DE69737191T2

DE69737191T2 - Entzündungshemmende Zusammensetzung aus Ei, Verfahren zur Isolierung und Verwendung

Info

Publication number: DE69737191T2
Application number: DE69737191T
Authority: DE
Inventors: G. Sandra Media FITZPATRICK-McELLIGOTT; G. Jeffrey West Chester HUNCHAR; Young-Zoon Cincinnati LEE; R. Lee Lebanon BECK
Original assignee: Arkion Life Sciences LLC
Current assignee: Arkion Life Sciences LLC
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2017-03-20
Also published as: EP0904090B1; AU2332997A; CN1178671C; NZ504132A; CA2249448A1; CN1226830A; KR20000004990A; WO1997035595A1; JP2001526629A; CA2249448C; JP4316012B2; EP0904090A1; DE69737191D1; HK1022623A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf eine entzündungshemmende Zusammensetzung, die in einem natürlichen Nahrungsmittel erzeugt wird. Die Erfindung bezieht sich speziell auf eine entzündungshemmende Eizusammensetzung, Verfahren zu deren Herstellung in im wesentlichen und hochreinen Formen und Verfahren zu deren Verwendung bei der Behandlung von Entzündungen.
Entzündung, wie in Dorland's Medical Dictionary definiert, ist „eine lokalisierte Schutzreaktion, bewirkt durch Verletzung oder Zerstörung von Geweben, die dazu dient, sowohl das schädliche Mittel als auch das verletzte Gewebe zu zerstören, zu verdünnen oder abzuteilen". Sie ist durch Fenestration der Mikrogefäßanordnung, Eindringen der Blutelemente in die Interstitialräume und Migration von Leukozyten in das entzündete Gewebe gekennzeichnet. Auf der makroskopischen Ebene ist dies normalerweise von den familiären klinischen Anzeichen von Erythem, Ödem, Hyperalgesie (Schwächlichkeit) und Schmerz begleitet.
Während dieser komplexen Reaktion werden chemische Mediatoren, wie Histamin, 5-Hydroxytryptamin, verschiedene chemotaktische Zusammensetzungen, Bradykinin, Leukotriene und Prostaglandine lokal freigesetzt. Phagozyten migrieren in die Fläche und zelluläre lysosomale Membranen können aufgespaltet werden, was lytische Enzyme freisetzt. Alle diese Vorgänge können zu der Entzündungsreaktion beitragen.
Die Entzündung bei Patienten mit Rheumatoidarthritis umfaßt wahrscheinlich die Kombination eines Antigens mit einem Antikörperkomplement, was die lokale Freisetzung von chemotaktischen und chemoaktivierenden Zusammensetzungen verursacht, die die Leukozyten anziehen. Die Leukozyten phagozytieren die Komplexe von Antigen-Antikörper und Komplement und setzen ebenso die vielen Enzyme frei, die in ihren Lysosomen enthalten sind. Diese lysosomalen Enzyme verursachen dann Verletzungen von Knorpel- und anderen Geweben, und dies fördert den Grad der Entzündung. Zell-vermittelte Immunreaktionen können ebenso involviert sein. Prostaglandine, die intrazelluläre Schlüsselregulatoren der zellulären Funktion sind, werden ebenso während dieses Prozesses freigesetzt.
Die Arthus-Reaktion ist eine Entzündungsreaktion, die durch die Bildung von Immunkomplexen an subkutanen Stellen hervorgerufen wird, wo ein Antigen mit dem Antikörper zu dem Antigen komplexiert. Die Neutrophilen binden typischerweise an den Fc-Teil des Immunglobulinkomplexes, der sich an der subkutanen Injektionsstelle bildet, wo sie Verdauungsenzyme freisetzen, die sichtbare akute Entzündung verursachen. Daher ist die Reaktion in erster Linie durch Neutrophile vermittelt, und Mittel, die die Entwicklung der Reaktion bewirken, tun dies über einen Einfluß auf diese Zellen.
Es gibt mehrere Wege, durch die ein Mittel mit der Neutrophilenmigration von den Blutgefäßen zu einer Entzündungsstelle interferieren kann. Ein möglicher Weg ist die Inhibierung der Margination, die reversible Adhäsion oder „Haften" von Entzündungszellen an die Endothelzellen, die die Blutgefäßwand auskleiden. Diese Adhäsion wird genau durch die Qualität und Quantität der Adhäsion und Integrinmoleküle, die als „Velcro" für weiße Blutzellen und die Auskleidung der Blutgefäße dienen, kontrolliert. In dem normalen Zustand haften etwa 50 % der Neutrophilen reversibel, aber während einer akuten Entzündungsreaktion wird die Adhäsion viel stärker und ist ein Schlüsselschritt in dem Verfahren der Neutrophilenmigration. Während Prostaglandine wahrscheinlich nicht direkt in die chemotaktische Reaktion involviert sind, ist ein anderes Stoffwechselprodukt von Arachidonsäure, Leukotrien, eine sehr wirksame chemotaktische Substanz.
Die Entzündungsreaktion ist jede Reaktion, die durch Entzündung gekennzeichnet ist, wie oben definiert. Es ist dem Mediziner allgemein bekannt, daß die Entzündungsreaktion einen Großteil der physischen Unannehmlichkeiten verursacht (d. h. Schmerz und Verlust der Funktion), die mit verschiedenen Krankheiten und Verletzungen in Verbindung stehen. Folglich ist es eine übliche medizinische Praxis, pharmakologische Mittel zu verabreichen, die die physischen Unannehmlichkeiten der Entzündungsreaktion verringern. Mittel mit diesen Eigenschaften werden als entzündungshemmend klassifiziert. Entzündungshemmende Arzneimittel werden für die Behandlung eines breiten Spektrums von Störungen verwendet, und dieselben Arzneimittel werden oftmals verwendet, um unterschiedliche Krankheiten zu behandeln. Die Behandlung mit entzündungshemmenden Arzneimitteln ist nicht für die Krankheit, aber meistens für die Symptome (d. h. Entzündung) gedacht.
Die entzündungshemmenden, analgetischen und antipyretischen Arzneimittel sind eine heterogene Gruppe von Verbindungen, oftmals chemisch nicht verwandt, die trotzdem bestimmte therapeutische Wirkungen und Nebenwirkungen teilen. Corticosteroide stellen die am häufigsten verwendete Klasse von Verbindungen für die Behandlung von Entzündungen dar. Proteolytische Enzyme stellen eine andere Klasse von Verbindungen dar, von denen angenommen wird, daß sie entzündungshemmende Wirkungen haben. Hormone, die direkt oder indirekt dafür sorgen, daß die Nebennierenrinde Steroide produziert und sekretiert, stellen eine andere Klasse von entzündungshemmenden Verbindungen dar.
Leider verursachen natürliche und synthetische Corticosteroidpräparate eine Vielzahl von schweren Nebenwirkungen, einschließlich Erhöhung des Blutdrucks, Salz- und Wasserretention, Nierenschäden und erhöhte Kalium- und Calciumexkretion. Außerdem können Corticosteroide die Anzeichen der Infektion maskieren und die Dissemination von infektiösen Mikroorganismen verstärken. Diese Hormone werden für die Verwendung bei schwangeren Frauen als nicht sicher betrachtet, und die Langzeit-Corticosteroid-Behandlung ist mit Magenhyperaktivität und/oder peptischen Geschwüren verbunden gewesen. Die Behandlung mit Corticosteroiden kann ebenso Diabetes mellitus verschlimmern, was höhere Dosierungen von Insulin erfordert, und kann psychotische Störungen erzeugen. Hormonale entzündungshemmende Mittel, die indirekt die Produktion von endogenen Corticosteroiden erhöhen, haben dasselbe Potential für nachteilige Nebenwirkungen.
Eine Vielzahl von nichtsteroidalen Antirheumatika (NSARs) sind beschrieben worden. Unter diesen sind die am häufigsten verwendeten die Salicylate. Acetylsalicylsäure oder Aspirin ist das am häufigsten verschriebene analgetisch-antipyretische und entzündungshemmende Mittel. Beispiele von steroidalen und nichtsteroidalen Antirheumatika sind in Physician's Desk Reference aufgelistet.
Die NSARs sind synthetische biochemische Verbindungen, die bei hohen Dosierungen aufgrund eines breiten Spektrums an unerwünschten Nebenwirkungen toxisch sein können. Beispielsweise tragen Salicylate zu den ernsten säurebasierenden Gleichgewichtsstörungen bei, die für Vergiftungen durch diese Klasse von Verbindungen charakteristisch sind. Salicylate stimulieren die Respiration direkt und indirekt. Toxische Dosen von Salicylaten verursachen zentrale Atemlähmung sowie Kreislaufkollaps, bedingt durch vasomotorische Depression. Die Ingestion von Salicylat kann zu Oberbauchleiden, Übelkeit und Erbrechen führen. Salicylat-induzierte Magenblutung ist allgemein bekannt. Salicylate können Leberschädigung erzeugen und die Gerinnungszeit verlängern. Deshalb sollte Aspirin bei Patienten mit schweren Leberschäden, Hypoprothrombinämie, Vitamin-K-Mangel oder Hämophilie vermieden werden, da die Inhibierung der Blutplättchenhämostase durch Salicylate zu Hämorrhagie führen kann. Salicylatvergiftung ist üblich und es gibt über 10.000 Fälle an ernsthafter Salicylatvergiftung in den Vereinigten Staaten jedes Jahr, einige von ihnen tödlich und viele bei Kindern. Siehe Goodman und Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. Aufl., 1985.
Folglich besteht trotzt der großen Anzahl an entzündungshemmenden Mitteln, die derzeit verfügbar sind, nach wie vor ein Bedarf an einem sicheren, wirksamen entzündungshemmenden Produkt, das frei von Nebenwirkungen und nachteiligen Reaktionen ist.
Wenn ein natürliches Nahrungsmittelprodukt mit entzündungshemmenden Wirkungen erhalten werden könnte, würde es eine leicht verabreichbare, ohne weiteres verfügbare und sichere therapeutische Zusammensetzung bereitstellen.
Stand der Technik:
Von Milch mit einer Vielzahl von therapeutischen Wirkungen ist berichtet worden. US-Patent Nr. 4,324,782 offenbart eine Milch, enthaltend Antikörper für Streptococcus mutans, welcher Zahnkaries-inhibierende Wirkungen aufweist. Die Milch wird durch Immunisieren einer Kuh mit S.-mutans-Antigen in zwei Phasen erhalten. US-Patent Nr. 4,284,623 offenbart Milch mit entzündungshemmenden Eigenschaften, US-Patent Nr. 4,879,110 offenbart Milch mit antihypertensiven Eigenschaften. US-Patent Nr. 3,128,230 offenbart Milch, die Globuline von alpha-, beta- und gamma-Komponenten enthält, erhalten durch Impfen einer Kuh mit Antigengemischen. US-Patent Nr. 3,376,198, kanadisches Patent 587,849 und britisches Patent 1,211,876 beschreiben ebenso Antiköper-enthaltende Milch. US-Patent Nr. 4,897,265 und US-Patent Nr. 4,636,384 (Reissue Nr. 33,403) offenbaren ein Verfahren zum Verringern der Blutlipidkonzentrationen durch Füttern von Tieren mit Antikörperenthaltender Milch, die von Kühen stammt, die in einem hyperimmunem Zustand durch Injektionen von polyvalenten bakteriellen Antigenen gehalten werden.
EP-A-0727216 beschreibt die Herstellung von Sialinsäurederivaten und die Gegenwart von Sialyloligosacchariden in Eigelb. Patent Abstracts of Japan, Bd. 95, Nr. 8, 29. September 1995 beschreibt die Trennung oder Synthese von Phospholipiden aus Eigelb.
Verschiedene Gattungen der Klasse Aves, wie Hühner (Gallus domesticus), Truthähne und Enten, erzeugen Antikörper in Blut und Eiern gegen Antigene, die Vogelkrankheiten erzeugen, sowie gegen andere Antigene. Beispielsweise haben LeBacq-Verheyden et al. (Immunology 27: 683 (1974)) und Leslie, G. A., et al. (J. Med. 130: 1337 (1969)) quantitativ Immunglobuline des Huhns analysiert. Polson, A., et al. (Immunological Communications 9: 495-514 (1980)) immunisierten Hennen gegen mehrere Proteine und natürliche Gemische aus Proteinen und detektierten IgY-Antikörper in den Dottern der Eier. Fertel, R., et al. (Biochemical and Biophysical Re search Communications 102: 1028-1033 (1981)) immunisierten Hennen gegen Prostaglandine und detektierten Antikörper in dem Eigelb. Jensenius et al. (Journal of Immunological Methods 46: 63-68 (1981)) stellen ein Verfahren zum Isolieren von Eigelb-IgG zur Verwendung in Immunodiagnostika bereit. Polson et al. (Immunological Communications 9: 475-493 (1980)) beschreiben Antikörper, isoliert aus dem Dotter von Hennen, die mit einer Vielzahl von Pflanzenviren immunisiert wurden.
US-Patent Nr. 4,357,272 offenbart die Isolation von Antikörpern aus den Dottern von Eiern, abgeleitet von hyperimmunisierten Hennen. Die Hyperimmunisierung wurde durch wiederholende Injektionen von Antigenen, abgeleitet von Pflanzenviren, menschlichem IgG, Tetanusantitoxin, Schlangengegengift und Serameba, bewirkt. US-Patent Nr. 4,550,019 offenbart die Isolierung von Antikörpern aus Eigelb, die in den Hennen durch Hyperimmunisierung mit Immunogenen mit einem Molekular- oder Teilchengewicht von mindestens 30.000 entstanden. Die Antigene, die verwendet wurden, um die Hühner zu hyperimmunisieren, wurden unter Pflanzenviren, menschlichen Immunglobulinen, Tetanustoxin und Schlangengiften ausgewählt.
Außerdem zeigten eine Feldstudie und ein kontrollierter Infektionsversuch die Schutzwirkung von Antikörper-Eigelb-Lyophilisat und Immun-Vollei-Lyophilisat gegen enterotoxinbildende E. coli (Wiedermann et al., J. Vet. Med. B. 38: 283-291 (1991)). Das oral verabreichte Eigelbpulver, erhalten aus Hennen, die mit hitzegetöteten Antigenen von K99-Fimbrien-tragenden enterotoxinbildenden E. coli geimpft waren, schützte neonatale Kälber gegen E. coli-induzierte Diarrhö (Ikemori et al., Am. J. Vet. Res. 53: 2005-2008 (1992)).
Es ist ebenso gezeigt worden, daß Anti-Rotavirus-IgY, das Mäusen verabreicht wurde, die mit Rotavirus infiziert waren, vollständigen Schutz bereitstellt (Ebina et al., Microbiol. Immunol. 34: 617-629 (1990)). Ferner wurde festgestellt, daß Eigelb, enthaltend Anti-Edwardsiella tarda-Antikörper, Edwardsiellose beim japanischen Aal wirksam verhindert (Gutierrez et al., J. Fish Diseases 16: 113-122 (1993)).
US-Patent Nr. 4,748,018 offenbart ein Verfahren der passiven Immunisierung eines Säugers, das das parenterale Verabreichen gereinigter Antikörper umfaßt, die aus den Eiern eines Vogels, der gegen das entsprechende Antigen immunisiert worden war, erhalten wurden, und wobei der Säuger eine Geschichte in bezug auf den Verbrauch von Eiern aufweist. Die Erfindung, die in US-Patent Nr. 4,748,018 offenbart ist, erstreckt sich auf die Konzepte, die in US-Patent Nr. 4,748,018 offenbart sind, indem die Verabreichung des Ei-Antikörpers durch jeden geeigneten Weg, nicht nur parenteral, erfolgen kann.
US-Anmeldung Serien-Nr. 08/688,576, übertragen auf DCV-Biologics, offenbart ein Verfahren zum Vorbeugen, Entgegenwirken oder Verringern chronischer Magen-Darm-Erkrankungen oder durch nichtsteroidale Antirheumatika induzierter (NSAR-induzierter) Magen-Darm-Schäden bei einem Patienten durch Verabreichen von hyperimmunisiertem Ei und/oder Milch oder Fraktionen davon an den Patienten.
Es wurde in US-Patent Nr. 5,215,746 offenbart, daß Eier von Hühnern, die gegen spezielle bakterielle Antigene immunisiert wurden, anti-atherosklerotische Wirkungen bei Säugern bereitstellen.
Eier, enthaltend Antikörper für S. mutans, wurden von Hühnern erhalten, die mit S. mutans immunisiert wurden (Otake et al., J. Dental Research 70: 162-166 (1991)) und inhibierten die Zahnkariesentwicklung.
Keines dieser Dokumente offenbart jedoch, daß Eier Zusammensetzungen) und/oder Faktor(en) erzeugen können, die Tieren verabreich werden können, um Entzündungen vorzubeugen oder zu verringern, oder läßt darauf schließen. Keines offenbart oder läßt auf ein Verfahren schließen, das eine vernünftige Erwartung bereitstellt, daß irgendeine Behandlung eines Vogels eine solche Zusammensetzung und/oder Faktor in Eiern produzieren könnte. Keines der Dokumente offenbart oder läßt auf die Identität einer entzündungshemmenden Komponente von Eiern, die die gewünschten therapeutischen Wirkungen erzeugen, schließen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung der Erfinder, daß es entzündungshemmende Aktivität in Ei und Eiprodukten gibt, und insbesondere in Eiprodukten, die von hyperimmunisierten Vögeln stammen, die, wenn an einen Patienten, insbesondere Säuger, verabreicht, Entzündung bei dem Patienten vorbeugen oder verringern.
Die Erfindung stellt eine entzündungshemmende Zusammensetzung in hochreiner Form und ein Verfahren zu deren Herstellung bereit, wobei die Zusammensetzung aus einem Ei eines Ei-produzierenden Tieres durch ein Verfahren erhältlich ist, umfassend

(1) das Isolieren einer wasserlöslichen Fraktion aus dem Vollei, Eigelb oder Eiweiß;
(2) das Trennen eines Permeats mit weniger als 3000 Dalton von der wasserlöslichen Fraktion und
(3) das Fraktionieren des Permeats mit weniger als 3000 Dalton, um eine biologisch aktive Fraktion zu gewinnen.

Insbesondere ist die Erfindung auf eine hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung gerichtet, die aus den Eiern eines Vogels erhalten wird. Die entzündungshemmende Aktivität wurde in Fraktionen gefunden, die sowohl von Eigelb als auch Eiweiß isoliert wurden.
Die Erfindung stellt eine entzündungshemmende Zusammensetzung in hochreiner Form bereit, erhältlich in übernormalen Niveaus aus einem Ei eines Ei-produzierenden Tiers, welches in einem hyperimmunisierten Zustand gehalten wird, durch ein Verfahren, umfassend:

(1) das Isolieren einer wasserlöslichen Fraktion aus dem Vollei, Eigelb oder Eiweiß;
(2) das Trennen eines Permeats mit weniger als 3000 Dalton von der wasserlöslichen Fraktion;
(3) das Fraktionieren des Permeats mit weniger als 3000 Dalton, um übernormale Niveaus der entzündungshemmenden Zusammensetzung zu gewinnen.

Die Erfindung ist ebenso auf eine hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung gerichtet, die durch ein Verfahren hergestellt wird, umfassend das Hyperimmu nisieren eines Vogels durch Verabreichen eines oder mehrerer Antigene und speziell bakterieller Antigene an den Vogel, Einsammeln der Eier von den hyperimmunisierten Vögeln und Isolieren der hochreinen entzündungshemmenden Zusammensetzung daraus.
Das Hyperimmunisierungsverfahren erzeugt übernormale Niveaus einer hochreinen entzündungshemmenden Zusammensetzung aus einem Vogelei. Überraschenderweise kann das Niveau der entzündungshemmenden Zusammensetzung sowohl in Eigelb als auch Eiweiß durch das Verfahren der Hyperimmunisierung erhöht werden.
Die Erfindung beschreibt ebenso ein Verfahren zum Behandeln von Entzündungen bei einem Patienten und speziell Säugern, umfassend das Verabreichen der im wesentlichen reinen entzündungshemmenden Zusammensetzung oder einer Zusammensetzung, die die im wesentlichen reine entzündungshemmende Zusammensetzung umfaßt, an den Patienten. Dieser Aspekt umfaßt das Verabreichen von entzündungshemmendem Vollei und/oder Fraktionen davon.
Die Erfindung beschreibt außerdem Verfahren zur Verwendung von Eiern, die die entzündungshemmende Zusammensetzung und/oder den hochreinen entzündungshemmenden Faktor selbst enthalten, um die Anlagerung von Lymphozyten und Neutrophilen an das Endothel von kleinen Venen oder (das Ablösen von Lymphozyten und Neutrophilen, die bereits an den Endothelzellen, die die Wände der kleinen Venen auskleiden, haften) zu verhindern und um die Migration von Lymphozyten und Neutrophilen zu verringern und daher übermäßiges Ödem und übermäßige Flüssigkeitsansammlung zu verringern. In dieser Weise wird die Zusammensetzung verwendet, um den Gewebeschaden, der mit der Entzündungsreaktion verbunden ist, zu verringern.
Die Erfindung umfaßt schließlich eine im wesentlichen reine entzündungshemmende Zusammensetzung, die entzündungshemmende Aktivität bei Säugern zeigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Chromatogramm, das die Trennung der entzündungshemmenden Eizusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 30.000 mittels eines DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatogramms zeigt.
2 ist ein Graph, der die Inhibierung der Pleuraleukozytenmigration durch die entzündungshemmende Eizusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 30.000 zeigt.
3 ist ein Graph, der die Inhibierung der Ratten-Pleuraleukozytenmigration durch Endotoxin-freie entzündungshemmende Zusammensetzung aus Eigelb, entfettet mit Hexan-Ethanol, zeigt.
4 ist ein Fließdiagramm der Herstellung der entzündungshemmenden Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 30.000 aus Eigelb.
5 ist ein Fließdiagramm der Herstellung der entzündungshemmenden Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 30.000 aus flüssigem Eiweiß.
6 ist ein Graph, der die Inhibierung von Ratten-Pleuraleukozyten einer Endotoxin-freien entzündungshemmenden Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 30.000 aus S-100-Eigelb, das durch superkritische CO₂-Extraktion entfettet wurde, zeigt.
7 ist ein Fließdiagramm der Herstellung der entzündungshemmenden Eizusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 30.000 aus getrocknetem Eigelbpulver.
8 ist ein Fließdiagramm der Reinigung der entzündungshemmenden Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 3.000 aus pulverisiertem Eigelb.
9 ist ein Fließdiagramm der Reinigung der entzündungshemmenden Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 3.000 aus pulverisiertem Eiweiß.
10 ist ein Chromatogramm der Trennung der entzündungshemmenden Eizusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 3.000 durch DEAE-Poros-Ionenaustauschchromatographie.
11 ist ein Graph, der die Inhibierung der Leukozytenmigration durch hochreine Fraktionen mit einem Molekulargewicht von weniger als 3.000 aus Eigelb und Eiweiß zeigt.
12 ist ein Graph, der die Inhibierung der Leukozytenmigration durch DEAE-Peak 2 von Ultrafiltraten mit einem MW von weniger als 3.000 und weniger als 10.000 aus hyperimmunem Eigelb zeigt.
13 ist ein Graph, der die hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 3.000 aus Eiern mit den entzündungshemmenden Arzneimitteln (NSARs) (Indomethacin und Aspirin) vergleicht.
14 ist ein Chromatogramm der HPLC-Trennung der entzündungshemmenden Zusammensetzung mit einem Molekulargewicht von weniger als 3.000 aus hyperimmunem Eigelb.
15 ist ein Chromatogramm der HPLC-Trennung der DEAE-Fraktion aus hyperimmunem Eigelb.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen:
Der Ausdruck „Eiprodukt" bedeutet irgendein Produkt, wie hierin beschrieben, das ein entzündungshemmendes Ei oder Eifraktion enthält.
Der Ausdruck „entzündungshemmendes Ei oder Eifraktion" bedeutet Ei oder Eifraktionen, enthaltend die hierin offenbarte entzündungshemmende Zusammensetzung, und speziell hergestellt durch die hierin offenbarten Verfahren.
Der Ausdruck „entzündungshemmende Zusammensetzung" bedeutet eine Zusammensetzung, die dem Entzündungsprozeß entgegenwirkt oder ihn unterdrückt.
Der Ausdruck „im wesentlichen reine entzündungshemmende Eizusammensetzung" bedeutet eine entzündungshemmende Zusammensetzung mit zumindest der in Beispiel 3 beschriebenen Reinheit und den exemplarischen Materialien und Figuren.
Der Ausdruck „hochreine entzündungshemmende Eizusammensetzung" bedeutet eine entzündungshemmende Zusammensetzung mit zumindest der in Beispiel 4 beschriebenen Reinheit und den exemplarischen Materialien und Figuren.
Der Ausdruck „entzündungshemmender Faktor" bedeutet ein im wesentlichen reines Mittel, das dem Entzündungsprozeß entgegenwirkt oder ihn unterdrückt, welches in der entzündungshemmenden Zusammensetzung mit zumindest der in Beispiel 7 beschriebenen Reinheit vorliegt.
Der Ausdruck „kombinatorisch abgeleitete Antigene" bezieht sich auf ein neues Verfahren zum Erzeugen molekularer Diversität unter Antigenen mittels kombinatorischer Synthese.
Der Ausdruck „biotechnische Antigene" bezieht sich auf Antigene, die durch das Verfahren der Genklonierungstechnologien und genetischen Umlagerungen erhalten werden, die die Einführung und Translation von Proteinen, die Antigeneigenschaften haben, erlauben.
Der Ausdruck „genetischer Impfstoff" bezieht sich auf einen Nukleinsäureimpfstoff, der im allgemeinen durch rekombinante Technologien hergestellt wird, und der eine Immunreaktion bewirken kann.
Der Ausdruck „hyperimmunisiertes Ei" bedeutet Vollei oder davon abgeleitete Produkte, die aus Ei-produzierenden Tieren erhalten werden, welche in einem hyperimmunen Zustand gehalten werden.
Der Ausdruck „übernormale Niveaus" bedeutet Niveaus im Überschuß von denen, die in Eiern von Ei-produzierenden Tieren gefunden werden, welche nicht in einem hyperimmunen Zustand gehalten werden.
Der Ausdruck „Tafelei" bedeutet ein nicht-hyperimmunisiertes Ei.
Der Ausdruck „Entzündung" wird in seinem technisch anerkannten Sinne als eine lokalisierte Schutzreaktion verwendet, bewirkt durch Verletzung oder Zerstörung von Geweben, die dazu dient, sowohl das schädliche Mittel als auch das verletzte Gewebe zu zerstören, zu verdünnen oder abzuteilen, gekennzeichnet durch die klassische Folge in unpassender, unkontrollierter Form von Schmerz, Wärme, Rötung, Schwellung und Funktionsverlust, und histologisch umfassend eine komplexe Reihe von Vorgängen, einschließlich Dilatation der Arteriolen, Kapillaren und kleinen Venen mit erhöhter Permeabilität und Blutfluß, Exsudation von Flüssigkeiten, einschließlich Plasmaproteinen, und Leukozytenmigration in den entzündlichen Fokus.
Der Ausdruck „Behandeln" bedeutet, daß den Symptomen der Störung und/oder dem pathogenen Ursprung der Störung vorgebeugt wird oder diese gelindert oder vollständig beseitigt werden. Beispielsweise behandelt die entzündungshemmende Zusammensetzung die Entzündung nicht nur durch Unterdrücken der Symptome der Entzündung bei Menschen und anderen Säugern, sondern ebenso auch, indem es als ein Prophylaktikum fungiert, um der erwarteten Gegenwart von Entzündungsmitteln in dem Empfänger entgegenzuwirken.
Der Ausdruck „Verabreichen" bedeutet jedes Verfahren, bei dem einem Patienten eine Substanz zugeführt wird, einschließlich oral, intranasal, parenteral (intravenös, intramuskulär oder subkutan) oder rektal.
Der Ausdruck „Patient" bedeutet jedes Lebewesen, das eine Entzündungsreaktion zeigen kann, und Entzündungserkrankungen und -schäden unterliegt, einschließlich Menschen und andere Lebewesen.
Die Erfindung
In einer Ausführungsform umfaßt die Erfindung eine hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung, die aus Vogeleiern erhalten wird, ihre Isolierung und Reinigung und die Verabreichung der Zusammensetzung an einen Patienten für die Behandlung der Entzündung. Die Erfindung umfaßt außerdem eine hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung, erhalten aus einem Ei eines Vogels, der mit einem oder mehreren Antigenen und insbesondere bakteriellen Antigenen oder dessen synthetischem Äquivalent hyperimmunisiert worden ist. Die hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung liegt in hyperimmunisierten Eiern bei übernormalen Niveaus vor, die entzündungshemmende Aktivität bei Patienten bereitstellen.
Obwohl die hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung in der wasserlöslichen Fraktion von Eigelb und Eiweiß jedes Tafeleis gefunden wird, wenn aus den hyperimmunisierten Eiern isoliert, ist festgestellt worden, daß die entzündungshemmende Zusammensetzung bei übernormalen Niveaus beim Behandeln von Entzündungen bei einem Patienten wirksam ist.
Die Erfindung umfaßt ebenso eine im wesentlichen reine entzündungshemmende Zusammensetzung, die aus Vogeleiern erhalten wird, ihre Isolierung und Reinigung und die Verabreichung der Zusammensetzung an einen Patienten für die Behandlung der Entzündung. Die Erfindung umfaßt außerdem eine im wesentlichen gereinigte entzündungshemmende Zusammensetzung, die aus dem Ei eines Vogels erhalten wird, der mit einem oder mehreren Antigenen und insbesondere bakteriellen Antigenen oder dessen synthetischem Äquivalent hyperimmunisiert worden ist. Die im wesentlichen reine entzündungshemmende Zusammensetzung liegt in hyperimmunisierten Eiern bei übernormalen Niveaus vor, die entzündungshemmende Aktivität bei Patienten bereitstellen.
Die entzündungshemmende Zusammensetzung(en) der vorliegenden Erfindung kann/können durch jedes Mittel verabreicht werden, das/die entzündungshemmende Aktivität bereitstellt/bereitstellen. Beispielsweise kann die Verabreichung parenteral, subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal oder oral sein. Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Körnchen.
Die Erfindung umfaßt außerdem einen im wesentlichen reinen entzündungshemmenden Faktor, der innerhalb der entzündungshemmenden Zusammensetzung gefunden wird. Der Faktor kann an einen Patienten durch dieselben Mittel, wie oben für die entzündungshemmende Zusammensetzung beschrieben, verabreicht werden.
Die Einzelheiten der Erfindung werden nachstehend angegeben.
Merkmale der hochreinen entzündungshemmenden Zusammensetzung:
Die hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung weist folgende Merkmale auf:

1) weist entzündungshemmende Aktivität bei einem Patienten und insbesondere Säugern auf;
2) liegt sowohl in dem Eiweiß als auch Eigelb von Vogeleiern vor;
3) weist, wenn aus Eigelb isoliert, größere entzündungshemmende Aktivität im Vergleich zur Isolierung aus Eiweiß auf;
4) weist ein Molekulargewicht von weniger als ungefähr 3000 Dalton auf;
5) wird nicht durch Enzyme, die Proteine abbauen, abgebaut;
6) ist nicht proteinhaltig und nicht steroidal;
7) weist eine negative Ladung unter vorherrschenden Bedingungen auf;
8) ist bei 100 °C für mindestens 30 Minuten wärmebeständig;
9) ist oral aktiv und wird durch Verdauungsenzyme nicht abgebaut;
10) und ist säure- und basenbeständig, wobei sie sich zu einer aktiven Form sogar nach der Behandlung unter Bedingungen von pH 4 bis pH 9,0 umwandelt.

Das Molekulargewicht von 3000 Dalton wird abgeleitet von der Isolierung und Reinigung der Zusammensetzung, wobei das Isolierungs- und Reinigungsverfahren eine Ultrafiltrationsmembran nutzt, die den Durchgang von molekularen Spezies von größer als 3000 Dalton dadurch nicht ermöglicht. Es ist festgestellt worden, daß die Zusammensetzung nicht proteinhaltig und nicht steroidal ist, da sie eine kleine Größe aufweist und durch die Enzyme, die Proteine abbauen, nicht abgebaut wird. Außerdem ist die Zusammensetzung oral aktiv und wird durch die Verdauungsenzyme nicht abgebaut. Die kleine stabile Form der Zusammensetzung (im Gegensatz zu Proteinen, die viel größer sind) erleichtert ihre Absorption aus dem Verdauungstrakt.
Die Zusammensetzung ist säure- und basenbeständig, wobei sie sich zu einer aktiven Form sogar nach der Behandlung unter Bedingungen von pH 9,0 umwandelt. Außerdem ist die Zusammensetzung bei 100 °C für mindestens 30 Minuten wärmebeständig und weist eine negative Ladung bei neutralem pH auf.
Die hochreine entzündungshemmende Eizusammensetzung kann aus Vollei, Eigelb und Eiweiß isoliert werden. Die entzündungshemmende Zusammensetzung, die aus Eigelb isoliert wird, zeigt höhere entzündungshemmende Aktivität als die entzündungshemmende Zusammensetzung, die aus Eiweiß gereinigt wurde.
Übernormale Niveaus der hochreinen entzündungshemmenden Zusammensetzung können aus hyperimmunisiertem Vollei, Eigelb und Eiweiß eines Vogels isoliert werden.
Merkmale der im wesentlichen gereinigten entzündungshemmenden Zusammensetzung:
Die im wesentlichen reine entzündungshemmende Zusammensetzung zeigt entzündungshemmende Aktivität bei Säugern. Die im wesentlichen reine entzündungshemmende Zusammensetzung wird in der wasserlöslichen Fraktion von Eigelb und Eiweiß in der Fraktion, die Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 30.000 Dalton enthält, gefunden. Die Zusammensetzung weist eine negative Ladung auf, ist bei 90 °C für mindestens 1 Stunde wärmebeständig und weist das Elutionsprofil aus Ei auf, das in 1 gezeigt wird. Außerdem weist die Zusam mensetzung, die aus Eigelb isoliert wurde, eine größere entzündungshemmende Aktivität bei Säugern als der Faktor auf, der aus Eiweiß isoliert wurde.
Das Molekulargewicht der entzündungshemmenden Eizusammensetzung, hergestellt aus Hühnereiern durch das oben beschrieben Verfahren, beträgt weniger als 30.000 Dalton. Dieses wurde aus der Tatsache abgeleitet, daß der erste Schritt der Isolierung des Faktors aus Eigelb und Eiweiß durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran erfolgte, die den Durchgang von Spezies mit einem Molekulargewicht von größer als 30.000 Dalton nicht erlaubte. Die Zusammensetzung weist unter vorherrschenden Bedingungen eine negative Ladung auf, wie durch Aufbringen von Ei-30K-Ultrafiltrat auf eine DEAE-Sepharose-Ionenaustauschsäule bestimmt. Die entzündungshemmende Zusammensetzung eluiert nicht mit Wasser aus der Säule. Die Veränderung der Elutionsmedien zu NH₄OAc-Lösung verursacht die Elution der entzündungshemmenden Eizusammensetzung. Wenn das Ultrafiltrat auf eine DEAE-Sepharosesäule aufgebracht wird, bilden verschiedene Proteine und Salze die nicht gebundene Fraktion.
Hyperimmunisierung des Ei-produzierenden Tieres:
Die Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, daß, wenn ein Ei-produzierendes Tier, wie ein Vogel, auf einen spezifischen Zustand der Hyperimmunisierung gebracht wird, das Tier Eier mit übernormalen Niveaus der stark vorteilhaften entzündungshemmenden Zusammensetzung produzieren wird, und dadurch wird eine höhere entzündungshemmende Wirkung bereitgestellt.
Das hyperimmunisierte Eiprodukt kann durch jedes Ei-produzierende Tier hergestellt werden. Es ist bevorzugt, daß das Tier ein Mitglied der Klasse Aves ist. Innerhalb der Klasse Aves ist domestiziertes Geflügel bevorzugt, aber andere Mitglieder dieser Klasse, wie Truthähne, Enten und Gänse, sind eine geeignete Quelle an hyperimmunisiertem Eiprodukt.
Wenn solche Ei-produzierenden Tiere auf den spezifischen Zustand der Hyperimmunisierung mittels beispielsweise regelmäßiger Booster-Verabreichung von Antigenen gebracht werden, werden die Tiere Eier produzieren, die übernormale Niveaus der entzündungshemmenden Zusammensetzung enthalten, die, wenn sie an einen Patienten verabreicht wird, vorteilhafte Eigenschaften bei der Behandlung von Entzündungen aufweisen wird.
Die Induktion von Immunempfindlichkeit allein ist nicht ausreichend, das Auftreten von übernormalen Niveaus der entzündungshemmenden Eizusammensetzung in Eiern hervorzurufen, wie durch die Tatsache gezeigt, daß normale Vogeleier, anderweitig als „Tafeleier" bezeichnet, diese übernormalen Niveaus nicht enthalten, selbst wenn die Vögel gegen verschiedene Antigene während der normalen Immunisierung gegen Vogelkrankheiten und während normaler Aussetzung zu Umweltfaktoren sensibilisiert worden sind. Die Eier weisen nur in den spezifischen hyperimmunen Zuständen die gewünschten übernormalen Niveaus auf.
Dieser spezielle Zustand der Hyperimmunisierung, bei dem das Ei höhere Niveaus der entzündungshemmenden Zusammensetzung enthält, wird durch Verabreichen einer anfänglichen Immunisierung erreicht, gefolgt von regelmäßigen Boostern mit ausreichend hohen Dosierungen von spezifischen Antigenen oder Gemischen aus Antigenen. Die bevorzugte Dosierung an Booster sollte gleich oder größer als 50 % der Dosierung sein, die notwendig ist, um die primäre Immunisierung des Vogels zu erzeugen. Daher gibt es eine Schwellenboosterdosierung, unter der die Eigenschaften nicht in dem Ei des Vogels erzeugt werden, selbst wenn der Vogel sich in einem Zustand befindet, der normalerweise immuner Zustand genannt werden würde. Mit dem Wissen des Erfordernisses in bezug auf Entwicklung und Aufrechterhaltung eines hyperimmunen Zustandes liegt es beim Fachmann, die Menge an verabreichtem Antigen in Abhängigkeit der Ei-produzierenden Tiergattung und eingesetzten Stamms zu variieren, um das Tier in dem hyperimmunen Zustand zu halten.
Es sollte selbstverständlich sein, daß, wenn Niveaus der entzündungshemmenden Zusammensetzung erhöht werden, wie oben beschrieben, dann natürlich folgt, daß sich die Niveaus des entzündungshemmendem Faktors entsprechend ebenso erhöhen werden.
Die hyperimmune Zusammensetzung kann durch irgendein Antigen oder Kombination aus Antigenen hergestellt werden. Die Hyperimmunisierung kann durch mehrfache Expositionen zu mehreren Antigenen, mehrfacher Exposition zu einzelnen Antigenen oder einzelnen Expositionen zu Bibliotheken von Immunogenen erreicht werden. Nahezu jedes Antigen kann verwendet werden, um den hyperimmunen Zustand zu induzieren, einschließlich bakterielle, virale, protozoische, fungale und zelluläre Substanzen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Zusätzlich zu Immunisierungen mit natürlich vorkommenden Antigenen kann die Immunisierung ebenso unter Verwendung von Antigenen erreicht werden, die synthetisch aus kombinatorischen Chemien abgeleitet sind. Die Grundstrategie ist, mehrere Kombinationen von chemischen Bausteinen zum Herstellen einer Population von Molekülen mit Diversität zu vereinen. Mehrere Verfahren sind jüngst für Fest- und Lösungsphasen-Kombinationssynthese von Bibliotheken von Oligomeren (Fodor, S. et al., Science 251: 767 (1991): Houghton, R. et al., Nature 354: 82 (1991)) sowie kleinen organischen Molekülen (Bunin, B. & Ellman, J. J. Am. Chem. Soc. 114: 10997 (1992)) entwickelt worden. Schnelle mehrfache Peptid- und Oligomersynthese kann als eine Quelle für kombinatorisch abgeleitete Antigene dienen. Außerdem würde eine alternative Strategie die Addition von organischen Bausteinen in kombinatorischer Weise an ein Hauptkettenmolekül zur verbesserten Antigenität erlauben.
Alternative Art und Weisen zum Hyperimmunisieren von Ei-produzierenden Tieren umfassen die Verwendung von genetischen Impfstoffen oder biotechnischen Antigenen. Insbesondere wird jedes DNA-Konstrukt (im allgemeinen bestehend aus einer Promotorregion und einer Antigen-kodierenden Sequenz) die Antikörperfreisetzung auslösen. Genetische Impfstoffe bestehen aus Antigen-kodierenden Vektoren, Fragmenten von nackter DNA, Plasmid-DNA, DNA-RNA-Antigenen, DNA-Protein-Konjugaten, DNA-Liposom-Konjungaten, DNA-Expressionsbibliotheken und viraler und bakterieller DNA, zugeführt, um eine Immunreaktion zu erzeugen.
Insbesondere existiert nun der Beweis, daß DNA immunomodulatorisch sowie immunogen ist. Die Abgabe von Antigen-kodierenden Vektoren, Fragmenten von nack ter DNA, Plasmid-DNA, DNA-RNA-Antigenen und DNA-Expressionsbibliotheken kann tatsächlich lebende und hitzegetötete bakterielle und virale Impfstoffe imitieren. Einer der Vorteile von DNA-Impfstoffen ist die Herstellung und Freisetzung von Antigenen aus einzelnen Zellen, die freie Antigene für die Induktion einer humoralen sowie einer zytotoxischen Immunreaktion bereitstellen. Die zytotoxische Reaktion ist für die verbesserte Wirksamkeit verantwortlich (Ada, G. L., Lancet 335: 523-526 (1990)). Ein zusätzlicher Vorteil ist die Fähigkeit der genetischen Impfstoffe, Fremdproteine mit einer entsprechenden dreidimensionalen Konformation zu produzieren.
Die genetische Immunisierung ist ein neuer Ansatz der Impfstoffherstellung, die viele der Vorteile von lebenden/abgeschwächten Pathogenen, aber kein Infektionsrisiko aufweist. Eine Expressionsbibliothek, die aus DNA aus mehreren Quellen besteht, kann als Impfstoff zur Erzeugung des hyperimmunen Zustandes verwendet werden.
Verfahren der DNA-Abgabe umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Teilchenbombardierung, direkte Injektion, Liposomen, Düseninjektion (Fynan, E. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478-11482 (1993)). Die Nukleinsäuren, die für bekannte und unbekannte Immunogene, Promotorregionen (besonders CMV Blumenkohlmosaikvirus) und SV40 bakteriellen Ursprungs kodieren, können in Bakterien repliziert werden, um Plasmid-DNA zur Verwendung in DNA-Injektionen herzustellen. Obwohl mehrere Wege der parenteralen Verabreichung der DNA bei Hühnern wirksam sind, ist das bevorzugte Verfahren die intramuskuläre Injektion in den Brustmuskel. Impfstoffversuche werden bei Eier-legenden Vögeln, bevorzugt Hühnern, durchgeführt. Wiederholte Immunisierungen werden bei Intervallen von ein bis zwei Wochen für bis zu sechs Monate verabreicht.
Es ist bevorzugt, daß die verwendeten Mengen an DNA im allgemeinen in der Größenordnung von 50 bis 300 µg DNA in Kochsalzlösung zur direkten Injektion vorliegen. Für die Teilchenbombardierung sind 4 bis 100 µg DNA, die auf Goldkügelchen durch die Addition von 2,5 M CaCl₂ mitgefällt wird, bevorzugt. Wiederholte Immunisierungen können intradermal durch dieses Verfahren des Beschleunigens DNA-beschichteter Teilchen in das lebende Tier verabreicht werden.
Folgendes ist eine ausführliche Beschreibung eines bevorzugten Verfahrens, das verwendet wird, um ein Ei-produzierendes Tier auf einen erhöhten Immunitätszustand zu bringen, von dem das resultierende hyperimmunisierte Ei oder Eiprodukt an einen Patienten verabreicht werden kann:

1. Auswählen von einem oder mehreren Antigenen.
2. Bewirken einer Immunreaktion in dem Ei-produzierenden Tier durch primäre Immunisierung.
3. Verabreichen von Booster-Impfstoffen von Antigenen von entsprechender Dosierung, um den hyperimmunen Zustand zu induzieren und zu halten.
4. Testen der hyperimmunisierten Eier hinsichtlich der entzündungshemmenden Aktivitätsniveaus.
5. Einsammeln und Verarbeiten der Eier.

Folgendes ist eine ausführlichere Beschreibung dieser Verfahrensweise.
Schritt 1: Jegliche Antigene oder Kombination aus Antigenen kann eingesetzt werden. Die Antigene können bakteriell, viral, protozoisch, fungal, zellulär, allergen oder jede andere Substanz sein, auf die das Immunsystem eines Ei-produzierenden Tieres reagieren wird. Der kritische Punkt in diesem Schritt ist, daß das/die Antigene) fähig sein muß/müssen, nicht nur die immunen und hyperimmunen Zustände in dem Ei-produzierenden Vogel zu induzieren, sondern ebenso die Produktion der entzündungshemmenden Zusammensetzung in dem Ei zu induzieren. Ein bevorzugter Impfstoff ist ein Gemisch aus polyvalenten bakteriellen Antigenen, bezeichnet als Series 100 (S-100) Impfstoff. Die Bakterien, die in dem S-100-Impfstoff enthalten sind, sind in Tabelle 1 von Beispiel 1 aufgelistet. Dieser Impfstoff ist zuvor in US-Patent Nr. 5,106,618 und 5,215,746 beschrieben worden, beide übertragen auf Stolle Research und Development Corporation.
Schritt 2: Der Impfstoff kann durch jedes Verfahren, das eine Immunreaktion bewirkt, verabreicht werden. Es ist bevorzugt, daß die Immunisierung durch Verabreichen der Antigene durch intramuskuläre Injektion erreicht wird. Der bevorzugte Muskel für die Injektion bei einem Vogel ist der Brustmuskel. Die Dosis beträgt bevorzugt 0,5 bis 5 mg des Antigenimpfstoffes. Andere Verfahren zur Verabreichung, die verwendet werden können, umfassen unter anderem intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, rektale Zäpfchen und orale Verabreichung. Wenn DNA-Techniken für das Hyperimmunisierungsverfahren verwendet werden, sind viel kleinere Mengen erforderlich, im allgemeinen 1 bis 300 µg.
Es kann bestimmt werden, ob der Impfstoff eine Immunreaktion in dem Eiproduzierenden Tier bewirkt hat, durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann für Immunologie bekannt sind. Beispiele von diesen umfassen heterologe Enzym-Immunassays (ELISA), Tests für die Gegenwart von Antikörpern zu den stimulierenden Antigenen und Tests, die konstruiert sind, um die Fähigkeit von immunen Zellen aus dem Wirt, auf das Antigen zu reagieren, zu bewerten. Im allgemeinen ist das Erscheinungsbild von Eiantikörpern nach der Immunisierung mit dem Impfstoff indikativ für eine Immunreaktion. Die minimale Dosis von Antigen, die notwendig ist, um eine Immunreaktion zu induzieren, hängt von dem verwendeten Impfverfahren ab, einschließlich des Typs an verwendeten Antigen(en) sowie des Typs an Eiproduzierendem Tier, das als Wirt verwendet wird.
Schritt 3: Der hyperimmune Zustand wird bevorzugt durch wiederholte Booster-Verabreichung einer entsprechenden Dosis zu festen Zeitintervallen induziert und gehalten. Die Zeitintervalle sind bevorzugt Zwei-Wochen-Intervalle über einem Zeitraum von sechs Monaten. Es ist wichtig, daß die Booster-Verabreichungen nicht zur Immuntoleranz führt.
Es ist ebenso möglich, andere Hyperimmunisierungsaufrechterhaltungsverfahren oder eine Kombination von Verfahren zu verwenden, wie beispielsweise intramuskuläre Injektion zur primären Immunisierung und intravenöse Injektion für Booster-Injektionen. Weitere Verfahren umfassen gleichzeitiges Verabreichen mikroeingekapselten und flüssigen Antigens oder intramuskuläre Injektion zur primären Immunisierung, und Booster-Dosierungen durch orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung durch Mikroeinkapselung. Mehrere Kombinationen von Primär- und Hyperimmunisierung sind dem Fachmann bekannt.
Schritt 4: Es ist notwendig, die Eier hinsichtlich der entzündungshemmenden Aktivitätsniveaus zu testen. Dies kann durch jede klinische oder vorklinische Bewertung erreicht werden, die die Wirkungen von entweder dem hyperimmunen Ei oder daraus abgeleiteten Produkten auf Entzündung testet. Chemisch-induzierte Entzündung der Ratte ist ein Standardassay für entzündungshemmende Arzneimittel (siehe Beispiel 6a, b, c).
Schritt 5: Dieser Schritt umfaßt die Einsammlung und Verarbeitung der Ei(er), die die entzündungshemmende Zusammensetzung enthalten. Das Ei kann durch konventionelle Verfahren eingesammelt werden. Das Verarbeiten des Eis, um die entzündungshemmende Zusammensetzung zu isolieren und zu reinigen, wird nachstehend beschrieben.
Isolierung und Reinigung:
Die Isolierung und Reinigung der entzündungshemmenden Eizusammensetzung kann unter Verwendung von Vollei, Eigelb oder Eiweiß erreicht werden. Ein Beispiel eines bevorzugten Verfahrens ist folgendes:

1. Herstellung einer wasserlöslichen Fraktion aus einem Ei;
2. Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktionen;
3. Trennung von Fraktionen durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie und
4. Bioassay der abgetrennten Fraktionen hinsichtlich der entzündungshemmenden Aktivität.

Folgendes ist eine ausführlichere Beschreibung dieses Verfahrens:
Schritt 1:
Die entzündungshemmende Zusammensetzung kann aus Vollei, Eigelb oder Eiweiß isoliert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung durch dieses Verfahren aus Eiweiß isoliert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung aus Eigelb isoliert. Der Lipidteil wird von dem Vollei oder Eigelb durch dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren entfernt. Beispielsweise kann in dem Fall von sprühgetrocknetem Eigelbpulver das Entfetten mit Lösungsmitteln (Propan, Butan oder Hexan oder mit binären Lösungsmitteln), superkritischem CO₂, Enzymen und dergleichen erreicht werden, und in dem Fall von flüssigem Eigelb kann das Entfetten durch das Octansäuretrennverfahren (CAPS), offenbart von Lee (US-Pat. Nr. 5,367,054), erreicht werden. Für das Eiweiß ist keine Fettentfernung notwendig, und daher kann die flüssige oder pulverisierte Form des Eiweißes entweder direkt durch konventionelle Verfahren und, wie in den nachstehend aufgelisteten Beispielen beschrieben, erhitzt oder gelöst werden. Das Vollei, Eigelb oder Eiweiß wird dann bevorzugt zu entweder einer flüssigen oder Pulverform verarbeitet, und wird weiter verarbeitet, um wasserlösliche Fraktionen zu erhalten. (siehe Beispiele)
Schritt 2:
Die resultierenden wasserlöslichen Fraktionen aus Vollei, Eigelb oder Eiweiß werden der Ultrafiltration unter Verwendung von Ultrafiltrationssystemen, ausgestattet mit einer Membran mit einem Cut-off-Molekulargewicht von 3000, unterzogen. Das UI-trafiltrationsverfahren trennt Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 3000 Dalton von denen mit einem Molekulargewicht von weniger als 3000 Dalton. Wenn einmal filtriert, werden die resultierenden Ultra-Filtrate, die Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 3000 Dalton enthalten, dann lyophilisiert, gewogen und für den Bioassaytest vorbereitet. In einer speziellen offenbarten Ausführungsform erfolgt die bevorzugte Ultrafiltration durch Amicon RA1000 (3K MWCO) und DEAE-Ionenaustauschchromatographie. Es ist jedoch selbstverständlich, daß äquivalente Techniken und Materialien verwendet werden könnten, um die Zusammensetzung zu isolieren, was die Information hierin und das Wissen ergibt, die für den Fachmann zugänglich sind.
Schritt 3:
Fraktionen des Ultrafiltrats von weniger als 3000 Dalton können beispielsweise durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie zur Isolierung der hochreinen entzündungshemmenden Zusammensetzung abgetrennt werden. Als eine alternative oder zusätzliche Strategie kann die entzündungshemmende Eizusammensetzung in dem Ultrafiltrat weiter durch Anionenaustausch-DEAE-Sepharose-Chromato graphie gekennzeichnet sein. Diese Trennverfahren sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Schritt 4:
Die entzündungshemmende Aktivität der Zusammensetzung kann durch jeden Bioassay getestet werden, der entzündungshemmende Aktivität bestimmt. Einige Beispiele umfassen unter anderem die Inhibierung der Leukozytenmigration, Rattenpfoten-Ödemtest, Hilfsmittel-induzierte Arthritis, Kollagen-induzierte Arthritis und Intravitalmikroskopie. Vergleiche von entzündungshemmender Eizusammensetzung mit bekannten entzündungshemmenden Arzneimitteln wie Aspirin und Indomethacin können ebenso durchgeführt werden. Und schließlich können ebenso klinische Tests für Rheumatoidarthritis, degenerative Gelenkerkrankung und Verletzungs-induzierte Arthritis verwendet werden, um die entzündungshemmende Aktivität zu bestimmen.
Die entzündungshemmende Wirkung der hochreinen entzündungshemmenden Eizusammensetzung wird durch Bioassays gemessen. Ein bevorzugter Bioassay ist der Pleuraleukozytenmigrations-Inhibierungsassay, wie in Vinegar et al., „Some Quantitative Characteristics of Carrageenan Induced Pleurisy in the Rat," Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 143: 711-714 (1973); Ammendola, G. et al., „Leukocyte Migration and Lysozomal Enzymes Release in Rat Carrageenan Pleurisy," Agents and Actions 5: 250-255 (1975); Vinegar, R. et al., „Quantitative Studies of the Pathway to Acute Carrageenan Inflammation." Fed. Proc. 35: 2447-2456 (1976) (siehe Beispiele 7, 7a, 7b, 7c und 9, 3, 5 und 6) beschrieben.
Der Leukozytenmigrations-Inhibierungsassay wird im allgemeinen folgendermaßen durchgeführt:
Die Proben, die die entzündungshemmende Zusammensetzung enthalten, werden an die künstlich entzündeten erwachsenen weiblichen Ratten mit 1 %iger Carrageenan-Lösung verabreicht, und dann wird die entzündungshemmende Wirkung der Proben bei jeder Dosierung (unter Verwendung von Automated Image Analysis Technique) durch die Reduktion der Anzahl von Leukozyten in den Pleuraexsudaten der behandelten Ratten im Vergleich zu denen der Kontrollratten bestimmt.
Alternativ kann die entzündungshemmende Wirkung der im wesentlichen reinen entzündungshemmenden Zusammensetzung auf Ödem getestet werden, das durch Injizieren von Carrageenan in Rattenpfoten verursacht wird (Winter, C. A., Risley, G. A., Nuss, A. W., „Carrageenan-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-Inflammatory Drugs," Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3: 544 (1967)).
Eine Vielzahl von anderen Tests kann verwendet werden (siehe Wetnick, A. S. and Sabin, C., „The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats." Jap. J. Pharm. 22: 741 (1972)).
Verabreichung an einen Patienten zur Behandlung:
Die Erfindung ist ebenso auf ein Verfahren zum Behandeln von Entzündungen bei einem Patienten gerichtet, welches das Verabreichen des Eis, Eiproduktes und/oder der entzündungshemmenden Zusammensetzung dieser Erfindung an den Patienten umfaßt.
Die entzündungshemmende Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch jedes Mittel verabreicht werden, das entzündungshemmende Aktivität bereitstellt. Beispielsweise kann die Verabreichung parenteral, subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal oder oral sein.
Die orale Verabreichung wird bevorzugt durch feste Dosierungsformen erreicht, die unter anderem Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Körnchen umfassen. Bei festen Dosierungsformen wird die entzündungshemmende Zusammensetzung mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel wie Saccharose, Lactose oder Stärke vermischt. Diese Dosierungsformen können ebenso, wie es die normale Praxis ist, zusätzliche andere Substanzen als inerte Verdünnungsmittel umfassen. In dem Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen ebenso Puffer, pH-empfindliche Polymere oder jegliche andere langsam freisetzende Kapselungsmaterialien umfassen, die typischerweise als einkapselnde Zusammensetzungen in der Lebensmittel- und Arzneimittelindustrie verwendet werden. Tabletten und Pillen können außerdem mit einer enterischen Beschichtung hergestellt werden.
Flüssige Dosierungsformen der entzündungshemmenden Zusammensetzung zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere, enthaltend inerte Verdünnungsmittel, die üblicherweise in der Pharmazie verwendet werden. Neben den inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen ebenso Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspendier- und Süßungsmittel umfassen.
Präparate der entzündungshemmenden Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wässerige oder nichtwässerige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele von nichtwässerigen Lösungsmitteln oder Vehikeln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie Olivenöl and injizierbare organische Ester wie Ethyloleat.
Die Dosis an Wirkstoffen kann variiert werden; jedoch ist es notwendig, daß die Menge des Wirkstoffes so sein soll, daß eine geeignete Dosierungsform erhalten wird. Es ist klar, daß die gewählte Dosierungsform von der gewünschten therapeutischen Wirkung, der Verabreichungsweise und der Dauer der Behandlung abhängt.
Es ist bevorzugt, daß das Ei selbst, welches die entzündungshemmende Zusammensetzung enthält, in ein Nahrungsmittelprodukt eingeführt wird, um das Eiprodukt zu bilden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Herstellen des Eis, das in ein Nahrungsmittelprodukt eingeführt werden soll, umfaßt das Trocknen des Eis zu einem Eipulver. Obwohl verschiedene Verfahren zum Trocknen von Eiern bekannt sind, ist Sprühtrocknen ein bevorzugtes Verfahren. Eine Temperatur von nicht mehr als 140 °F (60 °C) wird bevorzugt verwendet. Die Proben werden hinsichtlich des Feuchtigkeitsgehalts während des Trocknungsverfahrens überwacht, um ein Endprodukt mit jeder gewünschten Konsistenz zu erhalten. Das getrocknete Eipulver kann in Getränken, Proteinergänzungen und jeglichen anderen nahrhaften, mit Sportlern in Verbindung stehenden Produkten verwendet werden. Außerdem kann das Eipulver in Backmischungen, Pulvern, Riegeln, Süßigkeiten, Keksen usw. verwendet werden. Andere Beispiele der Eiverarbeitung umfassen das Zubereiten von Omelett, Weich- und Hartkochen des Eis, Backen des Eis oder, wenn gewünscht, kann das Ei roh gegessen werden.
Die Verabreichungsdosis und -häufigkeit werden von dem Alter und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten unter Berücksichtigung der Möglichkeit von Nebenwirkungen abhängen. Die Verabreichung wird ebenso von der gleichzeitigen Behandlung mit anderen Arzneimitteln und der Toleranz des Patienten für das verabreichte Arzneimittel abhängen.
Die bevorzugte Lagerweise für Präparate nach dem Ionenaustauschschritt ist als ein lyophilisiertes Pulver. Das Filtrat, das in dem ersten Reinigungsschritt gesammelt wird, kann tiefgekühlt bis zur Verwendung gelagert werden. Die Aktivität der entzündungshemmenden Zusammensetzung, die aus der Reinigung resultiert, wird unter Verwendung des zuvor beschriebenen Ratten-Pleuraleukozytenmigrationstests bestimmt.
Beispiele von entzündlichen Zuständen, die durch die Verabreichung des Eis, Eiproduktes und/oder der entzündungshemmenden Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen akute und subakute Bursitis, akute nicht-spezifische Tendinitis, systemischen Lupus erythematodus, systemische Dermatomyositis, akute rheumatische Karditis, Pemphigus, Bullous dermatitis, Herpeteformis, schweres Erythem, multiform Pityrisais rubra, Zirrhose, saisonale ganzjährige Rhinitis, Bronchialasthma, ectopische Dermatitis, Serumkrankheit, Keratitis, Regenbogenhautentzündung, diffuse Ureitis, Chorditis, Neuritis optica, sympathetische Ophthalmie, symptomatische Sarkoidose, Loeffler-Syndrom, Berylliose, Hämolyseanämie, Mastitis, Mastoiditis, Kontaktdermatitis, allergische Konjunktivitis, Psoriasis arthropathica, Spondylarthritis, akute Gichtarthritis, Gürtelrose-Rheumatoidarthritis, Osteoarthritis, jegliche anderen degenerativen Gelenkkrankheiten und jegliche anderen verwandten Autoimmunkrankheiten. Ferner kann das isolierte und gereinigte Eiprodukt verwendet werden, um Individuen zu behandeln, die möglicherweise entzündlichen Mitteln wie Allergenen ausgesetzt sind.
Wirksame Mengen:
In bezug auf die Verabreichung an einen Patienten des hyperimmunisierten Eis oder Eiproduktes ist bestimmt worden und wird in den folgenden Beispielen ausführlich dargestellt, daß der bevorzugte Dosierungsbereich an hyperimmunisiertem Ei oder Eiprodukt, das an einen Patienten verabreicht werden soll, zwischen 1 g und 40 g pro Kilogramm Patientengewicht liegt.
In bezug auf die hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung selbst ist bestimmt worden, daß der bevorzugte Dosierungsbereich der hochreinen Zusammensetzung, gereinigt und isoliert aus Vollei, Eigelb und Eiweiß eines hyperimmunisierten Eis, zwischen 1 µg und 400 mg der entzündungshemmenden Zusammensetzung liegt.
Entzündungshemmender Faktor:
Wenn die entzündungshemmende Zusammensetzung isoliert und gereinigt ist, können aktive Fraktionen in bezug auf sowohl die Struktur als auch die Aktivität weiter gereinigt und untersucht werden, um die Merkmale einer spezifischeren, aktiveren entzündungshemmenden Verbindung zu bestimmen. Insbesondere ist unter Verwendung der Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) ein einzelner, ultrareiner Peak identifiziert worden, der entzündungshemmende Aktivität zeigt. Es wird angenommen, daß dieser einzelne, ultrareine Peak eine einzelne Verbindung mit einer elementaren chemischen Struktur darstellt. Diese Verbindung ist als der „entzündungshemmende Eifaktor" markiert worden.
Mit der nun allgemein beschrieben Erfindung wird diese in bezug auf bestimmte spezielle Beispiele weiter beschrieben, die hierin nur für die Zwecke der Darstellung bereitgestellt werden und nicht einschränkend sein sollen, sofern nicht anders angegeben.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von S-100-Impfstoff
Der multivalente Impfstoff, bekannt als „Series 100" oder „S-100", offenbart in US-Pat. Nr. 5,215,746 und enthaltend die in Tabelle 1 gezeigten Bakterien (erhalten aus der American Type Culture Collection), wurde mit 15 ml Medium rekonstituiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Wenn einmal gutes Wachstum erhalten wurde, wurde ungefähr eine Hälfte der bakteriellen Suspension verwendet, um einen Liter der Brühe zu inokulieren, die dann bei 37 °C inkubiert wurde. Die übrige Suspension wurde in sterile Glykolröhrchen überführt und bei –20 °C für bis zu sechs Monate gelagert.
Nachdem gutes Wachstum in der Kultur sichtbar war, wurden die Bakterien durch Zentrifugation geerntet. Das bakterielle Pellet wurde in steriler Salzlösung resuspendiert und die bakterielle Probe wurde dreimal zentrifugiert, um die Zellen zu waschen. Nach der dritten Wäsche wurde das erhaltene Pellet in einer kleinen Menge an doppelt destilliertem Wasser resuspendiert.
Die Medium-freie bakterielle Suspension wurde durch Plazieren der Suspension in einem Glaskolben in ein 80 °C-Wasserbad über Nacht hitzegetötet. Die Lebensfähigkeit der Kulturbrühe wurde mit einer kleinen Menge an hitzegetöteten Bakterien getestet. Die Brühe wurde mit hitzegetöteten Bakterien inokuliert, bei 37 °C für fünf Tage inkubiert und täglich hinsichtlich des Wachstums untersucht, da die Bakterien für die Verwendung in dem Impfstoff getötet werden müssen.
Die hitzegetöteten Bakterien wurden lyophilisiert, bis sie trocken waren. Die trockenen Bakterien wurden dann mit steriler Salzlösung auf eine Konzentration von 2,2 × 10⁸ Bakterienzellen/ml Kochsalzlösung gemischt (1,0 optische Dichte Ablesung bei 660 nm).
TABELLE 1 Antigene in dem S-100-Impfstoff
Beispiel 2
Entzündungshemmende Wirkung von hyperimmunisiertem Ei
Dieses Beispiel zeigt die entzündungshemmende Wirkung von hyperimmunisiertem Ei, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf Carrageenan-induziertes Hautödem bei Hunden auf einer Diät, umfassend hyperimmunisiertes Ei. Diese Ergebnisse zeigen, daß hyperimmunes Ei die Entzündung reduziert. Die Wirkung auf die Entzündung wurde mit der verglichen, die mit dem nichtsteroidalen Antirheumatikum Ibuprofen bei 10 mg/kg ED₅₀ Dosis in diesem Test erhalten wurde.
Zwanzig weiße Eagle Beagles (vier Gruppen von jeweils fünf Hunden) wurden mit einer Grunddiät (350 g) aus kommerziell erhältlichem Lamm und Reishundefutter gefüttert. Wie in Tabelle 2 dargestellt, erhielten zwei Gruppen von fünf Hunden (Gruppen 1 & 2) nur die Grunddiät während des konditionierenden Zeitraums von ungefähr 100 Tagen. Außerdem wurden die Hunde aus Gruppe 2 mit dem nicht steroidalen Antirheumatikum, Ibuprofen, vor der entzündlichen Reizung mit Carragee nan behandelt. Während desselben Zeitraums wurden die übrigen zwei Gruppen (3 & 4) mit der Grunddiät zusammen mit hyperimmunem Ei (HIE) gefüttert. Die Gruppe 3 erhielt 3,5 g hyperimmunes Ei, während die Gruppe 4 35 g hyperimmunes Ei, das zu der Diät zugegeben wurde, erhielt. Am Ende der konditionierenden Diätbehandlung wurden die Hunde mit einer Intrakutaninjektion von 2 % Carrageenan gereizt und eine Entzündungsreaktion wurde bewirkt.
Das Reizsetzungsverfahren war folgendermaßen. Ein Hund aus jeder Gruppe wurde zufällig für die Reizsetzung ausgewählt und jeden Tag getestet. Dieses Verfahren wurde täglich für fünf Tage wiederholt, bis alle Hunde aus allen Gruppen getestet wurden. 15 Minuten vor dem Reizsetzungsverfahren erhielten die Hunde aus Gruppe 2 10 mg/kg Ibuprofen oral. Alle Hunde wurden durch intravenöse Injektion anästhesiert und auf der linken Seite rasiert (ungefähr 6 × 8 Inch). Zwei Linien mit 3 Markierungen wurden auf der rasierten Fläche gemacht und mit 1 bis 6 beziffert. Eine Intrakutaninjektion von 0,1 ml Kochsalzlösung wurde an Markierung 1 als eine negative Kontrolle verabreicht. Von Markierung 2 bis 6 wurde eine 0,1 ml Intrakutaninjektion einer 2%igen Lösung aus Carrageenan verabreicht. Die Injektionen wurden durch dieselbe Person für die Dauer der Studie verabreicht. Intrakutaninjektionen dieser Konzentration von Carrageenan wurden zuvor bestimmt, damit sie eine meßbare Schwellung in 100 % der Tiere hervorrufen, was durch 10 mg/kg Ibuprofen verringert werden könnte. Am Ende der letzten Injektion von Carrageenan wurden die Messungen von jeder Schwellung unter Verwendung eines Mikrometers durchgeführt und die Zahlen wurden aufgezeichnet. Die anästhesierten Tiere konnten sich erholen und sechs Stunden später wurden die Messungen wiederholt und aufgezeichnet. Die mittlere Größe der Entzündungsreaktion wurde für jede Gruppe bestimmt.
TABELLE 2
Diese Ergebnisse zeigten eine signifikante Verringerung der Schwellung bei den Tieren, die mit hyperimmunem Ei gefüttert wurden (3,5 g plus Grunddiät und 35 g plus Grunddiät), was eine vorbeugende Wirkung des hyperimmunen Eis auf die Entzündung angibt, wenn oral gefüttert. Außerdem zeigen die Ergebnisse, daß entzündungshemmende Aktivität des hyperimmunen Eis vergleichbar war mit der Wirkung, die mit dem entzündungshemmenden Arzneimittel Ibuprofen gesehen wird. Die Unterschiede bei dem p < 0,05 Signifikanzniveau lagen zwischen der behandelten und der Kontrollgruppe.
Beispiel 3
Isolierung von entzündungshemmender Eizusammensetzung < 30.000 Dalton aus hyperimmunem Vogelei
Schritt 1: Herstellung von wasserlöslichem Filtrat aus Ei
Flüssiges Eigelb, flüssiges Eiweiß und Eigelbpulver wurden verarbeitet, um die wasserlösliche Fraktion zu erhalten. Das flüssige Eigelb wurde durch das Octansäurephasentrennverfahren (CAPS) entfettet, offenbart durch Lee (US-Pat. Nr. 5,367,054), wie in diesen Beispielen beschrieben. Flüssiges Eiweiß wurde für einen spezifizierten Zeitraum erhitzt, wie in diesen Beispielen beschrieben. Das Eigelbpulver wurde mit binärem Lösungsmittel, superkritischem CO₂ oder Enzym entfettet, wie in diesen Beispielen beschrieben.
Schritt 2: Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktionen
Die wasserlöslichen Fraktionen wurden in einem Amicon DC10L Ultrafiltrations-System mit einer spiralgewundenen 30K MW CO Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Die Ultrafiltrationspatrone weist eine Membranoberfläche von 10 ft² auf, und lief nahe 40 psi Eingangs- und 33 psi Ausgangsdruck (7 psi Transmembrandruck) mit einer Rezirkulationsfließgeschwindigkeit von 10,4 l/min und einer Flußfließgeschwindigkeit von 2,3 l/min.
Schritt 3: Ionenaustauschchromatographie
Das Filtrat aus der DC10L-Ultrafiltration der wasserlöslichen Fraktionen wurde durch Anionenaustauschchromatographie weiter verarbeitet. Bei dieser Verfahrensweise wurde DEAE-Sepharose Fast Flow gel (Pharmacia) verwendet, um eine 3 × 15 cm Glassäule zu packen, die mit sterilem doppelt destilliertem Wasser, pH 7,0, äquilibriert wurde.
500 ml des Filtrats (< 30.000 Dalton), vorfiltriert durch einen 0,2-Mikrometer-Filter, wurden auf die Säule aufgebracht, welche mit 500 ml sterilem, doppelt destilliertem Wasser, pH 7,0, bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml pro min gewaschen wurde. Die gebundene Fraktion, von der angenommen wird, daß sie die entzündungshemmende Eizusammensetzung enthält, wurde mit 250 ml von 0,15M NH₄OAc elu iert. Die Fraktionen wurden gesammelt und bei 280 nm in einem LKB Uvicord 2138 Monitor mit optischer Dichte, ausgedruckt auf einem damit verbunden Aufzeichnungsgerät, überwacht. Das Elutionsprofil der Endotoxin-freien im wesentlichen reinen entzündungshemmenden Eizusammensetzung ist in 1 gezeigt. Die entzündungshemmende Eizusammensetzungsfraktion wurde für die weitere Verarbeitung lyophilisiert.
Herstellung von entzündungshemmender Eizusammensetzung < 30.000 Dalton aus flüssigem Eigelb und flüssigem Eiweiß
2 Liter von hyperimmunem Eigelb wurden durch das Octansäurephasentrennverfahren (CAPS) entfettet, offenbart von Lee (US-Pat. Nr. 5,367,054). Kurz, S-100-Eigelb wurde 15fach in einer gepufferten Lösung aus 1 % Octansäure und 0,06M Natriumchlorid in 0,02M Acetat bei einem pH von 5,0 verdünnt. Die wässerige Phase wurde durch Filtration von der ausflockenden Phase abgetrennt und auf pH 7 mit 0,5M NaOH eingestellt. Die wässerige Phase wurde ultrafiltriert, bis 2 l Retentat übrig blieben. Das Ultrafiltrat wurde auf die DEAE-Sepharosesäule aufgebracht. 46,6 g entzündungshemmende Eigelbzusammensetzung wurden aus 2 l Eigelb nach der DEAE-Säulenchromatographie erhalten (siehe 4).
1 Liter hyperimmunes Eiweiß wurde mit 3 l deionisiertem Wasser verdünnt. Das Gemisch wurde auf 90 °C für 1 Stunde erhitzt, abgekühlt und zentrifugiert. Der Überstand wurde durch 40-Mikrometer-Filterpapier filtriert und ultrafiltriert, bis ungefähr 64 ml Retentat erhalten wurden. 500 ml Ultrafiltrat wurden auf die DEAE-Sepharosesäule aufgebracht. Aus 1 l Eiweiß wurden 4,4 g entzündungshemmende Zusammensetzung nach der DEAE-Sepharosesäulenchromatographie erhalten (siehe 5).
Herstellung von entzündungshemmender Eizusammensetzung < 30.000 Dalton aus Eigelbpulver
Drei Verfahrensweisen wurden verwendet, um das Eigelbpulver zu entfetten und dann entzündungshemmende Eizusammensetzung aus dem entfetteten Eigelbpulver (7) zu isolieren.
Verfahrensweise 1: Binäre Lösungsmittelextraktion
Hyperimmunes Eigelbpulver wurde mit einem Gemisch vereinigt, das aus absolutem Ethanol und Hexan besteht, um die Lipide aus Eigelb zu entfernen, gefolgt von wässeriger Trennung der entzündungshemmenden Eizusammensetzungsfraktion. Kurz, 400 g hyperimmunes Eigelbpulver wurden mit 2 l binärem Lösungsmittel vereinigt (25 % absolutes Ethanol –75 % Hexan oder 25 % Isopropanol –75 % Hexan) und gemischt. Der Lösungsmittelüberstand wurde entfernt, und zwei zusätzliche Lösungsmittelextraktionen wurden für die gesamten drei Lipidextraktionen durchgeführt. Das Endextraktionsgemisch wurde zentrifugiert, um die Endtrennung zu unterstützen. Das entfettete Eigelbmaterial wurde getrocknet und mit 4.000 ml deionisiertem Wasser vereinigt, und der pH wurde auf 7 mit 0,5M NaOH eingestellt. Es wurde dann auf 500 ml in einem Amicon DC10L Ultrafiltrations-System konzentriert.
Die entzündungshemmende Eizusammensetzung in dem Ultrafiltrat (< 30.000 Dalton) wurde durch DEAE-Sepharosechromatographie weiter isoliert, und die entzündungshemmenden Eizusammensetzungsfraktionen wurden für die weitere Verarbeitung lyophilisiert. Nach der DEAE-Chromatographie wurden 0,45 g entzündungshemmende Zusammensetzung aus dem Ultrafiltrat rückgewonnen und hinsichtlich der Aktivität getestet (3).
Verfahrensweise 2: Superkritische CO₂-Extraktion
Trockenes hyperimmunes Eigelbpulver wurde unter superkritische Bedingungen gesetzt, um einen Teil der Lipide aus dem Eigelb zu entfernen, gefolgt von wässeriger Trennung von entzündungshemmender Eizusammensetzungsfraktion. Zusammenfassend wurden ungefähr 400 g trockenes immunes Eigelbpulver in die Autoclave Engineers^® SCE-Einheit gegeben und wurden der statischen CO₂-Extraktion bei ~5400 psi bei 32,2 °C für 20 Stunden unterzogen. Das teilweise entfettete Eigelb wurde mit 4.000 ml deionisiertem Wasser homogenisiert und bei 10.000 U/min für 30 Minuten zentrifugiert. Der wässerige Überstand wurde abgetrennt und dann auf 500 ml in einem Amicon DC10L Ultrafiltrations-System konzentriert. Die entzündungshemmende Eizusammensetzung in dem Permeat (< 30.000 Dalton) wurde weiter durch DEAE-Sepharose-Anionenaustauschchromatographie isoliert.
Die entzündungshemmenden Eizusammensetzungsfraktionen wurden für die weitere Verarbeitung lyophilisiert, und 1,86 g der entzündungshemmenden Eizusammensetzung wurden aus dem Ultrafiltrat nach der DEAE-Chromatographie erhalten. 6 zeigt die Bioassayaktivität der im wesentlichen reinen Zusammensetzung nach dem Entfetten durch superkritische CO₂-Extraktion, Ultrafiltration und DEAE-Chromatographie.
Verfahrensweise 3: Enzymbehandlungsextraktion
Hyperimmunes Eigelbpulver wurde mit einem Gemisch, bestehend aus Newlase F in Lactatpuffer, inkubiert, um die Lipide aus dem Eigelb zu entfernen, gefolgt von der wässerigen Trennung der entzündungshemmenden Zusammensetzungsfraktion. Kurz, 300 g getrocknetes S-100-Eigelbpulver wurden mit 6 l von 0,05M Lactatpuffer, pH 4,0, und 27 g Newlase F (Sigma #P-5027) gemischt und homogenisiert. Das Gemisch wurde bei 50 °C für eine Stunde inkubiert und dann wurde die untere wässerige Phase filtriert. Die resultierende wässerige Phase wurde mit 0,5M NaOH neutralisiert und dann auf Amicon DC10L (30K MWCO) konzentriert, bis 3 l Permeat gesammelt waren. 276 ml des Permeats wurden auf eine DEAE-Sepharosesäule aufgebracht. Nach der DEAE-Chromatographie wurde das Permeat mit einem MW von 30.000 hinsichtlich der entzündungshemmenden Aktivität analysiert.
Depyrogenation und Analyse des Endotoxingehalts von Isolaten der entzündungshemmenden Eizusammensetzung mit < 30.000 Dalton
Depyrogenation
Die Isolate der entzündungshemmenden Eizusammensetzung wurden depyrogeniert, um das Endotoxin zu beseitigen, das die entzündungshemmende Zusammensetzungsaktivität imitiert. Kurz, 60 mg entzündungshemmendes Eipulver wurden in 15 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Das Gemisch wurde durch UI-trazentrifugation in 3K MWCO Centriplus-Konzentratoren (Amicon) depyrogeniert. Die Centriplus-Konzentratoren wurden zuvor mit PyroCLEAN (AIerCHECK, Inc.) unter Verwendung von aseptischen Techniken unter Laminarströmung depyrogeniert. Endotoxin kann ebenso durch Standardverfahren entfernt werden, die für den Fachmann zugänglich sind, und muß nicht auf Molekulargewichtstrennung basieren.
Analyse
Für Nachweiszwecke wurde die depyrogenierte entzündungshemmende Eizusammensetzung hinsichtlich des Endotoxingehalts durch den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) heterologen Immunassay (ELISA) analysiert. Kurz, ein aliquoter Teil der entzündungshemmenden Eizusammensetzung, verdünnt mit physiologischer Kochsalzlösung, wurde zu Platten zugegeben, enthaltend J774 Makrophagen, gezüchtet in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medien mit 10 % fetalem Kalbsserum. Nach 4 Stunden der Inkubation bei 37 °C wurde der Überstand zu einer Platte zugegeben, beschichtet mit monoklonalem Anti-TNF-Antikörper und blockiert mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Nach der Inkubation über Nacht der Platte bei Raumtemperatur wurden biotinylierter Antikörper und Streptavidinperoxidase zugegeben. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-(TMB-) Substrat wurde zu der Platte für die Farbentwicklung zugegeben. Die Extinktion der Plattenlochgehalte wurde bei 450 nm abgelesen. Die TNF-Konzentration in der entzündungshemmenden Eiprobe wurde durch Interpolieren aus der Standardkurve bestimmt. Der TNF-Gehalt der Isolate der entzündungshemmenden Eizusammensetzung nach der Depyrogenation war unwesentlich (siehe Tabelle 3). TABELLE 3

^a Medien weisen nur 46,5 pg TNF/ml auf.
^b Medien weisen kein TNF auf.

Wirkung von Endotoxin-freier entzündungshemmender Zusammensetzung < 30.000 Dalton auf Leukozytenmigration
Die entzündungshemmende Wirkung von im wesentlichen reiner entzündungshemmender Eizusammensetzung mit < 30.000 Dalton bei jeder Dosierung wurde durch die Verringerung der Anzahl von Leukozyten in den Pleuraexsudaten von mit im wesentlichen reiner entzündungshemmender Eizusammensetzung behandelten Ratten im Vergleich zu denen von Kontrollratten bestimmt (siehe Tabelle 4, 2). 2 und Tabelle 4 vergleichen die Wirkung der im wesentlichen reinen hyperimmunisierten Eigelb- und Eiweißfraktionen mit der, die aus regulären Tafeleiern erhalten wird. Alle Dosierungen von im wesentlichen reiner hyperimmuner entzündungshemmender Zusammensetzung führten zu einer Verringerung der Anzahl von Leukozyten, die in das Pleuraexsudat migrieren. Die größte Wirkung wurde bei den Patienten beobachtet, die 2 mg der im wesentlichen reinen Zusammensetzung aus Eigelb erhielten.
TABELLE 4 Inhibierung der Leukozytenmigration in die Pleuraexsudate bei unterschiedlichen Dosierungen der entzündungshemmenden Eizusammensetzung
Charakterisierung der entzündungshemmenden Eizusammensetzung
Das Molekulargewicht der im wesentlichen reinen entzündungshemmenden Eizusammensetzung, hergestellt durch das oben beschrieben Verfahren, betrug weniger als 30.000 Dalton. Dies wurde aus der Tatsache abgeleitet, daß der erste Schritt bei der Isolation der Zusammensetzung aus Eigelb und Eiweiß durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran erfolgte, die den Durchgang von Molekulargewichtsspezies > 30.000 Dalton nicht erlaubte.
Die Zusammensetzung weist eine negative Ladung unter vorherrschenden Bedingungen auf. Der pKa-Wert dieses Gels beträgt 9,5. Dies wurde durch Aufbringen von Eiultrafiltrat auf eine DEAE-Sepharose-Ionenaustauschsäule bestimmt. Die entzündungshemmende Zusammensetzung eluierte nicht mit Wasser aus der Säule. Die Veränderung der Elutionsmedien auf NH₄OAc-Lösung oder jede Salzlösung oder Puffer mit einem pH höher als 9,5 verursachte die Elution der entzündungshemmenden Eizusammensetzung. Wenn das Ultrafiltrat auf die DEAE-Säule aufgebracht wurde, bildeten verschieden Proteine und Salze die nicht gebundene Fraktion (Peak 1, 1). Peaks wurden aufgezeichnet, wenn die Säule mit NH₄OAc-Lösung (Peak 2) und dann NaCl-Lösung (Peak 3) gewaschen wurde. Die Fraktion, isoliert aus Peak 2, zeigte entzündungshemmende Aktivität, basierend auf einem Rattenassay. Der dritte Peak zeigte geringfügige Aktivität. Die entzündungshemmende Eiweißzusammensetzung ist bei 90 °C für 1 h wärmebeständig.
Außerdem kann die entzündungshemmende Eizusammensetzung aus Eigelb und Eiweiß isoliert werden. Die entzündungshemmende Eizusammensetzung aus Eigelb zeigt höhere Aktivität als die entzündungshemmende Eizusammensetzung aus Eiweiß (2, Tabelle 4).
Beispiel 4
Bevorzugtes Verfahren zum Herstellen einer hochreinen entzündungshemmenden Zusammensetzung aus Ei
Die folgenden Beispiele beschreiben ein Verfahren (geeignet für Reinigung im großen Maßstab) für den Erhalt der entzündungshemmenden Zusammensetzung aus Vogeleiern in ihrer hochreinen, nicht-aggregierten Form mit geringstem Molekulargewicht. Volleier, hyperimmunisierte und Kontrolltafeleier wurden aufgeschlagen und das Eiweiß wurde von dem Eigelb abgetrennt und beide wurden sprühgetrocknet. Hyperimmunisierte Eier wurden erhalten, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Eiweißpulver wurde separat verarbeitet, um die wässerige Fraktion für die Ultrafiltration zu erhalten.
Alle Reinigungsschritte wurden so durchgeführt, daß die mögliche Kontamination mit Bakterien oder Pyrogenen minimiert wurde. Steriles Wasser wurde verwendet, um Lösungen herzustellen, und alle Glaswaren wurden depyrogeniert. Außerdem wurde die Lösung steril filtriert.
Beispiel 4a
Herstellung von entzündungshemmender Eizusammensetzung aus Eigelbpulver Lösungsmittelextraktion
Das getrocknete Eigelb wurde der Flüssiglösungsmittelextraktion mit entweder Propan oder Butan unterzogen, um die Lipide aus der wässerigen Eigelbfraktion, die die entzündungshemmende Zusammensetzung enthält, zu entfernen. Kurz, 500 g trokkenes Eigelbpulver wurden in eine Säule gegeben, zu der 4 Liter flüssiges Propanlösungsmittel zugegeben wurden. Der Lösungsmittelüberstand und extrahiertes Lipid wurden entfernt. Sechs zusätzliche Lösungsmittelextraktionen wurden für insgesamt sechs Lipidextraktionen durchgeführt.
Ultrafiltration
400 g des trockenen entfetteten Eigelbs wurden mit 4 Liter sterilem destilliertem Wasser verdünnt und mit einem Virtis (Handishear) homogenisiert. Das Eigelbgemisch wurde entweder bei 24 U/min zentrifugiert oder stand tiefgekühlt, bis die nichtgelösten Eigelbteilchen ausfielen. Die resultierende wässerige Fraktion wurde unter Verwendung eines Amicon RA1000 Ultra-Filtrationssystems, ausgestattet mit einer Federmembran mit 3000 Cut-off-MW, ultrafiltriert. Die Pumpgeschwindigkeit wurde bei 20 psi Eingangsdruck und 15 psi Ausgangsdruck gehalten. Die Permeate mit Molekulargewicht von < 3000 wurden unter Verwendung eines 0,45 µm sterilen weg werfbaren Nalgene-Filters steril filtriert und lyophilisiert oder zur Lagerung, Bioassaytests oder weiteren Reinigung eingefroren. 8 zeigt ein Fließdiagramm des Reinigungsverfahrens.
Molekülspezies unter 3.000 Dalton aus Eigelb enthalten die entzündungshemmende Zusammensetzung in einer nicht-aggregierten Form mit niedrigem Molekulargewicht. Aus 400 g Ausgangsmaterial betrug die Ausbeute an entzündungshemmender Zusammensetzung ungefähr 12 g oder 3 % insgesamt. Bioassaytests von dieser 3K-Fraktion hinsichtlich der entzündungshemmenden Aktivität zeigten hohe Niveaus an Aktivität (Beispiel 6a).
Beispiel 4b
Erzeugung von entzündungshemmender Eiaktivität aus Eiweißpulver
4 g Eiweiß, isoliert aus sowohl hyperimmunisiertem Ei, wie in Beispiel 1 beschrieben, als auch Kontrolltafelei, wurde mit einem Liter deionisiertem Wasser verdünnt. Das Gemisch wurde homogenisiert und durch einen 40-μm-Filter filtriert und durch ein 3K MW CO Ultra-Filtrationssystem (9) ultrafiltriert. Aus 400 g Eiweißpulver wurden 8,6 g oder 2,15 % der entzündungshemmenden Zusammensetzung gewonnen. Dieses Material zeigte Bioassayaktivität bei der Inhibierung der Ratten-Leukozytenmigration zu einer induzierten Verletzungsstelle (Beispiel 6a).
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung der aktiven entzündungshemmenden Zusammensetzung aus Eiweißmaterial von sowohl hyperimmunen als auch Kontrolltafeleiern.
Beispiel 5
DEAE-Ionenaustauschchromatographie
Die entzündungshemmende Eizusammensetzung wurde ebenso durch Anionenaustausch-DEAE-Chromatographie weiter charakterisiert. Dieses Beispiel zeigt, daß die entzündungshemmende Zusammensetzung bei neutralem pH negativ geladen ist.
10K Ultra-Filtrat aus sowohl Eiweiß- als auch Eigelbmaterial wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 4a beschrieben erhalten, außer daß eine Membran mit einem MW von 10.000 anstelle der Membran mit einem MW von 3000 verwendet wurde.
Eine DEAE-Poros 50-Säule (10/50 Millimeter) wurde mit sterilem doppelt destilliertem Pyrogen-freiem Wasser (Sigma), pH 7,0, äquilibriert. 10 mg des Ultrafiltrats (< 10.000 MW), gelöst in 100 ml sterilem Pyrogen-freiem doppelt destilliertem Wasser, wurden auf die DEAE-Poros-Säule auf dem BioCad 700 aufgebracht (Perseptives Biosystems). Bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min wurde das Material auf die Säule aufgebracht. Die anfängliche Elution des Materials, das nicht an die Säule gebunden war, wurde mit destilliertem Wasser entfernt und gesammelt. Ein linearer Gradient von Ammoniumacetat (0 % bis 100 %) wurde verwendet, um das Material, das an die Säule gebunden war, und die Fraktionen, die mit UV-Absorption bei 280 nm und 254 nm überwacht wurden, zu eluieren und 10 ml Fraktionen wurden durch einen Avantec-Fraktionssammler gesammelt. NaCl (0,15M) wurde verwendet, um das restliche Material, das an die Säule gebunden war, zu entfernen. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, bis die Extinktion von 280 nm und 254 nm zur Grundlinie zurückkehrte.
10 zeigt ein typisches Chromatogramm. Der Pfeil gibt die aktive entzündungshemmende Fraktion (Peak 2) an. Ein typisches Elutionsprofil mit NH₄-Acetat wird mit Veränderungen im Elutionspuffer, der durch die Pfeilspitze angegeben ist, gezeigt. Das Eluat wurde mit einem 0,45 µm sterilen Filter steril filtriert, zur Trockne lyophilisiert und gewogen. Der Bioassay der einzelnen Peaks zeigte, daß der Peak, der die Aktivität enthält, in Peak 2 (Beispiel 6b) gefunden wurde. Die Fraktion, isoliert durch DEAE-Ionenaustauschchromatorgraphie, zeigte, daß die entzündungshemmende Zusammensetzung negativ geladen war.
Beispiel 6
Assay der entzündungshemmenden Aktivität
Blindversuche von im wesentlichen gereinigten Fraktionen von Eigelb und Eiweiß, aus Tafeleiern und hyperimmunen Eiern wurden hinsichtlich der entzündungshemmenden Aktivität analysiert. Der Testassay mißt die Inhibierung der Leukozytenmigration von kleinen Venen zu einer induzierten Verletzungsstelle in der Pleurahöhle von Ratten.
Weibliche Ratten (Charles River, MA), die 120 bis 150 g wogen, wurden in der Pleurahöhle mit 2 ml von 1 % Carrageenan (ein Reizmittel) in physiologischer Kochsalzlösung injiziert, um die Leukozytenmigration in die Pleurahöhle zu induzieren. Die Ratten wurden dann intraperitoneal (IP) mit 0,5 ml Dosen von jeder Testfraktion in physiologischer Kochsalzlösung bei der ausgewählten Konzentration injiziert. Zwei Ratten wurden bei jeder Konzentration injiziert. Eine Injektion von Kochsalzlösung wurde als eine Kontrolle verwendet. 4 Stunden nach der Injektion wurden die Tiere unter Verwendung von Verfahren gemäß dem Tierschutzgesetzt getötet. Das Pleuraexsudat wurde entfernt und die Leukozyten wurden hinsichtlich der Bewertung fixiert. 50 Mikroliter des Exsudats wurden auf einen markierten Objektträger geladen und auf eine Cytospin geladen. Nach dem Ende des Cytospinkreislaufs wurden die Objektträger mit Cytoprep-Fixiermittel (Fisher Scientific Co. Atlanta) besprüht und mit Hematoxylin eingefärbt. Fünf repräsentative Flächen von jedem Objektträger wurden bewertet und die Anzahl an Leukozyten wurde mit dem Bioscan Optimas Image Analysis Programm gezählt. Der Durchschnitt von allen fünf Zählungen wurde für die gesamte durchschnittliche Leukozytenzählung für jede Ratte verwendet. Die prozentuale Inhibierung wurde im Vergleich zu den Kontrollkochsalzinjektionen für jede Probenkonzentration berechnet.
Beispiel 6a
Vergleich von entzündungshemmender Aktivität aus Eiweiß, Eigelb, hyperimmunen und Tafeleiern
Gereinigte Fraktionen aus sprühgetrocknetem entfettetem Eigelb und Eiweiß aus Tafeleiern und hyperimmunisierten Eiern, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden hin sichtlich der entzündungshemmenden Aktivität getestet. Das Permeat mit einem MW von weniger als 3000 aus Tafeleiweiß, hyperimmunisiertem Eigelb und hyperimmunisiertem Eiweiß wurde nach der Ultra-Filtration, wie in Beispiel 4 und 5 beschrieben, erhalten. Zwei Tiere für jede Probe wurden mit entweder Kochsalzlösung, 1, 5, 10 oder 20 mg der Testfraktionen IP injiziert und, wie in Beispiel 6 beschrieben, bewertet.
11 zeigt, daß hochreine Eigelbfraktionen mit einem Molekulargewicht von weniger als 3000 aus hyperimmunisierten Hühnern eine 65%ige Inhibierung der Leukozytenmigration bei einer Dosis von 1 mg/Ratte zeigten. Diese hyperimmunen Eigelbfraktionen zeigten ebenso ein höheres Niveau an Aktivität (65%ige Inhibierung bei einer Dosis von 1 mg/Ratte) als Fraktionen, die aus hyperimmunem Eiweiß (38 %) bei derselben Dosis erhalten wurden. Kontrolleiweiß zeigte weniger entzündungshemmende Aktivität (25%ige Inhibierung bei einer Dosis von 1 mg/Ratte). Nichthyperimmunisierte Eifraktionen enthalten ebenso die entzündungshemmende Aktivität, da alle Hennen geimpft werden und der natürlichen Immunisierung aufgrund der Gegenwart von Mikroorganismen und Allergenen in der Umgebung unterliegen. Überraschenderweise wird jedoch das Niveau der entzündungshemmenden Zusammensetzung in sowohl Eigelb als auch Eiweiß durch das Verfahren der Hyperimmunisierung erhöht. Da Komponenten in Ei im allgemeinen entweder in lipidreiches Eigelb oder Eiweiß unterteilt werden, ist es überraschend, daß die entzündungshemmende Aktivität in der Fraktion mit einem MW von weniger als 3000 aus sowohl dem Eigelb als auch Eiweiß gefunden wurde.
Dieses Beispiel zeigt, daß die entzündungshemmende Zusammensetzung weniger als 3000 Dalton beträgt, in Eigelb und Eiweiß gefunden wird und in viel höheren und wirksameren Mengen in hyperimmunen Eifraktionen als in Kontrolltafeleiern gefunden wird. Tatsächlich wird die hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung in hyperimmunisierten Eiern in einer Menge gefunden, die beim Behandeln von Entzündung wirksam ist.
Beispiel 6b
Wirkung der negativ geladenen DEAE-Fraktionen auf die Leukozytenmigration
Gemäß der entzündungshemmenden Bioassayverfahrensweise wurden der negativ geladene DEAE-Peak 2, eluiert mit NH₄OAc, das 3K und 10K Ultra-Filtrat aus hyperimmunem Eigelb hinsichtlich der Aktivität getestet. Jede Probe wurde bei den angegebenen Dosierungen getestet.
12 zeigt, daß die negativ geladene DEAE-Fraktion, das 3K und 10K Ultra-Filtrat aus Eiern von hyperimmunisierten Hühnern ein hohes Niveau an entzündungshemmender Aktivität im Vergleich zu der Kochsalzlösungskontrolle zeigt.
Beispiel 6c
Vergleich mit entzündungshemmenden Arzneimitteln
Die entzündungshemmenden Arzneimittel Indomethacin und Aspirin wurden mit dem Ei-3K-Ultra-Filtrat zur Inhibierung der Leukozytenmigration in vivo verglichen. Bei diesem Assay wurden die intraperitonealen Injektionen bei den Dosierungen von:
1000 µg, 100 µg, 10 µg, 1 µg, für Indomethacin, Aspirin und die 3K entzündungshemmende Eizusammensetzung aus hyperimmunem Ei verabreicht.
13 zeigt, daß das 3K Ultra-Filtrat und Aspirin ähnliche Niveaus von entzündungshemmender Aktivität zeigen. Das Niveau der Inhibierung der Leukozytenmigration durch Indomethacin scheint bei niedrigeren Dosierungen reduziert zu werden (1 bis 100 µg/Ratte).
Dieses Beispiel zeigt, daß die entzündungshemmenden Fraktionen aus Ei eine Wirkung im Vergleich zu dem Leukozytenmigrationsassay gegenüber bekannten entzündungshemmenden Arzneimitteln haben.
Beispiel 7
Reinigung von entzündungshemmendem Faktor durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC)
Im wesentlichen reine DEAE-Fraktionen mit weniger als 3K, 10K aus Eigelb und 30K DEAE-Fraktion aus Eiweiß wurden auf einer Waters C8 Symmetrie-Umkehrphasensäule (3,9 × 250 mm) abgetrennt. Ein linearer Gradient von 10 % bis 80 % Methanol und H₂O wurde als die mobile Phase auf einem Waters Modell 2010 HPLC mit einem 717 plus Auto-Sampler und einem 996 Diodenarraydetektor verwendet. Die lyophilisierten Proben wurden in 100 bis 200 ml sterilem doppelt destilliertem Wasser verdünnt. Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml pro Minute eluiert und die Abflußdiodenarraydaten wurden bei allen Wellenlängen von 200 nm bis 350 nm gespeichert.
14 zeigt ein MAX-Chromatogramm der Trennung des 3K-Permeats. Dieses Chromatogramm zeigt die zwei Hauptpeaks von weniger als 3K Molekulargewicht, was zu einer hochreinen entzündungshemmenden Eizusammensetzung führt. 15 zeigt die Trennung der Zusammensetzung von einem 10K-Permeat, das auf einer DEAE-Ionenaustauschsäule abgetrennt wurde, wie in Beispiel 5 dargestellt. Zwei Peaks, ähnlich denen, die mit der 3K-Ultra-Filtratfraktion beobachtet wurden, wurden erhalten. Diese Ergebnisse zeigen, daß beide Fraktionen, weniger als 3K und DEAE, das ebenso entzündungshemmende Aktivität (Beispiel 7) zeigte, verwendet werden können, um eine hochreine negativ geladene Komponente zu erhalten.
Die Analyse der Zusammensetzung der 3K-Eigelbfraktion zeigte die Gegenwart einer anfänglichen Reihe von Peaks, die bei einer bis zwei Minuten eluieren, und drei Peaks, die bei 10 bis 20 Minuten eluieren. Dieses Beispiel zeigt, daß die entzündungshemmende Zusammensetzung ein MW von weniger als 3000 hat und durch das Verfahren in einen relativ reinen Peak getrennt werden kann.
Präparative HPLC
Um große Mengen des entzündungshemmenden Faktors nach der Ultrafiltration zu erhalten, ist der bevorzugte Schritt, die hochreine Zusammensetzung mit einem Mo lekulargewicht von weniger als 3000 auf einer präparativen HPLC-Säule abzutrennen. Folglich wurde eine 5,08 × 20 cm Säule mit Zorbax C8 Packmaterial gepackt und 4 g des Ultrafiltrats mit einem MW von weniger als 3000 wurden während jedes Durchlaufs gereinigt. Unter Verwendung einer mobilen Phase von 80/20 H₂O/Methanol mit 0,05 % TFA wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 90 ml pro Minute das Permeat in die hochreine Zusammensetzung abgetrennt, gesammelt und lyophilisiert. Dann wurde der gesammelte Peak auf einer analytischen C8-Säule erneut getestet. Mit dem beschriebenen Verfahren wurden große Mengen des ultrareinen Peaks durch präparative HPLC erhalten und hinsichtlich der Bioassayaktivität, elementaren Zusammensetzung und chemischen Struktur, Massenspektroskopie, Elementaranalyse, Infrarotspektroskopie und kernmagnetischen Resonanz analysiert, wobei NMR verwendet wird, um die Struktur des Faktors zu bestimmen.
Beispiel 8
Physikalische Eigenschaften der entzündungshemmenden Zusammensetzung aus Ei
Dieses Beispiel zeigt die Stabilität gegen Erhitzen, Veränderungen in Säure und Base, Proteinasebehandlung.
4 mg des Ultrafiltrats mit einem MW von weniger als 3000 wurden in sterilem Wasser verdünnt und 100 °C für 30 Minuten unterzogen. Die Proben des Ultrafiltrats mit weniger als 3K wurden Säure HCl pH 2,0, neutral pH 7,4 oder Base NaOH pH 9,0 für 30 Minuten vor der Neutralisierung unterzogen. 3K-Fraktionen wurden ebenso mit 1 Einheit von Pronaseenzym für eine Stunde behandelt. Alle Proben wurden steril filtriert, lyophilisiert, gewogen und hinsichtlich der biologischen Aktivität getestet.
Vergleiche der Bioassayaktivität der behandelten Fraktionen (hohe Hitze, Veränderungen im pH und Pronasedigestion) mit der unbehandelten Kontrolle und Kochsalzinjizierten Tieren zeigen eine überraschende Stabilität gegen diese Behandlungen. Stabilität gegen hohe Hitze, Veränderungen im pH und Pronasebehandlung zusätzlich zu der kleinen Größe (weniger als 3000 MW) zeigt, daß die entzündungshemmende Zusammensetzung kein Protein ist.
Es wurde bestimmt, daß die hochreine entzündungshemmende Zusammensetzung die folgenden Merkmale aufweist. Sie weist ein Molekulargewicht von weniger als 3000 Dalton auf. Dieses Merkmal wird von der Isolation und Reinigung der Zusammensetzung abgeleitet, wobei das Isolations- und Reinigungsverfahren eine Ultra-Filtrationsmembran nutzt, die den Durchgang der molekularen Spezies von größer als 3000 Dalton nicht ermöglicht. Die Zusammensetzung wird als nicht-proteinhaltig und nichtsteroidal bestimmt, da sie hinsichtlich der Größe klein ist und durch Enzyme, die Proteine abbauen, nicht abgebaut wird. Außerdem ist die Zusammensetzung oral aktiv und wird durch die Verdauungsenzyme nicht abgebaut. Die kleine stabile Form der Zusammensetzung (im Gegensatz zu Proteinen, die viel größer sind) erleichtert ihre Absorption aus dem Verdauungstrakt.
Die Zusammensetzung ist säure- und basenresistent, wobei sie sich zu einer aktiven Form selbst nach der Behandlung unter Bedingungen von pH 9,0 umwandelt. Außerdem ist die Zusammensetzung bei 100 °C für mindestens 30 Minuten wärmebeständig und weist eine negative Ladung bei neutralem pH auf.
Die entzündungshemmende Eizusammensetzung kann aus Vollei, Eigelb und Eiweiß isoliert werden. Die entzündungshemmende Zusammensetzung, isoliert aus Eigelb, zeigt höhere entzündungshemmende Aktivität als die entzündungshemmende Zusammensetzung, die aus Eiweiß gereinigt wurde.
Übernormale Niveaus der entzündungshemmenden Zusammensetzung können aus hyperimmunem Vollei, hyperimmunem Eigelb und hyperimmunem Eiweiß isoliert werden.

Claims

Verfahren zum hohen Reinigen einer entzündungshemmenden Zusammensetzung aus einem Ei eines Ei-produzierenden Tieres, umfassend: (1) das Isolieren einer wasserlöslichen Fraktion aus dem Vollei, Eigelb oder Eiweiß, (2) das Trennen eines Permeats mit weniger als 3000 Dalton von der wasserlöslichen Fraktion, (3) das Fraktionieren des Permeats mit weniger als 3000 Dalton, um eine biologisch aktive Fraktion zu gewinnen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Fraktionierungsschritt weiter Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie des Permeats mit weniger als 3000 Dalton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Entfetten des Volleis oder des Eigelbs vor Schritt (1).
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Lyophilisieren des < 3000 Dalton Permeats von Schritt (2).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Trennschritt weiter das Ultrafiltrieren der wasserlöslichen Fraktion durch einen Filter mit einem Cut-oft-Molekulargewicht von 3000 Dalton umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ei-produzierende Tier in einem hyperimmunisierten Zustand gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der hyperimmunisierte Zustand durch einen antigenischen, genetischen oder bioverfahrenstechnischen Impfstoff induziert wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der genetische Impfstoff mindestens ein Antigen-kodierendes DNA-Konstrukt umfasst, welches aus der Gruppe, im Wesentlichen bestehend aus Fragmenten nackter DNA, Plasmid-DNA, viraler DNA, DNA-Expressionsbibliotheken, DNA-RNA-Antigenen, DNA-Protein-Konjugaten und DNA-Liposom-Konjugaten und Kombinationen davon, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der antigenische Impfstoff mindestens ein Antigen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus bakteriellen, viralen, protozoischen, fungalen und zellulären Antigenen, umfasst.
Entzündungshemmende Zusammensetzung in hochreiner Form, erhältlich in übernormalen Niveaus aus einem Ei eines Ei-produzierenden Tiers, welches in einem hyperimmunisierten Zustand gehalten wird, durch ein Verfahren, umfassend: (1) das Isolieren einer wasserlöslichen Fraktion aus dem Vollei, Eigelb oder Eiweiß, (2) das Trennen eines Permeats mit weniger als 3000 Dalton von der wasserlöslichen Fraktion, (3) das Fraktionieren des Permeats mit weniger als 3000 Dalton, um übernormale Niveaus der entzündungshemmenden Zusammensetzung zu gewinnen.
Entzündungshemmende Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Eiproduzierende Tier in einem hyperimmunisierten Zustand ist.
Entzündungshemmende Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei der hyperimmunisierte Zustand durch einen antigenischen, genetischen oder biover fahrenstechnischen Impfstoff induziert ist.
Entzündungshemmende Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der genetische Impfstoff mindestens ein Antigen-kodierendes DNA-Konstrukt umfasst, welches aus der Gruppe, im Wesentlichen bestehend aus Fragmenten nackter DNA, Plasmid-DNA, viraler DNA, DNA-Expressionsbibliotheken, DNA-RNA-Antigenen, DNA-Protein-Konjugaten und DNA-Liposom-Konjugaten und Kombinationen davon, ausgewählt ist.
Entzündungshemmende Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der antigenische Impfstoff mindestens ein Antigen umfasst, welches aus der Gruppe, bestehend aus bakteriellen, viralen, protozoischen, fungalen und zellulären Antigenen und Kombinationen davon, ausgewählt ist.
Verwendung einer entzündungshemmenden Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 14 in der Herstellung eines Medikaments zum Vorbeugen, Entgegenwirken oder Reduzieren einer Entzündung.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Medikament eine Menge der entzündungshemmenden Zusammensetzung im Bereich von 5 µg bis 300 µg umfasst.
Verwendung einer entzündungshemmenden Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 14 in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Leukozytenmigration.