FI115383B - Menetelmä Anti-inflammatorisen tekijän eristämiseksi - Google Patents

Description

115383

Menetelmä Anti-inflammatorisen tekijän eristämiseksi Tämä hakemus on osittain jatkoa US-patenttihakemukselle nro 5 07/580,382, hakemispäivä 11.9.1990, joka on osittain jatkoa US-patenttihakemukselle sarjanumero 177,223, hakemispäivä 4.4.1988 (nykyisin US-patentti nro 4,956,349), joka on osittain jatkoa US-patenttihakemukselle sarjanumero 001,848, hakemispäivä 9.1.1987 (nykyisin US-patentti nro 4,897,265), 10 joka on osittain jatkoa US-patenttihakemukselle sarjanumero 384,625, hakemispäivä 3.6.1982 (nyt hylätty) ja jaettu US-patenttihakemuksesta sarjanumero 546,162, hakemispäivä 27.10.1983 (nykyisin US-patentti nro 4,636,384) ja US-patent-tihakemuksesta sarjanumero 910,297, hakemispäivä 17.9.1986 15 (nykyisin US-patentti nro 4,919,929), joka on jatkohakemus US-patenttihakemukselle sarjanumero 576,001, hakemispäivä 1.2.1983 (nyt hylätty); kaikki nämä sisällytetään tähän kir-jailisuusviitteiksi kokonaisuudessaan.

20 Tämä keksintö koskee menetelmää anti-inflammatorisen (tulehdusta estävän) tekijän valmistamiseksi oleellisesti *. puhtaassa muodossa.

Tulehdus, kuten se määritellään kirjassa Dorland's Medical 25 Dictionary, on "kudosten vaurioitumisen tai tuhoutumisen esiin tuoma paikallinen suojaava reaktio, joka toimii tuho- » t ; ten, laimentaen tai sulkien pois sekä vaurioittavan tekijän * » · V ’ että vaurioituneen kudoksen." Tulehdukselle on luonteenomais ta hiussuonistoon syntyvät aukot, veren rakenneosien vuotami-j ‘ : 30 nen välitiloihin ja leukosyyttien kulkeutuminen tulehtunee- ; seen kudokseen. Makroskooppisella tasolla tähän yhdistyvät • · * yleensä tunnetut kliiniset merkit, punoitus, turvotus, arkuus • « (hyperalgesia) ja kipu. Tämän monimutkaisen reaktion aikana vapautuu paikallisesti kemiallisia välittäjäaineita kuten : : 35 histamiinia, 5-hydroksitryptamiinia, erilaisia kemotaktisia * i » » * 2 115383 tekijöitä, bradykiniiniä, leukotrieenejä ja prostaglandiineja. Fagosyyttiset solut kulkevat alueelle ja solujen ly-sosomien membraanit saattavat revetä, vapauttaen lyyttisiä entsyymejä. Kaikki nämä tapahtumat voivat myötävaikuttaa tu-5 lehdusreaktioon.

Tulehdukseen potilailla, joilla on nivelreuma, liittyy todennäköisesti antigeenin (gammaglobuliini) yhdistyminen vasta-aineen (reumatekijä) ja komplementin kanssa, mikä aiheuttaa 10 leukosyyttejä houkuttelevien kemotaktisten tekijöiden paikallisen vapautumisen. Leukosyytit fagosytoivat antigeeni-vasca-aine ja komplementti -komplekseja ja vapauttavat myös monia entsyymejä, joita niiden lysosomit sisältävät. Lysosomien entsyymit aiheuttavat sitten vaurioita rustoille ja muille 15 kudoksille, ja tämä lisää tulehduksen astetta. Myös soluvälitteiset immuunivasteet voivat osallistua. Tämän prosessin aikana vapautuu myös prostaglandiineja.

Prostaglandiinit, joita todennäköisesti syntyy tulehduksessa, 20 aiheuttavat punoitusta ja lisäävät paikallista veren virtausta. Prostaglandiineilla on kaksi tärkeää vaikutusta verisuoniin, jota muut tulehduksen välittäjäaineet eivät yleisesti omaa - pitkäkestoinen verisuonia laajentava vaikutus ja : kyky ehkäistä sellaisten aineiden, kuten norepinefriini ja . : 25 angiotensiini, verisuonia supistava vaikutus.

I ; ; Monet tulehduksen välittäjäaineista lisäävät verisuonten lä-

» · I

päisevyyttä (vuotoa) hiussuonten jälkeisissä ja keräävissä pikkulaskimoissa. Lisäksi leukosyyttien kulkeminen tulehtu-. , 30 neelle alueelle on tärkeä tekijä tulehdusprosessissa.

» | t · f ! i *·' ' Arthus-reaktio on tulehdusvaste, jonka saa aikaan im- • muunikompleksien muodostuminen ihon alle kohtiin, joissa an- • ti » tigeeni muodostaa kompleksin oman vasta-aineensa kanssa. Neu- , 35 trofiilit kiinnittyvät luonteenomaisesti ihon alle injek- tiokohtaan muodostuneen immunoglobuliinikompleksin Fc-osaan ja vapauttavat sinne hajottavia entsyymejä, aiheuttaen näky 115383 3 vän akuutin tulehduksen. Näin ollen reaktio on ensisijaisesti neutrofiilien välittämä, ja tekijät, jotka vaikuttavat reaktion kehittymiseen, tekevät sen vaikutuksensa välityksellä näihin soluihin.

5

On olemassa useita reittejä, joissa tekijä voisi häiritä neutrof iilien kulkeutumista verisuonista tulehduskohtaan. Eräs sopiva reitti on inhiboida reunustusta, tulehdussolujen palautuvaa "liimautumista" verisuonen seinämän endoteelisolu-10 verhoukseen. Normaalitilassa noin 50 % neutrofiileistä tarttuu palautuvasti, mutta akuutin tulehdusreaktion aikana tarttuminen muuttuu paljon voimakkaammaksi ja on ratkaiseva vaihe neutrofiilien kulkeutumisprosessissa. Vaikka prostaglandiinit eivät todennäköisesti osallistu suoraan kemotaktiseen reakti-15 oon, toinen arakidonihappometabolian tuote, leukotrieeni, on erittäin voimakas kemotaktinen aine.

Anti-inflammatorinen reaktio on mikä tahansa reaktio, jota tulehdus luonnehtii, kuten edellä on määritelty. On hyvin 20 tunnettua lääketieteeseen perehtyneille, että tulehdusreaktio aiheuttaa suuren osan fyysisestä vaivasta, ts. kipua ja toiminnan heikkenemistä, joka on opittu liittämään eri sairauk-·. ' siin ja vammoihin. Näin ollen on yleinen lääketieteellinen :t käytäntö määrätä farmakologisia aineita, joiden vaikutuksesta ; : 25 tulehdusreaktio heikkenee. Aineet, joilla on näitä ominai- ·:* : suuksia, luokitellaan anti-inflammatorisiksi lääkkeiksi. An- j .ti-inflammatorisia lääkkeitä käytetään suuren määrän erilai- . siä sairauksia hoitamiseksi, ja samoja lääkkeitä käytetään « * * usein eri sairauksien hoidossa. Hoito anti-inflammatorisilla . , 30 lääkkeillä ei hoida sairautta vaan useimmiten oiretta, ts.

·;;/ tulehdusta.

i Anti-inflammatoriset, analgeettiset (kipua lievittävät) ja I*"; antipyreettiset (kuumetta laskevat) lääkkeet ovat heterogee- • , 35 ninen joukko yhdisteitä, usein kemiallisesti toisilleen kau kaisia, mutta joille siitä huolimatta on yhteistä tietyt te- >' rapeuttiset vaikutukset ja sivuvaikutukset. Kortikosteroidit 115383 4 edustavat laajimmin käytettyä luokkaa yhdisteitä, joita käytetään anti-inflammatorisen reaktion hoidossa. Proteolyytti-set entsyymit ovat toinen yhdisteluokka, joilla uskotaan olevan anti-inflammatorisia vaikutuksia. Hormonit, jotka saavat 5 suoraan tai epäsuorasti lisämunuaisen kuoren tuottamaan ja erittämään steroideja, edustavat vielä yhtä anti-inflammato-risten yhdisteiden luokkaa. On kuvattu suuri määrä ei-hor-monaalisia anti-inflammatorisia aineita. Näiden joukossa kaikkein laajimmin käytettyjä ovat salisylaatit. Asetyyli-10 salisyylihappo, tai aspiriini, on eniten määrätty analgeet-tis-antipyreettinen ja anti-inflammatorinen aine. Esimerkkejä steroidi- ja ei-steroidi -anti-inflammatorisista aineista on luetteloitu kirjaan the Physician's Desk Reference, 1987 (ks. s. 207 ja 208 tällaisten valmisteiden hakemistosta).

15

Luonnolliset ja synteettiset kortikosteroidivalmisteet saavat aikaan useita vakavia sivuvaikutuksia, joihin kuuluu verenpaineen nousu, suolan ja veden pidättyminen ja lisääntynyt kaliumin ja kalsiumin eritys. Sen lisäksi kortikosteroidit 20 saattavat peittää infektion merkit ja lisätä infektiokykyis-ten mikro-organismien leviämistä. Näiden hormonien käyttöä ei pidetä turvallisena raskaana oleville naisille, ja pitkäai-kainen kortikosteroidihoito on yhdistetty mahan hyperaktiivi-‘ suuteen ja/tai ruoansulatuskanavan haavaumiin. Hoito näillä • * ’ 25 yhdisteillä voi myös pahentaa diabetes mellitusta, joka vaa- · tii suuria annoksia insuliinia, ja voi aiheuttaa psykoottisia ; : : häiriöitä. Hormonaalisilla anti-inflammatorisilla aineilla, jotka lisäävät epäsuorasti endogeenisten kortikosteroidien tuotantoa, on sama mahdollisuus tuottaa haitallisia sivuvai-: 3 0 kutuksia.

• · ·

Ei-hormonaaliset anti-inflammatoriset aineet ovat synteetti- • · ;.· : siä biokemiallisia yhdisteitä, jotka voivat olla suurina an- » noksina toksisia, mihin liittyy suuri joukko ei-toivottavia ; 35 sivuvaikutuksia. Esimerkiksi salisylaatit saavat aikaan vaka- • · .. . via happo-emästasapainon häiriöitä, jotka ovat osoitus näiden ’ * yhdisteluokkien aiheuttamasta myrkytyksestä. Salisylaatit 115383 5 stimuloivat hengitystä suoraan ja epäsuorasti. Myrkylliset annokset salisylaatteja aiheuttavat hengityskeskuksen halvautumisen, samoin kuin verenkierron kollapsin vasomotorisen lamautumisen seurauksena. Salisylaattien nauttiminen voi joh-5 taa sydänalan ahdistukseen, pahoinvointiin ja ylenantamiseen. Salisylaattien indusoima verenvuoto mahassa on hyvin tunnettua. Salisylaatit saattavat aiheuttaa maksavaurioita ja johtaa hyytymisajan pitenemiseen. Sen vuoksi aspiriinia tulisi välttää potilailla, joilla on vakavia maksavaurioita, hypo-10 protrombinemiaa (veren protrombiininiukkuutta), K-vitamiinin puutos tai hemofilia, koska salisylaattien aiheuttama verihiutaleiden hemostaasin inhibitio voi johtaa verenvuotoon. Salisylaattimyrkytys on yleinen ja yli 10 000 vakavaa sali-sylaattimyrkytystapausta tavataan Yhdysvalloissa joka vuosi, 15 joidenkin näistä johtaessa kuolemaan, ja monien esiintyessä lapsilla. Katso Goodman ja Gilman, the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. painos, 1985. Niinpä huolimatta suuresta määrästä anti-inflammatorisia aineita, joita nykyisin on saatavilla, on silti olemassa tarve turvalliselle, tehokkaalle 20 anti-inflammatoriselle tuotteelle, joka ei aiheuta sivuvaikutuksia ja haitallisia reaktioita.

' ’ Jos voitaisiin esimerkiksi saada luonnollinen ravintotuote, : kuten maidosta saatu, jolla olisi anti-inflammatorisia vaiku- - 25 tuksia, se voisi olla helposti annettava, helposti saatava, ·: : turvallinen terapeuttinen koostumus.

* * .·". Alan tunnettuun tekniikkaan kuuluu sellaisten maitojen tuo tanto, joilla on joukko terapeuttisia ominaisuuksia. Beck on . . 30 esimerkiksi kuvannut maidon, joka sisältää vasta-ainetta *;Y Streptococcus mutansille. ja jolla on hammaskariesta ehkäi- ’·’ ’ sevää vaikutusta (US-patentti nro 4,324,782). Maitoa saadaan i ; : immunisoimalla lehmä S. mutansin antigeenillä kahdessa vai- heessa ja ottamalla siitä maitoa.

' . 35

Stolle et ai. ovat kuvanneet menetelmän tupakointiin liit-' ·* tyvien verisuonisairauksien tai keuhkosairauksien hoitamisek- 115383 6 si eläimillä, jolloin menetelmässä annetaan eläimelle maitoa, joka on saatu lehmästä, jota on pidetty hyperimmuunitilassa (US-patentti nro 4,636,384). Beck on kuvannut menetelmän eläimen tulehduksen hoitamiseksi, jolloin menetelmässä anne-5 taan eläimelle anti-inflammatorisesti tehokas määrä maitoa, joka on saatu lehmästä, jota on pidetty anti-inflammatorista tekijää tuottavassa tilassa (US-patentti nro 4,284,623). Heinbach, US-patentti nro 3,128,230, on kuvannut maidon, joka sisältää alfa, beeta ja gammaglobuliinien komponentteja, kun 10 lehmään on siirrostettu antigeenisiä seoksia. Peterson et ai. (US-patentti nro 3,376,198), Holm (US-patenttihakemus (julkaistu), sarjanumero 628,987), Tunnah et ai. (GB-patentti nro 1,211,876) ja Biokema, S. A. (GB-patentti 1,442,283) ovat myöskin kuvanneet vasta-ainetta sisältäviä maitoja.

15

Julkaisussa W0 92/04035 on esitetty maitoa tuottavan eläimen maidosta eristetyn oleellisesti puhtaan, tulehduksenvastaisen aineen (MAIF) valmistaminen, aineen puhdistaminen, tunnistaminen ja karakterisointi sekä menetelmä tulehduksen 20 hoitamiseksi eläimellä, mikä käsittää tulehduksenvastaisen aineen tulehduksenvastaisesti tehokkaan määrän antamisen eläimelle. Tämä tunnettu MAIF- koostumus tuottaa esimerkiksi . ·, neutrofiilisen adheesion, -emigraation ja -vuon alenemisen.

. 25 Julkaisu US 4,956,349 liittyy maitoa tuottavan eläimen * > . maidosta eristettyyn oleellisesti puhtaaseen tulehduksen- * * ' vastaiseen aineeseen, aineen puhdistamiseen, tunnistamiseen '·' ' ja karakterisointiin sekä menetelmään tulehduksen hoitami seksi eläimellä, mikä käsittää tulehduksenvastaisen aineen • · : ’ ’ 3 0 tulehduksenvastaisesti tehokkaan määrän antamisen eläimelle.

Edullisessa suoritusmuodossa tekijä on eristetty hyper- .···, immunoidussa tilassa pidetyn, maitoa tuottavan eläimen ti<’; maidosta.

• 1 '.· ' 35 Missään edellä mainituista viitteistä ei kuitenkaan ole tun- \‘·· nistettu terapeuttisten maitojen komponenttia tai komponent teja, jotka saavat aikaan halutut terapeuttiset vaikutukset.

7 115383

Esimerkiksi Beckin US-patentissa nro 4,284,623, terapeuttisina välineinä käytetyt maitotuotteet koostuvat joko nestemäisestä kokomaidosta, nestemäisestä rasvattomasta herasta tai kokomaitojauheista. Vaikka kaikilla näillä maitotuotteilla on 5 anti-inflammatorisia ominaisuuksia, tekijää tai tekijöitä, jotka todellisuudessa saavat aikaan terapeuttiset edut, ei ole vielä eristetty tai tunnistettu.

Tämä keksintö koskee useita menetelmiä, joissa käytetään 10 maidossa olevaa anti - inflammatorista tekijää, joka on valmistettu maidosta poistamalla maidosta rasva, suodattamalla maito niin, että poistetaan molekyylit, joiden molekyylipaino on suurempi kuin noin 10 000 daltonia, fraktioidaan pienimole- ! kyylipainoiset molekyylit sisältävä suodos ioninvaihdolla, 15 rikastetaan vielä ioninvaihtofraktiot tekijän suhteen gee-lisuodatuksella ja rikastetaan vielä geelisuodatusfraktiot affiniteettikromatografiällä käyttäen kromatografiaväliainet-j ta, jolla on affiniteetti samantasoisiin, vierekkäisiin cis- j hydroksyyliryhmiin.

j 20

Keksinnössä kuvataan myös anti - inflammatorisen tekijän käyttö nisäkkäille, estämään solujen poistumista verisuonistosta ja tukahduttamaan lymfosyyttien mitogeenistä reaktiota vieraisiin antigeeneihin.

’·, ; 25 ': : Täydellisempi arvio keksinnöstä ja monista siihen liittyvistä ; ; eduista saavutetaan helposti, kun keksintö tulee paremmin . ymmärretyksi seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta, kun sitä tarkastellaan yhdessä mukaan liitettyjen kuvioiden kans-30 sa, joissa:

Kuvio 1. Anti-inflammatorisen tekijän eristäminen ionin-> vaihtokromatograf iällä DEAE-selluloosapylväässä .

% » 115383 8

Kuvio 2. DEAE-selluloosakromatografiästä (kuvio 1) tulevan anti-inflammatorisen tekijän sisältävän huipun (toinen) frak-tiointi Sephadex G-10 molekyyliseulapylväässä.

5 Kuvio 3. Immuunimaidon vaikutus karrageenanilla indusoituun turvotukseen rotilla (käpälän paino % kontrollikäpälästä, keskiarvo ± keskihajonta, n = 10).

Kuvio 4. Anti-inflammatorisen tekijän intraperitoneaalisen 10 annon vaikutus jalan polkuanturan turvotukseen rotilla (μΐ, keskiarvo ± keskihajonta, n = 6).

Kuvio 5. Intraperitoneaalisten annosten annos-vastekäyrä anti-inf lammatoriselle tekijälle rotan käpälän turvotustestissä 15 (% kontrollista, keskiarvo ± keskihajonta, n = 6).

Kuvio 6. Hyperimmuunin maidon tekijän vaikutus verrattuna plaseboon (laktoosi) jalan polkuanturan turvotukseen rotilla (% kontrollista, keskiarvo + keskihajonta, n = 6).

20 Kuvio 7. Intravenaalisen ja oraalisen MAIF:n vaikutus rottien jalan polkuanturan turvotukseen (% kontrollista, keskiarvo ± keskihajonta, n = 6).

Kuvio 8. Pienen intravenaalisen MAIF-annoksen vaikutus rot-25 tien jalan polkuanturan turvotukseen (% kontrollista, keski-’ arvo ± keskihajonta, n = 6) .

i : : .· ; Kuvio 9. MAIF:n intravenaalisen annoksen annos-vastekäyrä rotan käpälän turvotustestissä (% kontrollista, keskiarvo ± ; 3 0 keskihajonta, n = 6) .

t · I

• Kuvio 10. Ajo 1, kaksoskarja/ultrasuodatuskokeet (% keskimää- : räisestä kontrolliturvotuksesta, keskiarvo ± keskihajonta, n = 6) .

35 • » * 115383 9

Kuvio 11. Ajo 2, kaksoskarja/ultrasuodatuskokeet (% keskimääräisestä kontrolliturvotuksesta, keskiarvo ± keskihajonta, n = 6) .

5 Kuvio 12. Ajo 3, kaksoskarja/ultrasuodatuskokeet (% keskimääräisestä kontrolliturvotuksesta, keskiarvo ± keskihajonta, n = 6) .

Kuvio 13. Erilaisten MAIF-käsittelyjen vaikutus jalan polku-10 anturan turvotuksen ehkäisyyn rotilla (/xl jalan polkuanturan turvotusta, keskiarvo ± keskihajonta, n = 6).

Kuvio 14. MAIF-fraktioiden ja immuuni-wpc:n vaikutukset rottien jalan polkuanturan turvotuksen inhibitioon (μΐ jalan 15 polkuanturan turvotusta, keskiarvo + keskihajonta, n = 6).

Kuvio 15. Viiden eri nukutusaineen vaikutukset rotan jalan polkuanturan reaktioon karrageenaniin. Turvotuksen kertymistä seurattiin tietyin ajanjaksoin samoissa eläimissä, n = 6 kus-20 sakin datapisteessä.

Kuvio 16. Karrageenanin aiheuttaman reaktion kaksivaiheisen ' luonteen osoittaminen rotan jalan polkuanturassa. n = 5 kus- ; sakin datapisteessä. Nukutusaineena käytettiin eetteriä.

’ : 25 : ί Kuvio 17. MAIF, annettuna joko 5 mg rottaa kohti (A) tai 40 { ; mg rottaa kohti (B) ei inhiboi karrageenanin aiheuttamaa tu- * * * .* l, lehdusreaktiota eetterillä nukutetuissa rotissa, n = 4 kai- > < i kissa datapisteissä.

; 30

Kuvio 18. Karrageenanin indusoiman turvotuksen kertymisen t > i estäminen sekundäärisen, fagosyyttien välittämän reaktion \ ] aikana 40 mg: 11a MAIF: ia, injektoituna intravenaalisesti kar- Γ”: rageenan-altistuksen ajankohtana (aika 0). n = 12 kussakin 35 datapisteessä kontrolliryhmässä ja n = 10 kussakin datapis- * · , teessä MAIF:11a käsitellyssä ryhmässä.

► · 115383 10

Kuvio 19. MAIF:n vaikutus, annettuna intravenaalisesti 4 mg kullekin rotalle eri aikoina, karrageenanin aiheuttamaan reaktioon rotan jalan polkuanturassa. Turvotus arvioitiin 4 tunnin kuluttua altistuksesta kussakin tapauksessa, n = 12 5 kussakin datapisteessä.

Kuvio 20. 20 mg:n MAIF:ia vaikutus injektoituna intravenaalisesti käänteiseen passiiviseen Arthus-reaktioon. 1 = p < 0,01, ** = p < 0,05.

10

Kuvio 21. Pienenevien MAIF-annosten vaikutus neutrofiilien kykyyn siirtyä verisuonistosta ihon alle siirrostettuihin steriileihin sieniin. = p < 0,01.

15 Kuvio 22. MAIF:n vaikutus, annettuna 20 mg annoksena kullekin rotalle, inhiboida tulehdussolujen kykyä kerääntyä ihon alle siirrostettuihin sieniin, kun MAIF annetaan siirros-tusajankohtana tai aina 120 minuuttiin siirrostuksen jälkeen.

* = p < 0,01.

20

Kuvio 23. Tulehdukseen liittyvän solujen tihkumisen eteneminen ajan kuluessa ihon alle siirrostettuihin sieniin normaa-' ' leiliä eläimillä.

t ‘ 25 Kuvio 24. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmistei- '< den vaikutus verihiutaleita aktivoivan tekijän (PAF) indusoi- ! : : maan neutrofiilien tarttumiseen pikkulaskimoihin.

i ; :

Kuvio 25. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmistei-: 3 0 den vaikutus PAF: n indusoimaan neutrof iilien kulkeutumiseen.

f » ! I

V I t *, Kuvio 26. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmistei- l'\ l den vaikutus PAF: n indusoimaan neutrof iilien vuotoon pikku- i' laskimoiden läpi.

' . 35 * r # » » ,, , Kuvio 27. Neutrofiilien takertumisen kumoaminen anti-in- * » ► ** flammatorisen tekijän valmisteilla. Kuviossa 27a esitetään 115385 11 MAIF-valmisteen tehokkuus (40 mg/rotta) pienentää reaktiona PAFriin pikkulaskimoihin tarttuvien neutrofiilien lukumäärää. Kuviossa 27b esitetään MAIF-valmisteen (40 mg/rotta) vaikutus uusiin neutrofiili-endoteelisolutarttumisiin.

5

Kuvio 28. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmisteiden vaikutus neutrofiilien nopeuteen pikkulaskimoissa.

Kuvio 29. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmistei-10 den vaikutus punasolujen nopeuteen pikkulaskimoissa.

Kuvio 30. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmisteiden vaikutus leukosyyttien virtaan pikkulaskimoissa.

15 Kuvio 31. 40 mg:n MAIF-valmistetta vaikutus, annettuna int-ravenaalisesti, kiertävien neutrofiilien ja lymfosyyttien lukumäärään 24 tunnissa injektion jälkeen.

Kuvio 32. Intravenaalisesti annetun MAIF-valmisteen ja 20 kiertävien leukosyyttien lukumäärän annos-vaste-suhde (p < 0,01).

Kuvio 33. Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus lymfosyyttien toiminnan eri puoliin. Kuviossa 33a esitetään tekijän aikai-' 25 semman antamisen vaikutus isännän T-lymfosyyttien reaktioon • : vieraisiin histokompatibiliteettiantigeeneihin. Kuviossa 33b j : j esitetään saadut tulokset, kun lymfosyyttejä MAIF:lla käsi- * · i tellyistä rotista injektoidaan käsittelemättömiin rottiin.

Kuviot 33C ja 33D osoittavat MAIF-käsittelyn vaikutuksen per-3 0 nan painoon ja pernasolujen lukumäärään rotissa. Kuvio 33E ’ osoittaa MAIF-käsittelyn vaikutuksen konkanavaliini A:n sti- t ) i muloimaan lymfosyyttien mitogeeniseen reaktioon.

i % > » »

* 1 I

i t i s

Kuvio 34. Infektion indusoiman turvotuksen suppressio 40 35 mg:11a MAIF: ia injektoituna intravenaalisesti. Keskiarvot • t kahdesta ryhmästä olivat: kontrollit 87 ± 22 μΐ, MAIF 45 + 17 ’ μΐ, p < 0,01.

115383 12

Kuvio 35. MAIF:n vaikutus annettuna intravenaalisesti 40 mg kullekin rotalle bakteerien replikaatioon ja ihon alle siir-rostettuihin, E. colilla infektoituihin sieniin.

5 Kuvio 36. MAIF:n (40 mg intravenaalisesti kullekin rotalle) aikaansaama inhibitio tulehdussolujen siirtymiseen infektoi-tuihin sieniin.

Kuvio 37. MAIF:n (40 mg intravenaalisesti kullekin rotalle) 10 vaikutus tulehdusnesteen kertymisen välivaiheen (4 - 16 tuntia) suppressioon E. colilla infektoiduissa sienissä.

Kuvio 38. 40 mg:n MAIF:ia vaikutus, annettuna intravenaalisesti altistusajankohtana ja 48 tuntia myöhemmin, kokeellisen 15 pyelonefriitin patogeneesiin. Katkoviiva vasemmanpuoleisessa kaaviossa esittää taustakeskiarvoa munuaisten painosta. * < 0,01, ** = p < 0,02.

Keksintö käsittää anti-inflammatorisen tekijän eristämisen ja 20 puhdistamisen maidosta ja mainitun tekijän antamisen eläimelle tarkoituksessa hoitaa anti-inflammatorisia sairauksia. Jollei toisin ilmoiteta, käytetään seuraavia määritelmiä: Määritelmä "maidon anti-inflammatorinen tekijä" merkitsee te-25 kijää, joka saadaan joko hyperimmuunimaidosta tai normaalin * lehmän maidosta. Määritelmä "olennaisesti puhdas maidon anti- : inflammatorinen tekijä" merkitsee tämän keksinnön tarkoituk- f siä varten anti-inflammatorista tekijää, joka eluoituu yhtenä t pääasiallisena symmetrisenä huippuna (piikkinä) HPLC-kromato-j , 30 grafiassa, suurimolekyylipainoisten aineiden (> 10 000 dalto- ,· ·, nia) poistamisen jälkeen ja pienimolekyylipainoisten, nega- » < i tiivisesti varautuneiden aineiden eristämisen jälkeen ionin- t ’ i » ί vaihtokromatografiällä. Sekä normaalia maitoa että hyperim- *,,,· muunimaitoa voidaan prosessoida tässä kuvatuilla menetelmil- 35 lä, jotta saadaan anti-inf lammatorinen tekijä.

* i :· > »

I ‘ I » I

• I

115383 13 Määritelmä "hyperimmuunimaito" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia varten maitoa, joka on saatu maitoa tuottavista eläimistä, joita on pidetty hyperimmuunitilassa; hyperim-munisaation yksityiskohdat kuvataan yksityiskohtaisemmin jäl-5 j empänä.

Määritelmä "hera" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia varten maitoa, josa on poistettu kerma.

10 Määritelmä "normaali maito" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia varten maitoa, joka on saatu maitoa tuottavista eläimistä tavanomaisilla tavoilla ja maitotalouden käytännön mukaisesti .

15 Määritelmä "maitoa tuottava eläin" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia varten nisäkästä, joka tuottaa maitoa kaupallisesti käyttökelpoisia määriä, edullisesti lehmiä, lampaita ja vuohia, edullisemmin maitotalouslehmiä, jotka kuuluvat sukuun Bos (nauta), erityisesti niitä rotuja, jotka antavat suurim-20 mat saannot maitoa, kuten Holstein.

Määritelmä "bakteeriantigeeni" merkitsee tämän keksinnön tar-koituksia varten lyofilisoitua valmistetta lämpötapetuista bakteerisoluista.

25 Määritelmä "mikrokapseloitu muoto" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia varten polymeerisiä mikropartikkeleita, joihin . kapseloidaan yksi tai useampi bakteeriantigeeni annettavaksi V · maitoa tuottaville eläimille.

30 i Määritelmä "tulehdus" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia

• · I

varten paikallista suojaavaa reaktiota, jonka saa esiin ku- , dosten vaurioituminen tai tuhoutuminen, ja joka palvelee tu- • » · ’ hoten, laimentaen tai sulkien pois sekä vaurioittavan aineen ’··.* 35 että vaurioituneen kudoksen, ja jolle on sen akuutissa muo- ·;·'· dossa luonteenomaista klassinen tapahtumajärjestys kipu, kuu- IV; moitus, turpoaminen ja toiminnan menetys, ja johon kuuluu 115383 14 histologisesti monimutkainen sarja tapahtumia, mukaanluettuna pikkuvaltimoiden, hiussuonten ja pikkulaskimoiden laajentuminen, johon liittyy lisääntynyt läpäisevyys ja veren virtaus, plasmaproteiineja sisältävien nesteiden tulehduksellinen tih-5 kuminen ja leukosyyttien kulkeutuminen tulehduspisteeseen.

Määritelmä "hoito" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia varten, että sairauden ja/tai sairauden patogeenisen alkuperän oireet parannetaan tai poistetaan täysin.

10 Määritelmä "antaa" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia varten mitä tahansa menetelmää yksilön hoitamiseksi aineella, kuten esimerkiksi oraalisesti, intranasaalisesti, parenteraa-lisesti (intravenaalisesti, intramuskulaarisesti tai subku-15 taanisesti) tai rektaalisesti.

Määritelmä "eläin" merkitsee tämän keksinnön tarkoituksia varten mitä tahansa elävää olentoa, joka altistuu tulehdukselle, mukaanluettuna ihmiset, maatalouseläimet, kotieläimet 20 tai eläintarhaeläimet.

Esimerkkejä tulehdustiloista, joita voidaan hoitaa tämän keksinnön mukaisella eristetyllä ja puhdistetulla maitotuotteel-la ovat tilat, jotka valitaan joukosta, johon kuuluvat akuut- > t ;*. 25 ti ja subakuutti limapussintulehdus (bursitis), akuutti epä- spesifinen jännetulehdus (tendinitis), systeeminen punahukka . , (lupus erythematosus), systeeminen ihon ja ihonalaiskudoksen **!,' tulehdustauti lihastulehduksineen (dermatomyositis) , akuutti ’*’’ reumaattinen sydäntulehdus, rakkulaihottuma, rakkulainen iho- 30 tulehdus, rokahtumat, vakava punoitus, monimuotoinen hilsei- t · i,i ; levä ihotulehdus, kirroosi, kausittainen monivuotinen nuha, * · · lt·' ’ keuhkoastma, virhepaikkainen ihotulehdus (ectopic dermati- : ,·, tis) , seerumisairaus, sarveiskalvontulehdus, silmän värikal- * · · ".V von tulehdus, diffuusi virtsatietulehdus, äänihuulen tuleh- * · 35 dus, silmähermon tulehdus, silmän myötätulehdus, oireellinen sarkoidoosi, Löfflerin syndrooma, beryl 1 iummyrkytys, hemo-; · : lyyttinen anemia, nisätulehdus, kosketusihottuma, allerginen 15 115383 sidekalvontulehdus, psoriasikseen liittyvä niveltulehdus, [ jäykistävä nikamatulehdus, akuutti kihti ja vyöruusu. Lisäksi eristettyä ja puhdistettua maitotuotetta voidaan käyttää niiden yksilöiden hoitoon, jotka altistuvat mahdollisille tuleh-5 duksen aiheuttajille.

Keksintö perustuu osaksi siihen havaintoon, että kun maitoa tuottava eläin, kuten nauta, saatetaan erityiseen hyperim-muunisaation tilaan, eläin tuottaa maitoa, jossa on yli nor-10 maalin tason erittäin hyödyllistä anti-inflammatorista tekijää, joka mainittu tekijä ei ainoastaan suppressor tulehdusoireita ihmisellä ja muilla eläimillä, vaan on myös profylaktinen aine ennakoiden tulehduksen aiheuttajien läsnäolon vastaanottajassa. Määritelmä "yli normaalien tasojen" tar-15 koittaa tasoja, joissa on enemmän kuin mitä havaitaan ei-hyperimmunisoitujen eläinten maidosta. Yksin immuuniherkkyyden induktio on riittämätön saamaan aikaan yli normaalien tasojen olevia tasoja MAIFria maidossa, kuten osoittaa se tosiseikka, että normaalin lehmän maito ei sisällä näitä yli normaalin 20 olevia tasoja, vaikka lehmät ovat herkistyneet useita anti-geenejä vastaan normaalin immunisaation aikana lehmien sai-: rauksia vastaan ja ympäristön aiheuttaman normaalin altistuk- sen aikana. Maidossa on toivottuja yli normaalin olevia taso-ja ainoastaan erityisissä hyperimmuunitiloissa.

25 • · Tämä erityinen tila voidaan saavuttaa antamalla alkuimmu- nisointi, jota seuraavat ajoittaiset tehosteet riittävän suu- . , rilla annoksilla erityisiä antigeenejä. Edullisen tehostean- • * · ’_·· : noksen tulisi olla sama tai enemmän kuin 50 % annoksesta, *··* 30 joka on välttämätön tuottamaan primaari-immunisaatio naudal- ·:·· le. Näin ollen on olemassa vähimmäisannos tehostetta, minkä alle ominaisuuksia ei tuoteta maidossa, vaikka lehmä on ti- < · · lassa, jota normaalisti kutsuttaisiin immuunitilaksi. Jotta ’ saavutettaisiin vaadittu hyperimmuunitila, on olennaista tes- ’ * 35 tata hyperimmuunimaito, kun on annettu ensimmäinen sarja te hosteita. Jos hyödylliset tekijät eivät ole läsnä maidossa, 16 1153:83 suuria annoksia lisätehosteita annetaan, kunnes ominaisuudet ilmenevät maidossa.

Menetelmä yli normaalien tasojen anti-inflammatorista tekijää 5 sisältävän hyperimmuunimaidon tuottamiseksi on kuvattu samaan aikaan vireillä olevassa US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 580,382, hakemispäivä 11.9.1990, ja myöskin US-sarjanumerossa 355,786, hakemispäivä 22.5.1989 (nykyisin US-patentti nro 5,106,618, US-sarjanumeron 069,139, hakemispäivä 10 2.7.1987 jatkohakemus) ja US-sarjanumerossa 910,297, hakemis päivä 17.9.1986 (nykyisin US-patentti nro 4,919,929, US-sar-janumeron 576,001 jatkohakemus, hakemispäivä 1.2.1983); nämä kaikki sisällytetään tähän kirjallisuusviitteiksi kokonaisuudessaan. Lyhyesti sanottuna yksi menetelmä yli normaalien 15 tasojen anti-inflammatorista tekijää sisältävän hyperim- muunimaidon valmistamiseksi käsittää seuraavat vaiheet: (1) antigeenin valinta, (2) naudan primaarinen immunisointi, (3) seerumin testaus herkkyyden induktion varmistamiseksi, (4) hyperimmunisointi sopivilla tehosteannoksilla ja haluttaessa 20 (5) maidon testaus anti-inflammatoristen ominaisuuksien suh teen, (6) maidon kerääminen hyperimmuuninaudasta ja (7) maidon prosessoiminen MAIF:n eristämiseksi.

t .· ·, Vaihe 1: Voidaan käyttää mitä tahansa antigeeniä tai antigee- ·.) 25 nien yhdistelmää. Antigeenit voivat olla bakteeri-, virus-, , alkueläin-, sieni-, soluantigeenejä tai mitä tahansa muita aineita, joihin maidontuottajaeläimen immuunijärjestelmä rea- ··· · goi. Kriittinen kohta tässä vaiheessa on se, että antigeenin

< · I

V ' (antigeenien) tulee kyetä, ei ainoastaan indusoimaan immuuni- 30 ja hyperimmuunitiloja maidontuottajaeläimessä, vaan myöskin • t •J : tuottamaan yli normaalin olevia tasoja anti-inflammatorista tekijää maitoon. Mitä tahansa antigeeniä voidaan käyttää te- . kijän yli normaalin olevien tasojen tuottamiseksi. Eräs edul- • * » linen rokote on polyvalenttisten bakteeriantigeenien seos, i •y 35 jota kutsutaan Series 100 -rokotteeksi, ja joka on kuvattu *:**: yksityiskohtaisesti esimerkissä IA jäljempänä.

115383 17

Vaihe 2: Antigeeni (antigeenit) voidaan antaa millä tahansa menetelmällä, joka saa aikaan herkistymisen. Eräässä menetelmässä rokote, joka käsittää antigeenin, joka on saatu 1 x 106 - 1 x 1020, edullisesti 108 - 1010, edullisimmin 2 x 10® 5 lämpötapetusta bakteerista, annetaan intramuskulaarisena injektiona. Muita menetelmiä, kuten intravenaalista injektiota, intraperitoneaalista injektiota, peräpuikkoa tai oraalista antotapaa, voidaan käyttää.

10 Vaihe 3: On välttämätöntä määrittää, onko maidontuottajaeläin herkistynyt antigeenille. Herkkyyden testaamiseksi on olemassa joukko menetelmiä, jotka ovat immunologian alaan perehtyneiden tuntemia (Methods in Immunology and Immunochemistry, William, C. A. ja Chase, W. M., Academic Press, New York, 15 osat 1-5 (1975)). Edullisessa menetelmässä käytetään poly-valenttista rokotetta, joka käsittää monia bakteerilajeja antigeeninä, ja testataan agglutinoivien vasta-aineiden läsnäolo eläimen seerumista ennen ja jälkeen altistuksen rokotteella. Maidon vasta-aineiden ilmaantuminen rokotteella im-20 munisoinnin jälkeen osoittaa herkkyyttä; tässä vaiheessa on mahdollista edetä vaiheeseen 4.

Vaihe 4: Tämä käsittää hyperimmuunitilan induktion ja ylläpi-tämisen herkistetyssä eläimessä. Tämä toteutetaan toiste- * * » *;·, 25 tuilla tehosterokotteiden annolla tietyin välein samalla po- . lyvalenttisella rokotteella, jota käytettiin aikaansaamaan • · , . primaarinen herkistys. Kahden viikon tehosteväli on optimaa- *;;· linen polyvalenttisille bakteeriantigeeneille. On kuitenkin • · · “·'’ välttämätöntä varmistaa, ettei eläin joudu hyperimmuunitilas- 30 ta immuunitoleranssin tilaan antigeenin suhteen.

: : : Edullisessa suoritusmuodossa nautojen hyperimmunisaatio voi- ; daan saada aikaan antamalla yksi mikrokapseloitu rokote, joka I I t *!!.* on valmistettu, kuten esimerkissä IB jäljempänä on kuvattu j : *,·* 35 yksityiskohtaisesti. Etuna hyperimmunisaation antamisesta kontrolloidussa muodossa on, että jatkuva altistuminen anti-geenille varmistaa, että eläin pysyy hyperimmuunitilassa.

» » 115383 18

Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa on mahdollista myöskin yhdistää eri immunisointimenetelmiä, esim. antamalla samanaikaisesti mikrokapseloitua ja nestemäistä antigeeniä tai int-ramuskulaarinen anto primaari-immunisaatioksi ja tehostean-5 nokset oraalisesti tai parenteraalisesti mikrokapseloituna. Alan ammattilaiset tuntevat primaarisen ja hyperimmunisaation monia eri yhdistelmiä.

Vaihe 5: On välttämätöntä testata maidosta anti-inflammatori-10 sen aktiivisuuden tasot. Tämä voidaan tehdä millä tahansa tutkimustekniikalla, jolla testataan joko hyperimmuunimaidon tai siitä johdettujen tuotteiden vaikutuksia tulehduksen jälkeen. Rotan käpälään kemiallisesti indusoitu tulehdus on standardimääritys anti-inflammatorisille lääkkeille.

15

Vaihe 6: Tämä käsittää maidon keräämisen ja prosessoinnin. Maito voidaan kerätä talteen tavanomaisilla tavoilla. Maidon prosessointi anti-inflammatorisen tekijän eristämiseksi on kuvattu jäljempänä.

20 yksinkertaisin menetelmä anti-inflammatorisen tekijän eristämiseksi, puhdistamiseksi ja testaamiseksi käsittää seu-, · raavat vaiheet: t * !,) 25 1. poistetaan hyperimmuunimaidosta rasva, jotta tuotetaan kuorittua maitoa, > * • · I * ! : 2. poistetaan kaseiini kuoritusta maidosta, jotta tuotetaan V ·’ heraa, 30 : 3. poistetaan ultrasuodattamalla herasta makromolekyylit, ? · · joiden molekyylipaino on suurempi kuin noin 10 000 daltonia, : 4. fraktioidaan vaiheesta 3 saatu tuote käyttämällä ionin- h..* 35 vaihtohartsipylvästä, jotta eristetään negatiivisesti varau- ·;··· tuneet anti-inf lammatoriset molekyylilaj it, joiden molekyyli- paino on vähemmän kuin noin 10 000 daltonia, 115383 19 5. erotellaan vaiheesta 4 saadut negatiivisesti varautuneen molekyylilajit molekyyliseulakromatografiällä ja, 6. analysoidaan biologisesti anti-inflammatorinen tekijä, 5 joka valmistettiin vaiheessa 5.

Vaihtoehtoisessa edullisessa suoritusmuodossa ne fraktiot molekyyliseulakromatografiästä, joilla on biologista aktiivisuutta, puhdistetaan vielä suodattamalla membraanin läpi, 10 joka pidättää makromolekyylit, joiden molekyylipaino on suurempi kuin noin 5 000 daltöniä.

7. Maidon tekijän anti-inflammatorinen vaikutus testataan turvotukseen, joka aiheutetaan injektoimalla karrageenan- 15 liuosta rottien käpäliin. Rotan käpälätesti on standardin-omainen eläinkoe anti-inflammatorisille lääkkeille. Winter, C. A., Risley, G. A., Nuss, A. W., "Carrageenan-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-Inflammatory Drugs," Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3: 544 (1967). Joukkoa 20 muita testejä voidaan käyttää. Wetnick, A. S. ja Sabin, C., "The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats," Jap. J. Pharm. 22: 741 (1972) . Rotan käpälätesti on kuitenkin yksinkertaisin ja suorin saatavilla olevista tes-25 teistä, ja sen on osoitettu olevan tyydyttävä kaikille anti-inf lammatorisille lääkkeille. Tämän testin ovat kuvanneet . . yksityiskohtaisesti Beck, US-patentti 4,284,623, joka sisäl- lytetään tähän viitteeksi siinä määrin kuin se kuvaa rotan '·’ käpälätestiä. Lyhyesti sanottuna testi sisältää pienen määrän 30 karrageenania injektoimisen täysikasvuisten valkoisten rot-· tien jalan polkuanturaan. Tämän tiedetään indusoivan tuleh- > dusreaktion. Tästä seurannut turvotuksen määrä voidaan kvan- : tifioida. Anti-inflammatorisen tekijän sisältävät näytteet annetaan rotalle sopivaa reittiä, edullisesti injektoimalla

I J

35 intraperitoneaalisesti, ja tulehdusreaktion estymisen tai parantumisen määrä mitataan joko volumetrisilla tai gravimet- · : risilla menetelmillä.

1 > 115383 20

Yhteenvetona, anti-inflammatorinen tekijä voidaan eristää hyperimmunisoidusta maidosta menetelmän mukaisesti, jossa poistetaan maidosta rasva, poistetaan kaseiini, poistetaan makromolekyylit, jotka ovat suurempia kuin 10 000 daltonia ja 5 jatketaan ioninvaihto- ja molekyyliseulakromatografiällä.

Anti-inflammatorisen tekijän sopivien valmisteiden biologinen aktiivisuus voidaan testata tekemällä annos-vaste-koe rotilla, kuten tässä on kuvattu.

10 Tämän keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa hyperimmunisoidussa maidossa oleva anti - inflammatorinen tekijä puhdistetaan käyttämällä yhdistelmää vaiheista, joihin kuuluvat: suodatus membraanilla, joka kykenee erottelemaan molekyylejä niiden molekyylipainojen perusteella, ioninvaihtokro-15 matografia, molekyyliseulakromatografia ja affiniteettikroma-tografia (esimerkki 15).

Edullinen ensimmäinen vaihe käsittää edellä kuvatulla tavalla tuotetun hyperimmuunimaidon suodattamisen membraanin läpi, 20 joka pidättää molekyylit, joiden molekyylipainot ovat noin 10 000 daltonia tai enemmän. Membraanin läpi kulkenut materiaali (ts. suodos tai läpäissyt materiaali) kerätään talteen ja sitä käytetään lisäpuhdistusvaiheissa. Välineet ja membraanit • i 1 .1.· tällaisten suodatusten suorittamiseksi ovat alalla hyvin tun- t « •; ·. 25 nettuja.

> · » « < % t . t Edullinen vaihe suodatuksen jälkeen on ioninvaihtokromatogra- • 1 1 ···· fia anioninvaihtajalla. Vaihtajien, joissa on dietyyliamino- .1 ‘ etyyliryhmiä, on havaittu toteuttavan hyviä erotteluja, mutta 30 on oletettavaa, että muita anioninvaihtajia voitaisiin käytti j tää yhtä hyvin. On edullista, että ioninvaihtajan kiinteä kantaja kykenee pitämään yllä suuria virtausnopeuksia. Sepha- . rosen on havaittu olevan sopiva tähän tarkoitukseen.

» 1 ·

• · » I

a 1 * 1 ’·2’ 35 Edullinen vaihe ioninvaihtokromatografiän jälkeen on geeli- 2 ’:·1 suodatuskromatografia. Tämän vaiheen pylvääseen tulisi valita täyte, joka kykenee fraktioimaan molekyylejä, joiden molekyy- 115383 21 lipainot ovat vähemmän kuin 10 000 daltonia. Edullinen täyte on Toyopearl HW-40 (Rohm and Haas), mutta muita alalla hyvin tunnettuja täytteitä voitaisiin käyttää yhtä hyvin. Esimerkkejä muista täytteistä, joita voitaisiin käyttää, ja jotka 5 ovat kaupallisesti saatavilla, ovat polymeerisiin hiilihyd-raatteihin perustuvat täytteet, esim. Sephadex G-10 tai G-25 (Pharmacia) tai polyakryyliamidiin perustuvat käytteet, esim. Biogel P-2, P-4, P-6, P-10 tai P-30 (Bio-Rad).

10 Edullinen vaihe geelisuodatuskromatografiän jälkeen on af-finiteettikromatografia boronaattiaffiniteettikantajassa. Näiden kantajien on havaittu olevan tehokkaita fraktioimaan alhaisen molekyylipainon omaavia yhdisteitä, joissa on cis-dioliryhmiä. Edullinen kantaja on AffiGel 601 (Bio-Rad). Tämä 15 on polyakryyliamidigeelisuodatinkantajan Bio-Gel P-6 (jota Bio-Rad myy myöskin) boronaattijohdannainen.

Edullinen säilytystapa valmisteille ioninvaihto-, geelisuo-datus- tai affiniteettikromatografiavaiheiden jälkeen on 20 lyofilisoituna jauheena. Ensimmäisestä puhdistusvaiheesta kerätty suodos voidaan säilyttää jääkaapissa ennen sen käyttöä. Puhdistuksen tuloksena saadun anti-inflammatorisen tekijän aktiivisuus voidaan määrittää käyttämällä edellä kuvattua . rotan käpälätestiä.

k! 25

Esimerkissä 16 kuvattujen kokeiden tulokset osoittavat, että eläinten esikäsittely anti-inflammatorisen tekijän sisältä-i villä valmisteilla vähentää verihiutaleita aktivoivan tekijän

» » I

V ·' (PAF) stimuloimaa neutrofiilien tarttumista endoteelisolui- 30 hin, jotka reunustavat pikkulaskimoita, ja vähentää nopeutta, i jolla neutrofiilit poistuvat pikkulaskimoista. Lisäksi teki- jän valmisteiden antamisen sen jälkeen, kun eläimet oli käsi- ,telty PAF:11a, havaittiin vähentävän endoteelisoluihin tart- ·· : tuvien neutrof iilien lukumäärää. Siinä määrin, että potilaat } * 35 tai eläimet voivat hyötyä näistä vaikutuksista, tämä keksintö *;··j sisältää anti-inflammatorisen tekijän sisältävien valmistei- ;V. den käytön. Tämä on totta riippumatta asiaan liittyvästä eri- * * 115383 22 tyisestä sairaudesta. Samoin esimerkin 16 tulokset osoittavat, että anti-inflammatorinen tekijä aiheuttaa vaikutuksensa tarttumiseen ja soluista poistumiseen olemalla suoraan vuorovaikutuksessa solujen pinnan CD18-antigeenien kanssa ja estä-5 mällä muiden molekyylien vuorovaikutuksen tämän glykoprote-iinikompleksin kanssa. Tämä keksintö sisältää anti-inflamma-torisen tekijän valmisteiden käytön yhtä hyvin tähän tarkoitukseen .

10 Kuten esimerkissä 18 on esitetty, anti-inflammatorisen tekijän valmisteiden antaminen eläimille suppressoi isännän reaktiota siirrosta vastaan, mutta ei siirroksen reaktiota isäntää vastaan, ja aiheuttaa pernan painon nousua ja pernan lymfosyyttien lukumäärän kasvua. Valmisteen havaittiin myös es- 15 tävän lymfosyyttien reaktiota konkanavaliini A:hän. Nämä tulokset osoittavat, että anti-inflammatorinen tekijä on hyödyllinen inhiboimaan kudoksia tuhoavia infektioprosesseja ja tilanteissa, joissa lymfosyyttien toiminnan suppressio on toivottavaa.

20 Tämän keksinnön mukaiset koostumukset voidaan antaa millä tahansa tavalla, joka tarjoaa käyttöön anti-inflammatorisen aktiivisuuden. Antotapa voi olla esimerkiksi parenteraalinen, subkutaaninen, intravenaalinen, intramuskulaarinen, intrape- 25 ritoneaalinen tai oraalinen.

, . Oraalisen antotavan kiinteisiin annosmuotoihin kuuluvat kap- selit, tabletit,-pillerit, jauheet ja jyväset. Tällaisissa k ' i ‘ kiinteissä annosmuodoissa aktiivinen yhdiste sekoitetaan vä- 30 hintään yhden inertin laimennusaineen, kuten sakkaroosin, * » M j laktoosin tai tärkkelyksen kanssa. Tällaiset annosmuodot voi- t · *’ vat myös käsittää, kuten on normaali käytäntö, myös muita ; ,·, aineita kuin inertin laimennusaineen. Kapseleiden, tablettien * t $ ja pillerien tapauksessa annosmuodot voivat käsittää myös * · 35 puskurointiaineita. Tabletit ja pillerit voidaan lisäksi va-rustaa suolessa liukenevalla päällystyksellä.

> * * « » * f 115383 23

Nestemäisiin annosmuotoihin oraalista antoa varten kuuluvat farmaseuttisesti hyväksyttävät emulsiot, liuokset, suspensiot, siirapit ja eliksiirit, jotka sisältävät inerttejä lai-mennusaineita, joita käytetään tavallisesti farmasian alalla. 5 Paitsi inerttejä laimennusaineita, tällaiset koostumukset voivat sisältää myös adjuvantteja, kuten kostutusaineita, emulgointi- ja suspendointlaineita ja makeutusaineita.

Tämän keksinnön mukaisiin parenteraalista antoa varten ole-10 viin valmisteisiin kuuluvat steriilit vesipitoiset tai vedettömät liuokset, suspensiot tai emulsiot. Esimerkkejä vedettömistä liuottimista tai vehikkeleistä ovat propyleeniglykoli, polyetyleeniglykoli, kasviöljyt kuten oliiviöljy ja injektoitavat orgaaniset esterit kuten etyylioleaatti.

15

Aktiivisten aineosien annos tämän keksinnön mukaisessa koostumuksessa voi vaihdella; on kuitenkin välttämätöntä, että aktiivisen aineosan määrä on sellainen, että saadaan sopiva annosmuoto. Valittu annosmuoto riippuu halutusta terapeutti-20 sesta vaikutuksesta, antotavasta ja hoidon kestoajasta.

Annettava annos ja annon toistumistiheys riippuu potilaan iästä ja yleisestä terveydentilasta, ottaen huomioon mahdolliset sivuvaikutukset. Anto riippuu myös samanaikaisesta hoi-25 dosta muilla lääkkeillä ja potilaan siedosta annetulle lääkkeelle .

: » * · » ;.· : Nyt kun keksintö on kuvattu yleisesti, se tullaan kuvaamaan • » · ·',·* vielä tiettyjen erityisten esimerkkien yhteydessä, jotka tar- 30 jotaan tässä ainoastaan tarkoituksessa selvittää keksintöä, ja joiden ei tarkoiteta rajoittavan keksintöä, jollei toisin * t » · esitetä.

24 115383

Esimerkki 1 A (vertailu) S-100-rokotteen valmistus

Taulukossa 1 esitetyn joukon bakteereja, jotka oli saatu tal-5 letuslaitoksesta the American Type Culture Collection, sisältävä bakteeriviljelmä elvytettiin sekoittamalla siihen 15 ml ravintoalustaa ja sitä inkuboitiin yli yön 37 °C:ssa. Kun oli saavutettu hyvä kasvu, noin puolet bakteerisuspensiosta käytettiin yhden litran nestemäistä alustaa siirrostamiseen ja 10 inkuboitiin ymppiä 37 °C:ssa. Jäljelle jäänyt suspensio siirrettiin steriileihin glykoliputkiin ja varastoitiin -20 °C:seen aina kuuteen kuukauteen saakka.

Kun viljelmässä oli nähtävissä hyvä kasvu, bakteerisolut ke-15 rättiin talteen sentrifugoimalla suspensiota 20 minuuttia ravintoalustan poistamiseksi. Saatu bakteeripelletti suspen-doitiin uudelleen steriiliin suolaliuokseen ja bakteerinäyte sentrifugoitiin kolme kertaa ravintoalustan pesemiseksi soluista. Kolmannen steriilin suolaliuospesun jälkeen sentrifu-20 goimalla saatu pelletti suspendoitiin uudelleen pieneen määrään kaksi kertaa tislattua vettä · < · • · * v ·’ Ravintoalustasta puhdas bakteerisuspensio lämpötapettiin ·:·: laittamalla suspensio lasipullossa 80 °C:seen vesihauteeseen • 25 yöksi. Nestemäisen viljelmän elinkykyisyys testattiin pienel- lä määrällä lämpötapettuja bakteereita. Nestemäistä ravinto- • · · alustaa siirrostettiin lämpötapetuilla bakteereilla, inkuboi- . . tiin 37 °C:ssa viisi vuorokautta ja tarkastettiin päivittäin • · · kasvu, koska bakteerien täytyi olla tapettuja käytettäväksi • · "···* 30 rokotteessa.

• · # # · • » Lämpötapettuja bakteereja lyofilisoitiin, kunnes ne olivat * · » kuivia. Kuivat bakteerit sekoitettiin sitten steriilin suola- • · · ' , liuoksen kanssa konsentraatioon 2,2 x 10® bakteerisolua/ml 35 suolaliuosta (1,0 optinen tiheyslukema 660 nm:lla).

115383 25 TAULUKKO 1 _S-10 0 BAKTEERILUETTELO_

Nimi Alusta Gram ATTC # ___+ tai - I. Staph, aureus_ BHI + 11631 5 2. Staph, epidermidis_ BHI + 155 3. Strep, pyogenes. A. APT + 8671 tyyppi 1____ 4. Strep, pyogenes, A. APT + 10389 tyyppi 3____ 10 5. Strep, pyogenes, A. APT + 12347 tyyppi 5____ 6. Strep, pyogenes. A. APT + 12349 tyyppi 8____ 7. Strep, pyogenes, A. APT + 11434 15 tyyppi 12_ 8. Strep, pyogenes, A. APT + 12972 tyyppi 14 9. Strep, pyogenes, A. APT + 12357 tyyppi 18 20 10. Strep, pyogenes, A. APT + 10403 tyyppi 22_ II. Aerobacter aeroqenes BHI - 884 12. Escherichia coli BHI - 26 13. Salmonella enteritidis BHI - 13076 *;·, 25 14. Pseudomonas aeruginosa BHI - 7700 15. Klebsiella pneumoniae BHI - 9590 : ,·. 16. Salmonella tvphimurium BHI - 13311 17. Haemophilus influenzae BHI - 9333 18, Strep, mitis_ APT + 6249 : ,·, 30 19. Proteus vulgaris_ BHI - 13315 20. Shigella dvsenteriae BHI - 11835 , 21. Diplococcus pneumoniae APT + 63 06 22. Propionibacter acnes Liemi + 11827 ‘I’ 23 . Strep, sanguis APT + 10556 ‘ · 35 24. Strep, salivarius APT + 13419 1 25. Strep, mutans BHI + 25175 115383 26 26. Strep, agalactiae APT__+__13813

Lehmille annettiin päivittäisinä injektioina 5 ml erät poly-5 valenttista nestemäistä rokotetta. Injektoidun karjan vasta-aine (IgG) -tiitteritasot määritettiin määräajoin käyttämällä entsyymiin liitettyä immunoanalyysiä naudan vasta-aineelle polyvalenttista antigeeniä vastaan.

10 Esimerkki 1 B (vertailu)

Immunisointimenetelmät Lämpötapetut bakteerit valmistettiin edellä kuvatulla tavalla. Saatu polyvalenttinen antigeeninäyte (S-100) mikrokapse-15 loitiin tavanomaisella faasierottelumenetelmällä polyvalent-tisen antigeenin sisältävän mikropartikkelituotteen valmistamiseksi. Antigeenin sisältävät muotoillut matriisimateriaalit muodostetaan yleisesti biologisesti yhteensopivien materiaalien polymeereistä, edullisesti biologisesti hajoavista tai 20 biologisesti erodoituvista materiaaleista, edullisesti poly-maitohaposta, polyglykolihaposta, maito- ja glykolihappojen ,· kopolymeereistä, polykaptolaktonista, kopolyoksalaateista, l proteiineista, kuten kollageeni, glyserolin rasvahappoesteli reistä ja selluloosaestereistä. Nämä polymeerit ovat alalla ... j 25 hyvin tunnettuja ja niitä on kuvattu esimerkiksi US-patentis-:.. sa 3,773,919, US-patentissa 3,887,699, US-patentissa -'S 4,118,470 ja US-patentissa 4,076,798, jotka kaikki liitetään • · · tähän kirjallisuusviitteiksi. Käytetty polymeerimatriisimate-riaali oli biologisesti hajoavaa laktidi-glykolidikopolymee- * · » 30 riä.

• · • · i'"l Lämpötapetut bakteeriantigeenit kapseloidaan tällaisiin mat- ....: riisimateriaaleihin, edullisesti mikropallosina, joiden läpi- • mitta on välillä 1 - 500 mikronia, edullisesti 10 - 250 mik- * ···'· 35 ronia. Kapselointimenetelmät ovat tavanomaisia ja käsittävät • * faasierottelumenetelmiä, jakopintareaktioita ja fysikaalisia menetelmiä. Voidaan käyttää monia matriisien yhdistelmiä ja monia konsentraatioita valikoiduista antigeeneistä, jotta 115383 27 saadaan aikaan bakteeriantigeenien optimaaliset vapautumis-tasot isännän kehoon mikropartikkeleista. Nämä yhdistelmät voi alan ammattilainen määritellä ilman kohtuutonta kokeiden tekoa.

5

Esimerkin mikropartikkelit olivat läpimitaltaan vähemmän kuin 250 mikronia. Noin 750 mg mikropartikkeleita, jotka sisälsivät 22 % (16,5 mg) polyvalenttista antigeeniä, suspendoitiin sitten noin 3 cm3: iin vehikkeliä (1 painoprosentti Tween 10 20:ta ja 2 painoprosenttia karboksimetyyliselluloosaa vedes sä) .

Pieni joukko nautakarjaa valittiin suuremmasta karjalaumasta. Viisi näistä umpimähkään valituista naudoista valittiin kont-15 rolleiksi. Neljä nautaa injektoitiin intramuskulaarisesti mikropartikkeleilla, jotka sisälsivät polyvalenttista antigeeniä. Mikropartikkelinäytteet steriloitiin 2,0 mRad.-lla gammasäteilyä. Vasta-aine (IgG) -tiitteritasot määritettiin määräajoin lehmänmaitonäytteistä, jotka saatiin siirroksen 20 saaneista lehmistä, samoin kuin kontrollilehmistä.

Esimerkki 2 (vertailu) ; MAIF-tekijän eristäminen hyperimmunisoidusta maidosta 25 Vaihe 1: Maitosuodoksen valmistus '/· ‘ Kaksikymmentä, litraa tuoretta maitoa hyperimmunisoiduista lehmistä ajettiin kermaseparaattorin läpi (DeLaval malli 102) ·· rasvan poistamiseksi.

.···. 3 0 Jäljelle jäänyt kuusitoista litraa kuorittua maitoa ultrasuo- * * datettiin suurimolekyylipainoisten molekyyliluokkien (yli 10 ·”* 000 daltonia) poistamiseksi käyttämällä onttokuitudiasuodat- tajaa/konsentroijaa (amicon DL-10L). Konsentroija on varus- * · · > 35 tettu kahdella 10 000 daltonin molekyylipainon cut-off-pat-ruunalla (Amicon HSP10_43) . Kuorittu maito ajettiin pumpun no- 115383 28 peudella 80 mittarissa ja sisääntulo- ja ulostulopaineella 210 Kpa ja vastaavasti 170 Kpa.

Kaksitoista litraa suodosta (< 10 000 daltonia), joka tuli 5 ulos patruunoista virtausnopeudella neljä litraa tunnissa, jäädytettiin tai lyofilisoitiin varastointia varten ja lisä-puhdistusta varten.

Vaihe 2: ioninvaihtokromatografia 10

Maidon anti-inflammatorinen tekijä suodoksessa eristettiin ensin anioninvaihtopylväässä.

Tässä menettelytavassa käytettiin DEAE-Sepharose CL-6B-geeliä 15 (Pharmacia) pakattaessa 5 x 10 cm lasipylvästä, joka tasapainotettiin steriilillä kahteen kertaan tislatulla vedellä, pH

7.0.

Yksi litra suodosta (< 10 000) lisättiin pylvääseen ja eluoi-20 tiin steriilillä kahteen kertaan tislatulla vedellä, pH 7,0 virtausnopeudella 160 ml tunnissa. Kerättiin kymmenen milli-litran fraktioita ja seurattiin niitä 280 nm:ssä LKB:n Uvi-cord 4700 absorptiometrillä, josta optinen tiheys tulostet-tiin siihen yhdistetyllä piirturilla (Pharmacia REC-482).

25

Anti-inflammatorisen tekijän lisäksi muut aineet, joilla on i positiivisia ja neutraaleja varauksia, eivät sitoudu DEAE- • ;*t Sepharose-geeliin. Ne eluoituvat läpivirtaavassa huipussa (ensimmäinen huippu). Anti-inflammatorinen tekijä, jolla on 30 negatiivinen varaus, pidättäytyy geelissä.

V ‘ Tekijän eluoimiseksi pylvästä eluoitiin portaittaisella gra-

dientilla käyttäen steriiliä fysiologista suolaliuosta, pH

I · I * 7.0. Tyypillinen profiili on esitetty kuvassa 1. Yksittäisten • 35 fraktioiden bioanalyysi osoitti, että toinen huippu sisältää ' * tekijän. Toisen huipun ja sen olat käsittäviä fraktioita käy- * · 115383 29 tetään lisäpuhdistuksessa. Saantotutkimukset osoittavat, että tällä menetelmällä saatiin 8,8 grammaa kuivattua jauhetta.

Vaihe 3: geelisuodatuskromatografia 5

Vaiheesta 2 saatu toinen huippu sisältää anti-inflammatorisen tekijän ja muita negatiivisesti varautuneita molekyylejä, sen vuoksi tarvittiin vielä lisäjalostusvaihe. Jotta saavutettaisiin parempi puhtaus, on tarkoituksenmukaista käyttää geeli-10 suodatuspylvästä eri komponenttien erottamiseksi molekyyli-painon perusteella.

Tässä prosessissa pakattiin Sephadex G-10-hartsia (Pharmacia) 2,5 x 80 cm:n lasipylvääseen ja tasapainotettiin se sterii-15 Iillä kaksi kertaa tislatulla vedellä, pH 7,0. Kaksi grammaa toista fraktiota vaiheesta 2 liuotettiin uudelleen steriiliin kahteen kertaan tislattuun veteen ja lisättiin pylvään päälle. Pylvästä eluoitiin virtausnopeudella 30 ml tunnissa. Kerättiin fraktiot (3,3 ml) ja seurattiin niitä 254 nm:ssä ja 20 280 nm:ssä (Pharmacia Duo Optical Unit), josta optinen tiheys tulostettiin siihen yhdistetyllä piirturilla (Pharmacia REC-482) .

Eluutioprofiilissa näkyi tyypillisesti 3 huippua, kuten ku-25 viossa 2 on esitetty. Ensimmäinen ja toinen huippu sisälsivät anti-inf lammatorisen aktiivisuuden.

>.·( Ensimmäinen huippu on aktiivisen tekijän sisältävä aggregaat ti, joka muodostuu G-10-pylvääseen.

30 a a i ·’· * Toinen huippu sisältää tekijän ei-aggregoituneen muodon. Sekä • t a V * aggregaattimuoto (huippu 1) että ei-aggregaattimuoto (huippu j 2) ovat biologisesti aktiivisia eläinkokeessa rotilla.

< * · i · a · 115383 30

Esimerkki 3 (vertailu)

Maidon anti-inflammatorisen tekijän karakterisointi

Edellä kuvatulla menetelmällä valmistetun tekijän ei-aggre-5 goituneen muodon molekyylipainon havaittiin olevan vähemmän kuin 10 000 daltonia. Tämä pääteltiin siitä tosiseikasta,· että ensimmäinen vaihe tekijän eristämisessä herasta oli ult-rasuodattamalla käyttäen membraania, joka ei salli >10 000 daltonin molekyylipainoisten molekyylilajien läpikulkua.

10

Tekijällä on negatiivinen varaus. Tämä määritettiin lisäämällä maidon ultrasuodosta DEAE-selluloosaioninvaihtopylvääseen. Anti-inflammatorinen aktiivisuus ei eluoitunut pylväästä vedellä. Eluointiliuoksen vaihtaminen natriumkloridiksi (0,9 % 15 pH) aiheutti useiden huippujen eluoitumisen (kuva 1). Neutraalisti ja positiivisesti varautuneet molekyylilajit eivät kiinnity ioninvaihtohartsiin ja negatiivisesti varautuneet molekyylilajit eluoituvat lisäämällä suolakonsentraatiota.

Kun läpäissyt pienempien kuin 10 000 daltonin molekyylipa!-20 noisten osuus lisättiin DEAE-pylvääseen, neutraalit suolat ja . sokerit eluoituivat veden kanssa (huippu 1, kuvio 1). Kolme , erillistä huippua eluoitui, kun puskuri vaihdettiin suolali uokseksi (huiput 2 - 4). Toinen huippu ja sen olat sisälsivät ' , anti-inflammatorisen biologisen aktiivisuuden kokeessa rotil- 25 la. Näin ollen on päätelty, että tekijällä on negatiivinen * » · '··< > varaus.

* | »

Tekijän toinen kemiallinen ominaisuus on se, että se muodos- *;· taa aggregaatin suolanpoistomenettelyn aikana. Tämä ominai- 30 suus kävi ilmeiseksi kun läpäissyt < 10 000 daltonin molekyy- lipainoinen osuus laitettiin Sephadex G-10 -pylvääseen, pyi- ···’ väs tasapainotettiin kahteen kertaan tislatulla vedellä ja « » * · eluoitiin vedellä pH:ssa 7 (kuvio 2). G-10-pylväästä eluoitui ;· kolme huippua; ensimmäinen huippu eluoitui välisijatilavuuden m ;*· 35 kanssa, antaen olettaa molekyylipainon olevan 10 000 daltonia tai enemmän. Tämä oli odottamatonta, koska suuremmat kuin 10 000 daltonin molekyylit oli poistettu aikaisemmin tästä näyt- 115383 31 teestä ultrasuodatuksella. Toinen huippu eluoitui asemassa, joka oli odotettavaa anti - inflammatoriselle tekijälle. Sekä ensimmäiset että toiset huiput osoittivat anti-inflammatoris-ta biologista aktiivisuutta rotan käpälätestissä, kun taas 5 kolmannesta huipusta puuttui aktiivisuus. Oli hämmästyttävää havaita, että sekä ensimmäisillä että toisilla huipuilla oli anti-inflammatorista biologista aktiivisuutta. G-10-pylvään (vaihe 3) ensimmäisestä huipusta talteen otettu materiaali lyofilisoitiin ja lisättiin G-100-pylvääseen; yksi huippu 10 eluoitui välisijatilavuuden kanssa, antaen olettaa molekyyli-painoksi 100 000 daltonia tai enemmän. Vaiheen 3 G-10-pylväs poistaa suolan samanaikaisesti kun se erottaa eri molekyyli-painoiset molekyylilajit. Näin ollen on päätelty, että kulkiessaan G-10-pylväässä ja suolan poistumisen seurauksena 15 tekijä muodosti suurimolekyylipainoisen aggregaatin. Aggre-gaatioaste vaihteli suolakonsentraation mukaan.

Aggregaatio-ominaisuus antaa olettaa mahdollisuuden, että voi muodostua suuri joukko molekyylipainoltaan erilaisia molekyy-20 lilajeja, joilla on anti-inflammatorista biologista aktiivisuutta anti-inflammatorisen tekijän läsnäolon vuoksi. Tämän ominaisuuden havaitseminen antaa olettaa mahdollisuuden tuot- : j taa maidon anti-inflammatorisia tekijöitä, joilla on suuri :V: määrä erilaisia biokemiallisia ominaisuuksia riippuen lopul- i 25 lisen tuotteen aggregaation määrästä. Saatettaisiin esimer-kiksi voida tuottaa koostumuksia, joilla on pitempi tai lyhy- * t»t empi biologinen puoliintumisaika, käyttämällä suuremman tai * i » ‘pienemmän molekyylipainon omaavia aggregaatteja, jolloin mo- * 1 « ' t i ’ lekyylipainon jakaantumista kontrolloitaisiin suolakonsent- 30 raatiolla prosessoinnin aikana. Tässä kuvattu pylväskromato- iti · grafiamenetelmä saa aikaan pienimmän molekyylipainon omaavia :.'· : lajeja, mitä on saatu, joilla on biologista aktiivisuutta * f .·, (ts. huipun 2 vaiheen 3 G-10-pylvästä) . Tämä havainto antaa « I t » ···, aihetta käyttää muita menetelmiä aggregaattien muodostami-

f I

35 seen. Esimerkiksi laimentaminen vedellä saa aikaan aggregoi- » ' tumisen. Kemialliset aineet, jotka sitovat suoloja, erityi- t i · ; V sesti kalsium, voivat aiheuttaa aggregaatin muodostusta. Kun 115383 32 tämä havainto on tehty, toiset menetelmät aggregaatin muodostamiseksi ja tekijän erottamiseksi ovat ilmeisiä alaan perehtyneille.

5 Esimerkki 4 (vertailu)

Biologisen aktiivisuuden määrittäminen

Puhdistetun anti-inflammatorisen tekijän anti-inflammatorinen toiminta testattiin turvotuksiin, jotka aiheutettiin injek-10 toimalla karrageenan-liuosta rottien polkuanturoihin. Maidon anti-inflammatorisen tekijän lyofilisoitu näyte liuotettiin sopivaan vehikkeliin ja annettiin intraperitoneaalisesti koe-rotille. Karrageenan annettiin sen jälkeen rotille määränä 0,1 ml 1-prosenttista suolaliuosta kuhunkin takajalan polku-15 anturaan. Polkuanturat mitattiin ennen injektioiden antamista ja 2,5 tuntia injektioiden jälkeen käyttämällä paksuustulk-kia. Tulokset on esitetty taulukoissa 2 ja 3. Näissä taulukoissa lyhenne MAIF tarkoittaa maidon anti-inflammatorisen tekijän valmistetta, joka on saatu käyttämällä esimerkeissä 1 20 ja 2 edellä kuvattuja menetelmiä.

Tekijän aggregoitumaton muoto (huippu 2 G-10-pylväästä) kont-** rolli- ja hyperimmuunimaidosta aiheutti tulehduksen vähenemi- V ’ sen rotan käpälässä annoksina välillä 1 - 0,25 mg (taulukko 25 2). Sekä hyperimmuunimaito että tavallinen maito osoittivat i t ! : | aktiivisuutta; hyperimmuunimaito oli kuitenkin tehokkaampaa.

Me päättelimme tästä, että anti-inflammatorista tekijää t esiintyy suurempana konsentraationa hyperimmuunien lehmien maidossa.

MM

30 • · • »

Toinen huippu DEAE-pylväästä osoitti aktiivisuutta eristetty-nä joko hyperimmuunimaidosta tai tavallisesta maidosta. Ak-M**: tiivisuus on oleellisesti suurempaa hyperimmuunimaidossa (taulukko 3) .

» I I » » » * G-10-pylväästä tullut ensimmäinen huippu, joka on tekijän aggregoitunut muoto, osoitti aktiivisuutta rotan käpälätes- 35 115383 33 teissä (taulukko 2). Aggregoitunut muoto ei ole kuitenkaan yhtä tehokas kuin ei-aggregoitunut muoto verrattaessa niitä samanpainoisina.

5 Näistä tutkimuksista on päätelty, että anti-inflammatorinen tekijä esiintyy luonnostaan lehmän maidossa. Lehmien hyperim-munisaatio saa aikaan tekijän suuremman konsentraation maidossa. Tekijä on pieni, negatiivisesti varautunut molekyyli, joka voidaan erottaa maidosta usealla erilaisella menetelmälle) lä. Tekijä voi muodostaa suuren molekyylipainon omaavia aggregaatteja, joita ei luonnostaan esiinny maidossa, vaan muodostuu prosessoinnin aikana.

TAULUKKO 2

15 MAIDON ANTI-INFLAMMATORISEN TEKIJÄN (MAIF) VAIKUTUS

_TULEHDUKSEN VÄHENEMISEEN ROTISSA_ VALMISTETTU HYPERIMMUUNIMAIDOSTA_

Polkuanturan mittaukset (mm)

Ennen Injektion % 20 MAIF annos_injektiota jälkeen Erotus_Tulehdus 2.0 mg/rotta_3,43_5,01_1,58_46_ 1.0 mg/rotta 3,49_5,39_1,90_54_ 0,5 mg/rotta 3,42_5,51_2,09_61_ .···, 0,1 mg/rotta 3,43_5,86_2,43_71_ « * · 25 Kontrolli / 3,43 5,82 2,39 70 suolaliuos_ ____VALMISTETTU NORMAALISTA LEHMÄNMAIDOSTA_ 2.0 mg/rotta 3,3 0_5,24_1,94_59_ 1.0 mg/rotta 3,31_5,22_1,91_58_ 30 0,5 mg/rotta 3,32 5,33 2,01 61 0,25 mg/rotta 3,31_5,42_2,11_64_

» * I

» * * • * « · · 115383 34 TAULUKKO 3 MAIF:IN PUOLIKSI PUHDISTETTUJEN FRAKTIOIDEN VAIKUTUS TULEHDUKSEN VÄHENEMISEEN ROTISSA (VALMISTETTU HYPER IMMUUNIS TA JA TAVALLISESTA MAIDOS-5 TA)_

Polkuanturan mittaukset (mm) 2,5 h

Ennen injektion % _injektiota jälkeen_Erotus Tulehdus 10 DEAE pylväs toinen huippu hyperimmuuni- 3,25 5,04 1,79 55 maito 2 mg/rotta_ 15 DEAE pylväs toinen huippu tavallinen 3,30 5,24 1,94 -59 maito 2 mg/rotta_ 20 G-10 pylväs ensimmäinen 3,31 4,98 1,67 50 huippu 2 mg/ml_

Kontrolli / 25 suolaliuos_3,34_5,63_2,29_69_ • Esimerkki 5 (vertailu) _ : 30 Anti-inflammatorisen tekijän kemiallinen analyysi J Näytteet anti-inflammatorisesta tekijästä analysoitiin ke- miallisesti. Tekijä ei ole rakenteeltaan kiteinen, määritettynä röntgendiffraktiotutkimuksilla. MAIF-valmisteista saa- , 35 tiin alkuaineanalyysi, joka oli yhtäpitävä hiilihydraatti- • » · koostumuksen kanssa. C, H, O -suhteet olivat yhtäpitävät po-lymeerisessä ja oligomeerisessä materiaalissa, joidenkin kar-: binoliryhmien hapettuessa karboksyyliksi. Vähäinen kalsiume-

• I I

kvivalenttien ylimäärä kloori-ioneihin nähden voi johtua \ 40 osaltaan karboksylaattisuoloista. Loppu voi olla natrium- tai kaliumsuoloja. Sulamiskäyttäytyminen, tai ennemmin ei-sula-‘ ’ miskäyttäytyminen antoi suuntaa kuitenkin suolan kaltaiselle ja/tai suurempimolekyylipainoisille koostumuksille. Nykyises- 115383 35 sä puhtauden tasossaan materiaali sisältää ilmeisesti vaih-televan määrän kalsiumin ja kloorin suoloja, luultavasti CaCl2:ta.

5 Mikään valmiste ei sisältänyt merkittävää määrää typpeä, mikä sulkee pois kaikki peptidikomponentit sen koostumuksessa. Samoin merkittävän määrän typpeä puuttuminen voi jättää pois laskuista aminosokereiden ja muiden typpeä sisältävien materiaalien läsnäolon, kuten erilaisten monimutkaisten lipidien, 10 pääkomponenttina (-komponentteina).

Pyrolyyttinen massaspektri osoitti huomattavia merkkejä 18-hiilen rasvahapoista. Tämä tosiseikka, laskettuna yhteen merkkien N:stä ja P:stä kanssa, antaa olettaa monimutkaisen li-15 pidin läsnäoloa valmisteessa.

Infrapunaspektroskopia osoitti absorptioita, jotka vastasivat funktionaalisia karbinoli- ja karboksylaattiryhmiä. Ultra-violetti-, näkyvän valon ja fluoresenssispektroskopia eivät 20 osoittaneet kromoforien huomattavaa määrää infrapunan osoit-tamien lisäksi.

* Kemialliset testit ovat yhtenevät oligomeerisen hiilihydraa- *"· tin kanssa, jossa funktionaalinen karbonyyliryhmä (aldehydi ·,> I 25 tai ketoni) on sidottu alayksikköliitoksiin. Oligomeerinen hiilihydraatti sisältää myöskin jonkin verran sivuketjujen hapettumista karboksylaatiksi.

• » _ • » · * · * .···, MAIF-valmiste on olennaisesti, mutta ei täysin puhdas.

30 » '·' ' Esimerkki 6 (vertailu)

« I I

·...·* Rotan käpälän turvotustestit: oraalinen anto i < · * · · * · · > t

Rotan karrageenanilla tehtyä polkuahturatestiä käytettiin » · 35 anti-inflammatorisen tekijän tehokkuuden testaamiseksi anti-inflammatorisena tekijänä in vivo. Kolmekymmentä täysikasvuista valkoista rottaa jaettiin umpimähkään kolmeen ryhmään, 115383 36 kymmenen rottaa kuhunkin ryhmään. Ryhmät saivat viitenä peräkkäisinä käsittelyinä päivittäin joko 10 mg kuoritun maidon jauhetta hyperimmunisoiduista eläimistä, 10 mg kuoritun maidon jauhetta ei-immunisoiduista eläimistä tai ei lainkaan 5 käsittelyä (ainoastaan 20 ml vettä päivässä). Jauheet annettiin oraalisesti 20 ml:ssa vettä. Viidentenä päivänä kunkin rotan oikeaan käpälään injektoitiin 0,1 ml 1-prosenttista karrageenania suolaliuoksessa. Tämän menettelyn tiedetään aiheuttavan akuutin tulehduksen (turvotuksen). Kaksikymmen-10 täneljä tuntia injektion jälkeen rotat tapettiin, käpälät irrotettiin ja vasemman (kontrolli) ja oikean (turvonnut) käpälän painoja verrattiin. Määrityksen tulokset on esitetty taulukossa 4 (ilmaistuna painoina grammoissa) ja kuviossa 3 (ilmaistuna prosentteina kontrollikäpälien keskimääräisestä 15 painosta).

TAULUKKO 4 ROTAN KÄPÄLÄN TURVOTUSTESTIN TULOKSET (käpälän paino grammoissa ± SD, n = 10) 20 Hoito Karrageenan Kontrolli Erotus käpälä käpälä (g) __(paino)__(paino)__

Immuunimaito 1,78 + 0,03 1,71 + 0,02 0,06 + 0,02

Kontrollimaito 1,88 + 0,06 1,64 + 0,03 0,24 + 0,05

Vesi__1,86 + 0,03 1,65 + 0,03 0,22 + 0,02 25 •:*·* Tulehdusreaktio karrageenan-injektiosta väheni merkitsevästi j immuunimaidolla käsitellyissä rotissa verrattuna ei-immuuni- * · · · maito- ja vesikontrolliryhmiin. Mitään todisteita sivuvaiku- • · · 30 tuksista tai haitallisista vaikutuksista rottien yleiseen . , terveydentilaan ei havaittu. Näistä tuloksista voidaan pää- • · · *",* teliä, että hyperimmunisoiduista eläimistä peräisin olevan » · · '** ’ kuoritun maidon jauheen päivittäinen käyttäminen melkein täy- : : sin esti karrageenan-injektion indusoiman tulehdusreaktion 35 rottien jalan polkuanturassa.

• i · «I · » » · I · 115383 37

Esimerkki 7 (vertailu)

Kvantitatiiviset rotan käpälän turvotustestit

Hyperimmuunimaitofraktiolla tehtiin sarja kokeita. Kokeet 5 suunniteltiin varmistamaan maidon anti-inflammatorisen tekijän anti-inflammatorinen aktiivisuus, kun sitä annettiin int-raperitoneaalisesti, ja saamaan aikaan annos-vaste-käyrä, tutkimaan vaihtoehtoisia antoreittejä ja tutkimaan annoste-luohjelmia, jotka voisivat muodostaa perustan lisätutkimuk-10 sille.

Huippu I G-10-pylväästä, hankittu Stolle Milk Biologies In-ternationalista, valmistettiin patentissa nro 4,956,349 kuvattujen menetelmien mukaisesti. Plasebona käytettiin laktoo-15 siä, joka hankittiin kaupallisista lähteistä. Positiivisena kontrollina käytettiin aspiriinia. Aspiriini liuotettiin veteen ja annettiin oraalisesti mahaletkulla määränä 200 mg kiloa kohti, tämän annoksen tiedetään olevan aktiivinen kokeessa. 2-prosenttisen liuoksen kappa-karrageenania (Sigma C-20 1263) on havaittu saavan aikaan toistettavimmat tulokset, ja . niin sitä käytettiin näissä kokeissa. Jalan polkuanturakoetta muunnettiin käyttämällä isotooppisesti leimattua ihmisen seerumin albumiinia (125I-HSA) , joka paikallistuu karrageenanin | indusoimaan vaurioon suorassa suhteessa tulehdusnesteen tila- 25 vuuteen. Määrittämällä radioaktiivisuuden kokonaismäärä pol-: kuanturasta ja vertaamalla tätä lukuihin tietyssä plasmatila- V · vuudessa injektoidusta eläimestä, saadaan suoraan turvotuksen mitta mikrolitroina plasmaekvivalentteja . 125I-HSA injektoi-*· tiin intravenaalisesti annoksena 1,0 mikrocurieta rottaa koh- * · · t 3 0 ti. Käytettiin naaraspuolisia Dark Agouti -rottia. Rotat oli-vat noin 12 viikon ikäisiä, painoivat 160 - 200 grammaa ja • » *··*’ saatiin omassa talossa sisäsiitetystä kannasta.

• · ·*· Karrageenanilla tehtävän polkuantur.atestin suorittamiseksi * · » » ....: 35 0,1 ml 2-prosenttista karrageenania injektoitiin subku- taanisesti nukutetun rotan kuhunkin takajalan polkuanturaan. Tätä injektiota seurasi välittömästi 1,0 mikrocurien 125I- 115383 38 HSA: ta injektoiminen suolaliuoksessa häntälaskimoon. Neljän tunnin kuluttua kukin rotta punnittiin, otettiin verinäytteet ja rotta tapettiin. Kumpikin takajalka irrotettiin ja radioaktiivisuuden taso kussakin jalassa ja 200 μΐ:ssa plasmastan-5 dardia mitattiin automaattisella gammalaskijalla. Näistä mittauksista laskettiin turvotuksen tilavuus kussakin jalassa ja ilmaistiin se mikrolitroina.

Koe 1: Intraperitoneaalinen annos-vaste.

10

Kuviossa 4 on esitetty puhdistetun MAIF-valmisteen intraperi-toneaalisen annon vaikutus verrattuna laktoosiin (KONTR.), aspiriiniin ja ilman käsittelyä jättämiseen (EI RJ . Kaikki käsittelyt (laktoosi, aspiriini, MAIF) annettiin 30 minuuttia 15 ennen karrageenan-injektiota.

Karrageenan-injektio johti turvotukseen, joka oli keskimäärin 250 μΐ (EI Rx). Aspiriini ja kaikki MAIF-valmisteen annokset inhiboivat turvotusta, mutta laktoosi ei inhiboinut sitä.

20 MAIF-valmisteella saatu intraperitoneaalinen annos-vaste-käy-rä, joka saatiin ilmaisemalla tulokset prosentteina kontrol-liturvotuksen (ei käsittelyä) keskiarvosta on esitetty kuviossa 5.

t * 25 Koe 2: MAIF: in eri antoreittien vaikutukset.

» * * t r * i *

Kuviossa 6 esitetään laktoosin ja puhdistetusta MAIF:ista tehdyn valmisteen annon vaikutus jalan polkuanturan turvotuk- i !.;: seen, annettuna oraalisesti (ORAALINEN), intramuskulaarisesti V : 30 (IM), subkutaanisesti (SUBKUT.) ja intravenaalisesti (IV).

Esitettynä ovat myös positiivinen kontrolli (aspiriini) ja käsittelemätön kontrolli (EI Rx) .

Valmisteet annettiin ennen altistusta karrageenanille seuraani · 35 van aikataulun mukaisesti: aspiriini: oraalisesti 30 minuut-

I « I

!...‘ tia ennen; subkutaaninen MAIF: 1 tunti ennen; oraalinen MAIF: I l » ! * · > · 115383 39 24, 16 ja 1 tunti ennen; intramuskulaarinen MAIF: 30 minuuttia ennen; intravenaalinen MAIF: altistuksen ajankohtana (isotooppi injektoitiin myös).

5 Tulokset osoittavat, että ilmaistuna prosentteina keskimääräisestä kontrolliturvotuksesta kussakin erillisessä kokeessa, anti -inflammatorinen tekijä inhiboi turvotuksen muodostumista kaikilla antotavoilla. 40 mg MAIF-valmistetta annettuna intravenaalisesti kumosi melkein täysin tulehdusreaktion kar-10 rageenaniin. Nämä tulokset osoittavat MAIF:in anti-inflammatorisen aktiivisuuden ja edellä esitetyn kokeen 1 tulosten valossa antavat olettaa, että tehokkuuden järjestys eri anto-reiteille on IV > IP > IM > SUBKUT. > ORAALINEN.

15 Koe 3: Intravenaalisen ja pidennetyn oraalisen annon vaikutus turvotukseen: annos-vaste.

Kuviossa 7 esitetään anti-inflammatorista tekijää sisältävän puhdistetun valmisteen antamisen IV:sti ja oraalisesti vaiku-20 tus jalan polkuanturan turvotukseen rotilla. Oraalinen käsittely MAIF:illa (40 mg kullekin rotalla päivässä) annettiin päivittäin kuuden päivän ajan ja myös yksi tunti ennen altistusta karrageenanille (PO). Intravenaaliset käsittelyt (5, • i 10, 20 mg) annettiin karrageenan-altistuksen (IV) ajankohta- 25 na. Esitettynä ovat myös postitiivinen kontrolli (aspiriini)

I f I

ja negatiivinen kontrolli (ei käsittelyä) .

ill · ' ’ Kuviossa 7 esitetyt tulokset osoittavat, että kaikki kolme i MAIF-valmisteannosta saavat aikaan anti-inflammatorisen ak- ;(· · 30 tiivisuuden, joka ylittää jopa aspiriinin aktiivisuuden ko keessa, kun taas pidennetty oraalinen anto johtaa selvään • ·/; mutta rajoittuneeseen aktiivisuuteen.

’ · » · • · · • i t

Tutkimus laajennettiin sen vuoksi tutkimaan vielä vähennetty- t i i -! 1 35 jen intravenaalisten annosten anti-inflammatorista tekijää « » · vaikutuksia. Intravenaaliset annokset laktoosi-plaseboa si-säilytettiin kontrolliksi. Tulokset näistä tutkimuksista on 115383 40 esitetty kuviossa 8. Intravenaaliset annokset 2,5 ja 1 mg MAIF-valmistetta (IV) indusoivat anti-inflammatorisen aktiivisuuden aspiriinin indusoimalla aktiivisuusalueella. 10 ml intravenaalista laktoosiplaseboa (10 mg PLAS. IV) ei indusoi-5 nut aktiivisuutta tällä alueella.

Intravenaalinen annos-vaste-käyrä johdettiin yhdistämällä kokeiden 2 ja 3 tulokset ja ilmaisemalla nämä tulokset prosentteina keskimääräisestä kontrolliturvotuksesta (ei kasit-10 telyä) kussakin erillisessä kokeessa. Käyrä on esitetty kuviossa 9.

Johtopäätökset, jotka voidaan vetää kvantitatiivisista rotan käpälän curvotustesteistä ovat seuraavat: maidon fraktion 15 huippu I G-10-pylväästä, uutettuna ja puhdistettuna kuten patentissa nro 4,956,349 on kuvattu, osoittaa johdonmukaisesti anti-inflammatorista aktiivisuutta testattaessa sitä rotan käpälän turvotusmallilla. 4 mg:n annos MAIF-valmistetta kullekin rotalle annettuna intravenaalisesti karrageenan-injek-20 tion ajankohtana on riittävä inhiboimaan turvotusta voimakkaasti, ja se valittiin sen vuoksi standardiksi, jota vastaan , muita valmisteita voitaisiin verrata jatkokokeissa.

S »

Esimerkki 8 (vertailu) • mi· 25 Identtisistä kaksoslehmistä saadun hyperimmuunimaidon valmisti 1 teiden anti-inflammatoriset ominaisuudet • » ·

Rokotuksen vaikutusta maidon anti-inflammatoriseen aktiivi-*;· suuteen tutkittiin testaamalla identtisistä kaksoslehmistä

IMI

30 saatujen eri maitofraktioiden biologista aktiivisuutta. Pa-tentissä nro 4,956,349 kuvattuihin uuttomenetelmiin perustuen ·'* suunniteltiin uuttojärjestelmä, jossa käytettiin ultrasuoda- tusta. Käsittelyjärjestys oli seuraava: ··· raakamaito 35 ϊ • · kuorittu maito i pastöroitu maito i i 115383 41

juoksute --> I

I --> kaseiini (poistetaan) hera i i

5 ultrasuodatus -->pidättynyt osa (RJ

i i läpäissyt osa (Px) i i laimennus 1:4

10 I

ultrasuodatus -->läpäissyt osa (P2) j pidättynyt osa (R2) 15

Valmistettiin maitonäytteet, jotka olivat peräisin immunisoiduista kaksoslehmistä, ei-immunisoiduista kontrollikaksos-lehmistä ja kuoritun maidon jauheesta, johon oli lisätty vettä uudelleen, ja joka oli aikaisemmin immunisoiduista lehmis-20 tä peräisin. Näyteryhmä koostui 45 parista identtisiä kaksos-lehmiä. Yksi lehmä kustakin kaksosparista rokotettiin joka toinen viikko Stolle S100 sekabakteereilla (kuvattu patentissa nro 4,956,349). Eri fraktioiden biologinen aktiivisuus testattiin intravenaalisella injektiolla käyttäen edellä ku-25 vattua karrageenantestiä rotan polkuanturoilla.

Testattavat oletukset olivat, että (a) hyperimmunisaatio vastasi edellä kuvatusta anti-inflammatorisesta aktiivisuudesta, (b) MAIF voitiin uuttaa kaupallisella mittakaavalla ult-30 rasuodattamalla ja (c) läpäisseen osan laimentaminen aiheut-Ί , taisi anti-inflammatorisen tekijän aggregoitumista, saaden I fr ; aikaan, että se pidättyisi 30 000 molekyylipainon ultrasuoda- , tusmembraaniin.

» • 1 * I » ’ 35 Kuviossa 10 esitetään tulokset kaksoskarjan ultrasuodatusko- keesta, joka suunniteltiin testaamaan biologista aktiivisuut- * · j ta eri fraktioista, jotka oli tehty rokottamattomien kontrolli i likaksosten maidosta ja immunisoiduista lehmistä peräisin » ,·, olevasta maitojauheesta, johon lisättiin uudelleen vettä.

i i * 40 Testattavat fraktiot olivat seuraavat: Huippu I, G-10-pylvään valmiste, 4 ml (OHIO MAIF STD); R2 lopullinen pidättynyt osa *'" rokottamattomasta lehmästä (KONTROLLIKAKSONEN R2) ; P2 lopul- 115383 42 linen läpäissyt osa uudelleen liuotetusta maitojauheesta (UUD. LIUOT. S100 P2) ; dialysoitu R2 lopullinen pidättynyt osa rokottamattomasta kaksosesta (KONTR. DIALYSOITU R2) ; dialysoitu lopullinen pidättynyt osa uudelleen liuotetusta mai-5 to jauheesta (S100 DIALYSOITU R2) .

Anti-inflammatorista aktiivisuutta ei voitu havaita lopullisessa pidättyneessä fraktiossa R2, joka oli valmistettu im-munisoimattomista lehmistä, ei myöskään dialysoinnin jälkeen. 10 Anti-inflammatorista aktiivisuutta ei havaittu lopullisessa läpäisseessä osassa P2-fraktiossa, joka oli valmistettu uudelleen liuotetusta maitojauheesta. Uudelleen liuotetun maitojauheen pidättynyt osa, R2-fraktio, osoitti dialyysin jälkeen anti-inflammatorista aktiivisuutta MAIF-standardin ak-15 tiivisuuden alueella.

Kuviossa 11 on esitetty tulokset kaksoskarjan ultrasuodatus-kokeista, jotka suunniteltiin testaamaan rokotetuista ja rokottamattomista kaksoslehmistä peräisin olevien eri maito-20 fraktioiden ja immunisoiduista lehmistä peräisin olevan uudelleen liuotetun maitojauheen biologista aktiivisuutta. Testattavat fraktiot olivat seuraavat: huippu I, G-10-pylvään valmiste, 4 ml (OHIO MAIF STD); dialysoitu lopullinen pidättynyt osa R2 rokottamattomista kaksosista (KONTR. DIALYSOITU 25 R2) ; lopullinen pidättynyt osa R2 uudelleen liuotetusta mai- V ; tojauheesta (UUD. LIUOT. S100 R2) ; lopullinen pidättynyt osa ; ; R2 rokotetuista kaksosista (IMMUUNIKAKSONEN R2) ; ensimmäinen ·* | pidättynyt osa Rl uudelleen liuotetusta maitojauheesta, lai- ’ . . mennos: 1 (SI00 laimennettu Rl) .

30 * « »

Vain vähän anti-inflammatorista aktiivisuutta havaittiin dia-, . lysoidussa pidättyneessä osassa R2 rokottamattomista kontrol- I i · likaksosista tai dialysoimattomassa pidättyneessä osassa R2 1 f * ’ rokotetuista kaksosista. Jonkin verran aktiivisuutta on osoi- j 35 tettavissa hajontakuviolla. R2-retentaatti, joka on valmis- tettu ilman dialyysiä uudelleen liuotetusta Stolle-maito- 1 z * ‘ , jauheesta, joka oli peräisin immunisoiduista lehmistä, oli * 1 » 9 * · » Ψ • * 115383 43 voimakkaasti anti-inflammatorinen. Valmiste, joka oli tehty laimentamalla uudelleen liuotettua maitoa ennen ultrasuoda-tusta, eikä laimentamalla heraa, joka oli tehty maidosta, oli vain juuri ja juuri aktiivinen. Tämä tulos osoittaa, että 5 anti-inflammatorinen aktiivisuus uuttuu tehokkaammin hera-fraktiosta .

Kuviossa 12 esitetään tulokset kaksoskarjalla tehdyistä ult-rasuodatuskokeista, jotka oli suunniteltu testaamaan biolo-10 gista aktiivisuutta rokotetuista kaksoslehmistä peräisin olevasta dialysoidusta pidättyneestä osasta. Testatut fraktiot olivat seuraavat: huippu I, G-10-pylvään valmiste (OHIO MAIF STD); dialysoitu lopullinen pidättynyt osa R2 rokotetuista kaksosista (IMM DIALYSOITU R2) ; dialysoitu lopullinen pidät-15 tynyt osa G-10-valmisteesta (DIALYSOITU OHIO MAIF). Tulokset osoittavat, että immunisoiduista kaksosista peräisin olevassa R2-fraktiossa oli anti-inflammatorista aktiivisuutta dialyysin jälkeen. Dialysoitu MAIF oli aktiivisempi analyysissä kuin dialysoimaton MAIF-standardi. Tämä tulos antaa olettaa, 20 että dialyysi on tehokas tapa konsentroida lisää maidon tekijää, joka vastaa anti-inflammatorisesta aktiivisuudesta.

Edellä esitetyt kuvissa 10 - 12 esitetyt tulokset tukevat seuraavia johtopäätöksiä: (1) anti-inflammatorinen aktiivi- 25 suus voidaan uuttaa uudelleen liuotetusta maidosta, joka on peräisin immunisoiduista lehmistä, laimennetun läpäisseen : , , osan ultrasuodatuksella. (2) Anti-inflammatorista aktiivi- suutta ei osoitettu edellä esitetyissä valmisteissa, jotka oli tehty immunisoimattomien lehmien maidosta. (3) Anti-in- 30 flammatorista aktiivisuutta osoitettiin lopullisessa pidätty- : neessä osassa R2 immunisoitujen lehmien maidosta valmistetun ·.· * laimennetun läpäisseen osan ultrasuodatuksen jälkeen, mutta * :.·. dialyysi oli välttämätön osoittamaan aktiivisuuden.

115383 44

Esimerkki 9 (vertailu) MAIFrin stabiilisuus, MAIFrin kuumennus ja proteinaasikäsit-tely 5 Aikaisempi todiste, että maidon anti-inflammatorinen tekijä ei ole kemiallisesti proteiini tai peptidi, perustui suurelta osin kemiallisiin analyyseihin, jotka yhtäpitävästi osoittivat typen puuttumisen lähes täysin. Anti-inflammatorisen tekijän karakterisoimiseksi lisää useita valmisteita testattiin 10 rotan käpälän turvotustestillä käyttäen 4 mg huipun I, G-10-pylvään valmistetta intravenaalisesti standardina. Tehtiin seuraavat käsittelyt: kuuden tunnin proteinaasi (pronaasi) -käsittely, kontrollina kuusi tuntia ilman proteinaasia, käsittelemätön positiivinen kontrolli, kuumennus 100 °C:seen 30 15 minuutiksi.

Tulokset tästä analyysistä on esitetty kuviossa 13. Tästä tutkimuksesta tehdyt johtopäätökset olivat, että anti-inflammatorinen aktiivisuus ei johdu proteiinista tai peptidistä, 20 ja että keittäminen ei inaktivoi anti-inflammatorista tekijää. Pronaasikäsittelyn tehokkuus todistettiin havainnolla, että vastaavanlainen pronaasikäsittely denaturoi täysin mai-\ y don proteiinin.

• I 25 Esimerkki 10 (vertailu) : Immunisoiduista lehmistä peräisin olevien lisää puhdistetun MAIFrin ja heraproteiinikonsentraatin anti-inflammatorinen * · » aktiivisuus 30 Pidättyneestä osasta ja läpäisseestä osasta ultrasuodatukses-*...· ta, joka oli tehty käyttäen Amicon YM5-membraania, testattiin biologinen aktiivisuus käyttäen intravenaalista antotapaa rotan käpälän turvotustestissä. Tässä menetelmässä MAIF hui-• pusta I G-10-pylväästä, valmistettu patentin nro 4,956,349 35 mukaisesti, puhdistettiin vielä ultrasuodattamalla Amicon ’·*’· YM5-membraanilla. Tämä membraani pidättää molekyylit, joiden molekyylipaino on 5 000 tai suurempi. Myös immunisoitujen 115383 ' 45 eläinten maidosta valmistettiin heraproteiinikonsentraatit (WPCt) ja suodatettiin YM5-membraanin läpi. Kokeessa testattiin seuraavat näytteet käyttäen 4 mg huippua I, G-10-pylvään valmistetta intravenaalisesti standardina: läpäissyt osa Ami-5 con YM5 ultrasuodatuksesta; pidättynyt osa Amicon YM5 ult-rasuodatuksesta; WPC immunisoiduista lehmistä, 30 mg kullekin rotalle; WPC kaupallisesti tuotetusta (immunisoimattomat lehmät) , 30 mg kullekin rotalle.

10 Tämän analyysin tulokset on esitetty kuviossa 14. Näistä tuloksista on selvää, että kaikki aktiivisuus on pidättyneessä osassa, joka muodostaa noin 0,5 % YM5-suodattimeen lisätyn fraktion kokonaispainosta. Tässä kokeessa nähdyn turvotuksen väheneminen saavutettiin, kun annettiin 20 - 25 mikrogrammaa 15 materiaalia.

Mitä tulee WPC:n aktiivisuuteen, hyperimmunisoiduista eläimistä saatu WPC osoitti selvästi anti-inflammatorista aktiivisuutta, kuten oli odotettua. Mielenkiintoista oli, 20 että immunisoimattomista eläimistä peräisin oleva WPC osoitti myöskin anti-inflammatorista aktiivisuutta. Anti-inflammato-; risen aktiivisuuden läsnäolo immunisoimattomien lehmien mai- dossa ei ole hämmästyttävää, koska sen täytyy olla luonnolli-nen aine. Sen havaitseminen kuvastaa eläinkokeen herkkyyttä.

25

Esimerkki 11 (vertailu) ·’ Karrageenanilla indusoidun polkuanturan turvotuksen jatkuva seuranta

* * I

30 Oli tosiasia, että 4 mg MAIF-valmistetta annettuna intra- venaalisesti karrageenan-injektion ajankohtana, vähensi tur-votuksen kertymistä polkuanturaan välillä 40 - 50 %. Vaikka . nämä tulokset tarjoavat todisteita siitä, että materiaali ,,[** sisälsi anti-inflammatorisen osan, oli vain vähän osoitusta 35 MAIF: in vaikutuskohdasta tai farmakologisesta profiilista. Tällaisten tulosten saamiseksi oli välttämätöntä luoda menetelmä, joka teki mahdolliseksi jalan polkuanturan turvotuksen 115383 46 jatkuvan seurannan läpi koko karrageenanin aiheuttaman reaktion. Tämä saavutettiin pitämällä rotan jalkaa siirrettävässä gammasäteilyn osoittimessa. Menettely edellytti eläinten nukuttamista jopa neljäksi tunniksi, ja koska nukutusaineiden 5 tiedetään ehkäisevän tulehdusreaktiota, oli välttämätöntä ensin määrittää nukutusaineiden vaikutus karrageenanilla indusoituun turvotukseen. Sen vuoksi tehtiin arvio viidestä aineesta, joita käytetään yleisesti indusoimaan nukutus rotissa; nämä olivat eetteri, kloraalihydraatti, Innovar-vet, 10 nembutaali ja uretaani. Tulokset on esitetty kuviossa 15.

Näistä tuloksista oli selvää, että eetteri oli valittava nukutusaine, kun tulehdusreaktiota tuli arvioida tällä tekniikalla. Eetteriä käytettäessä saadun käyrän muoto osoitti kak-15 sivaiheista reaktiota. Reaktion kuvaamiseksi yksityiskohtaisemmin tehtiin lisätutkimus, jossa turvotuksen tilavuutta mitattiin 12 ajankohtana 5 tunnin aikana. Tulokset varmistivat kaksivaiheisen reaktion. Varhainen reaktio tapahtui välillä 0-1 tunti altistuksen jälkeen ja myöhäisen vaiheen 20 reaktio välillä 1,5-2 tuntia (kuvio 16).

Kaksi vaihetta, jotka toiset tutkijat ovat myös havainneet, *...: on nimitetty ei-fagosytoottiseksi tulehdusreaktioksi (NPIR) ν\: ja vastaavasti fagosytoottiseksi tulehdusreaktioksi (PIR).

25 ·;·· NPIR alkaa, reaktiona vaurioon, liukoisilla välittäjillä, ; kuten histamiinilla ja bradykiinillä, kun taas PIR riippuu ·;·, neutrofiilien osallistumisesta. Protokolla oli sen vuoksi antaa MAIF:ia ja seurata turvotuksen kertymistä jatkuvasti, , . 30 jotta määritettäisiin, johtuivatko aineen anti-inflammatori- * set ominaisuudet varhaisesta ei-sellulaarisesta (NPIR) tai *·' ’ myöhäisestä sellulaarisesta (PIR) vaiheesta. 5 mg tai 40 mg j MAIF-valmistetta kullekin rotalle annettiin intravenaalisesti karrageenan-altistuksen ajankohtana ja turvotuksen kertymistä • 35 seurattiin säännöllisin välein neljän tunnin ajan. Kumpikaan annos ei vaikuttanut turvotuksen kertymiseen kummankaan vai-heen aikana (kuvio 17) .

115383 47 Tämä tulos oli hämmästyttävä, koska moni aikaisempi tutkimus, joissa määritettiin puhdistettujen MAIF-valmisteiden vaikutus karrageenanin indusoimaan turvotukseen 4 tuntia altistuksen jälkeen, olivat osoittaneet huomattavaa anti-inflammatorista 5 aktiivisuutta fraktioissa. Sen vuoksi oli todennäköistä, että jatkuva altistus eetterille tukahdutti tai inaktivoi MAIFrin aktiivisen anti-inflammatorisen komponentin in vivo.

Aikaisemmat tutkimukset antoivat olettaa, että lyhytaikainen 10 altistus eetterille ei vaikuttanut anti-inflammatorisen tekijän aktiivisuuteen. Sen vuoksi tehtiin tutkimus, jossa määritettiin MAIFrin vaikutus kehittyvän turvotuksen kertymiseen ainoastaan neljänä ajankohtana, 0, l, 3 ja 4 tuntia, rajoittaen siten eläinten altistusta eetterille. 1 tunnin ajankohta 15 valittiin, jotta saataisiin arvioitua vaikutus varhaiseen, ei-fagosytoottiseen tulehdusreaktioon, kun taas 3 ja 4 tunnin määritykset valittiin kvantifioimaan vaikutusta myöhäiseen fagosytoottiseen tulehdusreaktioon. Tässä tutkimuksessa MAIF-valmiste annettuna 4 0 mg ma johti turvotuksen kertymisen vä-20 henemiseen sekundäärisessä, fagosytoottisten solujen välittämässä vaiheessa, mutta sillä ei ollut merkitsevää vaikutusta primaarisessa, liukoisen välittäjän ohjaamassa vaiheessa (ku-

« t I

·.,, ‘ vio 18) .

• · » :: 25 Tästä koesarjasta voidaan vetää seuraavat johtopäätökset.

| .’. 1. Eetteri on edullinen nukutusaine käytettäväksi tutkimuk- ;·. sissa, joissa on- tarkoitus seurata karrageenanin aiheuttamaa tulehdusreaktiota jatkuvasti.

. . 30 2. Jatkuva eetterinukutus inhiboi anti-inf lammatorisen teki-' jän anti-inf lammatorista aktiivisuutta in vivo karrageenanil- ; la tehdyssä jalan polkuanturatutkimuksessa.

t i · * 35 3. MAIF parantaa tulehdusta inhiboimalla myöhäistä, fago- sytoottisten solujen välittämää, karrageenanin aiheuttamaa • » * tulehdusreaktion vaihetta.

115383 48

Esimerkki 12 (vertailu) MAIF:in vaikutus ajan kuluessa karrageenanin indusoimaan pol-kuanturan turvotukseen 5 Toteutettiin vielä sarja kokeita, joissa aine annettiin valittuina ajankohtina ennen karrageenan-injektiota tai sen jälkeen, ennemmin kuin altistuksen ajankohtana. Tutkimuksen tarkoitus oli tarjota tietoa 10 (a) tehokkaimmasta ajasta MAIFrin antamiseksi suhteessa tu- lehdusstimulukseen.

(b) anti-inflammatorisen osan biologisesta puoliintumisajasta.

15 (c) MAIFrin vaikutuskohdat tulehdusreaktion kehittymisessä.

Tutkimus tehtiin kolmessa osassa. MAIF-valmiste annettiin intravenaalisesti annoksena 4 mg/rotta yhtenä 11 ajankohdas-20 ta, jotka ulottuivat 150 minuuttiin ennen karrageenan-injek-: tiota ja 150 minuuttiin sen jälkeen. Tulokset tästä kokeesta , , on esitetty kuviossa 19 ja taulukossa 5.

• · 115383 49 _TAULUKKO 5_

Koe A:n aika Kontrolli- MAIF-ryh- Turvotuksen suhteessa ryhmien mien jalan inhibitio altistuk- jalan ti- tilavuuden MAIF:illa seen lavuuden keskiarvo (% kontrollin) keskiarvo (μΐ ± SD) iitilavuu- (μΐ ± SD) desta ± ____ SD)_ 3__-150__311 ± 65 246 ± 52__79 ±17 2 __-90__304 ± 71 211 ± 33__73 ± 11 5 _2__-J50__304 + 71 186 ± 34__61 + 11 1 __-_30__391 ± 63 261 ± 49__67 ± 13 3 __-15__311 ± 65 152 ± 41__49 ± 13 1,2,3__0__336 ± 78 184 ± 42__55 ± 13 3__15__311 ± 65 218 ± 30__70 ± 10 10 __1__30__391 ± 63 218 ± 30__56 + 8 2 __60__304 ± 71 212 ± 40__69 + 13 2 __90__304 ± 71 216 ± 37__70 ± 12 3 __150__311 ± 65 261 ± 42__84 + 14 15

Huomattavaa turvotuksen inhibitiota havaittiin kaikissa tutkituissa ajankohdissa; inhibition taso oli kuitenkin pienempi ääripäissä (± 150 min). Kiinnostava syklinen reaktio MAIF:in antoon nähtiin niissä ryhmissä, joita käsiteltiin lähempänä ’ 20 altistuksen ajankohtaa. Se tosiseikka, että MAIF oli tehok- ’ kaampi annettuna 30 minuuttia altistuksen jälkeen kuin annet- : tuna 15 minuuttia altistuksen jälkeen tukee sitä käsitystä, Γ;’: että aine inhiboi sekundääristä, fagosytoottisten solujen välittämää vaihetta reaktiossa. MAIF-valmiste inhiboi voimak-25 kaasti reaktiota karrageenanille annettuna 15 minuuttia ennen .V altistusta tai juuri altistusajankohtana. Lisäksi on ilmeis tä, että aineella on suhteellisen pitkä puoliintumisaika see-; rumissa (1 - 2 t) ja sen tehokkuus on suhteessa altistusai- _ : kaan ja tulehdusreaktion dynaamiseen luonteeseen.

30 115383 50 Täten oletetaan, että anti-inflammatorinen vaikutus johtuu vaikutuksesta tulehdussoluihin, todennäköisesti neutrofiilei-hin.

5 Esimerkki 13 (vertailu) MAIFrin vaikutus käänteiseen passiiviseen Arthus-reaktioon

Sitä mahdollisuutta, että anti-inflammatorinen tekijä saattaisi vaikuttaa neutrofiilien osallistumiseen, tutkittiin 10 arvioimalla materiaalin kykyä muuntaa käänteistä passiivista Arthus-reaktiota (RPA). Tämä immuunikompleksin indusoima reaktio on pääasiassa neutrofiilien välittämä ja aineet, jotka vaikuttavat reaktion kehittymiseen tekevät niin näihin soluihin kohdistuvan vaikutuksen välityksellä. RPA:n indusoi-15 miseksi rotat injektoitiin intradermaalisesti kaniinin vasta-aineella ovalbumiiniin ja intravenaalisesti natiivilla oval-bumiinilla. Ovalbumiini/ovalbumiini-vasta-aine -immuunikom-pleksit muodostuvat ihon verisuonten seinämien sisään ja niiden ympärille, isännän neutrofiilit sitoutuvat vasta-aineen 20 Fc-osaan ja voimakas tulehdusreaktio alkaa. Tulisi huomata, että vaikka immuunikompleksit aloittavat reaktion, se. tapahtuu riippumattomana isännän immuunijärjestelmästä.

’ RPA:n kvantifioimiseksi käytetään kolmea parametria. Nämä 25 ovat (1) turvotus - mitattuna käyttäen 125I-HSA:n kertymistä, M · (2) verenvuoto - arvioituna in vivo s9Fe:llä esileimatuilla v * RBC:illä ja (3) neutrofiilien kertyminen - mitattuna määrit tämällä neutrofiileille spesifisen entsyymin myeloperoksidaa-·*;· si (MPO) tasot kudoksissa. Nämä määritykset ovat tunnettuja 30 alan tavanomaiset taidot omaavalle.

'*·’ Kahdeksantoista rottaa jaettiin kolmeen kuuden rotan ryhmään.

' · Kaniinin anti-ovalbumiinia (40 /xl) injektoitiin intradermaa- • j. lisesti neljään kohtaan kunkin eläimen selässä ja 2 mg oval- 35 bumiinia injektoitiin intravenaalisesti välittömästi sen jälkeen. Yksi eläinryhmä ei saanut mitään muuta käsittelyä ja palveli kontrollina. Toiseen ryhmään injektoitiin intravenaa- 115383 51 lisesti 20 mg laktoosivalmistetta, kun taas viimeiseen ryhmään injektoitiin intravenaalisesti 20 mg puhdistettua MAIF-valmistetta. Sekä laktoosi että MAIF-valmiste annettiin oval-bumiinin kanssa. Reaktion vakavuutta arvioitiin 3,5 tuntia 5 altistuksen jälkeen. Kun MAIF-valmiste annettiin intravenaalisesti annoksena 20 mg/rotta ennen RPA-reaktion alkamista, seurasi erittäin merkitsevä kolmen reaktion mittaamisessa käytetyn parametrin inhibitio (taulukko 6, kuvio 20). Laktoo-si-kontrollimateriaali aiheutti myös vaatimattoman ja juuri 10 ja juuri merkitsevän vähenemisen neutrofiilien kertymiseen ja verenvuotoon. Tämä antaa olettaa, että normaalissa maidossa on olemassa pieni määrä anti-inflammatorista aktiivisuutta.

__TAULUKKO 6__ 15 Ryhmä Neutrofiilien μΐ turvotus- Verenvuoto: kerääntyminen: ta μΐ RBC-.tä __yksikköä MPO___

Kontrolli 0,30 ± 0,157__107 ± 29 4,8 + 3,1

Laktoosi 0,214 ± 0,176** 104 ± 23__3,0 ± 1,5** MAIF__0,056 + 0,013__60 ± 27*__1,5 ± 1,7* * = p < 0,01 : 20 I ** = p < 0,05_ ’ Koska neutrofiili on RPA:n pääasiallinen välittäjä, nämä tu- , : lokset tarjosivat lisätodisteita siitä, että MAIF kykeni in- ' 25 hiboimaan tulehdusreaktiota vaikuttamalla neutrof iilien toi mintaan.

- ·

Esimerkki 14 (vertailu) MAIF:in vaikutus neutrofiilien kulkeutumiseen 30 * Osallistuakseen tehokkaasti tulehdusreaktioon, neutrofiilien täytyy ensin kulkeutua verisuonistosta tulehduskohtaan. Sen määrittämiseksi, häiritsikö anti-inflammatorinen tekijä neut- » » rofiilien kulkeutumista, käytettiin tulehdusmallia, jossa 35 käytettiin steriilien polyuretaanisienten subkutaanista siir- 115383 52 rostamista. Sienet poistetaan tietyin välein siirrostuksen jälkeen ja punnitsemalla sienet ja uuttamalla ja laskemalla solut suodoksesta, voidaan kvantifioida reaktion sekä nesteettä soluvaihe. 24 tuntia siirrostuksen jälkeen >95 % sie-5 nissä havaituista soluista on neutrofiilejä.

On toteutettu kaksi koetta. Ensimmäisessä eläimet käsiteltiin joko 5, 10, 20 tai 40 mgrlla puhdistettua MAIF-valmistetta sienten siirrostuksen ajankohtana. Sienet poistettiin 24 tun-10 tia siirrostuksen jälkeen. Kukin ryhmä käsitti 5-8 rottaa ja kuhunkin eläimeen siirrostettiin kaksi sientä. Tulokset on esitetty kuviossa 21.

20 tai 40 mgrlla MAIF-valmistetta annettuna intravenaalisesti 15 sienten siirrostuksen ajankohtana oli huomattavaa vaikutusta tulehdussolujen kykyyn kulkea. Vähemmän huomattava, mutta samoin merkitsevä nesteen kertymisen inhibitio oli myös nähtävissä. Kahdella pienemmällä MAIF-annoksella ei ollut osoitettavaa vaikutusta tässä tulehdusmallissa.

20

Tehtiin toinen koe, joka oli suunniteltu kuvaamaan tulehdus-altistuksen (sienten siirrostus) ja MAIFrin antamisen ajallista suhdetta. Tässä tutkimuksessa annettiin intravenaali-, sesti 20 mg MAIF-valmistetta 30, 60 tai 120 minuuttia sienten 25 siirrostamisen jälkeen. Neljäs, kontrolliryhmä, jätettiin i käsittelemättä. Kussakin ryhmässä oli viisi eläintä. Kuhunkin eläimeen siirrostettiin kaksi sientä ja ne poistettiin 24 ;·· : tunnin kuluttua. Tulokset on esitetty kuviossa 22. Tähän kaa- * / » · vioon on sisällytetty tulokset, jotka on saatu rottien näyte- 30 ryhmästä, joka sai 20 mg MAIF-valmistetta siirrostuksen ajan-: : kohtana (katso kuviosta 21) .

» « i

Tulokset MAIFrin vaikutuksesta ajan kuluessa karrageenanilla '· indusoituun polkuanturan turvotukseen osoittavat MAIFrin ole- <··* 3 5 van verrattain tehoton, kun se annetaan 60 minuutin kuluttua ;··· altistuksesta tai myöhemmin. On merkillepantavaa, että vaikka V. tarvittiin 20 mg MAIF-valmistetta suppressoimaan tulehdusta, 115383 53 joka liittyi sienten siirrostukseen, 4 mg oli riittävä inhiboimaan karrageenanin indusoimaa turvotusta. Aikomatta sitoutua tähän tulkintaan, tämä erilaisuus saattaa liittyä näiden kahden ärsykkeen isännälle aiheuttamaan eri ärsytystasoon.

5 Sienisiirros on suhteellisen hyvänlaatuinen ärsyke, joka indusoi hitaan tulehdusreaktion ja solumassa kertyy 8-16 tunnissa siirrostuksen jälkeen (kuvio 23). Toisaalta karrageenanin subkutaaninen injektio on erittäin voimakas stimulantti, joka indusoi verraten voimakkaan reaktion suhteellisen lyhy-10 essä ajassa (kuvio 16).

Esimerkki 15

Vaihtoehtoinen menetelmä anti-inflammatorisen tekijän puhdistamiseksi maidosta (valmiste "AIF") 15

Seuraavassa esimerkissä kuvataan menetelmää anti-inflammatorisen tekijän puhdistamiseksi maidosta molekyylipainoltaan pienimmässä, aggregoitumattomassa muodossa. Tässä kuvatuista puhdistusvaiheista saadulle valmisteelle on annettu nimitys 20 "AIF", sen erottamiseksi valmisteesta, joka saatiin käyttämällä esimerkissä 2 kuvattua menetelmää. Tässä esimerkissä ja sitä seuraavassa esimerkissä (ts. esimerkissä 16) aktiivista tekijää valmisteissa kutsutaan yksinkertaisesti "anti-inflam-matoriseksi tekijäksi". Kaikki puhdistusvaiheet tehtiin mini-25 moiden mahdollinen bakteerien tai pyrogeenien aiheuttama kontaminaatio. Liuosten valmistamiseen käytettiin steriiliä vettä ja kaikki lasitavara depyrogenoitiin.

; t i <

Vaihe 1: < 10 00 molekyylipainon ("MW") ultrasuodatus 30 | Tuoretta kuorittua immuunimaitoa S100 (katso esimerkistä 1 : immuunimaidon saamiseksi käytettävien menetelmien kuvausta) pumpattiin 10 000 MW:n cutoff-ultrasuodatusmembraanin i (Filtron) läpi paineella 207 kPa. Läpäissyt osa kerättiin t 35 depyrogenoituihin pulloihin, joita pidettiin jäissä. Läpäis-seet osat steriilisuodatettiin ja säilytettiin jääkaapissa ·'* käyttöön saakka. < 10 000 MW:n läpäissyt osa sisältää maidon 115383 54 anti-inflammatorisen tekijän, samoin kuin molekyylipainoltaan pieniä peptideitä, oligosakkarideja ja suuren määrän laktoosia. Anti-inflammatorinen aktiivisuus läpäisseessä osassa on pienimolekyylipainoisessa, aggregoitumattomassa muodossa.

5

Vaihe 2: DEAE-Sepharose-kromatografia

Anti-inflammatorisen aktiivisuuden alkufraktiointi tehtiin DEAE-Sepharosella. 5 x 50 cm pylväs, joka sisälsi 1 litran 10 DEAE-Sepharosea tasapainotettiin läpäisypuskurilla. Lä- päisypuskuri on steriili, endotoksiineista puhdas liuos, joka sisältää diffundoituvia ioneja, joita esiintyy bulkkimaidos-sa, sopivina konsentraatioina. Läpäisypuskuri sisältää CaCl2:ta, MgCl2:ta, NaCl:ia, Na-sitraattia ja NaH2P04:ää. Tyy-15 pillisesti noin 8 litraa < 10 000 MW:n läpäissyttä osaa pumpattiin DEAE-Sepharose-pylvääseen virtausnopeudella noin 500 ml tunnissa. Pylvään eluaattia seurattiin 280 nm:ssä. Pylväs pestiin tislatulla vedellä kunnes 280 nm:n absorbanssi palautui perustasolle (tyypillisesti vaadittiin noin 6-8 litraa 20 tislattua vettä). Anti-inflammatorinen aktiivisuus sitoutui pylvääseen ja se eluoitiin noin 4 litralla 0,5 M ammonium-asetaattia vedessä, pH 7,4. Eluaatti lyofilisoitiin kuiviin ja punnittiin. Kahdeksasta litrasta läpäissyttä osaa saadun talteen otetun materiaalin paino oli tyypillisesti välillä 25 15-20 grammaa. Koska ammoniumasetaatti haihtuu täysin ly- ofilisoinnin aikana, jäännöspaino edustaa sitoutuneen materiaalin painoa. Anti-inflammatorinen aktiivisuus tutkittiin hiiren neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määrityksellä.

i Φ 30 Vaihe 3: H-40-kromatografia » ; DEAE-Sepharose-pylväästä eluoitu materiaali fraktioitiin vie lä lajittelupylväässä, jotta erotettaisiin anti-inflammato- i l risesta aktiivisuudesta vastuussa oleva tekijä muista pieni- i 35 molekyylipainoisista komponenteista. Kahdeksan grammaa DEAE- !; näytettä liuotettiin 50 ml:aan tislattua vettä ja lisättiin 2,5 x 150 cm:n pylvääseen, joka sisälsi 736 ml Toyopearl HW- » 115383 55 40:ää (Rohm and Haas), joka oli tasapainotettu vedellä. Pylväs kehitettiin tislatulla vedellä virtausnopeudella 40 ml tunnissa ja eluaattia seurattiin 280 nm:ssä. Kerättiin fraktiot ja analysoitiin niistä anti-inflammatorinen aktiivisuus 5 hiiren neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määrityksellä. Fraktiot, jotka osoittivat aktiivisuutta ja minimiabsorbans-sia 280 nm:ssä yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Noin 80 mg materiaalia, joka sisälsi anti-inflammatorista aktiivisuutta, otettiin talteen kahdeksasta litrasta läpäissyttä osaa.

10

Vaihe 4: AffiGel 601 -kromatografia

Lopulliseen puhdistusvaiheeseen kuului aktiivisen tekijän affiniteettikromatografia pylväässä, joka oli pakattu boro-15 naatilla derivatisoidulla polyakryyliamidipohjaisella väliaineella (AffiGel 601, Bio-Rad), jolla on affiniteettiä samantasoisiin vierekkäisiin cis-hydroksyyliryhmiin. 40 mg pieni-molekyylipainoista HW-40:stä saatua materiaalia tasapainotettiin 10 ml:lla 0,25 M ammoniumasetaattia, pH 7,0 ja lisättiin 20 AffiGel-pylvääseen, joka oli myöskin tasapainotettu 0,25 M ammoniumasetaatilla. Eluaattia seurattiin 280 nmrssä. Pylväs pestiin 400 ml :11a 0,25 M ammoniumasetaattia virtausnopeudella 50 ml tunnissa, kunnes 280 nm:n absorbanssi pieneni taus-; ; tan tasolle. AffiGel-pylväs eluoitiin sitten 1 600 ml:lla 0,1 25 M muurahaishappoa, pH 2,8. Eluaatista testattiin aktiivisuus ,: hiiren neutrofiilien kulkeutumisen inhibitiomäärityksellä ja lyofilisoitiin kuiviin. Noin 8 - 10 mg sitoutunutta materiaa- !.* lia, joka sisälsi anti-inf lammatorista aktiivisuutta, otet- • » tiin talteen 8 litrasta läpäissyttä osaa.

30 : · Tällä menetelmällä saadulle valmisteelle annetaan nimi "AIF".

· Valmiste oli hyvin puhdistettu anti-inflammatorisen tekijän suhteen, mutta se ei ole homogeeninen. Valmiste osoittaa anti - inflammatorista aktiivisuutta hiiren neutrofiilien kulkeu-35 tumisen inhibitiomäärityksessä, rotan käpälän turvotuskokees-·* 1 sa, rotan korvan paisumiskokeessa ja estää neutrofiilien si- toutumista rotan suoliliepeen pikkulaskimoiden endoteeliin 115383 56 (visualisoitu elintensisäisellä mikroskoopilla). Perustuen vertaileviin analyyseihin hiiren neutrofiilien kulkeutumis-testissä, AIF on noin 55 000 kertaa puhdistetumpi kuin alkuperäinen kuorittu maito < 10 000 MW:n läpäissyt osa.

5

Esimerkki 16

Anti-inflammatorisen tekijän sisältävien valmisteiden vaikutus neutrofiilien adheesioon endoteelisoluihin ja neutrofiilien siirtymiseen verisuonistosta 10

Tutkittiin anti-inflammatorisen tekijän vaikutusta neutrofii-lien adheesioon endoteelisoluihin ja neutrofiilien siirtymiseen verisuonistosta. Käytettiin kahta eri valmistetta an-ti-inflammatorisesta tekijästä. Yksi valmiste tehtiin käyttä-15 mällä esimerkissä 2 kuvattua puhdistusmenetelmää. Tämän esimerkin tarkoituksia varten tätä valmistetta kutsutaan yksinkertaisesti "MAIF":iksi. Toinen anti-inflammatorisen tekijän valmiste tehtiin käyttämällä esimerkissä 15 kuvattua puhdistusmenetelmää, ja sitä kutsutaan sekä siinä esimerkissä että 20 tässä esimerkissä "AIF":iksi. Tulee ymmärtää, että sekä MAIF että AIF sisältävät anti - inflammatorisen tekijän puhtaudeltaan eri tasoisena.

» *

Kemikaalit: :·. 25 i ,,· Ihmisen seerumin albumiinia, trypsiiniä, verihiutaleita akti voivaa tekijää (PAF), forbolimyristaattiasetaattia (PMA), propidiumjodidia ja Histopaqueta hankittiin Sigma Chemical Co.:sta, St. Louis, Mo. Ihmisen neutrofiilien elastaasi os-30 tettiin Calbiochemistä. Hiiren anti-ihmis CD18 -monoklonaa-: : lista vasta-ainetta (IgG^alaluokka, FITC-konjugaatti) ja • · hiiren anti-avaimenreikäkotilon hemosyaniinia (IgG1-alaluok- ka, FITC-konjugaatti), joita käytettiin negatiivisina kont-rollivasta-aineina, ostettiin Beckton Dickinson Systems T 35 Inc.:lta, Mountain View, Kalifornia. Simply Cellular™ mikro- ·’*’ helmiä ostettiin Flow Cytometry Standards Corp.:ilta, Re- '/ search Triangle Park, NC. Toiset reagenssit olivat parasta 115383 57 kaupallisesti saatavilla olevaa laatua, ja niitä käytettiin ilman lisäpuhdistusta.

Menetelmät in vivo; 5

Elintensisäinen mikroskopiatutkimus. Kaksikymmentäneljä koi-raspuolista Wistar-rottaa (180 - 250 g) pidettiin puhdistetulla laboratorioruokavaliolla ja paastotettiin 24 tuntia ennen leikkausta. Eläimet nukutettiin aluksi pentobarbitaa-10 lilla (12 mg/100 g ruumiinpainoa). Oikeanpuoleinen päänvalti-mo ja kaulalaskimo kanyloitiin systeemisen valtimopaineen laskemiseksi (Statham P23A paineanturi ja Grass fysiologinen rekisteröintilaite) ja vastaavasti lääkkeen antamiseksi. Aukaistiin vatsa keskiviivaa pitkin ja eläimet asetettiin se-15 lälleen. Keskisuolesta vedettiin ulos segmentti aukileikatun vatsan kautta ja kaikki paljastunut kudos peitettiin suolaliuoksessa liotetulla sideharsolla kudosten kuivumisen estämiseksi. Suolilieve asetettiin varovasti optisesti kirkkaalle katselujalustalle, joka salli 2 cm2 kudossegmentin läpiva-20 laisun. Jalustan lämpötila pidettiin 37 °C:ssa jatkuvalla lämpötilan kierrättäjällä (Fisher Scientific, malli 80). Peräsuolen ja suoliliepeen lämpötilaa seurattiin sähkölämpömittarilla. Suolilieve peitettiin lämmitetyllä bikarbonaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,4). Elintensisäistä mik-25 roskooppia (Nikon Optiphot-2, Japani), jossa oli X 25 objektiivin linssi (Leitz Wetzlar L25/0,35, Saksa) ja X 10 okulaari, käytettiin suoliliepeen mikrokierron havainnoimiseksi.

• Kuva heijastettiin mikroskooppiin kiinnitetyllä videokameral la värimonitoriin ja kuvat nauhoitettiin jälkikäteen tehtävää 30 analysointia varten käyttäen videokasettinauhuria. Tutkimuk- t ; seen valittiin yksittäisiä haarautumattomia laskimoita, joi- : den läpimitta vaihteli välillä 25 - 40 μτα. Laskimoiden läpi mitta mitattiin suoraan videon mikrometriä käyttämällä. Kiinnittyneiden ja siirtyneiden neutrofiilien määrä määritettiin 35 erikseen nauhoitettuja kuvauksia toistettaessa. Neutrofiilin tulkittiin olevan kiinnittynyt laskimon endoteeliin, jos se pysyi paikallaan 30 sekuntia tai enemmän. Vieriviksi neutro- 115383 58 fiileiksi määriteltiin ne valkoiset verisolut, jotka liikkuivat pienemmällä nopeudella kuin erytrosyytit samassa suonessa. Leukosyyttien vierimisnopeus määritettiin sen ajan avulla, jonka leukosyytti tarvitsi kulkeakseen tietyn välimatkan 5 pikkulaskimon pituuden suuntaisesti.

Kokeen protokolla. Kun kaikki hemodynaamiset määreet olivat vakaassa tilassa, kuvia suoliliepeestä nauhoitettiin 5 minuuttia. Suolilievettä alijäähdytettiin sitten 60 minuuttia 10 100 mM PAF:ia kanssa MAIF-valmisteen ollessa läsnä joko 40 mg tai 5 mg/rotta (iv.). Edellä mainittujen määreiden mittaukset tehtiin jälleen 30 ja 60 minuutin PAF-alijäähdytyksen jälkeen. Kahdessa koeryhmässä suoliliepeen valmisteet altistettiin jälleen PAF:ille kuten edellä on kuvattu, mutta 30 mi-15 nuutin kuluttua ne saivat MAIF-valmistetta joko 40 tai 5 mg/rotta. Kolmessa lisäkokeessa annettiin AIF-valmistetta joko esikäsittelynä tai jälkikäsittelynä.

Menetelmät in vitro 20

Neutrofiilien eristäminen. Neutrofiilit terveistä luovuttajista puhdistettiin dekstraanisedimentoinnilla, mitä seurasi hypotoninen lyysaus ja Histopaque-sentrifugointi. Paitsi dekstraanisedimentointivaihetta, joka tehtiin huoneeniämmös-: 25 sä, soluja pidettiin 4 °C:ssa koko eristysmenettelyn ajan.

Soluvalmisteet sisälsivät 95 % neutrofiilejä ja enemmän kuin 99 % näistä oli elinkykyisiä määritettynä trypaanisineä käyt-;·, tämällä. Eristämisen jälkeen neutrofiilit suspendoitiin uu delleen lopulliseen konsentraatioon 2 X 106 solua/ml fosfaa-30 tiliä puskuroituun suolaliuokseen (PBS). Yhteneviä määriä soluja inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 20 minuuttia eri konsent-| * raatioissa joko MAIF- tai AIF-valmistetta. Pesun jälkeen neu- ;: trofiilejä inkuboitiin pimeässä 4 °C:ssa 30 minuuttia satu- roivissa konsentraatioissa fluoreskeiiniin konjugoitua hiiren

» I

‘ . 35 anti-ihmis CD18:aa, ihmisen CDllb:tä, IGG:llä päällystettyjä mikrohelmiä (Simply Cellular™ mikrohelmiä) tai hiiren negatiivista kontrollivasta-ainetta.

115383 59

Immunofluoresenssivärjäys ja FACS-analyysi. Suora im-munofluoresenssi CD18:n pintaekspression mittana tehtiin analysoimalla FACScanissa (Becton Dickinson Systems Inc. Mountain View, CA) käyttäen kanavan numeroa (log asteikko), joka 5 edusti 10 000 solun keskimääräistä fluoresenssi-intensiteettiä. Logaritmiset kanavanumerot muunnettiin lineaarisiksi arvoiksi käyttäen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Spesifinen keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti soluille, jotka oli värjätty CD18-vasta-aineilla, laskettiin sen jäl-10 keen, kun oli vähennetty negatiiviselle kontrollivasta-ai-neelle altistettujen solujen fluoresenssin intensiteetti. Elinkyvyttömät solut seulottiin käyttämällä propidiumjodidia.

Superoksidianalyysi. Superoksidin tuotanto eristetyistä neut-15 rofiileistä määritettiin PMA- ja N-formyyli-Met-Leu-Phe ("fM-LP") -stimulaation jälkeen eri konsentraatioiden MAIF:ia läsnäollessa. Aktivoitujen neutrofiilien aiheuttamaa sytokromi C:n pelkistymistä mitattiin käyttämällä spektrofotometriä (Hitachi U2000) 550 nm:ssä. Lyhyesti esitettynä näyte lisät-20 tiin kahteen kyvettiin ja yhtä kyvettiä käytettiin vertailuarvona. Jälkimmäinen sisälsi superoksididismutaasia (supe-roksidi-"puhdistaja"). Neutrofiilien annettiin tasapainottua 37 °C:ssa 5 min eri konsentraatioiden MAIF:ia läsnäollessa ja soluja stimuloitiin sitten joko PMA:11a tai fMLPtllä. Supe-25 roksidin tuotantoa mitattiin 3 min.

Proteiinin vapautuminen. Kaivot pinnoitettiin 125I:llä leimatulla albumiinilla ja annettiin kuivua yli yön. Sitoutumaton albumiini pestiin ja PMA:11a stimuloituja neutrofiilejä inku-30 boitiin kaivoissa yksi tunti eri konsentraatioiden MAIF:ia : läsnäollessa tai puuttuessa. Vapaa radioaktiivisuus kaivojen ’ supernatantissa jaettiin kokonaisradioaktiivisuudella kussa- kin kaivossa, jotta saatiin analysoitua proteolyysin taso.

115383 60

Tulokset

Tuloksista on esitetty yhteenveto kuvissa 24 - 30 ja taulukoissa 7-9. Kuviossa 24 osoitetaan, että PAF-alijäähdytys 5 lisäsi neutrofiilien tarttumista hiussuonten jälkeisiin pik-kulaskimoihin noin 6-kertaiseksi 60 min aikana. 40 mg MAIF-valmistetta kullekin rotalle vähensi PAF:in indusoimaa neut-rofiilien tarttumista enemmän kuin 90 % 30 minuutissa ja enemmän kuin 80 % 60 minuutissa. Kiinnostavaa oli, että MAIF-10 esikäsittely näytti myös vähentävän tarttuvien neutrofiilien lukumäärää ennen altistusta PAF:ille. MAIF:in pienempi kon-sentraatio (5 mg rottaa kohti) oli vähemmän tehokas, pienentäen leukosyyttien tarttumista 50 % 60 minuutissa. AIF-val-misteen konsentraationa 0,01 mg rottaa kohti havaittiin vä-15 hentävän leukosyyttien tarttumista noin 50 % 60 minuutissa.

Kymmenkertaisesti suuremmassa AIF-konsentraatiossa havaittiin hyvin suuri lisääntyminen leukosyyttien tarttumisessa (tuloksia ei ole esitetty). Tarttuminen oli niin dramaattista, ettei videonauhaa voitu analysoida. Kuvio 25 esittää MAIF:in ja 20 AIF:in vaikutuksen neutrofiilien kulkeutumiseen. MAIF:in konsentraationa 40 mg rottaa kohti 5 mg rottaa kohti ja AIF:in konsentraationa 0,01 mg rottaa kohti havaittiin estävän neutrof iilien kulkeutumisen lisääntymisen täysin PAF-altistuksen : : aikana. Neutrofiilien vuoto ei näyttänyt muuttuvan merkitse- • ; 25 västi MAIF:illa käsitellyssä ryhmässä verrattuna käsittele- .mättömään ryhmään (kuvio 26) . Kun annettiin AIFria, me ha-, ·, vaitsimme aluksi enemmän vieriviä neutrofiilejä kuin tavalli- sesti, niiden lukumäärä kuitenkin pieneni ajan kuluessa.

30 Toisessa koesarjassa annettiin eri anti-inflammatorisia ai-: » neita sen jälkeen kun neutrofiilit olivat jo tarttuneet (ku- ‘: vio 27). Tässä koesarjassa MAIF-annos 40 mg/rotta esti leu- kosyyttien tarttumisen, mutta annos 5 mg/rotta ei tehnyt sitä. AIF annoksena 0,01 mg rottaa kohti esti neutrofiilien '·’ 35 tarttumista noin 25 %. Suuremman konsentraation MAIF:ia (40 ' ' mg/rotta) vaikutuksen analysoimiseksi tutkittiin tarttuvien V neutrofiilien lukumäärä nauhoituksen alussa ja uusien neutro- 115383 61 fiilien, jotka tarttuivat yli 5 minuutiksi lukumäärä kussakin vaiheessa. Kuviossa 27a osoitetaan, että vähemmän neutrofii-lejä oli tarttuvia 10 minuutin jälkeen MAIF:in antamisesta osoittaen, että anti-inflammatorinen tekijä oli todellisuu-5 dessa "kuorinut pois" tarttuvat neutrofiilit. Lisäksi kuvio 27b osoittaa selvästi, että MAIF esti uudet neutrofiili-endo-teelisolutakertumiset. Se nopeus, jolla neutrofiilit kierivät pikkulaskimoita pituussuuntaan, ei vaihdellut ryhmien välillä tai ajan suhteen sillä poikkeuksella, että AIF saattaa ollut 10 lisännyt neutrofiilien kierimisnopeutta (kuvio 28). Tämä vaikutus oli melko kiinnostava sen tosiseikan valossa, että punasolujen nopeus pysyi muuttumattomana (kuvio 29). Tulokset antavat olettaa, että yksinkertainen hydrodynaamisten voimien lisääntyminen ei voi selittää neutrofiilien kierimisnopeuden 15 lisääntymistä. MAIF ei vaikuttanut myöskään neutrofiilien vuotoon, mutta AIF taas pienensi sitä (kuvio 30).

Tulokset kokeista in vitro osoittavat, ettei anti-inflammato-rinen tekijä häiritse neutrofiilien aktivaatiota per se. Su-20 peroksidiradikaalien "puhdistaja", superoksididismutaasi esti täysin PMA:n ja fMLP:n stimuloimien neutrofiilien aiheuttaman sytokromi c:n pelkistymisen, antaen olettaa, että tämä on superoksidin välittämä prosessi. Äärimmäisen suuret MAIF-kon-sentraatiot vaikuttivat sytokromi c:n pelkistymiseen vain 25 minimaalisesti, antaen olettaa, ettei MAIF suoraan poista superoksidia (taulukko 7). MAIF ei vaikuttanut proteaasin vapautumiseen (tuloksia ei ole esitetty).

Havaittiin, että MAIF tai AIF pystyi vähentämään mono-30 klonaalisen vasta-aineen anti-CD18 sitoutumista (taulukko 8).

:: Tätä ei tapahtunut CDllb-vasta-aineen yhteydessä. MAIF- tai '‘ AIF-valmisteet eivät myöskään vaikuttaneet CD18-vasta-aineen sitoutumiseen IgG:llä päällystettyihin mikrohelmiin, antaen ·’, olettaa, että anti-inflammatorinen tekijä ei vaikuttanut mo- • _ 35 noklonaalisen vasta-aineen anti-CD18 kykyyn sitoutua subst raattiin, vaan vaikutti todennäköisemmin ligandiin CD18. Sama kuvio havaittiin stimuloitujen neutrofiilien suhteen (tauluk- 115383 62 ko 9). Tulisi huomata, että sitoutuminen CD18:aan vaihteli päivien välillä, koska kunakin päivänä käytettiin eri soluja. Sen vuoksi ei voida tehdä suoraa vertailua taulukon 8 ja taulukon 9 tulosten välillä.

5 TAULUKKO 7 MAIF:in vaikutus solujen superoksidin eritykseen_ MAIF PMA:n stimuloima su- fMLP:n stimuloima peroksidin tuotanto superoksidin tuotan- (nmol/min/107 solua) to (nmol/min/107 so- __lua)_ 0,0 mg/ml 153 _55_ 10 0,1 mg/ml__145__50_ 1.0 mg/ml 143 _40_ 5.0 mg/ml _140__32_ 10.0 127 mg/ml _ _ ____ 15 TAULUKKO 8

Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus solun pinta-_antigeeneihin CD18 ja CPU_ 2 0 Stimuloimattomat Kanavan keskimää- Kanavan keski- neutrofiilit räinen fluo- määräinen fluoresenssi resenssi ! Anti-CD18 vasta- Anti-CDll vas- • aine ta-aine ,·, Vain neutrofiilit__314,24__1594,57_ ·!·* + 0,1 mg/ml MAIF 234,26__1553,74_ 25 +1,0 mg/ml MAIF 262,78__1796,00_ + 0,1 μg/ml AIF 248,28 1577,04 •’1 + 1,0 Mg/ml AIF 188,93 1554,61 _

Helmet + Anti- 60,03 ; > CD18 vasta-aine________ 3 0 + 1 mg/ml MAIF__88,61___ . ; + 1 Mg/ml AIF__84,99 115383 63 TAULUKKO 9 MAIF:in vaikutus solun pinta-antigeenien CD18 saatavuuteen stimuloiduilla ja stimuloimattomilla neutrofiileillä_ 5 Stimuloimattomat neutro- 236,95 fiilit__ + MAIF 1 mg/ml 216,08 + MAIF 5 mg/ml__251,51_

Stimuloidut neutrofiilit 266,69 10 + MAIF 1 mg/ml__158,68_ + MAIF 5 mg/ml 171,96

Tulosten tarkastelu 15

Edellä olevan esimerkin tulokset antavat olettaa, että anti-inflammatorinen tekijä estää neutrofiilien tarttumista ja kulkeutumista pikkulaskimoissa annoksesta riippuvalla tavalla. Tärkeämpää kuitenkin on, että anti-inflammatorinen tekijä 20 voisi, lyhyenä ajanjaksona (10 min), kumota neutrofiilien tarttumisen näihin verisuoniin. Ainoat muut aineet, jotka saavat tarttuvat neutrofiilit irrottamaan otteensa endotee-listä tällaisella tehokkuudella, ovat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on suunnattu CDll/CD18-glykoproteiinikompleksia 25 vastaan neutrofiilissa. MAIF:illa ei näyttänyt olevan mitään vaikutusta veren virtaukseen yksittäisten verisuonten läpi tai systeemiseen verenpaineeseen, antaen olettaa, että hemo-; ; dynaamiset tekijät, kuten leikkausjännitys, eivät voineet :: vastata leukosyyttien tarttumisen peruuntumisesta. Vaikka 30 leukosyyttien vieriminen näyttää olevan edellytyksenä leu-kosyyttien tarttumiselle, MAIF ei vaikuttanut leukosyyttien » » vierimisnopeuteen tai leukosyyttien vuotoon. Jälkimmäinen

i I

• tulos antaa olettaa, että anti-inflammatorinen tekijä ei vai- * * • ί kuttanut niiden neutrofiilien lukumäärään, jotka vierivät , ,· 3 5 suonen läpi ja sen vuoksi, että tarttuvien leukosyyttien vä heneminen ei johtunut siitä, että vähemmän leukosyyttejä olisi ollut vuorovaikutuksessa endoteelin kanssa. Se tosiseikka, että leukosyyttien vierimisnopeus, samoin kuin leukosyyttien 115383 64 vuoto pysyi muuttumattomana, antaa olettaa, että MAIF-valmisteessa oleva anti-inflammatorinen tekijä ei vaikuttanut neut-rofiileissä ja endoteelissä oleviin tarttumismolekyyleihin, jotka ovat vastuussa leukosyyttien vierimisestä (IL-selektii-5 ni, P-selektiini).

On raportoitu, että leukosyytti voi säädellä omaa tarttumistaan vapauttamalla superoksidia samoin kuin proteaaseja. Sen vuoksi oli mahdollista, että leukosyyttien tarttumisen puute 10 MAIF:in ja AIF:in läsnäollessa johtui näiden valmisteiden kyvystä estää superoksidin tai proteaasien vapautuminen. Tämä mahdollisuus ei kestä sen tosiseikan valoa, että MAIF:illa oli vain vähän vaikutusta superoksidin tai proteaasien vapautumiseen, eikä se ollut vuorovaikutuksessa vapautuneiden pro-15 teaasien tai puhdistajan vapauttaman superoksidin kanssa.

Sitä paitsi MAIF ei näyttänyt vaikuttavan neutrofiilien elin-kykyyn arvioituna propidiumjodidilla, tehden anti-inflammatorisen tekijän suoran sytotoksisen vaikutuksen neutrofiileihin epätodennäköiseksi.

20

Neutrofiilin tarttumiseksi ja kulkeutumiseksi sillä täytyy olla intakti CD11/CD18-glykoproteiinikompleksi. Tarttumiskom-pleksin immunoneutralisaatio heikentää täysin neutrofiilin kyvyn tarttua pysyvästi endoteeliin ja siirtyä ympäröivään 25 kudokseen. Koska neutrofiilien tarttuminen ja siirtyminen on ’ nopeutta rajoittava vaihe kudosvauriossa, johon liittyy jouk- • ko tulehdustiloja, aine joka häiritsee näitä prosesseja es- .·;·. täisi myös todennäköisesti tulehdusreaktion. Tässä tutkimuk sessa sekä MAIF että AIF kumosivat dramaattisesti neutrofii-. . 30 lien tarttumisen ja estivät neutrofiilien kulkeutumisen, jota PAF indusoi. Koska AIF:n, MAIF:in ja anti-CD18-monoklonaali- t i ' ·' ' sen vasta-aineen välinen samanlaisuus indusoi neutrofiilien : tarttumisen kumoutumista, näytti mahdolliselta, että anti-in- flammatorinen tekijä AIF:issa ja MAIF:issa käytti vaikutus-’ , 35 taan suoralla vuorovaikutuksella CD18-glykoproteiinikomplek- sin kanssa. Edellä esitetyt tulokset in vitro tukevat tätä näkemystä, että sekä AIF että MAIF estivät anti-CD18-vasta- 115383 65 aineen kyvyn sitoutua CD18-glykoproteiinikompleksiin. Sitä vastoin AIF tai MAIF eivät vaikuttaneet CDllb:n sitoutumiseen sen vastaavaan monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Lopuksi, AIF- ja MAIF-valmisteet eivät häirinneet monoklonaalisen vas-5 ta-aineen anti-CD18 kykyä sitoutua IgG:llä päällystettyihin mikrohelmiin. Näin ollen voidaan päätellä, että anti-inflam-matorinen tekijä on vuorovaikutuksessa CD18-kompleksin kanssa suoraan ja estää CD18.-aa sitoutumasta eri ligandeihin, mukaanluettuna endoteelisolujen tarttumismolekyylit.

10

Esimerkki 17 (vertailu) MAIF:in vaikutus verenkierrossa kulkeviin leukosyytteihin

Useat farmakologiset aineet voivat inhiboida neutrofiilien 15 kulkeutumista. Kun jotkin, kuten syklofosfamidi, ovat sytore-duktiivisia ja toimivat inhiboimalla hemopoieesia luuytimes-sä, toisilla aineilla, kuten steroideilla ja ei-steroidisilla anti-inflammatorisilla aineilla on spesifiset vaikutuskohdat, ja ne eivät johda leukosytoosiin. Sen vuoksi oli tärkeää mää-20 rittää anti-inflammatorisen tekijän vaikutus verenkierrossa > · kulkevien valkosolujen lukumäärään ja suhteisiin.

Tehtiin kaksi koetta. Ensimmäisessä MAIF-valmiste annettiin · intravenaalisesti annoksena 40 mg/rotta yhdelle 6 eläimen . .·. 25 ryhmälle ja kontrolliryhmä injektoitiin suolaliuoksella. Ve- rinäytteet otettiin perustasosta, 1, 4 ja 24 tuntia käsitte- • · · lyn jälkeen. Tuloksista on esitetty yhteenveto kuviossa 31.

115383 66 tu näytteestä, joka on otettu 4 tuntia 40 mg MAIF-valmistetta antamisen jälkeen (katso kuvio 31).

MAIF-annokset johtivat veressä kiertävien neutrofiilien luku-5 määrän lisääntymiseen ja lymfosyyttien määrän vähenemiseen. Samalla kun vaikutus lymfosyytteihin oli lineaarisesti riippuvainen annoksesta, neutrofiilien lukumäärän lisääntyminen oli käyrän muotoinen, suurimman vaikutuksen ollessa havaittavissa niissä eläimissä, joille oli annettu 10 mg.

10 Nämä tulokset tukevat sitä käsitystä, että anti-inflammatorinen tekijä muuntelee tulehdusta vaikuttamalla neutrofiilien tarttumiseen endoteelisoluihin.

15 Saatiin myös tulokset, jotka koskivat kolmen muun solukohden-netun, anti-inflammatorisen/immunomuuntelevan aineen vaikutusta verenkierrossa oleviin leukosyytteihin rotassa. Ste-roidilääke metyyliprednisoloni aiheuttaa muutoksen lymfosyyt-ti/neutrofiili -suhteessa joka on analoginen MAIF:in yhtey-20 dessä nähdyn kanssa. Temporaalinen suhde lääkkeen antamisen . ja vaikutuksen välillä on jokseenkin erilainen. Hylkimisen- vastainen/anti-inflammatorinen aine syklosporiini A aiheuttaa myös kiertävien neutrofiilien lukumäärän lisääntymistä, mutta lymfosyyttien lukumäärät joko lisääntyvät tai niihin ei ole • * 25 vaikutusta annoksen mukaan. Sitä vastoin sytotoksinen lääke ,· | syklofosfamidi poistaa sekä kiertävät lymfosyytit että neut- rofiilit. Anti-inflammatorisen tekijän vaikutukset näyttäisivät yhtenevän läheisesti metyyli-prednisolonin vaikutuksen : kanssa.

* * 9 30

Esimerkki 18

Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus lymfosyyttien toimin- ’...* taan • * · i · t • » · 35 Anti-inflammatorisen tekijän kyky indusoida palautuva kier- rossa olevien lymfosyyttien lukumäärän väheneminen (esimerkki 17) antoi aihetta lisätutkimuksiin tekijän vaikutuksesta lym- ♦ i 115383 07 fosyyttien toimintaan. Siirros vastaan isäntä (GvH) ja isäntä vastaan siirros (HvG) -analyysejä käytettiin määrittämään tekijän vaikutus T-lymfosyyttien toimintaan.

5 HvG-analyysissä oleviin Dark Agouti -emorottiin ("DA") injektoitiin i.v. 20 mg MAIF-valmistetta 48, 24 ja 3 tuntia ennen kuin lymfosyyttejä niiden Fl-hybridijälkeläisistä (DA x Hooded Oxford -rotat) injektoitiin niiden polkuanturoihin. Täten määritettiin anti-inflammatorisen tekijän vaikutus intaktista 10 isännästä (DA) peräisin olevien T-lymfosyyttien kykyyn reagoida Fl-lymfosyyttien vieraisiin histokompatibiliteettianti-geeneihin. Tämä menetelmä sai aikaan reaktion erittäin merkitsevän vähenemisen (30 %) osoitettuna polvitaipeen imusolmukkeen painolla (kuvio 33A) .

15

GvH-reaktiossa emon (DA) lymfosyytit saatiin MAIF:illa käsitellyistä emorotista (DA) ja injektoitiin niiden Fl (DA x Hooded Oxford) -jälkeläisten polkuanturoihin. Tällä kokeella mitattiin arvioinnisssa olevasta isännistä, ts. MAIFrilla 20 käsitellyistä rotista poistettujen T-lymfosyyttien reagointia >' arvioinnissa in vivo. MAIF-hoito-ohjelmalla ei ollut vaiku- ! tusta GvH-reaktioon (kuvio 33B) .

Edellä olevien esimerkkien aikana huomattiin pernan lymfo- t * 25 syyttien ilmeinen lisääntyminen MAIF:illa käsitellyissä eläi- :,· f missä. Lisätutkimukset osoittivat sekä pernan painon että

V : pernasolujen lukumäärän merkitsevän lisääntymisen (kuviot 33C

ja 33D). Pernasolujen lukumäärän lisääntyminen vastasi suun- | nilleen verenkierrossa olevien solujen lukumäärän vähenemis- * · · » 30 tä, josta kerrottiin aikaisemmin.

• » ·

Lopuksi määritettiin anti-inflammatorisen tekijän vaikutus eristettyjen pernan lymfosyyttien kykyyn reagoida mitogeeniin konkanavaliini A. MAIF-valmisteen antamisen havaittiin mel-35 kein täysin estävän viljeltyjen lymfosyyttien mitogeenisen reaktion tähän lektiiniin (kuvio 33E) .

115383 68

Esimerkki 19

Anti-inflammatorisen tekijän aiheuttama suppressio infektion indusoimaan tulehdukseen 5 On toteutettu tutkimuksia sen määrittämiseksi, voitaisiinko muutoksia akuutin vaiheen reaktanttien (APRt) seerumissa olevissa tasoissa käyttää kvantifioitaessa anti-inflammatorisen tekijän anti-inflammatorista aktiivisuutta. APR:t ovat ryhmä proteiineja, jotka syntetoidaan reaktiona tulehdusärsykkee-10 seen. Yksi näistä, alfa-2-makroglobuliini on yleinen sekä ihmisissä että rotissa, ja metodeja tämän tulehduskomponentin tutkimiseksi on saatavissa. Kaksi intravenaalista MAIF-val-misteen injektiota (0 ja 24 tuntia) ei pienentänyt alfa-2-makroglobuliinin huipun reaktiota (48 tuntia). Tämä tulos 15 osoittaa, ettei tekijä vaikuta myöhäisempään tulehdusreaktioon .

Esimerkki 20 (vertailu)

Maidosta johdetun anti-inflammatorisen tekijän arviointi in 2 0 vitro ja in vivo (naudan nisän makrofaagianalyysi, infek tioinani t hiiressä)

Naudan nisän makrofaagien inkubointi hyperimmuunimaito- ‘ fraktion kanssa ei lisännyt havaittavasti fagosytoosin mää- ‘ * 25 rää, mutta lisäsi makrofaagien kykyä tappaa fagosytoitua Sta- • · · phylococcus aureusta. Hiirissä, joihin oli injektoitu intra- '>/· : peritoneaalisesti 10 mg MAIF-valmistetta kilogrammaa kohti, osoitettiin lisääntynyttä resistenssiä intraperitoneaaliselle altistukselle letaalille Staphylococcus aureukselle.

im .···. 30 • i

Nisän sisäisessä Staphylococcus aureus mastitis -altistusmal- » # *···* lissa MAIFrilla injektoiduissa hiirissä näkyi merkitsevästi ·”* vähemmän nisätulehdusta ja surkastumista ja lisääntynyttä .j. selviytymistä infektoivasta organismista. MAIFrilla käsitel- » i * · 3 5 lyistä hiiristä olevan nisäkudoksen kvantitatiivinen histolo- > · ginen analyysi osoitti merkitsevästi enemmän ontelolta, vähemmän keuhkorakkuloiden välistä sidekudosta ja vähemmän leu- I 115383 69 kosyyttien infiltraatiota verrattuna kontrollihiiriin. Käsiteltyjen hiirten nisät sisälsivät myös vähemmän pesäkkeitä muodostavia yksiköitä kuin kontrollihiirten. Anti-inflammato-risuus näyttää käyttävän vaikutustaan ei-spesifiseen puolus-5 tusjärjestelmään muuntamalla leukosyyttien toimintaa.

Esimerkki 21

Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus kokeellisen infektion patogeneesiin 10

Ihmisen kohtaamat yleisimmät tulehduksen aiheuttajat ovat mikrobeja, ja on tärkeää määrittää minkä tahansa isännän puolustusta muuntelevan aineen teho infektiota vastaan. Kudosvaurion, joka yhdistyy moniin infektiosairauksiin, aiheuttaa 15 itse asiassa isännän reaktio infektioon, ennemmin kuin tunkeutuva organismi. Samalla kun kyky muuntaa tulehdusreaktiota infektioon voi olla hyödyllinen kliininen tekniikka, tulee ymmärtää, että isännän reaktion inhiboiminen infektion aikana voi olla epäedullista. Tämä on erityisen totta neutrofiilien 20 inhibition tapauksessa. Tutkimukset aineilla, jotka hillitse-*; vät neutrofiilien osallistumista infektion varhaisiin vaihei- siin ovat osoittaneet, että samalla kun tulehdusta ja kudos-;·. vaurioita voidaan suppressoida alun perin, lisääntynyt bak- I | teerikuormitus, joka seuraa vähentyneestä solujen reaktiosta, * · . , 25 johtaa lopulta kudosvaurion pahenemiseen. Näin ollen on olen-

' · I

naista arvioida maidon anti-inflammatorisen tekijän mahdolli- » · · '·* * suudet muuntaa infektiota, jotta (1) määritetään, voiko aine vähentää infektion indusoimaa kudosvauriota ja (2) analysoi-i daan, yhdistyykö mikään havaittu isännän reaktion suppressio : 30 infektion vakavuuden lisääntymiseen.

i * » · » » • » Määritettiin anti-inf lammatorisen tekijän vaikutusta turvo- I a tuksen muodostumiseen sen jälkeen kun oli injektoitu intra- * t t ’.· · dermaalisesti E. coli 075:ttä. Käytettiin kahta 8 eläimen ‘J·*: 35 ryhmää. Yksi ryhmä oli käsittelemätön ja toimi kontrollina, kun taas toisen ryhmän yksilöihin injektoitiin intravenaali-sesti 40 mg MAIF-valmistetta 0,5 ml suolaliuoksessa. Välittö- 115383 70 mästi MAIFrin antamisen jälkeen injektoitiin 100 μΐ E. coli 075:n yli yön kasvatettua viljelmää intradermaalisesti kahteen nahan kohtaan rotan ajellussa selässä, mitä seurasi 100 μ1:η suolaliuosta injektointi intradermaalisesti kahteen li-5 säkohtaan. Jotta mahdollistettaisiin turvotuksen tilavuuden arviointi infektoituneessa ihossa, 0,1 μ(2ϊ: tä 125I-HSA:ta injektoitiin intravenaalisesti altistuksen ajankohtana. Kuusi tuntia myöhemmin eläimet nukutettiin, otettiin verinäyte, poistettiin selän nahka ja infektoidut ja suolaliuoksella in-10 jektoidut kohdat otettiin rei'ityslaitteella irti. Turvotuksen tilavuus laskettiin liittämällä kudoslaskut plasmalaskui-hin kuvatulla tavalla. Jotta saataisiin turvotuksen tilavuus joka kertyy E. colin läsnäolon seurauksena, suolaliuoksella injektoitujen kohtien turvotus/plasmatilavuus vähennettiin.

15 Tulokset on esitetty kuviossa 34.

MAIF:in antaminen johti turvotuksen muodostumisen inhibitioon 48 prosentilla. Tämä koe osoitti, että anti-inflammatorinen tekijä pystyi mukauttamaan paikallista tulehdusreaktiota in-20 fektiolle.

Yhteyksien tutkimiseksi anti - inflammatorisen tekijän antamisen, bakteerien replikaation, nesteen kertymisen ja tulehdus-v · solujen infiltraation välillä käytettiin vaihtoehtoista in- ’· · 25 fektiomallia. Polyuretaanisienet, jotka oli valmistettu ja *:* : siirrostettu kuten aikaisemmin on kuvattu, infektoitiin suu- • */; ruudeltaan määrätyllä näytteellä E. coli 075:ttä siirrostuk- ' I I * sen ajankohtana. Sienet poistettiin määräaikaisin välein, punnittiin tihkuneen tulehdusnesteen tilavuuden määrittämi-, . 30 seksi ja puserrettiin sitten ravintoalustaan bakteereiden ja

Iti * * · solujen poistamiseksi sienistä. Bakteerien ja solujen luku- i · · *>* * määrät arvioitiin käyttämällä alaan perehtyneiden tuntemia S tekniikoita. Toteutettiin seuraava koe käyttämällä tätä mal- lia. Yhdeksänkymmentä eläintä jaettiin kahteen 45 eläimen • . 35 ryhmään. Toista näistä ryhmistä ei käsitelty ja se palveli ’ * kontrollina. Toiselle ryhmälle injektoitiin intravenaalisesti • 40 mg MAIF-valmistetta. Sienet siirrostettiin sitten subku- 115383 71 taanisesti ja siirrostuksen ajankohtana kukin sieni ympättiin 105 E. coli 075:llä. 6-8 eläimen ryhmät tapettiin sen jälkeen tietyin välein ja bakteriologinen status ja tulehdus-suodoksen määrä sienissä määritettiin. Tulokset on esitetty 5 kuvissa 35 - 37.

Bakteerien replikaation taso oli paljon suurempi MAIF:illa käsitellyissä eläimissä kuin kontrolleissa ja bakteerien lukumäärissä oli 10-, 1 000- ja 10 000-kertainen ero 4, 8 ja 10 vastaavasti 16 tunnissa. Tämän jälkeen bakteerien määrä väheni, vaikka vielä 96 tunnin kohdalla oli olemassa suuri ero (kuvio 35).

Varhainen reaktio infektioon on kriittinen määräävä tekijä 15 infektiotapahtuman seurauksena. Tässä kokeessa solujen tihku-ma 2, 4 ja 8 tunnin kohdalla niissä eläimissä, joille oli annettu MAIF:ia, oli 27 %, 35 % ja vastaavasti 46 % kontrol-litihkumasta (kuvio 36B). Solut, jotka kertyivät ensimmäisenä 24 tuntina altistuksen jälkeen ovat > 90-prosenttisesti neut-20 rofiilejä ja tämän solukomponentin suppressio tämän vaiheen aikana voi johtua bakteerien lukumäärän nopeasta lisääntymisestä. MAIF:in antaminen ei vaikuttanut nesteen kertymiseen 2 tunnin kohdalla, mutta se oli merkitsevästi vähäisempää 4, 8 V ja 16 tunnin jälkeen altistuksesta. Tämä on yhtenevää aikai- : ; 25 semman havainnon kanssa, ettei anti-inflammatorinen tekijä :· · suppressoinut primaarista, ei-sellulaarista vaihetta turvo- ; ,*, tuksen muodostumisessa karrageenanilla tehdyssä polkuantura- mallissa. Aikaisemmissa tutkimuksissa käyttäen immunomodula- »tl torisia aineita syklosporiini A:ta ja metyyliprednisolonia . , 30 osoitettiin samanlainen yhteys akuutin sellulaarisen tuleh- ;· dustihkuman suppression ja bakteerien replikaation edistymi- I * » ’·* ’ sen välillä. Näissä tutkimuksissa lisääntynyt bakteerikuormi- ; tus edisti kuitenkin isännän reaktiota 24 - 48 tunnin välillä • tl · altistuksen jälkeen, jolloin esiintyi massiivinen neutrofii-• 35 lien tulva. Kun kudos osallistui, lisääntynyt tulehdusreaktio johti merkittävään kudosvaurion pahenemiseen ja arpimuodos-.* tukseen. Kiinnostavaa oli, että vaikka MAIF:in antaminen sup- 115383 72 pressoi varhaista tulehdusreaktiota ja liittyi 10 000 kertai-seen bakteerien määrän lisääntymiseen, ei esiintynyt neutro-fiilien massiivista tulvaa 24 - 48 tuntia altistuksen jälkeen .

5

Esimerkki 22

Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus kokeelliseen pye-lonefriittiin 10 Aineella, joka pystyy suppressoimaan tulehdusta infektiossa aiheuttamatta jälkitilana lisääntynyttä kudosvauriota, olisi huomattavia mahdollisuuksia. Kliinisesti asiallinen infektiosairauden malli tarjoaisi kokeellisen perustan tällaisten mahdollisuuksien todistamiseksi.

15

Pyelonefriitti on infektiosairaus, jossa esiintyy paikallista tulehdusta, kudosvauriota ja arpimuodostusta pääasiallisina histologisina piirteinä. Sairaudesta on saatavilla hyvin karakterisoitu malli, joka jäljittelee sairauden pääasiallisia 20 patologisia piirteitä ihmisessä. Pyelonefriitti indusoidaan rottaan siirrostamalla suoraan kirurgisesti paljastettuun munuaiseen ennalta määritetty määrä E. coli 075:ttä. Altistuksen jälkeen bakteerien lukumäärä nousee nopeasti ja saa- \* vuttaa huipun 3-4 päivää myöhemmin. Normaaleissa eläimissä . » » : : 25 infektion taso vähenee seuraavien 5-6 päivän jälkeen ja ί"! saavuttaa tasangon noin 10 päivää altistuksen jälkeen. 21 päivässä vauriot ovat laskeneet ja läsnä kuten uurteinen ar- » i pikudos. Anti-inflammatorisen tekijän vaikutuksen arvioimiseksi tässä tulehdusmallissa 26 eläimen molempiin munuaisiin - f<> 30 indusoitiin pyelonefriitti. Puolet eläimistä hoidettiin MAIF- * t .Ί,' valmisteella suonensisäisesti annoksella 40 mg/rotta altis- * r tuksen hetkellä ja uudelleen 48 tuntia myöhemmin. Seitsemän tI| eläintä tapettiin 4 päivää sen jälkeen kun pyelonefriitti oli indusoitu ja kaksi jäljelle jäävää kuuden eläimen ryhmää 21 35 päivän jälkeen. Munuaiset poistettiin aseptisesti ja punnit- i t , , tiin tulehdusnesteen suhteellisen tilavuuden määrittämiseksi.

* ·

Pintavaurion kokoa arvioitiin suoraan visuaalisesti ja munu- 115383 73 ainen homogenisoitiin bakteerimäärien laskemiseksi. Tulokset on esitetty kuviossa 38.

Neljä päivää altistuksen jälkeen tulehdusvaste vaimeni MAIF:-5 in antamisen jälkeen, mitä todisti nesteen keräytymisen estyminen ja munuaisten pinnalla olevien vaurioiden koko. Kuten aikaisemmin oli havaittu tutkimuksissa, jotka koskivat infek-toituja, ihonalaisesti siirrostettuja sieniä, tulehduksen vaimeneminen varhain aiheutti bakteerien logaritmisen kasvun 10 MAIF:illa hoidetuissa eläimissä. 21 päivän kuluttua taudin patologiassa ei ollut mitään eroa, kun mitattiin munuaisen paino, bakteerien lukumäärä tai munuaisten pinnan vaurioiden koko. Siten samalla kun varhaisen tulehdusvasteen vaimentaminen MAIF:illa ei aiheuttanut vähenemistä kudoksen tuhoutumi-15 sessa pyelonefriitin kroonisessa (21 päivän) vaiheessa, se ei myöskään edistänyt patologisten vaurioiden kehitystä kuten muut anti-inflammatoriset ja immunomodulatoriset aineet ovat tehneet.

20 Esimerkki 23

Yhteenveto tutkimustiedoista

Kehitettiin menetelmä, joka mahdollisti karrageenanilla in-; jektoidun polkuanturan turvotuksen kerääntymisen jatkuvan : 25 tarkkailun.

Anti-inflammatorinen tekijä ei vaikuttanut tulehdusvasteen . . varhaiseen, ei-fagosyyttiseen vaiheeseen, kun taas myöhempi, solujen aikaansaama reaktion vaihe inhiboitui merkittävästi. 30 Lisäkokeet, joissa annettiin MAIF:ia jaksoittain ennen karra-

I I

geenan-injektiota tai sen jälkeen, antoi lisätodisteita sii-’ tä, että MAIF antoi anti-inflammatorisen vaikutuksensa modu- ; .* loimalla sekundääristä, neutrofiilien välittämää tulehdusvas- "’· tetta.

i i 35

‘ > I

Anti-inflammatorisen tekijän puoliintumisajan osoitettiin > » olevan 1-2 tuntia intravenaalisen injektion jälkeen, ja 115383 74 tulehduksen kehittymistä voitiin vaimentaa kun tekijää annettiin 30 minuuttia altistuksen jälkeen. Tämä tulos on tärkeä anti-inflammatorisen tekijän mahdolliselle terapeuttiselle käytölle.

5

Neutrofiili on tärkein solu, joka on osallisena akuutissa tulehdusvasteessa. Arthus-reaktion aikana havaittiin MAIF:in antamisen jälkeen > 80 % väheneminen neutrofiilien kertymisessä, mihin puolestaan liittyi erittäin merkitsevä tulehdus-10 reaktion sekundaaristen ominaisuuksien, nimittäin turvotuksen ja verenvuodon, inhiboituminen. Tämä tulos antoi lisäosoituk-sen siitä, että neutrofiilit ovat kohteena MAIF:in indusoimassa tulehduksen suppressiossa.

15 Yksi avainvaiheista tulehduksen kehittymisessä on neutrofii-lien kulkeminen verisuonistosta kudoksiin. Anti-inflammatorisen tekijän antaminen intravenaalisesti osoitettiin johtavan neutrofiilien kulkemisen selvään ja annoksesta riippuvaan inhibitioon. Kun anti-inflammatorisen tekijän vaikutusta tut-20 kittiin ääreisveren leukosyytteihin, havaittiin merkittävä verenkierrossa olevien neutrofiilien määrän lisääntyminen, johon liittyi vastaava lymfosyyttien lukumäärän väheneminen. Tämä vaikutus oli myöskin annoksesta riippuvainen, mutta : : neutrofiilien määrän lisääntymisen tapauksessa se ei ollut 25 lineaarinen.

» > i I

: Maidon anti-inf lammatorisen tekijän antamisen havaittiin sekä • t « t 1 « estävän neutrof iilien adheesio endoteeliin, että edistävän antamisen ajankohtana tarttuneina olevien isännän neutrofii- 30 lien dissosiaatiota. Tämä vaikutus on todennäköisesti tulosta : anti-inflammatorisen tekijän kyvystä estää vuorovaikutusta " solupinnan CD18-antigeenien ja muiden molekyylien välillä.

• Tekijän aiheuttama CD18:n sitoutumisen inhibitio näyttää ole- .···. van spesifinen siinä suhteessa, että tekijä esti monoklonaa- » · • 35 lisen vasta-aineen anti-CD18 sitoutumisen soluihin, mutta ei ' * estänyt samalla tavalla monoklonaalisen vasta-aineen anti- ; ".· CDllb sitoutumista.

115383 75

Niiden molekyylien välisten vuorovaikutusten estäminen, joihin CD18-solupinta-antigeeni osallistuu, voi johtua myöskin siitä havainnosta, että tekijä kykeni inhiboimaan isännän lymfosyyttien kykyä reagoida vieraisiin histokompatibiliteet-5 tiantigeeneihin. Toisissa tutkimuksissa anti-infiammatorisen tekijän havaittiin estävän konkanavaliinin indusoimaa mito-geenista reaktiota lymfosyyteissä.

Lopuksi, tekijä suppressoi merkitsevästi varhaista solujen 10 reaktiota infektioon, tämä vaikutus johti bakteerien lukumäärän logaritmiseen nousuun subkutaanisen infektion mallissa. Tämä infektion paheneminen ei johtanut tulehdusreaktion elpymiseen, kuten on nähty toisten aineiden suhteen, jotka supp-ressoivat akuuttia tulehdusta infektiossa. Toinen koe, jossa 15 käytettiin kliinisesti käyttökelpoista infektiomallia, pye-lonefriittiä, osoitti myöskin suppressiivista vaikutusta tulehdukseen, mikä liittyi bakteerien lukumäärän lisääntymiseen. Jälleen ei havaittu mitään palautumisvaikutusta, eikä esiintyneen kudosvaurion määrässä ollut eroa MAIF:illa käsi-20 tellyissä ja kontrolliryhmässä.

Tästä koesarjasta voidaan vetää seuraavat johtopäätökset: 1. Anti-inflammatorinen tekijä, annettuna intravenaalisesti, : 25 suppressoi sekundääristä, neutrofiilien välittämää vaihetta :**: karrageenanilla indusoidussa tulehdusreaktiossa.

I { · 2. Arvioituna karrageenan-polkuanturakokeella anti-inflamma-torisen tekijän puoliintumisaika on 1 - 2 tuntia ja se on ; ·_ 30 tehokas jopa annettuna sen jälkeen kun tulehdus on indusoitu.

’Tämän jälkeen tehdyt tutkimukset osoittavat, että tehokas puoliintumisaika riippuu sekä käytetyistä annoksesta että i * ·,· j tulehdusärsykkeestä.

• * · • » • i · 35 3. Anti-inflammatorinen tekijä inhiboi neutrofiilien kulke- • · . mistä in vivo.

I 4 k » · 115383 76 4. Anti-inflammatorisen tekijän antaminen johtaa verenkierrossa olevien neutrofiilien lukumäärän lisääntymiseen ja vastaavasti lymfosyyttien lukumäärän vähenemiseen.

5 5. Anti-inflammatorinen tekijä suppressoi isännän puolustus reaktioita infektiota vastaan, luultavasti vaikutuksen välityksellä neutrofiilien kulkemiseen.

6. Anti-inflammatorinen tekijä estää vuorovaikutuksia solu-10 pinnan CD18-antigeenien ja muiden molekyylien välillä.

7. Anti-inflammatorinen tekijä estää neutrofiilien tarttumista endoteeliin.

15 8. Anti-inflammatorinen tekijä edistää tarttuvien neutrofii- lien pysymistä erossa endoteelistä.

9. Anti-inflammatorinen tekijä estää isännän lymfosyyttien kyvyn reagoida vieraisiin histokompatibiliteettiantigeenei- 20 hin.

10. Anti-inflammatorinen tekijä estää lymfosyyttien mitogee- .' nisen reaktion.

• ’ 25 Näistä tutkimuksista saadut tutkimustulokset osoittavat sel- ;' ‘: västi, että maidon anti-inflammatorisella tekijällä on huo- | 7; mättävää vaikutusta sekä neutrofiileihin että lymfosyyttei- t I · · hin. Havaitut vaikutukset voivat johtua anti-inflammatorisen • · · tekijän vaikutuksesta suoraan soluihin per se. tai jonkin , . 30 muun solun välittäjäaineen tai liukoisen välittäjäaineen sup- ;;/ pressiosta (tai stimulaatiosta) , mikä muuttaa epäsuorasti ’·[ ’ solujen biologista aktiivisuutta. On myöskin yleisesti tun- ; : : nustettua, että useimmilla farmakologisilla aineilla on monia toimintoja ja on mahdollista, että anti - inflammatorisen teki- * . 35 jän havaitaan vaikuttavan joukkoon muita, vielä tunnistamat tomia biologisia prosesseja.

» » · » · k · 115383 77

Kun tämä keksintö on nyt kuvattu yleisesti, alan ammattilaisille tulee ilman epäilystä ilmeiseksi, että keksintöön voidaan tehdä monia muutoksia ja muunnelmia vaikuttamatta sen henkeen tai puitteisiin.

» i · • I * • · I ♦

Claims (2)

115383 1. Menetelmä sellaisen anti-inflammatorisen tekijän käsittävän koostumuksen valmistamiseksi, joka mainittu anti-5 inflammatorinen tekijä on vähintään 55 000 kertaa puhdiste-tumpi kuin mainittu tekijä 10 000 daltonin kuoritun maidon suodoksessa analysoituna hiiren neutrofiilien kulkeutumisen inhibitiomäärityksellä, tunnettu siitä, että mainittua koostumusta valmistetaan menetelmällä jossa: 10 a) poistetaan rasva maitoa tuottavan eläimen maidosta, jotta tuotetaan kuoritun maidon liuos; b) suodatetaan vaiheesta a saatu mainittu kuoritun maidon 15 liuos suodattimen läpi, jotta tuotetaan molekyylipainoltaan < 10 000 oleva kuoritun maidon suodos, jolloin mainittu suodatin pidättää molekyylit, joiden molekyylipainot ovat suurempia kuin noin 10 000 daltonia; 20 c) fraktioidaan vaiheessa b valmistettu mainittu kuoritun maidon suodos ioninvaihtokromatografiällä niin, että tuote-! taan ioninvaihtofraktiot, joissa mainittu tekijä on rikastet- ; tuna; 25 d) puhdistetaan mainittu tekijä mainituista rikastetuista . ioninvaihtofraktioista geelisuodatuskromatografiällä, jotta tuotetaan geelisuodatusfraktiota, jossa mainittu tekijä on vielä lisää rikastettuna; I » I I * I 30 e) puhdistetaan mainittu tekijä mainituista rikastetuista 9 ,,*·* geelisuodatusf raktioista af f initeettikromatograf iällä niin, :>(>! että tuotetaan koostumus, joka sisältää mainittua anti-in- ,···, flammatorista tekijää, joka on 55 000 kertaisesti puhdiste- • * tumpi kuin mainittu tekijä vaiheen b mainitussa kuoritun mai- » * , 35 don suodoksessa määritettynä hiiren neutrofiilien kulkeutuma- t>)!‘ sen inhibitiomäärityksellä. * » » * · • * 115383 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu affiniteettikromatografia tehdään af-finiteettiväliaineessa, jolla on affiniteetti samassa tasossa oleviin vierekkäisiin cis-hydroksyyliryhmiin. 5 115383

1. Förfarande för framställning av en sammansättning omfattande en antiinflammatorisk faktor, vilken nämnda antiinflammatoriska faktor är ätminstone 55 000 gänger mera t 5 renad än nämnda faktor i ett skummjölksfiltrat av 10 000 dalton, säsom analyserat medelst inhibitionsbestämning av neutrofilmigrationen hos en mus, kännetecknat av i att nämnda sammansättning framställs medelst ett förfarande, där: 10 a) fettet avlägsnas frän mjölken frän ett mjölkproducerande djur för att producera en skummjölkslösning; b) den nämnda skummjölkslösningen erhällen i steget a filtreras genom ett filter för att producera ett skummjölks-filtrat med en molekylvikt < 10 000, varvid nämnda filter 15 kvarhäller de molekyler vilkas molekylvikt är större än ca 10 000 dalton; c) det i steget b framställda nämnda skummjölksfiltratet fraktioneras medelst jonbyteskromatografi pä sä sätt, att » jonbytesfraktioner produceras, väri nämnda faktor är anrikad; • » •t 20 d) den nämnda faktorn renas frän nämnda anrikade jonbytes-. fraktioner medelst gelfiltreringskromatografi för att producera gelfiltreringsfraktioner, i vilka nämnda faktor är • ännu mera anrikad; e) nämnda faktor renas frän nämnda anrikade gelfiltrerings- 25 fraktioner medelst af f initetskromatograf i pä sä sätt, att en .sammansättning produceras, vilken innehäller nämnda antiin- .1.^ flammatoriska faktor, vilken är 55 000 ganger mera renad än , · nämnda faktor i skummjölksfiltratet i steget b, säsom bestämt t > · medelst inhibitionsbestämning av neutrofilmigrationen hos en h 30 mus. t i · 115386

( 2. Förfarande i enlighet med patentkrav 1, kanne- 1 tecknatav att nämnda affinitetskromatografi utförs i ett affinitetsmedium med affinitet tili intilliggande cis-hydroxylgrupper pä samma niva. ! * * » » .1 »