CN106434639A - 一种无需转管的dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸提取纯化技术领域，具体涉及一种无需转管的DNA提取方法；包括如下步骤：1）试剂准备：配制裂解液、漂洗液、洗脱液，准备好组合管；2）DNA提取：样品放入组合管内层裂解管中，加入裂解液和蛋白酶K后裂解，离心，内层裂解管中的液体在穿过中层DNA吸附管内的核酸吸附膜时，被核酸吸附膜结合，分离并获得纯化的DNA；3）PCR扩增及电泳；本发明提取DNA无需转管，简化了DNA提取操作步骤，缩短了检测时间；避免了转管操作过程中可能带来的DNA损失和交叉污染的风险。

Description

一种无需转管的DNA提取方法
技术领域
本发明属于核酸提取纯化技术领域，具体涉及一种无需转管的DNA提取方法。
背景技术
DNA是遗传信息的载体，对于真核生物而言，核基因组DNA位于细胞核内，要获得纯化的DNA，首先需要裂解细胞膜、核膜等结构，使DNA被释放出来，然后去除细胞碎片、蛋白质、脂类、糖类等杂质，使DNA纯化；如果需要从拭子、粪便、泥土等样品中提取DNA，还要考虑去除拭子、粪便、泥土等杂质；目前，可供选择的DNA提取方法包括苯酚-氯仿抽提法、磁珠法、硅胶膜法、硅珠法等。
苯酚-氯仿抽提法的原理是，通过裂解液裂解细胞，利用有机溶剂使蛋白质变性与DNA分离，高速离心后，密度较大的有机相与变性的蛋白质、细胞碎片等位于下层，DNA溶于水相位于上层；将上层水相转移到新的容器中后，用异丙醇或乙醇将DNA沉淀浓缩，最后用水将DNA溶解，获得纯化的DNA。
磁珠法、硅珠法、硅胶膜法原理是，通过裂解液裂解细胞，利用裂解液裂解细胞，离心分离拭子、粪便、泥土等杂质和细胞碎片，上清液中只有DNA、蛋白质、脂类、糖类等可溶性成分；将上清液转移后，向其中加入高浓度离液盐和异丙醇或乙醇，利用磁珠、硅珠、硅膜表面的硅烷醇在高盐条件下结合DNA的特性，使DNA与其它可溶性杂质分离；然后用乙醇漂洗磁珠、硅珠、硅胶膜表面残留的离液盐，待乙醇挥发之后，利用硅烷醇在低盐条件下不结合DNA的特性，用水或TE缓冲液将纯化的DNA洗脱出来。
上述DNA提取方法都需要将含有DNA的溶液在不同容器转移，由于移液器吸头、离心管管壁等粘附的溶液中含有DNA，这必然会造成部分DNA的损失，另外，转移操作还有一定风险造成不同样品间的交叉污染；本发明涉及的一种无需转管的DNA提取方法和试剂，可以避免DNA提取操作过程中的转管操作。
发明内容
本发明为解决上述存在的问题，提供了一种无需转管的DNA提取方法，其解决技术问题的技术方案是：
一种无需转管的DNA提取方法，包含如下步骤：
1）试剂准备
配制裂解液、漂洗液、洗脱液，准备好组合管；
所述裂解液，其组成成分包括表面活性剂、离液盐、pH缓冲剂；
所述表面活性剂为：十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、TWEEN 20、TWEEN 40、TWEEN 60、TWEEN 80、NP 40、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或两种及以上的混合，所述表面活性剂的浓度为0.1% m/v -10%m/v；
所述离液盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾、高氯酸钠、碘化钾、碘化钠中的一种或两种及以上的混合，所述离液盐的浓度为3mol/l -5mol/l；
所述pH缓冲剂为Tris-HCl、Tris-醋酸、NaH2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-K2HPO4、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠，所述pH缓冲剂的pH值为4.5-9.0；
所述漂洗液为80%乙醇；
所述洗脱液，其组分为：10 mmol/l Tris-HCl，0.1 mmol/l EDTA-2Na，pH 8.0；
所述组合管，包含三层套管的结构，所述三层套管的结构，包含内层裂解管、中层DNA吸附管、外层收集管和盖子；所述裂解管为中空结构，顶部为裂解管管口，底部有收口，收口台阶上有疏水性过滤材料；所述吸附管为中空结构，顶部为吸附管管口，底部有收口，收口台阶上设有两层材料，上层为核酸吸附膜，下层为疏水性过滤材料；所述收集管顶部有收集管管口；所述盖子可分别盖在裂解管管口、吸附管管口、收集管管口上；盖子边缘有柔性长柄和收集管管口边缘连接，防止盖子掉落；
2）DNA提取
样品放入组合管内层裂解管中，加入裂解液和蛋白酶K后50-100℃裂解，离心，内层裂解管中的液体在穿过中层DNA吸附管内的核酸吸附膜时，被核酸吸附膜结合，分离并获得纯化的DNA；具体包括以下步骤：
a.将样品放入组合管裂解管中，加入400-500 μl裂解液和15-25 μl蛋白酶K，涡旋振荡混匀，50℃-100℃加热10-20分钟；
b.12000 rpm离心1-2分钟，丢弃裂解管，倒弃收集管中的液体，吸附管放回收集管，向吸附管内加入400-500 μl漂洗液，12000 rpm离心0.5-1.0分钟；
c.倒弃收集管的液体，吸附管放回收集管内，向吸附管内加入400 -500μl漂洗液，12000 rpm离心0.5-1.0分钟；
d.丢弃收集管，吸附管放入一根新的收集管，打开盖子，70℃加热3-4分钟；
e.向吸附管内加入30 μl洗脱液，盖上盖子，70℃加热3-4分钟，12000 rpm离心1-1.5分钟，丢弃吸附管，收集管内的液体即DNA溶液；
3）PCR扩增及电泳
将上步纯化的DNA进行PCR扩增，在电泳仪中检测DNA。
本发明具有以下有益效果：
本发明的一种无需转管的DNA提取方法，配制好裂解液、漂洗液、洗脱液，利用包含内层裂解管、中层DNA吸附管、外层收集管的组合管结构，DNA在裂解管内裂解，裂解完成后，通过离心，裂解管底部的筛板或滤膜使固体杂质与可溶性成分分离，吸附管底部的核酸吸附膜使DNA与可溶性杂质分离，实现在同一装置内，一次性分离纯化DNA；与现有技术相比，本发明技术无需转管，简化了DNA提取操作步骤，避免了转管操作过程可能带来的DNA损失和交叉污染的风险。
附图说明
图1是本发明中组合管的结构示意图。
图中：1.裂解管，2.吸附管，3.收集管，4.核酸吸附膜，5.过滤器，6.收集管管口，7.吸附管管口，8.裂解管管口，9.盖子。
图2是本发明实施例1中提取的DNA的复合STR扩增图谱。
图3是本发明实施例2中提取的DNA的复合STR扩增图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1 针对总量500 pg DNA微量样品的提取
1）试剂准备
a.裂解液：其组分为5 mol/l 盐酸胍，2%月桂酰基肌氨酸钠（m/v)，5% Tween 20，100mmol/l Tris-HCl，100 mmol/l 柠檬酸钠，pH 7；
b.漂洗液：其组分为80%乙醇；
c.洗脱液：其组分为10 mmol/l Tris-HCl，0.1 mmol/l EDTA-2Na，pH 8.0；
d.组合管一套。
2）DNA提取
a.取一根无菌、无DNA污染的棉拭子，向棉拭子上滴加0.5μl Identifiler Plus PCR试剂盒9947A阳性对照DNA（1ng/μl），试剂盒由Appplied Biosystems公司提供；折断拭子头，放入组合管裂解管（1）中，加入400 μl裂解液，15 μl蛋白酶K，涡旋振荡混匀，50℃加热10分钟；
b.12000 rpm离心1分钟，丢弃裂解管（1），倒弃收集管（3）中的液体，吸附管（2）放回收集管（3），向吸附管（2）内加入400 μl漂洗液，12000 rpm离心0.5分钟；
c.倒弃收集管（3）的液体，吸附管（2）放回收集管（3）内，向吸附管（2）内加入400 μl漂洗液，12000 rpm离心0.5分钟；
d.丢弃收集管（3），吸附管（2）放入一根新的收集管（3），打开盖子，70℃加热3分钟；
e.向吸附管（2）内加入30 μl洗脱液，盖上盖子，70℃加热3分钟，12000 rpm离心1分钟，丢弃吸附管（2），收集管（3）内的液体即DNA溶液。
3）PCR扩增及电泳
PCR扩增使用Identifiler Plus试剂盒，由Applied Biosystems公司提供，10 μl扩增体系中含4 μl master mix、2 μl primer set、4 μl模板，扩增程序如下：
a.将扩增体系在95℃下恒温11分钟；
b.开始30个循环反应，每个循环反应条件为：在94℃下20秒，59℃下3分钟，60℃下10分钟，反复30次；
c.30个循环反应后，放置4℃环境下，保存待用。
电泳在ABI 3500XL仪器中进行；电泳上样体系为，1 μl PCR产物，9 μl甲酰胺，其中已加Liz。
图2是本实施例1中提取的DNA的复合STR扩增图谱，为粘有500 pg DNA拭子检测结果，16个基因座等位基因完整，峰高均在300以上，符合法医案件检测数据要求；证明本发明方法和试剂，能有效针对微量检材中的DNA进行提取。
实施例2 针对指纹脱落细胞的DNA提取
1）指纹样品的制作及采集：食指在干净玻璃窗户上按压5秒，湿的棉签搽拭指纹，用于DNA提取。
2）DNA提取
a.将上述1）中样品放入组合管裂解管（1）中，加入500 μl裂解液， 25 μl蛋白酶K，涡旋振荡混匀，100℃加热20分钟；
b.12000 rpm离心2分钟，丢弃裂解管（1），倒弃收集管（3）中的液体，吸附管（2）放回收集管（3），向吸附管（2）内加入500 μl漂洗液，12000 rpm离心1.0分钟；
c.倒弃收集管（3）的液体，吸附管（2）放回收集管（3）内，向吸附管（2）内加入500μl漂洗液，12000 rpm离心1.0分钟；
d.丢弃收集管（3），吸附管（2）放入一根新的收集管（3），打开盖子，70℃加热4分钟；
e.向吸附管（2）内加入30 μl洗脱液，盖上盖子，70℃加热4分钟，12000 rpm离心1.5分钟，丢弃吸附管（2），收集管（3）内的液体即DNA溶液；
3）PCR扩增及电泳
PCR扩增采用PowerPlex 21试剂盒，由Promega公司提供，10 μl PCR体系中包含，2 μlmaster mix、2 μl primer set、6 μl模板，扩增程序如下：
a.将扩增体系在96℃下恒温1分钟；
b.开始30个循环反应，每个循环反应条件依次为：在94℃下10秒，59℃下1分钟，72℃下30秒；60℃下10分钟，反复30次；
c.30个循环反应后，放置4℃环境下，保存待用。
电泳参照实施例1中进行，图3是本实施例2中提取的DNA的复合STR扩增图谱，为指纹脱落细胞 DNA检测结果，21个基因座等位基因完整，峰高均在1000以上，符合法医案件检测数据要求；证明本发明方法和试剂，能有效针对微量检材中的DNA进行提取。
以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化；凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种无需转管的DNA提取方法，其特征在于，包含如下步骤：
1）试剂准备
配制裂解液、漂洗液、洗脱液，准备好组合管；
所述裂解液，其组成成分包括表面活性剂、离液盐、pH缓冲剂；
所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂酰基肌氨酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、TWEEN 20、TWEEN 40、TWEEN 60、TWEEN 80、NP 40、十六烷基三甲基溴化铵中的一种或两种及以上的混合，所述表面活性剂的浓度为0.1% m/v -10%m/v；
所述离液盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾、高氯酸钠、碘化钾、碘化钠中的一种或两种及以上的混合，所述离液盐的浓度为3-5 mol/l；
所述pH缓冲剂为Tris-HCl、Tris-醋酸、NaH2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-K2HPO4、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠，所述pH缓冲剂的pH值为4.5-9.0；
所述漂洗液为80%乙醇；
所述洗脱液其组分为：10 mmol/l Tris-HCl，0.1 mmol/l EDTA-2Na，pH 8.0；
所述组合管，包含三层套管的结构，所述三层套管的结构，包含三层套管的结构，所述三层套管的结构，包含内层裂解管（1）、中层DNA吸附管（2）、外层收集管（3）和盖子（9）；所述裂解管（1）为中空结构，顶部为裂解管管口（8），底部有收口，收口台阶上有疏水性过滤材料（5）；所述吸附管（2）为中空结构，顶部为吸附管管口（7），底部有收口，收口台阶上设有两层材料，上层为核酸吸附膜（4），下层为疏水性过滤材料（5）；所述收集管（3）顶部有收集管管口（6）；所述盖子（9）可分别盖在裂解管管口（8）、吸附管管口（7）、收集管管口（6）上；盖子（9）边缘有柔性长柄和收集管管口（6）边缘连接；
2）DNA提取
DNA提取样品放入组合管内层裂解管中，加入裂解液和蛋白酶K后50℃-100℃裂解，离心，内层裂解管（1）中的液体在穿过中层DNA吸附管（2）内的核酸吸附膜（4）时，被核酸吸附膜（4）结合，分离并获得纯化的DNA；具体包括以下步骤：
a.将样品放入组合管裂解管（1）中，加入400-500 μl裂解液，15-25 μl蛋白酶K，涡旋振荡混匀，50℃-100℃加热10-20分钟；
b.12000 rpm离心1-2分钟，丢弃裂解管（1），倒弃收集管（3）中的液体，吸附管（2）放回收集管（3），向吸附管（2）内加入400-500 μl漂洗液，12000 rpm离心0.5-1.0分钟；
c.倒弃收集管（3）的液体，吸附管（2）放回收集管（3）内，向吸附管（2）内加入400 -500μl漂洗液，12000 rpm离心0.5-1.0分钟；
d.丢弃收集管（3），吸附管（2）放入一根新的收集管（3），打开盖子，70℃加热3-4分钟；
e.向吸附管（2）内加入30 μl洗脱液，盖上盖子，70℃加热3-4分钟，12000 rpm离心1-1.5分钟，丢弃吸附管（2），收集管（3）内的液体即DNA溶液；
3）PCR扩增及电泳
将上步纯化的DNA进行PCR扩增，在电泳仪中检测DNA。
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