CN114073765A - 一种抑制幽门螺杆菌的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了采用源于幽门螺杆菌单表位抗原肽制备的SEA‑MAP免疫禽类动物获得的高特异性卵黄抗体以及动植物提取物制备抗幽门螺杆菌组合物，对幽门螺杆菌的抑制率高，利于大规模工业生产，为幽门螺杆菌感染相关疾病的预防和治疗提供了新的手段。

Description

一种抑制幽门螺杆菌的组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制幽门螺杆菌的组合物及其应用。

背景技术

幽门螺杆菌(H.pylori)属于革兰氏阴性杆菌，其感染率高，可引起胃炎、胃溃疡甚至胃癌。仅有小部分被感染者会出现临床症状，而大部分无症状携带者常被忽视，间接导致了幽门螺杆菌在人群中广泛传播。迄今为止，由H.pylori感染引起的疾病主要采用三联法，即质子泵抑制剂加两种抗生素的方法进行抗菌治疗，但该方法存在抗生素耐药、副作用大、复发率高等缺陷。因此，开发新的预防及治疗H.pylori感染的方法是十分必要的。

卵黄抗体(免疫球蛋白卵黄，IgY)是母鸡血液中存在的可传递至鸡卵黄并在仔鸡孵育过程中和孵育后对仔鸡起到保护作用的免疫球蛋白，也是卵黄中唯一的免疫球蛋白，具有良好的稳定性、耐高渗性、耐热、耐酸及耐碱性。由于卵黄抗体的制备不需要牺牲免疫过的动物，且可以连续地生产抗体，适合工业化推广应用。

单表位多聚抗原肽(SEA-MAP)的设计可在较小的空间范围内聚集高浓度的有效抗原表位，使其免疫原性与线性抗原肽相比大大增强。本发明针对幽门螺杆菌设计了特异性单表位B细胞抗原肽，其本身具有良好的免疫原性，并创新性地基于这些高特异性单表位抗原肽制备了SEA-MAP，以这些SEA-MAP代替传统的线性肽抗原对禽类动物进行免疫，获得了特异性更强的卵黄抗体，基于该卵黄抗体制备的组合物具有特异性强、无潜在生物危害性、适用于大规模工业生产等优势，在防治幽门螺杆菌感染中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗幽门螺杆菌组合物，包括：卵黄蛋白、大麦嫩苗提取物和乳铁蛋白。

本发明的优选技术方案中，所述组合物中，卵黄蛋白的含量为5-10重量份，大麦嫩苗提取物的含量为1-5重量份，乳铁蛋白的含量为1-5重量份。

本发明的优选技术方案中，所述卵黄蛋白的制备方法包括下述步骤：采用单表位抗原肽或树状表位肽免疫禽类动物，制得卵黄抗体。

本发明的优选技术方案中，所述单表位抗原肽包含KNLIGDKANS(SEQ ID NO：1)，LPALKENNGTVN(SEQ ID NO：2)，QAINPDNLTGS(SEQ ID NO：3)，RSRYSELGNTY(SEQ ID NO：4)中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述树状表位肽具有式I所示结构：

其中，X为碱性氨基酸，Z为所述幽门螺杆菌单表位抗原肽。

本发明的优选技术方案中，所述的碱性氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)的任一种。

本发明的优选技术方案中，所述禽类动物选自鸡、鸭、鹅、鸟中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述方法包括如下步骤：S1：采用所述单表位抗原肽或树状表位肽免疫禽类动物，制得卵黄抗体；

S2：卵黄抗体的提取及纯化。

本发明的优选技术方案中，S1包括下述步骤：

(1-1)选取雌性禽类动物，将所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，以1ml/只的免疫剂量在动物体的胸肌及大腿根部进行多点注射；

(1-2)每隔两周，采用所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化后的免疫原加强免疫一次，免疫剂量为1ml/只，优选加强免疫至少3次；

(1-3)末次加强免疫后2周收集蛋，优选收集蛋至少2个月。

本发明的优选技术方案中，收集未免疫蛋作为阴性对照品。

本发明的优选技术方案中，S2包括下述步骤：

(2-1)取消毒完毕的蛋，收集卵黄并刺破，量取10ml蛋黄液，加10倍双蒸水稀释，混匀后，调pH4-5，-20℃过夜，室温解冻，4℃下12000rpm离心30min，将上清液用滤纸过滤除脂，收集上清液，加入硫酸铵，使其终浓度为20％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，收集沉淀；

(2-2)将沉淀溶于20ml 0.01M pH7.4的PBS中，加入硫酸铵，使其终浓度为14％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，将收集的沉淀溶于2ml 0.01M pH7.4的PBS中；置于双蒸水中搅拌透析，1h后，更换透析液1次，透析过夜后，收集透析上清液，以0.22μm滤膜过滤除菌后，无菌EP管盛装，-20℃保存。

本发明的优选技术方案中，更换透析液2-5次，优选为3-4次。

本发明的优选技术方案中，所述大麦嫩苗提取物的制备方法包括：将新鲜大麦苗清洗、沥干后，采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，预冷冻温度-50℃至-40℃，冷阱温度-45℃至-30℃，升华温度10-30℃，真空度150-200Pa；将冻干产物粉碎，过100目筛；称取适量样品置于锥形瓶中，加入95％(v/v)乙醇溶液进行浸提，料液比为20-40:1，用封口膜将锥形瓶密封并置于摇床中，37℃、100rpm条件下浸提60min；提取完成后将提取液于4℃下10000rpm离心10min，取上清，即得。

本发明的优选技术方案中，所述乳铁蛋白的制备方法包括：

1)原料乳预处理：将原料乳用消毒纱布过滤，除去大部分杂质，用离心式净乳机进行净化，放于水池冷却，于-18℃下储存待用；

2)缓化：冷冻的初乳化冻时放置室温缓化；

3)脱脂：用奶油分离机进行脱脂；

4)酪蛋白沉淀：脱脂乳放置于38℃、pH4.6下进行沉淀；

5)乳清分离：滤膜选用醋酸纤维素和聚砜超滤膜，先用截留分子量为60000的膜处理，当透过液达0.5L时，在浓缩液中加入同体积生理盐水，再处理得0.25L分子量大于8×10⁵的过滤液，所得浓缩液用截留分子量100000的膜处理得滤液0.25ml，分子量小于9×10⁵，经过两种膜处理后的蛋白质分子量介于8×10⁵和9×10⁵之间；

6)添加抗变性剂：向浓缩液中添加蔗糖、柠檬酸盐、磷酸盐等以增加乳铁蛋白的稳定性；

7)杀菌：65-70℃低温杀菌30min；

8)干燥：采用冷冻干燥法进行干燥。

本发明的优选技术方案中，所述组合物为粉剂、片剂、丸剂、胶囊或口服液。

本发明的优选技术方案中，所述组合物优选为压片糖果。

本发明的优选技术方案中，所述组合物中还包含赋形剂、缓冲剂、调味剂、着色剂中的任一种或其组合。

本发明的另一目的是提供所述组合物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染相关疾病的制品中的应用。

本发明的优选技术方案中，所述疾病选自急性胃炎、慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、萎缩性胃炎、胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述消化性溃疡选自胃溃疡、十二指肠溃疡、食管溃疡、胃空肠吻合口溃疡、胃粘膜Meckel憩室溃疡中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述制品选自药品、保健品、功能性食品、特殊医学用途配方食品(FSMP)中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述药品选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、混悬液、丸剂、散剂、滴丸、糖浆剂、合剂、露剂、泡腾剂、乳剂、茶剂中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述保健品选自饮品、汤品、茶、酒、蜂制品、鲜汁、药膳中的任一种或其组合。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

采用源于幽门螺杆菌单表位抗原肽制备的SEA-MAP免疫禽类动物获得的高特异性卵黄抗体以及动植物提取物制备抗幽门螺杆菌组合物，对幽门螺杆菌的抑制率高，利于大规模工业生产，为幽门螺杆菌感染相关疾病的预防和治疗提供了新的手段。

具体实施方式

以下结合具体实施方案对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1卵黄蛋白的制备

选取20周龄母鸡，将SEQ ID NO：2所示的单表位抗原肽分别与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，以1ml/只的剂量在母鸡的胸肌及大腿根部进行多点注射；每隔两周，采用所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化后的免疫原加强免疫一次，免疫剂量1ml/只，共加强免疫3次；末次加强免疫后2周收集鸡蛋，同时收集未免疫蛋作为阴性对照品。

取消毒完毕的鸡蛋，收集卵黄并刺破，量取10ml蛋黄液，加10倍双蒸水稀释，混匀后，调pH值为4-5，-20℃过夜，室温解冻，4℃下12000rpm离心30min，将上清液用滤纸过滤除脂，收集上清液，加入硫酸铵，使其终浓度为20％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，收集沉淀；将沉淀溶于20ml 0.01M pH7.4的PBS中，再加入硫酸铵，使其终浓度为14％，静置1h后，4℃下12000rpm离心15min，将收集的沉淀溶于2ml 0.01M pH7.4的PBS中；置于双蒸水中搅拌透析，1h后更换透析液1次，共4-5次，透析过夜后，收集透析液，以0.22μm滤膜过滤除菌后，无菌EP管盛装，-20℃保存。采用ELISA法测定所获得的卵黄抗体的效价，为1:1024。

实施例2大麦嫩苗提取物的制备

将新鲜大麦苗清洗、沥干后，采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，预冷冻温度-45℃，冷阱温度-37℃，升华温度25℃，真空度170Pa；将冻干产物粉碎，过100目筛；称取5.0g样品置于250ml锥形瓶中，加入95％(v/v)乙醇溶液进行浸提，料液比为25:1，用封口膜将锥形瓶密封并置于摇床中，37℃、100rpm条件下浸提60min；提取完成后将提取液于4℃下10000rpm离心10min，取上清，即得。

实施例3乳铁蛋白的制备

1)原料乳预处理：将原料乳用消毒纱布过滤，除去大部分杂质，用离心式净乳机进行净化，放于水池冷却，于-18℃下储存待用；

2)缓化：冷冻的初乳化冻时放置室温缓化；

3)脱脂：用奶油分离机进行脱脂；

4)酪蛋白沉淀：脱脂乳放置于38℃、pH4.6下进行沉淀；

5)乳清分离：滤膜选用醋酸纤维素和聚砜超滤膜，先用截留分子量为60000的膜处理，当透过液达0.5L时，在浓缩液中加入同体积生理盐水，再处理得0.25L分子量大于8×10⁵的过滤液，所得浓缩液用截留分子量100000的膜处理得滤液0.25ml，分子量小于9×10⁵，经过两种膜处理后的蛋白质分子量介于8×10⁵和9×10⁵之间；

6)添加抗变性剂：向浓缩液中添加蔗糖、柠檬酸盐、磷酸盐等以增加乳铁蛋白的稳定性；

7)杀菌：65-70℃低温杀菌30min；

8)干燥：采用冷冻干燥法进行干燥，即得。

实施例4组合物的体外杀菌效果

本实施例的组合物为压片糖果，其有效成分组成如下表所示：

表1

取组合物1-3各1片，1ml蒸馏水溶解；幽门螺杆菌(H.pylori)SS1菌株于BHI培养液中，在三气培养箱(O₂ 5％，CO₂ 15％，N₂ 85％)中，37℃培养72h，菌落浓度达到10⁹个/ml后，将组合物1-3的水解液加入到5ml细菌悬液中，混匀后孵育1h后，将菌液涂布在BHI琼脂培养基上，上述条件下培养48h进行菌落计数，并计算抑制率。

以蒸馏水代替组合物水解液用作空白对照。结果见表2。

表2

实施例5组合物对于幽门螺杆菌患者的治疗效果

随机选取服用组合物1的患者志愿者95名，其中0-15岁5名，16-30岁35名，31-50岁45名，50岁以上10名。这些志愿者每日2次，每次2片，持续4周。用药期间通过问诊来确定是否有不良反应，同时记录患者口气改善情况。结果如表3所示。

表3

随机选取3名患者，患者分别于服用组合物1前和服用后通过14C-尿素呼气试验评估幽门螺杆菌抑制情况，结果如表4所示。

表4

以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗幽门螺杆菌组合物，其特征在于，包括：卵黄蛋白、大麦嫩苗提取物和乳铁蛋白。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，卵黄蛋白的含量为5-10重量份，大麦嫩苗提取物的含量为1-5重量份，乳铁蛋白的含量为1-5重量份。

3.根据权利要求1-2任一项所述的组合物，其特征在于，所述卵黄蛋白的制备方法包括下述步骤：采用单表位抗原肽或树状表位肽免疫禽类动物，制得卵黄抗体。

4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其特征在于，所述单表位抗原肽包含KNLIGDKANS(SEQ ID NO：1)，LPALKENNGTVN(SEQ ID NO：2)，QAINPDNLTGS(SEQ ID NO：3)，RSRYSELGNTY(SEQ ID NO：4)中的任一种或其组合。

5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于，所述树状表位肽具有式I所示结构：

其中，X为碱性氨基酸，Z为所述幽门螺杆菌单表位抗原肽。

6.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其特征在于，所述的碱性氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)的任一种。

7.根据权利要求1-6任一项所述的组合物，其特征在于，所述禽类动物选自鸡、鸭、鹅、鸟中的任一种或其组合。

8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：采用所述单表位抗原肽或树状表位肽免疫禽类动物，制得卵黄抗体；S2：卵黄抗体的提取及纯化。

9.根据权利要求1-8任一项所述的组合物，其特征在于，S1包括下述步骤：

(1-1)选取雌性禽类动物，将所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，以1ml/只的免疫剂量在动物体的胸肌及大腿根部进行多点注射；

(1-2)每隔两周，采用所述单表位抗原肽或树状表位肽与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化后的免疫原加强免疫一次，免疫剂量为1ml/只，优选加强免疫至少3次；

(1-3)末次加强免疫后2周收集蛋，优选收集蛋至少2个月。

10.根据权利要求1-9任一项所述的组合物，其特征在于，收集未免疫蛋作为阴性对照品。