CN104130313B - 法氏囊活性肽bpp-ii特异性结合肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种法氏囊活性肽BPP‑II特异性结合肽及其应用，属于蛋白质多肽技术领域。法氏囊活性肽BPP‑II特异性结合肽的氨基酸序列为：短肽1：QSLPSPLWIQQS，短肽2：DRMPDSAWTTRK，短肽3：ALWPPNLHAWVP。本发明以BPP‑II‑BSA融合蛋白作为靶分子，通过噬菌体随机12肽库筛选，结合ELISA鉴定和竞争抑制试验，获得与BPP‑II特异性结合的噬菌体，进行序列测定，人工合成BPP‑II特异性结合肽。由此筛选得到的结合肽能与法氏囊活性肽BPP‑II特异性结合，且在一定浓度下抑制BPP‑II对小鼠WEHI‑231B淋巴瘤细胞增殖活性，在制备抑制法氏囊活性肽BPP‑II抗肿瘤细胞增殖的药物方面具有良好的应用前景，为BPP‑II抑制剂的研究开发及应用奠定基础。

Description

法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽，以及法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽的应用，属于蛋白质多肽技术领域。

背景技术

法氏囊（bursa of Fabricus，BF）是公认的禽类特有的中枢免疫器官，是B细胞分化发育和抗体产生的场所，对禽类体液免疫具有至关重要的作用。学者们对法氏囊的形态发生学、免疫学以及组织提取物的生物学活性等方面进行了广泛而深入的研究，发现法氏囊组织中存在多种活性分子，目前已从法氏囊中分离出多种法氏囊活性小肽如BSP-I、BSP-II、BHP、BTP、BPP-I、BP11、BP5等。研究发现，法氏囊活性肽大多具有免疫调节功能，有些还具有抗肿瘤潜能。

法氏囊活性肽BPP-II是从鸡的法氏囊中分离得到一种新型的免疫调节肽，分子量小，结构简单，其氨基酸组成顺序为Met-Thr-Leu-Thr-Gly。一些研究者对BPP-II的生物学活性进行了研究，结果发现BPP-II能够提高机体抗体水平，调节Th1型和Th2型免疫反应，促进淋巴细胞增殖，调节体液免疫和细胞介导的免疫应答，且在一定浓度下抑制MCF-7细胞、Hela细胞等肿瘤细胞的增殖，是一种多功能生物活性分子。

噬菌体随机肽库技术是一种高效、简便的淘选工具，能够将编码外源肽的DNA序列插入噬菌体编码外壳蛋白的基因中，使大量的随机肽段以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，是研究蛋白质分子间相互作用的有效手段，近年来广泛应用于生物活性肽、肽类药物筛选、抗原模拟表位筛选等研究领域。据资料证实，具有生物学功能的免疫因子大多是通过与细胞膜受体相互作用或通过受体介导而发挥生物学功能，如生长因子、胸腺五肽TP5等。BPP-II作为一种多功能免疫因子，其发挥生物学功能的机制尚不清晰。因此利用噬菌体展示技术筛选BPP-II特异性结合肽，并研究BPP-II结合肽是否对BPP-II的生物学功能有所影响。对BPP-II抑制剂的研究开发及应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽。

同时，本发明还提供一种法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

上述三条均为短肽，其中短肽1：QSLPSPLWIQQS，短肽2：DRMPDSAWTTRK，短肽3：ALWPPNLHAWVP。

一种法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽的应用，具体的，法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽在制备抑制法氏囊活性肽BPP-II抗肿瘤细胞增殖的药物方面的应用。

所述的肿瘤细胞为淋巴瘤细胞，具体为小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞。

本发明的有益效果：

本发明以BPP-II-BSA融合蛋白作为靶分子，通过噬菌体随机12肽库筛选，结合ELISA鉴定和竞争抑制试验，获得与BPP-II特异性结合的噬菌体，进行序列测定，人工合成BPP-II特异性结合肽。由此筛选得到的结合肽能与法氏囊活性肽BPP-II特异性结合，且在一定浓度下抑制BPP-II对小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖活性。标准MTT法检测BPP-II特异性结合肽抗BPP-II对小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖功能的影响，分析结果发现：短肽1、2、3本身对鸡DT40细胞的增殖均无明显影响；短肽1肽在2μg/mL和20μg/mL浓度下能够显著抑制BPP-II对WEHI-231细胞增殖功能（P<0.05）；短肽2和短肽3在20μg/mL浓度下能够显著抑制BPP-II对WEHI-231细胞增殖功能（P<0.05）；表明3个BPP-II特异性结合肽在一定浓度下均可抑制BPP-II抗小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖活性。为BPP-II抑制剂的研究开发及应用奠定了基础，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中ELISA检测噬菌体展示肽对靶分子的结合活性；

图2为实施例1中噬菌体阳性克隆竞争抑制试验结果；

图3为试验例中BPP-II对小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖的影响；

图4为试验例中BPP-II特异性结合肽对WEHI-231细胞增殖的影响；

图5为试验例中BPP-II特异性结合肽对BPP-II抗WEHI-231细胞增殖功能的影响；

图6为试验例中无关G-G-G-G-S五肽对BPP-II抗WEHI-231细胞增殖功能的影响。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中BPP-II特异性结合肽的筛选，包括以下步骤：

1）噬菌体随机12肽库的亲和筛选

(1)包被纯化的BPP-II-BSA

将BPP-II-BSA（BPP-II-BSA融合蛋白由BPP-II和BSA参照常规化学方法偶联制备，由上海科肽生物有限公司合成，纯度95%以上）以TBS稀释为100μg/mL，同倍稀释BSA，分别取稀释后的BPP-II-BSA和BSA包被酶标板，100μL/孔，放置湿盒中4℃过夜；次日倾弃包被液，加入含0.05%Tween20的TBST洗涤3次（每次静置3min），扣干，然后以含5%脱脂奶粉的TBS按100μL/孔加入各孔，置湿盒中37℃封闭2h；倾弃封闭液，以含0.05%Tween20的TBST溶液洗涤3次，叩干，将包被好的酶标板封口，于4℃保存待用。

(2)预筛选

以TBST稀释原始文库（即噬菌体随机12肽库，购于美国New England Biolabs，NEB公司）至1×10¹¹pfu/mL，取稀释后的文库液100μL加入到预先包被BSA的酶标板孔内，于湿盒中37℃放置2h，吸出孔内液体，并用100μL TBS清洗微孔一次，合并吸出的孔内液和清洗液为预筛选液。

(3)亲和筛选

将100μL的预筛选液加入到预先包被BPP-II-BSA的酶标板孔内，放置湿盒中4℃过夜，弃孔内液体，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100μL0.2M Glycine-HCl（pH2.2），于室温温和摇动10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，加入15μL1M Tris-HCl（pH9.1）中和上述洗脱液。测定少量（～1μL）洗脱物的滴度，剩余洗脱物加入到20mL ER2738培养物中（菌体应当处于对数前期），37℃剧烈摇动培养4.5h。将培养物转入离心管中，4℃12,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。取80%上清转入新管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉淀过夜。次日，4℃12,000rpm离心PEG沉淀15min。弃上清，再短暂离心，弃去残留上清。沉淀物重悬于1mL TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育30min（15-60min）。4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸弃残余上清。沉淀物重悬于200μL TBS0.02%NaN₃中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新的离心管中，即为第一轮扩增后的噬菌体洗脱物。根据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板测定扩增后洗脱物的滴度。将第一轮扩增后的噬菌体液以TBS稀释为1×10¹¹pfu/mL，取100μL加入到预先包被BP5-BSA的酶标板孔中进行第二轮筛选，37℃温育2h，弃孔内液，并用含0.05%Tween20的TBST溶液清洗10次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定，重复以上步骤进行第三轮和第四轮筛选。

在筛选过程中，将每轮投入筛选的噬菌体量记为Input、洗脱得到的噬菌体量记为Output，分析比较每轮产出/投入比（Input/Output）情况，来反映特异性结合噬菌体的富集程度。经过4轮筛选发现：淘选获得的噬菌体越来越多，特异性越来越强，其中第四轮噬菌体滴度为1.8×10⁶pfu/mL。噬菌体产出投入比逐轮提高（见表1），表明具有特异性结合作用的噬菌体显示较好的富集效果。

表1四轮亲和筛选对噬菌体的富集

2）单克隆噬菌体的扩增

将ER2738接种于20mL LB培养基中，37℃培养至稍浑浊。用灭菌的吸头从第三轮和第四轮淘选物中随机分别挑取10个克隆。每个噬菌体克隆加入到每管ER2738培养液中，37℃培养4.5h。将上述培养物于4℃12,000rpm离心10min，上清移入新的离心管，再离心。取80%上清于新离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀至少1h或过夜。4℃12,000rpm15min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，弃去残余上清。沉淀重悬于1mL TBS中，将悬液转入微量离心管，4℃离心5min除去沉淀中的残留细胞。上清转入新的微量离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用30min（15-60min）。4℃离心10min，弃上清，再进行短暂离心，弃去残余上清。沉淀重悬于50μL TBS中，按常规M13方法进行噬菌体滴度测定。

3）ELISA检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性

为了检测筛选得到的噬菌体克隆是否与BPP-II特异性结合，从第三轮和第四轮筛选后测滴度的琼脂板中随机挑选20个单个噬菌体克隆，以BPP-II-BSA和BSA包被酶联板做间接ELISA试验。用100μL100μg/mL的靶分子BPP-II-BSA（溶于0.1M pH8.6NaHCO₃中）包被ELISA板，并设BSA蛋白对照。在密封的湿盒中4℃包被过夜。经封闭液4℃封闭1h后，PBST洗涤，加入100μL待测单个克隆的噬菌体上清（稀释至：10¹¹pfu/mL）为待测短肽，室温反应1h。PBST洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP结合物，室温反应1h。PBST充分洗涤，加入TMB底物显色溶液，室温30min，后加50μL2M的H₂SO₄终止反应，测A450值。

结果显示其中10个克隆显示较强的阳性结果（见图1）。分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10。

4）竞争抑制试验

将上述10个克隆，做竞争ELISA实验，以人工合成的BPP-II来阻断阳性噬菌体与BPP-II结合，以进一步鉴定所筛选的噬菌体展示肽是否与BPP-II特异性结合，在湿盒中，包被靶分子BPP-II-BSA并封闭（方法同上），加入100μL不同浓度（25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL）人工合成的BP5与上述单克隆噬菌体（稀释至：10¹¹pfu/mL）等体积混合，室温作用10min，每孔100μL，室温轻摇孵育1h。PBST洗6次，加抗M13-HRP抗体，室温轻摇孵育1h，PBST洗6次，加TMB底物显色，测A450值。

抑制率的计算公式见下式（1）：

抑制率(%)=(未抑制A450值－抑制后A450值)/未抑制A450值×100% （1）

结果表明，人工合成的多肽对噬菌体P3、P5、P6与BPP-II结合具有一定的阻断作用（见图2）。说明噬菌体P3、P5、P6为BPP-II的特异性结合肽。

5）单链噬菌体DNA的制备

按1:100稀释ER2738过夜培养物并接种于LB培养基，分装到培养管中，每管1mL。用灭菌吸头挑一蓝色噬菌斑（从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以保证每个噬菌斑仅含一个DNA序列）加入上述1mL培养管中，每个要鉴定的克隆一管。37℃摇床培养5h（4.5-5h）。培养物转入微量离心管中，离心30s。上清转入新管中，再离心，然后将500μL含噬菌体的上清转入新离心管中。加200μL PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。离心10min，弃上清，再短暂离心，小心吸弃残余上清。用70%乙醇洗涤沉淀，充分干燥后，沉淀重悬于30μL TE（10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA）中。

6）阳性噬菌体DNA序列测定

提取上述3个噬菌体阳性克隆的单链DNA后，用-28gIII和-96gIII测序引物（-28gIII测序引物SEQ ID NO.4所示，-96gIII测序引物如SEQ ID NO.5所示）交由上海生工生物有限公司测序，以推测其相应的氨基酸序列，结果显示，得到的BPP-II特异性结合肽的氨基酸序列分别如下，P3-12（SEQ ID NO.1）：QSLPSPLWIQQS；P5-12（SEQ ID NO.2）：DRMPDSAWTTRK；P6-12（SEQ ID NO.3）：ALWPPNLHAWVP。

7）化学合成多肽

采用固相合成法合成上述多肽P3-12、P5-12、P6-12，由上海科肽生物有限公司合成。纯度95%以上。

实施例2

本实施例中法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽在制备抑制法氏囊活性肽BPP-II抗小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖的药物方面的应用。

本实施例中BPP-II特异性结合多肽采用通用的固相多肽合成方式合成，用反向高效液相色谱法进行纯化，纯化后冻干为95%以上纯度级别的多肽粉末。取多肽粉末与医药领域常规辅料混合，即得抗小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖的药物。或者先将多肽粉末用PBS缓冲液溶解，配制成不同浓度的多肽溶液，用于抑制BPP-II抗肿瘤增殖试验。

试验例

BPP-II特异性结合肽在对BPP-II功能的影响方面的应用

（1）BPP-II对小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖的影响

将WEHI-231细胞培养至2×10⁵cells/mL，重悬后分装至96孔细胞培养板中，均分为5组，第1组加入PBS作为空白对照，第2-5组分别加入0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL浓度的BPP-II，刺激48h后，通过标准MTT法检测BPP-II对小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖的影响。

相对细胞增殖率的计算公式见下式（2）：

相对细胞增殖率=实验组OD值/对照组OD值×100% （2）

细胞抑制率的计算公式见下式（3）：

细胞抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100% （3）

结果显示，BPP-II在2μg/mL和20μg/mL浓度下能够抑制小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞的增殖，浓度为20μg/mL时对其抑制作用显著，抑制率为12.6%（P<0.05）（见图3）。

（2）BPP-II特异性结合肽对BPP-II抗小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖功能的影响

为分析BPP-II特异性结合肽对小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖的影响，将WEHI-231细胞约2×10⁵cells/mL重悬后分装至细胞培养板中，实验分为四组，P3-12肽组：设四个浓度（0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL）；P5-12肽组和P6-12肽组浓度设置同P3-12肽组，同时以PBS为空白对照组，各组刺激细胞48h后，通过MTT法检测不同组WEHI-231细胞增殖情况，分析BPP-II特异性结合肽对WEHI-231细胞增殖的影响。

为进一步分析BPP-II结合肽对BPP-II抗小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖功能的影响，将WEHI-231细胞约2×10⁵cells/mL重悬后分装至细胞培养板中，实验分为五组，第1组为加PBS空白对照组，第2组为加20μg/mL BPP-II单独刺激组，第3组为加20μg/mLBPP-II+P3-12肽组，P3-12肽设置不同浓度（0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL），第4组为加20μg/mL BPP-II+P5-12肽组，第5组为加20μg/mL BPP-II+P6-12肽组，第4组和第5组中12肽浓度设置和第3组相同。各组刺激细胞48h后，通过MTT法检测WEHI-231细胞增殖情况。

实验同时设置无关G-G-G-G-S五肽（由上海科肽生物有限公司合成，纯度95%以上）作为对照，实验分为3组，第1组为加PBS空白对照组，第2组为加20μg/mL BPP-II单独刺激组，第3组为加20μg/mL BPP-II+G-G-G-G-S五肽组，G-G-G-G-S五肽设置四个浓度（0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL），刺激细胞48h后，通过MTT法检测WEHI-231细胞增殖情况。

结果显示，与PBS空白对照组相比，人工合成的P3-12、P5-12和P6-12肽在不同浓度（0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL）下刺激小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞时，细胞相对增殖率均无显著变化（图4）（P>0.05），表明BPP-II结合肽P3-12、P5-12和P6-12本身对WEHI-231细胞的增殖无明显影响。不同浓度（0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL）的P3-12、P5-12、P6-12肽与20μg/mL BPP-II联合刺激细胞，分别设PBS组、不同浓度（0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、20μg/mL）的无关G-G-G-G-S五肽和BPP-II单独刺激组作为对照，结果显示，P3-12肽在2μg/mL和20μg/mL浓度下能够显著抑制BPP-II抗小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖功能（P<0.05）（图5）；P5-12和P6-12肽在20μg/mL浓度下能够显著抑制BPP-II抗WEHI-231细胞增殖功能（P<0.05）（图5）；而无关G-G-G-G-S五肽对BPP-II抗WEHI-231细胞增殖功能无明显影响（P>0.05）（图6）。以上结果表明，BPP-II特异性结合肽（P3-12、P5-12和P6-12）在一定浓度下均可抑制BPP-II抗小鼠WEHI-231B淋巴瘤细胞增殖活性。

Claims (4)

1.一种法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-或SEQ ID NO.2所示。

2.一种如权利要求1所述的法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽的应用，其特征在于：法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽在制备抑制法氏囊活性肽BPP-II抗肿瘤细胞增殖活性的药物方面的应用。

3.根据权利要求2所述的法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽的应用，其特征在于：所述的肿瘤细胞为淋巴瘤细胞。

4.根据权利要求3所述的法氏囊活性肽BPP-II特异性结合肽的应用，其特征在于：所述的淋巴瘤细胞为小鼠WEHI-231 B淋巴瘤细胞。