CN117778363A - 一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽及其肿瘤多肽疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种α‑烯醇化酶肿瘤抗原多肽及其肿瘤多肽疫苗及其应用，属于生物医药技术领域。一种α‑烯醇化酶肿瘤抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述多肽同时富含B细胞表位、Th细胞表位和CTL细胞表位。所述α‑烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白制备预防和/或治疗肺癌的肿瘤多肽疫苗中的应用。所述肿瘤多肽疫苗能够刺激小鼠体内产生大量ENO1蛋白特异性抗体且抑制肿瘤的生长，增强T细胞免疫反应，能够有效抑制肺癌的发展过程，为目前肺癌的治疗提供新的靶标和途径。并且本发明肿瘤多肽疫苗安全性高，具有重要的临床价值。

Description

一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽及其肿瘤多肽疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽及其肿瘤多肽疫苗及其应用。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率最高的癌症之一，其中非小细胞肺癌发病率占肺癌发病率的80％以上且总体预后较差。在非小细胞肺癌肿瘤疫苗临床研究方面，目前还没有开发出一个具有良好效果的肿瘤抗原，严重地阻碍肺癌肿瘤疫苗的研发，使得难以进行基于肿瘤疫苗的联合肿瘤疗法。

α-烯醇化酶(α-enloase，ENO1)是一种参与丙酮酸合成的代谢酶。ENO1在多种肿瘤中过度表达，包括乳腺癌、肺癌、宫颈癌等；研究表明ENO1促进癌症侵袭与Warburg效应相关，进而导致肿瘤细胞在体内的扩散和侵袭。现阶段普遍认为肿瘤的致病原因受遗传、免疫以及生活方式等因素的影响。肿瘤相关抗原的突变或者异常表达往往会促进肿瘤在体内的生长、扩散和侵袭。然而目前还没有开发出一种针对肺癌的免疫原性强，治疗效果佳的肿瘤相关抗原。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽，所述抗原同时包含B细胞表位、Th细胞表位和CTL细胞表位序列，能够激发机体免疫应答产生ENO1特异性抗体，可用于制备预防和治疗非小细胞肺癌的疫苗。

本发明提供了一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了一种肿瘤多肽疫苗，活性成分包括所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白。

优选的，所述载体蛋白包括Ag85B；

所述Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选的，所述肿瘤多肽疫苗的剂型为注射剂；

在所述注射剂中，所述融合蛋白的浓度为0.1～0.6mg/ml。

本发明提供了一种所述肿瘤多肽疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将编码α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白的基因序列克隆至质粒中，得到重组载体；

将所述重组载体转化至表达宿主中，得到重组菌株；

利用所述重组菌株重组表达融合蛋白，收集融合蛋白，得到肿瘤多肽疫苗。

优选的，所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述质粒包括pET-30a；

所述表达宿主包括原核表达系统和/或真核表达系统。

优选的，当所述表达宿主为原核表达系统时，所述重组表达融合蛋白的方法为所述重组菌株在含卡那霉素的LB液体培养基中培养，当OD值达到0.6～0.7时，添加IPTG进行诱导培养，收集菌体，破碎，分离和纯化融合蛋白。

本发明提供了所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白在制备预防和/或治疗肺癌的肿瘤多肽疫苗中的应用；

所述载体蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的Ag85B。

本发明提供了一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明首先以α-烯醇化酶蛋白为对象，分别预测和筛选富含B细胞表位、Th细胞表位和CTL细胞表位的多肽片段，将筛选的多肽片段与载体蛋白融合表达免疫动物，来鉴定所述抗原的免疫活性，结果表明，免疫动物的血清中产生大量α-烯醇化酶多肽片段特异性抗体，且诱导细胞免疫，同时还具有安全无副作用的特点。

本发明还提供了一种肿瘤多肽疫苗，活性成分包括所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白。实验表明，所述肿瘤多肽疫苗免疫接种肺癌实体瘤的小鼠，结果表明，所述肿瘤多肽疫苗能够通过增强T细胞免疫反应显著抑制小鼠肺癌肿瘤的生长，为目前肺癌的治疗提供新的靶标和途径。本发明提供的疫苗安全性高，具有重要的临床价值。

附图说明

图1为Ag85B-ENO1模式图；

图2为重组质粒pET30a-Ag85B及pET30a-Ag85B-ENO1蛋白表达纯化图；

图3为ELISA检测Ag85B-ENO1免疫小鼠中ENO1特异性抗体结果；

图4为Ag85B-ENO1免疫组抑制小鼠体内肿瘤的生长的统计结果；

图5为Ag85B-ENO1免疫组抑制小鼠体内肿瘤体积大小的结果；

图6为不同处理组小鼠体在治疗过程中的平均重量结果；

图7为Ag85B-ENO1肿瘤多肽疫苗在肿瘤TIL中增强T细胞反应结果。

具体实施方式

本发明提供了一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明中，以α-烯醇化酶的全序列(SEQ ID NO：5)为对象，分别预测B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位的抗原多肽片段，得到SEQ ID NO：21所示的α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽同时含有B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位。经重组表达后免疫动物验证该抗原的活性，结果表明，所述抗原能够诱导机体产生α-烯醇化酶特异性抗体，同时能够抑制肺癌细胞的生长，诱导机体增强T细胞免疫反应，且免疫动物血常规检测值正常，体重未明显下降，说明该抗原的免疫具有良好的免疫原性的同时具有良好的安全性。

本发明提供了一种肿瘤多肽疫苗，活性成分包括所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白。

在本发明中，由于所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽肽段分子量小，免疫原性较弱，且易降解等特点，采用所述α-烯醇化酶肿瘤多肽抗原直接免疫机体很难使机体激发有效的免疫反应，产生相应抗体。基于此，本发明将所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和大分子的载体蛋白偶联或融合表达，有利于增强肿瘤多肽疫苗的免疫原性和稳定性。所述载体蛋白优选包括Ag85B。所述Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述Ag85B是指源于卡介苗的分支杆菌来源的分泌蛋白，能够刺激CD4+T细胞的增殖分化，促进IFN-γ、TFN-β、IL-2等细胞因子的分泌，诱导Th1型细胞免疫应答，是一种良好的免疫佐剂。本发明将肿瘤多肽抗原多肽与Ag85B串联表达(示意图见图1)后，能强化肿瘤多肽抗原的免疫原性和稳定性。

在本发明中，所述融合蛋白在重组表达时，优选在所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白之间用连接肽连接。所述连接肽优选为GGGGS(SEQ ID NO：6)。同时为了方便后续融合蛋白的分离纯化，优选在融合蛋白中添加标签序列。所述标签序列优选为组氨酸标签(HHHHHH，SEQ ID NO：7)。在本发明实施例中，制备的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：3(MHHHHHHFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAGGGGGSALELRDNDKTRYMGKGVSKAVEHINKTIAPALVSKKL)所示。

在本发明中，所述肿瘤多肽疫苗的剂型优选为注射剂。在所述注射剂中，所述融合蛋白的浓度优选为0.1～0.6mg/ml，更优选为0.6mg/ml。所述注射剂的溶剂优选为注射用水。本发明对所述注射剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的注射剂的制备方法即可。

本发明提供了一种所述肿瘤多肽疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将编码ENO1肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白的基因序列克隆至质粒中，得到重组载体；

将所述重组载体转化至表达宿主中，得到重组菌株；

利用所述重组菌株重组表达融合蛋白，收集融合蛋白，得到肿瘤多肽疫苗。

在本发明中，所述ENO1肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白的基因序列优选如SEQ ID NO：4所示。

本发明对所述质粒的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的质粒即可，例如根据表达宿主的类型进行选择。所述表达宿主优选包括原核表达系统和/或真核表达系统。当所述表达宿主为原核表达系统时，以大肠杆菌为代表说明重组表达的方案。所述质粒优选包括pET-30a。当所述表达宿主为原核表达系统时，所述重组表达融合蛋白的方法为所述重组菌株在含卡那霉素的LB液体培养基中培养，当OD值达到0.6～0.7时，添加IPTG进行诱导培养，收集菌体，破碎，分离和纯化融合蛋白。所述重组菌株的构建优选采用基因合成的方法得到。所述卡那霉素的浓度优选为25～35μg/mL，更优选为30μg/mL。所述培养的温度优选为20～37℃。所述IPTG的浓度优选为0.5mM。所述诱导培养的条件优选为20～37℃下培养6～12h。所述收集菌体的方法优选离心。所述离心的时间优选为5～10min，更优选为10min。所述离心的转速优选为5000-8000rpm，更优选为6000rpm。所述菌体重悬于PBS中，超声破碎。所述超声破碎的功率优选为350-400W，更优选为400W。所述超声破碎的时间优选为工作5s，间歇10s，总计10-30min，更优选为工作5s，间歇10s，总计20min，间隔时间优选为10s。所述分离融合蛋白优选为离心破碎液，收集沉淀。所述沉淀采用缓冲液溶解后得到粗蛋白液进行Ni柱层析。所述缓冲液的溶剂优选为含以下组分的水溶液：50mM Tris，300mMNaCl，0.2mM PMSF，体积浓度0.1％Triton X-100，pH值8.0。所述Ni柱层析的方法，将所述粗蛋白液和Ni柱填料混合孵育后上柱，平衡、清洗Ni柱和洗脱。所述平衡用溶剂优选为含50mMTris，300mM NaCl的水溶液，pH 8.0。所述洗涤用溶剂优选为含50mM Tris，300mM NaCl，20/50mM咪唑(Imidazole)的水溶液，pH8.0。所述洗脱用溶剂优选为含50mM Tris，300mM NaCl，500mM Imidazole的水溶液，pH 8.0。所述平衡、清洗Ni柱和洗脱时，溶剂的流速优选为1ml/min。收集洗脱液进行SDS-PAGE检测。检测后得到目标大小的蛋白后，将收集的洗脱液进行透析去除小分子，然后再浓缩蛋白。所述浓缩蛋白的方法优选用PEG20000浓缩和0.45μm滤膜过滤。

本发明提供了所述ENO1肿瘤抗原多肽和载体蛋白形成的融合蛋白在制备预防和/或治疗肺癌的肿瘤多肽疫苗中的应用；所述载体蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示的Ag85B。

在本发明中，所述肿瘤多肽疫苗包括融合蛋白和佐剂。本发明对所述佐剂的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的佐剂的种类即可，例如MF59。所述融合蛋白和佐剂的体积比优选为1∶1。

在本发明中，所述肿瘤多肽疫苗的免疫方法以免疫小鼠为例加以说明，优选为将所述肿瘤多肽疫苗肌肉注射至动物体内，每次注射的剂量为100μl。相邻两次注射的间隔时间为5～7天，更优选为7天。在本发明实施例中，Ag85B-ENO1肿瘤多肽疫苗直接免疫小鼠，激发机体的免疫应答，产生ENO1的特异性抗体。在医学上，该疫苗能用于预防和治疗非小细胞肺癌。

下面结合实施例对本发明提供的一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽及其肿瘤多肽疫苗及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种富含B细胞表位、Th细胞表位、CTL细胞表位的ENO1抗原多肽片段的筛选

1.B细胞抗原表位预测：

应用在线软件IEDB(http：//tools.iedb.org/bcell/)对该蛋白的B细胞抗原表位进行预测。输入氨基酸序列，通过KarpIus&Schulz分析柔韧性、Kolaskar和Tongaonkar预测抗原性、Emini预测抗原表面可及性、Parker预测亲水性，Chou和Fasman法预测氨基酸编码蛋白质的β转角，对B细胞表位进行联合预测分析；最后选取亲水性与表面可及性良好、柔韧性强、抗原性好、最好为卷曲和转角这种可能性大的区域作为候选B细胞表位，尽量避开α螺旋、β折叠结构。

结果见表1。

表1 B细胞表位预测结果

2.Th表位的预测：

(1)应用SYFPEITHI超基序法预测Th表位，登陆网址(http：//www.syfpeithi.de/)，点击EPITOPEPREDIC TION进入表位预测界面，输入ENO1蛋白氨基酸序列，对MHC类型为HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301(DR17)、HLA-DRB1*0401(DR4Dw4)、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1501(DR2b)进行远程预测，选多肽长度为15aa，取分值≥18分的序列为候选Th表位。

(2)应用RANKPEP软件预测Th表位，登陆网址(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)，输入ENO1蛋白氨基酸序列，在MHCII中选择亚型为HLA-DR1(DRB1*0101)、HLA-DR17(DRB1*0301)、HLA-DR4(DRB1*0401)、HLA-DR7(DRB1*0701)、HLA-DR8(DRB1*0801)、HLA-DR11(DRB1*1101)及HLA-DR15(DRB1*1501)的限制性Th细胞表位进行预测，记录有红色标记的为候选表位序列。综合分析上述两种软件的预测结果，将得分均较高的序列选为候选Th表位。

结果见表2～表3。

表2ENO1Th细胞表位预测

3.CTL表位的预测

(1)应用SYFPEITHI超基序法预测CTL表位，登陆网址(http：//www.syfpeithi.de/)，点击EPITOPEPREDIC TION进入表位预测界面，输入ENO1蛋白氨基酸序列，选择HLA-A*02：01、HLA-A*03、HLA-B*07：02三类进行远程预测，选多肽长度为9aa，取分值≥18分的序列。

(2)应用RANKPEP软件预测CTL表位，登陆网址(http：//imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)，输入ENO1蛋白氨基酸序列，在MHCI中选择HLA-A*02：01(A2)、HLA-A*03：01(A3)、HLA-B*07：02(B7)三类限制表型进行远程预测，记录有红色标记的为候选表位序列。

(3)应用NetMHC软件预测CTL表位，登陆网址(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)，输入ENO1蛋白氨基酸序列，选多肽长度为9aa，对MHC I类型为HLA-A*02：01(A2)、HLA-A*03：01(A3)、HLA-B*07：02(B7)三类进行远程预测，记录有红色标记的为候选表位序列。

表3ENO1CTL细胞表位预测

由上述筛选结果可知，ALELRDNDKTRYMGKGVSKAVEHINKTIAPALVSKKL(SEQ ID NO：1)为筛选最佳的抗原。根据筛选结果表明，该多肽序列同时覆盖B细胞表位，Th细胞表位，CTL细胞表位，因此确定为候选肽段。

实施例2

重组质粒pET-30a-Ag85B-ENO1的构建及相应的工程菌的获得

1.将Ag85B-ENO1片段通过生物合成构建至pET-30a质粒，构建pET-30a-Ag85B-ENO1重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌BL21，获得重组基因工柱菌。

Ag85B-ENO 1核酸序列：ATGCACCACCACCACCACCACTtctcccggccggggctgccggtcgagtacctgcaggtgc

cgtcgccgtcgatgggccgcgacatcaaggttcagttccagagcggtgggaacaactcacctgcggtttatctgctcgacggcctgcgcgcccaagacgactacaacggctgggatatcaacaccccggcgttcgagtggtactaccagtcgggactgtcgatagtcatgccggtcggcgggcagtccagcttctacagcgactggtacagcccggcctgcggtaaggctggctgccagacttacaagtgggaaaccttcctgaccagcgagctgccgcaatggttgtccgccaacagggccgtgaagcccaccggcagcgctgcaatcggcttgtcgatggccggctcgtcggcaatgatcttggccgcctaccacccccagcagttcatctacgccggctcgctgtcggccctgctggacccctctcaggggatggggcctagcctgatcggcctcgcgatgggtgacgccggcggttacaaggccgcagacatgtggggtccctcgagtgacccggcatgggagcgcaacgaccctacgcagcagatccccaagctggtcgcaaacaacacccggctatgggtttattgcgggaacggcaccccgaacgagttgggcggtgccaacatacccgccgagttcttggagaacttcgttcgtagcagcaacctgaagttccaggatgcgtacaacgccgcgggcgggcacaacgccgtgttcaacttcccgcccaacggcacgcacagctgggagtactggggcgctcagctcaacgccatgaagggtgacctgcagagttcgttaggcgccggcggtggaggtggatctgccctagagctccgggacaatgacaaaactcgctacatggggaagggtgtctcaaaggctgttgagcacatcaataaaactattgcacctgccctggttagcaagaaactgtaa。

2.工程菌发酵及重组Ag85B-ENO1蛋白的获得

1)蛋白表达：挑取单克隆pET-30a-Ag85B-ENO1到含有终浓度为30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养；当OD值达到0.6时，添加诱导剂0.5mM IPTG，继续培养，20℃条件下培养12h，未添加诱导剂的为阴性对照；离心，弃上清，收集菌体；在收集到的菌体中加入PBS重悬菌体，使用超声破碎仪使其充分溶解，离心，离心后的沉淀使用包涵体溶解液进行溶解，分别对上清和沉淀处理，制样蛋白电泳样品，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达。

2)蛋白纯化：诱导后的菌体用缓冲液溶解(50mM Tris，300mM NaCl，0.2mM PMSF，0.1％Tritonx-100，pH 8.0)后超声破碎，离心收集上清粗蛋白。取5mlNi-NTA，用5倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡Ni柱，流速5ml/min；将Ni柱填料加入至粗蛋白溶液中，孵育1h；将孵育后的产物上柱，流速1ml/min收集流出液。用20mL Binding buffer(50mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)清洗平衡Ni柱；用Washing buffer(50mM Tris，300mM NaCl，20/50mMImidazole，pH 8.0)清洗Ni柱，流速1ml/min收集流出液；用Elution buffer(50mM Tris，300mM NaCl，500mM Imidazole，pH 8.0)洗脱蛋白，流速1ml/min收集流出液。对粗蛋白、洗杂流出、洗脱流出分别处理，制样，准备SDS-PAGE检测。透析浓缩：将纯度较好的蛋白溶液透析到50mM Tris，300mM NaCl，0.1％sarkosyl，2mM DTT，pH 8.0中，透析结束后用PEG20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装1mL/管，-80℃保存。

结果见图2。由图2可知，Ag85B和ENO1多肽形成的融合蛋白成功重组表达。

实施例3

基于ENO1的肿瘤多肽疫苗的制备方法

将实施例2重组表达的Ag85B-ENO1融合蛋白用注射用水稀释至0.6mg/mL，然后与佐剂MF59按照体积比1∶1的比例混合，乳化，得到肿瘤多肽疫苗。

对比例1

Ag85B蛋白的重组表达和分离纯化

按照实施例2的方法对Ag85B蛋白进行重组和分离纯化，得到目标片段大小的蛋白(见图2)，说明成功得到Ag85B重组蛋白。

将Ag85B重组蛋白用注射用水稀释至0.6mg/mL，然后与佐剂MF59按照体积比1∶1的比例混合，乳化，得到Ag85B多肽疫苗。

实施例4

ENO1的肿瘤多肽疫苗的免疫实验

将实施例3制备的肿瘤多肽疫苗进行肌肉注射3次小鼠，每次注射剂量为100μL，相临两次注射的间隔时间为7天；对照组注射等量的对比例1制备Ag85B多肽疫苗。在最后一次次免疫注射后的一周处死小鼠，收集小鼠血液，通过ELISA(华美生物，中国，货号CSB-EL007670MO)实验检测血清中抗体。

结果图3表明，所述多肽疫苗能够免疫机体产生具有大量ENO1多肽片段特异性。

另外通过对Ag85B-ENO免疫后小鼠肝功、肾功、心肌酶谱的检测，结果见表4～表8。结果表明，检测值均在正常范国内，无明显脏器损伤指征。

表4肝功ALT指标检测

表5肝功AST指标检测

表6肾功UA指标检测

表7心肌酶谱CK指标检测

表8心肌酶谱LDH指标检测

实施例5

Ag85B-ENO1肿瘤多肽疫苗免疫荷瘤小鼠模型的实验

在小鼠皮下接种荷瘤后的第7天，将0.6me/ml的Ag85B-ENO1或Ag85B与MF59按照1∶1体积比混合，混合后分别与小鼠左右上肢注射50μL。共计注射3次，每次间隔时间为7天。

在小鼠荷瘤之前首次测量小鼠体重，之后在每次免疫小鼠之前，测量小鼠体重，共计测量4次，每次间隔7天。

在最后一次免疫小鼠后的第七天，对小鼠进行麻醉后，摘除眼球取血，随后处死小鼠，随后小心剥离小鼠皮下肿瘤。

肿瘤生长结果见图4和图5。由图5表明，Ag85B-ENO1肿瘤多肽疫苗具有较好的肿瘤治疗效果，在LLC小鼠皮下肿瘤模型中，显著抑制LLC肿瘤的生长。

免疫小鼠体重结果见图6。经过Ag85B-ENO1肿瘤多肽疫苗治疗后，小鼠体重未出现明显下降，小鼠治疗后未出现明显消度的状况。

实施例6

肿瘤TIL中增强T细胞反应实验

使用小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液试剂盒(索莱宝，中国，货号：P9000)从实施例5中剥离的小鼠皮下肿瘤中分离淋巴细胞，具体方法如下：

一、肿瘤浸润组织研磨

1.无菌条件下摘取肿瘤浸润组织，用眼科剪将肿瘤浸润组织剪成小块。

2.将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液(保证肿瘤浸润组织及获得的细胞处于液体环境中)。

3.将肿瘤浸润组织放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨肿瘤浸润组织(尽量控制研磨力度，保持筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡)

4.研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。

二、淋巴细胞分离方法

1.制备肿瘤浸润组织的单细胞悬液

2.取一支适当的离心管，加入与肿瘤浸润组织单细胞悬液等量的分离液(分离液最少不得少于3mL，总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果)。

3.小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。(可以使用巴氏德吸管吸取单细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。)4.室温，500～900g，离心20～30min。(根据肿瘤浸润组织单细胞悬液的量确定离心条件，单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以自行摸索，以达到最佳分离效果)。

4.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为稀释液层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。

5.用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞至另一洁净的15mL离心管中，向离心管中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min。

6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。

7.重复步骤7；

8.弃上清，细胞重悬备用。

三、小鼠肿瘤淋巴细胞中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞的检测

(1)将细胞浓度调整为1×10⁶个/ml，移至96孔细胞培养板，每孔100ul；

(2)进行细胞表面三染色，将细胞置于4℃冰箱，避光染色30min；Anti-CD3-Pacific Blue(155612，Biolegend，USA)+anti-CD4-FITC(130308，Biolegend，USA)+anti-CD8-APC/Cy7(100714，Biolegend，USA)，

(3)用无菌PBS清洗细胞3次，室温条件下，1000rpm离心5min，弃掉上清液；

(4)用300μl PBS重悬细胞，200目尼龙网(或铜网)过滤后，流式细胞仪检测细胞样品。

四、小鼠肿瘤淋巴细胞中Treg细胞检测

(1)按照“细胞表面的染色”方法进行胞外染色anti-CD4-FITC(130308，Biolegend，USA)+APCanti-mouse CD25(162106，Biolegend，USA)

(2)用200ul/孔4％多聚甲醛固定细胞，室温条件下，放置10min；

(3)用无菌PBS清洗细胞2次，室温条件下，1000rpm离心5min，弃掉上清液，加100ulPBS重悬；

(4)PE anti-mouse Foxp3(126404，Biolegend，USA)荧光抗体用0.2％Triton X-100(PBS配制)稀释，每孔加入20ul含trionX-f00的抗体(每10⁶个细胞加入0.1μl抗体，FITC，可以多加点)，将细胞置于4℃冰箱中，避光染色2h。

(5)用无菌PBS清洗细胞3次，室温条件下，1000rpm离心5min，弃掉上清液；

(6)取300μl PBS重悬细胞，200目尼龙网(或铜网)过滤后，流式细胞仪检测细胞样品。

结果见图6。结果表明，Ag85B-ENO1治疗后能够增强细胞免疫，在治疗后，肿瘤组织中CD4⁺，CD8⁺T细胞比例明显上调，Treg细胞比例明显降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种肿瘤多肽疫苗，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白。

3.根据权利要求2所述肿瘤多肽疫苗，其特征在于，所述载体蛋白包括Ag85B；

所述Ag85B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求3所述肿瘤多肽疫苗，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求2～4中任意一项所述肿瘤多肽疫苗，其特征在于，所述肿瘤多肽疫苗的剂型为注射剂；

在所述注射剂中，所述融合蛋白的浓度为0.1～0.6mg/ml。

6.一种权利要求2～5中任意一项所述肿瘤多肽疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将编码α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白的基因序列克隆至质粒中，得到重组载体；

将所述重组载体转化至表达宿主中，得到重组菌株；

利用所述重组菌株重组表达融合蛋白，收集融合蛋白，得到肿瘤多肽疫苗。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：4所示。

8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述质粒包括pET-30a；

所述表达宿主包括原核表达系统和/或真核表达系统。

9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，当所述表达宿主为原核表达系统时，所述重组表达融合蛋白的方法为所述重组菌株在含卡那霉素的LB液体培养基中培养，当OD值达到0.6～0.7时，添加IPTG进行诱导培养，收集菌体，破碎，分离和纯化融合蛋白。

10.权利要求1所述α-烯醇化酶肿瘤抗原多肽和载体蛋白连接形成的融合蛋白在制备预防和/或治疗肺癌的肿瘤多肽疫苗中的应用；

所述载体蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的Ag85B。