CN101434650B - 法氏囊五肽、其衍生肽及其应用 - Google Patents

Abstract

一种法氏囊五肽，其氨基酸结构序列为：Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。本发明的法氏囊五肽(Bp5)结构简单，分子量小，无化学毒性，无免疫原性，制备简单，既可以从鸡或其它禽类的法氏囊提取，也可以化学合成，化学合成时成本很低，可以大量制备。法氏囊五肽(Bp5)可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖、提高机体的体液免疫和细胞免疫的水平、还可以提高机体抗过氧化应激的能力，是一种具有广泛应用前景的免疫调节、免疫治疗和抗过氧化作用的药物或制剂。可用于基础研究、临床治疗、营养保健和美容化妆等领域。

Description

法氏囊五肽、其衍生肽及其应用

一、技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种具有免疫调节活性和抗氧化活性的法氏囊五肽、其衍生肽及其应用。

二、背景技术

现有技术：生物活性肽(Biologically active peptides，BAP)指的是一类分子量小于6000D，具有多种生物学功能的多肽。其分子结构复杂程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽，而且这些多肽可通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰。活性肽的种类很多，在动物体内广泛存在，并且具有重要的生理学功能，从具有免疫调节、抗氧化、类激素、类抗生素到调味及改变饲料味觉等功能。如免疫活性肽不仅能增强机体的免疫能力，在动物体内起重要的免疫调节作用；而且还能刺激机体淋巴细胞的增殖和增强巨嗜细胞的吞噬能力，提高机体对外界病原物质的抵抗能力。再如抗氧化肽具有较强的抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基的功能。生物活性肽在机体内含量甚微，代谢快，很容易降解，因此，对于新的活性肽的获得及生物活性的检测具有一定的困难。近年来，随着各种高灵敏多肽分离纯化、定量技术的应用，新的活性肽不断被发现，对活性肽的分布与功能的认识不断加深。新的活性肽的研究取得迅速发展。

免疫系统的基本功能是保护机体免于疾病的侵害。这些疾病不仅包括由于细菌、病毒及其他病原体引起的疾病，同时也包括癌症以及由于免疫失调自身免疫紊乱导致的疾病。免疫系统包括参与免疫应答的各种器官、组织细胞和免疫效应分子。胸腺和法氏囊是中枢免疫器官。胸腺不仅是T细胞分化、发育和成熟的场所，而且还可以分泌多种胸腺激素、调节机体的免疫功能，特别是细胞免疫功能。1966年Goldestein等从小牛胸腺中提取了具有生物学活性的物质，命名为胸腺素(thymosin)。之后，相继有文献报道了纯化胸腺激素的方法，先后分离出胸腺素a1(thymosin alpha 1)、胸腺素β(thymosinbeta4)、血清胸腺因子(thymulin)等多种具有有免疫生物学活性的蛋白和多肽因子。胸腺激素在疾病诊断和治疗中有重要的作用，现已广泛应用于治疗乙肝、丙肝、肿瘤、癌症和免疫缺陷等的研究中，是一类免疫增强剂或免疫调节剂。法氏囊是禽类的特有免疫器官，是细胞发育分化和成熟的场所，法氏囊除具有中枢免疫器官的地位外，还作为外周免疫器官发挥作用。而对于与胸腺具有相同地位的法氏囊免疫活性因子的研究不多。1960年Glick报道，法氏囊(BF)粗提物用丙酮处理后，多次注射去除BF的仔鸡，可使其恢复产生抗体的能力。1972年Toivanen等报道，给去除BF的雏鸡注射鸡胚干细胞后，可使其恢复体液免疫的能力。1976年Baba等报道，17日龄摘除BF的雏鸡连续注射5天法氏囊提取也能有效恢复对牛血清白蛋白(BSA)的抗体生成能力。1976年Brand等报道在外用鸡BF提取物诱导新生鸡骨髓淋巴细胞的分化，对T、B淋巴细胞分化都有诱导作用，提示可能存在一种淋巴细胞分化激素---bursopoietin。1977年Baba报道丙酸睾酮(TP)可以制鸡法氏囊发育，产生抗体多为IgM，而法氏囊提取物可恢复抗体水平，促使抗体类型由IgM向IgG转化。1986年Audyha首次利用各种层析技术从法氏囊中分离到一种物质Bursin，是一种三肽，其氨基酸组成顺序为Lys-His-Gly-NH₂，它可诱导哺乳动物和禽类B细胞的分化，提高人Daudi B细胞中的cAMP和cGMP水平。1991年郑昌学等报告，北京鸭法氏囊提取物能显著提高小鼠脾脏空斑形成细胞(PFC)的数量，对淋巴细胞抑制剂环磷酰胺具有明显的拮抗作用，并从法氏囊提取物中进一步分离到一种分子量小于750Da的肽类物质。1992年Murthy等报道，大剂量的法氏囊组织提取物在体外可以促进PHA诱导的淋巴细胞的转化，并确信是囊素之外的物质在起作用。

从生物体提取具有免疫活性或免疫调节作用的活性肽的文献很多。如美国专利：6337093，发明人申请了从昆虫体内提取具有免疫调节和抗菌作用的活性肽的专利。WO96/04005发明人申请了组药用复合物专利，该组药用复合物的主要成分是从山羊、猪、牛肝等组织中提取的一种具有激活主要组织相同性抗原、增强免疫反应的多肽。胸腺五肽(Thymopentin)是胸腺生成素(Thymopoieti，43肽)种氨基酸序列32-36的五肽，商品名日达仙，作为一种免疫因子已应用于医学临床，在抗感染、抗肿瘤、免疫缺乏症的治疗上获得可喜成果。

由于外界环境及机体自身新陈代谢，生物体内不断产生活性氧。所谓活性氧，是指机体内或者自然环境中含氧并且活泼的物质的总称。主要有一种单线态氧(～1O_2)；三种氧自由基，即超氧离子自由基(·O₂)、羟自有基(·OH)和氢过氧自由基(HOO·)；两种过氧化物，即过氧化氢(H₂O₂)和过氧化脂质(ROOH)以及一种含氮氧化物(NO)等。在机体中常见的活性氧有超氧自由基、羟自有基、单线态氧、过氧化氢、脂过氧基等。活性氧化学性质活泼，参与部分生物功能。如前列腺素的合成、凝血酶原的合成、机体内的解毒功能、吞噬细胞杀菌过程以及核糖核苷的还原等。但过多的活性氧则会引起一系列生物学反应，导致组织细胞、亚细胞和分子结构的破坏，并随着破坏层次逐渐扩展造成功能损伤，引起心脏病、癌症、和衰老等疾病，构成很多疾病的病理学基础。在人体内存在一整套防御活性氧损伤的体系，如：1、谷胱甘肽过氧化物酶体系(GHS-PX)，可系统地保护生物膜免受脂质过氧化损害。2、超氧化物歧化酶(SOD)，此酶能清除超氧阴离子，进而阻断脂质过氧化等一系列自由基反应，保护细胞免受损伤。3、过氧化氢酶，其主要作用是清除H₂O₂、SOD。事实上，GSH-PX、SOD、CAT和VE等构成了一个相互保护的防御体系，维持机体内活性氧的产生和清除的平衡。此外，生物体内还存在一些天然的抗氧化肽，如肌肽、谷胱甘肽等。一些分泌激素如黄体生成素释放激素，脑啡肽，血管紧张素，催产素等其第二功能就是抗氧化作用。这些激素具有清除过氧化自由基、防止低密度脂蛋白的氧化和抑制脑膜脂质过氧化的功能。

因此，在各种情况下，有重要的原因研究机体的各种生物活性肽，而同时具有免疫活性和抗氧化活性的生物活性肽必将在生物制药、保健品、化妆品、食品和饲料等行业有着广泛的用途。

三、发明内容

技术问题：本发明提供一种具有免疫调节活性和抗氧化活性的法氏囊五肽、其衍生肽及其应用。该法氏囊五肽(Bp5)结构简单，分子量小，无化学毒性，无免疫原性，制备简单。法氏囊五肽(Bp5)可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖、提高机体的体液免疫和细胞免疫的水平、还可以提高机体抗过氧化应激的能力，是一种具有广泛应用前景的免疫调节、免疫治疗和抗过氧化作用的药物或制剂。可用于基础研究、临床治疗、营养保健和美容化妆等领域。

技术方案：一种法氏囊五肽，其氨基酸结构序列为：Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。一种法氏囊五肽的衍生肽，其氨基酸结构序列为X-R1-R2-R3-R4-R5-Y，其中X：H、乙酰氨基或者氨基乙酰基；R1：D-Cys或者L-Cys；R2：D-Lys、D-Arg、D-His、L-Lys、L-Arg或者L-His；R3：D-Asp、D-Glu、L-Asp或者L-Glu；R4：D-Val或者L-Val；R5：D-Tyr或者L-Tyr；Y：-OH、NH2或OC_1-6烷基。

上述肽在治疗免疫缺陷病、机体免疫调节、控制肿瘤增长、抗病毒感染、治疗与机体过氧化有关的疾病药物中的应用。

上述肽在用于机体抗过氧化及清除体内自由基的抗衰老药品、化妆品或保健品中的应用。

上述肽在食品、饲料抗氧化剂中的应用。

本发明充分利用现代科技成果，采用先进的技术途径从鸡的法氏囊中提取到一种新的活性肽，即法氏囊五肽(Bp5)其氨基酸序列为Cys-Lys-Asp-Val-Tyr(见实施例1)。首先利用超滤浓缩技术，回收分子量1000Da以下的法氏囊组织有效活性成分。超滤浓缩技术是新近发展起来的一种分离、纯化技术，它具有效率高、利于工厂化生产，可在室温或低温下操作，对样品损害小，回收利用率高，不宜污染，不用化学试剂，浓缩的同时可部分纯化以及选择范围广等优点，因此，目前已广泛应用于医学制品、生物制品及生物技术产品的下游工程等方面。超滤浓缩技术的主要原理是通过微孔滤膜在外来压力作用下使溶液中的溶质得到浓缩或分离，采用排阻率为1000Da的滤膜，可以使小于1000Da的小分子量的物质滤过。这样通过超滤浓缩技术就可以获得含有有效成分的法氏囊组织超滤液。超滤液经真空冷冻干燥后获得粗制品。粗制品经适量的蒸馏水溶解后用1N的三氟乙酸溶液调pH值到2-3，充分摇匀后经12000转离心15分钟弃沉淀取上清液，再经真空冷冻干燥。冻干品用适量的蒸馏水溶解后用1N的三氟乙酸溶液调PH值到2-3，用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离、纯化活性成分。本发明充分利用了C18反相硅胶HPLC在分离、鉴定肽类物质时所具有的速度快、灵敏度高、分辨率好等优点，结合梯度浓度洗脱的操作手段，成功地从鸡法氏囊组织超滤液中获得了可用于分子量测定、多肽测序等生化分析说必需的高纯度的法氏囊活性肽。在获得高纯度的法氏囊活性肽后，发明人利用美国Finnigan公司的LCQDECAXP系统进行了液相色谱-电喷雾质谱分析，测得该法氏囊活性肽的分子量为626.27。在此基础上，发明人对该法氏囊活性肽进行了氨基酸序列的测定。众所周知，肽的氨基酸测定有很多方法，其中最常用的是化学法，通常用Edman降解法。其基本原理是多肽链-端的氨基酸的氨基与苯异硫氰酸酯(PITC)试剂在弱碱条件下形成苯异硫甲氨酰基衍生物(PTC-肽)，后者在无水三氟乙酸(TFA)下裂解释放出末端的苯氨基噻唑啉酮氨基酸(ATZ-氨基酸)，然后转化成乙内酰苯硫氨基酸(PTH-氨基酸)，这些氨基酸可用HPLC法加以鉴定。发明人根据Edman降解法原理，采用当今最先进的PROCISE cLC蛋白测序系统(Applied Biosystems)进行氨基酸序列测定。在所进行的五个测定循环中，第一个循环未见典型的氨基酸峰，第2-5个循环出现典型的氨基酸特征峰，它们分别是赖氨酸(Lys，K)、天冬氨酸(Asp，D)、缬氨酸(Val，V)、酪氨酸(Tyr，Y)结合分子量判断该多肽第一个氨基酸可能是半胱氨酸(Cys，C)。由于在PTH-氨基酸分析的体系中，PTH-半胱氨酸在该系统中没有色谱峰，必须对半胱氨酸进行修饰才能测定。所以，为了进一步确定该法氏囊活性肽氨基酸序列中的第一个氨基酸，获得完整的氨基酸序列，使用了另一种多肽氨基酸序列测定方法。即毛细管液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱(LC-ESI-MS-MS，英国Micromass公司)分析法测定氨基酸序列。最终根据质谱图确定了法氏囊活性肽的完整的氨基酸序列。即半胱氨酸(Cys，C)-赖氨酸(Lys，K)-天冬氨酸(Asp，D)-缬氨酸(Val，V)-酪氨酸(Tyr，Y)。

获得法氏囊五肽的途径并不局限于上述方法，还可以通过固相多肽合成技术或DNA重组技术获得。众所周知，化学合成多肽的方法见著与免疫学、生物化学、蛋白质化学、食品学、药物学等许多文献中。在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，(Merrifield，R.B.，″Solid phase peptide synthesis1.The synthesis of a tetrapeptide，″J.Am.Chem.Soc.85：7129(1963))他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。化学合成多肽现在可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行。

DNA重组技术是最近二三十年发展起来的最重要的新兴技术之一，目前已有很多基因工程新型药物及疫苗投放市场，产生了巨大的社会效应和经济效应。具体到本发明，可以利用DNA重组技术将编码上述活性肽的核酸序列插入到载体DNA中构建一个表达载体，继而将构件的表达载体导入到宿主细胞中获得一个基因工程宿主细胞，将基因工程宿主细胞放入一个适宜的环境中以利于基因工程宿主细胞表达上述活性肽。再通过基因工程后处理将表达的活性肽分离、纯化。

本发明提供的五肽具有非常好的免疫调节作用(见实施例2)，利用上述的法氏囊五肽(Bp5)或其推导的等价序列肽的免疫增强或免疫调节作用制造药物或医药组合物(药剂、药品)。可容易地验证上述的法氏囊五肽(Bp5)或其推导的等价序列肽的免疫增强或免疫调节作用。如淋巴细胞免疫活性监测、CTL、、细胞因子量的多少、抗体的产生等。诸如此类的免疫学检测方法见实施例部分

本发明提供的法氏囊五肽(Bp5)具有抗氧化活性。(见实施例3)本发明在体外试验采用Fenton反应产生羟基自由基检测囊素五肽那清除羟基自由基的能力、采用改良的邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子来检测囊素五肽清除超氧阴离子的能力；采用FRAP(ferric reducing antioxidant power)法检测囊素五肽的总的抗氧化能力、TBARS法检测囊素五肽的抗脂质体过氧化活性。上述检测方法祥见实施例3。从试验结果可知，囊素五肽具有很强的清除羟基自由基、超氧阴离子的能力。体外试验同样表明囊素五肽具有较强的抗脂质体过氧化能力。

鉴于囊素五肽具有良好的免疫促进作用和较强的抗氧化作用，其应用相当广泛。首先，可以利用囊素五肽作为人和动物一些疾病的预防和治疗的综合措施之一。如流感的防止措施中可以将囊素五肽同流感疫苗或抗病毒药物联合使用以加强疫苗或抗病毒药物的效果。囊素五肽对疾病的防治作用可以延伸到抗感染及抑制肿瘤的生长。因此，本发明一个可实施的方案是将囊素五肽和其他药剂如抗病毒制剂、抗感染制剂、抗肿瘤制剂混合或整合在一起组成药物组合物。该情况下只要药物组合物含有本发明的目的成分即囊素五肽就属于本发明的药剂范畴。

本发明中，用囊素五肽制造的医药组合物可用于人和动物的免疫功能异常的治疗(如免疫缺陷或免疫功能低下)、抗病毒、抗感染、抑制肿瘤的生长以及治疗机体过氧化相关的疾病(冠心病和衰老等疾病)。

本发明另一个可实施的方案是利用囊素五肽作为免疫佐剂制造疫苗复合物，即利用现有技术通过物理的方法将该该佐剂成份与适当的抗原混合。

本发明另外一个可实施的方案是利用囊素五肽用于制造饮食品，包括保健品、功能性食品、饮料。特别是与调节机体免疫功能及抗氧化有关的饮食品。

本发明另一个可拓展的实施方案是利用囊素五肽制造化妆品。即利用囊素五肽具有较好的抗氧化能力、无毒副作用的特性，将囊素五肽与其他化妆品成分组合可以很好地提高化妆品的抗老化、去角质、美白的功效。

本发明囊素五肽的施用量可根据使用目的、使用方法、制剂的形式等适当选择。组合物的有效肽的用量可以在较大范围内变化。此外，肽的使用量取决于该组合物的施用方法和所用的特别配剂。

有益效果：

本发明涉及从鸡法氏囊中提取到一种新的具有免疫调节活性和抗氧化活性的法氏囊五肽(Bursopentin，Bp5)、其衍生肽及其应用。本发明所提供的法氏囊五肽(Bp5)的氨基酸结构序列为：Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。本发明的法氏囊五肽(Bp5)结构简单，分子量小，无化学毒性，无免疫原性，制备简单，既可以从鸡或其它禽类的法氏囊提取，也可以化学合成，化学合成时成本很低，可以大量制备。法氏囊五肽(Bp5)可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖、提高机体的体液免疫和细胞免疫的水平、还可以提高机体抗过氧化应激的能力，是一种具有广泛应用前景的免疫调节、免疫治疗和抗过氧化作用的药物或制剂。可用于基础研究、临床治疗、营养保健和美容化妆等领域。

四、附图说明

图1：纯化囊素五肽的反相高效液相色谱图。

图2：Q-TOF质谱分析图

图3：HI抗体分析图。与AIV免疫组比较，差异显著P＜0.05；差异极显著P＜0.01。

图4～6：HA抗体和抗体亚型分析图。与AIV免疫组比较，差异显著P＜0.05；差异极显著P＜0.01。其中图4为HA抗体IgG亚型分析图；图5为HA抗体IgG1亚型分析图；图6为HA抗体IgG2a亚型分析图

图7：囊素五肽能够提高特异性CTL对靶细胞的杀伤活性。与AIV免疫组比较，差异显著P＜0.05；差异极显著P＜0.01。

图8：囊素五肽具有较强的还原能力，采用FRAP法可以检测出囊素五肽具有非常有效的还原能力。从而揭示了囊素五肽具有电子供体的特性从而具有中和自由基的能力。

图9：囊素五肽具有抗脂质体过氧化的能力，从图中可知囊素五肽能非常有效地抑制由Fe²⁺引发的卵磷脂分散体系的过氧化作用，而且所测定的浓度范围内随囊素五肽浓度的增大而增强。

图10：囊素五肽能够有效地清除超氧阴离子，从图中可以看到囊素五肽对超氧阴离子有较强的清除作用，并具有明显的剂量效应。

图11：囊素五肽能够有效地清除羟基自由基，从图中可以看到囊素五肽对羟基自由基有较强的清除作用，并且具有明显的剂量效应。

五、具体实施方式

实施例1、囊素五肽(Bp5)的制备

囊素五肽(Bp5)既可以从鸡或其他禽类法氏囊中通过生物化学方法提取，又可以通过人工合成的方法获得。

1)从法氏囊中提取

取剔除筋膜和脂肪组织的新鲜鸡法氏囊组织1000g，用予冷至4-10℃的质量浓度0.85％的生理盐水洗涤一次。沥干置于匀浆机中再加入4-10℃的质量浓度0.85％的生理盐水在0-10℃下组织捣碎机中高速匀浆三次，每次30秒。4℃超声裂解匀浆液两次，每次5分钟。水浴加热裂解液到80℃(5分钟)，迅速冰浴冷却至10℃以下，4℃，4000rpm离心30min。合并所得上清，-20℃反复冻融两次。4℃，12000rpm离心30min，收集上清。上清用美国Millipore公司的超滤系统进行超滤，滤膜排阻为1000Da。收集分子量1000Da以下超滤液，冷冻干燥后得到法氏囊粗提物。粗制品经适量的蒸馏水溶解后用10％三氟乙酸溶液调PH值到2-3，充分摇匀后4℃过夜，经12000rpm离心15分钟弃沉淀取上清液，再经真空冷冻干燥。冻干品用适量的蒸馏水溶解后用10％三氟乙酸溶液调PH值到2-3，用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离、纯化活性成分。色谱柱为ZorbaxC-18(ODS)柱(150×4.6mm)。流动相：A相为0.1％TFA(v/v)的水溶液；B相为0.1％TFA的乙晴溶液；线性梯度为5-18％B/A，流速1mL/min，30℃，20min。280nm检测。收集保留时间为19.098分钟的活性峰(见附图1)。活性峰经真空冷冻干燥后得到2.12mg粉末。即为天然囊素小肽。分离纯化得到的囊素小肽经过质谱分析得到氨基酸一级结构是Cys-Lys-Asp-Val-Tyr(见附图2)

2)化学合成囊素五肽(Bp5)

用化学方法合成氨基酸结构相同的五肽。方法为采用双通道全自动多肽合成系统合成。

实施例2囊素五肽(Bp5)的免疫调节活性

天然的囊素五肽具有增强有丝分裂原诱导的鼠脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖的能力。在此基础之上，发明人以4-6周龄小鼠为动物模型，以H9亚型禽流感病毒为抗原与不同浓度的囊素五肽混合免疫，分别于0、14、28天共免疫三次，分析了囊素五肽的免疫调节功能(见附表1)。通过下列实验可以发现囊素五肽不但能提高机体体液免疫的功能而且还能提高机体的细胞免疫功能，并且具有平衡Th1和Th2类型免疫反应的功能。

表1

1)囊素五肽(Bp5)具有提高血凝抗体滴度的能力(见附图3)

分别与免疫后7、21、35天分离血清，检测HA蛋白特异性血清效价。测定方法按照OIE标准进行。

2)囊素五肽(Bp5)能够提高特异性抗体(IgG)的分泌水平且具有平衡抗体亚型(IgG1和IgG2a)分泌水平的能力(见附图4A、4B、4C)分别于免疫后7、21、35d分离血清检测H₉N₂HA抗体，用0.05M carbonate buffer pH 9.6(CBS)稀释大肠杆菌表达的重组H₉N₂HA蛋白至10μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜包被，后用PBST洗涤3次。用1％BSA(m/v)于室温下封闭3h，PBST洗涤3次。加入1∶10-1∶10⁵(v/v)稀释的小鼠血清(每孔100μL)作用1h，再次以PBST洗涤3次。加入1∶1000(v/v)稀释的过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG和1∶2000(v/v)稀释的过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG1、IgG2a(每孔100μL)作用1h，PBST洗涤3次，拍干，加入现配的TMB显色液(每孔100μL)，室温避光反应20min后，以2M H₂SO₄终止反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀。

每个血清稀释度对应一个ELISA OD值，绘制血清稀释度(log scale)对应OD值曲线。通过拟合曲线回归分析half maximal OD时的血清稀释度。计算该血清稀释度的logarithm值来作为实验结果。每个血清滴定被重复三次。

3)囊素五肽(Bp5)能够提高细胞因子的分泌水平

Standard group is AIV.^**Significant as p＜0.01，^*Significant as p＜0.05

囊素五肽不但能提高代表Th1类型免疫反应的细胞因子IL-2和IFN-γ的水平，同时能显著提高代表Th2类型的细胞因子IL-4和IL-10的水平。

具体的检测方法是：分别于免疫后7、21、35d分离血清检测免疫后小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ的含量，应用商品化的小鼠细胞因子试剂盒检测。按试剂盒说明书进行操作。每次分析时，使用对照的重组细胞因子标准品绘制标准曲线，通过标准曲线来计算血清样品中细胞因子的含量。

4)囊素五肽(Bp5)能够显著提高脾脏T淋巴细胞CD3+CD4+和CD3+CD8+的百分率

Standard group is AIV.^**Significant as p＜0.01，^*Significant as p＜0.05

具体的检测方法是：最后一次免疫后7天分离小鼠脾淋巴细胞，通过流式细胞仪分析小鼠免疫后脾淋巴细胞中T细胞亚群和NK-T细胞的变化。制备的小鼠脾淋巴细胞(2×10⁶cells/mL)用100μl PBS液重悬，加入5μl FITC标记的anti-CD3 mAb，接下来加入5μl PE anti-CD4 mAb或anti-CD8 mAb，于4℃孵育30min，1200rpm，离心10min，PBS洗涤2次后用100μL封闭液(PBS/1％BSA/0.1％NaN₃)(m/v)重悬，4℃保存待检测。通过FACScan流式细胞仪检测不同表面抗原分子的荧光信号(BD，LSR)，应用Cell Quest软件分析实验数据。获取双参数散点图。

5)囊素五肽能够提高特异性CTL对靶细胞的杀伤活性(见附图5)

效应细胞制备

第三次免疫后1周后处死各组小鼠，在超净台内无菌操作取出脾脏，制备成单个脾细胞悬液，取淋巴细胞分离液入离心管管底，沿管壁小心加入两倍体积的脾细胞悬液，1200rpm，离心20min，沿管壁小心吸出界面层细胞，PBS洗涤3次，RPMI 1640营养液重悬细胞，计数细胞，使达到1×10⁷cells/5mL。参照同样的方法分离未免疫的同品系小鼠脾淋巴细胞，用100μL无血清的RPMI 1640营养液重悬细胞，使浓度达到5×10⁶cells/100μL。细胞用H9亚型禽流感病毒株A/Duck/Jiangsu/NJ08/05(10⁷pFU)37℃感染2h，用RPMI 1640营养液洗涤3次，用5ml RPMI 1640营养液重悬细胞，37℃，5％CO2培养3h后，3000rad照射。接下来将5mL的免疫的小鼠脾淋巴细胞和禽流感病毒感染未免疫的同品系小鼠脾淋巴细胞37℃5％CO₂培养箱共孵育6d，然后收集细胞，2000rpm离心10min。细胞沉淀用含5％FBS(m/v)的RPMI 1640悬浮，调整细胞浓度至1×10⁷cells/mL，即为效应细胞。

靶细胞的制备

将NIH3T3细胞培养成致密单层，用JS株H9亚型禽流感病毒(10⁸PFU)37℃感染2h，然后收集细胞，2000rpm离心10min。细胞沉淀用含5％FBS(m/v)的RPMI 1640悬浮，调整细胞浓度至1×10⁶cells/mL，即为靶细胞。

CTL的检测

按Cytotoxicity Assay试剂盒说明书确定靶细胞的最佳浓度。效应细胞与靶细胞数按效靶比100∶1、50∶1两个比例均匀混合于100μL含5％FBS(m/v)的RPMI 1640培养基中，作为试验组。同时设立以下对照：效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、培养液对照以及体积校正对照组，各组均设4个重复孔，每孔总体积100μL。4h后，于570nm波长下测定OD值。按照下列公式计算特异性细胞毒性T细胞的百分率：CTL(％)＝(试验孔OD值-效应细胞自发释放OD值-靶细胞自发释放OD值)/(靶细胞最大释放OD值-靶细胞自发释放OD值)。

实施例3囊素五肽的抗氧化活性

由于囊素五肽的独特的结构，使得囊素五肽具有非常好的抗氧化功能，主要表现在以下几方面：

1)囊素五肽具有较强的还原能力(见附图6)

采用FRAP法可以检测出囊素五肽具有非常有效的还原能力。从而揭示了囊素五肽具有电子供体的特性从而具有中和自由基的能力。

2)囊素五肽具有抗脂质体过氧化的能力(见附图7)

采用TBARS法评价囊素五肽的抗脂质体过氧化的能力。从图中可知囊素五肽能非常有效地抑制由Fe²⁺引发的卵磷脂分散体系的过氧化作用，而且所测定的浓度范围内随囊素五肽浓度的增大而增强。

3)囊素五肽能够有效地清除超氧阴离子(见附图8)

采用改良的邻苯三酚自氧化法产生活性氧来检测囊素五肽清除活性氧的能力。从图中可以看到囊素五肽对超氧阴离子有较强的清除作用，并具有明显的剂量效应。

4)囊素五肽能够有效地清除羟基自由基(见附图9)

采用Fenton反应产生羟基自由基来检测囊素五肽清除羟基自由基的能力。从图中可以看到囊素五肽对羟基自由基有较强的清除作用，并且具有明显的剂量效应。

Claims (4)

1.一种法氏囊五肽，其氨基酸结构序列为：Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。

2.根据权利要求1所述肽在制备治疗免疫缺陷病、机体免疫调节、治疗与机体过氧化有关的疾病药物中的应用。

3.根据权利要求1所述肽在制备用于机体抗过氧化及清除体内自由基的抗衰老药品、化妆品或保健品中的应用。

4.根据权利要求1所述肽在食品、饲料抗氧化剂中的应用。

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