (<10 000 daltonia) pakastettiin tai kylmäkuivattiin säilytystä ja jatkopuhdis-tusta varten.

98269 20

Vaihe 2: Ioninvaihtokromatografia

Suodoksen sisältämä maidon tulehdusta estävä tekijä, MAIF, eristettiin ensin anioninvaihtokromatografia-pylväässä.

5 Tässä työvaiheiden sarjassa täytettiin 5 x 10 cm lasipylväs käyttäen DEAE-Sepharose CL-6B -geeliä (Pharmacia), joka tasapainoitettiin steriilillä kahteen kertaan tislatulla vedellä, pH 7,0.

Litra suodosta (<10 000) ajettiin pylvään läpi ja 10 pylväs eluoitiin steriilillä kahteen kertaan tislatulla vedellä, pH 7,0 virtausnopeudella 160 ml tunnissa. Kymmenen millilitran jakeet kerättiin talteen samalla monitoroiden 280 nm:n aallonpituudella LKB Uvicord 4700 absorp-tiomittarilla, johon oli liitetty optisen tiheyden tulos-15 tava piirturi (Pharmacia REC-482).

Muut varaukseltaan positiiviset ja neutraalit aineet, jotka eivät ole samankaltaisia MAIF:n kanssa, eivät sitoudu DEAE-Sepharose -geeliin. Ne eluoituvat läpimenevässä huipussa (ensimmäisessä huipussa). Negatiivisen va-20 rauksen omaava MAIF jää pylvääseen.

MAIF:n irrottamiseksi pylväs eluoitiin askelgra-dientilla käyttämällä steriiliä fysiologista suolaliuosta, pH 7,0. Tyypillinen profiili esitetään kuviossa 1. Yksittäisten jakeiden biologinen määritys paljasti, että toinen 25 huippu sisälsi MAIF:n. Toisen huipun ja sen olkapään käsittävät jakeet otetaan jatkopuhdistukseen. Saantotutki-mukset osoittavat, että tällä menetelmällä saatiin 8,8 g kuivattua jauhetta.

Vaihe 3: Geelisuodatuskromatografia 30 Vaiheesta 2 saatu toinen huippu sisältää MAIF:n ja muita negatiivisesti varautuneita molekyyleja; tarvittiin vielä yksi puhdistusvaihe. Lisäpuhdistamiseen on kätevää käyttää geelisuodatuspylvästä eri komponenttien erottamiseksi molekyylipainon mukaan.

98269 21 Tässä menetelmässä täytettiin 2,5 x 80 cm lasipyl-väs Sephadex G-10 hartsilla ja tämä tasapainoitettiin steriilillä kahteen kertaan tislatulla vedellä, pH 7,0. Kaksi grammaa vaiheessa 2 saadusta toisesta jakeesta liuotettiin 5 steriiliin kahdesti tislattuun veteen ja imeytettiin pylvään yläpäähän. Pylväs eluoitiin virtausnopeudella 30 ml tunnissa. Jakeet (3,3 ml) kerättiin talteen monitoroiden 254 nm:ssä ja 280 nmrssä (Pharmacia Duo Optical Unit) tulostaen optinen tiheys laitteeseen liitetyllä piirturilla 10 (Pharmacia REC-482).

Eluutioprofiilissa oli tyypillisesti kuvion 2 esittämät kolme huippua. Ensimmäinen ja toinen huippu sisälsivät MAIF -aktiivisuutta.

Ensimmäinen huippu on yhteenkeräytymä, mikä muodos-15 tuu aktiivisen MAIF:n sisältävässä G-10 -pylväässä.

Toinen huippu sisältää MAIF:n yhteenkeräytymättömän muodon. Sekä yhteenkeräytynyt muoto (huippu 1) että yh-teenkeräytymätön muoto (huippu 2) ovat biologisesti aktiivisia biologisessa määrityksessä rotissa.

20 Maidon tulehdusta estävän tekijän luonnehtiminen

Ylläkuvatun menetelmän mukaisesti valmistetun MAIF:n yhteenkeräytymättömän muodon molekyylipainon havaittiin olevan pienempi kuin 10 000 daltonia. Tämä pääteltiin siitä tosiseikasta, että ensimmäinen vaihe MAIF:n 25 eristämiseksi herasta oli ultrasuodatus käyttäen sellaista kalvoa, joka ei päästä läpi molekyylejä, joiden molekyyli-paino >10 000 daltonia.

MAIF:11a on negatiivinen varaus. Tämä määritettiin viemällä maidon ultrasuodos DEAE selluloosa -ioninvaihto-30 pylvääseen. MAIF ei eluoitunut pylväästä vedellä. Eluutio-liuoksen vaihto natriumkloridiliuokseksi (0,9 % pH) aiheutti useiden huippujen eluoitumisen (kuvio 1). Neutraalit ja positiivisesti varautuneet yhdisteet eivät tartu ioninvaihtohartsiin, ja negatiivisesti varautuneet yhdis-35 teet eluoituvat suolapitoisuuden lisääntyessä. Kun alle 22 98269 10 000 daltonin molekyylipainoisista yhdisteistä koostuva suodattimen läpäissyt liuos vietiin DEAE -pylvääseen, neutraalit suolat ja sokerit eluoituivat vedellä (huippu 1, kuvio 1). Kolme toisistaan erottuvaa huippua eluoitui, kun 5 puskuriliuos vaihdettiin suolaliuokseksi (huiput 2 - 4). Toinen huippu ja sen olkapää sisälsivät MAIF:n biologista aktiivisuutta biologisessa määrityksessä rotassa. Johtopäätös tästä on sen vuoksi se, että MAlFrlla on negatiivinen varaus.

10 Vielä yksi MAIF:n kemiallinen ominaisuus on se, että se muodostaa yhteenkeräytymiä suolaa poistettaessa. Tämä ominaisuus ilmenee, kun <10 000 daltonin molekyyli-painoinen suodattimen läpäissyt osuus johdettiin kahteen kertaan tislatulla vedellä tasapainoitettuun Sephadex G-15 10 -pylvääseen ja eluoitiin vedellä, jonka pH oli 7 (kuvio 2). Kolme huippua eluoitui G-10 pylväästä; ensimmäinen huippu eluoitui suoraan läpi tullutta nestettä vastaavalla tilavuudella, mikä viittaa siihen, että molekyylipaino on 10 000 daltonia tai tätä suurempi. Tämä oli odottamatonta, 20 sillä yli 10 000 daltonin suuruiset molekyylit oli edeltäkäsin poistettu tästä näytteestä ultrasuodatuksella. Toinen huippu eluoitui kohdalla, missä tulehdusta estävän tekijän odotettiin eluoituvan. Sekä ensimmäinen että toinen huippu osoittivat tulehdusta estävää biologista aktiivi-25 suutta käpälätestissä rotalla, kun taas kolmannessa huipussa ei ollut aktiivisuutta. Oli hämmästyttävää, että sekä ensimmäisestä että toisesta huipusta löytyi tulehdusta estävää biologista aktiivisuutta. Ensimmäisestä G-10 -pylvään (vaihe 3) huipusta saatu aines kylmäkuivattiin ja 30 vietiin G-100 -pylväseen; yksi huippu eluoitui läpitullut-ta tilavuutta vastaavassa tilavuudessa, mikä viittaa siihen, että molekyylipaino on 100 000 daltonia tai tätä suurempi. Vaiheen 3 G-10 -pylväs poistaa suolan samalla kun eri molekyylipainoiset molekyylilajit erottuvat. Johtopää-35 töksenä on siksi se, että tulehdusta estävä tekijä muodos- .11 . Bm.L nlkl I I I li H· 98269 23 ti suurimolekyylipainoisen yhteenkeräytymän kulkiessaan G-10 -pylvään läpi ja jouduttuaan alttiiksi tästä johtuvalle suolojen poistumiselle. Yhteenkeräytyrnisen aste vaihteli suolapitoisuuden mukaisesti.

5 Yhteenkeräytymisominaisuus viittaa siihen mahdol lisuuteen, että voi muodostua suuri eri molekyylipainois-ten yhdisteiden joukko, jossa on tulehdusta estävästä tekijästä johtuvaa tulehdusta estävää biologista aktiivisuutta. Tämän ominaisuuden keksiminen herättää ajatuksen 10 mahdollisuudesta tuottaa maidon tulehdusta estäviä tekijöitä, joilla on suuri joukko erilaisia, lopputuotteen yhteenkeräytymisasteesta riippuvia biokemiallisia ominaisuuksia. Voisi esimerkiksi olla tuotettavissa tuotteita, joilla olisi pidempiä tai lyhempiä, suurempi- tai pienem-15 pimolekyylipainoisten yhteenkeräy tyrnien tuottamia puoliin- tumisaikoja, siten, että molekyylipainojakaumaa säädeltäisiin valmistuksen aikana vallitsevalla suolapitoisuudella. Tässä kuvattu pylväskromatografiamenetelmä tuottaa biologista aktiivisuutta osoittavan, molekyylipainoltaan pie-20 nimmän yhdisteen, mitä voidaan tuottaa (esim. huippu 2 vaiheen 3 G-10 pylväästä). Tämä havainto herättää myös ajatuksen muiden yhteenkeräytyrnistä aiheuttavien keinojen käytöstä. Esimerkiksi veteen tehty laimennus saa aikaan yhteenkeräytyrnisen. Kemialliset aineet, jotka sitovat suo-25 loja, erityisesti kalsiumia, voivat aiheuttaa yhteenkeräytymän muodostumisen. Tämän keksinnön tultua tehdyksi, ovat muut menetelmät yhteenkeräytymien muodostamiseksi ja MAIFrn erottamiseksi tavanomaisen ammattitaidon omaaville ilmeisiä.

30 Esimerkki 3

Biologinen aktiivisuusmääritys MAIFrn tulehdusta estävä vaikutus testattiin turvotukseen, joka aiheutettiin rotan polkuanturaan annetulla karrageeniliuosruiskeella. MAIFrn kylmäkuivattu näyte 35 liuotettiin sopivaan kantajaan ja annettiin kokeessa käy- « 98269 24 tettyjen rottien vatsaonteloon. Karrageeni annettiin sitten rottiin 0,1 ml:n eränä 1 % suolaliuosta jokaiseen ta-kapolkuanturaan. Polkuanturat mitattiin paksuusmitalla ennen ruiskeiden antamista ja 2,5 tuntia näiden jälkeen.

5 Tulokset kuvataan taulukoissa 2 ja 3.

Verrokki- ja hyperimmuunista maidosta saatu MAIF:n yhteenkeräytymätön muoto (huippu 2 G-10 -pylväästä) aiheutti rotan käpälän tulehduksen vähenemisen 1 mg:n ja 0,25 mg:n välisinä annoksina (taulukko 2). Sekä hyperim-10 muuni maito että tavallinen maito osoittivat aktiivisuutta; hyperimmuuni aines oli kuitenkin tehokkaampaa. Johtopäätöksemme tästä oli, että MAIF esiintyy korkeammassa pitoisuudessa hyperimmuuneista lehmistä saadussa maidossa.

Toinen DEAE -pylväästä saatu huippu osoitti aktii-15 visuutta joko hyperimmuunimaidosta tai tavallisesta maidosta eristettynä (taulukko 3).

G-10 -pylväästä saatu ensimmäinen huippu, joka on MAIF:n yhteenkeräytynyt muoto, osoitti aktiivisuutta käpä-lätesteissä rotalla (Taulukko 2). Yhteenkeräytymä ei ole 20 yhtäläisen painon perusteella yhtä tehokasta kuin yhteenkeräy tymätön .

Näistä kokeista tehdään se johtopäätös, että MAIF tekijä esiintyy luonnollisesti lehmänmaidossa. Lehmien hyperimmunisointi saa aikaan suuremman MAIF -pitoisuden. 25 MAIF on pieni, negatiivisesti varautunut molekyyli, joka voidaan erottaa maidosta eri menetelmillä. MAIF -tekijä voi muodostaa suurimolekyylipainoisia yhteenkeräytymiä, jotka eivät esiinny luonnostaan maidossa, mutta syntyvät käsittelyn aikana.

* 98269 25

Taulukko 2

Tulehdusta estävän tekijän vaikutus tulehduksen vähenemiseen rotissa.

5 -

Valmistettu hyperimmuunista maidosta Polkuanturamittaukset (mm) 10 MAIF 2,5 h tulehdus annos ennen injektion h injektiota jälkeen erotus 2.0 mg/ 15 rotta 3,43 5,01 1,58 46 1.0 mg/ rotta 3,49 5,39 1,90 54 20 0,5 mg/ rotta 3,42 5,51 2,09 61 0,1 mg/ rotta 3,43 5,86 2,43 71 25 verrokki/ suolaliuos 3,43 5,82 2,39 70 30 Valmistettu tavallisesta lehmänmaidosta 2.0 mg/ rotta 3,30 5,24 1,94 59 35 1,0 mg/ ; rotta 3,31 5,22 1,91 58 0,5 mg/ rotta 3,32 5,33 2,01 61 40 0,25 mg/ rotta 3,31 5,42 2,11 64 25 98269

Taulukko 3

Osittain puhdistettujen MAIF -jakeiden välinen vertailu tulehduksen vähenemisen suhteen rotissa (Valmistettu hyperimmunista ja tavallisesta maidosta) 5

Polkuanturamittaukset (mm) 2,5 h Tulehdus 10 Ennen Injektion % injektiota jälkeen Erotus DEAE -pylväs toinen huippu 15 hyperimmuuni maito 2 mg/rotta 3,25 5,04 1,79 55 DEAE -pylväs 20 toinen huippu tavallinen maito 2 mg/rotta 3,30 5,24 1,94 59 25 G-10 -pylväs ensimmäinen huippu 2 mg/rotta 3,31 4,98 1,67 50 30 Verrokki suolaliuos 3,34 5,63 2,29 69 35 Tulehdusta estävän tekijän kemiallinen analyysi

Tulehdusta estävän tekijän näytteet analysoitiin kemiallisesti. Röntgensädediffraktiotutkimusten mukaan MAIF ei ole rakenteeltaan kiteinen. MAIF -valmisteista saatiin alkuaineanalyysitulos, joka oli yhtäpitävä hiili-·. 40 hydraattikoostumuksen kanssa. C, H, 0 -suhteet olivat yh täpitäviä polymeeri- tai oligomeerimateriaalin esiintymisen kanssa, missä jotkin karbinoliryhmät ovat hapettuneet karboksyyleiksi. Pieni kalsiumekvivalenttien ylimäärä kloridi-ionien suhteen voidaan lukea osin karboksyylisuolojen

ia 9M >11! I ' · i M

98269 27 ansioksi. Jäännös voi olla natrium- ja kaliumsuoloja. Kuitenkin sulamiskäyttäytyminen, tai pikemmin tämän käyttäytymisen puute, viittasi suolamaisiin ja/tai suurimoleky-laarisiin koostumuksiin. Aine nykyisessä puhtausasteessaan 5 sisältää ilmeisesti eri määriä kalsiumin ja kloridin suoloja, lultavasti CaC12.

Kumpikaan valmisteista ei sisältänyt merkittävää määrää typpeä, mikä sulkee pois peptideihin kuuluvat komponentit näiden koostumuksessa. Typen puute voi myös sul-10 kea pois aminosokerien ja muiden typpeä sisältävien materiaalien, kuten kompleksisten lipidien esiintymisen pää-ainesosana (-osina).

Pyrolyyttiset massaspektrit paljastivat merkityksellisiä mutta pieniä määriä 18-hiilisiä rasvahappoja. 15 Tämä seikka, yhdessä pienten N ja P -määrien kanssa viittaa siihen, että tekijässä esiintyy kompleksinen lipidi.

Infrapunaspektroskopialla havaittiin absorptioita, jotka olivat yhdenmukaisia karbinoli- ja karboksylaatti-funktioiden esiintymisen kanssa. Ultravioletti-, näkyvän 20 valon ja fluoresenssispektroskopia ei paljastanut merkittäviä määriä kromoforeja infrapunan osoittamien lisäksi.

Kemialliset kokeiden kanssa yhtäpitävää on rakenne, jossa on oligomeerinen hiilihydraatti, jonka karbonyyli-funktio (aldehydi tai ketoni) on kiinni alayksikkösidok-• 25 sissa. Oligomeerisessä hiilihydraatissa on myös jossain määrin sivuketjujen hapettumista karboksylaatiksi.

MAIF -valmiste on olennaisesti, mutta ei täysin puhdas.

Claims (7)

98269

1. Menetelmä olennaisesti puhtaan tulehdusta estävän tekijän eristämiseksi maidosta, joka tekijä käsit- 5 tää oligomeerisen hiilihydraatin, jonka karbonyylifunktio on sidottu alayksikkösidoksiin, ja joka sisältää karbok-sylaatti-ioneiksi hapettuneita sivuketjuja, muodostaa kompleksin kalsium-ionien kanssa ja alifaattisten happojen kanssa ja johon on liittyneenä typpipitoisia yhdisteitä, 10 fosforipitoinen yhdiste ja kompleksinen lipidi ja jossa ei ole oleellisesti rikkiyhdistettä, tunnettu siitä, että (i) poistetaan rasva maitoa tuottavan eläimen maidosta kuoritun maidon valmistamiseksi; 15 (ii) poistetaan kaseiini tästä kuoritusta maidosta heran valmistamiseksi; (iii) poistetaan molekyylipainoltaan suurempien kuin noin 10 000 daltonia olevat makromolekyylit tästä herasta; ja 20 (iv) fraktioidaan edellisestä vaiheesta saatu pienimolekylaarinen tuote ioninvaihtokromatografiällä; (v) jatkopuhdistetaan edellisestä vaiheesta saatu tulehdusta estävä tekijä molekyylisuodatuskromatografiällä; ja 25 (vi) otetaan talteen tämä tulehdusta estävä teki jä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että maitoa tuottava eläin on hyperimmunisoidussa tilassa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hyperimmunisoitu tila saadaan « aikaan antamalla bakteeriantigeeniseosta, joka käsittää bakteerit; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epider-midis; Streptococcus pyogenes, A. Type 1; Streptococcus 35 pyogenes, A. Type 3; Streptococcus pyogenes, A. Type 5; • « 98269 Streptococcus pyogenes, A. Type 8; Streptococcus pyogenes, A. Type 12; Streptococcus pyogenes, A. Type 14; Streptococcus pyogenes, A. Type 18; Streptococcus pyogenes, A. Type 22; Aerobakter aerogenes; Escherichia coli; Pseudo-5 monas aeruginosa; Klebsiella pneumoniae; Salmonella typhi-murium; Haemophilus influenzae; Streptococcus mitis; Proteus vulgaris; Shigella dysenteriae; Diplococcus pneumoniae; Proplonibacter acnes; Actinomyces (anaerobinen); Streptococcus mutans; Streptococcus sanguis; Streptococcus 10 salivarius ja Streptococcus agalactiae.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monitehoinen bakteeriantigee-ni annetaan eläimelle suun kautta.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että mainittu monitehoinen baktee- riantigeeni annetaan ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 10 000 daltonia suurempien makromolekyylien poisto käsittää ultrasuodatuksen sellai- 20 sen molekyylisiiviläkalvon läpi, joka pidättää suuremmat kuin noin 10 000 daltonin molekyylit.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 10 000 daltonia suuremmat makromolekyylit poistetaan molekyylisuodatuskromatogra- 25 fiällä. . i 4 · so 98269