JP2002501526A - 乳汁における免疫グロブリンａの生成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、乳房内(IMM)、腹腔内（IP）及び筋肉内（IM）経路から選択されたいづれか２つの経路によって、抗原により活性免疫化し、そしてIMM，IP又はIM経路による第３投与経路によって、抗原により活性免疫化し、但し、すべての３種の投与経路は異なっていることを含有する、免疫グロブリンＡ(IgA)の誘発方法を言及する。そのような方法はこれまで開示されても、又は示唆されてもおらず、そして従って、それらの方法は新規且つ新歩性がある。さらに、本発明は、前記方法の生成物の記載される用途の観点から、産業的適用性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 乳汁における免疫グロブリンＡの生成方法 技術分野 本発明は、哺乳類における免疫グロブリンＡの生成方法、免疫グロブリンＡを 含む乳汁を生成する方法、及び生成された免疫グロブリンＡ及び乳汁の使用に関 する。 背景 免疫グロブリンＡ(IgA)は、ほとんどすべての体液に存在する十分に詳細に記 載されている免疫グロブリンである。それは、呼吸器、胃腸及び尿生殖器管の粘 膜表面を通して侵入する病原性生物による感染からの宿主の保護において主な役 割を演じると思われる。IgAは、毒素及びウィルス粒子を中和し、細菌性病原体 の付着を阻害し、そして病原性微生物による粘膜表面でのコロニー形成及び侵入 を妨げることによって、粘膜表面からの病原性細菌、ウィルス又は寄生生物、及 び種々の摂取された又は吸入された抗原のクリアランスに関与している。従って 、乳汁における免疫グロブリン、たとえばIgAの主たる役割は、哺乳期間の間、 子供の胃腸器管に局部的な保護免疫性を提供することである。 免疫グロブリンは、腸の細菌又はウィルス感染を治療するための医薬及び獣医 分野において、並びにより一般的には、疾病及び炎症の治療において有用である ものとして認識されて来た。年長にわたり、免疫グロブリンを生成するための種 々の技法が提案されている。反すう動物乳汁からの免疫グロブリンの誘発及び収 穫のための方法が特に一般的な方法である。このアプローチは、乳汁中に生成さ れる免疫グロブリンが即座の消費のために適切な形で存在し、又は適切な調合乳 もしくは製品に加工され得ることにおいて特に好都合である。それは使用するの が安全であり、そして抗体を含む乳汁を生成するための産業的基礎構造はすでに 存在する。 反すう動物の免疫系は、ウシ乳分泌において有用な免疫グロブリンがIgG₁であ る点において、そのヒトの対応物とは異なるように思える。従って、理論的には 好ましい免疫グロブリンは上記で概略される理由のためにIgAであるが、活性免 疫化(active immunization)による乳汁における抗体生成は、免疫グロブリンＧ 類に集中されて来た。 反すう動物の乳汁において高められたレベルのIgAを生成するためへのいくつ かの試みがなされて来た。単一の投与経路、たとえば非経口、皮下、静脈内、全 身性、経口、腹腔内、筋肉内、乳房内及び同様の経路によるワクチン接種のため の計画が提案されている。一般的に、それらの投与経路は、IgG₁の卓越した生成 をもたらして来た。全身性免疫化は乳汁中にIgA及びIgMの両者を生成したが、し かしそれは低い濃度でのみ生成された。筋肉内／皮下（IM）及び乳房内(IMM)免 疫化過程が組合される場合、その応答は増強された（Am．J．Vet．Res¹）。非経 口（IP）及び乳房内(IMM)注入の組合せもまた、IgA及びIgG₁を生成することが示 されている（Immunology⁷；Res．in Vet．Sci.⁸，Res．in Vet．Sci．”，The R uminant Immune System is Health and Disease¹⁰）。この経路はIgA生成の限定 された増強を導びくことが注目されている（The Ruminant Immune System in He alth and Disease¹⁰）。IM及びIMM免疫化の組合せが、乳汁におけるIgG₁の卓越 性、並びにIgG₂，IgA及びIgMのレベルの一般的な上昇性を生ぜしめた(Am．J．Ve t．Res.¹)。生成される抗体力価の動物変動性間の有意性もまた注目されている 。 IgG₁の生成の卓越性は、生成されるIgGが反すう動物乳分泌における主要な免 疫グロブリンである発見と一致する。 乳房内免疫化技法は一般的に、乳房感染の高い機会のために、野外条件下での ワクチン接種のための経路としては好ましくない(Aus．J．Dairy Technology⁶) 。しかしながら、他の研究は、これが事実でないことを示唆している(Am．J．Ve t．Res.¹)。 乳腺分泌における免疫グロブリン生成に関する公開された文献の多くは、動物 又はそれらの子孫における疾病防止に向けられていることが注目されるべきであ る。免疫グロブリン自体を得るために免疫グロブリン富化された乳汁の生成に向 けられた文献はほとんどない。 この例外は、スイス特許第1,573,995号における、乳酸起原の免疫学的因子を 含むタンパク質濃縮物の製造方法である。ほぼ、20年前、この特許は、乳腺中へ の槽内滴注（intraciternal instillation）、非経口注射（皮下、静脈内）、乱 切法による乳房後方神経節系中への注入、経口摂取、又はそれらの態様のいくつ かの組合せにより、高い抗体力価を有する乳汁を生成するための方法を開示した 。開示される初乳及び遷移性乳汁を得るための唯一の特別な免疫化プロトコール は、出産の前、８週間にわたって、11の免疫化段階を包含した。このプロトコー ルは、複数の非経口（静脈内を包含する）投与段階、並びに、散在するいくつか のIMM投与段階を含んで成り、そして出産前の週において２回の投与段階を必要 とする。 このプロトコールは、今日、広く使用されていない。この免疫化計画は、関与 する段階の数から面倒であり、そして免疫グロブリンＡ生成のために、実際的に 最適化されていない。実際、この特許は、IgAが反すう動物の母性乳汁において 卓越することを示唆する点においての誤解を与えており；IgAがヒト乳汁におい て卓越すると いう知識に起因する誤解をまねいている。他の教示（たとえば、Aus．J．Dairy Technology⁶を参照のこと）において確立されるように、IgGは母性乳汁に生成さ れる卓越した免疫グロブリンである。 抗原の経口供給は、接種されていない対照と比較して、乳房分泌においてIgA 力価の上昇をほとんどもたらさないか又はまったくもたらさないことがまた、介 入する年に示されいる(Am．J．Vet．Res.¹)。第一胃の存在が、抗原の小腸への 到達を妨げていると推定される。従って、Hilpertにより要求される経口投与段 階は現在、禁止されている。 同様に、静脈内注入は一般的に、可能性ある悪影響、たとえば過敏性ショック のために、免疫化目的のためには推薦されない（Cold Spring Harbor¹⁸，ILAR J ournal¹⁹）。 既知の抗原投与過程によりこれまで得られて来たよりも高いレベルで、乳汁中 にIgAを誘導し、そして生成するための方法の必要性が現在存在する。IgAの生成 における動物変動性をさらに減じる方法もまた所望される。免疫化プロトコール を単純化すると共に、IgAの生成を最適化する商業的方法もまた、探求されてい る。 従って、上記欠点を克服し、又は少なくとも有用な選択を公衆に提供する、乳 汁における免疫グロブリンＡの誘発及び生成のための方法を提供することが、本 発明の目的である。 従って、本発明は、広く、哺乳類における免疫グロブリンＡ(IgA)の誘発のた めの方法から成ると言うことができ、この方法は、 （ａ）乳房内(IMM)、腹腔内（IP）及び筋肉内（IM）から選択されたいづれか ２つの投与経路によって妊娠している哺乳類を抗原により積極的に免疫化し；そ して （ｂ）乳房内(IMM)、腹腔内（IP）及び筋肉内（IM）から選択された第３投与 経路により前記哺乳類を抗原により積極的に免疫化す ることを含んで成り、但し３種すべての投与路は異なっている。 さらなる観点においては、本発明は、免疫グロブリンＡ(IgA)を含む哺乳類乳 汁の生成方法を提供し、この方法は、 （ａ）上記の方法に従ってIgAを誘発し；そして （ｂ）前記哺乳類からIgAを含む乳汁を集める； ことを含んで成る。 好ましくは、初期免疫化プロトコールに続いて、出産前期間にわたって、追加 免疫化がプログラムされている。 本発明の好ましい方法においては、投与される抗原は、個々の投与経路に関し て同じである。 好ましくは、投与される抗原は、アジュバント中に乳化される。特に好ましい アジュバントは、フロイント不完全アジュバント(FIC)である。 本発明の１つの態様において、IgAは集められた哺乳類乳汁から単離され得る 。その単離されたIgAは、所望により、精製され得る。 さらなる観点においては、本発明は、本発明の方法に従って生成されたIgAを 含む哺乳類乳汁を提供する。 さらにもう１つの観点においては、本発明は、本発明の方法に従って生成され たIgAを提供する。 本発明の方法に使用するための好ましい哺乳類は、反すう動物、特に乳牛であ る。 本発明はさらに、本発明の方法に従って生成された免疫グロブリンＡの、医薬 、化粧品及び家畜用組成物、並びに食品、たとえば機能食物及びダイエット補足 剤への使用を提供する。 本発明は上記で広く定義されているが、本発明はそれに制限されず、そしてそ れが次に記載される例の態様も包含することは、当業 者により理解されるであろう。特に、本発明の好ましい態様は、次の添付図面に 関して、記載されるであろう。 図１は、羊大腸菌IgAエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)に おける陽性対照サンプルについての典型的な免疫グロブリン希釈曲線を示す。 図２は、出産後、０日、５日、２週及び４週でのすべてのグループについての 右の（免疫化された）乳腺の抗−大腸菌乳汁IgA力価を示す。 図３は、０日での、右の（免疫化された）乳腺及び左の（処理されていない） 乳腺の抗−大腸菌IgA乳汁応答を比較する。 図４は、出産後１日で、右の（免疫化された）乳腺を有する個々の羊に関する 抗−大腸菌IgA応答を示す。免疫化経路の効果が示される。 図５は、出産後２日で、右の（免疫化された）乳腺を有する個々の羊に関する 抗−大腸菌応答を示す。 図６は、０日及び５日目でのすべてのグループについての抗−３Ｋ Scourguar d右（免疫化された）乳腺乳汁IgA抗体力価を示す。 図７は、０日でのすべてのグループについての抗−３Ｋ Scourguard左（免疫 化された）乳腺及び左乳腺乳汁IgA抗体力価を示す。 図８は、羊TNF IgA ELISAにおける陽性及び陰性対照サンプルについての典型 的な希釈曲線を示す。 図９は、免疫化グループの個々についての出産後１日での右の（免疫化された ）乳腺乳汁サンプルにおける抗−TNF IgA力価の個々のサンプル分析を示す。 図10は、右の（免疫化された）及び左の（処理されていない）乳腺からの出産 後１日でのサンプルからの抗−TNF力価についてのデータを示す。 図11は、授乳期の段階に対する抗−TNF IgAの関係を示す。 図12は、Ｃ．アルビカンス（C．albicans）IgA ELISAにおける陽性及び陰性対 照サンプルについての典型的な希釈曲線を示す。 図13は、１，２，７，14及び60日でのすべてのグループについての右の（FIC におけるIMM免疫原）乳腺乳汁抗−Ｃ．アルビカンスIgA抗体力価を示す。 図14は、授乳期間にわたっての右の乳腺（水性IMM免疫原）及び左の乳腺（FIC IMM免疫原）における抗−Ｃ．アルビカンスIgA抗体応答を比較する。 詳細な記載 本明細書において使用される用語“乳汁”とは、哺乳類から生成される形での 乳汁及び初乳の両者を意味する。 本明細書において使用される用語“抗原”とは、処理された哺乳類において抗 原性応答を誘発することができるいづれかの物質を言及する。 本発明の第１の観点は、哺乳類における免疫グロブリンＡ(IgA)の誘発方法に 関する。前記方法は、第１段階において、乳房内(IMM)、腹腔内（IP）及び筋肉 内（IM）から選択されたいづれか２つの投与経路により妊娠した哺乳類を抗原に より積極的に免疫化することを含んで成る。第２段階として、哺乳類は再び、上 記それらの経路から選択された第３の投与経路により積極的に免疫化される。但 し、前記方法においては、選択される３種すべての投与経路は異なっている。 本発明者は、３種の投与経路の使用が、２種の既知の投与経路過程と第３の投 与経路とを単純に組合すことによって予測されるレベルよりも、IgA抗体力価レ ベルを高め、又はIgA抗体力価応答にお ける動物間変動性（animal variability）を少なくとも低めることを、驚くべき ことには見出した。 投与の経路の順序及びタイミングは、免疫グロブリンＡを誘発するための方法 に関しては決定的でないことが理解されるであろう。さらに、異なった経路によ る免疫化が、連続的に、断続的に、又は同時に実施され得る。現在好ましい免疫 化プロトコールは、同時IM及びIP免疫化、並びにそれに続くIMM免疫化である。I M及びIP免疫化は、免疫系応答を感作するよう効果的に作用する。IMM免疫化は、 その免疫化された領域においてIgA生成を誘発するための局在化された攻撃であ る。 さらに好ましい態様においては、初期免疫化プロトコールに続いて、出産前の 期間にわたって、抗原の多くの追加用量が伴なう。導入される抗原の量、頻度（ 時間間隔）、及び追加免疫化用量の回数は広く変化することができる。たとえば 、１つの場合での１つの投与経路を通しての１回の追加免疫化ショットから多く の異なった場合での３種の投与経路の個々を通しての複数回の追加免疫化ショッ トまで、広く変化する。 追加免疫化ショットは一般的に、オペレーターの便利さに合うように間隔を開 けられる。局部的な刺激及び充血を回避するために、同じ部位への追加免疫化シ ョットは１週以上ごとの頻度で与えられないことが通常好ましい。 好ましい１つのレジメに関しては、２つの別々の場合においての同時のIM及び IP免疫化、続いて１つの場合においてのIMM免疫化が必要とされる。すなわち、 効果的な２回の感作段階、続いての局部的な攻撃である。最初の感作段階は一般 的に、２回目の感作及び攻撃段階の２〜８週前に実施される。それらの後者の段 階は所望により同時に実施される。便利なプロトコールは、最初の感作段階に関 しては、出産前６〜14週、好ましくは８〜12週、そして最とも望ましくは８週で もたらされ、そして第２の感作／局部攻撃段階は、出産前、２〜10週、好ましく は４〜８週、そして最とも望ましくは４週前にもたらされる。しかしながら、上 記に示されたように、タイミングは決定的ではない。 第２の好ましいレジメに関しては、初期免疫化が、出産前６〜14週、好ましく は８〜12週、そして最とも望ましくは８週でもたらされ、続いて、出産前、１〜 ３の場合において３種の投与経路の個々を通しての１〜２回の追加免疫化ショッ トが伴なう。最終免疫化は一般的に、出産前１〜２週で与えられるであろう。 出産前８週（−８週）で、同時的IM及びIP免疫化、続いて、−４週での同時的 IM／IP及びIMM免疫化、−２週での第２のIMM免疫化並びに−１週での最終的な同 時的IM及びIP免疫化が存在するよう、１つの追加の感作及び局部的攻撃段階を必 要とするレジメが特に好ましい。 追加の好ましいレジメに関しては、出産前12週でもたらされる初期IM／IP免疫 化、及び出産前８週での第２の感作／局部的攻撃段階、−６週での第２のIMM免 疫化、並びに−４週での最終の同時IM／IP免疫化が存在する。 出産前14週で、好ましくは出産前12又は８週で開始する免疫化のタイミングの 広い変動性が一般的に実施できることが上記から理解されるであろう。 出産に続いて、低下する抗体濃度は、上記に概略された同等の出産前プロトコ ールに従って、授乳期の間、哺乳類中に選択された抗原の追加免疫ショットを定 期的に導入することによって高められ得る。一般的に、これは、授乳期の関与段 階での１回のIMM免疫化と共に、出産に続いて授乳期相において、１〜６回、好 ましくは２〜 ４回、そして最とも好ましくは２又は３回の同時的IM及びIP免疫化を包含する。 本発明のさらなる態様においては、本発明の方法はさらに、予備選択段階を包 含する。この段階においては、個々の動物が、IgAを生成するそれらの能力につ いて試験され、そして選択される。 上記のように、相当の動物間変動性が、免疫グロブリンの生成に関して存在す る。最良のIgA抗体力価応答を示す動物が選択されるこの予備選択段階は、動物 間変動性因子の低下を助ける。この工程は同様に、IgA生成に特に適切な動物の グループを構築するために使用され得る。 IM，IP及びIMM投与のための工程は当業界においてよく知られている。IM免疫 化に関しては、一般的に、１以上の部位がこの工程による投与のために使用され ることが好ましい。IM投与のための好ましい部位は、腕頭筋肉の左及び右側（す なわち、１つの筋肉において２つの部位）である。IP免疫化に関しては、一般的 に、わずか１つの部位での腹腔中への投与が現在、好ましい。好ましくは、投与 は、腰下窩で実施される。それらの経路のための投与の正確な部位は、もちろん 、既知の投与プロトコールに従って変化することができる。投与される抗原の量 及び形はまた、既知のワクチン配合に従って免疫化される動物及び使用される抗 原に従って変化するであろう。 一般的に、抗原は、IM及びIP経路に関しては、注射器及び針を用いて：及びIM M経路に関しては、注射器に固定された小さな穴のあるポリエチレン製手術用管 、又は他方では、従来の無菌乳房内アプリケーターを用いて注入される。IMM免 疫化に関しては、抗原は一般的に、主要乳汁分泌性管又は乳腺上リンパ節を通し て投与される。好ましくは、処理オリフィスを通して処理管中に投与される。最 良の結果のためには、個々の乳腺が個々の場合で免疫化されることがまた好まし い。これは、哺乳類において高められる局在化されたIgA応答を最大にする。 注入される抗原の体積は、哺乳類及ひ免疫化の経路に従って変化するであろう 。下記表１は、IM，IP及びIMM経路を通して免疫化される羊及び牛についての注 入体積の要約である。 典型的には、ウシを免疫化するためには、抗原は、IMに関しては、１つの部位 当たり２mlで２つの部位に、IPに関しては、１つの部位で４ml、そしてIMMに関 しては、４つの腺の個々中に２ml、投与される。 従来の知識に反して、適切な注意が払われる場合、野外試験は、乳房内免疫化 を用いての感染の有意な危険性は存在しないことを示す。たとえば、免疫化の前 、腺を殺菌することに注意が払われるべきである。適切な殺菌方法は、当業界に 知られている。たとえば、エタノール／ヨウ素洗浄がこの目的の役に立つであろ う。さらなる 注意は、抗原が、抗生物質含有溶液中で投与されることを確保することに払われ る。適切な抗生物質は、ドゥボシリン（dupocillin）及びアンピシリン、並びに clavulox L.Cを包含する。 本発明の方法に使用するために選択される哺乳類は一般的に、経済的に有用な 哺乳類、たとえば反すう動物であろう。反すう動物の例としては、牛、ヤギ及び 羊を挙げることができる。 用語“抗原”とは、本明細書において使用される場合、処理された哺乳類にお いて抗原性応答を誘発することができるいづれかの物質を意味する。抗原は、Ig A配合物の究極的な利用に従って選択され得る。すなわち、前記配合物が受動免 疫性を生成するために使用される場合、そのような免疫性が調べられる抗原が使 用されるべきである。本発明の方法に使用され得る抗原性物質は、細菌、ウィル ス、酵母、マイコプラズマ、タンパク質、ハプテン、動物組織抽出物、植物組織 抽出物、精子、菌類、花粉、ダスト、化学物質抗原、及び哺乳類細胞を包含する 。 ハプテンが抗原として使用される場合、それらはまず、当業者によく知られて いる化学的方法を用いて、キャリヤー物質、たとえばタンパク質に接合されるべ きである（ILAR Journal¹⁹）。 有用な細菌性抗原は、エシェリキア(Escherichia)、スタフィロコッカス（Sta phylococcus）、ストレプトコッカス(Streptococcus)、サルモネラ（Salmonella ）及びニウモノコーカス（Pneumonococcus）の種を包含する。特に好ましい細菌 抗原は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、クロストリジウム・ジフィ シレ(Clostridium difficile)、ビブリオ・コレアエ(Vibrio cholerae)、及びヘ リコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)である。 好ましい酵母抗原は、カンジダ(Candida)の種を包含する。 特に好ましい酵母抗原は、カンジダ・アルビカンス（Candida al bicans）である。 有用なウィルス抗原は、ロタウィルス、ヘルペス、鶏痘、鼻肺炎；コロナウィ ルス、パルボウィルス及びインフルエンザを包含する。タンパク質抗原は、腫瘍 壊死因子、インスリン様成長因子、及びソマトスタチン、ウィルス又は細菌細胞 表面タンパク質及び接合されたタンパク質抗原を包含する。化学物質抗原は、花 粉、殺虫剤、殺昆虫剤、殺カビ剤及びトキシンを包含する。同定される複数の抗 原の組合せを含んで成る複合体抗原もまた実施可能である。１つのそのような好 ましい複合体抗原は、３Ｋ Scourguard(Smithkline Beecham，Royal Oak，Auckl and，New Zealand)である。ワクチンは、病原性大腸菌、ウシロタウィルス、及 びコロナウィルスを含む。 有用なマイコプラズマ抗原は、マイコプラズマ・ニウモニアエ(Mycoplasma pn eumoniae)及びクリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）を 包含する。 一般的に、抗原性物質は、既知のプロトコールに従って、注入又は注射のため に液体媒体に懸濁される。当業界において知られているいづれかの適切なキャリ ヤー、希釈剤、緩衝液及びアジュバントが使用され得る。適切な懸濁液体は、塩 溶液、水及び生理学的緩衝液を包含する。 アジュバントの使用はまた望まれる。本発明の抗原と共に使用するための適切 なアジュバントは、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジ ュバント(FIC)、アジュバント65、コレラトキシンＢサブユニット、アルヒドロ ゲル；又はボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）、ムラミルジペプ チド、サイトカイン及びサポニンを包含する。油基材のアジュバント、及び特に 、FCA及びFICが好ましい。 注入の前、適切なキャリヤー中、抗原は、典型的には、実験用ホ モジナイザーを用いて、油基材のアジュバント（FICが好ましい）により乳化さ れる。水性抗原は典型的には、３体積の油性アジュバントと共に混合され、当業 界においてよく知られた試験を用いて示されるように、そして安定した油中水エ マルジョンが形成されるまで乳化される。 直接的な乳房内免疫化を伴う油基材のアジュバントの使用は、有害な反応の危 険性のために実施できないことが、従来の知識により教示されている。本発明者 は、油基材のアジュバントによる投与が、適切な注意条件下で実施可能であるの みならず、また望ましいことを見出した。FICの使用は、特にIMM経路により投与 される場合、いく種かの抗原に対して得られる免疫原応答を有意に高めることが できる。従って、抗原はすべての免疫化のためにFICに乳化されることが現在好 ましく、但し例外として、小さなポリペプチドによる最初のIM／IP免疫化のため にはFCAが好ましい。しかしながら、FCAは、LMMのためには使用されていない。 上記で示されたように、抗原用量のサイズ及び濃度は決定的ではなく、そして 抗原のための免疫原性の窓（window）として知られる用量範囲が存在し、そして 一般的に、これは比較的広いことが当業界において知られている。 しかしながら、多過ぎるか又は少な過ぎる抗原は、細胞性免疫への抑制、寛容 性又は免疫偏位を誘発し、そして体液免疫応答から離れる。典型的には、生タン パク質抗原に関しての適切な用量は、反すう動物において、５〜25μｇ／kg生重 量の程度であり、そして凍結乾燥された死細菌又はウィルスに関しては、１×10⁸ 〜4×10¹⁰の生物／mlの範囲の用量が典型的である。 また上記で示されたように、IMM免疫化においては、抗原はさらに、抗生物質 を含む懸濁液として配合されることが好ましい。 抗原の特定形に関しては、生ワクチン及び殺されたワクチンの両者が可能であ ることが理解されるであろう。研究は、殺されたワクチンはIgG₁応答を刺激し、 そして生ワクチンはIgG₃応答を刺激することを示している。IgAの生成に関して は、二者のいづれでも可能である。 個々の免疫化経路により投与される抗原は、同じであっても又は異なっていて もよい。従って、いくつかの異なった抗原が、個々の初期免疫及び追加免疫化の ために、３種の異なった免疫化経路により投与され得る。しかしながら、同じ抗 原又は抗原の組合せが、個々の免疫化の場合、３種の経路を通して投与されるこ とが現在望ましい。 さらなる観点において、本発明はIgAを含む哺乳類乳汁の生成方法に関し、こ の方法は、上記で詳述された方法に従ってIgA抗体を誘発し、そして次に、哺乳 類からIgA含有乳汁を集めることを含んで成る。乳汁の収集は、通常の乳しぼり 工程を用いてもたらされ得る。 IgA力価は一般的に、出産に続いて最初の日に、最高である。この後、抗体レ ベルは、初期レベルの５〜20％まで低下する。これに続くレベルは、通常、２〜 ３ヵ月間、又は乳が止まるまで又は退縮まで、維持される。IgAレベルは、上記 で論じられたように、追加免疫化を通して、この期間、高められ得る。IgA含有 乳汁は通常、この期間を通して集められ得る。 この乳汁は、哺乳類から直接的に得られる形で有用であるが、しかし必要なら 、加工され得る。加工段階の例は、熱処理、紫外線照射、濃縮、食品添加物によ る補充、濃縮物への乾燥、粉乳化及び同様の手段を包含する。 本発明の方法への追加の段階として、IgAは乳汁から単離され得 る。単離は、当業界において知られている分離技法を用いてもたらされ得る。た とえば、ホエーからの（Can．J．Vet．Res²¹、ヨーロッパ特許第0320152号、WO9 7/27757、イギリス特許第2179947号）、乳汁からの（Milchwissenschaft²²、ア メリカ特許第4,229,342号）、初乳からの（Agric．Biol．Chem.²⁰、フランス特 許第2520235号、ニュージーランド特許第239466号及びアメリカ特許第4,582,580 号）、及び乳汁及び初乳からの（アメリカ特許第4,644,056号）、免疫グロブリ ンに富んでいる画分の単離が包含される。 続いて、その単離されたIgAは、所望により精製され得る。精製は、既知の技 法、たとえば沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーにより実施され得る。適切 な技法は、上記で引用された雑誌及び特許に開示される。追加の工程段階に従っ て生成された、単離され、そして精製された免疫グロブリンＡの両者は、本発明 の一部を形成する。 さらなる観点においては、本発明は、本発明の方法に従って生成されるIgA含 有哺乳類乳汁に関する。 商業的規模での免疫グロブリン含有タンパク質濃縮物の生成方法は、引用によ り本明細書に組込まれるスイス特許第1,573,995号に開示される。手短に言及す れば、前記方法は、高免疫化された乳汁を出す雌牛の乳汁を集め；乳脂及び不純 物を分離し；澄まされ、そして乳脂を除かれた乳汁を凝集し；カゼインを分離し ；濾過し；限外濾過し；そして免疫グロブリンを変性せず、そして無菌性を維持 する条件下で生成物を濾過し、蒸発し、そして乾燥せしめることによってホエー のタンパク質を殺菌することを含んで成る。 さらなる観点においては、本発明は、本発明の方法に従って生成された、乳汁 、加工された乳汁製品、濃縮物の形でのIgA、単離されたIgA及び精製されたIgA の使用を提供する。IgAは、医薬、獣 医、及び化粧組成物の分野、及び食品及び食事補足物において潜在的に広い用途 を有する。そのような組成物、食品及び補足物は、それらの必要な患者（ヒト患 者も包含する）に投与され得る。 より特別には、ヒトヘルスケアー分野においては、特異的にワクチン接種され たウシからの乳汁免疫グロブリンを用いての受動的経口免疫化がこれまで長く知 られている。IgAは腸感染の阻止において有意な役割を演じるので、IgAを含む配 合物は、そのような腸感染に対して敏感な患者の処理において効果的であり得る 。腸毒素産生性胃病原体、たとえば病原性大腸菌、ロタウィルス(Rotavirus)、 スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、アエロバクター（Aerobacter）、サ ルモネラ、シュードモナス(Pseudomonas)、ハエモフィラス・インフルエンザ(Ha emophilrs inflnenza)、プロテウス（Proteus）、バルガリス（Vulgaris）、シ ゲラ（Shigella）、ダイセンテリアエ(Dysenteriae)、ジプロコッカス・ニウモ ナエ(Diplococcus pneumonae)、コロナウィルス及びコネリバクテリウム・アク ネ（Corynebacterium acne）に対するIgA抗体を含む配合物は、すべて可能であ る。 乳児に対して特異的な高レベルのIgAを含む配合物は、１つの用途である。乳 児は時々、胃腸疾患に対して非常に敏感である。HIV及びAIDS患者におけるクリ プトスポリジウム症感染に対しての保護のための抗−クリプトスポリジウム症Ig Aを含む特定の配合物はさらに可能性を有する。下痢及び一般的な胃疾患に対し ての旅行者の保護のための一般的配合物が企画される。胃潰瘍に対する保護のた めの、ヘリコバクター・ピロリに対する抗体を含む価値ある配合物が実施可能で ある。 適切な配合物は、既知の技術配合法に基づいて生成され得る。たとえば、次の 疾患を処置するための配合物は、当業界に提供されて いる： Ｈ．ピロリ、Ｃ．パルブム(C．parvum)、大腸菌、Ｓ．フレキセネリ(S．flexn eri)、Ｃ．ジフィシル（C．difficile）、Ｖ．コレラエ(V．cholerae)及びロタ ウィルスにより引き起こされる一定のヒト疾患を処理し、又は妨げるためへのウ シ免疫グロブリンの使用の包括的な総説が、乳汁の固有の抗微生物剤に対するID Fセミナー の会報に提供されている²³。 より一般的には、若い人、老人、医学的に障害のある人々及び末期的疾病の人 々の必要性に応じて調製された、IgA含有医薬配合物がすべて所望される。 本発明の配合物は同様に、獣医学的分野において、たとえば新生家畜における 胃疾患の予防及び処置のための、病原性微生物、たとえば大腸菌、ロタウィルス 、コロナウィルス及び他の白痢を引き起こす微生物に対する特異的IgA抗体を含 む配合物の調製に適用できる。 マイコトキシン、植物毒素、アフラトキシン、除草剤、殺虫剤及び殺カビ剤の 経口摂取に続いての吸収を阻止するためへの、それらに対する特異的IgA抗体を 含む配合物が可能である。 より一般的には、不所望の食物成分の吸収を阻止するためにそれらの成分に対 するIgAを含む配合物が調製され得る。 医薬及び獣医学的配合物と同様、本発明に従って調製されたIgA抗体は、栄養 分野にも適用できる。これは、栄養飲料水及びスポーツ栄養物への適用のために 、乳汁自体の使用から高レベルのIgAを含んで生成される特定の配合物まで及ぶ 。 アレルギー保護のために通常のアレルゲン、たとえば花粉、ダスト及びダニに 対する特異的IgAを含む配合物は可能である。マイコトキシン、植物毒素、アフ ラトキシン、殺虫剤、除草剤、環境的汚染物、たとえばジオキシン、ポリ塩化ビ フェニル、及び殺カビ剤の吸収を阻止するために、それらの化合物に対する特異 的抗体を含む配合物が、本明細書において企画される。不所望の食品成分、たと えばコレステロールの吸収を阻止するためにそれらの成分に対する配合物は特に 有用であろう。さらなる観点においては、前記特異的IgAは、胃を満足のいく状 態にするための配合物の調製のために、 共生体又は成長因子に対して複合体化され得る。 獣医学的推論においては、経済学的に重要な動物子孫、たとえば子羊、子ブタ 、子ウシ、子ウマ及び鶏の特に栄養支持物としてIgAを含む配合物は可能である 。所望しない食物成分の吸収を阻止するために、そのような成分、たとえばβカ ロチンに対して向けられた特異的IgAから成る配合物もまた有用である。 本発明のIgA生成物についての適用のさらなる分野は、局部適用のための皮膚 又は髪タンパク質抗原に対する抗体、すなわち日焼けに対する保護を長期間続け るためにUV吸収性化合物、たとえば亜鉛に対して複合体化された皮膚抗原に対す る抗体、及び皮膚修復のための成長因子に対して複合体化された特異的IgA抗体 を含む配合物。 配合物は、当業界において良く知られている原理に従って、飲料水、ローショ ン、粉末、クリーム及び同様のものの形で調製され得る。配合物は、経口、静脈 内、筋肉内、皮下、直腸、局部、非経口、又は所望されるような他の経路により 投与され得る。 配合物は、医薬的に許容できるキャリヤー、又は栄養補足物の場合、栄養学的 に許容できるキャリヤーを含むことができる。そのようなキャリヤーは、水溶液 、非毒性賦形剤、塩、保存剤及び緩衝液を包含する。配合物は、添加剤、たとえ ば鉱物、ビタミン、風味剤、芳香剤及び同様のものを包含する。 そのような配合物の調製のための一般的な助力は、Remingtons Pharmaceutica l Sciences，16th Edition，Easton：Mac Publishing Company（1980）；the Na tional Formulary XIV，14th Edition，Washington：American Pharmaceutical Association（1975）；及びGoodman and Gillmans The Pharmacological basis for Therapeutics(7th Edition)(それらは、引用により本明細書に組込まれる )から得られる。 本発明の特定の非制限的例が記載されるであろう。 例 １． 64匹の妊娠したヤギを選択し、そして８つのグループに分け、そして筋肉内（ IM）、腹腔内（IP）もしくは乳房内(IMM)経路、又はそれらの３種の組合せによ り免疫化した。IMM免疫化に関しては、８種の乳腺を免疫化し、ここで左の乳腺 は未処理であり、そして対照として使用した。免疫化プロトコール 動物は、次のスケジュールに従って免疫化された。免疫化スケジュール 抗原 市販の病原性大腸菌ワクチン（Suvaxyn，Maternafend-4；J & H Pacific Ltd ，NZ）を、抗原として使用した。このワクチンは、高濃度のＫ88，Ｋ99，987Ｐ 及びＦ41線毛抗原を有することが知られている。 免疫化プロトコールの詳細は、次の通りである：免疫化Ｉ． IM／IP ストックワクチンを、フロイント不完全アジュバント(FIC；１部のワクチン； ３部のFIC)により乳化した。 IM：１ml／部位；２部位 IP：１ml／部位；１部位免疫化II． IM／IP 免疫化ＩについてのようにIM／IPを反復する。 IMM ストックワクチンを、無菌塩溶液に希釈した（１部のワクチン；１部の塩溶液 ）。抗生物質（Dupocillin）を、IMM免疫原に、１mlの抗生物質：30mlの免疫原 の比で添加した。 IMM：１ml／乳腺；右の乳腺のみ免疫化III． IMM IMMのみについての免疫化IIを反復する。免疫化IV，Ｖ及びVI． IM／IP 免疫化Ｉを反復する。免疫化VII． IM／IP & IMM 免疫化IIを反復する。動物の健康状態 試験におけるヤギの一般的な健康を、規則的な体重の調査及び獣医学的調査に よりモニターした。処理グループ間での体重の増加／低下において観察される識 別できる差異は存在しなかった。免疫化の悪影響は観察されなかった。64匹のヤ ギのうち２匹は、乳腺炎のために治療され、グループ６(IP／IMM)からの１匹の ヤギ及びグループ７(IM／IP／IMM)からの１匹のヤギも同様に治療された。全体 的に、IMM免疫化の有害な効果は示されなかった。サンプル ヤギは、免疫化Ｉ，II及びIVの前に採血され、その後、分娩した。血液及び初 乳／乳汁の出産後サンプル（それぞれ、左及び右の乳腺から）を、０日目（出産 ）、１，２，３及び５日目、次に１，２、及び３週目、次に１，２及び３カ月目 に集めた。 血液をEDTA真空容器（vacutainer）に集めた。分離された血漿を、抗体分析の ために−20℃で貯蔵した。左の（未処理の）及び右の（免疫化された）乳腺から の初乳／乳汁サンプル（20〜30ml）を、脂肪を除去するために遠心分離（４℃； 20分：2,000ｇ_max）するまで、氷上に維持した。脱脂された上清液を再遠心分離 し（４℃；１時間；40,000ｇ_max）、乳汁をホマー／血漿及びカゼインに分離し た。上清液を、抗体分析のために−20℃で貯蔵した。サンプル分析 すべてのサンプル及び試薬を、0.05％（ｖ／ｖ）のTween-20(PBS-T)、及び１ ％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン(BSA；タイプＡ7030，Sigma Chem．Co.，USA )を含む0.01Ｍのリン酸緩衝溶液(pH7.5)により希釈し、そしてすべての洗浄を、 特にことわらない限り、 PBS-Tを用いて、自動プレート洗浄機(ELP-35，BioTek Instruments，USA)により 実施した。 ELISAプレート(Maxisorp F-96イムノプレート、Nune，Denmark)を、0.05Ｍの 炭酸緩衝液(pH9.6)により１：１Ｋに希釈された100μｌの大腸菌抗原（Suvaxyn Maternafend-4;J & H Pacific Ltd，NZ）により被覆し、４℃で一晩インキュベ ートし、そして３度、洗浄した。イムノプレート上の残る活性化された部位を、 １％（ｗ／ｖ）のBSAを含むPBS-T 250μｌと共に22℃で２時間インキュベートす ることによってブロックした。プレートを２度、洗浄した後、試験サンプルの10 倍の連続した希釈溶液(一次抗体；１：100，１：１Ｋ，１：10Ｋ，１：100Ｋ)10 0μｌを、ウェルに二重反復して添加した。プレートを22℃で２時間、インキュ ベートし、次に３度、洗浄した。Ｈ−鎖特異的ウサギ抗−羊IgAから成る第２抗 体(１：200Ｋ；Bethyl Laboratories，USA)100μｌを、プレートに添加した。プ レートを４℃で、一晩インキュベートし、次に、３度洗浄し、その後、100μｌ の酵素接合体、すなわちホースラディシュペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗 −ウサギIg(１：８Ｋ；Dako，Denmark)を添加した。22℃で２時間のインキュベ ーションの後、プレートを、PBS-Tにより２度、次にTween-20を含まないPBSによ り２度、洗浄し、そして新しく調製された基質溶液100μｌにより満たした。前 記基質溶液は、1.3ｍモル／ｌの過酸化水素を含む0.1Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.5)中、0.1ｇ／ｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Boehri nger Mannheim，Germany）から成る。22℃で30分間のインキュベーションに続い て、50μｌの停止溶液、すなわち２ＭのH₂SO₄を添加し、そして光学密度（OD） を、450nmで、自動プレートリーダー(EL311s，BioTek Instruments，USA)により 測定した。 個々のELISAマイクロプレートを用いて、陽性性質の対照サンプル（１：100， １：１Ｋ，１：10Ｋ，１：100Ｋ及び１：1000Ｋでアッセイされる）及び陰性性 質の対照サンプル（１：１Ｋでアッセイされる）を、サンプルと共に実験した。 それらの対照サンプルからの吸光度値を、サンプル抗体力価を決定するために計 算に使用した。陽性対照の最大吸光度と陰性対照の吸光度との間の中央吸光度が 、50％数値を付与する。この50％吸光度数値に等しいサンプル抗体の逆数希釈度 を、サンプルのための抗体力価として分類する。 図１は、大腸菌IgA ELISAにおける陽性対照サンプルについての典型的な曲線 を示す。結果 サンプルをまず、グループプールとしてアッセイし、異なった免疫化レジメに 対するグループ応答の概観を得た。 図２は、０日、５日、２週及び４週でのすべてのグループについての左の（免 疫化された）乳腺乳汁抗−大腸菌IgA力価を示す。すべてのグループにおいては 、IgA乳汁抗体力価は、０日（出産）で最高であり、そしてそのレベルは第１週 にわたって低下する。グループ７(IM／IP／IMM)は、105Kの乳汁抗体力価を伴っ て、最良のIgA応答を付与した。これに続いて、50Kの力価を有するグループ５(I M／IMM)及び22Kの力価を有するグループ６(IP／IMM)が存在した。グループ３(IM M)を包含する他のグループは、最小応答を提供した。５日目までに、グループ５ ，６及び７におけるIgA乳汁抗体力価は、０日目での力価の約20％まで低下した が、しかし第４週まで、その力価はまだ有意であり、約３Ｋであった。 図３は、０日での右の（免疫化された）乳腺及び左の（未処理）乳腺の抗−大 腸菌IgA応答を比較する。IgA乳汁抗体力価は、右の（免疫化された）乳腺と左の （未処理）乳腺との間のサンプル間で 、応答の著しい差異を示した。高い力価がグループ５，６及び７の右の乳汁サン プルにおいて測定されたが、その対応する左の乳汁サンプルにおける力価は、最 高で、それらのレベルのわずか20％であった。 例 ２． 抗−大腸菌IgA力価応答の個々のサンプル分析を、例１の個々の免疫化グルー プに対して実施した。サンプルを、例１の方法に従って、ELISAアッセイを用い て分析した。０日及び１日目での結果は、それぞれ、図４及び５に示される。結果 初期のプールされたデータに一般的に一致して、力価は、IM，IP又はIMM経路 のみにより免疫化された動物においては低く、そしてIM／IMM，IP／IMM及びIM／ IP／IMM経路の組合せにより処理された動物においてはより高かった(平均±s.e. m.抗体力価；それぞれ、１／32,100±１／13,500；１／29,000±１／12,000；１ ／30,000±１／7,300)。 有意な差異は、３種の組合せ経路の個々による免疫化に起因平均IgA力価応答 に観察されなかった。しかしながら、力価応答における実質的なグループ内変動 性が観察され、そして注目すべきことには、IM／IP／IMMグループ(１／7,300)に ついての平均の標準誤差は、IM／IMM(１／13,500)及びIP／IMM(１／12,500)経路 について計算された標準誤差よりもより低かった。 力価応答のこのパターンは、２日目から及び続いて、乳汁サンプルにおいて維 持された。このデータは、３部位IM／IP／IMM方法による免疫化が、IM／IMM及び IP／IMMの組合せにより得られる応答以上に応答の大きさを上昇させないが、し かしIgA応答における動物間変動性を低下させるように作用することを示すよう に見える。例 ３． 64匹の妊娠したヤギを選択し、そして８匹のグループに分け、そして筋肉内（ IM）、腹腔内（IP）もしくは乳房内(IMM)経路、又はそれらの３種の組合せによ り免疫化した。IMM免疫化に関しては、右の乳腺のみが免疫化され、そして左の 乳腺は処理されず、そして対照として作用した。免疫化プロトコール 動物は、次のスケジュールに従って免疫化された。免疫化スケジュール 抗原 市販のワクチン、３Ｋ Scourguard(Smith Kline Beecham，Roya l Oak，Auckland，NZ)を、免疫原として使用した。このワクチンは、病原性大腸 菌、ウシロタウィルス及びコロナウィルスを含む。 免疫化プロトコールの詳細は、次の通りである： 例１の免疫化プロトコールを、Maternafendの代わりに、ストックワクチンと して使用される３Ｋ Scourguardによりくり返した。動物の健康状態 この試験におけるヤギの一般的な健康を、規則的な体重調査及び獣医学的調査 によりモニターした。例１に関してのように、処理グループ間での体重の増加／ 低下において観察される識別できる差異は存在せず、そして免疫化の悪影響も観 察されなかった。サンプル 血液及び初乳／乳汁のサンプルを、例１のプロトコールに従って採取した。サンプル分析 ELISAアッセイを、例１の方法に従って実施した。但し、３Ｋ Scourguard(１ ：１Ｋ)が、Maternafendの代わりに、マイクロプレート被覆のために使用された 。血漿及び初乳／乳汁を、グループ抗体応答の初期表示を得るために、プールし た。結果 図６は、０日及び５日目でのすべてのグループについての右の（免疫化された ）乳腺乳汁抗−３Ｋ Scourguard IgA力価を示す。すべてのグループにおいて、I gA乳汁抗体力価は０日（出産）で最高であり、そしてそのレベルは最初の週にわ たって低下した。グループ７(IM／IP／IMM)は、210Ｋの乳汁抗体力価を伴って、 最良のIgA応答を付与した。70Kの力価を有するグループ５(IM／IMM)、及び27Ｋ の力価を有するグループ３がこれに続いた。グループ６(IP／IMM)は、20Ｋの乳 汁抗体応答を提供した。他のグループは最小の 応答を提供した。５日目までに、グループ３，５及び７におけるIgA乳汁抗体力 価は、０日での力価の約10％に低下した。 図７は、０日でのすべてのグループについての右の（免疫化された）及び左の （未処理）乳腺乳汁抗−３Ｋ Scourguard IgA力価を示す。右の乳腺は、左の乳 腺の応答よりも、より高い応答を有した。グループ３を除いて、未処理の左の乳 腺に関して、有意な抗体力価応答は存在しなかった。例 ４． 32匹の妊娠したヤギを、４種の処理グループに割り当て、そして筋肉内（IM） 、腹腔内（IP）又は乳房内(IMM)経路の組合せにより免疫化した。グループ３に ついてのIMM免疫原は水溶液に存在し、そしてグループ４についてのIMM免疫原は 、FICにおいて乳化された。IMM免疫化のために、右の乳腺のみを免疫化し、そし て左の乳腺は処理されず、そして対照として作用した。免疫化プロトコール 動物は、次のスケジュールに従って免疫化された。免疫化スケージュール 抗原 R & D Systems，614 McKinley Place，New England，USAから市販されているT NF調製物を、抗原として使用した。ストック溶液（１mg／ml）は、無菌塩溶液に 、凍結乾燥されたTNFを再構成することによって調製された。 免疫化プロトコールの詳細は、次の通りである：免疫化Ｉ． IM／IP ストック抗原溶液を、FICにより；0.16mg／mlに希釈し、次に乳化した(１部の 塩溶液：３部のFIC)。 IM；１ml／部位；２部位 IP；１ml／部位；１部位免疫化II． IM／IP 免疫化Ｉに関してのIM／IPをくり返す。 IMM 右の乳腺に関しては：ストック抗原溶液を、無菌塩溶液により0 .1mg／mlに希釈した。抗生物質（Dupocillin）を、１mlの抗生物質：40mlの免疫 原の比で添加した。IMM；１ml／右の乳腺。 IMM（FIC） 右の乳腺に関しては：ストック抗原溶液を、無菌塩溶液により0.32mg／mlに希 釈し、そしてFICにより乳化した(１部の塩溶液：３部のFIC)。抗生物質（Dupoci llin）を、１mlの抗生物質：40mlの免疫原の比で添加した。IMM（FIC）；１ml／ 右の乳腺。免疫化III． IMM／IMM（FIC） IMM／IMM（FIC）のみについて免疫化IIをくり返す。免疫化IV． IM／IP 免疫化Ｉをくり返す。動物の健康状態 試験におけるヤギの一般的な健康を、規則的な体重の調査及び獣医学的調査に よりモニターした。動物は、妊娠及び授乳の間、体重を維持し、そして処理のグ ループ間効果は観察されなかった。２匹の動物は、妊娠／分娩の間、無関係な原 因から死亡した（両ヤギはグループ１、IM／IMMからであった）。１匹の動物は 、左の未処理の乳腺における乳腺炎のために試験から除いた。免疫化に対する悪 影響は示されなかった。IM及びIP免疫化での潰瘍の証拠は最小であった。左の乳 腺と右の乳腺との間での、及び無菌塩溶液又はFIC中、免疫原により免疫化され た乳腺間での乳房機能における有意な差異は観察されなかった。サンプル ヤギは、免疫化Ｉ，II及びIVの前に採血され、その後、分娩した。分娩後、血 液及び初乳／乳汁のサンプル（それぞれ、左及び右の 乳腺から）を、０日目（出産）、２，３，６，14及び28日目、並びに２及び３ヵ 月目に集めた。 サンプルを集め、そして例１に使用される型式に従って処理した。サンプル分析 TNFについてのELISAアッセイを、例１において使用される型式に従って実施し た。但し、TNFがプレート被覆のために使用された（２mg／ml）。図８は、TNF I gAにおける陽性及び陰性対照サンプルについての典型的な希釈曲線を示す。アッ セイ間精度は、陽性対照の10回の反復分析から計算され、そして変動率は10.2％ であった。結果 IgA 乳汁応答 個々の免疫化グループについての右の（免疫化された）乳腺の出産後１日目で の乳汁サンプルにおける抗−TNF IgA力価応答の個々のサンプル分析が図９に示 される。力価は、免疫原が塩溶液中で投与されるIM／IMM，IP／IMM又はIM／IP／ IMM経路により免疫化される動物においては低かった(平均±s.e.m.抗体力価：そ れぞれ、１／3,600±１／2,600；１／3,300±１／1,500；１／900±１／500)。 ことに比較して、力価は、IMM免疫原がFIC中で乳化された組合せIM／IP／IMM経 路により処理された動物においては、20倍ぐらい高かった（１／61,900±１／29 ,600）。１／4,000〜１／250,000の範囲の力価を伴って、個々のグループ４動物 の応答に相当の変動性が観察された。右及び左の乳腺の乳汁抗体応答 右の（免疫化された）及び左の（未処理）乳腺からの抗−TNF IgA乳汁力価に おいては、有意な差異が、大腸菌についての初期の発 見と一致して見出され、そして左の乳腺のIgA力価はほとんど検出できなかった 。図10は、左及び右の乳腺からの出産後１日目での乳汁サンプルについての抗− TNF IgA力価についてのデータを示す。授乳期にわたっての乳汁抗体応答 授乳期の段階に対する抗−TNF IgAの関係が、図11に示される。データは、組 合せIM／IP／IMM(FIC)経路により処理されたグループ４動物からの右の（免疫化 された）乳腺力価の平均±s.e.m.である。抗−TNF IgA力価は、初期の出産後の 乳房分泌において最高であり、そして６日目までに、ピークレベルの約10％に及 び１ヵ月目までに約５％に低下することが見出された（１／3,500のIgA力価に相 当する）。応答の全体的パターンは、Ｅ．コリ試験において見られるパターン、 すなわち十分な授乳の開始及び上昇する乳汁体積と同時に起こる抗体低下と類似 する。 例 ５． 35匹の妊娠した牛を４種のグループに分け、そして下記プロトコールに従って 、２種の経路、３種の経路又はいづれでもない経路のいづれかにより免疫化した 。免疫原を、右側の乳腺の乳房内（IMM）免疫化、及び筋肉内（IM）及び腹腔内 （IP）免疫化のために、フロイント不完全アジュバント(FIC)において乳化した 。左側の乳腺の免疫化のためには、水溶液も、免疫原溶液が使用された。 免疫化プロトコール 動物は次のスケジュールに従って免疫化された。免疫化スケジュール 抗原 免疫化のための抗原は、酵母、すなわちカンジダ アルビカンスであった。そ の酵母細胞を培地において培養し、遠心分離により収穫し、洗浄し、そして熱に より殺し、次に凍結乾燥した。Ｃ．アルビカンスのストック溶液（７mgのタンパ ク質／ml）を、リン酸緩衝液に前記凍結乾燥されたＣ．アルビカンスを再構成す ることによって調製した。 免疫化プロトコールの詳細は、次の通りである：免疫化Ｉ． IM／IP ストック抗原溶液を無菌塩溶液に希釈し、１mg／mlにし、そしてFICにより乳 化した(１部の塩溶液：３部のFIC)。 IM；２ml／部位；２部位 IP：４ml／部位；１部位免疫化II． IM／IP 免疫化Ｉ．に関するIM／IPをくり返す。 IMM 右の乳腺に関しては：ストック抗原溶液を無菌塩溶液に希釈し、１mg／mlにし 、そしてFICにより乳化した(１部の塩溶液：３部のFIC)。 左の乳腺に関しては：ストック抗原溶液を無菌塩溶液に希釈し、0.25mg／mlに する。 IMM；２mg／乳腺；４乳腺免疫化III． IMM IMMのみについて免疫化IIをくり返す。免疫化IV． IM／IP 免疫化Ｉをくり返す。動物健康状態 試験における牛の一般的な健康を、規則的な体重の調査及び獣医学的調査によ りモニターした。免疫化部位を、規則的な間隔で調べ、免疫化工程の効果を評価 した。臨床学的段階の部位反応は、免疫化されたいづれの部位にも観察されなか った。さらに、収集された乳汁体積データは、乳腺の処理が動物の全体的な授乳 性能に影響を及ぼさなかったことを示した。サンプル 牛は、分娩の前、免疫化Ｉ，II及びIVの前で採血された。血液及び初乳／乳汁 の出産後サンプルを、１，２，３，５，７，14，28及び60日目に集めた。サンプ リングの日、牛は乳房区から乳をしぼられ（すなわち、サンプルが個々の乳腺か ら集められ）、AM及びPM、乳汁の体積が記録され、そして100mlのサンプルが保 持された。AM及びPMの乳房区乳汁サンプルを、実験室での分析のためにプールし た。 血液及び初乳／乳汁サンプルを、例１のために使用される型式に従って処理し た。サンプル分析 Ｃ．アルビカンスについてのELISAアッセイを、例１のために使用される型式 に従って実施され、但し、Ｃ．アルビカンス（５mg／ml）がプレート被覆のため に使用され；クラス特異性を同定するために使用される第２抗体はウサギ抗−ウ シIgA(１：40Ｋ；Bethyl Laboratories，USA)であり；酵素接合された抗体はヤ ギ抗−ウサギ(１：12Ｋ；Dako，Denmark)であった。終点検出システムは、例１ におけるのと同じであった。 図12は、陽性対照サンプルについての典型的な抗体希釈曲線を示す。 グループ１ａ，１ｂ及び１ｃに関しては、抗−Ｃ．アルビカンスIgA乳汁抗体 力価は１日目（出産）で最高であり、そしてそのレベルは、初期のヤギの試験に 関して観察されるように（例１〜４）、授乳期間にわたって低下した。 ２部位対．３部位免疫化 図13は、１，２，７，14及び60日目でのすべてのグループについての、右の(F ICにおける免疫原のIMM)乳腺の乳汁抗−Ｃ．アルビカンスIgA抗体力価を示す。 ３部位で免疫化された動物(グループ１ｃ；IM／IP／IMM)は、２部位で免疫化さ れた動物(グループ１ａ；IM／IMM及びグループ１ｂ；IP／IMM)よりも高い応答性 を有した。平均±s.e.m.での抗体力価は、それぞれ、11,700±3,700、2,500±70 0及び3,000±900であった。グループ１ｄ（対照）は、１日目で、非常に低い抗 体力価を有した(200±70の力価)。３部位で免疫化された動物についての高い力 価は、授乳期間にわたって維持さ れた。 IMM免疫化に関してのフロイント対．塩溶液 図14は、授乳期間にわたって、グループ１ｃにおける左の（水性IMM免疫原） 及び右の(FIC IMM免疫原)の乳汁抗−Ｃ．アルビカンスIgA力価の比較を示す。FI Cに乳化された免疫原により免疫化された乳腺は、水性免疫原により免疫化され た乳腺よりも高い応答性を提供し、そしてこの差異は時間と共に上昇した。１日 目、右の乳腺力価は、11,700±3,700であり、ことに比較して、左の乳腺力価は8 ,700±2,900であった。60日目までに、左の乳腺力価は590±200まで低下し、と ころが右の乳腺力価はそれよりも４倍高かった(2,300±800)。左及び右の乳腺応 答間のこの差異はまた、２部位で免疫化されたグループにおいても明らかであっ た（グループ１ａ及び１ｂ）。 従って、本発明によれば、哺乳類におけるIgAの誘発方法、及びこれまで得ら れて来たか、又は既知の２つの経路での投与プロトコールと、抗原についての第 ３の投与経路とを組合すことから予期され得るよりも高いレベルで、哺乳類の乳 汁にIgAを生成する方法を提供する。他方では、本発明は、IgA抗体力価応答にお ける動物間変動性を低める方法を、少なくとも提供する。それらの結果は、IgA 含有生成物が医薬、獣医及び化粧用配合物、及び栄養及び食事補足物への使用の ために探求される利点を示すことが理解されるであろう。 本発明の記載は、単に例により提供され、そして本発明の範囲は、それらの例 により制限されないことが、当業者によりさらに理解されるであろう。 本明細書及びその開示に言及されるすべての文献及び特許は、引用により組込 まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 39/02 39/02 39/09 39/09 39/106 39/106 39/108 39/108 39/112 39/112 39/12 39/12 39/215 39/215 39/395 39/395 Ｘ Ｙ Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類において免疫グロブリンＡ(lgA)を誘発するための方法であって、 （ａ）乳房内(IMM)、腹腔内（IP）及び筋肉内（IM）から選択されたいづれか ２つの投与経路によって、妊娠している哺乳類を抗原により積極的に免疫化し； そして （ｂ）乳房内(IMM)、腹腔内（IP）及び筋肉内（IM）から選択された第３投与 経路によって、前記哺乳類を抗原により積極的に免疫化する； ことを含んで成り、但しすべての３種の投与経路は異なっていることを特徴と する方法。 ２．前記段階（ａ）において、選択される投与の２つの経路がIP及びIMであり 、そして前記段階（ｂ）において、投与の第３経路がIMMである請求の範囲第１ 項記載の方法。 ３．前記段階（ａ）の２つの活性免疫化が、連続的に、断続的に、又は同時に 行われる請求の範囲第１又は２項記載の方法。 ４．前記段階（ａ）の２つの活性免疫化が同時に行われる請求の範囲第３項記 載の方法。 ５．前記段階（ａ）及び（ｂ）が、連続的に、断続的に又は同時に行われる請 求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の方法。 ６．前記段階（ａ）及び（ｂ）が、出産の前に１度又は２度反復される請求の 範囲第１〜５のいづれか１項記載の方法。 ７．前記段階（ａ）が、出産の前に２度反復される請求の範囲第１〜５のいづ れか１項記載の方法。 ８．個々の段階（ａ）が２〜８週間隔で行われる請求の範囲第７項記載の方法 。 ９．個々の段階（ａ）が２〜４週間隔で行われる請求の範囲第８項記載の方法 。 10．前記段階（ａ）が、出産の前６〜14週で行われ、最初の反復段階（ａ）が 出産の前２〜10週で行われ、そして最終段階（ａ）が出産の前１〜４週で行われ る請求の範囲第６〜９のいづれか１項記載の方法。 11．前記段階（ａ）が、出産の前８〜12週で行われ、最初の反復段階（ａ）が 出産の前４〜８週で行われ、そして最終段階（ａ）が出産の前１〜４週で行われ る請求の範囲第10項記載の方法。 12．前記段階（ａ）が、出産の前８週で行われ、最初の反復段階（ａ）が出産 の前４週で行われ、そして最終段階（ａ）が出産の前１週で行われる請求の範囲 第11項記載の方法。 13．前記段階（ｂ）が、出産の前に１度反復される請求の範囲第６〜12のいづ れか１項記載の方法。 14．前記段階（ｂ）が、１〜６週間隔で行われる請求の範囲第６〜13のいづれ か１項記載の方法。 15．前記段階（ｂ）が、２週間隔で行われる請求の範囲第14項記載の方法。 16．前記段階（ｂ）が、出産の前３〜12週で行われ、そして反復段階（ｂ）が 出産の前１〜10週で行われる請求の範囲第13又は14項記載の方法。 17．前記段階（ｂ）が、出産の前４〜８週で行われ、そして反復段階（ｂ）が 出産の前２〜４週で行われる請求の範囲第16項記載の方法。 18．前記段階（ｂ）が、出産の前４週で行われ、そして反復段階（ｂ）が出産 の前２週で行われる請求の範囲第17項記載の方法。 19．免疫グロブリンＡ(IgA)を含む哺乳類乳汁の生成方法であっ て、 （ａ）請求の範囲第１〜18のいづれか１項記載の方法に従ってIgAを誘発し； そして （ｂ）前記哺乳類からIgA含有乳汁を集める； ことを含んで成る方法。 20．前記抗原が、細菌、酵母、ウィルス、マイコプラズマ、タンパク質、ハプ テン、動物組織抽出物、植物組織抽出物、精子、菌類、花粉、ダスト及び抗原の 複合体の群の少なくとも１つを含んで成る請求の範囲第１〜19のいづれか１項記 載の方法。 21．前記抗原が細菌抗原である請求の範囲第20項記載の方法。 22．前記細菌抗原が、エシュリキア(Escherichia)、スタフィロコッカス（Sta phylococcus）、ストレプトコッカス(Streptococcus)、サルモネラ（Salmonella ）、ニウモノコッカス（Pneumonococcus）、ヘリコバクター（Hilicobacter）、 クリプトスポリジオサス(Cryptosporidiosus)、カンピロバクター(Campylobacte r)及びシゲラ（Shigella）から成る群から選択される請求の範囲第21項記載の方 法。 23．前記細菌抗原が大腸菌である請求の範囲第22項記載の方法。 24．前記抗原が酵母抗原である請求の範囲第20項記載の方法。 25．前記酵母がカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）である請求の範 囲第24項記載の方法。 26．前記抗原がタンパク質抗原である請求の範囲第20項記載の方法。 27．前記タンパク質抗原が腫瘍壊死因子である請求の範囲第26項記載の方法。 28．前記抗原が抗原の複合体である請求の範囲第20項記載の方法。 29．前記抗原の複合体が大腸菌、ロタウィルス及びコロナウィルスを含んで成 る請求の範囲第28項記載の方法。 30．前記抗原が懸濁液として配合される請求の範囲第１〜29のいづれか１項記 載の方法。 31．前記抗原が許容できるキャリヤー、希釈剤、緩衝液及び／又はアジュバン トと一緒に投与される請求の範囲第１〜30のいづれか１項記載の方法。 32．前記抗原がアジュバントと一緒に投与される請求の範囲第31項記載の方法 。 33．前記アジュバントが、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不 完全アジュバント(FIC)、アジュバント65、コレラトキシンＢ サブユニット、 アルヒドロゲル；又はボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）、ムラ ミルジペプチド、サイトカイン及びサポニン、油基材のアジュバントから選択さ れ、そして特にFCA及びFICが好ましい請求の範囲第32項記載の方法。 34．前記アジュバントがフロイント不完全アジュバントである請求の範囲第33 項記載の方法。 35．前記抗原が、抗生物質と一緒に投与される請求の範囲第１〜34のいづれか １項記載の方法。 36．個々の免疫化工程において及び個々の部位で投与される抗原が同じか又は 異なっている請求の範囲第１〜35のいづれか１項記載の方法。 37．個々の免疫化工程において、及び個々の部位で投与される抗原が同じであ る請求の範囲第36項記載の方法。 38．前記免疫化される哺乳類が、ウシ、ヤギ及び羊から成る群から選択される 請求の範囲第１〜37のいづれか１項記載の方法。 39．前記哺乳類が乳牛である請求の範囲第38項記載の方法。 40．請求の範囲第１〜39のいづれか１項記載の方法に従って生成されたIgA。 41．IgAを含む哺乳類乳汁の生成方法であって、 （ａ）請求の範囲第１〜39のいづれか１項記載の方法に従ってIgAを誘発し； そして （ｂ）前記哺乳類から前記IgAを含む乳汁を集める； ことを含んで成る方法。 42．請求の範囲第41項記載の方法に従って生成されたIgA含有哺乳類乳汁。 43．請求の範囲第42項記載の哺乳類乳汁から単離されたIgA。 44．精製されたIgAである請求の範囲第43項記載のIgA。 45．医薬、化粧及び／又は家畜用組成物としての、あるいはそれらの調製のた めの請求の範囲第40又は44項記載のIgAの使用。 46．食品及び／又はダイエット用補充物としての、あるいはそれらの調製のた めの請求の範囲第42〜44のいづれか１項記載のIgAの使用。