CN100349914C - 人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列 - Google Patents

人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列 Download PDF

Info

Publication number
CN100349914C
CN100349914C CNB2005100428104A CN200510042810A CN100349914C CN 100349914 C CN100349914 C CN 100349914C CN B2005100428104 A CNB2005100428104 A CN B2005100428104A CN 200510042810 A CN200510042810 A CN 200510042810A CN 100349914 C CN100349914 C CN 100349914C
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
cell
gastric cancer
huvecs
blood vessel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2005100428104A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1709905A (zh
Inventor
梁树辉
丁杰
林涛
潘阳林
吴开春
樊代明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fourth Military Medical University FMMU
Original Assignee
Fourth Military Medical University FMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fourth Military Medical University FMMU filed Critical Fourth Military Medical University FMMU
Priority to CNB2005100428104A priority Critical patent/CN100349914C/zh
Publication of CN1709905A publication Critical patent/CN1709905A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100349914C publication Critical patent/CN100349914C/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于生物医学技术领域,具体涉及采用噬菌体肽库体外筛选所得到的人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽(GEBPs)。本发明利用Transwell共培养技术构建人胃癌血管内皮细胞体外培养模型,通过噬菌体肽库体外筛选,成功获得能与人胃癌血管内皮细胞特异结合的短肽,经体外细胞结合实验、免疫细胞/组织化学染色、体外结合竞争抑制实验、免疫荧光检测等方法进行鉴定,证实了短肽与胃癌血管内皮细胞结合的特异性。这些短肽在胃癌诊断、血管靶向治疗以及胃癌血管生成相关分子的研究等方面具有一定的理论意义和重大的潜在应用价值。

Description

人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列
                       技术领域
本发明属于生物医学技术领域,具体涉及采用噬菌体肽库体外筛选所得到的人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列GEBPs。
                       背景技术
胃癌是一种常见的恶性肿瘤,传统的治疗方式如手术、化疗和放疗,不能取得理想的治疗效果。研究发现,血管生成是实体肿瘤生长和转移的重要条件之一,肿瘤血管抑制治疗已成为目前肿瘤治疗研究领域的一个热点,并显示出了良好的治疗前景。然而,一些进入临床试验的血管抑制剂却难以达到动物试验中所显示的抑癌效果,临床效果并不令人满意。究其原因,最突出的问题之一就是这些用于临床试验的血管生成抑制剂没有选择性,广泛作用于全身血管,难以在肿瘤局部形成较高的药物浓度,即治疗的肿瘤血管靶向性不强。研究表明,肿瘤血管不同于正常血管,具有异常的解剖特征及分子异质性,肿瘤血管表达一些被称为“vascular zip codes”的与正常血管不同的特异性蛋白(Cancer Cell.2003;4(5):331-333)。由于胃癌微血管内皮细胞体外培养困难,异质性分子的表达量较低,用常规的方法难以检测、分离和纯化,所以目前尚未发现明确的胃癌血管内皮细胞特异性分子。
                       发明内容
本发明的目的在于提供一种建立胃癌血管内皮细胞体外培养模型、进行噬菌体肽库体外筛选及鉴定筛选结果结合活性的方法,特别是提供能与胃癌血管内皮细胞特异结合的短肽系列(GEBPs)。
本发明的技术方案是:提供人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列,其特征是:它们分别由9个氨基酸组成,两端各一个半胱氨酸形成二硫键,从而形成环状,其氨基酸序列如下列之一
短肽名称      氨基酸序列(N→C)
GEBP11:      CTKNSYLMC
GEBP3:       CPPSKMSQC
GEBP6:       CLSSSLSDC
GEBP9:       CKNSLTMAC
GEBP12:      CTNTMLPQC
GEBP1:       CPVSLQALC
GEBP2:       CDRHNLTFC
GEBP4:       CSSTTPNAC
GEBP5:       CQPALQMKC
GEBP13:      CTTTDLRAC
GEBP14:      CIPTHPRLC
GEBP15:      CNSTKYNQC
所述的人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列,其实现方法是:通过Transwell共培养技术构建人胃癌血管内皮细胞体外培养模型,利用共培养内皮细胞筛选噬菌体肽库,进而挑取噬菌体单克隆,进行测序鉴定。
所述的人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列,其实现方法是:用于筛选噬菌体肽库的人胃癌血管内皮细胞体外培养模型,采用带有0.4μm孔径半透膜的Transwell培养皿将人胃腺癌细胞SGC7901、正常人脐静脉内皮细胞(HUVECs)进行间接共培养,它们通过分泌可溶性因子相互作用,诱导相应分子表达的变化。
所述的人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列,其实现方法是:噬菌体肽库筛选以经典亲和筛选方法为基础,采用了液相结合、逐渐增加筛选强度、多轮消减等优化措施,增加了获得高亲和力、特异结合噬菌体克隆的概率,并且对投入下一轮筛选噬菌体克隆的挑选和扩增方法进行改进,以大量挑取单克隆和分组进行分别扩增的方法相结合,降低了偏态扩增的风险,逐渐缩小了筛选库容量,保证了筛选的顺利进行。
本发明的特点是:由于目前研究认为,血管异质性的出现是内皮细胞与组织微环境相互作用的结果,同时受全身因素的影响,不同组织内皮细胞所处微环境不同,其表型及生长特性也出现差异。肿瘤血管内皮细胞存在于特殊的肿瘤微环境中,因此会出现相应的异质性分子特征,正是这些仅在肿瘤血管表达而在正常血管内皮细胞中不表达或仅痕量级表达的特异性分子,有可能成为肿瘤血管治疗的关键靶标。最近的研究提示,与肿瘤细胞体外共培养可以诱导内皮细胞发生类似体内肿瘤环境中内皮细胞的变化(Microvascular Res.2002;63:316),肿瘤细胞分泌的可溶性因子可能在这一诱导过程中起重要作用。有学者将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人神经胶质瘤U87MG细胞共培养,发现内皮细胞的基因表达发生了变化,出现了Tie2受体、VEGF1受体、FGF2受体等肿瘤血管内皮细胞特有的基因表达(J Cell Sci.2003;116(6):1013);通过前列腺癌细胞与骨髓内皮细胞的立体共培养发现,内皮细胞的生长被癌细胞或其条件培养基抑制,内皮细胞发生明显形态学改变:形大,分枝状,条索状结构,模仿血管生成,但并不引起非骨髓内皮细胞的形态学变化,这与临床上前列腺癌具有向骨髓转移的倾向性相一致(2005 Jan;Epubahead of print);也有人利用双层培养皿间接共培养内皮细胞与肿瘤细胞,再现了体内肿瘤内皮细胞的单层膜状结构,成功模拟了肿瘤微环境pH值较低、血管通透性增加等特征(肿瘤.2004;24(3):226-229)。上述研究表明,通过共培养的方法,不仅可以模拟内皮细胞的生长微环境,还可以再现肿瘤血管内皮细胞单层膜状结构的特征及功能,这就为通过共培养技术建立胃癌血管内皮细胞体外模型提供了理论依据,在此基础上研究胃癌血管内皮细胞的异质性分子。
近年来,噬菌体表面呈现技术不断发展和完善,它将外源蛋白的基因型与表型联系在一起,把与其它分子的结合活性与噬菌体的可扩增性统一起来,目前已经成功构建了多种类型的噬菌体随机肽库。进行噬菌体肽库筛选,不需预先知道受体分子的结构信息,能够得到与低浓度靶分子特异结合的短肽,是一种高效的筛选体系,操作简便,已成功地应用于抗原表位筛选、疫苗研制、辅助药物设计、复杂生物系统特异结合短肽的筛选等领域,为相关研究提供了全新的思路与先进的手段(US.Patent.No.5,866,363)。Arap等采用噬菌体呈现技术发现能与前列腺癌血管特异结合的短肽“SMSIARL”(Proc Natl Acad Sci USA.2002;99:1527-1531/US.Patent.No.6,610,651)。Hoffman等发现CGKRK和CDTRL能够特异结合于由HPV16诱导的小鼠皮肤鳞癌的新生血管,而与正常皮肤或其它器官的血管不结合(Cancer Cell.2003;4(5):383-391)。采用此项技术,可以先获得胃癌血管内皮细胞特异性结合的短肽,进而寻找其结合受体。
综上所述,基于共培养技术建立胃癌血管内皮细胞体外培养模型,以及不断发展、完善的噬菌体随机肽库筛选技术,为胃癌血管内皮细胞异质性分子的探索和研究提供了可供选择的解决途径。目前,由于肿瘤微血管内皮细胞体外培养的困难,相关的噬菌体肽库筛选多采用基于动物模型的体内筛选(专利申请号:200410026137.0,200310122611.5;Cancer Biol Ther.2004;3(12):1232-5)。但是,进行体内筛选影响因素较多,筛选条件难以严格控制,并且移植瘤组织中的血管为动物源性或难以确定,这些问题都可能影响到筛选结果,而体外细胞筛选则不存在这些问题。采用与胃癌细胞共培养的内皮细胞代替胃癌微血管内皮细胞进行筛选,具有充分的理论依据和实验基础,这就避开了胃癌微血管内皮细胞体外培养的难题,目前还没有见到将噬菌体肽库筛选技术和共培养模型相结合,进行肿瘤血管内皮细胞异质性分子研究的报道。如果获得能与胃癌血管内皮细胞特异结合的短肽具有重要的应用价值和研究意义,有可能为胃癌的诊断、抗血管靶向治疗提供新的候选分子,为进一步寻找该短肽的结合受体并研究其功能奠定实验基础。
本发明应用Transwell共培养技术,建立了胃癌细胞-内皮细胞体外共培养模型,初步鉴定表明,共培养细胞发生了类似体内肿瘤环境中的表型变化,比如,内皮细胞增殖被促进,粘附力未见明显变化,而胃癌细胞增殖受到抑制,粘附力降低,共培养微环境呈现出变酸趋势等,与多数文献报道一致。在噬菌体肽库筛选过程中,采用液相结合、逐渐增加筛选强度、多轮消减筛选等一系列措施优化体外全细胞筛选方案,更为重要的是,对于投入下一轮筛选噬菌体克隆的挑取及扩增方法进行了改进,结果噬菌体在靶细胞上富集明显,并通过进一步实验鉴定了所得短肽的结合特异性,取得了理想的结果。这一方面表明,此程序是一种有效的体外全细胞筛选方案,另一方面也说明,基于共培养技术的胃癌血管内皮细胞体外培养模型,是一种理想的胃癌血管内皮细胞异质性分子研究的技术平台。本发明采用体外分离、培养及鉴定人脐静脉内皮细胞(HUVECs),用Transwell双层培养皿与人胃腺癌细胞SGC7901共培养,建立胃癌血管内皮细胞体外培养模型;通过噬菌体肽库筛选,获得与胃癌血管内皮细胞具有高结合活性的噬菌体短肽;并利用噬菌体细胞结合实验、免疫细胞/组织化学染色、细胞结合竞争抑制实验、免疫荧光检测等方法鉴定了GEBPs的结合活性及特异性;经过氨基酸序列的同源性分析,确认所得GEBPs氨基酸序列的唯一性。结果筛选得到12个噬菌体克隆及其呈现的环状短肽序列,其中有5个噬菌体克隆及其呈现短肽在胃癌血管内皮细胞及HUVECs上有明显的差异性结合。这些短肽对于胃癌诊断、血管靶向治疗及胃癌血管生成相关分子的研究,具有重要的潜在应用价值及重大的理论意义。
下面结合实施例附图对本发明作进一步的详细说明。
                      附图说明
图1是内皮细胞与胃癌细胞体外共培养模型示意图。
图2是噬菌体肽库体外筛选流程图。
图3是四轮筛选中噬菌体在Co-HUVECs上逐渐富集图示。
图4是12个噬菌体克隆与Co-HUVECs结合特异性的ELISA鉴定结果图示。
图5是IN11噬菌体体外活细胞结合实验结果图示。
图6是IN11噬菌体的免疫细胞化学染色鉴定结果图示。
图7是IN11噬菌体的免疫组织化学染色鉴定结果图示。
图8是细胞结合竞争抑制实验结果图示。
图9是GEBP11合成肽与Co-HUVECs结合特异性的免疫荧光检测结果图示。
图10是GEBP11合成肽与胃癌组织血管结合特异性的免疫荧光检测结果图示。
                   具体实施方式
胃癌血管内皮细胞表面分子标记物是胃癌血管抑制治疗的关键靶标,申请人通过噬菌体随机肽库体外全细胞筛选,成功地获得了一组人胃癌血管内皮细胞的特异性结合环状短肽GEBPs,并利用噬菌体细胞结合实验、免疫细胞/组织化学染色、细胞结合竞争抑制实验、免疫荧光检测等方法鉴定了GEBPs的结合特异性。
具体方法如下:
1.人胃癌血管内皮细胞体外培养模型的建立
1.1.原代分离和培养HUVECs
参照Jaffe等人的方法加以改良,进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的原代分离和培养,新生儿脐带来源于第四军医大学第一或第二附属医院妇产科。采用倒置显微镜下细胞形态及生长特性的观察、免疫细胞化学染色(VIII因子及CD31,分别购于北京中山公司、美国Bio-Legend公司)、透射电镜下超微结构观察及管状结构形成试验(matrigel购于美国BD公司)等方法,鉴定所培养细胞为内皮细胞。
1.2.建立人胃癌血管内皮细胞体外培养模型
采用Transwell共培养技术,将HUVECs及人胃腺癌SGC7901细胞共培养于双层培养皿(购于美国Corning公司),两种细胞被带有0.4μm孔径的半透膜分隔开,它们通过分泌可溶性因子相互作用,诱导分子表达的变化(见图1)。通过共培养细胞生长特性观察、细胞消化实验、MTT细胞增殖实验、共培养微环境酸碱度测定等方法进行初步鉴定,发现共培养细胞发生了类似肿瘤环境中的表型变化,这就为筛选噬菌体肽库提供了技术平台。
2.噬菌体肽库的体外全细胞消减筛选
2.1.筛选流程
以人正常胃粘膜上皮细胞GES及正常人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为阴性消减细胞,与原始肽库共孵育(原始肽库购于New England Biolabs公司),取未结合的噬菌体再和共培养的内皮细胞(Co-HUVECs)共孵育,回收结合噬菌体,扩增后投入下一轮筛选,4轮后挑取噬菌体单克隆进行DNA序列测定(上海华诺公司)及同源性分析(见图2)。
2.2.体外筛选步骤
用EDTA(市售)细胞分离液收获对数生长期的GES细胞1×107,与取原始肽库10μl(2×1011pfu)混合,4℃孵育1.5h,800rpm,离心5min,收集上清,以同样的方法将HUVECs与回收的上清共孵育,再离心,收集上清。用EDTA收获亚融合状态的Co-HUVECs 1×107,与上述回收上清共孵育,离心,弃上清,用BF重悬Co-HUVECs,混旋3min后再离心,重复洗5遍,0.1%TBST洗1遍,PBS洗2遍。以pH2.2的甘氨酸洗脱缓冲液4℃洗脱10min,加入pH9.1的Tris/HCl中和缓冲液,离心,收集上清,即为膜洗脱噬菌体或膜结合噬菌体(Mp)。以含PMSF的TEA碱洗脱液4℃裂解洗脱5min,加入pH7.4的Tris/HCl中和缓冲液,离心,收集上清,即为裂解洗脱噬菌体或内化噬菌体(INp)。
2.3.噬菌体的体外扩增
铺制LB-Tet平板,并加入X-gal/IPTG(购于上海生工),颠倒培养后,随机挑取间距0.5cm以上、生长良好的蓝色噬斑400-500个,分为5部分分别加入宿主菌,37℃、250rpm振荡培养4-6h。将培养物4℃、10000rpm离心15min,上清与1/6体积的PEG/NaCl溶液4℃过夜。再离心,TBS重悬沉淀,微离心,将上清与1/6体积的PEG/NaCl溶液冰浴1h,离心,弃上清,以200μl 0.02%NaN3溶液重悬沉淀物,即为第一轮扩增的噬菌体。
2.4.下一轮筛选
将扩增后的膜洗脱噬菌体和裂解洗脱噬菌体各取1×1011pfu,投入下一轮筛选。筛选过程同前,共进行4轮筛选,逐渐增加筛选强度:与阴性细胞孵育的时间增加至2h,与靶细胞的孵育时间减为1h;BF、TBST、PBS混旋洗涤时间增至5min,TBST浓度渐增为0.2%、0.3%、0.5%。
2.5.阳性噬菌体克隆的挑选及测序
经过4轮筛选,从Co-HUVECs上回收的噬菌体显著增高,明显高于对照细胞(见图3)。铺制LB平板,随机挑取20个噬菌体单克隆(Mp、INp各10个),编号为M1-10,IN11-IN20,提取其单链DNA(DNA提取试剂盒购于上海华瞬公司),由上海华诺公司完成测序。除外IN17测序失败,部分克隆有重复序列,最终得到12个不同的噬菌体克隆(见表1),将其呈现短肽命名为GEBPs(Gastric cancer Endothelial cell BindingPeptides)。
表1  测序得到12个随机插入片段及其编码的短肽
  序号   噬菌体克隆   克隆编号   短肽编号   短肽序列(N→C)
  123456789101112   M1/M8M2M3M4M5M6/M10/IN18M9/IN16IN11/IN19/M7IN12IN13/IN20IN14IN15   M1M2M3M4M5M6M9IN11IN12IN13IN14IN15  2GEBP1GEBP2GEBP3GEBP4GEBP53GEBP62GEBP93GEBP11GEBP122GEBP13GEBP14GEBP15   C P V S L Q A L CC D R H N L T F CC P P S K M S Q CC S S T T P N A CC Q P A L Q M K CC L S S S L S D CC K N S L T M A CC T K N S Y L M CC T N T M L P Q CC T T T D L R A CC I P T H P R L CC N S T K Y N Q C
2,3表示该片段在所有测序克隆中重复出现的次数,未注明的均为1次
3.GEBPs氨基酸序列的同源性分析
3.1.12个GEBPs间的同源性分析
12个插入片段中,GEBP6、GEBP11重复频率最高,为3次。登陆ClustalW网站(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/),12个短肽氨基酸序列之间进行对比分析,部分序列呈现出较高的同源性,但没有发现普遍的共有序列(基序)模式。见表2所示。
表2  12个短肽序列同源性比较
Figure C20051004281000091
  GEBP2GEBP3GEBP53GEBP6GEBP14   CCCCC   D  R  H  N  L  T  FP  P  S  K  M  S  QQ  P  A  L  Q  M  KL  S  S  S  L  S  DI  P  T  H  P  R  L   CCCCC
2,3表示该肽段在所有测序克隆中的重复频率,未注明的均为1次
3.2.通过数据库检索进行同源性分析
登陆NCBI/BLAST网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/),搜索蛋白质数据库进行同源性分析,结果未发现含有与这些短肽氨基酸序列完全一致的蛋白质,GEBPs与某些蛋白质分子具有较好的同源性(见表3)。其中,GEBP11与脑特异性血管生成抑制分子-3(BAI-3)有5个氨基酸完全一致,而BAI-3分子与血管生成直接相关,因此GEBP11短肽可能具有潜在的研究价值。根据相关文献分析认为,GEBP11短肽可能与BAI-3蛋白具有相似的结合活性,它可能通过与BAI-3配体分子的结合,阻断了BAI-3蛋白与其配体分子的结合,从而终止相应的信号传递。以上仅是一种推测,GEBP11短肽的结合受体也完全可能是一种新分子,这都需要进一步的实验来证实。
表3  12个GEBPs短肽的蛋白质数据库检索同源性分析
  短肽名称     同源性分子   同源肽段数目 同源性(%)
  GEBP1GEBP2GEBP3GEBP4GEBP5GEBP6GEBP9GEBP11GEBP12     白细胞介素-28受体A锌指蛋白101TDE2LNCOA-3G-蛋白偶联受体与CDKN1A作用的锌指蛋白-1CCSP-2c-myc结合蛋白TIAM-1GCYS-20ICaBP钙结合区域BAI-3;Syne-1CAD-23UREB1     6/76/75/55/55/66/65/77/116/86/75/55/55/76/8     858510010083100716375851001007175
GEBP13GEBP14GEBP15   加压素前体TNFR相关死亡受体分泌型钙依赖激活蛋白-2信号转导子及转录激活子-1IFN-α2b诱导的相关蛋白-1癌易感性候选分子-1   5/76/95/55/65/65/5   71661008383100
注:TDE2L(tumor differentially expressed protein 2-like):肿瘤差异表达蛋白-2类似物;NCOA3(Nuclear receptor coactivator 3):核受体激活剂-3;CDKN(cyclin dependentkinase inhibitor):细胞周期蛋白依赖的激酶抑制因子;CCSP-2(colon cancer secretedprotein-2):结肠癌分泌蛋白-2;TIAM-1(T-cell lymphoma invasion and metastasis 1):T细胞淋巴瘤侵袭转移因子-1;GCYS-20(gastric cancer-related protein GCYS-20):一种胃癌相关蛋白GCYS-20;ICaBP(intestinal calcium binding protein):肠钙结合蛋白;BAI-3(brain-specific angiogenesis inhibitor 3):脑特异性血管生成抑制分子;Syne-1(Synaptic nuclear envelope protein 1):核膜连接蛋白-1;CAD23(cadherin 23):钙粘蛋白-23;UREB1(upstream regulatory element binding protein 1):上游调控元件结合蛋白-1;TNFR:肿瘤坏死因子受体;IFN-α2b:干扰素-α2b。
4.12个噬菌体克隆结合活性的ELISA鉴定
根据测序结果,以单独培养的HUVECs为对照细胞,用ELISA法初步鉴定测序成功的噬菌体克隆与Co-HUVECs的结合活性,排除假阳性或无差异结合的噬菌体。并设PBS对照及无关噬菌体(Unrelatedphages,URPh,原始肽库的扩增液)对照。实验步骤如下:
收集处于对数生长期的HUVECs、Co-HUVECs,铺于96孔板(每孔细胞数为1×105),培养4h使细胞贴壁、伸展,0.25%戊二醛(市售)中固定15min,4%H2O2室温封闭30min,1%BSA(购于北京鼎国公司)37℃封闭30min,分别加入1×1010pfu阳性噬菌体,37℃孵育2h。与HRP-抗M13IgG(购于美国Pharmacia公司)37℃孵育1h,TMB(购于万泰药业)显色30min,终止反应,450nm波长下测定OD值。实验重复3次,计算平均OD值,实验组OD值与对照组OD值之比≥2.1判定为阳性。数据以均数±标准差表示,SPSS软件进行统计学分析。结果显示,IN11、M3、M6、M9、IN12这5个噬菌体克隆在Co-HUVECs和HUVECs上有明显的差异性结合(见图4)。
5.5个差异结合噬菌体及其呈现环肽的结合特异性鉴定
以IN11噬菌体及其呈现短肽GEBP11为例,采用噬菌体细胞结合实验、免疫细胞/组织化学染色、细胞结合竞争抑制实验、免疫荧光检测等方法鉴定其结合活性及特异性。其它噬菌体克隆或短肽的鉴定,以同样方法进行。
5.1.体外细胞结合实验
为验证IN11噬菌体在Co-HUVECs上结合的特异性,以GES细胞、HUVECs为对照细胞,进行噬菌体体外结合实验。方法如下:收获对数生长期的GES细胞、HUVECs、Co-HUVECs各1×107个,将IN11噬菌体1×1010pfu分别与三种细胞共孵育,洗脱、回收、滴定噬菌体,比较三种细胞上的回收噬菌体量。结果发现,从Co-HUVECs上回收的IN11噬菌体滴度分别是对照细胞HUVECs、GES的5.7、16.9倍(见图5)。
5.2.免疫细胞化学染色鉴定
按常规免疫细胞化学染色步骤封闭完成后,先与IN11噬菌体1×1010pfu4℃孵育过夜,然后依次与鼠抗M13单体(购于美国Pharmacia公司)、抗鼠IgG二抗、SP复合物孵育,DAB显色(SP组化试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京中山公司)。PBS代替噬菌体,作阴性对照。参照Shimizu等的评分方法,依据棕色反应的阳性强度及阳性细胞的比例综合判断,评为阴性(-),弱阳性(+),阳性(++),强阳性(+++)。结果显示,IN11噬菌体在Co-HUVECs上呈强阳性,而对照细胞为阴性或弱阳性(见图6)。
5.3.免疫组织化学染色鉴定
检测IN11噬菌体同人胃癌血管的结合特异性。按常规免疫组化程序血清封闭结束后,与IN11噬菌体1×1010pfu 4℃孵育过夜,再依次与抗M13噬菌体单抗、二抗、SP复合物孵育,DAB显色。PBS代替一抗作阴性对照,同时用人CD31单抗显示血管作阳性对照,结果判定同前。结果胃癌组织呈阳性,血管结构显示清楚,而非癌人胃组织未见明显阳性反应(见图7)。
5.4.体外结合竞争抑制实验
为明确IN11噬菌体是否通过其表面呈现的GEBP11短肽特异结合于Co-HUVECs,可以利用GEBP11的人工合成肽对IN11噬菌体的特异性结合进行干预,通过以下两种方式进行竞争抑制实验。体外活细胞结合竞争抑制实验:与体外细胞结合实验相似,收获7组对数生长期的Co-HUVECs 1×107,6个实验组细胞先与浓度分别为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml的合成肽GEBP11(上海吉尔生化公司),4℃孵育2h,BF代替GEBP11为对照组。然后分别与1×1010pfu的IN11噬菌体4℃孵育2h,洗脱、回收并滴定结合噬菌体。竞争抑制ELISA实验:与ELISA操作相似,在加入1%BSA封闭完成后,各孔先加入浓度分别为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml的GEBP11合成肽及BF液100μl,37℃孵育30min,再与1×1010pfu的IN11噬菌体37℃孵育2h,然后加一抗、TMB,测定光密度OD值。计算合成肽GEBP11对IN11噬菌体结合的竞争抑制率:抑制率=(对照组回收噬菌体的数量或OD值-实验组回收噬菌体的数量或OD值)/对照组回收噬菌体的数量或OD值×100%,作出抑制率-合成肽浓度曲线。结果随着GEBP11浓度的增高,抑制率逐渐上升,在100-400μg/ml时,抑制率维持在较高水平,表明GEBP11合成肽对IN11噬菌体在Co-HUVECs上的结合有竞争抑制作用(见图8)。
5.5.GEBP11合成肽结合特异性的免疫荧光检测
采用免疫荧光技术鉴定FITC-GEBP 11合成肽与Co-HUVECs及胃癌血管结合的特异性,以HUVECs、非癌人胃组织作对照。细胞爬片及组织切片经正常血清封闭后,加入100μg/ml的FITC-GEBP11约100μl,37℃孵育1h,振荡洗涤5min×3次,于荧光显微镜下观察比较。结果发现,Co-HUVECs及胃癌组织呈阳性,而对照细胞或组织呈阴性或弱阳性,这表明,GEBP11短肽确实能够特异性结合于胃癌血管内皮细胞,而与非癌人胃组织血管未见明显结合(见图9、10)。
本发明采用噬菌体随机肽库,筛选得到能与胃癌血管内皮细胞结合的高特异性结合环状短肽GEBPs,经体外细胞结合实验、免疫细胞/组织化学染色、体外结合竞争抑制实验、免疫荧光检测等方法进行鉴定,均显示GEBPs短肽与胃癌血管内皮细胞结合的特异性。这表明,本发明所建立的胃癌血管内皮细胞体外培养模型是一种成功的模型,可以作为人胃癌血管内皮细胞异质性分子研究的技术平台。经氨基酸序列的同源性分析,在目前蛋白质数据库中未发现含有与本发明氨基酸序列完全一致的蛋白分子,因此本发明具有唯一性。
这些环肽的发现,在胃癌的诊断、血管靶向治疗以及胃癌血管生成相关分子的研究等方面,具有的潜在的应用价值及理论研究意义。现可用于以下几个方面:
1.胃癌诊断试剂盒的研制
将本发明中发现的环状短肽与荧光物质、同位素等物质偶联,或者通过制备其单克隆抗体等方式,研制开发用于胃癌诊断的试剂盒,如果在更大标本范围内通过鉴定,有望成为胃癌早期诊断的一种途径。
2.血管靶向药物的构建
如果短肽具有生物学活性,那么可以在此基础上,直接研发具有血管生成调节作用的短肽药物。如果短肽没有生物学活性,也可以用它作为胃癌血管的靶向工具,用于胃癌血管靶向治疗,比如构建如下的胃癌血管靶向药物。血管靶向性腺病毒介导siRNA的构建:将本发明中这些特异性环肽用腺病毒pAdeasy系统改造为特异性靶向胃癌血管内皮的基因治疗载体,并借助该载体将KDR、Raf-1等血管生成相关分子的siRNA特异性导入胃癌血管内皮细胞,干扰其RNA水平的表达,抑制血管内皮细胞增殖和迁移,最终达到血管靶向性抑制胃癌的目的。血管靶向性复合肽的构建:将本发明中发现的特异性环肽同一种生物活性肽D(KLAKLAK)2或TNF等分子连接,利用本发现中环肽特异性结合血管内皮细胞的能力和生物活性肽的细胞抑制或杀伤作用,使复合肽靶向破坏胃癌血管内皮细胞,从而达到胃癌血管抑制治疗的目的。
3.GEBPs短肽结合靶分子的研究
通过对血管内皮细胞cDNA表达文库的筛选或亲和层析等方法,可以用GEBPs短肽为诱饵钓取其结合靶分子或其编码基因,从而阐明短肽与血管内皮细胞特异性结合的分子基础,并进一步研究此靶分子的功能,如果该靶分子在血管发生中发挥重要作用,有可能成为胃癌治疗新的靶分子。
此外,通过蛋白质数据库检索,虽然没有发现含有与本发明GEBPs氨基酸序列完全一致的蛋白质分子,但是部分蛋白质与某些短肽表现出了较好同源性,其中不乏与肿瘤或血管生成密切相关的分子,GEBPs可能与这些蛋白具有相似的结合活性,但也可能没有任何关系,而是模拟了某些蛋白质分子非相邻氨基酸经空间折叠之后所形成的空间构象的结合能力。通过对GEBPs短肽空间结构的计算机模拟分析,推测其结合结构域,有可能为其特异性的结合活性提供合理的解释或寻找其结合受体分子提供有益的线索。
附图中图1是内皮细胞与胃癌细胞体外共培养模型示意图,图中:1、TRANSWELL上室;2、TRANSWELL下室;3、0.4μm孔径的半透膜;4、双层细胞通过可溶性分子相互影响;5、培养液;6、HUVECs;7、SGC7901细胞。HUVECs(6)接种于TRANSWELL上室(1),SGC7901细胞(7)接种于TRANSWELL下室(2),上下两室培养液(5)保持液面平衡,两种细胞被0.4μm孔径的半透膜(3)分开,双层细胞通过分泌可溶性因子相互影响(4),诱导分子表达的变化。
图2是噬菌体肽库体外筛选流程图,如图2所示,与GES细胞、HUVECs不结合的噬菌体再与Co-HUVECs共孵育,回收并扩增与其结合的噬菌体,重复进行四轮筛选。
图3是四轮筛选中噬菌体在Co-HUVECs上逐渐富集结果图示,当R1→R4,从Co-HUVECs回收的噬菌体滴度增加数百、上千倍,而噬菌体在对照细胞HUVECs、GES上保持低水平结合或逐渐降低。
图4是12个噬菌体克隆与Co-HUVECs结合特异性的ELISA鉴定结果图示,图中白色柱表示Co-HUVECs,黑色柱表示HUVECs。在12个噬菌体克隆中,IN11、M3、M6、M9、IN12这5个克隆能特异性结合于Co-HUVECs。
图5是体外活细胞结合实验结果图示,图中白色柱表示IN11噬菌体,黑色柱表示URPh,即无关噬菌体。IN11噬菌体在Co-HUVECs上的回收量分别是对照细胞HUVECs组、GES组的5.7、16.9倍。这提示IN11噬菌体与Co-HUVECs具有特异结合活性。
图6是IN11噬菌体的免疫细胞化学染色鉴定(SP法,×400),图中A:IN11噬菌体在Co-HUVECs上的染色;B:PBS阴性对照;C:IN11噬菌体在对照细胞HUVECs上的染色D:IN11噬菌体在对照细胞GES上的染色。图A可见Co-HUVECs中出现棕褐色沉淀颗粒,以胞膜、核周胞浆为著,即为强阳性。图B中无棕色颗粒,为阴性。图C,D中出现较弱的棕黄色沉淀颗粒,为弱阳性或阴性。比较A、B、C、D表明,IN11噬菌体能与Co-HUVECs特异性结合,而与HUVECs或GES细胞不结合或弱结合,两者相比有显著差异。
图7是IN11噬菌体的免疫组织化学染色鉴定(SP法,A/B×200,C/D×100)图示,图中A:IN11噬菌体在胃癌组织上的染色;B:PBS阴性对照;C:CD31阳性对照;D:IN11噬菌体在非癌人胃组织(慢性浅表性胃炎,CSG)上的染色。图A中胃癌组织血管内皮细胞出现棕色沉淀颗粒,血管结构显示清楚,呈阳性,与图C的CD31阳性对照相似。图B中无棕色颗粒,为阴性。图D中非癌人胃组织未见棕色沉淀颗粒,呈阴性。比较A、B、C、D表明,IN11噬菌体能特异结合于胃癌血管内皮细胞,而与非癌人胃组织血管内皮细胞无明显结合,两者相比有显著差异。
图8是细胞结合竞争抑制实验图示,图中实线表示活细胞结合竞争抑制实验,虚线表示竞争ELISA实验。两种实验结果均表明,随着GEBP11合成肽浓度的增高,抑制率不断上升,当GEBP11浓度在100-400μg/ml时,抑制率维持在较高水平。这说明GEBP11合成肽对IN11噬菌体在Co-HUVECs上的结合活性有竞争抑制作用。
图9是GEBP11合成肽与Co-HUVECs结合特异性的免疫荧光检测(×200)图示,图中A:GEBP11合成肽在Co-HUVECs上的免疫荧光检测;B:GEBP11合成肽在HUVECs上的免疫荧光检测。图A可见,Co-HUVECs胞膜、胞浆发出绿色荧光,呈阳性。图B中HUVECs未见明显绿色荧光,为阴性。这表明GEBP11合成肽能特异结合于Co-HUVECs上,而与HUVECs无明显结合。
图10是GEBP11合成肽与胃癌组织血管结合特异性的免疫荧光检测(×200)图示,图中A:GEBP11合成肽在人胃癌组织上的免疫荧光检测;B:GEBP11合成肽在非癌人胃组织(慢性萎缩性胃炎,CAG)上的免疫荧光检测。图A可见人胃癌组织血管结构清晰,发出绿色荧光,呈阳性。而图B中非癌人胃组织未见绿色荧光,为阴性。这表明GEBP11合成肽能特异结合于胃癌组织血管,而与非癌人胃组织血管无明显结合。

Claims (1)

1、人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列,其特征是:它包含9个氨基酸,两端各一个半胱氨酸形成二硫键,从而形成环状,其氨基酸序列如下:
短肽名称     氨基酸序列(N→C)
GEBP11:     CTKNSYLMC
GEBP3:      CPPSKMSQC
GEBP6:      CLSSSLSDC
GEBP9:      CKNSLTMAC
GEBP12:     CTNTMLPQC
GEBP1:      CPVSLQALC
GEBP2:      CDRHNLTFC
GEBP4:      CSSTTPNAC
GEBP5:      CQPALQMKC
GEBP13:     CTTTDLRAC
GEBP14:     CIPTHPRLC
GEBP15:     CNSTKYNQC
CNB2005100428104A 2005-06-14 2005-06-14 人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列 Expired - Fee Related CN100349914C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005100428104A CN100349914C (zh) 2005-06-14 2005-06-14 人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005100428104A CN100349914C (zh) 2005-06-14 2005-06-14 人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1709905A CN1709905A (zh) 2005-12-21
CN100349914C true CN100349914C (zh) 2007-11-21

Family

ID=35706200

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2005100428104A Expired - Fee Related CN100349914C (zh) 2005-06-14 2005-06-14 人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN100349914C (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517214A (zh) * 2012-01-13 2012-06-27 王秀梅 一种评价细胞迁移行为的细胞培养器

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100376690C (zh) * 2006-01-28 2008-03-26 中国人民解放军第四军医大学 人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列
CN101927008B (zh) * 2009-08-06 2012-10-31 中国人民解放军第四军医大学 诊断及治疗型胃癌血管特异结合肽gebp11同位素探针
CN102409024A (zh) * 2010-09-25 2012-04-11 上海市计划生育科学研究所 构建前列腺癌细胞体外浸润模型
CN101985599A (zh) * 2010-11-15 2011-03-16 中国科学院深圳先进技术研究院 体外光调控的细胞共培养装置
CN103288927B (zh) * 2013-05-31 2014-09-10 陕西师范大学 Sgc-7901细胞表面特异性结合的多肽
CN103446597B (zh) * 2013-09-04 2015-08-19 中国人民解放军第四军医大学 用于动脉粥样硬化易损斑块mri/pet双模态分子影像学成像探针的制备方法
CN108424852B (zh) * 2018-03-14 2021-04-27 张洪剑 模拟血管壁受力作用的transwell细胞培养装置
CN110724633A (zh) * 2019-11-11 2020-01-24 浙江汇泽医药科技有限公司 一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺
CN112379101A (zh) * 2020-10-27 2021-02-19 宁夏医科大学 一种VEGF-CXCL8-Akt的Crosstalk机制的研究方法及其应用
CN112999152B (zh) * 2021-02-26 2023-04-07 遵义医科大学附属医院 一种基于gebp11修饰的靶向聚合物胶束及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1580075A (zh) * 2004-05-17 2005-02-16 中国人民解放军第四军医大学 11段人消化道肿瘤血管特异性结合环肽gx系列

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1580075A (zh) * 2004-05-17 2005-02-16 中国人民解放军第四军医大学 11段人消化道肿瘤血管特异性结合环肽gx系列

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人胃癌血管特异性结合多肽的体内筛选及其三维结构模拟的初步分析 郅敏等,第四军医大学学报,第25卷第21期 2004 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517214A (zh) * 2012-01-13 2012-06-27 王秀梅 一种评价细胞迁移行为的细胞培养器

Also Published As

Publication number Publication date
CN1709905A (zh) 2005-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100349914C (zh) 人胃癌血管内皮细胞特异结合短肽系列
Gomez-Pinilla et al. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract
CN105209489B (zh) 针对间质和上皮-间质转化的循环肿瘤细胞的特异性检测工具
CN105198964B (zh) 一种肿瘤靶向多肽、其制备方法及应用
CN111253472B (zh) 一种靶向多种肿瘤细胞的新型多肽及其用途
CN104387453A (zh) 树突状细胞靶向肽及编码基因及应用
CN103626865B (zh) 具有趋化活性的分泌蛋白及其编码序列和医药用途
CN100376690C (zh) 人胃癌耐药细胞特异结合及耐药逆转短肽筛选方法及序列
CN108912212B (zh) 一种与cd105特异性结合的多肽及其应用
CN106701902A (zh) Foxr2基因和表达产物在肝癌诊断与治疗中的应用
CN105037499A (zh) 利用噬菌体抗体库针对人组胺受体4(hr4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法
CN1224631C (zh) 11段人消化道肿瘤血管特异性结合环肽系列
CN112358531B (zh) 靶向her2蛋白的多肽及其应用
CN105873950A (zh) 用于治疗和诊断癌症的抗s100a7抗体
CN101225108A (zh) 人血管内皮细胞生长因子受体3结合肽及其筛选方法
CN101503473A (zh) 一种用于肺癌体内外诊断或治疗的靶向性多肽及其应用
CN101838310B (zh) 碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽t3及其应用
CN101255190B (zh) 一种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用
CN108866066B (zh) 一种检测人纤维肉瘤细胞的核酸适体及其在制备检测制剂中的应用
CN105713070A (zh) 人乳腺癌细胞特异性结合的多肽及其应用
CN1560073A (zh) 碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟短肽及其筛选与用途
CN1546522A (zh) 一种碱性成纤维细胞生长因子抗原表位模拟肽及其筛选
CN113527429B (zh) 人肝癌细胞特异结合多肽及其用途
CN116375802B (zh) 一种小窝膜联蛋白AnnA1的亲和多肽及应用
CN108822189A (zh) 一种靶向结合淋巴癌细胞系的特异性多肽及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20071121

Termination date: 20190614