CN110724633A - 一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺 - Google Patents

一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺。系统包括：加压组件、核酸提取与扩增组件和回收组件；核酸提取与扩增组件包括：依次相连接的细胞裂解单元，孔径筛选单元，和扩增单元；细胞裂解单元：用于接收样品，并对样品进行裂解；孔径筛选单元：用于接收经过裂解的样品，并对样品进行孔径筛选；扩增单元：用于接收经过孔径筛选的样品，并对样品进行扩增；回收组件，用于接收经过扩增的样品；加压组件，用于对样品施加压力以使样品依次经过细胞裂解单元、孔径筛选单元、扩增单元进入回收组件。本发明所提供的工艺和系统方便快速，并能藉由抽换、增减扩增单元的内容物，达到不同区段的核酸扩增、全基因组核酸扩增，具有广大的应用前景。

Description

一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺
技术领域
本发明涉及基因恒温扩增的快速定性检测技术领域，特别是涉及一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺。
背景技术
目前的核酸样品扩增或侦测，需要采样、提取、扩增，数个步骤需要一天以上时间完成，虽然行业常用步骤方法可以获得稳定、高质量、大范围的核酸扩增效果，但需要在有完整仪器配置的生物实验室进行复杂程序，无法在短时间完成。
核酸恒温扩增技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，其特点为扩增反应的全过程均在单一温度，反应时间大大缩短。其扩增反应可在单纯微小体积中进行，因此有利于单颗细胞到数千颗细胞的微小反应。但此类实验反应常常都被设计在微量离心管中进行。
DNA作为遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。提取基因组DNA是许多分子生物学实验的基础，在诸如基因组测序、Southern杂交、PCR扩增、构建BCA文库、分子克隆等常规实验中，获得高分子量、高纯度的基因组DNA是开展研究工作的重要前提。随着分子生物学技术的深入发展，在基因水平上对疾病进行检测、诊断已经成为临床诊断的一项基本技术手段；尤其是法医学中的个体识别、亲子鉴定等，对所提取基因组DNA的完整性及纯度要求更高。血液取材方便可靠，因此许多研究均以血液作为材料以提取完整的基因组DNA。而出于对实验成本、工作效率等多方面因素的考虑，研究人·员希望尽可能一次性获取最大采血量(2-10ml)的基因组DNA，以进行长期保存，满足长期、反复、多种研究的需要。
基因组DNA提取一般需遵循以下几个原则：1、保证提取的DNA具有一定的长度；2、纯化后不应存在对没有抑制作用的物质；3、排除有机溶剂和金属离子污染；4、蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度；5、排除其他核酸分子的污染。对于范围在2-10ml血样的基因组DNA提取，经典方法是用SDS、蛋白酶k消化，再用酚氯仿反复抽提，此过程不但用到了有毒的苯酚、氯仿，且操作繁琐、耗时耗力，极易造成样本的丢失和污染。目前市场上商品化的离心柱型试剂盒操作简单，但只满足100-500ul的全血提取需求，不适用于使用笔式安全采血针的血量。
发明内容
本发明提供一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺，以实现核酸处理效率与方便性提升。具体技术方案如下：
一种微量细胞核酸提取与扩增系统，包括：加压组件、核酸提取与扩增组件和回收组件；其中：
核酸提取与扩增组件，包括：依次相连接的细胞裂解单元，孔径筛选单元，和扩增单元；
其中，所述细胞裂解单元：用于接收样品，并对所述样品进行裂解；
所述孔径筛选单元：用于接收经过裂解的样品，并对所述样品进行孔径筛选；
所述扩增单元：用于接收经过孔径筛选的样品，并对所述样品进行扩增；
回收组件，用于接收经过扩增的样品；
加压组件，用于对样品施加压力以使所述样品依次经过所述细胞裂解单元、孔径筛选单元、扩增单元进入所述回收组件。
所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，优选地，所述细胞裂解单元为无菌滤纸，且所述无菌滤纸(能够)含有裂解液；所述裂解液选自NaOH、KOH、二硫苏糖醇(DTT)、蛋白酶K溶液(Protease K)中的一种或至少两种。
所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，优选地，所述细胞裂解单元的直径为第一设定直径。
所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，优选地，所述孔径筛选单元为滤膜，且所述滤膜(能够)含有缓冲液；所述滤膜具有设定孔径。
更优选地，所述缓冲液为Tris-HCl，且所述缓冲液中含有三氯乙酸(TCA/trichloroacetic acid)、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)、苯甲基磺酰氟(PMSF)或二异丙基氟磷酸(DFP)中的一种或至少两种。本发明所提供的技术方案中，含有上述成分可以终止裂解反应。
所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，优选地，所述滤膜的直径为第二设定直径。
所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，优选地，所述第一设定直径大于所述第二设定直径。
所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，优选地，所述扩增单元为无菌滤纸，所述无菌滤纸在使用时可为一层或数层，且所述无菌滤纸(能够)含有引物、酶、核酸、盐等反应物。
作为本领域技术人员，可依据选择的引物等反应物选择合适的实验方式。优选如下：引物、核酸和盐类反应物采用预浸润所述无菌滤纸的方式；酶等反应物采用滴加至所述无菌滤纸的方式。
所述引物可为A、T、C、G的任意组成,或是只有A与G组成的5-mer到20-mer(mer即单体单元)有修饰或无修饰的寡核苷酸。含有所述引物用于放大一个、数个或全基因组区域；作为本领域技术人员可以依据实际需要进行选择，在此不做进一步的特殊限定。
酶可选用克列诺酶(klenow fragment)、Phi29 DNA聚合酶(phi29 DNApolymerase)、Bst DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)、UvrD解旋酶(UvrD helicase)、DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase)等其中一种或合并数种。
本发明所提供的无菌滤纸还可进一步包括其他成分，如依不同扩增需求，加入适量的MgCl2、MnCl2、DMSO、NaH2PO4、KPO4、NaCl、KCl、(NH2)4SO4、dNTP等中的一种或至少两种，在此不做进一步的特殊限定。
本发明同时提供一种利用上述任一项技术方案所述微量细胞核酸提取与扩增系统进行微量细胞核酸提取与扩增系统的工艺，包括如下步骤：
取得样品，以所述加压组件将所述样品注入所述细胞裂解单元以裂解产生核酸；
将所述核酸注入所述孔径筛选单元，进行孔径筛选；
将筛选后的核酸注入所述扩增单元，以使核酸于所述扩增单元中进行基因组扩增；
将扩增后的核酸注入所述回收组件。
本发明所述的微量细胞核酸提取与扩增系统的工艺，优选地，直接将所述样品滴于所述细胞裂解单元上。
所述样品包括微量细胞、微生物和游离核酸中的一种，所述样品的体积为0.1-5uL。
本发明所述的微量细胞核酸提取与扩增系统的工艺，优选地，所述细胞裂解单元含有裂解液，所示裂解液选自NaOH、KOH、二硫苏糖醇、蛋白酶K溶液中的一种或至少两种；
和/或，所述孔径筛选单元含有缓冲液；
和/或，所述扩增单元含有引物。
作为本发明的优选的技术方案，所述的微量细胞为血液。
本发明提高了微量细胞的核酸处理效率与方便性，藉由采血片与恒温扩增结合，指尖血珠就能在采样装置提取与扩增核酸，并能利用后送等待时间完成实验。
整体而言，本发明所提供的工艺和系统具有方便快速的特点，并能藉由抽换、增减扩增单元的内容物，达到不同区段的核酸扩增、全基因组核酸扩增，具有广大的应用前景。
作为本发明的优选技术方案，提供一种微量细胞核酸提取与扩增系统的工艺，包括如下步骤：
1)获取样品0.1-5uL，沾于所述细胞裂解单元上，其中所述细胞裂解单元为无菌滤纸，且所述无菌滤纸含有所述裂解液；
以所述加压组件将所述样品注入所述细胞裂解单元静置20-60min以裂解产生核酸；
2)加压组件持续加压，使所述样品按照顺序依次通过孔径筛选单元和扩增单元后进入回收组件，静置4-10小时后冻于-20℃。
当然，实施本发明的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的微量细胞核酸提取与扩增系统结构示意图。
附图标记：
101：加压组件；
102：核酸提取与扩增组件；
103：回收组件；
104：细胞裂解单元；
105：孔径筛选单元；
106：扩增单元。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下各实施例中所涉及的实验器材、实验试剂，如无特殊说明均可从商业渠道获得。
实施例1
结合附图1，本实施例提供一种微量细胞核酸提取与扩增系统，包括：加压组件、核酸提取与扩增组件和回收组件；其中：
核酸提取与扩增组件，包括：依次相连接的细胞裂解单元，孔径筛选单元，和扩增单元；
其中，所述细胞裂解单元：用于接收样品，并对所述样品进行裂解；
所述孔径筛选单元：用于接收经过裂解的样品，并对所述样品进行孔径筛选；
所述扩增单元：用于接收经过孔径筛选的样品，并对所述样品进行扩增；
回收组件，用于接收经过扩增的样品；
加压组件，用于对样品施加压力以使所述样品依次经过所述细胞裂解单元、孔径筛选单元、扩增单元进入所述回收组件。
由此，所述的系统中各部件依序层迭，组成完整的实验反应；加压组件将样品注入裂解单元，裂解后细胞的释放出核酸，核酸进入通过孔径筛选单元，进行孔径的筛选，通过筛选的核酸进入扩增单元，核酸于扩增单元中进行单个、数个或全经基因组扩增。最后加压组件给予压力，将扩增单元和/或核酸冲入回收组件。
本实施例中所述的微量细胞核酸提取与扩增系统中，所述的加压组件可选择本领域常见的加压组件，作为举例，可选用胶加压头和加压夹的组合或其他组件。
优选地，所述细胞裂解单元为无菌滤纸，且所述无菌滤纸含有裂解液；所述裂解液选自NaOH、KOH、DTT中的一种或至少两种。由此，使用无菌滤纸简便易得，适宜实验室使用，无需使用昂贵的仪器或复杂的提取装置。
优选地，所述细胞裂解单元的直径为第一设定直径。更优选地，所述第一设定直径为1-2cm。由此，上述规格的细胞裂解单元可充分满足实验室提取扩增核酸的需求。
优选地，所述孔径筛选单元为滤膜，且所述滤膜含有缓冲液；所述滤膜具有设定孔径。更优选地，所述设定孔径为0.5um。由此，使用滤膜，方便易得，成本低廉，效果较好，可充分满足实验室做提取扩增核酸的要求。
更优选地，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。由此，适合核酸样品保存、以便接续其他实验的优势。
优选地，所述滤膜的直径为第二设定直径。更优选地，所述第二设定直径为0.5-1cm。由此，使用上述特定直径的滤膜，可满足提取的需求。
优选地，所述第一设定直径大于所述第二设定直径。由此，可避免样品浪费，使系统运行可靠。
优选地，所述扩增单元为无菌滤纸，且所述无菌滤纸含有引物。本领域技术人员可以理解，所述扩增单元不仅含有引物，还可含有核酸恒温扩增反应所需反应的其他成分。由此，使用无菌滤纸作为扩增单元，可在降低成本的同时，充分满足实验室提取扩增核酸的需求。
实施例2
本实施例提供一种利用实施例1中任一项技术方案所述微量细胞核酸提取与扩增系统进行微量细胞核酸提取与扩增系统的工艺，包括如下步骤：
1)获取指间血液0.1-5uL，沾于所述细胞裂解单元上，其中所述细胞裂解单元为两层无菌滤纸，且所述无菌滤纸含有1u mol NaOH与300p mol DTT；
将加压组件置于所述细胞裂解单元上方，所述加压组件内含有45uL ddH2O；对加压组件施加压力，使内部的ddH2O流出至所述细胞裂解单元上；
静置30min；
2)加压组件持续加压，ddH2O按照顺序依次通过孔径筛选单元和扩增单元后进入回收组件，室温静置6小时后冻于-20度。
其中，所述孔径筛选单元为滤膜，所述滤膜上含有0.4mmol Tris-HCl；
所述扩增单元为无菌滤纸，所述无菌滤纸含有15pmol TP53-FW(引物：ATGTAATAAAAGG(SEQ ID NO.1))、15pmol TP53-RE(引物：TGATCTAATACTT(SEQ ID NO.2))、60nmol MgCl2、60nmol(NH2)4SO4、25nmol DTT、8nmol dNTP、10U/1uL克列诺酶、10U/1uLPhi29 DNA聚合酶、和10U/1uL DNA拓扑异构酶。
本领域技术人员可以理解，上述的TP53-FW和TP53-RE分别具有括号内所示的序列。
本领域技术人员可以理解，实施例2中所涉及的裂解液、缓冲液、引物等反应物仅仅是作为一种实施方式，不应视为限制本发明所述保护范围的限定。作为本领域技术人员，可在实施例2的基础之上，依据实际的需要选择合适的裂解液、缓冲液、引物等所需反应物，也应涵盖在本发明的保护范围之内。
采用本发明所提供的微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺提高了微量细胞的核酸处理效率与方便性，藉由采血片与恒温扩增结合，指尖血珠就能在采样装置提取与扩增核酸，并能利用后送等待时间完成实验。具有方便快速的特点，并能藉由抽换、增减扩增单元的内容物，达到不同区段的核酸扩增、全基因组核酸扩增，具有广大的应用前景。
需要说明的是，在本文中，除特殊说明以外的，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 浙江汇泽医药科技有限公司
<120> 一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺
<130> PP191554
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtaataaa agg 13
<210> 2
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgatctaata ctt 13

Claims (10)

1.一种微量细胞核酸提取与扩增系统，其特征在于，包括：加压组件、核酸提取与扩增组件和回收组件；其中：
核酸提取与扩增组件，包括：依次相连接的细胞裂解单元，孔径筛选单元，
和扩增单元；
其中，所述细胞裂解单元：用于接收样品，并对所述样品进行裂解；
所述孔径筛选单元：用于接收经过裂解的样品，并对所述样品进行孔径筛选；
所述扩增单元：用于接收经过孔径筛选的样品，并对所述样品进行扩增；回收组件，用于接收经过扩增的样品；加压组件，用于对样品施加压力以使所述样品依次经过所述细胞裂解单元、孔径筛选单元、扩增单元进入所述回收组件。
2.根据权利要求1所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，其特征在于，所述细胞裂解单元为无菌滤纸。
3.根据权利要求2所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，其特征在于，所述细胞裂解单元的直径为第一设定直径。
4.根据权利要求3所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，其特征在于，所述孔径筛选单元为滤膜；所述滤膜具有设定孔径。
5.根据权利要求4所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，其特征在于，所述滤膜的直径为第二设定直径。
6.根据权利要求5所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，其特征在于，所述第一设定直径大于所述第二设定直径。
7.根据权利要求1-6任一项所述的微量细胞核酸提取与扩增系统，其特征在于，所述扩增单元为无菌滤纸。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述微量细胞核酸提取与扩增系统进行微量细胞核酸提取与扩增系统的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
取得样品，以所述加压组件将所述样品注入所述细胞裂解单元以裂解产生核酸；
将所述核酸注入所述孔径筛选单元，进行孔径筛选；
将筛选后的核酸注入所述扩增单元，以使核酸于所述扩增单元中进行基因组扩增；
将扩增后的核酸注入所述回收组件；
优选地，所述细胞裂解单元含有裂解液，所示裂解液选自NaOH、KOH、二硫苏糖醇、蛋白酶K溶液中的一种或至少两种；和/或，所述孔径筛选单元含有缓冲液；和/或，所述扩增单元含有引物。
9.根据权利要求8所述的微量细胞核酸提取与扩增系统的工艺，其特征在于，所述样品的体积为0.1-5uL。
10.根据权利要求8或9所述的微量细胞核酸提取与扩增系统的工艺，其特征在于，所述样品包括微量细胞、微生物和游离核酸中的一种；优选地，所述的微量细胞为血液。
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