TWI528965B - 乳汁萃取物在製備用於類風濕性關節炎的組成物的用途 - Google Patents

Description

乳汁萃取物在製備用於類風濕性關節炎的組成物的用途

本發明係有關於一種乳汁萃取物之用途；具體而言，本發明係有關於一種乳汁萃取物用於製備預防、緩解、或治療類風濕性關節炎的組成物的用途。

類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自體免疫疾病，其發生係與遺傳及感染有關。RA的致病機轉目前推測是由於自體或外來的一未知抗原與第二型組織相容複合體分子(MHC II)及抗原呈現細胞(APC)結合後，與T細胞受器(TCR)連結而活化T細胞。T細胞因此產生發炎性的細胞激素例如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)與介白素1、6(interleukins 1,6；IL-1,6)，以及驅化因子(chemmokins)與附著分子(adhesion molecules)。這些分子促使發炎細胞進入關節腔，造成滑液囊發炎；T細胞則產生血管內皮生長因子，使局部血管新生，讓更多發炎細胞浸潤；發炎細胞激素如TNF-α、IL-1、及IL-6會刺激關節中的巨噬細胞與纖維母細胞分泌軟骨分解酵素，造成軟骨的破壞。

因此，類風溼性關節炎亦為一種慢性發炎性的關節疾病。病程初期大都發生於手、腕、膝、足等四肢關節，嚴重時會影響頸椎關節。症狀包含熱、腫、痛及僵硬感。進入病程中晚期，關節可能變形、嚴重疼痛，肢體甚至失能。因此不但使患者生活品質受到影響，亦失去工作能力而造成社會負擔。

目前對於RA的治療包含減輕疼痛及降低發炎反應，其中有非類固醇/類固醇抗發炎藥之使用及/或免疫抑制劑之使用。一般而言，藥物、藥劑之使用透過抑制免疫系統，減少對於關節的破壞。然而，藥物治 療產生的副作用可包含免疫力下降，使患者易受微生物感染，或發生內分泌失調。

除此以外，在RA的治療上亦有免疫療法的採用。舉例來說， 九十年代始採用發炎細胞激素如TNF-α的阻斷抗體以減輕關節腫脹與疼痛、降低急性發炎反應。然而TNF-α的抗體治療一來可能因病患本身對該阻斷抗體產生抗體而逐漸失效，二來此被動免疫方式有賴持續施打，並且產生花費；再者，在正常情況下，TNF-α是免疫系統的重要細胞激素，TNF-α受阻斷將產生嚴重的副作用。

因此，類風溼性關節炎的藥物治療或阻斷性抗體治療皆伴隨有副作用產生，在進行治療的同時也對抗人體內天然的免疫機制。

另一方面，一種稱為口服耐受性的免疫現象亦應用於自體免疫疾病之預防、緩解、或治療。口服耐受性，簡單來說，在物質經由口腔進入腸道之後，腸道黏膜的免疫系統會產生認識該物質的抗原特異性調節型T細胞。此調節型T細胞產生的抑制性細胞激素可抑制發炎型T細胞的活性，避免發炎反應或自體免疫反應。因此，口服耐受性一方面可伴隨飲食產生，二方面是一種天然的免疫機制。因此，在藥物與阻斷性抗體治療以外，透過攝取食物啟動天然免疫機制係為在預防、緩解、或治療自體免疫疾病上一種值得更多關注的方式。

本發明之目的在於提供一種乳汁萃取物之用途，用於製備預防、緩解、或治療類風濕性關節炎的組成物。

本發明之另一目的在於提供一種乳汁萃取物之用途，用於製備調節第一型輔助性T細胞反應的組成物。

本發明之另一目的在於提供一種乳汁萃取物之用途，用於製備預防、緩解、或治療自體免疫反應所致四肢腫脹的組成物。

具本發明用途之乳汁萃取物每100公克中含有80公克以上的蛋白質量，有大於600毫克的免疫球蛋白G，且由包括下列各步驟之方法所 生成：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態；自該產乳動物收集乳汁；在不大於80℃之溫度條件下進行該乳汁之滅菌；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量；以及移除該脫脂乳之水分，而完成該乳汁萃取物。

由具有本發明用途之乳汁萃取物製備而得之組成物抑制發炎相關細胞激素的分泌，且降低第一型輔助性T細胞特異性免疫球蛋白G2a(IgG2a)數量。

由具有本發明用途之乳汁萃取物製備而得之組成物係以口服投予，且該投予包括每日每公斤體重投予具有相當於一重量之乳汁萃取物所含成分之該組成物。

圖1(A)~1(E)所示為腫脹計分0~4與所對應之腫脹情形。

本發明提供一種乳汁萃取物之用途，用於製備預防、緩解、或治療類風濕性關節炎的組成物，或用於製備調節第一型輔助性T細胞反應的組成物，或用於製備預防、緩解、或治療自體免疫反應所致四肢腫脹的組成物，其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G，且該乳汁萃取物可由包括如下步驟之方法生成。舉例而言，該些步驟包含使一產乳動物維持在超高免疫狀態、自該產乳動物收集乳汁、在不大於80℃之溫度條件下進行該乳汁之滅菌、去除乳汁中之脂肪而生成脫脂乳、最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量以及移除該脫脂乳之水分，而完成該乳汁萃取物。

在本發明實施例中，前述使一產乳動物維持在超高免疫狀態之步驟可包含選擇抗原、藉由初始免疫使產乳動物產生致敏化反應以及引 發並維持超高免疫狀態等步驟，其中該產乳動物較佳為牛與羊。在本發明較佳實施例中，可選擇例如Bos taurus(家牛、黃牛、歐洲牛)作為產乳動物。使一產乳動物維持在超高免疫狀態之各步驟分別進一步描述如下：選擇抗原：在本發明實施例中，選擇之抗原為細菌性抗原，包含沙門氏桿菌(Salmonella enteritidis)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、表皮鏈球菌(Streptococcus epidermidis)、A1型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A1)、A3型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A3)、A5型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A5)、A8型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A8)、A12型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A12)、A14型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A14)、A18型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A18)、A22型產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes，type A22)、產氣桿菌(Aerobacter)、大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)、流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、和緩鏈球菌(Streptococcus mitis)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、赤痢桿菌(Shigella dysenteriae)、肺炎雙球菌(Streptococcus pneumoniae)、粉刺出油酸菌(Propionibacterium acnes)、突變鏈球菌(Streptococcus mutans)以及無乳鏈球菌等細菌(Streptococcus agalactiae)之至少其一。另一方面，並可使用抗原之多價混合物。在本發明另一實施例中，可採用S100免疫原(S100 immunogen,D.A.Ginzcxich,C.A.McPhillips,Regulatory Toxicology and Pharmacology 41(2005)102-112)致敏產乳動物及引發超高免疫狀態。

藉由初始免疫使產乳動物產生致敏化反應：此步驟係包含投予產乳動物前述之抗原、抗原之多價混合物或免疫原(下皆稱致敏原)，且方式可為以肌肉注射、靜脈注射、腹膜內注射、直腸注射、皮內注射、皮下注射或口服投予該產乳動物適當劑量之致敏原。

引發並維持超高免疫狀態： 一旦該產乳動物已經顯示致敏，則反覆於適當時間間隔施予上述劑量之致敏原以維持產乳動物之高免疫狀態。該時間間隔通常是由致敏原之特性來決定，不過以多價細菌致敏原來說，適當之時間間隔為兩個禮拜。此外，需要注意的是，要盡量避免引發免疫耐受性(immune tolerance)，因為對於致敏原之免疫耐受性將使產乳動物所分泌之乳汁中不具有抗敏效用之特性。

為了避免上述免疫耐受性現象發生，可以採用不同之致敏原投予方式。舉例來說，初始免疫係用皮下注射方法，引發超高免疫狀態(hyperimmune)時則用皮下注射以外之方式等其它可提供類似功效之方法。藉由上述方法或其混合方法來致敏或引發並維持超高免疫狀態都可大幅減低免疫耐受性發生之可能。

此外，使產乳動物產生致敏化反應以及引發並維持超高免疫狀態之步驟中間可進一步包含一測試步驟，驗證是否有致敏化反應；有許多習知的檢驗方法可以測得是否致敏(如文獻Methods in Immunology and ImmunoChemistry,William,C.A.,Chase,W.M.Academic Press,N.Y.,London(vols 1-5)(1977))。測試方法包含皮膚敏感、血清對致敏原敏感、免疫細胞對致敏原敏感等檢驗。測試方法可依所使用之致敏原來選擇。在本發明中，較佳是以例如酵素免疫分析法(ELISA)測試初始免疫後產乳動物的血清。舉例來說，若未達致敏化反應，則可提高維持超高免疫狀態步驟中致敏原之劑量。

在本發明實施例中，前述自該產乳動物收集乳汁的步驟包含自產乳動物收集生乳，並將所收集的生乳保存於適當溫度，如5℃~20℃的溫度範圍，且較佳係於收集後將生乳迅速冷卻至8℃以下並保存於8℃以下。此外，無論是農場內的生乳儲存槽、工廠中的乳槽或者將生乳由農場運往工廠的奶槽車，槽內較佳恆常提供前述保存生乳之適當溫度環境；溫度之選擇與控制係有利乳汁中有效成分的保存。另一方面，在集乳前，可進行乳汁中有效成分含量例如免疫球蛋白含量、特異性免疫球蛋白含量的測量，且較佳於該含量達到標準後再行集乳。

在本發明實施例中，前述滅菌與去除乳汁中之脂肪(下稱脫 脂)的順序可為先滅菌再脫脂，或為先脫脂再滅菌。較佳來說，可以熱處理之方式滅菌，例如於80℃~65℃的溫度範圍以及約10秒~20秒的持續時間滅菌。在本發明較佳實施中，可先將乳汁預熱，再以例如72.5℃持續16秒之條件使微生物失活(滅菌)。脫脂可依循脫脂標準程序進行，且脫脂時乳汁的溫度一般為約40℃~60℃，且較佳於52℃~56℃的溫度範圍。此外，在本發明實施例中，可使用標準乳汁分離設備進行脫脂。保存經滅菌乳汁或/及脫脂乳的溫度較佳為8℃以下。

在本發明實施例中，前述最小化該脫脂乳中小於5,000道爾 頓之分子的量的步驟包含對該脫脂乳進行滲濾。舉例而言，滲濾之實施可為利用可保留5,000道爾頓以上之分子的薄膜進行該脫脂乳之薄膜通透，進而降低該脫脂乳中乳糖和鹽類含量。進一步而言，在本發明實施例中，可使用5,000道爾頓標稱截留孔徑螺捲式膜(5,000Da nominal cutoff spiral wound membrane)進行薄膜通透；其中未通透的部分被收集與保留。此外，脫脂乳較佳於8℃以下進行薄膜通透。

在本發明較佳實施例中，前述最小化該脫脂乳中小於5,000 道爾頓之分子的量的步驟進一步包含利用溶劑交換法降低該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量。詳細來說，溶劑交換法係以水連續且主動提高脫脂乳中分子量高於5,000道爾頓之物質的濃度，並降低分子量低於5,000道爾頓之物質的濃度。此外，溶劑交換較佳於前述薄膜通透之後進行。溶劑交換法可降低該脫脂乳中乳糖和鹽類含量，並提高蛋白質含量至80%以上。

在本發明較佳實施例中，前述移除該脫脂乳之水分的步驟包 含蒸除該脫脂乳之水分及乾燥該脫脂乳之至少其一。詳細來說，蒸除該脫脂乳之水分較佳於低溫、低壓之狀態下，使用例如蒸發器(evaporator)等設備來進行。蒸除該脫脂乳之水分係為濃縮該脫脂乳，且較佳濃縮達到固形物含量為35%(w/v)以上。乾燥該脫脂乳的步驟較佳於蒸除該脫脂乳之水分後，以例如噴霧乾燥等方式進行。乾燥之步驟除去脫脂乳中大部分的水分，且獲得粉末狀之乳汁萃取物。

另一方面，在本發明實施例中，用於製備預防、緩解、或治 療類風濕性關節炎的組成物，或用於製備調節第一型輔助性T細胞反應的組 成物，或用於製備預防、緩解、或治療自體免疫反應所致四肢腫脹的組成物的乳汁萃取物較佳具如下組成與特性。該些組成與特性可經物理化學試驗、免疫及微生物試驗獲得，且可作為乳汁萃取物的品質管理標準。

1. 化學試驗

2. 物理試驗

3. 免疫試驗

3. 免疫試驗中所測專一性抗體較佳為牛的抗Salmonella enteritidis抗體。

4. 微生物試驗

如上所述，本發明提供一種乳汁萃取物之用途，用於製備預 防、緩解、或治療類風濕性關節炎的組成物，或用於製備調節第一型輔助性T細胞反應的組成物，或用於製備預防、緩解、或治療自體免疫反應所致四肢腫脹的組成物。使用乳汁萃取物製備而得之組成物於預防、緩解、或治療類風濕性關節炎、於調節第一型輔助性T細胞反應，或於預防、緩解、或治療自體免疫反應所致四肢腫脹的功效係於下方描述，其中該功效係經實驗證實。在本發明實施例中，係以如下實驗流程以及分組設計進行動物實驗：

較佳而言，是以所設計之分組進行至少兩次實驗流程。舉例 來說，在本發明實施例中，係分別對兩批實驗動物進行實驗。兩次實驗的結果可合併分析。

(一)建立動物模式：較佳而言，係以膠原蛋白誘發之方式，建立類風濕性關節炎的動物模式。例示如下：

1. 實驗動物：建議選用小鼠，如5~8週齡之DBA/1小鼠。在本發明較佳實施例中，可令5~6週齡之小鼠適應一週以上再進行實驗，例如以8~9週齡之小鼠進行實驗。此外，本發明係分別進行二批小鼠的實驗，再合併分析實驗結果。實驗結果以學生氏t檢定，數值係以平均值±標準差表示。

2. 實驗材料；誘發類風濕性關節炎之膠原蛋白及佐劑包含：(1)第二型膠原蛋白Type II collagen(CII)；(2)弗氏完全佐劑(Freund’s Complete adjuvant,CFA，含有4 mg/ml經加熱殺死的結核分枝桿菌)；以及(3)弗氏不完全佐劑(Freund’s Incomplete adjuvant,IFA)。

3. 誘發方法：

(1)致發炎：將CII與CFA以1：1的體積比例於冰上操作混合。使用微量注射器以26*1/2 gauge針頭對小鼠實施尾皮內注射，即注入50微升的CII/CFA混合乳化劑。

(2)加強發炎反應：將CII與IFA以1：1的體積比例混合，製作加強劑。實施尾皮內注射，即注入50微升的CII/IFA混合乳化劑。

此外，對於空白對照組內的小鼠，係注射50微升滅菌PBS取代CII/CFA或CII/IFA混合乳化劑來進行注射。

(二)餵食使用乳汁萃取物製備而得之組成物、對照藥物、或對照食物：

(1)餵食使用乳汁萃取物製備而得之組成物：餵食小鼠之組成物可具有一含量之乳汁萃取物、或由該含量之乳汁萃取物製備、或具有相當於該含量之乳汁萃取物所含成分。該含量可參考人類每日/每單位體重之適當攝取量作為餵食小鼠之組成物中所含之乳汁萃取物量(例如重量)；其中餵食小鼠之乳汁萃取物量可由例如一函數關係自人類的乳汁萃取物攝取量換算而得。

(2)餵食對照藥物：在本發明實施例中，較佳係設計有以藥物處理的正對照組。舉例來說，可以常見之類風濕性關節炎治療藥物：非類固醇消炎止痛藥(NSAID)Indomethacin(IDN)，用於正對照組。IDN在臨床上用於緩解疼痛、發熱與腫脹等發炎症狀。

(3)餵食對照食物：在本發明實施例中，可進一步設計有以食物處理的食物對照組。舉例來說，可以具有抗發炎等免疫調節功能之苜蓿芽乙酸乙酯萃取物用於食物對照組。

此外，對於控制組內的小鼠，係以100微升水餵食。

(三)收集動物樣品。動物樣品除了血液以外，可包含腹腔細胞以及於動物犧牲後取得之檢體。血液樣品、細胞及檢體之取得例示如下：

(1)血液樣品：自致發炎起，約每兩週進行眼窩採血；其中較佳係以乙醚使小鼠昏迷後再行採血。將所收集之血液以轉速12,000 rpm離心15分鐘，收集上清液並保存。上清液之檢測較佳包含血清中特異性抗體與非特異性抗體濃度，詳如實施例3。

(2)腹腔細胞：滅菌之緩衝液如HBSS係注入鼠體內，輕晃鼠體再吸出而取得細胞懸浮液。將細胞懸浮液以轉速1,500 rpm離心10分鐘，移除上清液；清洗後計數細胞並使細胞貼附於培養皿。細胞貼附後移除上清液、加入等量的培養液或含LPS(裂殖素)之培養液，預處理1小時並經48小時的恆溫培養(5%CO₂,37℃)後，收集上清液並保存。上清液之檢測包含腹腔細胞分泌之發炎細胞激素。在本發明實施例中，檢測之 發炎細胞激素較佳包含類風濕性關節炎之主導激素。目前普遍認為類風濕性關節炎之主導激素包含TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-12；詳如實施例4。細胞激素之分泌量，舉例來說，可以ELISA測定。

(3)檢體：較佳於犧牲小鼠後收集。在本發明實施例中，檢體包含臟器、細胞及組織；其中包含觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟之重量變化(詳如實施例1)，以及取下小鼠腳掌製作病理切片，觀察小鼠關節如踝關節及其周圍。脾臟細胞之取得為：在無菌操作下取出脾臟、置於TCM培養液(10ml TCM^TM加入500ml RPMI-1640培養液)中，磨碎脾臟使成細胞懸浮液；離心(150xg)懸浮液10分鐘，移除上清液；加入ACK裂解液並靜置2分鐘、加入HBSS緩衝液，離心(150xg,10分鐘)後以HBSS緩衝液洗去ACK裂解液；加入TCM培養液使成細胞懸浮液；取適當量細胞液與含ConA或CII的TCM培養液混合，其中細胞最終密度較佳為5*10⁶ cells/ml，ConA最終濃度較佳為5 μ g/ml，CII最終濃度較佳為40 μ g/ml；細胞經24小時的恆溫培養(5%CO₂,37℃)後，收集上清液並保存。上清液之檢測包含脾臟細胞分泌之發炎細胞激素；詳如實施例5。在本發明實施例中，檢測之發炎細胞激素較佳包含IL-2及IFN-λ，其係發炎反應時，活化的T細胞所分泌。此外，脾臟之細胞液並另以含裂殖素(刺激物)的培養液培養48小時，進行免疫細胞增生能力之測試。舉例來說，可以³H-thymidine嵌入法或MTT法測試。在本發明實施例中，係於脾臟細胞液經培養48小時後加入0.05 μ Ci/ml ³H-thymidine反應24小時、收集細胞於纖維濾紙上並於風乾後測定³H-thymidine強度，藉以測試脾臟細胞之增生能力；詳如實施例6。

此外，在本發明實施例，除了前述分析以外，進一步包含觀察小鼠體重的變化及發炎反應/自體免疫反應所致四肢腫脹的情形；詳如實施例1及2。其中體重的部分在此例中係比較小鼠分組前及犧牲時的體重；四肢腫脹係大約於致發炎後兩週始觀察。此外，係可對腫脹程度進行評分。在本發明實施例，舉例來說，係參考文獻Brand,D.D.et al.,Nat.Protoc.2007所揭示之表進行評分。計分及其代表之腫脹程度如下示：表3：腫脹量表

實施例1：對生長狀況的影響

如表4所示，相較於控制組，空白對照組(即未發炎的組別) 的小鼠在犧牲時的體重較重。然而，其他組別小鼠犧牲時的體重與控制組相比並未有顯著差異。如表5所示，空白對照組的小鼠在犧牲時的脾臟重量在統計上較控制組低，其他組別的脾臟重量和控制組相比並未有顯著差異。其次，在心臟、肝臟、肺臟及腎臟的重量，各組間未有差異。

表5：使用乳汁萃取物製備而得之組成物對小鼠臟器重量的影響

實施例2：四肢腫脹的影響

請參考圖1與表3。在本發明實施例中，係依據表3對小鼠 每肢腫脹程度進行評分，因此最低分為0分，最高分可達16分。結果如表6及圖1所示，如同正對照組，乳汁萃取物組與控制組相比在統計上顯著降低小鼠四肢腫脹的情形。

實施例3：血清中免疫球蛋白濃度及C-反應性蛋白濃度

在類風濕性關節炎病人血清中常可發現高濃度的自體抗體(又稱風濕因子；高濃度風濕因子可表示體內在進行發炎反應)，其中最常見的風濕因子為對構成關節軟骨的第二型膠原蛋白(type II collagen，CII)產生的抗原特異性免疫球蛋白IgG2a，其表現可作為一發炎指標。結果如表7所示。如同正對照組，乳汁萃取物組與控制組相比具有顯著降低血清中CII特異性疫球蛋白IgG2a濃度的功效，進而降低發炎反應的發生；其中高劑量組別更在統計上達顯著差異。此外，值得注意的是，在發炎反應加強後(施打加強劑之後)，餵食約七週後之中、高劑量乳汁萃取物組不但在統計上具有顯著降低的血清中CII特異性疫球蛋白IgG2a濃度，其中高劑量組更達p<0.01的顯著差異，顯示在病程中期後持續食用使用乳汁萃取物製備而得之組成物可緩和血清中CII特異性免疫球蛋白IgG2a濃度的進一步提高。

再者，如表8所示，乳汁萃取物組與控制組相比在統計上亦顯著降低血清中非特異性免疫球蛋白G(IgG)而具有減緩發炎的作用。另一方面，乳汁萃取物有提高血清中免疫球蛋白A(IgA)的趨勢，符合食用 免疫奶製品有助於提升腸道抗體的說法。

除了特異性/非特異性抗體(免疫球蛋白)以外，本發明實施例進一步檢測血清中另一非特異性發炎指標：C-反應性蛋白(CRP)。結果如表9所示。如同正對照組，乳汁萃取物組與控制組相比，C-反應性蛋白有降低的趨勢。

實施例4：對腹腔細胞分泌發炎細胞激素的影響

腹腔中有肝臟、脾藏、腸胃等臟器，且含有包含免疫細胞的液體；其中免疫細胞包括巨噬细胞、B细胞及T细胞。在類風濕性關節炎的致病機轉中，T細胞扮演很重要的角色。其中該致病機轉目前推測是由於自體或外來的一未知抗原與第二型組織相容複合體分子(MHC II)及抗原呈現細胞(APC)結合後，與T細胞受器(TCR)連結而活化T細胞。T細胞因此產生發炎性的細胞激素例如TNF-α、IL-1、IL-6及IL-12，以及產生促使發炎細胞進入關節腔的分子；發炎細胞進入關節腔則可造成滑液囊發炎。此外，發炎細胞激素如TNF-α、IL-1及IL-6會刺激關節中的巨噬細胞與纖維母細胞分泌軟骨分解酵素，造成軟骨的破壞，刺激骨髓的單核細胞分化為蝕骨細胞，造成骨基質的破壞。另一方面，T細胞會產生血管內皮生長因子，使局部血管新生，讓更多發炎細胞浸潤。因此，在本發明實施例中，係藉由測定該些類風濕性關節炎主導激素TNF-α、IL-1、IL-6及IL-12的表現，作為評量由乳汁萃取物製備而成之組成物預防、緩解、或治療類風濕性關節炎的依據。如表10-1~4所示。

如表10-1~4所示，乳汁萃取物組與控制組相比，在統計上顯著降低腹腔細胞自發性的TNF-α、IL-1、IL-6及IL-12分泌量；其中中、高劑量的乳汁萃取物在統計上皆顯著降低腹腔細胞自發性的IL-1分泌量。乳汁萃取物並且在統計上顯著降低LPS刺激下腹腔細胞的IL-12分泌量。

另一方面，在第一型輔助性T細胞(Th1)與第二型輔助性T細胞(Th2)及其相關細胞激素以外，近來在許多自體免疫疾病患者身上，發現Th17分泌的IL-17量上升。IL-17被認為是一種重要的自體免疫介質。此外，IL-17可促進TNF-α、IL-6及IL-1分泌，進而加強發炎反應。在本發明實施例，進一步測定IL-17表現的情形。如表10-5所示，乳汁萃取物組與控制組相比係降低腹腔細胞自發性的IL-17分泌量，且在統計上顯著降低LPS刺激下腹腔細胞的IL-17分泌量。

實施例5：對脾臟細胞分泌發炎細胞激素的影響

如前述，在類風濕性關節炎的致病機轉中，T細胞活化。活化的T細胞除了產生發炎性的細胞激素外，會分泌IL-2及IFN-γ作用於吞噬細胞。IL-2及IFN-γ一般為第一型輔助性T細胞(Th1)所分泌；在一些自體免疫疾病患者身上亦可觀察到IL-2及IFN-γ分泌量增加的情形。此外，活化的吞噬細胞會分泌TNF-α及IL-1，進一步促進免疫反應；其中如前述，TNF-α與IL-1亦為類風濕性關節炎主導激素。在本發明實施例中，如表11所示，乳汁萃取物組與控制組相比，在統計上顯著降低脾臟細胞的IL-2與IFN-γ分泌量。

實施例6：對免疫細胞生長的影響

在本發明實施例中，進一步評估免疫細胞的增生能力。免疫細胞增生能力係指免疫細胞受到刺激時(例如添加裂殖素)，能夠增生的能力。在本發明實施例中，如表12所示，比較中劑量乳汁萃取物組與控制組，脾臟細胞在刺激下(以LPS刺激)其B細胞的增生沒有達到統計上顯著差異，然空白對照組中B細胞之增生相較於控制組在統計上達p<0.01顯著差異；比較中、高劑量乳汁萃取物組與控制組，脾臟細胞在刺激下(以PHA刺激)其T細胞的增生沒有達到統計上顯著差異，然空白對照組中T細胞之增生相較於控制組在統計上達p<0.01顯著差異。當以本動物模式之特異性刺激物CⅡ刺激脾臟細胞，則實驗組的所有組別及空白對照組中脾臟細胞之增生皆高於控制組。

表12：使用乳汁萃取物製備而得之組成物對免疫細胞增生能力的影響

綜上所述，本發明使用乳汁萃取物製備而得之組成物的功效包含：

(1)可降低Th1型免疫反應中的抗原特異性免疫球蛋白IgG2a及Th1細胞激素TNF-α、IFN-γ、IL-2，同時也降低IL-1，以及降低調節Th1反應的IL-12與調節Th1細胞激素的IL-17。

(2)本發明使用乳汁萃取物製備而得之組成物可防止日後抗原特異性免疫球蛋白濃度的提高，顯示該組成物具有預防的能力。

(3)本發明使用乳汁萃取物製備而得之組成物並改善四肢腫脹的情形，此不但表示四肢活動能力獲得改善，且發炎反應亦獲得緩解。

(4)本發明使用乳汁萃取物製備而得之組成物達成的效果不亞於一治療藥物，顯示該組成物具有治療的能力。

(5)另一方面，本發明使用乳汁萃取物製備而得之組成物較佳係以餵食方式投予小鼠，相當於人體以口服方式攝食該組成物，啟動腸 道黏膜免疫系統；此係合於口服耐受性之免疫原理。

本發明已由上述相關實施例加以描述，然而上述實施例僅為實施本發明之範例。必需指出的是，已揭露之實施例並未限制本發明之範圍。相反地，包含於申請專利範圍之精神及範圍之修改及均等設置均包含於本發明之範圍內。

Claims (23)

1. 一種乳汁萃取物之用途，用於製備預防、緩解、或治療類風濕性關節炎的組成物，其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G，且該乳汁萃取物係由包括下列各步驟之方法所生成：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態，其中該超高免疫狀態係經由投予由沙門氏桿菌、模仿葡萄球菌、表皮鏈球菌、A1型產膿鏈球菌、A3型產膿鏈球菌、A5型產膿鏈球菌、A8型產膿鏈球菌、A12型產膿鏈球菌、A14型產膿鏈球菌、A18型產膿鏈球菌、A22型產膿鏈球菌、產氣桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸道沙門氏菌、流行性感冒嗜血桿菌、和緩鏈球菌、普通變形桿菌、赤痢桿菌、肺炎雙球菌、粉刺出油酸菌、突變鏈球菌、無乳鏈球菌之細菌性抗原組成之多價混合物所誘生；自該產乳動物收集乳汁；在不大於80℃之溫度條件下進行該乳汁之滅菌；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量；以及移除該脫脂乳之水分，而完成該乳汁萃取物；其中該組成物以一每日適當量投予人體，且該適當量於小鼠之等效劑量包含重量不大於40毫克之乳汁萃物。
2. 一種乳汁萃取物之用途，用於製備降低第一型輔助性T細胞反應的組成物，其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G，且該乳汁萃取物係由包括下列各步驟之方法所生成：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態，其中該超高免疫狀態係經由投予由沙門氏桿菌、模仿葡萄球菌、表皮鏈球菌、A1型產膿鏈球菌、A3型產膿鏈球菌、A5型產膿鏈球菌、A8型產膿鏈球菌、 A12型產膿鏈球菌、A14型產膿鏈球菌、A18型產膿鏈球菌、A22型產膿鏈球菌、產氣桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸道沙門氏菌、流行性感冒嗜血桿菌、和緩鏈球菌、普通變形桿菌、赤痢桿菌、肺炎雙球菌、粉刺出油酸菌、突變鏈球菌、無乳鏈球菌之細菌性抗原組成之多價混合物所誘生；自該產乳動物收集乳汁；在不大於80℃之溫度條件下進行該乳汁之滅菌；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量；以及移除該脫脂乳之水分，而完成該乳汁萃取物；其中該組成物係以一每日適當量投予人體，且該適當量於小鼠之等效劑量包含重量不大於40毫克之乳汁萃取物。
3. 一種乳汁萃取物之用途，用於製備預防、緩解、或治療自體免疫反應所致四肢腫脹的組成物，其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G，且該乳汁萃取物係由包括下列各步驟之方法所生成：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態，其中該超高免疫狀態係經由投予由沙門氏桿菌、模仿葡萄球菌、表皮鏈球菌、A1型產膿鏈球菌、A3型產膿鏈球菌、A5型產膿鏈球菌、A8型產膿鏈球菌、A12型產膿鏈球菌、A14型產膿鏈球菌、A18型產膿鏈球菌、A22型產膿鏈球菌、產氣桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸道沙門氏菌、流行性感冒嗜血桿菌、和緩鏈球菌、普通變形桿菌、赤痢桿菌、肺炎雙球菌、粉刺出油酸菌、突變鏈球菌、無乳鏈球菌之細菌性抗原組成之多價混合物所誘生；自該產乳動物收集乳汁；在不大於80℃之溫度條件下進行該乳汁之滅菌；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量；以及 移除該脫脂乳之水分，而完成該乳汁萃取物；其中該組成物以一每日適當量投予人體，且該適當量於小鼠之等效劑量包含重量不大於40毫克之乳汁萃物。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該類風濕性關節炎之預防、緩解、或治療包含降低第一型輔助性T細胞反應。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該類風濕性關節炎之預防、緩解、或治療包含抑制發炎相關細胞激素的分泌。
6. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該第一型輔助性T細胞反應的降低包含抑制發炎相關細胞激素的分泌。
7. 如申請專利範圍第5或6項所述之用途，其中該細胞激素包含IL-2及IFN-γ。
8. 如申請專利範圍第5或6項所述之用途，其中該細胞激素包含IL-17、IL-6、IL-1、IL-12及TNF-α之至少其一。
9. 如申請專利範圍第5或6項所述之用途，其中該發炎相關細胞激素由包含脾臟之器官所分泌。
10. 如申請專利範圍第5或6項所述之用途，其中該發炎相關細胞激素由腹腔細胞所分泌。
11. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該類風濕性關節炎之預防、緩解、或治療包含降低第一型輔助性T細胞特異性免疫球蛋白G2a(IgG2a)數量。
12. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該第一型輔助性T細胞反應的降低包含降低第一型輔助性T細胞特異性免疫球蛋白G2a(IgG2a)數量。
13. 如申請專利範圍第11或12項所述之用途，其中該第一型輔助性T細胞特異性免疫球蛋白G2a(IgG2a)包含血清中膠原蛋白特異性免疫球蛋白。
14. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該類風濕性關節炎之預防、緩解、或治療降低四肢腫脹的情形。
15. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之用途，其中每公克之乳汁萃取物具有6000以上的抗體力價。
16. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之用途，其中該滅菌溫度進一步介於80℃與65℃之間，且滅菌時間為10至20秒鐘。
17. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之用途，其中該最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量的步驟包含利用可保留5,000道爾頓以上之分子的薄膜進行該脫脂乳之薄膜通透。
18. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之用途，其中該最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量的步驟進一步包含利用溶劑交換法降低該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量。
19. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之用途，其中最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量的步驟包含降低該脫脂乳中乳糖和鹽類含量。
20. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之用途，其中該移除該脫脂乳之水分的步驟包含蒸除該脫脂乳之水分及乾燥該脫脂乳之至少其一。
21. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之用途，其中該組成物以口服投予。
22. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之用途，其中該投予包括每日每公斤體重投予具有相當於一重量之乳汁萃取物所含成分之該組成物，且該重量不大於180mg。
23. 一種乳汁萃取物之用途，用於製備預防、緩解、或治療類風濕性關節炎的組成物，其中每100公克之該乳汁萃取物含有80公克以上的蛋白質量，具有大於600毫克的免疫球蛋白G，且該乳汁萃取物係由包括下列各步驟之方法所生成：使一產乳動物維持在一超高免疫狀態，其中該超高免疫狀態係經由投予S100免疫原之細菌性抗原組成之多價混合物所誘生；自該產乳動物收集乳汁；在不大於80℃之溫度條件下進行該乳汁之滅菌；去除乳汁中之脂肪而生成一脫脂乳；最小化該脫脂乳中小於5,000道爾頓之分子的量；以及移除該脫脂乳之水分，而完成該乳汁萃取物；其中該組成物係以一每日適當量投予人體，且該適當量於小鼠之等效劑量包含重量不大於40毫克之乳汁萃取物。