TWI454268B

TWI454268B - 乳汁萃取物做為降低過敏反應的用途

Info

Publication number: TWI454268B
Application number: TW097125234A
Authority: TW
Inventors: Bi Fong Lin; Chi Heng Wu; Miaw Ling Chen
Original assignee: Stolle Internat Co Ltd
Priority date: 2008-07-04
Filing date: 2008-07-04
Publication date: 2014-10-01
Also published as: TW201002333A

Description

乳汁萃取物做為降低過敏反應的用途

本發明屬於一種乳汁萃取物做為免疫調節的新用途。更具體來說，本發明係關於一種自超高免疫狀態(hyperimmune)產乳動物之乳汁中萃取而得一乳汁萃取物，其具有能降低過敏反應之難以預見之新用途。

發炎一般被定義為「組織受傷或受破壞時，用來摧毀，稀釋或隔離傷害因子及受傷組織兩者之侷限性保護反應」。蓋一般常見的過敏反應係為上述發炎反應之一支。目前用來處理過敏反應如消炎、鎮痛、解熱，最廣泛被使用為藥物的化合物係類固醇類藥物。另外，水楊酸類化合物則為另一廣用的非類固醇之消炎劑，參考『醫師桌面參考文獻』，1987年(參見第207及208頁之製劑索引)。

然而，不論是天然或人工合成之類固醇製劑皆會引發多種嚴重副作用，包括生長遲緩、骨質疏鬆、血壓升高、水腫、血中離子濃度過低。此外，因類固醇等激素類藥劑具有上述消炎、抗過敏等反應，同時也會使身體本身之先天免疫反應下降，倘若此時有感染性微生物侵入體內而不自知，很容易引起敗血症死亡。再者，蓋此等激素類藥劑並不適宜孕婦使用。由於胎兒發育階段時，母親會分泌多種女性荷爾蒙使其正常發育，倘若施以激素類藥劑，勢必對胎兒發育會造成嚴重干擾。

對於非激素類等水楊酸類消炎劑而言，其副作用包括，呼吸麻痺、體循環衰竭、上腹窘迫、噁心、噁吐、肝損傷、胃出血及凝血時間過長等問題。在先進國家中如美國，每年可見1萬例以上之嚴重水楊酸類消炎劑中毒，造成多人死亡且常見於兒童，參考Goodman及Gilamn之『治療學之藥理基礎』，第七版，1985年。

近年來，順勢療法盛行，傳統的中草藥被用來改善發炎或過敏等症狀的趨勢越來越普遍，然而儘管有一部分人因中草藥而使病症改善，但絕大部分患者之過敏仍舊無法獲得改善。通常，中草藥劑製造商將這絕大部分無法獲得改善或沒有明顯改善之原因歸咎於「不明原因」，然而當我們細細探究此「不明原因」發現，原來「不明原因」中草藥的品質管理通常欠缺一套嚴格的流程，例如不同產地所生產的藥材，其有效性成分會有不同及差異，當一中草藥劑需要混合數種不同草藥時，其有效性成分排列組合後所產生之結果複雜程度想見一斑，是故雖經過嚴格的無菌製程，但其根本成分差異性太大，最終品質之隱憂值得深慮。

以美國專利第09/949610號申請案為例，該發明揭露一種用於鼻炎的醫藥組合物，其包含：麥冬(Tuber Ophiopogon)、半夏(Tuber Pinelliae)、甘草(Radix Glycyrrhizae)與西洋嵾(Radix Pancis Quinquefoli)的水溶液萃取物，以及Herba Tridacis Procumbentis的50%乙醇萃取物。雖然上述萃取物有消炎的效果，但對於過敏的效果仍待進一步研究。然而上述萃取物的消炎效果僅具短期舒緩症狀之能力，其長期療效容易因為草藥品質差異而不易掌握。是故對於具有過敏體質者而言，急需一種不具有副作用及不良反應之安全穩定長期有效的消炎抗過敏產品。

過敏常見的症狀包含呼吸道過敏症，該症是一種免疫球蛋白E(IgE)所媒介之一種過敏反應，參考Brinker刊登於『自然療術期刊』(J.Naturopathic Medicine，1993年，4期，64-68頁)。呼吸道過敏反應主要有兩型：立即過敏免疫反應及過敏性支氣管喘息。立即過敏免疫反應包含過敏性鼻炎，過敏性鼻炎的發生係由抗原與IgE結合於吞噬細胞(macrophage)及嗜鹼性白血球(Basophils)上，造成該等細胞內cAMP減少，進而釋出組織胺等傷害因子。當組織胺結合於受體上時，會引發一連串細胞內訊息傳遞，進而導致血管擴張、毛細血管通透性上升、平滑肌收縮，進而產生鼻塞流鼻水，打噴嚏等症狀。

而過敏性氣喘亦為IgE所媒介之免疫反應，在IgE與抗原結合後，吞噬細胞(macrophage)會分泌組織胺、花生四烯酸(arachidonic acid)之代謝物等，進而使周邊白血球釋出血小板激活因子，此因子將引發強烈的支氣管氣喘現象發生。因此，對於一種天然不具副作用之穩定長期有效且能抑制IgE的抗過敏產品應具有龐大的市場潛力。

本發明之目的係提供一種可緩和過敏症狀之乳汁萃取物，並藉由抑制IgE的方式提供抑制過敏反應之用途。

為達成前述之目的，本發明用來緩和過敏症狀之乳汁萃取物係由下列各步驟之方法產生：首先使產乳動物維持在超高免疫狀態(hyperimmune)；並自產乳動物收集乳汁；去除乳汁中之脂肪而生成脫脂乳；利用巴斯德滅菌法將脫脂乳滅菌後(80℃至70℃之間，加熱10至20秒鐘)；對此脫脂乳進行透析(diafiltration)以除去乳醣而成脫脂乳蛋白；而後蒸除脫脂乳蛋白之水分；以及利用噴霧乾燥器乾燥脫脂乳蛋白，而完成乳汁萃取物。此乳汁萃取物由接下來的活體實驗證實，其具有顯著抑制血液中IgE的濃度之功能，同時令人驚訝的是乳汁萃取物對於生物體本身先天免疫能力沒有明顯抑制或明顯提升之能力，因此本發明就某方面來說，明顯具有先前技術中類固醇藥劑所無之優點卻能達成相同功效。

對於上述乳汁萃取物之乳汁來源係由產乳動物維持在超高免疫狀態(hyperimmune)，在本發明中，產乳動物可自牛、羊或能提供類似大量乳汁動物中選其一；其中為了維持其超高免疫狀態，可利用經口投予產乳動物或注射等類似方式將細菌性抗原導入產乳動物體內。而其中細菌性抗原之多價混合物至少部分包含：沙門氏桿菌(Salmonella enteritidis )；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )；表皮鏈球菌(Streptococcus epidermidis )；A1型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A1 )；A3型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A3 )；A5型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A5 )；A8型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A8 )；A12型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A12 )；A14型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A14 )；A18型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A18 )；A22型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A22 )；產氣桿菌(Aerobacter aerogenes )；大腸桿菌(Escherichia coli )；綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )；肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae )；傷寒桿菌(Salmonella enterica serovar Typhi )；流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )；和緩鏈球菌(streptococcus mitis )；普通變形桿菌(Proteus Vulgaris )；赤痢桿菌(Shigella dysenteriae )；肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae )；粉刺出油酸菌(Propionibacterium acnes )；突變鏈球菌(Streptococcus mutans )或無乳鏈球菌等細菌(Streptococcus agalactiae )其中之一。

本發明之另一目的係提供一種可緩和過敏症狀之乳汁萃取物，其屬於天然萃取物且不具有激素等荷爾蒙因而不會使懷孕婦女之胎兒發育產生干擾，是故不具有生長遲緩、骨質疏鬆、血壓升高、水腫、血中離子濃度過低等類固醇之副作用所產生。產後婦女身體急需調養，此時若發炎並不適合使用水楊酸類消炎劑，因其副作用包含呼吸麻痺、體循環衰竭、上腹窘迫、噁心、噁吐、肝損傷、胃出血及凝血時間過長，其中凝血時間過長對婦女傷害尤大，蓋本發明提供一種緩和過敏症狀之乳汁萃取物且並無上述副作用，是故在某些情況下，本發明的確具有水楊酸類消炎劑所無法達成的功效。

本發明之乳汁萃取物製程方法中，透析方式係為利用可保留約10,000至100,000道爾頓分子的分子篩膜進行超滲透過濾，將乳醣等小分子去除。然而2000至10,000道爾頓分子亦有少許存在於本發明之乳汁萃取物中。在本發明之乳汁萃取物亦包含些許碳水化合物，這些碳水化合物之羰基官能基係繫於次單位鍵聯上，同時這些碳水化合物亦含有側鏈氧化成羧酸根離子或碳水化合物並與鈣離子錯合或是碳水化合物與脂肪族酸錯合，亦發現碳水化合物與含氮化合物結合或碳水化合物與含磷化合物結合或碳水化合物與複合脂質結合以及這些碳水化合物不含實質硫化合物者。

本發明提供一種乳汁萃取物，對免疫失調尤其是抑制血液中免疫球蛋白E(IgE)之產生及降低細胞介白素IL-13、IL-10、IL-1β、IL-4及其他與過敏發炎相關因子TNFα與干擾素IFNγ之分泌等用途具有顯著效果。

以下說明僅為本發明實施例，不應作為本發明範圍之限制。

實施例1：乳汁萃取物之製備

本發明之產乳動物係自下列動物尖額牛(Bos acutifrons )、古埃及牛(Bos aegyptiacus )、大額牛(Bos frontalis )、印度野牛(Bos gaurus )、氂牛(Bos grunniens )、爪哇野牛(Bos javanicus )、平額牛(Bos planifrons )、平牛(Bos primigenius )、林牛(Bos sauveli )、家牛(Bos taurus )、奶牛(Cows)、綿羊(Ovis aries )、加拿大盤羊(Ovis canadensis )、白大角羊(Ovis dalli )、摩弗倫羊(Ovis musimon )、赤盤羊(Ovis orientalis )、赤羊(Ovis vignei )、盤羊(Ovis ammon )及山羊(Capra aegagrus hircus )選其一。在較佳實施例中係以Bos taurus 為較佳實施例之產乳動物(在http：//en.wikipedia.org/wiki/Cow網站中有詳盡的介紹)。

本發明之在超高免疫狀態(hyperimmune)下的產乳動物所分泌之乳汁係本發明之乳汁萃取物的主要原料。而使產乳動物處於超高免疫狀態的步驟如下：

1.選擇抗原：

超高免疫狀態係經由投予包含至少部分下列各者之細菌性抗原之多價混合物所誘生者：沙門氏桿菌；金黃色葡萄球菌；表皮鏈球菌；A1型產膿鏈球菌；A3型產膿鏈球菌；A5型產膿鏈球菌；A8型產膿鏈球菌；A12型產膿鏈球菌；A14型產膿鏈球菌；A18型產膿鏈球菌；A22型產膿鏈球菌；產氣桿菌；大腸桿菌；綠膿桿菌；肺炎桿菌；傷寒桿菌；流行性感冒嗜血桿菌；和緩鏈球菌；普通變形桿菌；赤痢桿菌；肺炎雙球菌；粉刺出油酸菌；突變鏈球菌或無乳鏈球菌。

2.藉由初始免疫使產乳動物(如Bos taurus )產生致敏化反應：

較佳初始免疫(primary immunization)的方法係藉由肌肉注射(intramuscular injection)，然而在不同實施例中，靜脈注射(intravenous injection)、腹膜內注射(Intraperitoneal injection)、口服法(oral administration)、直腸注射法(rectal suppository)等方法，將適當劑量之上述細菌性抗原之多價混合物注射入產乳動物中。

3.藉由產乳動物之血清測試而證實致敏反應：

此步驟是為了證實產乳動物(如Bos taurus )是否產生對於抗原致敏之反應。有許多習知的檢驗方法可以測得是否致敏(如文獻Methods in Immunology and ImmunoChemistry, William, C. A., Chase, W. M. Academic Press, N.Y., London(vols 1-5)(1977))，這些檢驗方法包含皮膚敏感、血清對致敏原敏感、免疫細胞對致敏原敏感等檢驗。如何取決使用何種檢驗方法是由所使用之致敏原決定。本發明中，較佳是使用含多種細菌抗原之多價疫苗去測試產乳動物(如Bos taurus )，分別在疫苗注射前與注射後，血清中抗體凝集(agglutinating)現象。而在致敏後，乳汁抗體表現態可以用來調整不同致敏原之最小適當劑量並用來致敏。

4.引發並維持超高免疫狀態(hyperimmune)：

一旦產乳動物(如Bos taurus )已經顯示致敏，產乳動物(如Bos taurus )之高免疫狀態將反覆於一定適當時間間隔施予上述劑量之致敏原以維持。通常上述時間間隔是由致敏原之特性來決定。不過對於多價細菌致敏原來說適當之時間間隔為兩個禮拜。此外，需要注意的是，要盡量避免引發免疫耐受性(immune tolerance)，因為對於致敏原之免疫耐受性將使產乳動物所分泌之乳汁中不具有抗過敏效用之特性。

為了避免上述免疫耐受性現象發生，可以採用不同之上述致敏化方法，例如初始免疫係用肌肉注射方法，但引發超高免疫狀態(hyperimmune)注射時可用靜脈注射、腹膜內注射、口服法或直腸注射法等其它可提供類似功效之方法來引發超高免疫狀態，藉由上述方法或其混合方法來致敏或引發超高免疫狀態都可大幅減低免疫耐受性發生之可能。

5.測試高免疫狀態乳汁對於支氣管及肺部之改善能力：

在較佳實施例中，兔子及大鼠的組織適合來當實驗組織，在實驗中，使兔子或大鼠食用超高免疫狀態乳汁並當成實驗祖；同時以只餵食一般乳汁之兔子或大鼠當成控制組，經過數周後犧牲這些實驗動物後，其肺部及支氣管部分取出以進行下列實驗：用掃描式電子顯微鏡掃描肺支氣管以觀察是否有內皮細胞損害或有細胞殘骸；並利用穿透式電子顯微鏡進行血管觀察是否有脂肪堆積、內皮細胞退化、脂泡細胞油脂堆積及組織切片分析，例如用Oil Red或Sudan Black當成oil-soluble dye來處理冷凍切片組織，或是針對細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)免疫染色來證實是否有吞噬細胞作用發生，並觀察是否有嗜中性白血球或其他白血球滲透入肺組織中。

6.收集及處理超高免疫狀態(hyperimmune)乳汁：

乳汁藉由傳統方法收集後被分開保存，必須注意乳汁中對於抗過敏的有效成分的保留而維持溫度5℃至20℃，較佳為9℃至12℃保存12至36小時，較佳為20至28小時。一般來說乳汁中有效成分通常會因熱失去活性(heat sensitive)，因此較佳係採用低溫巴斯德滅菌法溫度控制在73℃至65℃之間，持續時間約20秒到10秒之間，後降溫3℃至15℃之間，較佳為6℃至10℃之間。一般係採用脫脂標準程序(此時約40℃至60℃之間，較佳為52℃至56℃)將乳汁中的脂肪(cream)移除後，始利用低溫巴斯德滅菌法(如前述)將脫脂乳滅菌，才再利用超滲透過濾方式(ultrafiltration)將1千至10萬道爾頓以內的分子保留，較佳係以2千至10萬道爾頓以內的分子保留，最佳係保留5千道爾頓以上的分子並將其餘成分去除，利用噴霧乾燥器乾燥此脫脂乳。並使用習知噴霧乾燥法利用真空(此時約80℃至50℃，較佳為70℃至60℃)將此脫脂乳的有效成分在低溫中被保存(參考Kosikowski,F.,“Cheese and Fermented Milk Products,”2d Ed,1977)，最後有效成分能被保存於乳汁萃取物中，換言之，乳汁萃取物(包含乳脂粉末或奶粉以及進一步萃取的乳汁菁華)含有對抗過敏具有功效之有效成分。而乳汁菁華之製備流程如下：得自超高免疫狀態牛之乳汁20公升並將乳汁利用乳酪分離機(德拉瓦型號102)來去除脂肪(cream)。得到約16公升的脫脂乳，再使用中空纖維滲透機/濃縮機(阿米康DL-10L)超滲透過濾來去除高分子量分子(超過10萬道爾頓)。脫脂乳於儀表上以80泵送速度及分別為30psi及25psi之入口及出口壓力流動。並以每小時4公升流速從匣中送出20公升濾液，濾液經冷凍或凍乾後供儲存及進一步純化用。利用DEAE-西法雷斯CL60B膠(法瑪)用來填充5X10cm玻璃柱，並以無菌二次蒸餾水pH 7.0平衡後，以流速160ml/hr的無菌二次蒸餾水當成移動相來分離有效成分後。再利用西法雷斯G-10樹脂(法瑪)填充入2.5X80公分玻璃柱內，且以無菌二次蒸餾水pH 7.0平衡。以30m/hr流速收集，併用254mm及280mm(法瑪都光學單元)監視並連接記錄器來記錄並收集有效成分。

實施例2乳汁萃取物之品質管理標準

本實驗之乳汁萃取物是藉由ELISA方法決定牛的抗Salmonella enteritidis 抗體之量來進行品質控管。並利用Radial immunodiffusion(RID)法，定量全部IgG抗體含量。

實驗設備及耗材包含：96-well盤；校正後之1管、8管、以及12管之pipettor；96-well盤讀取儀器；96-well盤清洗器；washing/dilution buffer(Tris pH 7.2/0.05% Tween)；Blocking reagent(1% heat-treated skim milk)；Coating reagent(Salmonella enteritidis ATCC #13076)；Assay standard(未稀釋之專一性係2025單位)；偵測抗體(Peroxidase-labeled goat anti-bovine IgG)；TMB受質(3,3’-5,5,-tetramethylbenzidine)；2N H₂ SO₄ ；Coating buffer(borate saline,pH 8.5)；Humidity chamber；Microcentrifuge離心機；計時器；離心管。上述所有的coating buffer，blocking reagent及washing/dilution buffer需經標準程序處理；所有耗材及器材需經認證之製造商購得。

實驗流程：

1.將溶於coating buffer之Salmonella enteritidis 10μg/ml塗佈於96-well盤，每well含有100μl。

2.將之置放於Humidity chamber至少18小時5℃±4℃，最長能存放至7天。

3.加入至少250μl之Blocking reagent至每個well，搖晃20-60分鐘23℃±5℃。

4. Vortex後這些樣本於500-1000g離心力離心2-3分鐘後，將上清液取來當後續實驗樣本。

5.稀釋樣本及正控制(positive control)於washing/dilution buffer。

6.加入200μl之washing/dilution buffer入8個well中以標準樣本做序列稀釋。

7.用300μl之washing/dilution buffer洗96-well盤兩次，後加入50μl washing/dilution buffer到每個well。

8.將序列稀釋之標準樣品置入實驗96-well盤，每個well 50μl。

9.將此實驗96-well盤置入Humidity chamber 1小時±10分鐘，溫度約23℃±5℃。

10.用300μl之washing/dilution buffer洗96-well盤兩次後，加入100μl detecting antibody，並用washing/dilution buffer適當稀釋。

11.將此實驗96-well盤置入Humidity chamber 1小時±10分鐘，溫度約23℃±5℃。

12.用300μl之washing/dilution buffer洗96-well盤兩次後，加入100μl detecting antibody。

13.加入100μl之TMB受質於每個well，將實驗96-well盤置入96-well盤讀取儀器一直到OD值第一序列稀釋的前兩個稀釋well在650nm吸光值超過1.0，後根據經驗，加入2N H₂ SO₄ 溶液以停止反應，並作用4-10分鐘。

14.在30分鐘內用96-well盤讀取儀器在吸光值450nm讀取數值，標準曲線應該是在450nm吸光值有最大OD值約20-2.5，最後OD值也應在0.01-0.5之間以完成一標準曲線，否則實驗數據將予以廢棄。

15.藉由標準曲線來計算每個樣本的真實數值。

16.並以正控制之數值來當成實驗數值是否接受的一種指標。

最後「品質標準」係以(1)每100公克具有大於600毫克之免疫球蛋白G及(2)每公克具有大於6000抗體力價之專一性抗體(以上述ELISA實驗過程)，而再利用The Binding Site Ltd.所生產之RID實驗kit進行實驗，其方法大致：將本發明之乳汁萃取物放入培養孔中，靜置24至48小時後，再測量其直徑大小，與標準值對照，算出IgG免疫球蛋白濃度。

品管標準表：

1.化學試驗

2.物理試驗

3.免疫試驗

4.微生物試驗

實施例3實驗設計

a.實驗動物：建議選用小鼠，常用的Balb/c或是B6小鼠皆可，6-8週大，雄鼠或雌鼠皆可，每組隻數為單一性別至少10隻，並飼養於無特定病源之環境，每組老鼠均分開飼養。

控制組：餵食0.4mL去離子水(d.d H₂ O)(有接下來的致敏步驟)

中劑量乳汁萃取物組：餵食2g乳汁萃取物(SMPC)/kg Body Weight(溶於d.d H₂ O)，餵食0.4mL。

高劑量乳汁萃取物組：餵食4g乳汁萃取物(SMPC)/kg Body Weight(溶於d.d H₂ O)，餵食0.4mL。

未致敏對照組：餵食0.4mL去離子水(d.d H₂ O)(無接下來的致敏步驟)

b.致敏小鼠：本動物實驗之過敏免疫反應是以腹腔注射過敏原的模式進行，採用過敏原作為抗原，可以氫氧化鋁作為佐劑(adjuvant)，在注射抗原前及注射抗原一週後以眼窩採血，取得血清進行抗原特異性抗體濃度之分析，確定動物過敏模式之建立，必要時須致敏三至四次。對於呼吸道過敏之動物模式，宜另以噴霧致敏法使從呼吸道接觸過敏原，鼻腔過敏之動物模式宜以鼻腔接觸過敏原等各種不同過敏動物模式。

本發明之致敏過程如下：第一次腹腔注射(周齡8)OVA(10ug OVA+2mg Al(OH)₃ /0.2mL PBS)入老鼠；第二次腹腔注射(周齡10)OVA(30ug OVA+2mg Al(OH)₃ /0.2mL PBS)入老鼠；第三次腹腔注射(周齡12)OVA(30ug OVA+2mg Al(OH)₃ /0.2mL PBS)入老鼠；並於周齡約11、14及16分別眼窩採血。

c.測定血液抗體濃度

(1)可利用sandwich-ELISA免疫呈色反應法，定量血清中免疫球蛋白IgE、IgG、IgM、IgA和總抗體含量。

利用免疫呈色反應法測定免疫球蛋白濃度：將血清加入表面已覆蓋免疫球蛋白抗體的96孔盤中，靜置反應後，再加入標有呈色酵素的抗體作用，最後加入呈色劑並與標準值對照，經由可見光吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度。

(2)過敏原誘發的特異性抗體產生。

利用免疫呈色反應法測定抗原特異性免疫球蛋白濃度：將血清加入表面已覆蓋過敏抗原的96孔盤中，靜置反應後，再加入標有呈色酵素的抗老鼠IgE、IgG₁ 或等抗體作用，最後加入呈色劑並與標準值對照，經由可見光吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度。

d.脾臟或是淋巴結細胞增生反應

細胞增生能力即指免疫細胞受到刺激時，能夠增生的能力。故增生能力之表示，以添加裂殖素後，細胞增生的數值為未添加裂殖素時數值的倍數，稱為增生指數(Stimulation Index)，簡稱S.I.。

本實驗的細胞增生的刺激物須包括過敏原和裂殖素，T細胞須以過敏原刺激培養，另可使用如ConA、PHA等裂殖素或抗CD3抗體的刺激劑，以分析T細胞的增生反應。B細胞須以過敏原刺激培養，另可使用如LPS來刺激，分析B細胞的增生反應。

進行步驟有以下三種方法：

(1)³ H-thymidine嵌入法

本方法較靈敏，將脾臟細胞2x 10⁶ /ml置於96孔盤，再加入RPMI培養基或分別添加有LPS、Con A、PHA等細胞裂殖素的培養基。於37℃二氧化碳無菌培養箱培養兩天後，加入1μ Ci/well³ H-thymidine，繼續培養20小時後，以細胞收集儀收集細胞於濾紙上，濾紙風乾後以閃爍計數儀測³ H-thymidine含量，計算細胞增生能力。

(2)MTT法

MTT的測定方法，是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，細胞數與吸光值的直線相關有飽和現象，吸光值無法代表細胞數值，以致較不靈敏，進行本實驗時應特別注意。

e.細胞激素分泌實驗

將分離出的淋巴球以5x10⁶ /ml的濃度置於24-孔盤中，利用已經定量過的過敏原、Con A或抗CD3抗體來刺激這些淋巴球。經過24到48小時的培養後，將上層液離心下來，以測定其細胞激素製造的量。在取得足夠檢體以前，可將其它檢體先保存在-70℃，等到檢體足夠時再一起測試。細胞激素的測定是利用sandwich-ELISA法。先將抗細胞激素的抗體先覆蓋在24-孔盤上，在4℃靜置一晚，在進行實驗前先以1% PBS-BSA處理清洗去多餘抗體。再加入測定的樣品至24-孔盤，於室溫2小時後加入biotin聯結的抗細胞激素抗體。兩小時的室溫靜置後，加入avidin聯結過氧化酵素(avidin-linked peroxidase)，再靜置二個小時後加入受質以呈色。上述的裂殖素的濃度及刺激時間在實驗進行之前都應先測定其最適當的濃度，並以已知濃度的細胞激素作為對照。

f.呼吸道肺沖洗液之分析

1.發炎細胞數量及種類分析，如：嗜伊紅性白血球、中性白血球、單核球及淋巴球等

犧牲鼠隻後，剪開氣管露出小洞，以靜脈置留管插入氣管，軟管綁緊後，以生理食鹽水沖洗肺部5次，回收肺沖洗液放入離心管離心，取上清液保存待分析。下層細胞以含BSA生理食鹽水溶開，經trypan blue dye exclusion法染色，以細胞計數器計算所有存活白血球數目。裝置好玻片後，取細胞液置於cytospin離心管，cytospin後取下載玻片風乾，取Liu A染劑染色30秒，從背面以水龍頭沖去多餘染劑，風乾，取Liu B染劑染色60秒，再沖去多餘染劑，風乾，觀察染色成果。以阿拉伯膠封片，以油鏡判讀至少五個視野之細胞或總數200個以上之細胞組成，計算判讀細胞所佔總細胞之數目。

2.發炎相關介質分析，如：組織胺、細胞激素及趨化激素

組織胺可以HPLC方法分析，唯樣品中組織胺回收率較低，目前組織胺定量多以市售的組織胺測定試劑組分析。細胞激素與趨化激素分析方法如前所述。

實施例4對生長狀況的影響

如表1、表2所示給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩周期間，觀察小鼠生長狀況，中、高劑量乳汁萃取物組對終體重、飼料攝取、攝食效應和器官重量均無顯著差異。

實施例5對吞噬細胞能力的影響

給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後，進行吞噬細胞活性測試，此測試中吞噬細胞可以分別測定單核球 (monocyte)或是中性白血球的吞噬能力，目前可以分別利用吞噬細菌如E.coli 或酵母菌等方法來加以測定，也可以利用已標記好的E.coli (如螢光)，在細胞吞噬後利用螢光流體計數儀來加以分析。以上述方法測試小鼠血液中吞噬細胞能力。結果如圖1所示，活化前的底值各組無顯著差異。活化後，中劑量乳汁萃取物組小鼠的血中顆粒性白血球佔血球總數比例雖然顯著低於控制組，但吞噬活性各組之間並無顯著影響。

因此，雖然可能因其他血球數增加的關係使顆粒性白血球相對上所佔的百分比較低，以及未致敏組無致敏處理下顆粒性白血球的比率較高的現象，但各組間對吞噬活性無顯著差異，顯示餵食乳汁萃取物並未顯著影響先天自然免疫力的吞噬活性。

實施例6具有對抗過敏原顯著抑制免疫球蛋白E的功能

給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後，免疫球蛋白之定量方法如實施例3所述，如圖2所示對血清中的總抗體濃度的影響方面，餵食乳汁萃取物組之抗體濃度與控制組雖無顯著差異，但在餵食前後抗體濃度增加倍數，中劑量組有顯著抑制血液中總IgE增加的效果，如圖3所示。

在圖4中，對血清中的卵蛋白(OVA)特異性抗體濃度的影響方面，如實施例3所述之致敏反應後，中、高劑量乳汁萃取物組均顯著降低血清中抗卵蛋白IgG₁ 的含量，也都有降低抗卵蛋白IgE含量的趨勢。管餵後如圖5所示，代表第二型T輔助細胞抗卵蛋白IgG₁ 和IgE的增加倍數，在中、高劑量乳汁萃取物組也都顯著較低，代表第一型T輔助細胞的抗卵蛋白IgG_2a 的增加倍數在中劑量乳汁萃取物組也有較高的趨勢。因此，本趨勢顯示致敏過程中，各類抗體的分泌趨勢，可受到餵食乳汁萃取物的影響，使第二型的過敏抗體分泌能力較低，第一型的防禦性抗體分泌能力略增，對免疫平衡發展應具有正面的調節作用。

實施例7乳汁萃取物對呼吸道阻力的影響

本發明之實驗步驟如實施例3致敏後，約在周齡15時給予吸入性刺激，每隻小鼠在最後一次吸入式致敏的隔天進行肺功能測定，使用whole body plethysmography(Buxco)，以噴霧的方式依序吸入3分鐘的0、3.125、6.25、12.5、25mg/mL methacholine，再分別測定3分鐘，記錄肺功能指標Penh(Enhanced Pause)值。因此給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後，吸入平滑肌收縮劑methacholine(Mch)測試小鼠的呼吸道阻力。結果顯示於圖6，在濃度漸增的Mch刺激下所造成的呼吸阻力，餵食乳汁萃取物組有較低的現象，在12.5mg/mL Mch時刺激時更達顯著差異性。因此，乳汁萃取物應有助於減緩過敏性所造成的呼吸阻力現象(例如氣喘或支氣管炎)。

實施例8乳汁萃取物對肺沖洗液中細胞激素與細胞種類的影響

本發明之實驗步驟如實施例3進行呼吸道肺沖洗液之分析。給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後，犧牲鼠隻，測定肺沖洗液中各細胞激素含量與計算各種類細胞數目。中、高劑量乳汁萃取物組均可顯著降低肺沖洗液中代表促發炎細胞激素的IFNγ含量，高劑量乳汁萃取物可顯著降低造成呼吸道氣喘的主要細胞激素IL-13的含量如表3所示。顯示乳汁萃取物可抑制氣管與肺內發炎性細胞激素含量，有助於減緩發炎性細胞聚集的正面效果。同時可由表3觀察到不只IL-13連IL-10、IL-1β、IL-4及其他與過敏發炎相關因子TNFα與干擾素IFNγ都有下降的趨勢，因此可推斷乳汁萃取物對於該些過敏發炎因子具有抑制的功能。

肺沖洗液中各種類細胞數目結果可由圖7所顯示，高劑量乳汁萃取物具有減少嗜伊紅性白血球聚集到肺部的效果。因此，有助於減緩肺部過敏性發炎反應。

實施例9乳汁萃取物對脾臟細胞分泌細胞激素的影響

本發明之實驗步驟如實施例3之脾臟或是淋巴結細胞增生反應所述。給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後犧牲，將取得之脾臟細胞進行體外培養，測定脾臟細胞在不同裂殖素刺激之下分泌的細胞激素含量。第一型T輔助細胞細胞激素結果如表4，此時IL-2並無明顯抑制或明顯增加的現象發生。中、高劑量乳汁萃取物均可顯著降低卵蛋白刺激下脾臟分泌IFNγ的能力，進一步確認本發明在肺沖洗液中的趨勢，乳汁萃取物組也在肺沖洗液中有顯著較低的IFNγ分泌量。IFNγ可活化巨噬細胞與單核球等促發炎性細胞，餵食乳汁萃取物可使小鼠受到特定抗原(卵蛋白)刺激時有顯著較低的IFNγ分泌能力，顯示乳汁萃取物具有降低呼吸道與全身性發炎反應的功效。同時也代表餵食乳汁萃取物對另一種代表第一型T輔助細胞的細胞激素，IL-2，並無顯著影響。

第二型T輔助細胞細胞激素結果如表5，中、高劑量乳汁萃取物均可顯著降低IL-4的含量，IL-4會促使naïve T輔助細胞傾向分化成造成過敏的第二型T輔助細胞，也會使B細胞同型轉換成IgE與IgG₁ 生成細胞，促使過敏反應的形成。因此，乳汁萃取物可能透過降低特定抗原卵蛋白刺激下的IL-4分泌量，間接減少抗卵蛋白IgE與IgG₁ 的生成。此外本發明證實餵食乳汁萃取物對其他第二型T輔助細胞細胞激素IL-5，無顯著影響。

實施例10乳汁萃取物對免疫細胞生長的影響

本發明之實驗步驟如實施例3之脾臟或是淋巴結細胞增生反應所述。給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後，以培養，利用³ H-thymidine嵌入法測定脾臟細胞增生能力，結果如圖8。在特異性抗原卵蛋白的刺激下，餵食乳汁萃取物組對脾臟的增生能力無顯著差異，顯示餵食乳汁萃取物對致敏的特異性抗原無顯著影響。在B細胞裂殖素LPS刺激下，乳汁萃取物具有增加脾臟細胞增生的效果，在T細胞裂殖素PHA刺激下脾臟細胞增生能力無顯著差異。顯示餵食乳汁萃取物可以增加B細胞的增生能力，但不會影響T細胞的增生能力，對致敏抗原刺激下脾臟細胞的增生能力亦無顯著影響。

本發明已由上述相關實施例加以描述，然而上述實施例僅為實施本發明之範例。必需指出的是，已揭露之實施例並未限制本發明之範圍。相反地，包含於申請專利範圍之精神及範圍之修改及均等設置均包含於本發明之範圍內。

圖1顯示以乳汁萃取物對吞噬細胞能力的影響，發現吞噬活性各組之間並無顯著影響並顯示餵食乳汁萃取物並未顯著影響先天自然免疫力的吞噬活性。。

圖2顯示乳汁萃取物對抗體生成的影響，發現餵食乳汁萃取物組之抗體濃度與控制組雖無顯著差異，因此顯示乳汁萃取物並未顯著影響後天自然免疫力。

圖3顯示乳汁萃取物對抗體生成影響的另一實施例中，在餵食前後抗體濃度增加倍數，中劑量乳汁萃取物組有顯著抑制血液中總IgE增加的效果，因此顯示乳汁萃取物對於IgE所引發之過敏性症狀具有舒緩的效果。

圖4顯示乳汁萃取物對特異性抗體生成影響的實施例中，中及高劑量乳汁萃取物組均顯著降低血清中抗卵蛋白IgG₁ 的含量，也都有降低抗卵蛋白IgE含量的趨勢，因此顯示乳汁萃取物對於IgE所引發之過敏性症狀具有舒緩的效果。

圖5顯示乳汁萃取物對抗體生成影響的另一實施例中，管餵後代表第二型T輔助細胞抗卵蛋白IgG₁ 和IgE的增加倍數，在中、高劑量乳汁萃取物組也都顯著較低，代表第一型T輔助細胞的抗卵蛋白IgG_2a 的增加倍數在中劑量乳汁萃取物組也有較高的趨勢，因此，本趨勢顯示致敏過程中，各類抗體的分泌趨勢可受到餵食乳汁萃取物的影響，使第二型的過敏抗體分泌能力較低，第一型的防禦性抗體分泌能力略增，對免疫平衡發展應具有正面的調節作用。

圖6顯示乳汁萃取物對呼吸道阻力影響的實施例中，發現在濃度漸增的Mch刺激下所造成的呼吸阻力，餵食乳汁萃取物組有較低的現象，在12.5mg/mL Mch時刺激時更達顯著差異性。因此，乳汁萃取物應有助於減緩過敏性所造成的呼吸阻力現象(例如氣喘或支氣管炎)。

圖7顯示乳汁萃取物對免疫細胞生長影響的實施例中，發現高劑量乳汁萃取物具有減少嗜伊紅性白血球聚集到肺部的效果。因此，有助於減緩肺部過敏性發炎反應。

圖8顯示乳汁萃取物對肺沖洗液中細胞激素與細胞種類影響的實施例中，發現在B細胞裂殖素LPS刺激下，乳汁萃取物具有增加脾臟細胞增生的效果，在T細胞裂殖素PHA刺激下脾臟細胞增生能力無顯著差異。顯示餵食乳汁萃取物可以增加B細胞的增生能力，但不會影響T細胞的增生能力，並對致敏抗原刺激下脾臟細胞的增生能力亦無顯著影響。

Claims

一種乳汁萃取物，具有在不影響先天免疫能力的情況下調節第一型T輔助細胞特異性免疫球蛋白與第二型T輔助細胞特異性免疫球蛋白以降低過敏反應的能力，而該乳汁萃取物係由包括下列各步驟之方法所生成：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態，其中該超高免疫狀態係經由投予選自由沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮鏈球菌、A1型產膿鏈球菌、A3型產膿鏈球菌、A5型產膿鏈球菌、A8型產膿鏈球菌、A12型產膿鏈球菌、A14型產膿鏈球菌、A18型產膿鏈球菌、A22型產膿鏈球菌、產氣桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、傷寒桿菌、流行性感冒嗜血桿菌、和緩鏈球菌、普通變形桿菌、赤痢桿菌、肺炎雙球菌、粉刺出油酸菌、突變鏈球菌以及無乳鏈球菌之細菌性抗原組成的群組之多價混合物所誘生；自該產乳動物收集乳汁；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；利用巴斯德滅菌法在不大於80℃之溫度條件下將該脫脂乳滅菌；利用可保留5,000道爾頓以上之分子的分子篩膜進行該脫脂乳之透析；除去該脫脂乳中之乳糖而成一脫脂乳蛋白；蒸除該脫脂乳蛋白之水分；以及利用噴霧乾燥器乾燥該脫脂乳蛋白，而完成該乳汁萃取物；其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G。
如申請專利範圍第1項所述之乳汁萃取物，其中該產乳動物係選自為牛和羊。
如申請專利範圍第1項所述之乳汁萃取物，其中巴斯德滅菌法的溫度約在80℃至70℃之間，加熱10至20秒鐘。
如申請專利範圍第1項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物對一生物體本身先天免疫能力沒有明顯抑制或明顯提升之能力。
如申請專利範圍第4項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有顯著抑制血液中免疫球蛋白E(IgE)數量之功能。
如申請專利範圍第5項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，血液中免疫球蛋白總數量沒有明顯抑制或明顯提升之能力。
如申請專利範圍第4項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有顯著抑制血液中第二型T輔助細胞特異性免疫球蛋白G₁ (IgG₁ )數量之功能。
如申請專利範圍第4項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有提升血液中第一型T輔助細胞特異性免疫球蛋白G_2a (IgG_2a )數量之功能。
如申請專利範圍第4項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有下降該生物體呼吸道遭受刺激所產生之呼吸道阻力之功能。
如申請專利範圍第4項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有降低該生物體之至少一器官中細胞介白素IL-13、其他與過敏發炎相關因子TNFα或顯著降低干擾素IFNγ之功能。
如申請專利範圍第10項所述之乳汁萃取物，其中該器官包含肺臟及/或脾臟。
如申請專利範圍第10項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有抑制嗜伊紅性白血球(Eosinophil)聚集到該器官之功能。
如申請專利範圍第4項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時所分離之複數個脾臟細胞，具有對細胞介白素IL-2及IL-5分泌無顯著抑制或顯著增加之能力。
如申請專利範圍第13項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時所分離之該些脾臟細胞，具有顯著抑制干擾素IFNγ分泌之功能。
如申請專利範圍第4項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時所分離之複數個脾臟細胞，具有顯著抑制細胞介白素IL-4分泌之功能。
如申請專利範圍第4項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時所分離之複數個脾臟細胞，具有B細胞增生之能力但卻不會影響T細胞之增生能力。
如申請專利範圍第1項所述之乳汁萃取物，其中每克之乳汁萃取物具有6000以上的抗體力價。
一種乳汁萃取物，具有減緩呼吸道過敏性發炎反應的能力，其中該乳汁萃取物包括下列各步驟之方法所生成：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態，其中該超高免疫狀態係經由投予選自由沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮鏈球菌、A1型產膿鏈球菌、A3型產膿鏈球菌、A5型產膿鏈球菌、A8型產膿鏈球菌、A12型產膿鏈球菌、A14型產膿鏈球菌、A18型產膿鏈球菌、A22型產膿鏈球菌、產氣桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、傷寒桿菌、流行性感冒嗜血桿菌、和緩鏈球菌、普通變形桿菌、赤痢桿菌、肺炎雙球菌、粉刺出油酸菌、突變鏈球菌以及無乳鏈球菌之細菌性抗原組成的群組之多價混合物所誘生；自該產乳動物收集乳汁；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；利用巴斯德滅菌法在不大於80℃之溫度條件下將該脫脂乳滅菌；利用可保留5,000道爾頓以上之分子的分子篩膜進行該脫脂乳之透析；除去該脫脂乳中之乳糖而成一脫脂乳蛋白；蒸除該脫脂乳蛋白之水分；以及利用噴霧乾燥器乾燥該脫脂乳蛋白，而完成該乳汁萃取物；其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G。
如申請專利範圍第18項所述之乳汁萃取物，其中該產乳動物包含牛與羊。
如申請專利範圍第18項所述之乳汁萃取物，其中巴斯德滅菌法的溫度約在80℃至70℃之間，加熱10至20秒鐘。
如申請專利範圍第18項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物對一生物體本身先天免疫能力沒有明顯抑制或明顯提升之能力。
如申請專利範圍第21項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有顯著抑制血液中免疫球蛋白E(IgE)數量之功能。
如申請專利範圍第22項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，血液中免疫球蛋白總數量沒有明顯抑制或明顯提升之能力。
如申請專利範圍第21項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有顯著抑制血液中免疫球蛋白G₁ (IgG₁ )數量之功能。
如申請專利範圍第21項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有提升血液中免疫球蛋白G_2a (IgG_2a )數量之功能。
如申請專利範圍第21項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有下降該生物體呼吸道遭受刺激所產生之呼吸道阻力之功能。
如申請專利範圍第21項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有顯著降低該生物體之一器官中細胞介白素IL-13與干擾素IFNγ之功能。
如申請專利範圍第27項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，進一步具有降低該生物體呼吸道之一器官中過敏發炎相關因子TNFα之功能。
如申請專利範圍第27項所述之乳汁萃取物，其中該器官包含肺臟。
如申請專利範圍第27項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有抑制嗜伊紅性白血球(Eosinophil)聚集到該器官之功能。
如申請專利範圍第18項所述之乳汁萃取物，其中每克之乳汁萃取物具有6000以上的抗體力價。
一種乳汁萃取物，在不影響先天免疫能力的情況下，具有抑制細胞介白素IL-4及干擾素IFNγ以降低過敏性發炎反應的能力，而該乳汁萃取物係由包括下列各步驟之方法所生成：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態，其中該超高免疫狀態係經由投予選自由沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮鏈球菌、A1型產膿鏈球菌、A3型產膿鏈球菌、A5型產膿鏈球菌、A8型產膿鏈球菌、A12型產膿鏈球菌、A14型產膿鏈球菌、A18型產膿鏈球菌、A22型產膿鏈球菌、產氣桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、傷寒桿菌、流行性感冒嗜血桿菌、和緩鏈球菌、普通變形桿菌、赤痢桿菌、肺炎雙球菌、粉刺出油酸菌、突變鏈球菌以及無乳鏈球菌之細菌性抗原組成的群組之多價混合物所誘生；自該產乳動物收集乳汁；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；利用巴斯德滅菌法在不大於80℃之溫度條件下將該脫脂乳滅菌；利用可保留5,000道爾頓以上之分子的分子篩膜進行該脫脂乳之透析；除去該脫脂乳中之乳糖而成一脫脂乳蛋白；蒸除該脫脂乳蛋白之水分；以及利用噴霧乾燥器乾燥該脫脂乳蛋白，而完成該乳汁萃取物；其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G。
如申請專利範圍第32項所述之乳汁萃取物，其中該產乳動物包含牛與羊。
如申請專利範圍第32項所述之乳汁萃取物，其中巴斯德滅菌法的溫度約在80℃至70℃之間，加熱10至20秒鐘。
如申請專利範圍第32項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物對一生物體本身先天免疫能力沒有明顯抑制或明顯提升之能力。
如申請專利範圍第35項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有顯著抑制血液中免疫球蛋白E(IgE)數量之功能。
如申請專利範圍第36項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，血液中免疫球蛋白總數量沒有明顯抑制或明顯提升之能力。
如申請專利範圍第35項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有顯著抑制血液中免疫球蛋白G₁ (IgG₁ )數量之功能。
如申請專利範圍第35項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有提升血液中免疫球蛋白G_2a (IgG_2a )數量之功能。
如申請專利範圍第35項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有下降該生物體呼吸道遭受刺激所產生之呼吸道阻力之功能。
如申請專利範圍第35項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有降低該生物體之至少一器官中細胞介白素IL-13、IL-10、IL-1β或其他與過敏發炎相關因子TNFα之功能。
如申請專利範圍第41項所述之乳汁萃取物，其中該器官包含肺臟及/或脾臟。
如申請專利範圍第41項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時，具有抑制嗜伊紅性白血球(Eosinophil)聚集到該器官之功能。
如申請專利範圍第35項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時所分離之複數個脾臟細胞，具有對細胞介白素IL-2及IL-5分泌無顯著抑制或顯著增加之能力。
如申請專利範圍第44項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時所分離之該些脾臟細胞，具有顯著抑制干擾素IFNγ分泌之功能。
如申請專利範圍第35項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時所分離之複數個脾臟細胞，具有顯著抑制細胞介白素IL-4分泌之功能。
如申請專利範圍第35項所述之乳汁萃取物，其中該乳汁萃取物，對該生物體遭受外來抗原刺激至過敏時所分離之複數個脾臟細胞，具有B細胞增生之能力但卻不會影響T細胞之增生能力。
如申請專利範圍第32項所述之乳汁萃取物，其中每克之乳汁萃取物具有6000以上的抗體力價。
一種製備乳汁萃取物的方法，該乳汁萃取物具有在不影響先天免疫能力的情況下調節第一型T輔助細胞特異性免疫球蛋白與第二型T輔助細胞特異性免疫球蛋白以降低過敏反應的能力，包含下列各步驟：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態，其中該超高免疫狀態係經由投予選自由沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮鏈球菌、A1型產膿鏈球菌、A3型產膿鏈球菌、A5型產膿鏈球菌、A8型產膿鏈球菌、A12型產膿鏈球菌、A14型產膿鏈球菌、A18型產膿鏈球菌、A22型產膿鏈球菌、產氣桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、傷寒桿菌、流行性感冒嗜血桿菌、和緩鏈球菌、普通變形桿菌、赤痢桿菌、肺炎雙球菌、粉刺出油酸菌、突變鏈球菌以及無乳鏈球菌之細菌性抗原組成的群組之多價混合物所誘生；自該產乳動物收集乳汁；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；利用巴斯德滅菌法在不大於80℃之溫度條件下將該脫脂乳滅菌；利用可保留5,000道爾頓以上之分子的分子篩膜進行該脫脂乳之透析；除去該脫脂乳中之乳糖而成一脫脂乳蛋白；蒸除該脫脂乳蛋白之水分；以及利用噴霧乾燥器乾燥該脫脂乳蛋白，而完成該乳汁萃取物；其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G。
如申請專利範圍第49項所述之方法，其中該產乳動物係選自牛和羊。
如申請專利範圍第49項所述之方法，其中該使一產乳動物維持在一超高免疫狀態的步驟包含藉由初始免疫使該產乳動物產生致敏化反應；該初始免疫係以選自包含肌肉注射、靜脈注射、腹膜內注射、口服、直腸注射法之群組的方法實施。
如申請專利範圍第49項所述之方法，其中該使一產乳動物維持在一超高免疫狀態的步驟係以選自包含肌肉注射、靜脈注射、腹膜內注射、口服、直腸注射法之群組的方法實施。
如申請專利範圍第49項所述之方法，其中巴斯德滅菌法的溫度約在80℃至70℃之間，加熱10至20秒鐘。
如申請專利範圍第49項所述之方法，其中該進行該脫脂乳之滲濾的步驟進一步包含利用超滲透過濾方式保留約1,000道爾頓至約100,000道爾頓間之分子。
如申請專利範圍第49項所述之乳汁萃取物，其中每克之乳汁萃取物具有6000以上的抗體力價。