CN106119195A - 一种用于诱导产生识别hpv的dc细胞的试剂盒以及诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，包含一种树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C‑端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：

Description

一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒以及诱导方法

技术领域

本发明涉及抗HPV领域，更特别地，涉及一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，以及诱导方法。

背景技术

宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤，严重威胁着妇女的健康和生命。我国是宫颈癌高发国家,特别是近年来年轻宫颈癌患者有明显上升趋势，发病率以每年2％-3％速度增长。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)可引起良、恶性增生，特别是高危型HPV与宫颈癌的关系密切。目前，对宫颈癌的治疗多采用手术、化疗、放疗、生物治疗和中医疗法联合应用。这些疗法的共同缺陷是缺乏特异，对正常组织细胞损伤大,毒副作用大，不但疗效不能满意，而且医疗费用巨大。

随着免疫识别理论、分子生物学知识和电子显微技术的不断进展与突破,大量研究证实发现T细胞对于抗原的识别是与MHC分子结合递呈的抗原短肽。即当外源性抗原被抗原呈递细胞捕获后，蛋白质抗原在内吞系统被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即T细胞表位与MHC I类分子结合，被转运至APC表面供T细胞受体识别，从而激发细胞免疫应答，发挥免疫调节作用。

通过结合这些免疫理论，研究者和医疗人员联想到可通过体外致敏活化树突状细胞，活化的树突状细胞会输至患者体内，从而诱导特异性的CTL，攻击病原体以及受感染的细胞。在不断实践的基础上，他们研发出主动的、特异的细胞免疫治疗。细胞免疫治疗特异性地杀伤受感染的细胞，对正常细 胞和组织伤害较小，并且对机体免疫起巨大的促进作用，所以一经出现就吸引了医学界的目光。

然而，该治疗方法仍然处于研发阶段，许多问题亟待解决。对于HPV感染的细胞免疫治疗而言，有效诱导出能够特异性识别HPV的DC细胞就是难题之一。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，其包含一种树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C-端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：

其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr-Met-Leu-Asp-Leu-Gln-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly

并且所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。

优选地，所述试剂盒还可包含GM-CSF和IL-4。

优选地，所述试剂盒还可包含CD14微珠。

本发明还提供了一种诱导产生识别HPV的DC细胞的方法，包括以下步骤：

1)从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；

2)使用GM-CSF和IL-4孵育步骤1)得到的所述CD14+细胞，使所述CD14+细胞分化成成熟的DC细胞；

3)使用权利要求1-3中任一项所述的试剂盒中的树状多肽冲击步骤2)得到的成熟的DC细胞，即得到识别HPV的DC细胞。

优选地，通过白细胞分离法从外周血或骨髓分离所述单核细胞。

优选地，在步骤3)之前对步骤2)得到的细胞进行DC细胞的分子标记染色，以确认所述CD14+细胞已经分化成成熟的DC细胞。

优选地，所方法包括以下步骤：

1)通过白细胞分离法从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；

2)将步骤1)中得到的CD14+细胞重悬于含有50ng/ml IL-4和100ng/mlGM-CSF的RPMI-1640培养基中，使所述CD14+细胞分化成DC细胞，在培养过程中取样，并对所述样品进行分子标记CD86、CD40、CD80、HLA-DR和MHC-I染色，当所述分子标记都呈阳性时，将所述DC细胞用于下一步；

3)使用所述树状多肽冲击步骤2)得到的所述DC细胞，所得到的DC细胞即为识别HPV的DC细胞。

通过本发明的试剂盒和方法，可有效地将从患者的外周血或骨髓分离的单核细胞诱导成识别HPV的DC细胞，用于后续的细胞免疫治疗或用于科研用途。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1试剂盒的组成

本发明的用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒包含以下成分：

1)树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C-端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：

2)GM-CSF；

3)IL-4；

4)CD14微珠。

所述树状多肽通过以下方法制备：

1.表位肽的预测和筛选

1)人乳头瘤病毒抗原及其同源性分析

从Genebank中选择HPV16E7蛋白，其98个氨基酸序列：MHGDT PTLHE YMLDT QPETTDLYCY EQLND SSEEE DEIDG PAGQA EPDRA HYNIV TFCCK CDSTL RPLCVQ STHVD IRTLEDLLMG TLGIV CPICS QKP，将E7蛋白氨基酸序列与NCBI数据库中的蛋白片段进行Blast,以确定该段蛋白质的特异性。

2)HPV16E7抗原的一般特性预测

应用软件CLC Protein Workbench3版本和Signal P3.0软件对蛋白质进行预测，包括疏水性、亲水性、抗原性、跨膜结构域、等电点及信号肽潜在切割位点。

本发明采用SYFPEITHI远程预测数据库、PREDEPP数据库、基序法和多项式法共同对HPV16E7编码蛋白进行HLA-A2限制性CTL表位预测。

3)利用SYFPEITHI数据库进行CTL表位初步预测，通过PREDEPP数据库进行MHCI类结合基序预测。

4)基序法

(1)不同的MHCI类对所结合的肽的组成有不同的要求，但其中起主要作用进而对肽链与MHCI类分子的结合有重要影响的是肽链的两个主要锚点残基，他们在多肽与MHCI类分子的高亲和力结合中是必需的。

(2)二级锚点残基的作用除了两个主要锚点残基的必需因素外，多肽链中的其他氨基酸残基对多肽与HLA-A2分子的高或中等亲和力结合也有不可忽视的影响。在其他位置上，不同氨基酸残基对多肽与HLA-A2分子的结合有着不同的影响，有的氨基酸残基有利于结合，而有的则不利于结合。理想的与HLA-A2结合的CTL表位(即有高的或中等亲和力)应不包含不利于结合的氨基酸残基，或有利于结合的残基多于不利于结合的残基。

5)多项式方案预测表位肽

多项式方案是指当某残基R出现在某肽的第I位时，不考虑其他肽序列的情况下，该残基对于整个肽与MHCI类分子的结合自由能提供了一常量Ri，用在第I位为残基R的大量多肽的IC₅₀的负log10值的平均值来估计此常量。IC₅₀被定义为待测肽将对照肽-MHC复合物中50％的对照肽置换下来的浓度。将其所有氨基酸残基对应的Ri值相加，选择分值大于选定阈值的抗原肽为可能的后选肽。

将SYFPEITHI数据库的预测结果和PREDEPP数据库的预测结果进行对比，筛选出作为T细胞表位肽的可能性最大的5条肽:TLHEYMLDL(E7 7-15)、YMLDLQPET(E7 11-19)、RAHYNIVTF(E7 49-57)、RLCVQSTHV(E7 66-74)、LIMGTLGIV(E7 82-90)，再计算其多项式的值，设定阈值，最终筛选出HLA-A2限制性CTL表位肽：YMLDLQPET(E7 11-19)

2.表位肽的合成

1)运用Fmoc法固相合成优势表位肽其氨基酸序列为：YMLDLQPET(E7 11-19)

(1)第一个氨基酸与树脂的连接：将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂 1g置于干燥洁净的肽合成柱中，加入8ml DCM，溶胀5min，真空吸弃溶剂。分别取2mmol Fmoc氨基酸和5mmol DIEA，溶于8ml DCM，并加入于树脂中，室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃溶剂。用10ml DMF洗涤树脂2次，每次2min。加入10ml DCM/MeOH/DIEA(80:15:5)，轻轻摇动反应10min，真空吸弃溶剂。重复一次。用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。真空吸弃溶剂，N₂吹干。

(2)Fmoc基团的脱保护：向树脂中加入10ml脱保护(DEBLOCK)试剂(25％哌啶/DMF)，混匀，室温轻轻摇动反应5min。弃溶剂，用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。用6ml异丙醇洗涤树脂3次，每次5min。用6ml己烷洗涤树脂3次，每次5min。真空吸弃溶剂。取少量树脂样品，用茚三酮显色法(Kaiser法)快速测定树脂上的游离氨基含量：将树脂2ml用乙醇洗涤3次，分别加入2滴5％茚三酮、80％苯酚和KCN(2ml 0.001M KCN:98ml哌啶)，充分混匀，120℃加热6min,判断Fmoc基团的去保护反应程度。

(3)第二个氨基酸的偶联反应：第二个氨基酸的连接采用原位活化法，取2mmol的Fmoc氨基酸、4.0mmol的TBTU和4.0mmol的HOBT，加入最少量的DMF溶解后加入5mmol的DIEA，充分混匀后，加于脱Fmoc基团的树脂中。室温轻轻摇动反应60min。真空吸弃溶剂。用5ml甲醇洗涤树脂3次，每次5min。用10ml DMF洗涤树脂3次，每次2min。真空吸弃溶剂。

(4)肽链的延伸反应：用10ml DEBLOCK试剂脱去上一个氨基酸N端的Fmoc保护基团，10ml DMF洗涤树脂3次，真空吸弃溶剂。按照(3)方法偶联下一个氨基酸。重复进行Fmoc保护基团脱保护和氨基酸偶联反应，直至偶联得到所需多肽链。

(5)肽链的侧链去保护及从树脂上的切割：将已合成好全部氨基酸序 列的树脂，用10ml DMF洗涤后再用6ml异丙醇洗涤树脂3次，每次5min。用6ml己烷洗涤树脂3次，每次5min。真空吸弃溶剂后N₂吹干，放入裂解容器中。1g树脂加入25ml切割试剂(TFA:硫代苯甲醚:水：苯酚：EDT＝82.5:5:5:5:2.5v/v)，室温切割反应2h，不时摇动混匀，反应后的混合液经玻璃滤器过滤树脂，收集切割反应混合液，用TFA洗涤树脂3次。将反应混合液转移于一圆底烧瓶中，用等体积预冷的乙醚洗涤4次，收集沉淀。干燥后即得到合成抗原肽粗品。

(6)合成抗原肽的脱盐：将抗原肽粗品加蒸馏水溶解。称取AmershamG-25凝胶15g，溶胀后装柱，装好后的柱子先用50ml蒸馏水平衡，平衡好后，每次上样3-5ml，用蒸馏水进行洗脱，紫外分光光度仪检测220nm处紫外吸收，按峰收集抗原肽。

2)HPLC纯化抗原肽：使用HPLC高效色谱仪分离纯化抗原肽,经HPLC纯化后的纯度＞98％。色谱柱为径向加压色谱柱(25×100，15μm，DELTA PAK C18填料)，洗脱系统为：A液：5％乙腈溶液(含0.1％TFA)；B液：95％乙腈溶液(含0.08％TFA)。手动进样，每次进样1ml，流速4ml/min，线性梯度，45min内，B液从5％升到50％，然后5min内升到95％B液做最后洗脱。220nm处检测紫外吸收，按峰收集组分，用于质谱检测。将分子量检测正确的组分收集，真空冻干，成为需要的纯品，备用。

3)质谱鉴定抗原肽：采用激光解析质谱鉴定抗原肽，数据分析软件为G2025ASoftware A.02.01，方法严格按照操作手册进行，检测合成抗原肽的分子量，测定结果与理论值相符：1109.270。

4)表位肽的修饰：在肽的C端添加三个甘氨酸，这可提高肽的免疫调节作用，增加免疫活性。在T细胞表位的N-末端加上棕榈酰基可以增加小分子肽在细胞膜上的定位、跨膜及穿透能力。为了提高T细胞表位通过外源性途径引发CTL反应的能力，我们选择了棕榈酰丝氨酸以-AAA-柔性连接的 方式进行T细胞表位肽的修饰。相对无修饰的对照组，经修饰后的表位肽可使细胞活性呈现极显著升高(p<0.01)，将经修饰的表位肽的C端与三聚精氨酸骨架的氨基连接，每分子三聚氨基酸骨架有四个氨基，连接四分子表位肽。

实施例2使用实施例1的试剂盒诱导产生识别HPV的DC细胞

诱导产生识别HPV的DC细胞

1)通过白细胞分离法从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；

2)将步骤1)中得到的CD14+细胞重悬于含有50ng/ml IL-4和100ng/ml GM-CSF的RPMI-1640培养基中，使所述CD14+细胞分化成DC细胞，在培养过程中取样，并对所述样品进行分子标记CD86、CD40、CD80、HLA-DR和MHC-I染色，当所述分子标记都呈阳性时，将所述DC细胞用于下一步；

3)使用所述树状多肽冲击步骤2)得到的所述DC细胞，所得到的DC细胞即为识别HPV的DC细胞。

在实验过程中，培养CD14+细胞的第10天，大部分细胞的CD86、CD40、CD80、HLA-DR和MHC-I分子标记都呈阳性，于第11天使用树状多肽冲击。

对冲击后所得到的DC细胞进行检测：

1)DC细胞对HPV肽吸收情况

用FITC对肽标记，进行细胞定位，采用共聚焦显微法以确定DC细胞对HPV肽吸收情况。分析显示：30分钟内肽就会被DC细胞吸收。最初，在细胞体会看到荧光，细胞核看不到荧光；2小时后，肽会经由胞体扩散到树突；12小时后，在树突和胞体检测到荧光会逐渐消退。在细胞核没有观察到荧光。说明小分子肽不参与细胞的遗传信息传递，这一现象提示我们将表位肽作为疫苗，与DC共培养后回输机体，应该不会产生遗传性疾病(继发 性伤害)。

2)MTT检侧短肽对细胞活性的影响

采用MTT法检测HPV优势表位肽致敏后DC刺激T淋巴细胞的增殖效应。设置对照组如下：未致敏DC+T细胞组、优势表位肽+T细胞组、优势表位肽致敏DC+T细胞组，以及空白对照。结果显示：DC具有刺激T淋巴细胞增殖的作用。而单纯表位肽直接作用于T淋巴细胞不能引起T细胞的明显增殖,只能通过非特异性刺激引起T淋巴细胞反应性增长。而负载表位肽的DC细胞能有效刺激T淋巴细胞的生长，与其他对照组有显著差异(p<0.05)。

3)ELISPOT检测γ-IFN分泌

ELISPOT检测经负载表位肽DC刺激后的释放γ-IFN的T细胞的频数。所设立空白对照，DC组、T细胞组及负载优势表位肽的DC细胞组。结果显示：负载优势表位肽的DC细胞组相对于空白对照，DC组、T细胞组的结果高出很多，说明γ-IFN分泌。

实施例3将实施例1的试剂盒用于HPV免疫治疗

1.临床收集60例宫颈癌患者，年龄31-65岁，平均发病年龄49岁。均经人乳头状瘤病毒PCR检测确诊。所有患者随机分成治疗组和对照组两组，治疗组30例，对照组30例。

2.方法

治疗组通过血细胞成份分离机采集含有单核细胞的自体外周血60mL(必要需提前皮下注射G-CSF进行细胞动员)，提取单个核细胞，加入诱导因子将单个核细胞诱导为DC细胞，第9天用优势抗原表位肽活化致敏，第10天收集成熟的DC制备成细胞悬液，通过静脉回输和局部注射两种方式进行治疗。对照组以常规治疗做空白对照。观察治疗前后HPV DNA转阴率、 免疫功能变化、瘤体变化等指标。

3结果

3.1PCR检测HPV DNA

治疗组和对照组分别于治疗前及治疗一个月后，采用人乳头瘤病毒通用型引物，取宫颈病变部位皮肤组织或局部分泌物，于PCR扩增仪上做聚合酶链反应，PCR产物经电泳、染色后紫外分析仪下观察记录结果：治疗组HPV DNA转阴19例，对照组转阴者5例。显示细胞治疗对HPV DNA的清除率高，效果明显。

3.2细胞免疫功能检测

取治疗前一周及治疗结束一周取患者抗凝静脉血2mL，进行T细胞亚群检测：CD3、CD4、CD8，用Excel软件分别对治疗组与对照组患者治疗前后数据做z检验。治疗组治疗前CD3、CD4、CD8、CD4/CD8较治疗后CD3、CD4、CD8、CD4/CD8,两组差异显著(P<0.05)免疫功能改善明显.而对照组治疗前CD3、CD4、CD8、CD4/CD8与治疗后CD3、CD4、CD8、CD4/CD8比较，两组无显著差异(P>0.05)免疫功能改善不明显。

3.3瘤体变化

参照实体瘤疗效RECIST判定标准，通过治疗前和治疗后一个月的CT和B超数据进行对照比较，治疗组患者完全缓解9例，部分缓解11例，轻度缓解MR2例，总缓解率达73.3％；对照组患者完全缓解6例，部分缓解8 例，轻度缓解MR2例，总缓解率53.3％。治疗组经治疗缓解率高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于诱导产生识别HPV的DC细胞的试剂盒，其特征在于，包含一种树状多肽，所述树状多肽由四个HPV表位肽C-端的羧基与三个精氨酸残基构成的多聚精氨酸骨架的氨基连接而形成，并且具有以下结构式：

其中，R为精氨酸残基，X为所述表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为Tyr-Met-Leu-Asp-Leu-Gln-Pro-Glu-Thr-Gly-Gly-Gly，并且所述表位肽的N端有棕榈酰丝氨酸修饰。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含GM-CSF和IL-4。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含CD14微珠。

4.一种诱导产生识别HPV的DC细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；

2)使用GM-CSF和IL-4孵育步骤1)得到的所述CD14+细胞，使所述CD14+细胞分化成成熟的DC细胞；

3)使用权利要求1-3中任一项所述的试剂盒中的树状多肽冲击步骤2)得到的成熟的DC细胞，即得到识别HPV的DC细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过白细胞分离法从外周血或骨髓中分离所述单核细胞。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)之前对步骤2)得到的细胞进行DC细胞的分子标记染色，以确认所述CD14+细胞已经分化成成熟的DC细胞。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)通过白细胞分离法从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；

2)将步骤1)中得到的CD14+细胞重悬于含有50ng/ml IL-4和100ng/ml GM-CSF的RPMI-1640培养基中，使所述CD14+细胞分化成DC细胞，在培养过程中取样，并对所述样品进行分子标记CD86、CD40、CD80、HLA-DR和MHC-I染色，当所述分子标记都呈阳性时，将所述DC细胞用于下一步；

3)使用所述树状多肽冲击步骤2)得到的所述DC细胞，即得到识别HPV的DC细胞。