CN109134613B

CN109134613B - 一种促进疫苗免疫反应的法氏囊七肽及其应用

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Publication number: CN109134613B
Application number: CN201710665550.9A
Authority: CN
Inventors: 冯秀丽; 宗嫚嫚; 余远楠; 郑阳; 曹瑞兵; 陈溥言
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2019-11-01
Anticipated expiration: 2037-08-07
Also published as: CN109134613A

Abstract

本发明涉及一种促进疫苗免疫反应的法氏囊七肽的分离鉴定及其应用。本发明所述的免疫活性肽是一种来源于法氏囊的小分子多肽，氨基酸组成为Gly Gly Cys Asp Gly Ala Ala，结构简单，免疫原性极弱。本发明活性肽具有促进疫苗免疫反应的功能，对小鼠和鸡具有刺激抗体产生、细胞免疫反应、淋巴细胞活力增强和提高疫苗免疫效力作用。本发明可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。

Description

一种促进疫苗免疫反应的法氏囊七肽及其应用

技术领域

本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种具有促进疫苗免疫反应的法氏囊活性七肽及其应用。

背景技术

禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种急性、败血性传染病，几乎所有野生及家养禽类均可感染。H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)自上个世纪90年代以来已经广泛在我国和世界各地流行。H9N2禽流感病毒不但可以感染禽类，而且已逐渐具有感染哺乳动物包括人的能力，不仅仅给养禽业造成了巨大的经济损失，而且给公共卫生安全造成的隐患不可估量，对人类的健康也构成了巨大的威胁。令人关注的是2013年中国暴发的H7N9禽流感，其能感染人并导致人类死亡。通过对其各个片段的基因分析发现，发现其内部基因与H9N2高度同源，也证实了该病毒已经发生了重组。这些大量报道禽流感病毒跨越种间障碍直接传播给了人类的事件，已经越来越多的引起了社会的关注，而其对应的公共卫生意义也日益突显。

在我国，独特的地理环境及养殖模式为此病的发生、传播提供了有利条件。而免疫压力及活禽市场的存在又为H9N2亚型禽流感病毒的重组和变异提供了必要条件。疫苗免疫不仅是当前畜禽传染病防制的主要措施，而且也是我国动物疫病防控规划的重要举措。临床上使用的大多数疫苗配合佐剂才能发挥良好的功效。因此，安全、无残留、有效的新型免疫增强剂研究及技术创新已成为养禽业发展防控规划的重要举措。

发明内容

本发明的目的在于提供一种价格低、安全、无残留的高效促进疫苗免疫效果的新型活性肽，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。

本发明提供的一种法氏囊多肽BP7，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，为：5’-GlyGly Cys Asp Gly Ala Ala-3’。

本发明所述法氏囊多肽BP7在制备免疫药物中的应用，优选的在制备畜禽免疫药物中的应用，特别优选的，在制备预防禽流感的疫苗药物中的应用。

本发明还提供一种预防禽流感的免疫组合物，包含禽流感疫苗及所述的法氏囊多肽BP7。

所述法氏囊多肽BP7优选以2～255ug/mL计量存在于免疫组合物中，更优选10～250ug/mL，进一步优选10～50ug/mL，具体的，本发明所述的法氏囊多肽BP7可以以以下计量存在于免疫组合物中：10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL。

本发明通过超滤浓缩技术，回收分子量1000Da以下的有效成分(即粗提物)。经真空干燥，再次浓缩，溶解后，用反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离、纯化多种法氏囊中的活性成分。经MODIL-TOF质谱分析，测定该法氏囊活性肽的分子量为550.474(m/z)，并获得完整的氨基酸序列，即GGCDGAA(即5’-Gly Gly Cys Asp Gly Ala Ala-3’，序列1)，并命名为法氏囊多肽(BP7)。

本发明还提供一种更为具体的法氏囊多肽BP7的制备：

以500g健康鸡法氏囊组织为原料，经过冷冻、超声、离心、分子筛等技术，回收小分子量(＜1KDa)的法氏囊粗提物，经真空冷冻干燥，法氏囊粗提物样品经超纯水稀释后进行反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离，收获主要滞留峰组分，利用蛋白质氨基酸质谱分析系统(MALDI-TOF-MS)分析收集到的主要滞留峰样品的氨基酸序列，测定该法氏囊活性肽的分子量为550.474(m/z)，并获得该法氏囊多肽的完整氨基酸序列，即GGCDGAA。通过人工合成BP7，以一定浓度进行验证实验。

本发明所述的法氏囊多肽BP7促进AIV灭活抗原的免疫实验

(1)将法氏囊多肽BP7按照10、50和250ug/mL三种剂量添加至AIV灭活抗原中进行联合接种小鼠；免疫后的小鼠的抗体水平、抗体亚型、细胞因子水平高于疫苗组，且T细胞亚型和淋巴细胞增殖活力发生了变化；其中添加10ug/mL剂量BP7的实验组AIV疫苗免疫效力显著高于未加该组分的疫苗对照组。

(2)将法氏囊多肽BP7按照50ug/mL剂量添加至AIV灭活疫苗中进行联合接种75日龄；免疫后的鸡体内的抗体水平和细胞因子水平高于疫苗组，且淋巴细胞增殖活力明显增加。

本发明的积极意义：

本发明从鸡中枢体液免疫器官法氏囊中分离、鉴定出一个新的免疫活性肽BP7，结构简单，由七个氨基酸组成，免疫原性极弱，可作为畜禽疫苗免疫增强剂，如促进AIV灭活抗原的免疫活性。本发明所述的活性肽是一种来源于法氏囊的小分子多肽，安全、副作用小、无残留、具有促进广泛的免疫增强作用，对多种畜禽具有刺激抗体生成、调节细胞免疫反应和提高疫苗免疫效力作用，该多肽的氨基酸序列为：5’-GGCDGAA-3’。

附图说明

图1法氏囊七肽肽的分离和纯化。反向高效液相色谱图中，箭头所指，BP7的洗脱峰17.09min。

图2：多肽BP7的MALDI-TOF-MS分析。

图3：免疫后6周，小鼠AIV特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。

图4：免疫后6周，小鼠AIV特异亚型IgG2a抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。

图5：三免后1周，小鼠血清细胞因子水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)，ns代表无显著性差异。

图6：三免后1周，小鼠淋巴细胞活力，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。

图7：免疫后2周和4周，鸡AIV特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。

图8：二免后1周，鸡血清细胞因子水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)，ns代表无显著性差异。

具体实施方式

本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。

实施例1

1.BP7的分离及鉴定

用0.85％的生理盐水(预冷至4-10℃)洗涤无筋膜和脂肪组织的500gAA肉鸡法氏囊组织一次。沥干后，将法氏囊组织置于组织捣碎机中，再加入预冷的生理盐水，高速匀浆三次，每次三十秒，匀浆过程保持在0-10℃。然后将匀浆液在4℃条件下超声裂解处理2次，5min/次。然后将裂解液加热至80℃，保温5min，之后迅速置于冰上，冷却至10℃。然后将裂解液冷冻离心30分钟(4000×g/min)。收集上清液，反复冻融两次。然后将上清液高速离心，条件为12000g/min，4℃，30min。收集上清液进行超滤操作，收集1000Da以下分子量的超滤液，即法氏囊组织粗提物。冻干后，超纯水稀释，然后0.22um滤膜过滤，经反向高效液相纯化分析，收获洗脱峰值时间为17.09min的活性峰(见图1)，经MALDI-TOF-MS分析，分子量为550.474，氨基酸序列GGCDGAA(见图2)。

实施例2

1.人工合成BP7

委托商业化多肽合成公司按照GGCDGAA序列(SEQ ID No.1)合成多肽，要求纯度≧97％。

2.疫苗

AIV灭活疫苗(购自南京天邦生物科技有限公司)

3.实验动物分组

将BALB/C小鼠随机分为五组，每组10只：(I)PBS对照组(每只免疫0.2ml PBS)；(II)AIV灭活疫苗免疫组(每只免疫灭活疫苗0.2ml)；(III～V)灭活疫苗+BP7组(BP7浓度分别为10、50、250ug/mL，免疫剂量均为0.2ml)；采用腹腔注射的方式对相应组小鼠分别进行两次免疫。免疫间隔两周，200ul/每只/每次(表1)。

4.免疫小鼠样品采集

小鼠三免后，每周眼眶采血，8000×g离心10min分离血清，测定抗体水平和抗体亚型水平；并于第三次免疫后1周采血分离血清，测定细胞因子的水平，并采用流式细胞术检测了第二次免疫后一周小鼠血液中淋巴细胞及其亚群的情况，所有检测结果进行统计分析。

表1 BP7与AIV灭活疫苗混合免疫程序

5.鸡免疫及样品采集

将75日龄鸡(购自青龙山养殖场)随机分成3组，每组15只。采用50ug/mL BP7剂量联合AIV灭活疫苗联合免疫鸡，每两周免疫一次，共免疫两次。分别于免疫后2周和四周采血分离血清，检测血清中AIV特异的HI抗体水平；并于二免后一周采血，分离血清，检测IL-4和IFN-gamma细胞因子的水平，所有检测结果进行统计分析。

6.结果

(1)抗体水平检测结果

采用间接ELISA方法测定了小鼠免疫后6周的血清中针对AIV抗原的抗体水平，结果见图3。实验显示，第六周，BP7联合免疫组与只免疫疫苗组小鼠相比，抗体水平均出现提高，特别是10ug/mL BP7联合免疫组，其抗体水平显著高于疫苗对照组。

(2)AIV特异亚型IgG2a水平检测结果

免疫后6周采血分离血清，用ELISA方法对各组小鼠血清中AIV特异的抗体亚型IgG2a检测，结果见图4。结果表明，与疫苗组相比，10ug/mL和50ug/mL BP7联合免疫组提高IgG2a抗体水平，且10ug/mL BP7联合免疫组的IgG2a抗体水平极显著升高，但250ug/mL BP7联合免疫组IgG2a抗体水平则明显下降(图4)；这说明BP7促进疫苗免疫的能力与其调节IgG2a抗体的能力有密切关系，同时也存在其他亚型抗体的影响。

(3)细胞因子水平

第三次免疫后采血分离血清，用小鼠细胞因子的ELISA试剂盒(RD,USA，按其说明书使用)对各组小鼠血清中的细胞因子IL-4和IFN-γ水平进行了检测，结果见图5。与AIV疫苗组相比，BP7联合免疫组的IL-4没有明显变化。但BP7联合免疫组的IFN-γ水平均高于AIV疫苗组，特别是50ug/mL和250ug/mL BP7联合组的IFN-γ水平显著高于AIV疫苗组。

(4)淋巴细胞增殖结果

采用了MTT比色法检测了BP7对淋巴细胞增殖的影响情况，结果见图6。结果实验表明，与AIV疫苗组相比较，抗原刺激之后，250ug/mL BP7联合AIV疫苗组的淋巴细胞增殖能力显著增强。

(5)免疫鸡的抗体水平

采用HI方法检测免疫后2周和4周的血清抗体水平，结果如图7所示。实验结果表明，在免疫后2周和4周，50ug/mL BP7联合AIV疫苗组的抗体水平均明显高于AIV疫苗对照组。

(6)免疫鸡的细胞因子水平

采用鸡试剂盒检测鸡血清中的细胞因子含量，结果如图8所示。实验结果表明，在二免后一周，与AIV疫苗组相比，50ug/mL BP7联合AIV疫苗组明显促进实验鸡体内的IFN-gamma和IL-4的水平升高。

小鼠和鸡免疫实验结果表明，BP7能够促进疫苗免疫反应的免疫活性分子。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种促进疫苗免疫反应的法氏囊七肽及其应用

<130>2017

<160> 1

<170> Patent In version 3.5

<210>1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Gly Gly Cys Asp Gly Ala Ala

1 5

Claims

1.一种法氏囊多肽BP7，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述法氏囊多肽BP7在制备预防禽流感的疫苗佐剂中的应用。

3.一种预防禽流感的免疫组合物，其特征在于，包含禽流感疫苗及权利要求1所述的法氏囊多肽BP7。

4.根据权利要求3所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽BP7以2～255μg/mL计量存在于免疫组合物中。

5.根据权利要求4所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽BP7以10～250μg/mL计量存在于免疫组合物中。

6.根据权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽BP7以10～50μg/mL计量存在于免疫组合物中。

7.根据权利要求6所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽BP7以50μg/mL计量存在于免疫组合物中。