CN102343103B - 人乳头状瘤病毒16型三肽疫苗的筛选和验证及持续表达hpv16 e5, e6, e7的肿瘤动物模型的构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人乳头瘤病毒(HPV)16“三肽”联合CpG佐剂疫苗的筛选和验证，以及一种持续表达HPV16E5，E6，E7的肿瘤动物模型的构建方案。采用针对抗原加工相关转运子(TAP)分析多肽片段的方法结合生物信息学，筛选出评分较高的多肽片段，结合体内、外试验得到免疫效果最强的三个片段组成三肽疫苗核心，再结合CPG佐剂，构建出兼具预防、治疗双重作用的HPV16疫苗。同时，构建了一种持续表达HPV16E5，E6，E7的肿瘤动物模型：其技术特征在于：通过腺相关病毒表达系统将HPV16E5稳定的整合到TC-1细胞中，将改造后的TC-1细胞注入C57BL/6小鼠体内，可以成功成瘤。

Description

人乳头状瘤病毒16型三肽疫苗的筛选和验证及持续表达HPV16 E5, E6, E7的肿瘤动物模型的构建

一、技术领域

本发明涉及人乳头状瘤病毒(Humanpappilomavirus，HPV)16型三肽疫苗的筛选和验证及持续表达HPV16E5，E6，E7的肿瘤动物模型的构建。其技术特征在于：针对抗原加工相关转运子(transporterassociatedwithantigenprocessing，TAP)设计HPV16E5，E6，E7蛋白的主要组织相容性复合物Ⅰ(MHC-Ⅰ)抗原结合表位，利用生物信息学分析平台筛选出一致性较高、特异性及亲和力较强的HPV16E5，E6，E7三肽作为研究对象制备HPV16多肽疫苗，从而获取对HPV16阳性肿瘤兼具预防和治疗双重作用的疫苗；同时，通过腺相关病毒表达系统将HPV16E5稳定的整合到TC-1细胞中，再将改造后的TC-1细胞注入C57BL/6小鼠体内，可以成功成瘤，为研究HPV16相关的疾病制造了有效而又特异的动物模型。发明内容属于肿瘤免疫治疗领域。

二、背景技术

宫颈癌高居全球妇女癌症死亡率中的第二位，在一些发展中国家由于缺乏合适的筛查方法，甚至居于首位，严重威胁妇女的健康和生命。WHO资料显示，全球每年宫颈癌的新发病例约为50万例，其中80％以上发生在发展中国家。我国是宫颈癌的高发国家之一，每年发病率为14.6/10万，新增病例约15万，占全世界新发病例数的1/3。近年，宫颈癌发病率逐年上升并趋于年轻化。

然而目前常规的肿瘤治疗手段尚无法从根本上清除恶性肿瘤，肿瘤的彻底根治需要不断的革新。这种需要在宫颈癌的治疗中尤其明显，早期宫颈癌的治疗主要为根治性全子宫切除或术前辅以新辅助化疗，晚期宫颈癌则主要为放射治疗，这两种方法都不可避免地部分或完全破坏了女性生殖道，无法生育、性生活丧失或不满意成为不可忽视的后遗症，宫颈癌发病年轻化的特点使得这种矛盾在近年显得十分突出。对新型治疗手段的需求迫使人们不得不从分子水平寻找靶点。

随着肿瘤发病内在分子机制逐渐明了，肿瘤分子医学理论和方法学的突破引发了一系列发展新型肿瘤治疗模式的尝试，大量分子靶点特异性抗癌化合物进入临床试用，标志着肿瘤治疗的突破到了一个关键的转折点，并已获得阶段性成果，初步凸显出未来肿瘤问题解决的基本轮廓，其最为核心的解决方法之一就是要从肿瘤繁复的基因调控网络中分解出最为关键的分子靶标，实施分子靶向治疗。截止至2001年底，获美国FDA批准进入临床实验阶段的分子治疗品种已超过三千种，包括细胞传导阻断剂、血管生成抑制剂、肿瘤疫苗和单克隆抗体，为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望。可以说，未来人类肿瘤的有效控制在根本上依赖分子治疗的发展完善。2008年美国FDA批准宫颈癌疫苗“加德西”在美国上市，是人类研制成功的第一种宫颈癌疫苗，是一种主要针对6型、11型、16型和18型HPV的多价预防性预苗。但该疫苗有以下的不足之处：①预防作用较好但治疗作用甚微，对于已经感染HPV的患者疗效不明显；②对于那些长期持续感染HPV的患者单纯的预防性治疗无法解决其实际问题，特异性的治疗性疫苗研发迫在眉睫；③对于术后复发的宫颈疾病患者多为HPV整合感染所致，针对L1的预防性疫苗对整合后的HPV感染无能为力，一个针对HPV的兼具预防和治疗双重作用的疫苗急待研发。

宫颈癌病因学研究表明：人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌首要致癌因素和重要启动因子，几乎100％宫颈癌组织有高危型HPVDNA表达。HPV属于乳头多瘤空泡病毒科乳头瘤病毒属，是由DNA核心和蛋白衣壳组成的无包膜DNA病毒，衣壳由主要(L1)和次要(L2)衣壳蛋白组成。HPV具有明显的种属特异性，它们不能在动物体内感染，也不能作体外细胞培养。不同型别的HPV基因结构基本相似，由三个基因区组成，按其功能可分为早期区(E区)、晚期区(L区)和上游调节区(URR)。早期区含有6个开放阅读框(ORF)，其中有直接恶性潜能的E5、E6、E7基因主要与病毒细胞恶性转化功能及致癌性有关。在HPV感染之初，在疾病发生的阶段，E5通过下调凋亡相关因子P21的表达和作用于表皮生长因子受体等途径导致细胞的生长加快甚至是恶性增殖；E6不仅通过结合并降解p53从而导致细胞周期失控，而且能激活端粒酶使细胞永生化；E7则通过与控制细胞周期有关的肿瘤抑制蛋白Rb的相互作用，使细胞周期失控而发生永生化；有研究进一步揭示，在HPV感染初期E5能扩大或加强E6和E7的表达和与之相关的恶性作用，并且这种辅助作用是不可缺少的，特别在E7所调控的细胞恶性转化方面，E5扮演着重要的角色。E5、E6、E7三种癌蛋白的表达是维持肿瘤细胞处于恶性转化状态所必须的，与宫颈癌的发生及发展有极密切联系。另外，HPV16型是最常见的高危型别，我国的流行病学表明宫颈癌患者中HPV16型阳性率达到50％-87％。针对目前国外的研究，E6，E7多肽疫苗一直都是热点，但大多数的实验结果只是在一定程度上达到治疗目的，鲜有完全根治的报道。最近的研究进一步发现，除E6，E7外，HPVE5蛋白也是HPV感染之初导致宫颈癌的重要环节，因此，我们以疾病的源头为起点，同时针对E5，E6，E7三个靶点制备疫苗，阻断目前已知的HPV全部的直接导致细胞恶性转化的因素，从而希望能以此为契机彻底杜绝HPV的致病潜能。

三、发明内容

基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种针对16型HPVE5，E6，E7三个靶点制备的多肽疫苗，我们希望通过这种兼具预防和治疗功效的疫苗来有效解决目前HPV16阳性肿瘤治疗的困难与不足，同时开辟一条免疫方法治疗恶性肿瘤的康庄大道。

宫颈癌疫苗的研究最早可追溯到20世纪70年代，在90年代初蓬勃兴起。从蛋白疫苗，多肽疫苗，核酸疫苗到联合疫苗，多种形式的疫苗各具特色。与其他可能的治疗性疫苗相比，多肽疫苗安全性高，制备容易，免疫源性特异，并且毒副作用较小。同时，考虑到多肽片段短，抗原性可能稍弱，我们在实验中加用了CpG序列作为免疫增强剂。CpG序列(CpGmotifs)是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODN)，其碱基排列大多遵循以下规律：5’2PurPurCGPyrPyr23’，即5’端为2个嘌呤，3’端为2个嘧啶.研究表明，这种序列可激活多种免疫效应细胞，因此又被称为免疫刺激DNA序列(Immuno-stimulatoryDNAsequence，ISS).

本研究中采用2004年Bhasin等^[10]报道的针对抗原加工相关转运子(TAP)结合生物信息学，分析HPV16E5，E6，E7蛋白与主要组织相容性复合物Ⅰ类分子(MHC-Ⅰ)的抗原结合表位，联合二核苷酸胞嘧啶(CpG)佐剂，研制兼具预防和治疗双重作用的HPV16多肽疫苗，有望成为新一代强有力的宫颈癌靶向治疗和预防的方法。

本研究中，由于E5靶点的存在，需要稳定表达E5的成瘤细胞系来检测疫苗的针对性，同时更好的模拟天然HPV感染时的情况，我们选择了腺相关病毒表达系统将HPV16E5稳定的整合到TC-1的基因组中，从而建立符合本实验要求的动物模型。腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长以及可感染分裂期和非分裂期的宿主细胞等特点，被视为继腺病毒、逆转录病毒之后最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。AAV则因其独特的生物学性状显示出在基因治疗中的巨大潜力包括①AAV能转导分裂期细胞和非分裂期细胞；②AAV具有广泛的趋向性；③AAV能整合至宿主染色体具有建立长期表达的能力；④AAV是一种非致病性病毒；⑤AAV不会产生细胞介导的免疫反应。本研究中成功利用AAV构建了稳定表达HPV16E5的TC-1细胞，并在C57BL/6小鼠成功成瘤，为研究HPV16相关的疾病制造了很好的动物模型，为深入探讨HPV相关疾病的分子免疫学机制和治疗方法提供了有力保障。

为此，本发明提出的宫颈癌“三肽”疫苗(针对E5，E6，E7三靶点)，在国内外尚无相关报道，且在本研究中我们发现了很有效的三肽组合，可以很好的预防和治疗HPV16阳性的肿瘤，甚至可以完全的无瘤生存。同时，我们成功构建了持续表达HPV16E5，E6，E7的免疫全能动物肿瘤模型，也无同类报道，它将为研究HPV16相关肿瘤提供有效而逼真的实验平台。

本发明达到了以下效果：

1、成功构建持续表达HPV16E5，E6，E7的肿瘤动物模型：通过腺相关病毒表达系统将HPV16E5稳定的整合到TC-1细胞中，再将改造后的TC-1细胞注入C57BL/6小鼠体内，可以成功成瘤，为研究HPV16相关的疾病制造了有效而又特异的动物模型。

2、肿瘤细胞系体外实验结果表明：该“三肽”联合CpG佐剂的疫苗可诱发特异性针对HPV16阳性肿瘤细胞的免疫应答，特异性杀伤靶细胞，从而抑制HPV16型阳性的肿瘤细胞的增殖和生长，诱导其凋亡，进而预防肿瘤的发生，阻断肿瘤的发展。

3、肿瘤动物模型的体内研究证实：通过肿瘤局部注射的途径给药，该“三肽”联合CpG佐剂的疫苗对受试的肿瘤动物模型有显著的治疗和预防作用，阻遏肿瘤细胞成瘤、抑制侵袭，而且可以使已形成的肿瘤明显缩小；有效预防肿瘤的形成，甚至可以完全的无瘤生存，且对动物无明显相关毒副作用。

四、附图说明

附图1：HPV16E5多肽片段筛选。

附图2：HPV16E7多肽片段筛选。

附图3：HPV16E6多肽片段筛选。

附图4：持续表达HPV16E5、E6、E7的免疫全能动物肿瘤模型的构建及鉴定。

附图5：体内外试验对HPV16E5、E6、E7多肽片段进一步筛选与鉴定。

附图6：体内外试验观察“三肽+CPG”疫苗的免疫效应。

五、具体实施方式

例1：HPV16E5、E6、E7多肽片段的筛选

将HPV16E5、E6和E7全长序列通过国立卫生研究所生物信息及分子结构分析系统，抗原表位预测系统及TAP预测系统进行相关分析，得到相应片段我们选择评分较高，亲和力强，免疫源性及抗原性较好的靶位片段作为侯选片段进行下一步的实验室筛选。具体详见(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)[1](http://www.syfpeithi.de/)[2](http://www.imtech.res.in/cgibin/tappred/)[3]结果见图1-3

1.Parker，K.C.，M.A.Bednarek，andJ.E.Coligan.SchemeforrankingpotentialHLA-A2bindingpeptidesbasedonindependentbindingofindividualpeptideside-chains.J.Immunol.1994；152：163-175.

2.Rammensee，H.G.，J.Bachmann，N.P.N.Emmerich，etal.SYFPEITHI：databaseforMHCligandsandpeptidemotifs.Immunogenetics，1999；50：213-219.

3.Bhasin，M.andRaghava，G.P.S.AnalysisandpredictionofaffinityofTAPbindingpeptidesusingcascadeSVM.ProteinSci.，2004；13(3)，596-607

例2：构建持续表达HPV16E5，E6，E7的肿瘤动物模型

1)AAV-E5目的载体的构建

用限制性内切酶EcoRⅠ和BAMHⅠ分别酶切pEGFP-C1-HPV16E5和pAAV-MCS构建AAV-E5重组质粒。

①酶切体系

混匀，37℃，2-4h或过夜，电泳分析鉴定。

②胶纯化：(U-gene试剂盒，具体操作见第一部分2.2.23)

③连接：

混匀，4℃，过夜后，电泳分析鉴定。

④转化筛选：用连接产物转化感受态细菌DH5a。涂板(kanamycin/IPTG/X-gel)，进行蓝白斑筛选，挑选白斑。

⑤酶切鉴定：提取质粒DNA后(博大泰克的质粒小量提取试剂盒，操作严格按说明书进行)，用EcoRⅠ和BAMHⅠ双酶切鉴定N1/C1-HPV16/18E5连接是否成功。

37℃，水浴过夜。

⑥电泳鉴定：1.2％琼脂糖凝胶电泳。

⑦将酶切后正确的克隆送序(由北京奥科公司测序)

⑧对测序后正确的质粒，进行大量提取(博大泰克的质粒大量提取试剂盒，操作严格按说明书进行)，同时大量提取pAAV-RC和pHelper

2)病毒的制备-三质粒钙磷共转染法

1.在直径为15cm的细胞培养皿内将293细胞按1∶1-1∶3的比例传代。

2.待细胞至75-90％融合时进行转染，转染前3小时换培养基(PH7.20每升培养基内加3.0克Hepes)，

3.按以下方法配制钙磷混合液

1)15cm培养皿中加入质粒总量为50微克，三种质粒比例为

Phelper25微克

RC质粒6.25微克

Vector质粒18.75微克

2)将质粒加入到0.25MCaCl2中，每盘需2mlCaCl2

3)将配制的混合液置于漩涡震荡器上(转速800-1000rpm/min)，再向其中加入2*HEBS，每盘需2ml2*HEBS，震荡10-20秒，充分混匀后，每盘滴入4ml混合液。

4.过6-16小时后，换无血清DMEM培养基。

5.收集病毒，步骤见下面方案

3)病毒收集

1.转染后72小时吸弃培养基，离心800rpm*10分钟，弃上清，留沉淀。

2.PBS10ml轻轻吹打盘子里的细胞，将盘子里的细胞清洗干净，转至离心管，800rpm*10分钟离心。

3.弃上清，重复步骤2。

4.用PBS重悬细胞沉淀，800rpm*10分钟离心，留取沉淀，尽可能除尽培养基。

5.用10mMTris+15mMNaCl(PH8.0)或1*PBS溶液充分溶解细胞(1ml/15cm培养皿。若想滴度高可减少pbs体积)

6.放置于-80度，反复冻融3-4次。

7.离心1000rpm*10分钟，取上清-80度保存。

8.CsCl₂梯度离心法大量纯化提取病毒，透析去除小分子DNA纯化病毒。VLB法测定病毒吸光度(病毒颗粒)，分装病毒，于-80℃冻存。

4)病毒滴度测定：

TCID₅₀法进行MOI检测，以确定具有活性的病毒颗粒。将293细胞以2×10⁴/孔接种96孔板，待细胞达到70-80％融合时进行TCID₅₀测定。用1ml含5％胎牛血清的DMEM以倍比稀释法依次稀释病毒至10^-1-10^-10，从10^-3开始，依次将10^-3-10^-10病毒液100μl加入96孔板1-8行，第11、12列设为阴性对照，每孔设10个复孔，连续观察12-14天后根据每孔是否出现CPE效应计算TCID₅₀值以PFU/ml表示。

5).病毒转染起始MOI的确定：

对数生长期的TC-1细胞以1×10⁵/孔接种6孔板，常规培养24h至70-80％融合，以倍比稀释法分别加入含0.01、0.1、1、10、100MOI的AAV-GFP病毒液(以无血清DMEM稀释，终体积0.5ml)转染细胞，3-4h后加入1.5mlDMEM完全培养基终止转染。继续培养24h后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光强度，并经胰酶消化后上流式细胞仪分析转染效率，以转染效率达50-80％的MOI值作为病毒转染的起始MOI。

6).CPE实验：

TC-1细胞以2×10⁵/孔接种12孔板，转染不同MOI的AAV-E5，wt-AAV和AAV-GFP(转染方法同上)，显微镜下观察细胞病变，当0.1MOI的wt-AAV组出现完全CPE效应时，用PBS轻洗非贴壁细胞和细胞残渣，1％多聚甲醛固定10min，结晶紫染色，PBS洗去多余结晶紫，观察并拍照。

7).体外复制能力实验：

对数生长的TC-1细胞以3×10⁵/孔接种6孔板，转染5MOI的AAV-E5，wt-AAV和AAV-GFP(转染方法同上)，分别于转染后24、48、72、96h收集细胞和培养上清，500rpm离心10min，弃上清后加入PBS1ml，反复冻融3次，3000rpm离心10分钟后去除细胞碎片留用上清，用TCID₅₀法测定上清中病毒滴度。

8).RT-PCR检测肿瘤细胞中目的基因的表达：

对数生长的TC-1细胞以5×10⁵/孔接种60mm培养皿，常规培养24h后转染1MOI的AAV-E5，wt-AAV和AAV-GFP(方法同上)，分别在转染后12、24、48、72h收取细胞并采用Trizol^TM试剂一步法提取细胞总RNA，测定样品吸光度值。各取2μgmRNA，按照逆转录酶M-MLV说明书进行逆转录合成cDNA。取等量cDNA模板，PCR分别扩增HPV16E5基因片段并同时扩增β-actin作为内参照。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照。

9).Westernblot检测肿瘤细胞中目的基因的表达：

对数生长的TC-1细胞以5×10⁵/孔接种60mm培养皿，常规培养24h后转染2MOI的AAV-E5，wt-AAV和AAV-GFP(方法同上)，分别在转染后12、24、48、72h收取细胞并提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝G-250染料法测定蛋白质浓度。10％或12％SDS-PAGE胶电泳分离蛋白质(上样量为50μg)，转至硝酸纤维素膜，脱脂奶常温封闭2h，一抗(antiGFP1∶100)4℃孵育过夜，TBST洗膜，用相应二抗(1∶1000)37℃孵育1h，TBST洗膜，用ECL试剂盒化学发光后曝光成像，同时检测β-actin(1∶500)作为内参照。

10).C57BL/6鼠接种：

选择4-6周龄的C57BL/6鼠，各取对数生长期的rTC-1(AAV-E5感染之TC-1细胞)细胞制备单细胞悬液(1×10⁶/100μl)，于每只鼠左侧大腿根部接种200μl。观察其成瘤情况，同时用活体荧光成像仪，观察肿瘤生长情况。

实验证实我们已成功构建持续表达HPV16E5，E6，E7的肿瘤动物模型，为后续试验建立了确实有效的操作平台，见图4。

例3：利用体内外试验对HPV16E5、E6、E7多肽片段进一步筛选与鉴定。

(一)肿瘤生长情况

先将鼠随机分为9组，各取对数生长期的rTC-1细胞制备单细胞悬液(1×10⁶/100μl)，于每只鼠左侧大腿根部接种200μl，一周后于鼠左侧大腿根部给予相应的肽制剂，CpG和生理盐水共9组，其后，每周给一次相应的肽制剂，或CpG、或生理盐水。每1-2天一次，观察瘤块生成情况。有瘤体长出后，每周观察并测量肿瘤大小2-3次(垂直测量肿瘤最长径a、b)直至成瘤或治疗后3-4周，以公式1/2*a*b计算肿瘤体积。

(二)ELISA法检测免疫因子表达

A.标本的采集及保存

小鼠眼球后取血：标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

B.试剂的准备和保存

A).标准品的稀释和使用。

试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。

1.配制10,000pg/ml标准品：取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。

2.配制1000pg/ml标准品：取0.1ml10,000pg/ml的标准品加入有0.9ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。

3.配制500pg/ml→15.6pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3ml样品稀释液，分别标记上500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml。取0.3ml1000pg/ml的标准品加入标记500pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3ml，加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。

溶解后的标准品应在12小时内使用。

B)生物素标记的抗体工作液。

1.根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实际配制时应多配制0.1-0.2ml)。

2.按1μι生物素标记抗人VEGF加抗体稀释液99μι的比例配制工作液。轻轻混匀。

C).亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备：在使用前1小时内准备。

1.根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实配时应多配制0.1-0.2ml)。

2.按1μι亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99μι的比例配制工作液。轻轻混匀。

C.操作程序

所有试剂用前需在室温平衡。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次测都应该做标准曲线。如果估计样品VEGF浓度＞2000pg/ml时，应在试管中将样品用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数＝样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。

2.将1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、体液、组织匀浆或细胞培养上清，每孔先加50μι样品稀释液，再加50μι样品。

3.酶标板加上盖，37℃反应120分钟。

4.反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体(将自动洗板机的洗涤次数设为零再开始即可)；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。

5.将准备好的生物素抗人VEGF抗体工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)。37℃反应60分钟。

6.0.01MTBS或0.01MPBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。吸去或甩去多余液体。

7.将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)。37℃反应30分钟。

8.0.01MTBS或0.01MPBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。吸去或甩去多余液体。

9.按每孔0.1ml依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25分钟(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显)。

10.按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。

11.用酶标仪在450nm测定O.D.值，将TMB空白显色孔设为对照。

12.所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。

13.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。

在本阶段试验中，根据分子生物学筛选出的多肽片段再结合实验室证据，我们在候选的三段多肽中各选择了一段效应最强的片段进行下一步试验，为三肽疫苗最有效的组合奠定基础，见图5。

例4：体内外试验观察“三肽+CPG”疫苗的免疫效应。

(一)C57BL/6鼠接种：

选择4-6周龄的C57BL/6鼠，根据实验目的分为预防和治疗两大组，每个大组又分为三肽组，二肽组，单肽组，错构肽组，CpG组和生理盐水组6组

1)预防组：先于鼠左侧大腿根部给予相应的肽制剂+CpG或单纯CpG或生理盐水，按不同的配伍将鼠随机分为三肽组，二肽组，单肽组，错构肽组，CpG组和生理盐水组五组，一周后按取对数生长期的细胞制备单细胞悬液(1×10⁶/100μl)，于每只鼠左侧大腿根部接种200μl，同时再给一次相应的处理，其后，每1-2天一次，观察瘤块生成情况。在预防组中根据实验成瘤细胞的不同又分为：A.未转染组(TC-1)；B.转染a组(AAV-E5b2-TC-1)；C.转染b组(AAV-TC-1)；D.B16F1细胞(小鼠黑色素瘤细胞)组

2)治疗组：先将鼠随机分为6组，A.未转染组(TC-1)；B.转染a组(AAV-E5b2-TC-1)；C.转染b组(AAV-TC-1)；D.B16F1细胞(小鼠黑色素瘤细胞)组。各取对数生长期的细胞制备单细胞悬液(1×10⁶/100μl)，于每只鼠左侧大腿根部接种200μl，一周后于鼠左侧大腿根部给予相应的肽制剂+CpG，或单纯CpG或生理盐水，按不同的配伍将鼠随机分为三肽组，二肽组，单肽组，错构肽组，CpG组和生理盐水组六组，其后，每周给一次相应的处理，每1-2天一次，观察瘤块生成情况。有瘤体长出后，每周观察并测量肿瘤大小2-3次(垂直测量肿瘤最长径a、b)直至成瘤或治疗后3-4周，以公式1/2*a*b计算肿瘤体积。

(二)鼠脾淋巴细胞的分离培养：

1.小鼠眼球后取血后，拉颈处死小鼠，置70％酒精中浸泡5分钟消毒，然后移入超净台。

2.打开腹腔，无菌取出小鼠脾脏，放入盛有5-10mlDMEM不完全培养液的平皿中轻轻漂洗，并细心剥除脾脏周围的结缔组织。

3.将脾脏移入另一个盛有5-10mlDMEM不完全培养液的平皿中，轻轻漂洗后置于100目细胞筛用滴管拉碎，使脾细胞通过筛孔被挤压入培养液中，反复冲洗，以取得单个细胞悬液。

4.将脾细胞悬液缓缓加入到已装有淋巴细胞分离液的10ml离心管中(脾细胞悬液与淋巴细胞分离液体积比为1∶1)，然后2000rpm/min离心20分钟；

5.收集分离出的脾细胞，置于10ml的离心管内加入DMEM不完全培养液吹打。取少量用于显微镜下计数，同时1500rpm/min离心10分钟，弃上清；加入适量完全培养液(DMEM液+10％小牛血清)，将细胞重悬，调整细胞浓度为1×106/ml。

6.然后移入培养瓶，放入37℃，5％CO₂培养箱培养。

(三)淋巴细胞的肿瘤细胞毒功能检测

分别取各组的小鼠脾脏，无菌制备脾细胞悬液，低渗法除去红细胞，PBS液洗3次，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基调细胞浓度2×106/ml，以100μl/孔接种于96孔板中，作为效应细胞(effectorcells，E)，同时计数B16调整浓度分别为1×105/ml，2×105/ml，以每孔100μl接种于96孔板中，分别作靶细胞组(targetcells，T)、效靶混合组，温育28h，然后采用LDH法分别检测杀伤率。

杀伤率(％)＝(靶细胞OD值-效应细胞OD值)/靶细胞OD值×100％

(四)CFSE标记rTC-1细胞

(1)将CFSE用DMSO溶解成5mmol/L的储存液，于-20℃避光保存；

(2)收集对数生长期B16F10细胞

(3)用PBS洗涤后，再用PBS悬浮细胞，调整细胞浓度为5×106/ml；

(4)加入CFSE至终浓度为5μmol/L，置37℃培养箱，温育10min；

(5)取出B16F10细胞，迅速加入等体积小牛血清中和；

(6)将细胞置离心机离心，1000rpm，3min，收集细胞；

(7)加入无血清DMEM，洗涤一次；

(8)将细胞置离心机离心，1000rpm，3min，收集细胞；

(9)再用PBS洗涤细胞2次，用PBS悬浮细胞

(五)ELISPOT法检测细胞因子分泌情况

1.按1∶200比例稀释，将包被抗体加入到4℃储存的1×PBS中，在ELISPOT平板每孔中加入100μl稀释后的包被抗体；

2.置于4℃冰箱封闭过夜(16小时)；

3.弃去包被抗体稀释液。每孔加入200μl含10％牛血清的RPMI1640培养基清洗，放置2分钟；

4.每孔加入200μl的含10％牛血清的RPMI1640培养基，室温放置2小时；

5.弃去每孔中的200μl的含10％牛血清的RPMI1640培养基；

a)阴性孔：在11列中加入20μl含10％牛血清的RPMI1640培养基；

b)阳性孔：在12列中加入5μl的10μg/ml的PMA和2μl的1mg/ml的Ionomycin；

c)实验孔：实验孔每孔加入8μl的100μg/ml的多肽；

6.每孔加入180μl的1.5×10⁶/ml小鼠脾细胞悬液；

7.37℃5％CO₂孵育24小时；

8.吸弃细胞。每孔中加入200μl去离子水，室温放置5分钟，再次加入200μl去离子水，室温放置5分钟；

9.每孔用200μl1×PBST清洗3次，每次室温放置2分钟，弃去PBST；

10.按1∶250比例稀释，将检测抗体加入到含10％血清的1×PBS中，ELISPOT平板每孔加入100μl稀释后的检测抗体；

11.室温放置2小时；

12.弃去检测抗体稀释液。每孔用200μl1×PBST清洗，共3次，每次室温放置2分钟；

13.按1∶100比例稀释，将亲和素-HRP加入到含10％血清的1×PBS中，ELISPOT平板每孔加入100ul酶联稀释液；

14.室温放置1小时；

15.弃去酶联稀释液。每孔用200μl的1×PBST清洗4次，每次放置2分钟；

16.每孔用200μl的1×PBS清洗2次，每次放置2分钟；

17.每孔加入AEC显色液100μl，室温避光放置10～30分钟，其间观察是否形成斑点；

18.斑点形成后，用去离子水冲洗终止酶联反应；

19.取下垫盘，室温干燥过夜；

20.使用CTLELISPOT读数仪，读取分析数据，ELISPOT平板放入自封袋室温保存。

本阶段的试验证实了“三肽+CPG”疫苗有很好的体内预防和治疗效应，可以特异性的刺激相应免疫分子表达，引发有效地免疫反应，抑制或治疗肿瘤的发生发展，见图6.

Claims (3)

1.一种HPV16三肽联合CpG佐剂的疫苗的制备方法，其特征在于：先针对抗原加工相关转运子设计HPV16E5,E6,E7蛋白的主要组织相容性复合物Ⅰ抗原结合表位，利用生物信息学分析平台筛选出HPV16E5,E6,E7三肽，再结合动物体内外试验，得到免疫效果最强的三个片段：E5PmdLSVSTYTSL，E6PmdNKPLCDLLI，E7PmdRAHYNIVTF；利用所述的HPV16E5,E6,E7三肽，联合CpG佐剂，制备HPV16三肽疫苗。

2.使用权利要求1所述的方法筛选得到的HPV16E5,E6,E7三肽片段，其特征在于，所述的三肽片段为E5PmdLSVSTYTSL，E6PmdNKPLCDLLI，E7PmdRAHYNIVTF。

3.使用权利要求1所述的方法制备得到的HPV16三肽联合CpG佐剂的疫苗。