JPH04275232A - 胃炎，胃または十二指腸潰瘍予防食品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヘリコバクター　　ピ
ロリで免疫した鶏の卵から調製した該抗原に特異的な抗
体を有効成分とする胃炎，胃または十二指腸潰瘍予防食
品に関する。

【０００２】

【従来の技術】１９８３年ＭｅｒｓｈａｌｌとＷａｒｒ
ｅｎが胃炎，胃潰瘍患者の胃生検材料からカンピロバク
ター　　ピロリが高率に検出されること（Ｗａｒｒｅｎ
　　ＪＲ，Ｍａｒｓｈａｌｌ　　ＢＪ：Ｌａｎｃｅｔ，
　　１２７３〜１２７５，１９８３）を報告して以来、
胃炎，胃または十二指腸潰瘍の発症にカンピロバクター
　　ピロリが関わっていることが次第に明らかとなって
きた。尚、カンピロバクターピロリは１９８９年Ｇｏｏ
ｄｗｉｎらにより食中毒菌であるカンピロバクタージェ
ジュニやカンピロバクター　　コリとは、別属であるこ
とが証明され、新しい属名を設けヘリコバクター　　ピ
ロリ（Ｈｅｌｉｏｃｂａｃｔｅｒ　　ｐｙｌｏｒｉ）と
分類された。以下、カンピロバクター　　ピロリは全て
ヘリコバクター　　ピロリと読みかえる。胃潰瘍，十二
指腸潰瘍の治療剤としては胃酸分泌を抑制するＨ２ブロ
ッカーが主流であり治癒効果は高いが、一旦治癒しても
再発することの多いことが本疾患の特徴とされている。 再発率の高い理由としては、Ｈ２ブロッカーを投与して
も、ヘリコバクターピロリが除去されないことによると
考えられている（ＭｃＬｅａｎ　　ＡＪ，　　ｅｔ　　
ａｌ：Ｌａｎｃｅｔ，ｉｉ：５２５〜５２６，　　１９
８４）。また、胃または十二指腸へのヘリコバクター　
　ピロリの感染に対し、抗生物質を用いる治療も試みら
れているが、評価は一定でない。ー方、食中毒菌，例え
ばサルモネラ菌やカンピロバクター菌の少ない食鳥肉を
製造するための、食鳥の食中毒菌保菌抑制材料及び食鳥
肉の食中毒菌抑制方法（特開平１−９３５３９）が提唱
されている。しかし、該特許には、カンピロバクター　
　ジェジュニが食中毒菌として例示され、食鳥の食中毒
抑制材料として該菌体に対する抗体を用いることが記載
されているのみで、胃炎，胃または十二指腸潰瘍との関
連、あるいはその予防方法等を示唆する記載は全くない
。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、飲食
等により摂取されるヘリコバクター　　ピロリの感染を
抑制することにより胃炎，胃潰瘍，十二指腸潰瘍発症の
リスクファクターを除くことにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するため鋭意検討した結果、ヘリコバクター　　ピ
ロリで免疫した鶏に当該菌体に対する特異な抗体すなわ
ち抗ヘリコバクター　　ピロリ抗体（特異的抗体）が効
率的に産生されること、さらに抗ヘリコバクターピロリ
抗体を経口的に投与することにより、胃粘膜，十二指腸
粘膜へのヘリコバクター　　ピロリの付着及び感染が抑
制されることをはじめて見い出し、本発明を完成するに
至った。即ち、本発明の要旨は、ヘリコバクター　　ピ
ロリ菌体を抗原とし免疫した鶏の卵から調製した該抗原
に特異的な抗体を有効成分とする胃炎，胃または十二指
腸潰瘍予防食品に関する。

【０００５】本発明に用いる抗ヘリコバクター　　ピロ
リ抗体は、予めヘリコバクター　　ピロリ菌体を抗原と
し免疫した鶏が産生した卵から調製される。免疫に用い
る鶏は産卵鶏を用いるが、特に産卵率の高い、白色レグ
ホン系、ロードアイランドレッド系、横斑ブロマスロッ
ク系、ニューハンブシャー系等の卵用種を用いるのが好
ましい。免疫方法としては、皮下注射、筋肉注射、腹腔
内注射等、一般的な免疫方法が用いられる。

【０００６】抗原に用いるヘリコバクター　　ピロリ菌
体はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｃｎ）４３５０４，４
３５２６，４３５７９，４３６２９株等の登録株の他、
臨床分離株が使用できる。菌の培養は例えば、トリプト
ソイブイヨン培地やハートインフュージョンブイヨン培
地に馬血液または馬血清を３〜１０％の濃度で混和した
培地等、ヘリコバクター　　ピロリの培養に適した培地
が使用され、５％Ｏ２，１０％ＣＯ２，８５％Ｎ２下，
３７℃　　３日間等の条件で培養できる。特に、寒天培
地を用いる場合は、９８％以上の高湿度で培養すること
が望ましい。

【０００７】このようにして培養されたヘリコバクター
　　ピロリ菌体は薬剤，加熱等により不活化した後、遠
心して集菌され、生理的リン酸緩衝液等で洗浄した後、
そのままもしくは粉砕した後、生理食塩に溶解するか、
フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不
完全アジュバント（ＦＩＡ）等のアジュバントと共に乳
化懸濁して鶏免疫用の抗原とする。抗原の投与量は所望
の抗体価が得られ、かつ鶏に対して悪影響を与えない程
度の量を適宜選択すればよい。初回免疫後の追加免疫は
、目的とする抗体の抗体価により、適宜決定できる。

【０００８】鶏卵中等の特異的抗体価は、酵素免疫吸着
法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ，マイクロタ
イター法等を用いて測定することができ、これらの方法
に従って免疫後の抗体価の推移を追跡することができる
。後述の実施例においては、マイクロタイター法により
凝集抗体価の推移を追跡し、抗体価が十分に上昇した段
階（例えば３２０以上）の卵を採取して、全卵粉末，卵
黄粉末，卵黄水溶性蛋白粉末及び精製鶏卵抗体をそれぞ
れ調製した。

【０００９】抗体の抽出、分離方法としては、例えば、
デキストラン硫酸やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
，寒天，カラギナン，ファーセレラン，ペクチン，キサ
ンタンガム，アルギン酸塩，アルギン酸誘導体等を用い
てリポ蛋白を沈殿させ、その上清から分離，精製する方
法（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，４６，６３〜６８，１９８１／Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，９
（５），４７５〜９３，１９８０／特開昭６３−２１５
６９９号／特開昭６４−３８０９８号）や、プロパノー
ル，クロロホルム等を用いた抽出法など公知の方法が用
いられるが、本発明の抗体の利用分野を考慮して、例え
ば食品等での利用の場合は、カラギナン，キサンタンガ
ム，ペクチン等の食品天然添加物として認められている
ものを用いるのが人体への安全性の見地から好ましい。

【００１０】本発明に用いる抗体は、ヘリコバククー　
　ピロリの不活化菌体を抗原とし免疫した鶏の卵から得
た全卵または卵黄液をそのまま、または噴霧乾燥等通常
の方法により乾燥粉末化した粉末、卵黄液をカラギナン
等を用いて卵黄リポ蛋白を除去した卵黄水溶性蛋白を粉
末化した卵黄水溶性蛋白粉末として、あるいは卵黄水溶
性蛋白をイオン交換クロマトグラフィー，疎水性クロマ
トグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ゲ
ルろ過，硫酸ナトリウム塩析，硫酸アンモニウム塩析等
の公知の蛋白精製方法により精製された精製鶏卵抗体と
して等、各種の形態，純度のものが使用できる。このよ
うにして得られた各種調製サンプルの鶏卵抗体の純度は
、粉末重量に対する鶏卵抗体重量で換算すると、卵黄粉
末の形態では、鶏卵抗体が１〜２％，卵黄水溶性蛋白粉
末の形態では、通常８〜３０％，精製鶏卵抗体の形態で
は９５％以上である。

【００１１】本発明の胃炎，胃または十二指腸潰瘍予防
食品は投与形態に応じて種々の形に調製される。例えば
、アイスクリーム，ヨーグルト，ショートケーキ，ガム
等の冷菓，菓子類、調製粉乳，ココア，コーヒー等の粉
末飲料、マーガリン，バター，チーズ，ベビーフード等
の各種食品が適用される。また、胃，十二指腸の手術を
受けた患者等の病院食，経口輸液等としても適用される
。本発明の胃炎，胃潰瘍または十二指腸潰瘍予防食品中
の鶏卵抗体の含有量は、その投与形態に応じた投与量に
従って適宜選択すれば良く、鶏卵抗体として０．０２５
〜０．２５重量％，好ましくは０．０５重量％以上とす
るのが良い。

【００１２】

【作用】胃炎，胃潰瘍または十二指腸潰瘍の患者の胃，
十二指腸のびらん部の粘膜からヘリコバクター　　ピロ
リが検出されること、潰瘍病変部の菌数が有意に高いこ
とからこれらの疾患の発症にヘリコバクター　　ピロリ
が深くかかわっていることが明らかにされてきた。ヘリ
コバクター　　ピロリの胃，十二指腸への感染は、食物
等と共に経口的に侵入した菌が、まず胃，十二指腸粘膜
に付着することから始まる。一方、本発明に用いる抗体
は、ヘリコバクター　　ピロリの胃，十二指腸粘膜への
付着を抑制することができる。例えば、豚胃粘膜ムチン
を被覆したポリスチレンプレートにヘリコバクターピロ
リ菌体の懸濁液またはヘリコバクターピロリ菌体と当該
精製鶏卵抗体の混液を添加してインキュベートし、洗浄
後、プレート上に残存する菌数を測定したところ、精製
鶏卵抗体を含む溶液を添加したプレート上の菌数は抗体
を含まない溶液の場合の菌数の１７％にまで減少した。 従って、本発明の食品を食すれば、経口的にヘリコバク
ター　　ピロリが侵入しても口腔内，食道，胃，十二指
腸で抗体が吸着し、胃，十二指腸粘膜への菌の付着を抑
制することができる。

【００１３】

【実施例】以下、実施例、試験例により本発明を更に具
体的に説明するが、本発明はもとよりこれに限定される
ものではない。 実施例１．＜抗原の調製＞ヘリコバクター　　ピロリ臨
床分離株を７％馬脱繊維血液を含むＳｋｉｒｒｏｗの寒
天培地で３７℃，４日間培養した（１０％ＣＯ２，９０
％空気，加湿）。次いで生成したコロニーをかきとり生
理食塩水に懸濁し、懸濁液に０．５％（ｖ／ｖ）となる
ようにホルマリンを加え、室温１８時間放置し菌体の不
活化処理を行った。次いで菌体を３，０００×ｇ，１０
分間の遠心分離で集め、生理食塩水で３回洗浄した。菌
体を生理食塩水に分散させた後、ヒスコトロンで均質化
し、波長６６０ｎｍにおける吸光度を８．０に調製し抗
原液とした。

【００１４】＜産卵鶏への免疫＞産卵鶏（白色レグホン
系）に抗原液を１羽あたり１ｍｌ筋肉注射した。免疫は
毎週１回、合計４回繰り返した後、抗体価の維持を目的
として、１ケ月毎に１回の免疫を行った。

【００１５】＜鶏卵卵黄中の特異的抗体価の測定＞鶏卵
卵黄中の特異的抗体価は、マイクロタイター法により凝
集抗体価を測定した。２週毎に集めた鶏卵から卵黄を分
離し、該卵黄１ｇとλ−カラギナン水溶液（１．５％Ｗ
／Ｖ）９ｍｌを混和し、室温で３０分間放置後、１，０
００×ｇ，１０分間の遠心分離を行い、特異的抗体を含
有する卵黄水溶性蛋白画分を得、試料液とした。試料液
を生理的リン酸緩衝液ｐＨ　　７．４（以下ＰＢＳとい
う）で２ｎ倍希釈し検液とした。各検液５０μ１と抗原
液５０μ１をマイクロプレート中に混合し、３７℃，２
４時間後静置し、凝集の有無を調べた。抗原液は免疫に
用いた抗原を、ＰＢＳで１０倍希釈し（波長６６０ｎｍ
における吸光度０．８）したものを用いた。凝集抗体価
は、凝集の見られるサンプルの最大希釈倍率の逆数で示
した。表１に鶏卵卵黄中特異的抗体価の推移を示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】＜鶏卵抗体の調製＞ （ａ）ヘリコバクター　　ピロリに対する特異抗体を含
有する全卵または卵黄粉末の調製 凝集抗体価が３２０以上の鶏卵を割卵して得た全卵、お
よび卵黄各１ｋｇをホモミキサーで均質化した。それぞ
れの溶液を６３℃，３分間の条件で殺菌を行った後、噴
霧乾燥により、それぞれの粉末を調製し、ヘリコバクタ
ー　　ピロリに対する特異抗体を含有する全卵粉末（以
下抗ＨＰ全卵粉末という）２３２ｇ，および卵黄粉末（
以下抗ＨＰ卵黄粉末という）４７０ｇを得た。噴霧乾燥
の条件は、送風温度１４５℃排風温度８５℃で行った。

【００１８】（ｂ）ヘリコバクター　　ピロリに対する
特異抗体を含有する卵黄水溶性蛋白粉末の調製凝集抗体
価で３２０以上の鶏卵１ｋｇより分離した卵黄を４４０
ｇ、ホモミキサーで均質化した。この卵黄液に４倍量の
λ−カラギナン水溶液（１．５ｍｇ／ｍｌ）を混和した
。この液を室温で３０分間放置した遠心分離（１０，０
００×ｇ，１０分間）で卵黄リポ蛋白を、沈殿として分
離した。上清をろ紙（アドベンテック東洋．Ｎｏ．２ペ
ーパーフィルター）でろ過した。ろ液を分画分子量３０
，０００の限外ろ過膜を用い、１０倍に濃縮した後、凍
結乾燥しヘリコバクターピロリに対する特異抗体を含有
する卵黄水溶性蛋白粉末（以下抗ＨＰ卵黄水溶性蛋白粉
末という）２２ｇを得た。

【００１９】（ｃ）ヘリコバクター　　ピロリに対する
特異抗体を含有する精製鶏卵抗体の調製 卵黄水溶性蛋白粉末の調製工程で得られた、卵黄水溶性
蛋白画分（２１）に終濃度１０ｍＭとなるようにリン酸
２ナトリウムを溶解し、３Ｎ塩酸を滴下しｐＨ８．０と
した。あらかじめ１０ｍＭのリン酸緩衝液（以下ＰＢと
いう）ｐＨ８．０で平衡化した陰イオン交換樹脂（ＤＥ
ＡＥ−セファセル：ファルマシア社製）カラム（３００
ｍｌ）へ、ｐＨ８．０に調製した卵黄水溶性蛋白溶液を
アプライし、非吸着成分を、平衡化緩衝液で洗浄した。 次に１００ｍＭ　　ＰＢ　　ｐＨ８．０で吸着成分を溶
出した。溶出液に対し、終濃度１５％（ｗ／ｖ）となる
よう硫酸ナトリウムを加え、室温で３０分間撹拌した後
、１０，０００×ｇ，１０分間の遠心分離で塩析物を集
めた。塩析物を１０ｍＭ　　ＰＢ　　ｐＨ８．０に溶解
し、同様の塩析操作をさらに２回繰り返した。最終的に
得られた塩析物を１０ｍＭＰＢｐＨ８．０に溶解し、１
０ｍＭ　　ＰＢ８．０に対し透析後、凍結乾燥し、ヘリ
コバクター　　ピロリに対する特異抗体を含有する精製
鶏卵抗体（以下抗ＨＰ精製鶏卵抗体という）１．２ｇを
得た。得られた抗ＨＰ精製鶏卵抗体は、ＳＤＳ−電気泳
動による純度検定において、鶏卵抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の２
本のバンドのみが検出された。

【００２０】＜各種調製サンプルの凝集抗体価＞抗ＨＰ
全卵粉末、抗ＨＰ卵黄粉末、抗ＨＰ卵黄水溶性蛋白粉末
を、それぞれ５０ｍｇ／ｍｌとなるように、抗ＨＰ精製
鶏卵抗体は５ｍｇ／ｍｌとなるように、ＰＢＳ（ｐＨ７
．４）に溶解し、ろ紙（Ｎｏ．２　　ペーパーフィルタ
ー）でろ過した。ろ液についてマイクロタイター法に従
い、ヘリコバクター　　ピロリに対する凝集抗体価を求
めた。各サンプルの抗体純度及び凝集抗体価を表２に示
す。抗体純度は、粉末重量に対する鶏卵抗体重量（％）
で示した。

【００２１】

【表２】

【００２２】＜胃炎，胃または十二指腸潰瘍予防食品の
調製＞下記の組成よりなる胃炎，胃または十二指腸潰瘍
予防食品を、７０℃以上の過度の加熱あるいは酵素分解
による抗体の失活がおこらぬよう、抗ＨＰ全卵粉末，抗
ＨＰ卵黄粉末または抗ＨＰ卵黄水溶性蛋白粉末等の添加
時間を考慮し、通常の製造方法により調製した。 （１）胃炎，胃または十二指腸潰瘍予防アイスクリーム
の処方例 （２）胃炎，胃潰瘍または十二指腸潰瘍予防ヨーグルト
の処方例

【００２３】試験例１．ムチンへの接着阻害試験ヘリコ
バクター　　ピロリの調製は実施例１と同様の方法で行
った。ヘリコバクター　　ピロリのコロニーを集め、１
０ｍＭ　　ＰＢ　　ｐＨ７．４で洗浄した。遠心（３０
００×ｇ，１０分間）して集めた菌を再び１０ｍＭ　　
ＰＢ　　ｐＨ７．４に懸濁し、１ｍｌ当り２×１０２Ｃ
ＦＵにした。０．２％豚胃粘膜ムシン（Ｓｉｇｍａ社製
）溶液でコーティングされた２４穴ポリスチレンプレー
トに、菌液と実施例１の抗ＨＰ精製鶏卵抗体（１ｍｇ／
ｍｌ）または、菌液と市販の鶏卵から精製したコントロ
ール鶏卵抗体（抗体純度９８％）（１ｍｇ／ｍｌ）の混
液各１ｍｌを加えて１時間インキユベートし、生理的食
塩水で洗浄後、プレートに残存するヘリコバクター　　
ピロリの菌数を、同菌が産生するウレアーゼを測定する
ことにより算定した。ウレアーゼの活性は単位時間に生
成するアンモニア量をインドフェノール法により波長５
５７ｎｍの吸光度（５５７ｎｍ）として求めた。コント
ロールとして抗ＨＰ精製鶏卵抗体の代わりに、牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ：１ｍｇ／ｍｌ）を菌液に加えた。コ
ントロールを１００としたときの測定結果を表３に示す
。

【００２４】

【表３】

【００２５】

【発明の効果】本発明の胃炎，胃または十二指腸潰瘍予
防食品は人体にとって安全であり、これを食することに
より、ヘリコバクター　　ピロリの感染による胃炎，胃
潰瘍，十二指腸潰瘍の発症を予防することができ、この
ことにより健康の維持を図ることがてきる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ヘリコバクター　　ピロリ（Ｈｅｌｉ
   ｃｏｂａｃｔｅｒ　　ｐｙｌｏｒｉ）菌体を抗原とし免
   疫した鶏の卵から調製した該抗原に特異的な抗体を有効
   成分とする胃炎，胃または十二指腸潰瘍予防食品。