CN113528547B - 新型冠状病毒b.1.617.1突变株dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种新型冠状病毒B.1.617.1突变株DNA疫苗。本发明提供的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，在表达蛋白依然为新型冠状病毒B.1.617.1突变株S蛋白的前提下，优化得到的核酸序列可以在真核表达系统中高效转录和表达，同时具有良好的免疫原性。

Description

新型冠状病毒B.1.617.1突变株DNA疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型冠状病毒B.1.617.1突变株DNA疫苗。

背景技术

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。经呼吸道飞沫传播是主要的传播途径，亦可通过接触传播，可导致肺部感染或病毒性肺炎疾病（COVID-19）。

SARS-CoV-2基因组依次编码棘突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。S蛋白介导病毒进入宿主细胞，对决定组织嗜性和宿主范围至关重要，负责新型冠状病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合，是疫苗设计的关键靶点。

SARS-CoV-2是具有包膜结构的单股正链RNA病毒，极易发生突变。目前根据GISAID数据库公布的新冠病毒谱系信息，包括B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株、B.1.617突变株。其中，新冠病毒变异株B.1.617有三种亚型：B.1.617.1、B.1.617.2及B.1.617.3，目前，需要针对该突变株的有效疫苗。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种核酸分子。

本发明的第二目的在于提供一种生物材料。

本发明的第三目的在于提供核酸分子或生物材料的应用。

本发明的第四目的在于提供一种DNA疫苗。

本发明的第五目的在于提供DNA疫苗的制备方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种核酸分子，所述核酸分子具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述核酸分子编码新型冠状病毒B.1.617.1突变株S蛋白。

与上述核酸分子相关的生物材料，包括：

一种重组载体，含有上述的核酸分子。

进一步地，重组载体选自真核表达载体，优选地，载体的骨架为pVAX1，优选地，所述重组载体为pB.1.617.1。

一种重组细胞，所述重组细胞含有上述的重组载体。

一种多肽，由上述核酸分子编码。

上述的核酸分子、重组载体、重组细胞或多肽在（A）或（B）中的应用：

（A）制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗；

（B）制备预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病的药物。

优选地，新型冠状病毒包括野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株或B.1.617突变株。

一种DNA疫苗，含有上述的核酸分子或重组载体。

进一步地，含有重组载体pB.1.617.1。

进一步地，核酸分子可在机体表达蛋白，该蛋白具有如下（a）-（c）至少一种功能：

（a）调整机体的免疫功能；

（b）抗新型冠状病毒感染；

（c）防止免疫病理损伤；

新型冠状病毒包括野生株、B.1.1.7突变株、B.1.351突变株、P.1突变株、B.1.2突变株、B.1突变株、B.1.525突变株或B.1.617突变株。

进一步地，所述DNA疫苗还包括佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种；

所述佐剂包括铝佐剂和/或TLRs 配体和/或金属离子如Mn²⁺、Zn²⁺和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂等。

进一步地，所述DNA疫苗还包括至少一种对新型冠状病毒有治疗作用的药物。

上述DNA疫苗的制备方法，将含有SEQ ID NO.1核酸分子的重组载体导入宿主细胞，培养宿主细胞，提取重组载体，得到DNA疫苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的核酸序列是发明人针对编码新型冠状病毒B.1.617.1突变株S蛋白的DNA序列进行优化得到，该优化包括基因的信号肽优化，在表达蛋白依然为新型冠状病毒B.1.617.1突变株S蛋白的前提下，优化得到的核酸序列可以在真核表达系统中高效转录和表达，同时具有良好的免疫原性。

以此核酸序列为活性功能成分制备得到的DNA疫苗有效激活机体免疫应答，对于体液免疫应答，在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体；对于细胞免疫应答，不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应、抗原特异性 CD4TNFa T细胞亚群和CD8IFNγ T细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性CTL反应。此外，该DNA疫苗具有良好的广谱性，对新冠病毒（野生型和突变型）均具有良好的免疫效果，不仅能够预防病毒的侵入，还可以轻触受感染细胞，并且调节抗体依赖性增强的潜在副作用引发的不良反应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中新冠野生株和变异株核酸疫苗在体外转染HEK293T细胞株后核酸序列表达的WB检测结果图；

图2为本发明实施例3中新冠野生株和变异株核酸疫苗在初次免疫14天后抗原特异性抗体检测结果；

图3为本发明实施例3中新冠野生株和变异株核酸疫苗在加强免疫7天后抗原特异性抗体检测结果；

图4为本发明实施例3中新冠野生株和变异株核酸疫苗在初次免疫14天后抗原特异性ELISOPT结果；

图5为本发明实施例3中新冠野生株和变异株核酸疫苗在加强免疫7天后抗原特异性CD4TNFa T细胞亚群结果；

图6为本发明实施例3中新冠野生株和变异株核酸疫苗在加强免疫7天后抗原特异性CD8TFNa T细胞亚群结果；

图7为本发明实施例3中新冠野生株和变异株核酸疫苗在加强免疫7天后抗原特异性CD8IFNγT细胞亚群结果；

图8为本发明实施例3中新冠野生株和变异株核酸疫苗在加强免疫7天后抗原特异性体内CTL结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明提供一种核酸分子，如SEQ ID NO.1所示，编码新型冠状病毒B.1.617.1突变株S蛋白。该核酸序列可以在真核表达系统中高表达S蛋白，从而增强以此制备的DNA疫苗的免疫原性。

需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中，提及的基因或核苷酸序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条，及其可反推成相应的氨基酸序列或蛋白序列。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，同时也公开了相应的氨基酸序列或蛋白序列。例如，提及SEQ ID NO.1，实际包括其互补的核苷酸序列，也包括其对应的翻译后的氨基酸序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然；本申请中的基因序列包括RNA形式或DNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

ATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGCCCATGGTGTGGGCCTCGCAGTGCGTGAACCTGACCACACGGACCCAGCTGCCTCCAGCTTACACAAATAGCTTCACCAGAGGCGTGTACTACCCGGACAAGGTGTTCCGGTCCTCTGTGCTGCACAGCACCCAGGACCTCTTCCTGCCCTTTTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCTATCCACGTGTCTGGCACAAACGGAACCAAAAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCTTTCAATGATGGAGTCTACTTCGCCTCTATCGAAAAGAGCAACATCATCCGCGGCTGGATCTTCGGCACCACCCTGGACAGTAAGACCCAGAGCCTGCTCATCGTGAACAACGCCACGAACGTGGTGATCAAGGTGTGTGAATTCCAATTTTGCAACGACCCCTTTCTCGACGTGTACTACCACAAGAACAATAAATCTTGGATGAAGAGCGAGTTTAGAGTGTACAGCTCTGCTAACAACTGCACTTTCGAGTACGTGTCCCAGCCATTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGGGCAATTTCAAGAACCTGAGAGAATTCGTGTTTAAGAACATCGACGGCTACTTCAAAATCTATTCTAAGCACACCCCAATCAACCTGGTCCGGGACCTGCCACAAGGCTTCAGCGCCCTGGAACCTCTGGTGGACCTGCCTATCGGAATCAACATCACCCGGTTCCAGACCCTGCTGGCCCTGCATCGGAGCTACCTGACACCTGGCGACAGCAGCTCTGGCTGGACCGCCGGCGCTGCCGCATATTACGTCGGCTACTTGCAACCTAGGACCTTCCTGCTGAAATACAACGAGAACGGCACCATCACAGATGCCGTTGATTGCGCCCTGGACCCCCTGAGCGAAACCAAGTGTACCCTGAAATCCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTTAGAGTACAGCCTACAGAATCTATCGTTCGGTTTCCAAACATTACCAACCTGTGTCCTTTCGGCGAGGTGTTTAACGCCACACGGTTCGCCAGCGTGTATGCCTGGAATAGAAAGCGGATCAGCAACTGTGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAATAGCGCCAGCTTCTCTACATTTAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACAAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTATGCCGATAGCTTCGTGATCCGGGGCGATGAGGTCCGGCAGATCGCTCCTGGCCAGACAGGCAAGATTGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGATGACTTCACCGGATGTGTGATAGCCTGGAACAGCAACAACCTGGATAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCGGTACCGACTGTTTAGAAAGAGCAACCTGAAACCTTTTGAGCGGGACATCAGCACAGAGATCTACCAAGCCGGCTCTACCCCTTGTAACGGCGTGCAGGGCTTCAACTGTTACTTCCCTCTGCAGTCTTACGGATTCCAGCCTACAAACGGCGTGGGATACCAGCCCTATAGAGTGGTGGTGCTGTCATTCGAGCTGCTACATGCCCCTGCCACCGTGTGCGGCCCTAAGAAGTCTACCAACCTCGTGAAGAACAAGTGCGTGAATTTTAACTTCAATGGACTGACAGGCACAGGCGTGCTGACAGAGAGCAACAAAAAGTTCCTGCCCTTCCAGCAGTTTGGCAGAGATATCGCTGACACCACAGACGCCGTGCGCGATCCTCAGACCCTGGAGATCCTGGACATCACCCCTTGCTCCTTTGGAGGAGTGTCCGTGATCACACCTGGAACGAACACCAGCAACCAGGTTGCCGTGCTGTACCAGGGCGTGAACTGCACAGAAGTTCCTGTGGCCATCCATGCCGATCAGCTGACGCCCACGTGGCGGGTGTACTCTACCGGCAGCAATGTGTTCCAGACCAGAGCCGGCTGCCTTATTGGCGCTGAGCACGTGAATAATAGCTATGAATGCGATATCCCAATCGGAGCCGGCATTTGCGCCAGCTACCAGACCCAGACAAATAGTCGGAGAAGAGCCAGATCTGTGGCCTCCCAGAGCATCATCGCATATACCATGAGCCTAGGAGCCGAAAACAGCGTCGCCTATTCCAACAATAGCATCGCCATCCCGACAAACTTCACCATCAGCGTGACCACCGAAATCCTGCCCGTGAGCATGACCAAGACAAGCGTGGACTGTACAATGTACATCTGTGGAGACTCCACCGAGTGCAGCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAACAGAGCCCTGACAGGGATCGCCGTGGAACAGGATAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTATAAGACTCCACCTATTAAGGACTTTGGCGGCTTCAACTTCAGCCAAATCCTGCCCGATCCTAGCAAGCCAAGCAAGCGGTCCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAGGTGACCCTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGACTGTCTGGGCGATATCGCCGCTAGAGACCTGATCTGCGCCCAGAAGTTCAATGGCCTGACCGTGCTCCCACCTCTGCTCACCGACGAGATGATCGCCCAGTACACCTCTGCCCTGCTGGCCGGCACCATCACCAGCGGGTGGACATTCGGGGCTGGAGCTGCTCTGCAAATCCCCTTCGCCATGCAGATGGCCTACAGATTCAACGGCATCGGCGTTACCCAGAATGTGCTGTATGAAAACCAGAAACTGATAGCTAACCAGTTCAACAGCGCCATAGGCAAAATCCAGGATAGTCTGAGCTCTACAGCCAGCGCCCTGGGAAAACTGCAGGATGTGGTGAATCAGAACGCCCAGGCCCTGAATACACTGGTGAAACAACTGAGCAGCAATTTCGGCGCCATCAGCAGCGTGCTGAATGATATCCTGTCTAGACTGGACCCCCCCGAGGCCGAGGTGCAGATCGATAGACTGATCACCGGCAGACTGCAGTCCCTGCAGACATACGTGACTCAACAGCTGATCAGAGCCGCTGAGATCAGAGCTTCTGCTAATTTGGCTGCCACAAAGATGAGCGAGTGCGTGCTGGGCCAGAGCAAAAGAGTGGACTTCTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCCCAGAGCGCCCCTCACGGCGTCGTGTTCCTGCACGTGACTTACGTGCCTGCCCACGAGAAGAACTTCACCACCGCCCCTGCCATCTGCCACGACGGCAAGGCCCACTTCCCCCGGGAGGGCGTGTTCGTGAGCAATGGCACCCACTGGTTCGTGACCCAAAGAAACTTTTACGAGCCCCAGATTATCACCACCGACAACACCTTCGTGTCAGGCAACTGCGACGTGGTGATCGGCATCGTGAACAACACTGTGTACGACCCTCTGCAGCCTGAGCTGGACAGCTTCAAGGAGGAACTGGACAAGTACTTCAAAAACCACACATCTCCTGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGCATTAACGCCTCTGTGGTGAACATCCAGAAGGAAATCGACAGACTGAACGAGGTGGCCAAGAACCTGAATGAGAGCCTGATCGACCTGCAGGAGCTGGGCAAGTACGAGCAGTACATCAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGCTTTATCGCCGGCCTGATCGCCATCGTGATGGTCACCATCATGCTGTGCTGCATGACCAGCTGTTGCAGCTGCCTGAAAGGCTGTTGCAGCTGCGGAAGTTGCTGCAAGTTTGACGAGGACGACTCTGAGCCTGTGCTGAAGGGCGTCAAGCTGCACTACACATGA（SEQ ID NO.1）。

本发明同时提供与上述核酸分子相关的生物材料，例如重组载体、重组细胞和多肽。这些生物材料均可作为生物模块直接应用于不同需求和场景的生产中。重组载体的骨架可以为表达载体或克隆载体，优选为pVAX1，重组载体优选为本发明实施例构建得到的pB.1.617.1；宿主细胞可以是HEK293、CHO、COS-7细胞株、DH5a、Top10、BL21、DH10B等感受态细胞。

上述核酸分子、重组载体、重组细胞和多肽均可用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗，或者用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病的药物。由于该核酸序列表达的抗原具有免疫广谱性，所以新冠病毒可以为野生株（SARS-CoV-2）和突变株。

本发明提供以上述核酸分子为活性功能成分的DNA疫苗，具体优选为本发明提供的重组载体pB.1.617.1。在一些实施方式中，可以添加药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂等改善核酸疫苗的性能，该核酸疫苗在机体内激活体液免疫应答产生的抗体可以预防新型冠状病毒的侵入，以及激活的细胞免疫应答可进一步清除受新型冠状病毒感染的细胞，以及调节由于抗体依赖性增强的潜在副作用引发的不良反应。

上述DNA疫苗的制备方法简单，将含有SEQ ID NO.1核酸序列的重组载体导入宿主细胞，培养宿主细胞，提取重组载体，即得到DNA疫苗。下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1：DNA疫苗的构建过程

1.新冠病毒DNA疫苗的制备方法

1.1.质粒的构建

根据B.1.617.1突变株序列（EPI_ISL_1669767，GISAID），结合经验优化获得SEQID NO.1所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO.1 所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I 位点间，得到新冠病毒B.1.617.1变异株质粒（命名为pB.1.617.1）。

根据新冠野生型（SARS-CoV-2）序列（MN908947.3，NCBI），优化获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，将如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列插入pVAX1载体的BanH I与Xho I 位点间，得到新冠病毒野生株质粒（命名为pWT）。pWT野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。

1.2.质粒的转化

从-80 ℃冰箱中取100 µl DH10B感受态细胞悬液，冰上解冻。加入质粒DNA溶液（体积不超过10 µl）轻轻摇匀，冰上放置30 min。42℃水浴中热击70秒，迅速置于冰上冷却5min。向管中加入0.9ml的LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液摇匀后取100µL涂布于含适当抗生素的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h。挑选形状均匀的单克隆菌体，使用无菌移液器头将克隆扎取后置入5ml 含有50mg/mL卡那霉素的LB选择培养基中37℃过夜培养。

1.3.质粒的提取

将上述菌液按照1：1000加入到200-400ml 含有卡那霉素（50mg/mL母液，1：1000使用）的LB选择培养基中，37℃ 200rpm培养12-16h。用EndoFreen Plasmid Maxi kit（QIAGEN，德国）进行质粒提取：将上述培养12-16h的菌液8000rpm 4℃离心10min后弃上清收集菌体，加入10ml Buffer P1重悬菌液后加入10ml Buffer P2轻轻颠倒4-6次混匀，室温孵育5min充分裂解。向混液中加入10ml Buffer P3, 轻轻颠倒4-6次混匀终止裂解后，全部转移至QIAfilter Cartridge中，室温孵育10min，加入栓塞过滤上清。将滤液转移至干净无内毒素50ml离心管中，加入2.5ml Buffer ER，轻轻颠倒10次混匀后放于冰上孵育30min。取出QIAGEN-tip 500加入10ml Buffer QBT平衡柱子，将上述液体转移至柱子中，利用重力流进行吸附质粒，用30ml Buffer QC洗涤2次，再用15ml Buffer QN进行洗脱。每管样品用10.5ml异丙醇沉淀，4℃，4000g离心30min。弃上清，加入70%乙醇洗涤1次，4℃，4000g离心10min。弃上清，晾干沉淀，每样加入500µl无内毒素水进行重悬质粒，得到DNA疫苗质粒（pB.1.617.1和pWT）。

实施例2：新冠病毒DNA疫苗哺乳动物细胞抗原蛋白表达鉴定

为了进一步验证实施例1构建的质粒是否在哺乳动物细胞内可以有效表达，因此通过提取抗原蛋白，Western Blot方法进行鉴定。

1.蛋白提取

将pWT和pB.1.617.1转染到HEK293T细胞株中，转染48小时结束后，去除转染后的培养液，用预冷的PBS洗一遍，弃去PBS，加入150µl裂解液（使用前按1：100加入EDTA及蛋白酶抑制剂）混匀后吹打10次。置于12,000rpm 4度离心5 分钟。吸出上清至1.5mL离心管中，每样取出50µl上清液，加入12.5µl 5×蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min后，瞬离备用。

2.样品上样及SDS-PAGE电泳

将煮沸离心后的上清样本每孔加62.5µl 于SDS-PAGE胶孔中，接通电源，调至恒压200V，时间设置45min进行电泳。电泳结束后取出SDS-PAGE进行转膜制作。取PVDF膜在甲醇中浸泡30s激活，将PVDF膜置于1x转膜平衡液中1min。

3.转膜

以正极为底面按照：eBlot L1转膜垫片、PVDF膜、凝胶、eBlot L1转膜垫片顺序依次叠加，每叠加一次用管子排除层间气泡。封闭：将PVDF膜从取出放入盛有1× TBST+5%脱脂奶粉的玻璃盒中，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1X TBST中清洗3次，每次 10分钟，摇床90rpm摇动。一抗孵育：将PVDF膜放入一抗溶液（S-ECD/RBD monoclonalantibody(1), 1:2000 稀释）反应，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，在摇床中90rpm摇动。二抗孵育：将PVDF膜放入二抗溶液中（BDPharmingen HRP Anti human IgG，1:5000 稀释）反应，在摇床90rpm室温孵育1h。洗涤：将PVDF膜放入1×TBST中清洗5次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。显色：取化学发光液A液3ml和B液3ml以1：1比例混合后加入到 PVDF膜孵育1-2min，拍照。

结论：如图1所示，新冠野生株及变异株DNA疫苗在体外转染48小时后与空载体（pVAX1）相比能够在细胞内高水平地表达抗原Spike蛋白。

实施例3：新冠DNA疫苗免疫原性验证

为了评估实施例1制备的疫苗的免疫原性，以及免疫策略对体液免疫和细胞免疫应答的影响，从卡文斯百格公司购买了无特定病原体的6周龄C57BL/6雌性小鼠，并将其保存在艾棣维欣Advaccine 实验室（苏州）的动物设施中。对于DNA疫苗的接种：将实施例1的pB.1.617.1和pWT根据不同分组的注射剂量先后注射到股骨前肌肉，然后进行电脉冲（EP）。电脉冲（EP）装置由两组具有0.2 Amp恒定电流的脉冲组成。第二脉冲组被延迟3秒。在每个组中，有两个52 ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198 ms。将第一次初免计为0天，第14天进行第二次免疫（加强免疫）。实验分组：（1）对照组载体质粒pVAX1-25µg；（2）实验组野生型毒株pWT-25 µg；（3）实验组变异株pB.1.617.1-2.5 µg；（4）实验组变异株pB.1.617.1-10 µg；（5）实验组变异株pB.1.617.1-25 µg；第14，21天采集小鼠血液样品，用ELISA法测定血清的特异性抗体滴度。在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天，处死被免疫的小鼠，以分析细胞免疫反应。

1.评估DNA疫苗引发的抗原特异性体液免疫应答

1.1.ELISA检测抗体浓度

使用基于ELISA方法评估针对SARS-CoV-2 RBD蛋白结合抗体。将Nunc 96孔ELISA平板在4°C下用1 µg / mL SARS-Cov-2 RBD蛋白（Acro Biosystems，DE，美国）包被过夜。将板洗涤3次，然后用含5％牛血清白蛋白（BSA）的PBS（含0.05％Tween 20，即PBST缓冲液）37℃下封闭1小时。将三倍连续稀释的小鼠血清添加到每个孔中，并在37°C下孵育1小时。将板再次洗涤五次，然后在37°C加入1：8000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP（GenScript，NJ，CN）孵育1小时后，随后检测结合抗体。最后洗涤后，通过使用TMB底物使板显影，并用50μl/孔2MH₂SO₄终止反应。在450 nm和620 nm处读数，血清抗体滴度的终点确定为最高稀释度的倒数，样本最高稀释度比阴性对照的吸光度高2.1倍。(判定标准：实验组：对照组（阴性）OD450-620值≧2.1，判定该OD值下对应的最高稀释度为血清抗体滴度）。

结论：结果如图2（初次免疫后14天）和图3（加强免疫后7天）所示，新冠变异株和野生株DNA疫苗初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体。上述ELISA试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外包被抗原，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的变异株B.1.617.1DNA疫苗也取得了良好的，甚至更优的技术效果，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。

2.进一步评估DNA疫苗引发的抗原特异性细胞应答

预测并合成了S抗原特异性表位肽的多肽库（S peptide），并用该肽库刺激疫苗免疫后的小鼠脾细胞。

2.1.免疫细胞特异性刺激检测细胞免疫反应

我们通过ELISpot分析，研究DNA疫苗是否可以促进细胞免疫。在初次免疫后14天分离脾细胞，进行IFN-γ 阳性细胞ELISpot实验。

2.2分离脾细胞

在初次免疫后第14天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。

2.3 IFN-γ ELISpot实验

通过使用小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒（Dakewe，SZ，CN）进行IFN-γELISpot测定。将通过上述方法分离的每只小鼠的脾脏细胞悬液以250,000的密度接种到每个包被有抗IFN-γ抗体的孔中，并在37℃的CO₂培养箱中用SARS-CoV-2 RBD肽库刺激20小时，每孔中肽库浓度为10μg/mL（终浓度）（溶于RPMI + 10％FBS）。根据产品说明书进行操作。培养基和PMA /Iono分别作为阴性和阳性对照。阳性斑点通过iSpot Reader（AID，德国Straßberg）进行定量检测。通过减去阴性对照孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位（SFu）。

结论：IFN-γELISPOT结果如图4所示，新冠变异株和野生株DNA疫苗免疫后均能有效诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应。上述试验ELIspot试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的B.1.617.1变异株DNA疫苗甚至取得了明显更优的技术效果，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。

3.进一步评估疫苗引发的抗原特异性细胞免疫应答的影响，尤其是CD4和CD8 T细胞功能的影响，在加强免疫后7天分离脾细胞，进行流式细胞仪检测实验。

分离脾细胞：在加强免疫后7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含FBS的PBS终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％FBS，1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中。

流式细胞仪检测实验：通过上述方法获得的来自每只小鼠的脾脏细胞悬液，37℃，5％CO₂下用SARS-CoV-2 RBD肽库或PMA /Iono刺激，同时利用1μg/ ml的Brefedlin A阻断（BD，CA，美国）6小时。对脾细胞进行胞外及细胞内细胞因子染色，将刺激的脾细胞用FVD-eFluor780染色，然后洗涤，并在室温下于黑暗中分别用抗小鼠CD4，CD8a抗体染色30分钟。用固定/通透缓冲液透化细胞，并用抗小鼠IFN-γ和抗小鼠TNF-α在4℃下进行45分钟细胞内染色。将细胞洗涤两次，并用200µL PBS重悬，然后使用流式细胞仪（ThermoFisher，MA，美国）进行采集，然后用FlowJo软件（BD，CA, 美国）进行分析。

结论：结果如图5-7所示，新冠变异株和野生株DNA疫苗加强免疫后第7天, 能够显著诱导抗原特异性 CD4TNFa T细胞亚群和CD8IFNγ T细胞亚群的产生。上述试验FACS试验中，采用新冠野生型SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的B.1.617.1变异株DNA疫苗取得了显著的，甚至更优的技术效果，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。

4.免疫细胞特异性刺激检测体内CTL反应

由于CTL反应在抵抗病毒感染和消除病毒感染细胞方面起着关键作用，为了探索实施例1的两种DNA疫苗对细胞毒性T细胞功能的影响，在初次免疫后第14天和加强免疫后的第7天进行体内CTL检测。

取空白C57BL/6小鼠脾脏细胞（1.5x10⁸）与10µg S peptide pool共孵育，另取空白 C57BL/6小鼠脾脏细胞（1.5x10⁸）不孵育多肽。37℃ 5% CO₂培养4h。用eflour450标记细胞，多肽孵育组（1x10⁷细胞/ml+5µM，高染）,无多肽孵育对照组（1x10⁷细胞/ml+0.5µM，低染）。高染细胞与低染细胞按照1:1的比例混合，最终总细胞浓度为2x10⁷细胞 /ml。通过尾静脉注射，将4x10⁶混合细胞注射免疫组小鼠体内，4h后取脾脏细胞，流式上机，收集样本。体内杀伤率计算公式如下。

其中T代表Targets群，NT代表Non Targets群。

结论：结果如图8所示，新冠变异株和野生株DNA疫苗加强免疫后第7天能够诱导高活性的抗原特异性CTL反应。

综上，由实施例1-4的结果可知，本发明的变异株DNA疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达；而且具有免疫原性，表现在体液免疫和细胞免疫应答中，对于体液免疫应答，变异株DNA疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体；对于细胞免疫应答，变异株DNA疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性IFN-γ反应、抗原特异性 CD4TNFa T细胞亚群和CD8IFNγ T细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性CTL反应。

值得注意的是，pWT野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入III期临床，具有非常优秀的免疫效果。上述试验中例如ELISA、ELIspot和FACS的检测中，试验均采用的是新冠野生型 SARS-Cov-2 RBD蛋白作为体外包被抗原或者体外刺激肽，该条件均是对新冠野生型核酸疫苗pWT有利，然而本发明提供的B.1.617.1变异株核酸疫苗也取得了显著的，甚至明显更优的技术效果，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

序 列 表

<110> 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司

<120> 新型冠状病毒B.1.617.1突变株DNA疫苗

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3849

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60

gcctcgcagt gcgtgaacct gaccacacgg acccagctgc ctccagctta cacaaatagc 120

ttcaccagag gcgtgtacta cccggacaag gtgttccggt cctctgtgct gcacagcacc 180

caggacctct tcctgccctt tttcagcaac gtgacctggt tccacgctat ccacgtgtct 240

ggcacaaacg gaaccaaaag attcgacaac cccgtgctgc ctttcaatga tggagtctac 300

ttcgcctcta tcgaaaagag caacatcatc cgcggctgga tcttcggcac caccctggac 360

agtaagaccc agagcctgct catcgtgaac aacgccacga acgtggtgat caaggtgtgt 420

gaattccaat tttgcaacga cccctttctc gacgtgtact accacaagaa caataaatct 480

tggatgaaga gcgagtttag agtgtacagc tctgctaaca actgcacttt cgagtacgtg 540

tcccagccat tcctgatgga cctggaaggc aagcagggca atttcaagaa cctgagagaa 600

ttcgtgttta agaacatcga cggctacttc aaaatctatt ctaagcacac cccaatcaac 660

ctggtccggg acctgccaca aggcttcagc gccctggaac ctctggtgga cctgcctatc 720

ggaatcaaca tcacccggtt ccagaccctg ctggccctgc atcggagcta cctgacacct 780

ggcgacagca gctctggctg gaccgccggc gctgccgcat attacgtcgg ctacttgcaa 840

cctaggacct tcctgctgaa atacaacgag aacggcacca tcacagatgc cgttgattgc 900

gccctggacc ccctgagcga aaccaagtgt accctgaaat ccttcaccgt ggaaaagggc 960

atctaccaga ccagcaactt tagagtacag cctacagaat ctatcgttcg gtttccaaac 1020

attaccaacc tgtgtccttt cggcgaggtg tttaacgcca cacggttcgc cagcgtgtat 1080

gcctggaata gaaagcggat cagcaactgt gtggccgact actccgtgct gtacaatagc 1140

gccagcttct ctacatttaa gtgctacggc gtgtccccta caaagctgaa cgacctgtgc 1200

ttcacaaacg tgtatgccga tagcttcgtg atccggggcg atgaggtccg gcagatcgct 1260

cctggccaga caggcaagat tgccgactac aactacaagc tgcccgatga cttcaccgga 1320

tgtgtgatag cctggaacag caacaacctg gatagcaagg tgggcggcaa ctacaactac 1380

cggtaccgac tgtttagaaa gagcaacctg aaaccttttg agcgggacat cagcacagag 1440

atctaccaag ccggctctac cccttgtaac ggcgtgcagg gcttcaactg ttacttccct 1500

ctgcagtctt acggattcca gcctacaaac ggcgtgggat accagcccta tagagtggtg 1560

gtgctgtcat tcgagctgct acatgcccct gccaccgtgt gcggccctaa gaagtctacc 1620

aacctcgtga agaacaagtg cgtgaatttt aacttcaatg gactgacagg cacaggcgtg 1680

ctgacagaga gcaacaaaaa gttcctgccc ttccagcagt ttggcagaga tatcgctgac 1740

accacagacg ccgtgcgcga tcctcagacc ctggagatcc tggacatcac cccttgctcc 1800

tttggaggag tgtccgtgat cacacctgga acgaacacca gcaaccaggt tgccgtgctg 1860

taccagggcg tgaactgcac agaagttcct gtggccatcc atgccgatca gctgacgccc 1920

acgtggcggg tgtactctac cggcagcaat gtgttccaga ccagagccgg ctgccttatt 1980

ggcgctgagc acgtgaataa tagctatgaa tgcgatatcc caatcggagc cggcatttgc 2040

gccagctacc agacccagac aaatagtcgg agaagagcca gatctgtggc ctcccagagc 2100

atcatcgcat ataccatgag cctaggagcc gaaaacagcg tcgcctattc caacaatagc 2160

atcgccatcc cgacaaactt caccatcagc gtgaccaccg aaatcctgcc cgtgagcatg 2220

accaagacaa gcgtggactg tacaatgtac atctgtggag actccaccga gtgcagcaac 2280

ctgctgctgc agtacggcag cttctgcacc cagctgaaca gagccctgac agggatcgcc 2340

gtggaacagg ataagaacac ccaagaggtg ttcgcccaag tgaagcagat ctataagact 2400

ccacctatta aggactttgg cggcttcaac ttcagccaaa tcctgcccga tcctagcaag 2460

ccaagcaagc ggtccttcat cgaggacctg ctgttcaaca aggtgaccct ggccgacgcc 2520

ggcttcatca agcagtatgg cgactgtctg ggcgatatcg ccgctagaga cctgatctgc 2580

gcccagaagt tcaatggcct gaccgtgctc ccacctctgc tcaccgacga gatgatcgcc 2640

cagtacacct ctgccctgct ggccggcacc atcaccagcg ggtggacatt cggggctgga 2700

gctgctctgc aaatcccctt cgccatgcag atggcctaca gattcaacgg catcggcgtt 2760

acccagaatg tgctgtatga aaaccagaaa ctgatagcta accagttcaa cagcgccata 2820

ggcaaaatcc aggatagtct gagctctaca gccagcgccc tgggaaaact gcaggatgtg 2880

gtgaatcaga acgcccaggc cctgaataca ctggtgaaac aactgagcag caatttcggc 2940

gccatcagca gcgtgctgaa tgatatcctg tctagactgg acccccccga ggccgaggtg 3000

cagatcgata gactgatcac cggcagactg cagtccctgc agacatacgt gactcaacag 3060

ctgatcagag ccgctgagat cagagcttct gctaatttgg ctgccacaaa gatgagcgag 3120

tgcgtgctgg gccagagcaa aagagtggac ttctgcggca agggctacca cctgatgagc 3180

ttcccccaga gcgcccctca cggcgtcgtg ttcctgcacg tgacttacgt gcctgcccac 3240

gagaagaact tcaccaccgc ccctgccatc tgccacgacg gcaaggccca cttcccccgg 3300

gagggcgtgt tcgtgagcaa tggcacccac tggttcgtga cccaaagaaa cttttacgag 3360

ccccagatta tcaccaccga caacaccttc gtgtcaggca actgcgacgt ggtgatcggc 3420

atcgtgaaca acactgtgta cgaccctctg cagcctgagc tggacagctt caaggaggaa 3480

ctggacaagt acttcaaaaa ccacacatct cctgacgtgg acctgggcga tatcagcggc 3540

attaacgcct ctgtggtgaa catccagaag gaaatcgaca gactgaacga ggtggccaag 3600

aacctgaatg agagcctgat cgacctgcag gagctgggca agtacgagca gtacatcaag 3660

tggccttggt acatctggct gggctttatc gccggcctga tcgccatcgt gatggtcacc 3720

atcatgctgt gctgcatgac cagctgttgc agctgcctga aaggctgttg cagctgcgga 3780

agttgctgca agtttgacga ggacgactct gagcctgtgc tgaagggcgt caagctgcac 3840

tacacatga 3849

<210> 2

<211> 3852

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtggtggc gcctgtggtg gctgctgctg ctgctgctgc tgctgtggcc catggtgtgg 60

gcctctcagt gcgtgaacct gaccaccaga acccagctgc ctcctgctta caccaactcg 120

ttcacacggg gagtgtacta ccccgacaag gtgttcagga gctcagtgct gcatagcacc 180

caagacctgt tcctgccatt cttcagcaac gtcacgtggt tccacgccat ccacgtgtct 240

ggaaccaacg gcaccaagag attcgacaac cccgtgctgc ctttcaacga tggagtgtac 300

ttcgctagca ccgagaagag caacatcatc cggggctgga tcttcggcac cacactggac 360

tccaagacac agagtctgct gatcgtgaac aacgccacca acgtcgtgat caaggtgtgt 420

gagttccagt tctgcaacga tcctttcctc ggcgtttact accacaagaa caacaagagc 480

tggatggaat cagaatttag ggtatattct tctgccaata actgtacgtt tgaatacgtg 540

tctcagcctt tcctaatgga cctggaaggc aaacagggca actttaagaa cctgagagaa 600

ttcgtgttta agaacatcga cggctatttc aagatctaca gtaagcacac ccctatcaac 660

ctggtgcggg acctgcccca ggggttttcc gcccttgaac ctctggtgga cctgcccatt 720

ggcatcaata tcacaagatt ccagaccctg ctggccctgc acagaagcta cctgacccct 780

ggcgacagca gcagcggatg gaccgccggc gccgccgcct actacgtggg atacctgcag 840

cctagaacct tcctactgaa atacaacgaa aacggtacca tcaccgacgc cgtggattgc 900

gctctggacc ctctgagcga aaccaagtgc accctgaaaa gctttaccgt ggagaagggc 960

atttatcaga caagcaactt tcgggtgcag cctaccgaga gcatcgtgag attccctaac 1020

atcaccaacc tgtgtccttt cggcgaggtg ttcaatgcca cacggttcgc cagcgtgtac 1080

gcctggaacc ggaagcggat cagcaactgc gtggccgact acagcgtgct gtataatagc 1140

gccagcttca gcacattcaa gtgctacggc gtgagcccca ccaagctgaa tgatctgtgc 1200

tttaccaacg tgtatgccga tagctttgtg atccgggggg acgaggtaag acagattgcc 1260

ccaggacaga caggcaaaat cgcagattac aactacaaac tgcctgacga cttcaccggc 1320

tgcgttatcg cctggaactc caacaacctg gacagcaagg tgggaggaaa ctacaactac 1380

ctgtaccgac tgttcagaaa gagcaacctg aagccattcg agagagatat ttcgacagag 1440

atctaccagg ccggaagcac accttgcaac ggcgtggaag gcttcaactg ctacttcccc 1500

ctgcagagct acggctttca gcccacaaac ggcgtcggct accagcctta cagagtggtg 1560

gtgctgagct tcgagctgct gcatgcccct gccaccgtgt gcgggcctaa gaagtccaca 1620

aatctggtaa agaataagtg tgtgaacttc aatttcaatg gcctgaccgg aacgggtgtg 1680

ctgaccgaat ctaataagaa gttcctgcct ttccagcagt tcggccgtga tatcgccgac 1740

accaccgacg ctgtccgcga tcctcaaacc ctggaaatcc tggacattac accttgcagc 1800

ttcggcggcg tgtccgtgat cacaccaggc acaaacacca gcaaccaggt ggctgtgctg 1860

taccaggacg tgaactgtac agaggtgcct gtggccatcc acgccgacca gctgacacct 1920

acatggagag tgtattcaac aggcagcaac gtcttccaga ccagagcagg atgcctgatc 1980

ggcgctgagc atgtgaacaa ctcctacgag tgcgacatcc ctatcggcgc cggcatctgc 2040

gctagttacc agactcaaac caactctcct cggcgggcta gaagcgtcgc ctcccagagc 2100

atcatcgctt ataccatgtc tctgggcgcc gagaacagcg tggcctacag caacaactcc 2160

atcgccattc ctaccaactt cacgatctca gttaccaccg agatcctgcc tgtgagcatg 2220

acaaagacca gcgtcgactg caccatgtac atctgcggcg attccacaga atgctccaac 2280

ctgctgctcc agtacggctc tttctgtacc cagctgaaca gagccctgac aggcatcgcc 2340

gtggaacagg ataagaacac tcaggaggtg ttcgcccagg tgaagcagat ctacaagacc 2400

cctccaatca aggactttgg cggctttaat ttcagccaaa tcctcccaga tcctagcaag 2460

cccagcaaga gaagcttcat cgaggacctg ctgttcaaca aggtcaccct ggctgacgcc 2520

ggcttcatca agcagtatgg cgactgcctg ggcgatatcg ccgcgaggga tctaatttgt 2580

gctcagaagt tcaacggcct gaccgtgctg ccccccctgc tgacagacga aatgatcgct 2640

cagtacacat ctgccctgct ggccggcacc atcacgagcg gctggacctt cggagccggc 2700

gccgccctgc agatcccctt cgctatgcag atggcctata gattcaacgg catcggcgtg 2760

acccagaacg tgctgtacga gaaccaaaaa ctgattgcca atcaatttaa ttccgcgatc 2820

ggaaagatcc aggactctct gagctctact gccagcgccc tgggcaagct gcaagacgtg 2880

gtgaaccaga atgctcaagc cctgaacacc ctggtgaagc agctgagcag caatttcgga 2940

gcaatcagct ctgtcctcaa cgacattctg tctagactag acaaggtgga agccgaagtg 3000

cagatcgatc ggcttatcac cggaagactg cagagcctgc agacatatgt tacacagcag 3060

ctgatcagag ccgccgagat cagagccagc gccaacctgg cagccacaaa aatgtccgag 3120

tgcgtcctcg gccaatctaa gcgggttgat ttctgtggca aaggctacca cctgatgagc 3180

ttcccccaaa gcgctcctca cggcgtggtg tttctgcacg tcacctacgt gcccgcccaa 3240

gagaagaact tcaccaccgc ccccgctatc tgccacgacg gcaaggccca cttccctcgg 3300

gaaggcgtgt tcgtgagtaa cggtacacac tggtttgtga cccaaagaaa cttctacgag 3360

cctcagatca tcaccaccga taacaccttt gtgagcggca actgcgatgt ggtgatcggc 3420

atcgtgaaca acacagtata cgaccccctg cagcccgagc tggacagctt taaagaggag 3480

ctcgataagt acttcaagaa ccacacatct ccagacgtgg acctgggcga catcagcggc 3540

atcaacgcca gtgttgtgaa catccagaaa gaaatcgata gactgaacga agtggccaag 3600

aatctgaacg agagcctgat cgacctgcag gagctgggca aatacgagca gtacatcaag 3660

tggccttggt acatctggct gggctttatc gccggcctga tcgccattgt gatggtgaca 3720

atcatgctgt gctgtatgac ctcttgctgc tcctgcctga aaggctgttg tagttgcggc 3780

agctgctgta aattcgatga ggatgactcc gagccggtcc tcaaaggcgt caagctgcac 3840

tacacctgat aa 3852

Claims (11)

1.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.与权利要求1所述的核酸分子相关的生物材料，其特征在于，包括如下（1）-（2）的至少一种：

（1）重组载体，负载有SEQ ID NO.1核酸分子；

（2）重组宿主细胞，含有（1）中重组载体。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述重组载体选自真核表达载体，所述载体的骨架为pVAX1。

4.权利要求1所述的核酸分子或权利要求2或3所述的生物材料在制备预防SARS-CoV-2感染的疫苗或SARS-CoV-2引起的相关疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，SARS-CoV-2为野生株或B.1.617.1突变株。

6.一种DNA疫苗，其特征在于，含有权利要求1所述的核酸分子或者权利要求2或3中所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的DNA疫苗，其特征在于，核酸疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的DNA疫苗，其特征在于，所述佐剂包括TLRs 配体和/或金属离子和/或细胞因子佐剂。

9.根据权利要求8所述的DNA疫苗，其特征在于，金属离子佐剂包括铝佐剂，细胞因子佐剂包括趋化因子。

10.根据权利要求6-9任一项所述的DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗具有如下（a）-（c）至少一种功能：

（a）调整机体的免疫功能；

（b）抗SARS-CoV-2感染；

（c）防止免疫病理损伤；

SARS-CoV-2为野生株或B.1.617.1突变株。

11.权利要求6-10任一项所述DNA疫苗的制备方法，其特征在于，将含有SEQ ID NO.1核酸分子的重组载体导入宿主细胞，培养宿主细胞，提取重组载体，得到DNA疫苗。

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