JP6917303B2 - 人工多抗原融合タンパク質およびその製造と使用 - Google Patents
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Description
現在、臨床において、腫瘍と一部の細胞に感染する細菌およびウイルスには、有効な化学薬物がまだない。そのため、細胞免疫を刺激する治療性ワクチンは腫瘍および細菌・ウイルスの感染の抑制に非常に重要な作用を果たす。現在、米国FDAは既に前立腺癌を治療する治療ワクチンの市販を許可した。
通常の細胞免疫を検出する方法は酵素結合イムノスポット法(enzyme linked immunospot assay、ELISPOT)で、当該方法では、単一細胞のレベルでサイトカインを分泌するT細胞を検出することができる。たとえば、結核(TB)特異的抗原によって刺激された後サイトカインを分泌するT細胞の数を検出することによって、細胞免疫機能を評価することができる。結核にとって、細胞免疫の検査はTB感染の有無を診断する方法の一つである。2008年に、米国FDAはELISPOTの商品化キットT-SPOTの結核感染の診断への使用を許可した。これらの診断キットでは、基本的に、いずれも18〜20個のアミノ酸のポリペプチドの混合物が刺激源として使用される。これらのポリペプチドは末梢血の抗原提示細胞に取り込まれた後、加工されて自身のHLA抗原とともに細胞の表面に提示され、さらに記憶T細胞のT細胞受容体に認識される。T細胞が刺激された後、インターフェロン-γをはじめとするサイトカインが発生し、検出できるようになる。
このように、現在、本分野では、満足できるようなCD8+T細胞免疫を刺激できるワクチンはまだない。そのため、本分野では、有効にCD8+T細胞免疫を刺激でき、品質管理が容易で安全性が高い新規なワクチンの開発が切望されている。
本発明の第一の側面では、哺乳動物の対象に施用される場合、前記対象において同時にCD4+T細胞とCD8+T細胞の免疫応答を刺激することができる、人工多抗原融合タンパク質を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のCD4+T細胞の免疫応答とCD8+T細胞の免疫応答によって、前記のT細胞が細胞の表面に前記抗原を持つ標的細胞を認識するようになる。
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質は、≧3個、好ましくは≧5個、より好ましくは≧10個の抗原領域を含有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗原領域の数の上限は、≦200個、好ましくは≦100個、より好ましくは≦50個である。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域は、それぞれ異なるか、部分的に同じものか、または完全に同じものである。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域は同じか異なる病原体由来のもの、または同じか異なる種由来のものであるか、あるいは前記の各抗原領域は人工的配列(すなわち人工的に設計され、自然界に存在しない配列)である。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域はウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、クラミジア抗原、腫瘍抗原、またはこれらの組み合わせ由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記各抗原領域に、少なくとも一つ(好ましくは少なくとも2つ)のCD8+エピトープまたはCD8+T細胞免疫応答を刺激できるモチーフ配列と、少なくとも一つ(好ましくは少なくとも2つ)のCD4+エピトープまたはCD4+T細胞免疫応答を刺激できるモチーフ配列とが含まれる。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域の長さは8〜50個のアミノ酸、好ましくは10〜40個のアミノ酸、より好ましくは15〜35個のアミノ酸である。
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質は、さらに、各抗原領域の間に位置する酵素切断部位配列を含む。
もう一つの好適な例において、前記のカテプシンの酵素切断部位は、カテプシンSの酵素切断部位(たとえばLeu-Arg-Met-Lysまたは類似の酵素切断部位)、カテプシンBの酵素切断部位(たとえばMet-Lys-Arg-Leuまたは類似の酵素切断部位)、カテプシンKの酵素切断部位(たとえばHis-Pro-Gly-Glyまたは類似の酵素切断部位)、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のカテプシンSの酵素切断部位は、Arg-Cys-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gln↓-Leu、X-Asn-Leu-Arg↓、X-Pro-Leu-Arg↓、X-Ile-Val-Gln↓およびX-Arg-Met-Lys↓からなる群から選ばれるが、ここで、各Xは独立に任意の一つの天然アミノ酸で、↓は酵素切断位置を表す。
もう一つの好適な例において、前記の人工多抗原融合タンパク質において、各抗原領域は前記の酵素切断部位配列によって直接連結している。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域を連結するための酵素切断部位配列は同じか、異なる。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域を連結するための酵素切断部位配列は同じである。
もう一つの好適な例において、前記の各抗原領域自身は前記の酵素切断部位配列を含有しないか、あるいは前記の各抗原領域自身は前記の酵素切断部位配列を含有するが、前記抗原領域が酵素切断されてなる少なとも一つの酵素切断産物(または一部もしくは全部の酵素切断産物)はまだCD8+エピトープまたはCD4+エピトープとされる。
(a) タグ配列(たとえば精製用のもの、たとえば6His)、
(b) シグナルペプチド配列、
(c) 膜透過エレメント配列(たとえばCPP)、
(d) アジュバントエレメント配列(たとえばLRMK)、
(e) 細胞壊死因子エレメント配列。
もう一つの好適な例において、前記の哺乳動物は、ヒト、家畜(たとえばウシ、ヒツジ、ブタ)、ペット(たとえばイヌ、ネコ)、齧歯動物、ウサギ、サルなどを含む。
もう一つの好適な例において、前記抗原融合タンパク質における前記抗原領域は一つまたは二つ、あるいはそれ以上の標的タンパク質の≧10%、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、≧90%、より好ましくは100%の標的タンパク質のアミノ酸配列をカバーしている。
Y-(A-C)n-Z (I)
(式中において、
Aは抗原領域である。
Cはカテプシンの酵素切断部位配列である。
nは≧3の正整数である。
Yはないか「Y0-B」で表される配列であるが、ここで、Y0はシグナルペプチド配列、タグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせで、Bはないか切断部位(cleavage site)配列である。
Zはないか、あるいはタグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせである。
付加条件は、Zがない場合、最後の一つの「A-C」におけるCはなくてもよい。)
もう一つの好適な例において、前記の切断部位配列はCと同じである(すなわちB=C)。
もう一つの好適な例において、前記のnは、5〜100、より好ましくは6〜50、さらに好ましくは7〜30の任意の整数である。
もう一つの好適な例において、前記の組成物は、薬物組成物およびワクチン組成物を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組成物の剤形は、注射剤、凍結乾燥粉末、液体製剤、経口投与製剤、または経皮製剤を含む。
もう一つの好適な例において、前記のワクチン組成物は、抗病原体(たとえばウイルス)のワクチン組成物、抗腫瘍のワクチン組成物を含む。
もう一つの好適な例において、前記薬物組成物は、細菌関連疾患、ウイルス関連疾患、自己免疫疾患、腫瘍関連疾患またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる疾患の治療および/または予防に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の特異性T細胞免疫はCD4+T細胞免疫およびCD8+T細胞免疫を含む。
もう一つの好適な例において、当該試薬またはキットは皮膚試験に使用されるものを含む。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、病原体感染または腫瘍の治療および/または予防に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の対象は、ヒトおよびヒト以外の哺乳動物を含む。
もう一つの好適な例において、前記の施用の様態は、静脈注射、皮下注射、経口投与、経皮投与などを含む。
技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
具体的に、本発明者は実践を繰り返したところ、意外に、カテプシンの酵素切断部位によって連結した多抗原融合タンパク質ワクチンに基づき、非常に有効に抗原提示細胞によってMHC-I経路を介して提示されることを見出した。体外実験と体内実験では、当該タンパク質ワクチンは有効にCD8+T細胞を刺激することができ、かつ同時にCD4+T細胞を刺激する能力を持つことが示された。
本明細書で用いられるように、用語「本発明のタンパク質」、「本発明の融合タンパク質」、「人工多抗原融合タンパク質」、「抗原融合タンパク質」、「本発明のCD4+T細胞とCD8+T細胞の免疫応答を刺激する融合タンパク質」は、入れ替えて使用することができ、式Iの構造を有する、有効に同時にCD4+T細胞とCD8+T細胞の免疫応答を活性化させる人工組み換えタンパク質をいう。
短鎖断片のポリペプチド抗原(たとえば商業化されたT.SPOT.TBキットはヒト抗原提示細胞を刺激するための抗原である)は、リソソームに入ってMHC-I分子に提示されるだけでなく、提示細胞によって細胞質に吸収され、加工されてMHCクラスI分子にも提示される。一方、タンパク質系抗原は、まず、抗原提示細胞によって呑み込まれた後、初期ファゴソーム、後期ファゴソームを経て、最後にリソソームに入る。通常、リソソームに入ったタンパク質は完全にアミノ酸に分解される。しかし、タンパク質が次第に分解され、生成するポリペプチドがリソソームにあるMHC-II分子と結合して比較的に安定した複合体になり、細胞の表面に提示され、CD4+T細胞免疫を刺激する場合もある。通常の場合、タンパク質抗原は、リソソームから細胞質に漏れることはないため、MHC-I経路に入ってCD8+細胞を刺激することはない。本発明者は、意外に、本発明で特別に設計された抗原融合タンパク質は、CD8+T細胞を刺激できるだけでなく、元のCD4+T細胞を刺激する機能も維持することを見出した。
普通の短鎖断片の抗原ポリペプチド(一般的に≦70aa、≦60aaまたはそれ以上短い)は直接抗原提示細胞によって細胞質に吸収されることによって、MHCクラスI分子に提示される。普通のタンパク質抗原は、抗原提示細胞によってリソソームに呑み込まれるだけで、そしてリソソームにおける普通の成熟タンパク質はMHC-IIだけと結合し、CD4+T細胞だけを刺激する。
本発明の試験では、本発明の融合タンパク質が細胞のリソソームに入った後、リソソームの機能を抑制しても、融合タンパク質はすぐになくなったことが示され、これはリソソームにおいて本発明のタンパク質またはその酵素切断産物は細胞質に漏れることを示す。
本発明において、複数のエピトープ(または抗原領域)を連結した一つの特異性細胞免疫の検出に使用されるか、予防・治療性ワクチンとしての単一のタンパク質、すなわち、多抗原融合タンパク質を提供する。
本発明の多抗原融合タンパク質に、少なくとも1個、好ましくは2個、3個、4個、5個またはそれ以上(たとえば6〜20の任意の一つの正整数)のCD8+T細胞エピトープが含まれる。
本発明の多抗原融合タンパク質に、少なくとも1個、好ましくは2個、3個、4個、5個またはそれ以上(たとえば6〜20の任意の一つの正整数)のCD4+T細胞エピトープが含まれる。
カテプシンは1組のシステインプロテアーゼで、主な機能はリソソーム内におけるタンパク質を分解することである。カテプシン-S(cathepsin-S)の既知の主な機能はMHC-2の抗原提示過程に関与することである。
本発明の多抗原融合タンパク質において、これらのCD8+T細胞エピトープおよびCD4+T細胞エピトープを含有するポリペプチドの連結方法は、任意の抗原提示細胞におけるカテプシンの認識部位によるものでもよいが、好ましくはカテプシンCathepsin Sが好むLeu-Arg-Met-Lys配列を使用する。
もう一つの好適な例において、前記人工多抗原融合タンパク質は様々なカテプシンSの酵素切断部位を使用してもよいが、好適な酵素切断部位として、Arg-Cys-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gly↓-Leu、Thr-Val-Gln↓-Leu、X-Asn-Leu-Arg↓、X-Pro-Leu-Arg↓、X-Ile-Val-Gln↓およびX-Arg-Met-Lys↓が含まれるが、これらに限定されず、ここで、Xは任意のアミノ酸で、↓は酵素切断位置を表す。
本発明の好適な例として、HPV16-E7多抗原融合タンパク質がカバーする範囲は100%である。もちろん、カバー率が下がっても、行ける場合もあるが、特に目標タンパク質におけるMHC-Iエピトープが少なくてかつ明確な場合である。たとえば、本発明の一つの好適な例において、OVAがカバーする範囲は40%で、これはOVAに単一のMHC-Iエピトープしかなく、選ばれる断片がこのエピトープを含むためである。
多抗原融合タンパク質は一つ以上の抗原タンパク質をカバーしてもよいが、もう一つの好適な例において、本発明の結核菌の抗原融合タンパク質はESAT6およびCFP10の二つのタンパク質配列をカバーし、これによって生産コストを削減することができ、品質管理に有利である。
本発明の人工多抗原融合タンパク質は短鎖断片の抗原ポリペプチド(たとえば≦70または≦60のアミノ酸の抗原ペプチドおよびエピトープのポリペプチド)とも異なる。一つの主な違いは本発明のタンパク質の分子量が大きく、大分子タンパク質に属する(小分子ポリペプチドではない)ため、細胞に入る経路が違うことで、抗原提示の経路、T細胞を刺激する様態および機序のいずれも短鎖断片の抗原ポリペプチドと異なる。
抗原タンパク質が確定すると、本発明のタンパク質は組み換え法による大量生産で得られる。この場合、通常、人工合成のコードするDNAを発現ベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で宿主細胞または発酵産物からを単離して得る。
一つの典型的な抗原融合タンパク質の製造方法は、以下の工程を含む。
タンパク質抗原のアミノ酸の順番に合わせて一つの人工多抗原融合タンパク質を構築し、当該多抗原融合タンパク質は一連の特定の長さの抗原領域を含有するかそれらからなるもので、ここで、各抗原領域の間は同じか異なるカテプシンの酵素切断部位(たとえばleu-Arg-Met-Lys)で連結する。
また、本発明の融合タンパク質を発現するための細胞も本発明に含まれる。「宿主細胞」は、原核細胞と真核細胞とを含む。よく使用される原核細胞は大腸菌である。よく使用される真核宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されない。本発明の好適な形態として、使用される宿主細胞は大腸菌、たとえばBL21(DE3)および酵母、ならびにCHO細胞である。
また、本発明は、本発明の融合タンパク質の使用を提供するが、たとえば免疫診断とワクチンの製造に使用される。
免疫診断は、皮膚試験およびT細胞酵素結合イムノスポットを含む。皮膚試験は被験個体に本発明の多抗原融合タンパク質で免疫させた後、当該個体の皮膚反応を観察することによって、当該個体が類似の抗原に感染したことがあるか判断する。本発明の好適な形態として、前記の免疫診断は本発明の融合タンパク質を刺激源として個体のT細胞免疫反応を検出することである。たとえば、個体のT細胞が本発明のESAT6-CFP10多抗原融合タンパク質による刺激を受けた後のインターフェロン-γの生成状況を観察することによって、患者が結核に感染したことがあるか、またはどの段階にあるか判断するか、あるいは予後に使用することができる。
ワクチンは予防性ワクチンと治療性ワクチンを含む。後者は主にT細胞、特にCD8+傷害性T細胞(CTL)の活性化と関連する。そして、CTL細胞の活性化はMHC-I分子によって制限される。本発明の一つの好適な例として、体外において、本発明のHPV16-E7多抗原融合タンパク質はヒト抗原提示細胞によって呑み込まれ、かつ抗原提示細胞を活性化させることができることが証明された。また、もう一つの好適な例において、本発明のOVA多抗原融合タンパク質をモデルとし、それが抗原提示細胞によって加工されてMHCクラスI分子に提示されることが証明された。
本発明の融合タンパク質は抗原提示細胞自身のエンドソームおよびリソソームにおけるカテプシン(Cathepsin)認識配列を利用し、CD4+およびCD8+エピトープを含有する複数の抗原エピトープペプチドを連結して一つのタンパク質にし、発現・精製を経た後、直接免疫診断に、または予防・治療性ワクチンとして応用することができる。
本発明のタンパク質または組成物を予防・治療性ワクチンとする場合、直接単独であるいはアジュバントとともに動物体内に注射するか、体外で細胞治療方法と併用することができる。たとえば、DC/NK細胞の培養時に入れて刺激して特異性抗原提示細胞を生成させた後、前記抗原提示細胞で体内/体外で刺激して特異性CD8+T細胞(すなわちCTL)を生成させる。
本発明において、これらの体外感作の特異性抗原提示細胞および/または体外で生成するCTL抗原は相応する対象の体内に戻し、抗ウイルス、抗腫瘍などの様々な用途に使用する。
本発明において、本発明のタンパク質または前記体外感作の細胞(または相応する製剤)は、好ましくは静脈注射、灌注、皮下注射、経皮投与からなる群から選ばれる施用の様態で個体に投与される。
(1) 初めて、本発明の人工多抗原融合タンパク質は有効にMHC-I分子に提示されることを見出した。
(2) 初めて、単一の多抗原融合タンパク質は複数の抗原短鎖ペプチドの代わりに、特異的にヒトT細胞を刺激してインターフェロン-γを放出させることができることを見出した。
(3) 初めて、本発明の抗原融合タンパク質は抗原提示細胞によって呑み込まれ、かつCD8+細胞を活性化させることができることを証明した。
(4) 本発明の融合タンパク質を利用すれば、免疫診断のための試薬と技術を開発することができる。たとえば、皮膚試験によって特異性細胞免疫を検出するか、またはELISPOT試験によって特異性細胞免疫を検出する。
(5) 本発明の融合タンパク質を利用すれば、治療性または予防性の薬物またはワクチンを開発することができ、本発明の融合タンパク質で感作させて製造するDC細胞および/またはCTL細胞製剤を含み、産業応用価値は計り知れない。
(6) 通常の1組の短鎖断片のポリペプチドを使用する案と比べ、本発明の方法および製品のコストが顕著に低下し、通常、少なくとも80%またはそれ以上低下し、かつ品質管理が容易で、大量の労力、物資および時間を省くことができる。
多抗原融合タンパク質のクローニング
タンパク質のアミノ酸の順番に基づいて抗原融合タンパク質を設計した。抗原融合タンパク質は一連の長さが25〜35個のアミノ酸のポリペプチド断片(短鎖断片の抗原ペプチド)が連結してなり、抗原ペプチドの間は同じカテプシンSが好む配列部位(Leu-Arg-Met-Lys)で連結している。
抗原融合タンパク質をコードするDNAをコドン最適化して適切な大腸菌が好むコドンにした。全人工合成の方法でDNAコード配列を製造し、かつ5'末端にTACTTCCAATCCATG(配列番号: 7)を、そして3'末端にTATCCACCTTTACTGTTA(配列番号: 8)配列を付加した。合成されたDNA分子をT4 DNAポリメラーゼおよびdCTPで30分間処理した。
結果は図2、図3および図4に示すように、得られた融合タンパク質のコード配列およびタンパク質の分子量の大きさは設計または予測値と一致したことが示された。
各多抗原融合タンパク質のアミノ酸およびヌクレオチドのコードは以下の通りである。
MAEMKTDAAT LAQEAGNFER ISGDLKTQID QVESTLRMKT QIDQVESTAG SLQGQWRGAA 60
GTAAQAAVVR FQELRMKAQA AVVRFQEAAN KQKQELDEIS TNIRQAGVQY SRLRMKIRQA 120
GVQYSRADEE QQQALSSQMG FLRMKMTEQQ WNFAGIEAAA SAIQGNVTSI HSLLDEGKQS 180
LRMKHSLLDE GKQSLTKLAA AWGGSGSEAY QGVQQKWDAL RMKYQGVQQK WDATATELNN 240
ALQNLARTIS EAGQAMASLR MKISEAGQAM ASTEGNVTGM FA 282
caaatcgatc aagtggaaag taccgcaggt agcctgcagg gtcagtggcg tggtgcagca 180
ggcaccgcag cacaggcagc agttgttcgt tttcaagaac tgcgcatgaa agcccaggca 240
gccgtggtgc gcttccaaga agccgcaaat aaacagaaac aagagctgga tgaaatcagc 300
accaatattc gtcaggcagg cgttcagtat agccgtttac ggatgaaaat tcgtcaagcc 360
ggtgtgcagt attcacgtgc agatgaagaa cagcagcaag cactgagcag ccagatgggt 420
tttttaagaa tgaaaatgac cgagcagcag tggaattttg caggtattga agcagccgca 480
agcgcaattc agggtaatgt taccagcatt catagcctgc tggacgaagg taaacagagc 540
ctgcggatga agcatagtct gttagatgaa ggcaaacagt cactgaccaa actggcagca 600
gcatggggtg gtagcggtag cgaagcatat cagggtgttc agcagaaatg ggatgcatta 660
cgtatgaagt atcagggcgt gcaacaaaag tgggacgcaa ccgcaaccga actgaataat 720
gcactgcaga atctggcacg taccattagt gaagccggtc aggcaatggc cagcttacgc 780
atgaagattt ctgaagcagg ccaagctatg gcaagcaccg aaggcaatgt gaccggtatg 840
tttgcataa 849
MLVLLPDEVS GLEQLESIIN FEKLTEWTSS LRMKLESIIN FEKLTEWTSS NVMEERKIKV 60
YLPRMKMEEK YNLTSVLMAM GITDVFSSSA NLSGISSAES LKISQAVHAA HAEINEAGRL 120
RMKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGSAEAGV DA 152
atgctggttc tgctgccgga tgaagttagc ggtctggaac agctggaaag cattatcaat 60
tttgaaaaac tgaccgaatg gaccagcagc ctgcgtatga aactggaatc catcattaac 120
ttcgagaaac tgacagagtg gacaagcagc aatgttatgg aagaacgtaa aatcaaagtg 180
tacctgcctc gcatgaaaat ggaagagaaa tataacctga ccagcgttct gatggcaatg 240
ggtattaccg atgtttttag cagcagcgca aatctgagcg gtattagcag cgcagaaagc 300
ctgaaaatta gccaggcagt tcatgcagca catgccgaaa ttaatgaagc aggtcgtctg 360
cggatgaaaa tttcacaggc cgtgcatgct gcccatgcag aaatcaacga agctggccgt 420
gaagttgttg gtagtgccga agccggtgtt gatgcataa 459
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYCYEQLND SSEEELRMKE QLNDSSEEED EIDGPAGQAE 60
PDRAHYNIVT FCCKLRMKHY NIVTFCCKCD STLRLCVQST HVDIRTLEDL LMGLRMKIRT 120
LEDLLMGTLG IVCPICSQKP 140
atgcatggtg ataccccgac cctgcatgaa tatatgctgg atctgcaacc ggaaaccacc 60
gatctgtatt gttatgagca gctgaatgat agcagcgaag aggaattacg catgaaggaa 120
cagctgaacg attcaagcga agaagaggac gaaattgacg gtccggcagg tcaggcagaa 180
ccggatcgtg cacattacaa cattgttacc ttttgttgca aactgagaat gaaacactac 240
aatatcgtga ccttctgctg taaatgtgat agcaccctgc gtctgtgtgt tcagagcacc 300
catgttgata ttcgtacatt agaggacctg ctgatgggcc tgcggatgaa aattcgtacc 360
ctggaagacc tgttaatggg caccctgggt attgtttgtc cgatttgtag ccagaaaccg 420
taa 423
抗原融合タンパク質の発現
測定によって人工多抗原融合タンパク質コード配列を含有すると確認された陽性集落のプラスミドDNAを抽出し、通常の方法で大腸菌BL21(DE3)を形質転換させた。
形質転換された単一集落を低塩LB培養液に接種して37℃で一晩培養し、低塩LB培養液に1:100で培養物を希釈してOD600 = 1.0になるまで37℃で振とう培養した後、18℃に下げて0.2mMのIPTGを入れてタンパク質の誘導発現を行い、続いて18℃で16時間振とう培養した後、4000rpmで遠心、菌体を収集し、かつリン酸緩衝液に再懸濁させた。
抗原融合タンパク質の精製
(a)ESAT6-CFP10およびOVA抗原融合タンパク質の精製
超音波法で細胞を分解させ、遠心して封入体を収集した。封入体を変性緩衝液(pH7.4のHEPES緩衝液において8M尿素)で溶解させた後、Ni-NTAカラムを通させ、ヒスチジン標識を含有する抗原融合タンパク質がカラムに結合し、十分な洗浄で不純物のタンパク質を除去した後、抗原融合タンパク質は尿素を含有する溶離緩衝液で溶離させた。溶離された抗原融合タンパク質はまず0.5Mアルギニンを含有するPBS(pH9.5)で8倍希釈し、その後、PBSを透析して尿素を十分に除去した(図2右と図3右)。
(b)HPV16-E7 抗原融合タンパク質の精製
超音波法で細胞を分解させ、遠心して目標タンパク質を含む上清を収集し、Ni-NTAカラムを通させ、ヒスチジン標識を含有する抗原融合タンパク質がカラムに結合し、十分な洗浄で不純物のタンパク質を除去した後、HPV16-E7抗原融合タンパク質はイミダゾールを含有する溶離緩衝液で溶離させた(図4右)。
抗原提示細胞の抗原融合タンパク質に対する摂取
献血ボランティア由来の血液からFicollでヒト末梢血リンパ球PBMCを単離した後、洗浄して細胞培養液で細胞濃度を2 ×106/mlにし、5mlの細胞懸濁液を取って細胞培養瓶に置き、HPV16-E7抗原融合タンパク質(50μg/ml)あるいは同時にFITC-HPV16-E7(5μg/ml)を入れ、37℃、5%CO2で24時間培養した後続いて12時間培養した。細胞を抗ヒトCD54抗体で4℃で30分間染色した後フローサイトメーターで分析した。13時間処理した細胞をEDTA処理を経て得、1mlの冷たいFACS緩衝液(PBSにおいて2% FCS)で2回洗浄した。その後、濃度が0.6μg/mlになるようにPEで標識されたモノクローナル抗体25.D-16を入れた。4℃で30分間インキュベートし、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、最後に細胞を0.2mlのFACS固定緩衝液(BD)に再懸濁させてフローサイトメーターで分析した。
結果から、多抗原融合タンパク質を呑み込んだ主な細胞はCD54陽性細胞であったことが示された(図5)。
抗原融合タンパク質による患者のインターフェロンγ分泌T細胞の検出
本実施例において、インターフェロンγ放出の検出によって、TB-抗原融合タンパク質のCD8+T細胞に対する刺激能力をテストした。方法は以下の通りである。
結核菌の喀痰塗抹陽性患者の末梢血の単核細胞を単離した後、細胞濃度を5×106個活細胞/mlに調整した。それぞれ50ulの上記細胞懸濁液を取って陰性ウェル、陽性ウェル(CONAを刺激源とする)、検出ウェル(TB-抗原融合タンパク質を刺激源とする)およびコントロールウェル(市販の牛津免疫技術公司のT-SPOT.TBキットにおける抗原T-spot AおよびT-spot Bを刺激源とするか、あるいは成熟したCFP10-ESAT6融合天然タンパク質(TB-ESAT6-CFP10と記する)をコントロール刺激源とする)に入れた。
37℃、5% CO2で16〜20時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、さらに50 μlの標識抗体使用液を入れ、2〜8℃で60分間インキュベートした後、プレートを洗浄し、50 μlのBCIP INBT基質溶液を入れ、室温で光を避けてインキュベートし、乾燥し、計数した。結果の判断は、T-SPOT.TBキットの説明書に従って行われた。ブランクコントロールウェルのスポットが0〜5個の場合、(抗原を入れたウェルにおけるスポット数-ブランクコントロールウェルにおけるスポット数)≧ 6で、あるいはブランクコントロールウェルのスポットが6〜10個の場合、抗原を入れたウェルにおけるスポット数≧ブランクコントロールウェルにおけるスポット数の2倍である。
また、特異性抗CD4の磁気ビーズで患者のCD4+T細胞を除去した後、残ったT細胞は主にCD8+T細胞になり、これに基づいて多抗原融合タンパク質とCFP10成熟タンパク質の違いを比較した。
結果から、本発明のTB-抗原融合タンパク質はCD8+T細胞に対して顕著な刺激効果があったに対し、野生型配列のESAT6-CFP10成熟タンパク質はCD8+T細胞に対して顕著な刺激効果はほとんどなかったことが示された(図6、下)。
抗原融合タンパク質負荷DCによる体外における特異性CD8+T細胞の誘導
以下のように抗原負荷DC細胞を製造した。単離された末梢血単核細胞(PBMC)に対し、一部を凍結して保存し、残りの細胞を細胞濃度が1×107個細胞/mLになるように調整し、通常のAIM-V培地で2時間培養した後、懸濁細胞を除去し(別途に凍結保存)、GM-CSF (1000IU/ml)、IL-4 (50IU/ml)を含有するAIM-V培地を入れて続いて37℃、5% CO2で培養し、3日目にHPV16-E7抗原融合タンパク質(50μg/ml)または組み換えHPV16-E7タンパク質(50μg/ml)を入れた。
以下のように抗原負荷DCによって体外においてCD8+T細胞を感作させた。5日目に付着DC細胞を収集し、同時に凍結保存したPBMCを蘇生させ、そのうちのCD8陽性細胞をCD8磁気ビーズで分離し、かつCD8陰性細胞を凍結保存した。CD8陽性細胞:DC細胞を5:1の比率で共培養し、かつIL-2 100IU/ml、IL-7 25IU/mlを追加した。また、2日おきに1回IL-2 (100IU/ml)およびIL-7(25IU/ml)を追加したか、あるいは液の半分を入れ替えた。7日目に凍結保存したCD8陰性細胞を蘇生させ、マイトマイシンで処理した後1/10のCD8+T細胞数でCD8陰性細胞を入れて二次刺激を行い、相応するタンパク質50μg/mlを追加し、IL-2 100IU/ml、IL-7 25IU/mlを追加した。2日おきにIL-2 100IU/mlおよびIL-7 25IU/mlを追加した。
以下のようにインターフェロンγ放出の検出によって多抗原融合タンパク質負荷DCで体外で特異性CD8+T細胞を誘導する効果を評価した。96ウェルプレートにおいて、CD19陽性細胞5×104个/50μlを入れ、同時に50μg/mlまで相応するタンパク質(HPV16-E7抗原融合タンパク質(配列番号:5)または通常の組み換えHPV16-E7タンパク質)を入れ、37℃、5%CO2で続いて2hインキュベートした。遠心して上清を除去した後、新鮮な培地50μlを入れて細胞を再懸濁させ、かつCD8陽性細胞5x104个/50μlを入れ、37℃、5%CO2で18hインキュベートした。ELISAによって上清におけるIFN-γの濃度を検出した。
結核病皮膚感作性試験
体重が250gくらいのモルモットに対し、PPD 0.1 mlで皮内注射し、皮膚試験の反応を24時間観察した。皮膚試験の反応が陰性のモルモットをランダムに5群に分け、後肢鼠径部において、40mg/mlのマイコバクテリウム・ツベルクローシスH37Rv懸濁液0.2mlを皮下注射し、週に1回、計5回免疫させた。5回目の免疫から1週間後、モルモットをランダムに5群に分け、モルモットの背部の毛を抜き、ホイール法によって陽性コントロール(PPD)、陰性コントロール(結核と無関係の組み換えタンパク質)、組み換えESAT6/CFP10タンパク質および組み換えESAT6-CFP10-抗原融合タンパク質の混合液(1mg/ml、0.1mg/ml)を0.1mlずつ皮内注射し、注射後24時間の時点でモルモットの背部の各注射点の皮膚の腫れの縦、横の直径の大きさ(mm)を測定し、その平均値を記録した。
24時間皮膚反応の結果は図7に示すように、TB-抗原融合タンパク質群(配列番号:1)の平均皮膚硬結直径はPPDおよびESAT6-CFP10天然タンパク質よりも大きかった。コントロール群では、モルモットの局部の皮膚に腫れ、硬結反応がなかった。これは、TB-抗原融合タンパク質は皮膚試験に使用して有効に結核の感染を検出することができることを示す。
図では、E6-C10はESAT6-CFP10-天然タンパク質を、LRMKはTB-抗原融合タンパク質を表し、ここで、各抗原領域の間はカテプシンSの酵素切断部位で連結し、配列は配列番号:1で表され、TEVは配列番号:1におけるすべてのカテプシンSの酵素切断部位の代わりにTEV酵素切断部位(非カテプシンの酵素切断部位)を使用したコントロールタンパク質を表す)。
抗原提示細胞の抗原融合タンパク質および普通の抗原に対する処理と提示機序
抗原提示細胞が摂取して抗原融合タンパク質によって活性化された後、有効にT細胞エピトープをMHC-I分子に提示することができることを確認するためである。(MHC-I分子に提示しなければ、CD8+T細胞を活性化し、細胞傷害反応が生じ、細菌/ウイルスに感染した細胞または癌細胞を殺傷することはない)。本実施例において、オボアルブミン(OVA)の242〜352番目のアミノ酸配列(当該配列はMHC-IエピトープSIINFKLを含む)に合わせてOVA抗原融合タンパク質を設計・発現・精製した。同時に、当該エピトープを含有するOVAタンパク質断片255-340をコントロールとした。マウス樹状細胞系(DC2.4)を抗原提示細胞としてOVA抗原融合タンパク質におけるSIINFEKLの提示の状況を研究した。最後に、T細胞受容体様抗体(SIINFEKL/MHC-I複合体を認識する)で検出した。
OVAタンパク質断片100μg/ml(またはOVA抗原融合タンパク質(配列番号:3) 30 μg/ml)をDC2.4細胞と混合し、10%熱不活性化牛胎児血清(sigma)、2mMのL-グルタミンを含むRPMI 1640(Sigma)で13時間培養した後、PEで標識された市販の25.D1-16抗体で染色した(当該モノクローナル抗体25.D1-16はSIINFEKLが結合したMHC-I分子を特異的に認識する)。1mlの冷たいFACS緩衝液(PBSにおいて2% FCS)で2回洗浄した。その後、濃度が0.6μg/mlになるようにPEで標識されたモノクローナル抗体25.D1-16を入れた。4℃で30分間インキュベートし、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、最後に細胞を0.2mlのFACS固定緩衝液(BD)に再懸濁させてフローサイトメーターで分析した。
陽性コントロールとして、オクタペプチド(SIINFEKL)は直接細胞の表面のMHC-I分子と結合することができるため、80%以上の細胞染色は陽性であった(図8におけるC1とC2)。
OVA天然タンパク質におけるSIINFEKLペプチドはDC細胞によって加工されてMHC-I分子に提示されることができなかった(図8におけるA1とA2)。(注:図8A2における青のピークと赤のピークはほとんど重なった。)
意外なことに、同じ大分子量のタンパク質ではあるが、OVA-抗原融合タンパク質(配列番号:3)におけるSIINFIKLペプチドは有効にマウス樹状細胞系DC2.4によって加工されて細胞の表面に提示されることで、約17.6%と高い比率の細胞は25.D1-16抗体染色が陽性であった(図8におけるB1とB2)。
抗原融合タンパク質で免疫されたC57/BL6マウスのSurvivinまたはHPV-E7過剰発現のマウス黒色腫細胞B16に対する抗腫瘍作用。
抗原溶液2mg/ml(コントロール群:組み換えHPV-E7タンパク質、組み換えSurvivinタンパク質、実験群:HPV-E7抗原融合タンパク質(配列番号:5)、Survivin抗原融合タンパク質)と1mg/ml MPLを等体積で混合して免疫懸濁液を調製した後、それぞれ10匹のランダムに分けた週齡が7〜8週で、体重が25グラムのC57/B6雌マウスに、0日目、21日目および42日目で頸部で免疫懸濁液100μlを皮下注射した。
各免疫させたマウスに対し、注射器(BD)でマウスの右側の側腹部に100μlの均一に混合したヒトHPV-E7またはSurvivinをトランスフェクトして安定したマウスB16細胞を皮下接種し、注射の細胞量は7×105個細胞で、そして統計を開始し、マウスの生存状況を評価した。結果を図9および図10に示す。
組み換えSurvivinタンパク質と比べ、本発明のSurvivin抗原融合タンパク質は顕著にマウスの生存率を向上させ(図10)、25日目でも70%のマウスが生存していたが、組み換えタンパク質コントロール群では40%しか生存していなかった。
本発明の前に、臨床ではタンパク質抗原をCD8+細胞免疫を刺激するワクチンとして使用することに成功したことはなかった。
タンパク質系ワクチンの生産および品質管理はいずれも既に成熟の技術でかつ多くの臨床用薬およびワクチン(刺激抗体)はいずれもタンパク質である。タンパク質を生産する成熟の方法によって、CD8+T細胞免疫を刺激できるワクチンの生産することができれば、非常に理想的である。しかし、どのようにタンパク質抗原の提示をエンドソーム-リソソーム-MHC-II経路から細胞質-MHC-I経路に転換させるかは、非常に挑戦的な課題である。たくさんの免疫学者およびワクチン学者は試みているが、未だに突破がない。
1.リソソームに多くの酵素が含まれ、これらの機能は一般的にはタンパク質を完全に分解することで、タンパク質をポリペプチドではなく、アミノ酸に分解し、通常の組み換えタンパク質抗原は完全に分解されてT細胞を刺激することができない。
2.リソソーム膜の作用はリソソーム内における酸性物質を細胞質と隔離することであるため、リソソームは漏れにくい細胞内小器官である。通常の発現タンパク質または組み換えタンパク質は完全に分解されなくても、リソソームから逃げるかまたは漏れることが可能であるかは未知である。
3.CD4+T細胞を刺激できるタンパク質抗原に対し、CD8+抗原を添加した融合タンパク質が分解されて細胞質に漏れる(CD8+T細胞を刺激する)と、元のCD4+T細胞を刺激する機能が低下または消失するかも、未知である。
本発明の実験では、意外に、本発明のこの特定の構造の融合タンパク質が分解された後、分解後のポリペプチドがリソソームから漏れて細胞質に入り、加工されてMHCクラスI分子に提示されることによって、MHC-I抗原提示経路が始まってCD8+細胞を刺激し、かつ元のCD4+T細胞を刺激する機能が保留または向上することが実証された。
Claims (13)
- 複数の抗原断片および抗原断片のあいだに位置される切断部位の配列を含み、
切断部位の配列が、Leu-Arg-Met-Lys、カセプシンSの切断部位であり、および
抗原断片が、少なくとも1つのCD8+T細胞のエピトープおよび少なくとも1つのCD4+T細胞エピトープを含む、
人工多抗原融合タンパク質。 - 前記人工多抗原融合タンパク質は、≧3個の抗原領域を含有することを特徴とする請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質。
- 前記人工多抗原融合タンパク質は、≧5個の抗原領域を含有することを特徴とする請求項2に記載の人工多抗原融合タンパク質。
- 前記人工多抗原融合タンパク質は、≧10個の抗原領域を含有することを特徴とする請求項3に記載の人工多抗原融合タンパク質。
- 前記の各抗原領域はウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、クラミジア抗原、腫瘍抗原、またはこれらの組み合わせ由来のものであることを特徴とする請求項2〜4のいずれか一項に記載の人工多抗原融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は式Iの構造を有することを特徴とする請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質。
Y-(A-C)n-Z (I)
(式中において、Aは抗原領域である。
Cは、カテプシンSの酵素切断部位配列、Leu-Arg-Met-Lys、である。
nは≧3の正整数である。
Yはないか「Y0-B」で表される配列であるが、ここで、Y0はシグナルペプチド配列、タグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせで、Bはないか切断部位配列である。
Zはないか、あるいはタグ配列、膜透過エレメント配列、アジュバントエレメント配列、細胞壊死因子エレメント配列、または上記配列の任意の組み合わせである。
付加条件は、Zがない場合、最後の一つの「A-C」におけるCはなくてもよい。) - 請求項1〜6のいずれかに記載の人工多抗原融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする組成物。
- 請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質の使用であって、予防性および/または治療性のワクチン組成物または薬物組成物の製造に使用されることを特徴とする使用。
- 予防性および/または治療性のワクチン組成物がまたアジュバントを含む、請求項8に記載の使用。
- 予防性および/または治療性のワクチンが、in vitroにおいて、細胞治療とともに使用される、請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質の使用。
- 請求項1に記載の人工多抗原融合タンパク質の使用であって、特異性T細胞免疫を検出する試薬またはキットの製造に使用されることを特徴とする使用。
- 人工多抗原融合タンパク質が、皮膚試験およびT細胞酵素結合イムノスポットのために使用される、請求項11に記載の使用。
- 人工多抗原融合タンパク質が、結核による感染、感染の段階または予後を決定するために使用される、請求項11または12に記載の使用。
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