DE68923310T2

DE68923310T2 - Antientzündungsfaktor aus Milch.

Info

Publication number: DE68923310T2
Application number: DE68923310T
Authority: DE
Inventors: Lee R Beck
Original assignee: Stolle Research and Development Corp
Current assignee: Stolle Milk Biologics Inc
Priority date: 1988-04-04
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1996-01-11
Anticipated expiration: 2009-04-05
Also published as: KR900700111A; FI895751A0; ATE124628T1; IL89741A0; IE69395B1; JPH02503802A; HK1007511A1; MX165968B; DK175473B1; DK610389D0; KR0131014B1; PH27076A; ES2073434T3; EP0336694B1; AU3343789A; AU620289B2; JP2834244B2; DK610389A; IL89741A; FI98269C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antientzündungsfaktor (AF), ein Verfahren zu dessen Herstellung in im wesentlichen reiner Form und dessen Verwendung in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Entzündung.
Eine Entzündung ist nach der Definition in Doland's Medical Dictionary eine "lokalisierte Abwehrreaktion, die durch Verletzung oder Zerstörung von Geweben hervorgerufen wird und zur Zerstörung, Verdünnung oder Ablösung sowohl des schädlichen Agens als auch des verletzten Gewebes dient". Sie ist durch die Fensterung des Mikrogefäßsystems, Durchsickern der Blutelemente in die Interstitialräume und Migration von Leukozyten in das entzündete Gewebe gekennzeichnet. Auf makroskopischer Ebene wird dies üblicherweise von den üblichen klinischen Zeichen der Erytheme, Ödeme, Empfindlichkeit (Hyperalgesie) und des Schmerzes begleitet. Während dieser komplexen Reaktion werden chemische Mediatoren wie Histamin, 5-Hydroxytryptamin, verschiedene chemotaktische Faktoren, Bradykinin, Leukotriene und Prostaglandine lokal freigesetzt. Phagozytische Zellen migrieren in den Bereich, und zellulare lysosomale Membrane können aufgebrochen werden, wodurch lytische Enzyme freigesetzt werden. Alle diese Voffälle können zu der entzündlichen Reaktion beitragen.
Die Entzündung bei Patienten mit Arthritis rheumatica beinhaltet wahrscheinlich die Kombination eines Antigens (Gammaglobulin) mit einem Antikörper (Rheumafaktor) und einem Komplement, welches die lokale Freisetzung chemotaktischer Faktoren herbeiführt, welche Leukozyten anziehen. Die Leukozyten phagozytieren die Komplexe aus Antigen-Antikörper und Komplement und setzen auch die vielen Enzyme frei, die in ihren Lysosomen enthalten sind. Diese lysosomalen Enzyme bewirken dann eine Verletzung des Knorpels und anderer Gewebe, und dadurch wird das Ausmaß der Entzündung vergrößert. Es können auch zellvermittelte Immunreaktionen beteiligt sind. Während dieses Ablaufs werden auch Prostaglandine freigesetzt.
Prostaglandine, die wahrscheinlich bei einer Entzündung erzeugt werden, führen zu Erythemen und erhöhen den lokalen Blutstrom. Zwei wichtige vaskuläre Wirkungen der Prostaglandine werden im allgemeinen nicht von anderen Entzündungsmediatoren geteilt - eine langanhaltende Vasodilatatorwirkung und eine Fähigkeit, den Vasokonstriktorwirkungen von Substanzen wie Norepinephrin und Angiotensin entgegenzuwirken.
Eine Reihe von Entzündungsmediatoren erhöhen die vaskuläre Durchlässigkeit (das Durchsickern) in den Meinen postkapillaren und Sammelvenen. Zusätzlich ist die Migration von Leukozyten in einen entzündeten Bereich ein wesentlicher Aspekt des Entzündungsvorganges. Während es unwahrscheinlich ist, daß Prostaglandine direkt an der chemotaktischen Reaktion beteiligt sind, ist ein anderes Metabolismusprodukt der Arachidonsäure, Leukotrien, eine hochwirksame chemotaktische Substanz.
Die Antientzündungsreaktion ist jede Reaktion, die durch eine Entzündung wie oben definiert gekennzeichnet ist. Es ist dem Fachmann der Medizin allgemein bekannt, daß die Entzündungsreaktion einen Großteil des körperlichen Unbehagens, d.h. Schmerz und Funktionsverlust, verursacht, das mit verschiedenen Erkrankungen und Verletzungen in Verbindung gebracht wird. Daher ist es eine allgemein übliche medizinische Praxis, pharmakologische Mittel zu verabreichen, die eine Neutralisierung der Entzündungsreaktion bewirken. Mittel mit diesen Eigenschaften werden als Antientzündungsmittel klassifiziert. Antientzündungsmittel werden zur Behandlung eines breiten Spektrums von Leiden verwendet, und dieselben Medikamente werden häufig zur Behandlung verschiedener Erkrankungen eingesetzt. Die Behandlung mit Antientzündungsmitteln ist nicht auf die Erkrankung, sondern häufig auf das Symptom, d.h. die Entzündung, ausgerichtet.
Die antientzündlichen, analgetischen und antipyretischen Medikamente sind eine heterogene Gruppe von Verbindungen, die oft chemisch nicht verwandt sind, aber dennoch gewisse therapeutische Wirkungen und Nebenwirkungen gemeinsam haben. Corticosteroide stellen die am häufigsten verwendete Klasse von Verbindungen für die Behandlung der Antientzündungsreaktion dar. Proteolytische Enzyme stellen eine weitere Klasse von Verbindungen dar, von welchen behauptet wird, daß sie antientzündliche Wirkungen besitzen. Hormone, die direkt oder indirekt bewirken, daß die Nebennierenrinde Steroide produziert und absondert, stellen eine weitere Klasse von Antientzündungsverbindungen dar. Eine Reihe von nichthormonalen Antientzündungsmitteln wurden beschrieben. Von diesen werden am häufigsten Salicylate verwendet. Acetylsalicylsäure oder Aspirin ist das am häufigsten verschriebene analgetisch-antipyretische und antientzündliche Mittel. Beispiele für steroidale und nichtsteroidale Antientzündungsmittel sind in Physician's Desk Reference, 1987 (siehe S. 207 und 208 für einen Index solcher Zubereitungen), aufgelistet.
Die natürlichen und synthetischen Corticosteroidzubereitungen verursachen eine Reihe ernsthafter Nebenwirkungen einschließlich eines Anstieges des Blutdruckes, der Salz- und Wasserretention und einer erhöhten Kalium- und Kalziumexkretion. Ferner können Corticosteroide die Zeichen einer Infektion maskieren und die Verbreitung infektiöser Mikroorganismen verstarken. Diese Hormone werden in der Anwendung bei schwangeren Frauen als nicht sicher erachtet, und eine langfristige Corticosteroidbehandlung wurde mit gastrischer Überaktivität und/oder gastrointestinalem Geschwüren in Verbindung gebracht. Die Behandlung mit diesen Verbindungen kann auch Diabetes mellitus verstarken, wodurch höhere Dosen von Insulin erforderlich sind, und kann psychotische Leiden hervorrufen. Hormonale Antientzündungsmittel, welche die Produktion endogener Corticosteroide indirekt erhöhen, besitzen dasselbe Potential für schädliche Nebenwirkungen.
Die nichthormonalen Antientzündungsmittel sind synthetische biochemische Verbindungen, die bei hohen Dosen mit einem breiten Spektrum unerwünschter Nebenwirkungen toxisch sein können. Zum Beispiel tragen Salicylate zu den ernsthaften Säure-Base-Gleichgewichtsstörungen bei, die eine Vergiftung durch diese Klasse von Verbindungen kennzeichnen. Salicylate stimulieren direkt und indirekt die Respiration. Toxische Dosen von Salicylaten verursachen eine zentrale respiratorische Paralyse wie auch einen Kreislaufkollaps infolge einer vasomotorischen Depression. Die Einnahme von Salicylat kann zu epigastrischen Beschwerden, Ekel und Erbrechen führen. Die salicylatbedingte Magenblutung ist allgemein bekannt. Salicylate können einen Leberschaden verursachen und zu einer Verlängerung der Gerinnungszeit führen. Daher sollte Aspirin bei Patienten mit schwerem Leberschaden, Hypoprothrombinämie, Vitamin K-Mangel oder Hämophilie vermieden werden, da die Hemmung der Plättchenhämostase durch Salicylate zu einer Blutung führen kann. Eine Salicylatvergiftung ist häufig, und mehr als 10000 Fälle einer schweren Salicylatvergiftung werden jährlich in den Vereinigten Staaten beobachtet, von welchen einige fatal sind und viele bei Kindern auftreten. Siehe Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics", 7. Auflage, 1985. Daher besteht trotz der großen Anzahl von Antientzündungsmitteln, die gegenwärtig verfügbar sind, nach wie vor der Bedarf an einem sicheren, wirksamen Antientzündungsprodukt, das frei von Nebenwirkungen und unerwünschten Reaktionen ist.
Wenn ein natürliches Nahrungsmittelprodukt, wie jenes, das zum Beispiel von Milch abgeleitet wird, mit Antientzündungswirkungen erhalten werden könnte, wäre es eine einfach zu verabreichende, sofort verfügbare und sichere therapeutische Zusammensetzung.
Nach dem Stand der Technik ist bekannt, Milchsorten mit einer Vielzahl von therapeutischen Wirkungen herzustellen. Zum Beispiel offenbarte Beck eine Milch, die einen Antikörper zu Streptococcus mutans enthält, der eine den Zahnkaries hemmende Wirkung besitzt (U.S. Patent Nr. 4.324.782). Die Milch wird durch ein zweistufiges Immunisieren einer Kuh mit S. mutans-Antigen und Gewinnung der therapeutischen Milch von dieser erhalten.
Stolle et al. offenbarten ein Verfahren zur Behandlung von Gefäßstörungen oder Lungenleiden, die mit dem Rauchen in Zusammenhang stehen, bei einem Tier, welches die Verabreichung der Milch an das Tier umfaßt, die von einer Kuh erhalten wurde, welche in einem hyperimmunisierten Zustand gehalten wird (U.S. Patent Nr. 4.636.384). Beck offenbarte ein Verfahren zur Behandlung einer Entzündung bei einem Tier, welches das Verabreichen einer antientzündlichen wirksamen Menge von Milch an ein Tier umfaßt, die von einer Kuh erhalten wurde, die in einem Antientzündungsfaktor-produzierenden Zustand gehalten wird (U.S. Patent Nr. 4.284.623). Heinbach, U.S. Patent Nr. 3.128.230, beschrieb eine Milch, die durch Impfen einer Kuh mit antigenen Mischungen Globuline der Alpha-, Beta- und Gamma-Komponenten enthält. Peterson et al. (U.S. Patent Nr. 3.376. 198), Holm (U.S. (veröffentlichte) Anmeldung Seriennr. 628.987), Tunnah et al. (Britisches Patent Nr. 1.211.876) und Biokema S. A. (Britisches Patent Nr. 1.442.283) beschrieben ebenso antikörperhaltige Milcharten.
Keine der obengenannten Literaturstellen offenbart jedoch die Identität der Komponente(n) der therapeutischen Milcharten, welche die gewünschten therapeutischen Wirkungen erzeugen. Zum Beispiel bestehen bei Beck, U.S. Patent Nr. 4.284.623, die Milchprodukte, die als therapeutisches Mittel verwendet werden, entweder aus flüssiger Vollmilch, flüssiger fettfreier Molke oder Vollmilchpulver. Obwohl jedes dieser Milchprodukte Antientzündungseigenschaften aufweist, wurden der oder die Faktoren, die tatsächlich den therapeutischen Nutzen bringen, noch nicht isoliert oder identifiziert.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Überlegung des Erfinders, daß ein isoliertes und gereinigtes Antientzündungsprodukt aus Milch zur Behandlung von Antientzündungserkrankungen bei einem Tier besonders nützlich wäre.
In dieser Absicht wurde von dem Erfinder ein Antientzündungsfaktor aus hyperimmuner Rindermilch, der in der Folge Antientzündungsfaktor aus Milch (MAIF) genannt wird, isoliert, teilweise gereinigt und charakterisiert.
Weitere Untersuchungen zeigten, daß dieses Milchprodukt die klinischen Symptome einer Entzündung verhinderte oder milderte. Daher ist die vorliegende Erfindung die Entdeckung, daß ein Antientzündungsfaktor, der aus der Milch von milchproduzierenden Tieren isoliert wird, die zuvor gegen bestimmte polyvalente Antigene hyperimmunisiert wurden, gegen Entzündungszustände wirksam ist, wenn der isolierte und gereinigte Antientzündungsfaktor in einer Menge und unter einem Schema verabreicht wird, das zur Erzeugung von Antientzündungswirkungen ausreicht. Diese Entdeckung ist insbesondere angesichts der Tatsache überraschend, daß der polyvalente Antigenimpfstoff selbst MAIF nicht enthält. Die Isolierung des aktiven Faktors aus Milch von hyperimmunisierten Rindern führte zu der unerwarteten Erkenntnis, daß die MAIF in kleinen Mengen in der Milch von normalen Rindern vorhanden sind. Diese Entdeckung wurde durch die Tatsache verborgen, daß die MAIF-Konzentration in normaler Kuhmilch zu gering ist, um der Milch erkennbare Antientzündungseigenschaften zu verleihen. Der MAIF von normaler Milch kann jedoch durch das Isolierungsverfahren der Erfindung konzentriert werden und danach wirksam zur Behandlung einer Entzündung verwendet werden.
Eine vollständigeres Verständnis der Erfindung und vieler begleitender Vorteile ist durch die nähere Erklärung mit Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung möglich, die in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen gegeben wird, die folgendes zeigen:
Figur 1. Isolierung von MAIF durch Ionenaustauschchromatographie auf einer DEAE-Zellulosesäule in Schritt 2 des bevorzugten Verfahrens.
Figur 2. Fraktionieren des MAIF-Peaks (zweiten) von der DEAE-Zellulosechromatographie (Fig. 1) auf einer Sephadex G-10 Molekularsiebsäule in Schritt 3 des bevorzugten Verfahrens.
Die Erfindung umfaßt die Isolierung und Reinigung von MAIF für den Zweck der Behandlung von Antientzündungserkrankungen.
Unter dem Begriff "Antientzündungsfaktor aus Milch (MAIF)" wird ein Faktor verstanden, der entweder von einer hyperimmunen Milch oder einer normalen Kuhmilch erhalten wird. Unter dem Begriff "im wesentlichen reiner MAIF" wird für den Zweck dieser Erfindung ein Antientzündungsfaktor verstanden, der als einfacher symmetrischer Hauptpeak in der HPLC-Chromatographie nach Entfernung der Substanzen mit hohem Molekulargewicht (> 10000 Dalton) und Isolierung der Spezies mit niederem Molekulargewicht und negativer Ladung durch Ionenaustauschchromatographie eluiert. Es kann sowohl normale Milch als auch hyperimmune Milch durch die hierin beschriebenen Verfahren zur Gewinnung des MAIF verarbeitet werden.
Unter dem Begriff "hyperimmune Milch" wird für den Zweck dieser Erfindung Milch verstanden, die von milchproduzierenden Tieren erhalten wird, die in einem hyperimmunen Zustand gehalten werden, wobei die Einzelheiten zur Hyperimmunisierung in der Folge ausführlicher beschrieben werden.
Unter dem Begriff "Molke" wird für den Zweck dieser Erfindung Milch verstanden, von welcher Rahm und kaseinartiges Material entfernt wurden.
Unter dem Begriff "normale Milch" wird für den Zweck dieser Erfindung Milch verstanden, die von milchproduzierenden Tieren durch herkömmliche Mittel und Molkereipraktiken erhalten wird.
Unter dem Begriff "milchproduzierendes Tier" werden für den Zweck dieser Erfindung Säugetiere verstanden, die Milch in kommerziell geeigneten Mengen produzieren, vorzugsweise Kühe, Schafe und Ziegen, insbesondere Milchkühe der Gattung Bos (Rind), insbesondere jene Rassen, welche die höchsten Milcherträge liefern, wie Holstein.
Unter dem Begriff "bakterielles Antigen" wird für den Zweck dieser Erfindung eine lyophilisierte Zubereitung aus durch Hitze abgetöteten bakteriellen Zellen verstanden.
Unter dem Begriff "mikroeingekapselte Form" werden für den Zweck dieser Erfindung polymere Mikropartikel zur Verabreichung an milchproduzierende Tiere verstanden, die ein oder mehrere bakterielle Antigene einkapseln.
Unter dem Begriff "Entzündung" wird für den Zweck dieser Erfindung eine lokalisierte Abwehrreaktion verstanden, die durch Verletzung oder Zerstörung von Geweben hervorgerufen wird und zur Zerstörung, Verdünnung oder Ablösung sowohl des schädlichen Agens als auch des verletzten Gewebes dient, die in der akuten Form durch die klassische Folge von Schmerz, Wärme, Rötung, Schwellung und Funktionsverlust gekennzeichnet ist und histologisch eine komplexe Serie von Vorfällen umfaßt, einschließlich der Erweiterung der Arteriolen, Kapillaren und kleinen Venen mit erhöhter Durchlässigkeit und erhöhtem Blutstrom, Exsudation von Fluids, ein schließlich der Plasmaproteine und Leukozyten migration in den Entzündungsherd.
Unter dem Begriff "behandeln" wird für den Zweck dieser Erfindung verstanden, daß die Symptome der Erkrankung und/oder der pathogene Ursprung der Erkrankung verbessert oder vollständig beseitigt werden.
Unter dem Begriff "verabreichen" wird für den Zweck dieser Erfindung jede Methode zur Behandlung eines Patienten, wie oral, intranasal, parenteral (intravenös, intramuskulär oder subkutan), mit einer Substanz verstanden.
Unter dem Begriff "Tier" wird für den Zweck dieser Erfindung jedes Lebewesen verstanden, das zu Entzündungen neigt, einschließlich Menschen, Zuchttieren, Haustieren oder Zootieren.
Beispiele für Entzündungszustände, die durch das isolierte und gereinigte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind Zustände, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus akuter und subakuter Bursitis, akuter und nichtspezifischer Tendonitis, systemischer Schmetterlingsflechte, systemischer Dermatomyositis, akuter rheumatischer Karditis, Pemphigus, großblasiger Dermatitis, Herpetiformis, schwerem Erythem, polymorpher Dermatitis exfoliativa, Zirrhose, periodischer Rhinitis vasomotorica, Bronchialasthma, ektopischer Dermatitis, Serumallergie, Keratitis, Ophthalmicus iritis, diffuser Ureitis, Choriditis, Neuritis nervi optici, sympathischer Ophthalmie, symptomatischer Sarkoidose, Leeffler-Syndrom, Berylliose, hämolytischer Anämie, Mastitis, Mastoiditis, Kontaktdermatitis, allergischer Konj unktivitis, psoriatischer Arthritis, ankylosierender Spondylitis, akuter Gichtarthritis und Herpes zoster. Ferner kann das isolierte und gereinigte Milchprodukt zur Behandlung von Patienten verwendet werden, die potentiellen Entzündungserregern ausgesetzt werden.
Die Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, daß wenn ein milchproduzierendes Tier wie ein Rind in einen bestimmten Hyperimmunisierungszustand gebracht wird, das Tier Milch produziert, die supranormale Werte des äußerst nützlichen MAIF aufweist, welcher MAIF nicht nur die Symptome der Entzündung beim Menschen und anderen Tieren unterdrückt, sondern auch ein prophylaktisches Mittel in der Vorwegnahme der Gegenwart von Entzündungserregern beim Empfänger darstellt. Unter dem Begriff "supranormale Werte" werden Werte verstanden, die über jenen liegen, die in der Milch von nicht hyperimmunisierten Tieren gefunden werden. Die Herbeiführung eines Immunsensitivität alleine ist nicht ausreichend, um das Auftreten von supranormaien Werten von MAIF in Milch zu verursachen, wie durch die Tatsache gezeigt wird, daß normale Kuhmilch diese supranormalen Werte nicht aufweist, selbst wenn die Kühe während der normalen Immunisierung gegen Kuherkrankungen und während der normalen Umweltbelastung gegen verschiedene Antigene sensitiviert werden. Nur in bestimmten hyperimmunen Zuständen weist die Milch die gewünschten supranormaien Werte auf.
Dieser bestimmte Zustand kann durch Verabreichung einer anfänglichen Immunisierung, auf welche periodische Auffrischungen mit ausreichend hohen Dosen der spezifischen Antigene folgen, erzielt werden. Die bevorzugte Dosierung der Auffrischung sollte gleich oder größer 50% der Dosierung sein, die zur Erzeugung der primären Immunisierung des Rindes erforderlich ist. Daher gibt eine Auffrischungsgrenzdosierung, unter welcher die Eigenschaften nicht in der Milch erzeugt werden, selbst wenn sich die Kuh in einem Zustand befindet, der normalerweise als immun bezeichnet wird. Zur Erzielung des erforderlichen hyperimmunen Zustandes ist es wesentlich, die hyperimmune Milch nach einer ersten Serie von Auffrischungsverabreichungen zu testen. Wenn die nutzbringenden Faktoren in der Milch nicht vorhanden sind, werden zusätzliche Auffrischungen mit höherer Dosierung verabreicht, bis die Eigenschaften in der Milch auftreten.
Das Verfahren zur Herstellung der hyperimmunen Milch, welche die supranormalen MAIF-Werte aufweist, ist in der gleichzeitig anhängigen U.S. Anmeldung, Seriennr. 069.130, eingereicht am 2. Juli 1987, und in der gleichzeitig anhängigen U.S. Anmeldung, Seriennr. 910.297, eingereicht am 17. September 1986, einer Fortsetzung der U.S. Patentanmeldung, Seriennr. 576.001, eingereicht am 1. Februar 1983, offenbart. Zusammenfassend umfaßt ein Verfahren zur Herstellung der hyperimmunen Milch, die supranormale MAIF-Werte aufweist, die folgenden Schritte: (1) Antigenauswahl; (2) primäre Immunisierung des Rindes; (3) Testen des Serums zur Bestätigung der Herbeiführung einer Sensitivität; (4) Hyperimmunisierung mit Auffrischungen in geeigneter Dosierung; und gegebenenfalls (5) Testen der Milch auf Antientzündungseigenschaften; (6) Gewinnen der Milch von dem hyperimmunen Rind; und (7) Verarbeiten der Milch zur Isolierung des MAIF.
Schritt 1: Es können alle Antigene oder Kombinationen von Antigenen verwendet werden. Die Antigene können bakterielle, virale, protozoische, fungale, zelluläre oder alle anderen Substanzen sein, auf welche des Immunsystem des milchproduzierenden Tieres reagiert. Der kritische Punkt in diesem Schritt ist, daß das oder die Antigene imstande sein müssen, nicht nur immune und hyperimmune Zustände bei dem milchproduzierenden Tier hervorzurufen, sondern auch supranormale MAIF-Werte in der Milch zu erzeugen. Es kann jedes Antigen zur Erzeugung supranormaler MAIF-Werte verwendet werden. Ein bevorzugter Impfstoff ist eine Mischung aus polyvalenten bakteriellen Antigenen, die als Serie 100 Impfstoffe bezeichnet werden und in dem folgenden Beispiel 1A ausführlich beschrieben sind.
Schritt 2: Das oder die Antigene können durch jede Methode verabreicht werden, die eine Sensitivierung hervorruft. Bei einer Methode wird ein Impfstoff, der aus einem Antigen besteht, das von 1x10&sup6; bis 1x10²&sup0;, vorzugsweise 10&sup8; bis 10¹&sup0; und insbesondere 2x10&sup8;, durch Hitze abgetöteten Bakterien abgeleitet wird, durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Es können aber auch andere Methoden wie die intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, rektale Zäpfchen oder orale Verabreichung verwendet werden.
Schritt 3: Es muß bestimmt werden, ob das milchproduzierende Tier gegenüber dem Antigen sensitiviert wurde. Es gibt eine Reihe von Verfahren, die dem Fachmann im Bereich der Immunologie bekannt sind, um die Sensitivierung zu testen (Methods in Immunology and Immunochemistry, William, C.A., und Chase, W.M. Academic Press, New York, Bd. 1-5 (1975)). Das bevorzugte Verfahren ist die Verwendung eines polyvalenten Impfstoffes, der zahlreiche Bakterienarten umfaßt, als Antigen und das Testen auf die Gegenwart von agglutinierenden Antikörpern im Serum des Tieres vor und nach der Impfstoffexposition. Das Auftreten von Milchantikörpern nach der Immunisierung mit dem Impfstoff weist auf eine Sensitivierung hin; zu diesem Zeitpunkt kann mit Schritt 4 fortgefahren werden.
Schritt 4: Dieser umfaßt das Herbeiführen und Aufrechterhalten des hyperimmunen Zustandes bei dem sensitivierten Tier. Dies wird durch wiederholte Verabreichungen von Auffrischungen desselben polyvalenten Impfstoffes in bestimmten Zeitabständen erzielt, der zur Erzielung der primären Sensitivierung verwendet wurde. Ein zweiwöchiger Auffrischungsabstand ist für polyvalente bakterielle Antigene optimal. Es ist jedoch notwendig zu gewährleisten, daß das Tier nicht von einem hyperimmunen Zustand in einen Zustand der Immuntoleranz gegenüber dem Antigen übergeht.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die Hyperimmunisierung von Rindern durch eine einfache Verabreichung eines mikroeingekapselten Impfstoffes erzielt werden, der wie ausführlich im folgenden Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde. Der Vorteil der kontrollierten Freisetzungsform der Hyperimmunisierung besteht darin, daß die konstante Antigenexposition garantiert, daß das Tier in dem hyperimmunen Zustand bleibt.
In einem anderen Ausführungsbeispiel ist es auch möglich, verschiedene Immunisierungsverfahren zu kombinieren, wie zum Beispiel die gleichzeitige Verabreichung eines mikroeingekapselten und flüssigen Antigens oder die intramuskuläre Injektion zur primären Immunisierung und Auffrischungsdosen durch orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung durch Mikroeinkapselungsmittel. Dem Fach mann sind viele verschiedene Kombinationen der Primär- und Hyperimmunisierung bekannt.
Schritt 5: Die Milch muß auf Antientzündungsaktivitätswerte getestet werden. Dies kann durch jede Untersuchungstechnik erfolgen, welche die Wirkungen entweder der hyperimmunen Milch oder der davon abgeleiteten Produkte auf die Entzündung testet. Eine chemisch herbeigeführte Entzündung der Rattenpfote ist ein Standardtest für Antientzündungsmittel.
Schritt 6: Dieser umfaßt die Gewinnung und Verarbeitung der Milch. Die Milch kann durch herkömmliche Methoden gewonnen werden. Die Verarbeitung der Milch zur Isolierung des MAIF wird in der Folge beschrieben.
Das einfachste Verfahren zur Isolierung, Reinigung und Testung des MAIF umfaßt die folgenden Schritte:
1. Entfetten der hyperimmunen Milch zur Erzeugung von Magermilch;
2. Entfernen des Kaseins von der Magermilch zur Herstellung von Molke;
3. Entfernen von Makromolekülen aus der Molke, mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10000 Dalton durch Ultrafiltration;
4. Fraktionieren des Produktes aus Schritt 3 mit einer Ionenaustauschharzsäule zur Isolierung einer negativ geladenen MAIF-Spezies mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10000 Dalton;
5. Abtrennen der negativ geladenen Spezies von Schritt 4 durch Molekularsiebchromatographie; und
6. Biologische Testung des MAIF von Schritt 5.
7. Die Antientzündungswirkung des Milchfaktors wird bei Ödemen getestet, die durch Injektion einer Carrageenlösung in die Pfote von Ratten verursacht wird. Der Rattenpfotentest ist ein standardmäßiger Tiertest für Antientzündungsmittel. Winter, C.A., Risley, G.A., Nuss, A.W., "Carrageenan-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs," Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3:544 (1967). Eine Reihe von anderen Tests kann verwendet werden. Wetnick, A.S., und Sabin, C., "The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis in Rats," Jap. J. Pharm. 22:741(1972). Der Rattenpfotentest ist jedoch der einfachste und direkt verfügbare Test und hat sich bei allen Antientzündungsmitteln als zufriedenstellend erwiesen. Dieser Test wurde ausführlich von Beck, U.S. Patent 4.284.623, beschrieben. Kurz gesagt, umfaßt der Test die Injektion einer kleinen Menge von Carrageen in den Fußballen von erwachsenen weißen Ratten. Es ist bekannt, daß dadurch eine Entzündungsreaktion hervorgerufen wird. Das resultierende Schwellungsmaß kann quantitativ bestimmt werden. Proben, die einen AF enthalten, werden der Ratte über einen geeigneten Weg verabreicht, vorzugsweise durch intraperitoneale Injektion, und die Blockierung oder Verbesserung des Entzündungsprozesses wird entweder durch volumetrische oder gravimetrische Methoden bestimmt.
Zusammenfassend kann der Antientzündungsfaktor von hyperimmunisierter Milch durch ein Verfahren zur Entfettung der Milch, Entfernen des Kaseins, Entfernen von Makromolekülen mit mehr als 10000 Daiton und anschließende Ionenaustausch- und Molekularsiebchromatographie isoliert werden. Die biologische Aktivität von geeigneten Zubereitungen des Antientzündungsfaktors kann durch Ausführung eines Dosis-Reaktions-Experiments bei Ratten wie hierin beschrieben getestet werden.
Die Erfindung beruht teilweise auf der unerwarteten Entdeckung, daß ein MAIF isoliert und gereinigt werden kann und in der Behandlung einer Reihe von Entzündungsprozessen bei Menschen und Tieren wirksam ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird der MAIF durch Hyperimmunisierung eines milchproduzierenden Tieres gegen einen bakteriellen Antigenimpfstoff erzeugt. Der Impfstoff, der zur Hyperimmunisierung der Tiere verwendet wird, enthält keine Antientzündungsaktivität. Es ist daher überraschend, daß die Behandlung mit einem isolierten und gereinigten Faktor, der von Tieren erhalten wird, die gegen einen gemischten bakteriellen Antigenimpfstoff immunisiert sind, bei der Linderung oder Beseitigung von Entzündungsprozessen wirksam ist.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird diese mit Bezugnahme auf bestimmte besondere Beispiele näher erläutert, die hierin nur zum Zwecke der Erklärung angeführt sind.

HERSTELLUNG VON MILCH

Beispiel 1A

Herstellung des S-100 Impfstoffes

Eine Bakterienkultur, die das in der folgenden Tabelle 1 dargestellte Bakterienspektrum enthält, das von der American Type Culture Collection erhalten wurde, wurde mit 15 ml Medium rekonstituiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Sobald ein gutes Wachstum erzielt worden war, wurde etwa die Hälfte der bakteriellen Suspension zur Inokulierung eines Liters einer Nährbouillon verwendet, wobei das Inokulat bei 37ºC inkubiert wurde. Die übrige Suspension wurde in sterile Glykolröhrchen überführt und bei -20ºC bis zu sechs Monate gelagert.
Nachdem in der Kultur ein gutes Wachstum sichtbar geworden war, wurden die bakteriellen Zellen durch Zentrifugation der Suspension über 20 Minuten zur Entfernung des Mediums gewonnen. Das erhaltene bakterielle Pellet wurde in steriler Kochsalzlösung resuspendiert, und die bakterielle Probe wurde dreimal zum Abwaschen des Mediums von den Zellen zentrifugiert. Nach der dritten Waschung mit steriler Kochsalzlösung wurde das bakterielle Pellet, das nach der Zentrifugation erhalten wurde, in einer geringen Menge von doppeltdestilliertem Wasser resuspendiert.
Die medienfreie Bakteriensuspension wurde durch Einbringen der Suspension in einen Glaskolben in einem 80ºC Wasserbad über Nacht durch Hitze abgetötet. Die Lebensfähigkeit der Bouillonkultur wurde mit einer geringen Menge der durch Hitze abgetöteten Bakterien getestet. Die Bouillon wurde mit durch Hitze abgetöteten Bakterien inokuliert, bei 37ºC fünf Tage inkubiert und täglich auf ein Wachstum überprüft, da die Bakterien zur Verwendung in dem Impfstoff abgetötet sein müssen.
Die durch Hitze abgetöteten Bakterien wurden bis zur Trocknung lyophilisiert. Die trockenen Bakterien wurden dann mit steriler Kochsalzlösung zu einer Konzentration von 2,2x10&sup8; bakteriellen Zellen/ml Kochsalzlösung (1,0 optische Dichte, abgelesen bei 660 nm). Tabelle 1 S-100 Bakterienliste Bezeichnung Medien Gram-+ od.Staph. aureus Staph. epidermidis Strep. pyogenes Aerobacter aerogenes Escherichia coli Salmonella enteritidis Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Haemophilus influenzae Strep. mitis Proteus vulgaris Shigella dysenteriae Diplococcus pneumoniae Propionibacter acnes Antinomyces (anaerob) Strep. sanguis Strep. salivarius Strep. mutans Strep. agalactiae Bouillon
Kühe erhielten tägliche Injektionen von 5 ml Proben des polyvalenten flüssigen Impfstoffes. Die Antikörper- (IGG-) Titerwerte für die injizierten Rinder wurden periodisch unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunassays für Rinderantikörper gegen das polyvalente Antigens bestimmt.

Beispiel 1B

Durch Hitze abgetötete Bakterien wurden auf die zuvor beschriebene Weise hergestellt. Die erhaltene polyvalente Antigenprobe (S-100) wurde durch ein herkömmliches Phasen trennverfahren mikroeingekapselt, um ein Mikropartikelprodukt zu erhalten, das ein polyvalentes Antigen enthält. Im allgemeinen werden die antigenhaltigen geformten Matrixmaterialien aus Polymeren eines bicompatiblen Materials hergestellt, vorzugsweise aus biologisch abbaubaren oder biologisch erodierbaren Materialien, vorzugsweise aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Copolymeren der Milch- und Glykolsäuren, Polycaptolakton, Copolyoxalaten, Proteinen wie Collagen, Fettsäureestern von Glycerin und Zelluloseestern. Diese Polymere sind in der Wissenschaft gut bekannt und sind zum Beispiel in U.S. 3.773.919; U.S. 3.887.699; U.S. 4.118.470; U.S. 4.076.798 beschrieben. Das verwendete polymere Matrixmaterial war ein biologisch abbaubares Lactid-Glycolid-Copolymer.
Durch Hitze abgetötete bakterielle Antigene werden in solchen Matrixmaterialien vorzugsweise als Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 1-500 um, vorzugsweise 10-250 um, eingekapselt. Die Einkapselungsverfahren sind konventionell und umfassen Phasentrennmethoden, Grenzflächenreaktionen und physikalische Methoden. Es können viele Kombinationen von Matrizen und viele Konzentrationen von passend zusammengestellten Antigenen verwendet werden, um optimale Freisetzungsraten von bakteriellen Antigenen aus Mikropartikeln an den Wirtskörper zu erzielen. Diese Kombinationen können ohne unnötige Experimente vom Fachmann bestimmt werden.
Die Mikropartikel in dem Beispiel wiesen einen geringeren Durchmesser als 250 um auf. Etwa 750 mg Mikropartikel, die 22% (16,5 mg) polyvalentes Antigen enthielten, wurden dann in etwa 3 ml eines Trägers (1 Gew.-% Tween 20 und 2 Gew.-% Carboxymethylcellulose in Wasser) suspendiert.
Aus einer großen Rinderherde wurde eine kleine Rindergruppe ausgewählt. Fünf dieser nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Rinder wurden als Kontrollen bestimmt. Vier Rinder erhielten intramuskuläre Injektionen mit Mikropartikeln, welche polyvalentes Antigen enthielten. Mikropartikelproben wurden mit 2,0 mRad Gammastrahlung sterilisiert. Antikörper- (IgG-) Titerwerte wurden periodisch in Proben der Kuhmilch bestimmt, die von dem beimpften Kühen wie auch von den Kontrollkühen erhalten wurde.

Beispiel 2

Isolierung des MAIF-Faktors aus hyperimmunisierter Milch

Schritt 1: Herstellung des Milchfiltrates

Zwanzig Liter frische Milch von hyperimmunisierten Kühen wurden zur Entfernung des Fettes durch eine Entrahmungszentrifuge (Delaval Modell 102) laufen gelassen.
Die erhaltenen sechzehn Liter Magermilch wurden zur Entfernung der Spezies mit hohem Molekulargewicht (mehr als 10000 Dalton) unter Verwendung eines HohlfaserdiafiltrationlKonzentrator (Amicon DL-10L) ultrafiltriert. Der Konzentrator ist mit zwei 10000 Dalton-Abscheidepatronen (Amicon H&sub5;P&sub1;&sub0;&submin;&sub4;&sub3;) ausgestattet. Die Magermilch wurde bei einer Pumpengeschwindigkeit von 80 auf der Meßvorrichtung und einem Einlaß- und Auslaßdruck von 2,07x10&sup5; Pa (30 psi) bzw. 1,72x10&sup5; (25 psi) laufen gelassen.
Zwölf Liter des Filtrates ((10000 Dalton), die aus den Patronen mit einer Fließgeschwindigkeit von vier Liter pro Stunde liefen, wurden zur Lagerung und weiteren Reinigung gefroren oder lyophilisiert.

Schritt 2: Ionenaustauschchromatographie

Der Antientzündungsfaktor aus Milch, MAIF, in dem Filtrat wurde zunächst mit einer Anionenaustauschchromatographiesäule isoliert.
Bei diesem Vorgang wurde DEAE-Sepharose CL-6B Gel (Pharmacia) verwendet, um eine 5x10 cm Glassäule zu packen, die mit sterilem, doppeltdestillierten Wasser, pH 7,0, äquilibriert war.
Ein Liter Filtrat (< 10000) wurde in die Säule eingebracht und mit sterilem, doppeltdestillierten Wasser, pH 7,0, bei einer Fließgeschwindigkeit von 160 ml pro Stunde eluiert. Es wurden zehn Milliliter Fraktionen gewonnen und bei 280 nm in einem LKB Uvicord 4700 Absorptiometer aufgezeichnet, wobei die optische Dichte auf einem angeschlossenen Schreiber (Pharmacia REC-482) ausgedruckt wurde.
Die von MAIF unterschiedlichen Substanzen mit positiven und neutralen Ladungen sind nicht an das DEAE-Sepharose-Gel gebunden. Sie werden an dem Fallpeak (ersten Peak) eluiert. Der MAIF, der eine negative Ladung aufweist, wird von dem Gel gehalten.
Zur Entladung des MAIF wurde die Säule mit einem stufenweisen Gradienten unter Verwendung steriler physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,0, eluiert. Ein typisches Profil ist in Figur 1 dargestellt. Ein Biotest der einzelnen Fraktionen zeigte, daß der zweite Peak den MAIF enthält. Fraktionen, welche den zweiten Peak und seine Schulter enthalten, werden zur weiteren Reinigung verwendet. Gewinnungsstudien zeigen, daß durch dieses Verfahren 8,8 Gramm getrocknetes Pulver erhalten wurden.

Schritt 3: Gelfitrationschromatographie

Der zweite Peak, der in Schritt 2 erhalten wurde, enthält MAIF und andere negativ geladene Moleküle; daher war ein zusätzlicher Reinigungsschritt erforderlich. Zur Erzielung einer weiteren Reinigung ist es angemessen, eine Gelfiltrationssäule zur Trennung verschiedener Komponenten auf der Basis des Molekulargewichts zu verwenden.
In diesem Verfahren wurde Sephadex G-10 Harz (Pharmacia) in eine 2,5x80 cm Glassäule gepackt und mit sterilem, doppeltdestillierten Wasser, pH 7,0, äquilibriert. Zwei Gramm der zweiten Fraktion aus Schritt 2 wurden in sterilem, doppeltdestillierten Wasser aufgelöst und auf den Säulenkopf aufgebracht. Die Säule wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde eluiert. Es wurden Fraktionen (3,3 ml) gesammelt und bei 254 nm und 280 nm (Pharmacia Duo Optical Unit) aufgezeichnet, wobei die optische Dichte auf einem angeschlossenen Schreiber (Pharmacia REC-482) ausgedruckt wurde. üblicherweise zeigten sich 3 Peaks in dem Elutionsprofil, wie in Figur 2 dargestellt ist. Der erste und zweite Peak enthielten MAIF-Aktivität.
Der erste Peak ist ein Aggregat, das sich auf der G-10 Säule bildet, welches den aktiven MAIF enthält.
Der zweite Peak enthält die nichtaggregierte Form des MAIF. Sowohl die Aggregatform (Peak 1) als auch die nichtaggregierte Form (Peak 2) sind in dem Ratten-Biotest biologisch aktiv.

CHARAKTERISIERUNG DES ANTIENTZÜNDUNGSFAKTORS AUS MILCH

Das Molekulargewicht der nichtaggregierten Form des MAIF, wie durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt, erwies sich als geringer als 10000 Dalton. Dies wurde von der Tatsache abgeleitet, daß der erste Schritt in der Isolierung des MAIF von Molke durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran erfolgte, die den Durchgang einer Molekulargewichtspezies > 10000 Dalton nicht ermöglichte.
Der MAIF besitzt eine negative Ladung. Dies wurde durch Aufbringen eines Milchultrafiltrates auf eine DEAE-Cellulose-Ionenaustauschsäuie bestimmt. Der MAIF eluiert nicht von der Säule mit Wasser. Die Änderung des Elutionsmediums zu Natriumchlorid (0,9% pH) führte zu der Elution mehrerer Peaks (Fig. 1). Spezien mit neutraler und positiver Ladung haften nicht an dem Ionenaustauschharz, und Spezies mit negativer Ladung werden durch Erhöhung der Salzkonzentration eluiert. Wenn das Permeat mit einem geringeren Molekulargewicht als 10000 Dalton auf die DEAE-Säule aufgebracht wurde, eluierten neutrale Salze und Zucker mit Wasser (Peak 1, Fig. 1). Drei verschiedene Peaks eluierten, wenn der Puffer zu Kochsalz geändert wurde (Peaks 2-4). Der zweite Peak und seine Schulter enthielten in dem Rattentest biologische MAIF-Aktivität. Es wird daher der Schluß gezogen, daß der MAIF eine negative Ladung besitzt.
Eine weitere chemische Eigenschaft des MAIF ist, daß er während des Verfahrens der Salzentfernung ein Aggregat bildet. Diese Eigenschaft wird offensichtlich, wenn ein Permeat mit einem Molekulargewicht von < 10000 Dalton über eine Sephadex G-10-Säule laufen gelassen, mit doppeltdestilliertem Wasser äquilibriert und mit Wasser bei einem ph von 7,0 eluiert wurde (Fig. 2). Drei Peaks eluierten von der G-10 Säule; der erste Peak eluierte mit dem Ruheinhalt, was auf ein Molekulargewicht gleich oder größer 10000 Dalton schließen läßt. Dies war unerwartet, da Moleküle mit mehr als 10000 Dalton zuvor durch Ultraflltration aus dieser Probe entfernt worden waren. Der zweite Peak eluierte in der für den Antientzündungsfaktor erwarteten Position. Sowohl der erste als auch der zweite Peak wiesen eine biologische Antientzündungsaktivität in dem Rattenpfotentest auf, während dem dritten Peak die Aktivität fehlte. Es war überraschend festzustellen, daß sowohl der erste als auch der zweite Peak eine biologische Antientzündungsaktivität aufwiesen. Das Material, das aus dem ersten Peak der G-10 Säule (Schritt 3) gewonnen wurde, wurde lyophilisiert und auf eine G-100 Säule aufgebracht; ein einziger Peak wurde mit dem Ruheinhalt eluiert, was auf ein Moiekulargewicht von 100000 Dalton oder mehr schließen läßt. Die G-10 Säule aus Schritt 3 entfernt Salz und trennt gleichzeitig die verschiedenen Molekulargewichtspezies. Es wird daher der Schluß gezogen, daß während des Durchganges durch die G-10 Säule und der daraus erzielten Salzentfernung der gebildete Antientzündungsfaktor ein Aggregat mit hohem Molekulargewicht formt. Das Ausmaß der Aggregierung schwankte mit der Salzkonzentration.
Die Eigenschaft der Aggregierung läßt auf die Möglichkeit schließen, daß ein breites Spektrum von Spezies mit verschiedenen Molekulargewichten gebildet werden kann, die eine biologische Antientzündungsaktivität aufgrund der Gegenwart des Antientzündungsfaktors aufweisen. Die Entdeckung dieser Eigenschaft läßt auf die Möglichkeit schließen, Antientzündungsfaktoren aus Milch herzustellen, die ein breites Spektrum verschiedener biochemischer Eigenschaften aufweisen, abhängig von dem Ausmaß der Aggregierung des Endproduktes. Zum Beispiel könnten Formulierungen mit längeren oder kürzeren biologischen Halbwertszeiten unter Verwendung von Aggregaten mit größerem oder kleinerem Molekulargewicht mit einer Molekulargewichtsverteilung, die während der Verarbeitung durch die Salzkonzentration reguliert wird, hergestellt werden. Das hierin beschriebene Säulenchromatographieverfahren ergibt eine Spezies mit dem kleinsten erzielten Molekulargewicht, die eine biologische Aktivität aufweist (d.h., Peak 2 von der G-10 Säule aus Schritt 3). Diese Beobachtung legt auch die Verwendung anderer Methoden zur Bildung der Aggregate nahe. Zum Beispiel bewirkt eine Verdünnung in Wasser das Eintreten der Aggregation. Chemische Mittel, die Salze binden, insbesondere Kalzium, können die Bildung der Aggregate verursachen. Mit dieser Entdeckung sind für den Fachmann andere Verfahren zur Bildung der Aggregate und Abtrennung des MAIF offensichtlich.

Beispiel 3

Test auf biologische Aktivität

Die Antientzündungswirkung des MAIF wurde bei Ödemen getestet, die durch Injektion einer Carrageen-Lösung in die Fußballen von Ratten verursacht worden waren. Eine lyophilisierte Probe des MAIF wurde in dem geeigneten Träger aufgelöst und den Versuchsratten intraperitoneal gegeben. Das Carrageen wurde dann den Ratten in einer Menge von 0,1 ml einer 1 % Kochsalzlösung in jeden hinteren Fußballen verabreicht. Die Fußballen wurden unter Verwendung eines Dickenmeßgerätes vor Verabreichung der Injektionen und 2,5 Stunden nach den Injektionen vermessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und 3 dargestellt.
Die nichtaggregierte Form des MAIF (Peak 2 von der G-10 Säule) von der Kontroll- und hyperimmunen Milch bewirkte eine Verringerung der Entzündung der Rattenpfote bei Dosen zwischen 1 mg und 0,25 mg (Tabelle 2). Sowohl die hyperimmune Milch als auch die normale Milch zeigten Aktivität; das hyperimmune Material war jedoch wirksamer. Wir schlossen daraus, daß der MAIF in der Milch von hyperimmunen Kühen in größerer Konzentration vorliegt.
Der zweite Peak von der DEAE-Säule zeigte eine Aktivität sowohl bei der Isolierung von hyperimmuner Milch als auch von normaler Milch. Die Aktivität ist bei der hyperimmunen Milch im wesentlichen größer (Tabelle 3).
Der erste Peak von der G-10 Säule, der die aggregierte Form des MAIF dargestellt, zeigte in den Rattenpfotentests Aktivität (Tabelle 2). Die aggregierte Form ist jedoch nicht so wirksam wie die nichtaggregierte Form auf derselben Gewichtsbasis.
Aus diesen Studien wird geschlossen, daß der MAIF-Faktor in Kuhmilch von Natur aus vorkommt. Die Hyperimmunisierung der Kühe bewirkt eine höhere Konzentration von MAIF in der Milch. Der MAIF ist ein kleines, negativ geladenes Molekül, das durch eine Reihe von Verfahren von der Milch abgetrennt werden kann. Der MAIF-Faktor kann Aggregate mit großem Molekulargewicht bilden, die normalerweise in Milch nicht vorkommen, aber sich während der Verarbeitung bilden. TABELLE 2 WIRKUNG DES ANTIENTZÜNDUNGSFAKTORS AUS MILCH (MAIF) AUF DIE VERRINGERUNG DER ENTZÜNDUNG BEI RATTEN Hergestellt aus hyperimmuner Milch Fußballenmessungen (mm) MAIF-DOSIERUNG Vor der Injektion 2,5 Std nach Injektion Unterschied % Entzündung Ratte Ratte Kontrolle/Kochsalz Hergestellt aus normaler Milch TABELLE 3 VERGLEICH VON HALBGEREINIGTEN FRAKTIONEN VON MAIF IN DER VERRINGERUNG EINER ENTZÜNDUNG BEI RATTEN (hergestellt aus hyperimmuner und normaler Milch) Fußballenmessungen (mm) Vor der Injektion 2,5 Std nach Injektion Unterschied % Entzündung DEAE-Säule Zweiter Peak hyperimmune Milch 2 mg/Ratte DEAE-Säule Zweiter Peak normale Milch 2mg/Ratte G-10 Säule Erster Peak 2 mg/Ratte Kontrolle/Kochsalz
Proben des Antientzündungsfaktors wurden chemisch analysiert. MAIF weist eine nichtkristalline Struktur auf, wie durch Röntgendiffraktionsstudien bestimmt wurde. MAIF-Zubereitungen ergaben eine Elementanalyse, die mit einer Kohlenhydratzusammensetzung übereinstimmt. Die C, H, O Anteile stimmten mit einem polymeren oder oligomeren Material überein, wobei einige Carbinolgruppen zu Carboxyl oxidiert sind. Der leichte Überschuß von Kalziumäquivalenten gegenüber Chloridionen kann teilweise als Carboxylatsalze erklärt werden. Der Rest können Natrium- oder Kaliumsalze sein. Das Schmelzverhalten oder vielmehr das Nichtschmelzverhalten ließ auf salzähnliche Zusammensetzungen und/oder Zusammensetzungen mit hohem Molekulargewicht schließen. Das Material im gegenwärtigen Reinheitszustand enthält offensichtlich eine variable Menge an Kalzium- und Chloridsalzen, wahrscheinlich CaCl&sub2;.
Keine Zubereitung enthielt eine signifikante Menge an Stickstoff, wodurch jede Peptidkomponente in ihrer Zusammensetzung ausgeschlossen wird. Ebenso kann das Fehlen des Stickstoffes die Gegenwart von Aminzuckern und anderen stickstoffhaltigen Materialien wie verschiedener komplexer Lipide als Hauptkomponente(n) ausschließen.
Pyrolytische Massenspektra zeigten signifikante Spuren von Fettsäuren mit 18 Kohlenstoffen. Diese Tatsache läßt in Verbindung mit Spuren von N und P auf die Gegenwart eines komplexen Lipids in dem Faktor schließen.
Die Infrarotspektroskopie zeigte Absorptionen, die mit Carbinol- und Carboxylatfunktionalitäten übereinstimmten. Ultraviolettspektroskopie, Spektroskopie im sichtbaren Bereich und fluoreszierende Spektroskopie ergaben keine signifikante Menge an Chromophoren über jener, die durch Infrarot angezeigt wurde.
Die chemischen Tests stimmten mit einem oligomeren Kohlenhydrat überein, wobei die Carbonylfunktion (Aldehyd oder Keton) in den Untereinheitenverknüpfungen gebunden ist. Das oligomere Kohlenhydrat enthält auch eine gewisse Seitenkettenoxidation zu Carboxylat.
Die MAIF-Zubereitung ist im wesentlichen, aber nicht vollständig rein.

Claims

1. Antientzündungsfaktor in im wesentlichen reiner Form, herstellbar durch ein Verfahren, welches folgendes umfaßt:

(i) Entfernen des Fettes von der Milch eines milchproduzierenden Tieres zur Erzeugung von Magermilch;

(ii) Entfernen des Kaseins von der Magermilch zur Herstellung von Molke;

(iii) Entfernen von Makromolekülen aus der Molke, mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10000 Dalton;

(iv) Fraktionieren des Produktes mit geringem Molekulargewicht aus dem vorangehenden Schritt durch Ionenaustauschchromatographie;

(v) weiteres Reinigen des Antientzündungsfaktors aus dem vorangehenden Schritt durch Molekularsiebchromatographie; und

(vi) Isolieren des Antientzündungsfaktors.

2. Antientzündungsfaktor nach Anspruch 1, wobei das milchproduzierende Tier ein Rind oder Schaf ist.

3. Antientzündungsfaktor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das milchproduzierende Tier in einem hyperimmunisierten Zustand ist, der zum Beispiel durch (beispielsweise orale oder parenterale) Verabreichung einer polyvalenten Mischung aus bakteriellen Antigenen herbeigeführt werden kann, umfassend: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Streptococcus pyogenes, A. Typ 1; Streptococcus pyogenes, A. Typ 3; Streptococcus pyogenes, A. Typ 5; Streptococcus pyogenes, A. Typ 8; Streptococcus pyogenes, A. Typ 12; Streptococcus pyogenes, A. Typ 14; Streptococcus pyogenes, A. Typ 18; Streptococcus pyogenes, A. Typ 22; Aerobacter aerogenes; Escherichia coli, Salmonella enteriditis; Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae; Salmonella typhimurium; Haemo hilus influenzae; Streptococcus mitis; Proteus vulgaris; Shigella dysenteriae; Diplococcus pneu moniae; Proprionibacter acnes; Actinomyces (anaerob); Streptococcus sanguis; Streptococcus salivarius; Streptococcus mutans; oder Streptococcus agalactiae.

4. Antientzündungsfaktor nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei die Entfernung der Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10000 Dalton durch (1) Ultrafiitration der Molke durch eine Molekularsiebmembran, das die Moleküle von etwa 10000 Dalton zurückhält, und/oder (2) Molekularsiebchromatographie erfolgt.

5. Antientzündungsfaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einem relativen Moiekulargewicht zwischen 0 und etwa 10000 Dalton.

6. Verfahren zur Isolierung eines im wesentlichen reinen Antientzündungsfaktors von Milch, welches Verfahren folgendes umfaßt:

(ii) Entfernen des Kaseins von der Magermilch zur Herstellung von Molke;

(vi) Isolieren des Antientzündungsfaktors.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das milchproduzierende Tier in einem hyperimmunisierten Zustand ist, der zum Beispiel durch (beispielsweise orale oder parenterale) Verabreichung einer Mischung aus bakteriellen Antigenen herbeigeführt werden kann, umfassend: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Streptococcus pyogenes, A. Typ 1; Streptococcus pyogenes, A. Typ 3; Streptococcus pyogenes, A. Typ 5; Streptococcus pyogenes, A. Typ 8; Streptococcus pyogenes, A. Typ 12; Streptococcus pyogenes, A. Typ 14; Streptococcus pyogenes, A. Typ 18; Streptococcus pyogenes, A. Typ 22; Aerobacter aerogenes; Escherichia coli, Salmonella enteriditis; Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae; Salmonella typhimurium; Haemophilus influenzae: Streptococcus mitis; Proteus vulgaris; Shigella dysenteriae; Diplococcus pneumoniae; Proprionibacter acnes; Actinomyces (anaerob); Streptococcus sanguis; Streptococcus salivarius; Streptococcus mutans; oder Streptococcus agalactiae.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Entfernung der Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10000 Dalton durch (1) Ultrafiltration durch eine Molekularsiebmembran, das die Moleküle von etwa 10000 Dalton zurückhält, und/oder (2) Molekularsiebchromatographie erfolgt.

9. Im wesentlichen reiner Antientzündungsfaktor, der von Milch isolierbar ist und ein oligomeres Kohlenhydrat umfaßt.

10. Antientzündungsfaktor nach Anspruch 9, wobei das Kohlenhydrat eines, alle oder irgendeine Kombination der folgenden Merkmale aufweist:

(a) die Carbonylfunktion des Kohlenhydrates in Untereinheitenbindungen gebunden ist;

(b) das Kohlenhydrat eine Seitenkettenoxidation zur Ionencarboxylierung enthält;

(c) das Kohlenhydrat an Kalziumionen komplexiert ist;

(d) das Kohlenhydrat mit einer oder mehreren aliphatischen Säuren komplexiert ist;

(e) das Kohlenhydrat mit einer oder mehreren Stickstoffverbindungen assoziiert ist;

(f) das Kohlenhydrat mit einer oder mehreren Phosphorverbindungen assoziiert ist;

(g) das Kohlenhydrat mit komplexem Lipid assoziiert ist;

(h) dem Kohlenhydrat im wesentlichen eine Schwefelverbindung fehlt.

11. Verwendung eines Antientzündungsfaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 9 und 10 in der Herstellung eines Antientzündungsmittels.

12. Verwendung eines Antientzündungsfaktors nach Anspruch 11 in der Herstellung eines Mittels zur Behandlung oder Prophylaxe von akuter und subakuter Bursitis, akuter und nichtspezifischer Tendonitis, systemischer Schmetterlingsflechte, systemischer Dermatomyositis, akuter rheumatischer Karditis, Pemphigus, großblasiger Dermatitis, Herpetiformis, schwerem Erythem, polymorpher Dermatitis exfoliativa, Zirrhose, periodischer Rhinitis vasomotorica, Bronchialasthma, ektopischer Dermatitis, Serumallergie, Keratitis, Ophthalmicus iritis, diffuser Ureitis, Choriditis, Neuritis nervi optici, sympathischer Ophthalmie, symptomatischer Sarkoidose, Loeffler-Syndrom, Berylliose, hämolytischer Anämie und/oder Mastitis.