CN113234589B - 一种核酸快速提取四联管装置、试剂盒和提取方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种核酸快速提取四联管装置、试剂盒和提取方法。一种核酸快速提取四联管装置，该装置包括一体成型的第一面板、裂解液试管、第一漂洗液试管、第二漂洗液试管、第二面板和洗脱液试管，裂解液试管、第一漂洗液试管和第二漂洗液试管设置在第一面板上，所述第二面板设置在第一面板的端板，在第一面板和第二面板之间设置有能使第一面板和第二面板折断的连接部，所述洗脱液试管设置在第二面板上；裂解液试管、第一漂洗液试管、第二漂洗液试管和洗脱液试管中分别预先封存用于核酸提取的裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱液。本申请实现了快速提取核酸，简单、快捷、高效，特别适用于野外采样、宠物疾病检测等服务。
Description
技术领域
本申请涉及核酸提取技术领域，尤其涉及一种核酸快速提取四联管装置、试剂盒和提取方法。
背景技术
实时荧光定量PCR技术已广泛应用于遗传病分子诊断、临床检验、动植物进出口检疫、食品安全监测、土壤微生物检测和亲子鉴定等众多领域。由于血液、食物、土壤等样品中含有大量抑制因子，如血红蛋白、高铁血红素、乳铁蛋白、腐植酸等，对常规Taq DNA聚合酶将产生明显的抑制作用。因此，必须先从这些待测样品分离提取核酸，然后用于PCR扩增。核酸提取是核酸检测第一步，也是分子生物学中关键方法之一。为下游核酸检测提供基础，提取质量和完整性直接影响临床研究或诊断。
一般核酸提取过程包括三步：裂解、漂洗和洗脱过程。传统的提取试剂由于取得率相对较低，且步骤较为繁杂，给提取工作带来一定影响，尤其当样品量稀少时，难以得到合格的核酸。并且，传统方法操作步骤多、成本高、对样品的需要量较大且易于造成交叉污染，不利于客户快速提取纯化核酸样品。
另外，在目前核酸检测应用最广的实时荧光 PCR 技术中，试剂大都不是即用型的，造成PCR检测普遍存在操作复杂、费事、所需费用高等问题，使用前需要有复杂的配置工作，容易造成试验的误差甚至失败。不同人员操作也引起实验误差；不能做到一步法快速提取核酸；PCR检测试剂需要现场手动配置，多个步骤需要人工标记，各阶段的检测仪器独立，不利于全自动处理大量试验样品。特别是在野外作业（如畜牧渔养殖业和宠物疾病诊疗和检验的从业人员）时，样本保藏不易，并且可能由于随着时间，样本中核酸物质会分解，不利于后续检测。
申请人申请了中国发明专利（公开号：CN111286448A，公开日：20200616）公开了一种生物样本前处理添加剂存储与添加装置。该装置包括盖体和破穿装置，所述的盖体包括螺旋管、储藏管和按压行程管，螺旋管内部设置有螺纹，按压行程管位于螺旋管的上部，所述的储藏管设置在盖体的内腔并通过连接部与盖体连接成一体，储藏管的底端封闭；所述的破穿装置包括破穿杆、按压头和密封橡胶活塞，所述的破穿杆与按压头相互连接，破穿杆下部位于储藏管内，按压头设置按压行程管上，所述的密封橡胶活塞固定设置在破穿杆上，密封橡胶活塞的外壁与储藏管内壁相贴合，下压按压头能使破穿杆穿破储藏管底部，并通过封橡胶活塞推动储藏管内的前处理添加剂从储藏管底部流出。但是该装置只能实现裂解液的添加，无法有效解决漂洗和洗脱的问题。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本申请的一个目的是提供一种核酸快速提取四联管装置，该装置预先封存用于合算提取的裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱液，可以在一个装置中实现裂解、漂洗和洗脱过程，洗脱完毕后只需要折下洗脱液试管保存即可，实现了快速提取核酸，简单、快捷、高效，特别适用于野外采样、宠物疾病检测等服务。
为了实现上述的目的，本身采用了以下的技术方案：
一种核酸快速提取四联管装置，该装置包括一体成型的第一面板、裂解液试管、第一漂洗液试管、第二漂洗液试管、第二面板和洗脱液试管，裂解液试管、第一漂洗液试管和第二漂洗液试管设置在第一面板上，所述第二面板设置在第一面板的端板，在第一面板和第二面板之间设置有能使第一面板和第二面板折断的连接部，所述洗脱液试管设置在第二面板上；裂解液试管、第一漂洗液试管、第二漂洗液试管和洗脱液试管中分别预先封存用于核酸提取的裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱液。
核酸提取通常裂解液中需要加入核酸提取蛋白溶解酶，比如蛋白酶K等，核酸提取蛋白溶解酶为生物活性成分，与其他裂解液混合后不易长时间保存。本申请的核酸提取蛋白溶解酶可以是在使用的时候加入到裂解液中，但是最为方便的方法还是希望能封存在裂解液试管，这样使用起来更为方便。
为了解决上述的技术问题，本申请裂解液试管内部底部预先封存有纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶，在纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶的上方设置有隔离层，除核酸提取蛋白溶解酶以外的其他裂解液成分封存在隔离层的上方；所述的隔离层采用熔点为40-65℃的有机固态材料。用固态的分隔层将裂解液试管中的裂解液与纳米磁珠及核酸提取蛋白溶解酶分隔，然后通过加热熔融分隔层，利用液体密度使得裂解液与纳米磁珠及核酸提取蛋白溶解酶接触。
作为优选，核酸提取蛋白溶解酶选用蛋白酶K或胃蛋白酶；所述的隔离层采用石蜡；所述的第二漂洗液不含乙醇。本申请中蛋白酶K为最优选，石蜡也为最优选，不含乙醇第二漂洗液可以漂洗后，无需晾干，直接进行洗脱，避免乙醇对后续检测的干扰。
作为优选，裂解液试管底部壁厚增加，形成半球状腔室；所述的纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶储存在半球状腔室内。
作为优选，所述的洗脱液试管底部为离心管，在离心管的外侧设置有支撑套管。
作为优选，所述连接部为连接在第一面板和第二面板之间的缩小的连接条带。再优选，连接条带上设置刻线或缺口。刻线或缺口可以分别折下洗脱液试管。
作为优选，该装置还包括第一盖板，第一盖板上设置有与裂解液试管、第一漂洗液试管和第二漂洗液试管相互匹配的三个端盖，并且第一盖板与第一面板的一侧通过第一翻折连接部相连接，通过第一翻折连接部能使第一盖板翻折至第一面板的上方，使三个端盖分别盖在裂解液试管、第一漂洗液试管和第二漂洗液试管上。通过一体成型端盖，不需要在另外配备试管的盖章，方便了使用。
再优选，第一面板朝向第一盖板的第一侧边位置设置有第一面板凸出部，所述的第一翻折连接部与第一面板凸出部相连接，在第一面板凸出部设置第一卡口；并在第一盖板翻折对应第一卡口的位置设置有第一卡扣。通过第一卡扣可以使第一盖板方便的锁紧在第一面板上，使端盖封闭试管。
作为优选，该装置还包括第二盖板，第二盖板上设置有与洗脱液试管相互匹配的端盖，并且第二盖板与第二面板的一侧通过第二翻折连接部相连接，通过第二翻折连接部能使第二盖板翻折至第二面板的上方，使端盖分别盖在洗脱液试管上。
再优选，第二面板朝向第二盖板的第一侧边位置设置有第二面板凸出部，所述的第二翻折连接部与第二面板凸出部相连接，在第二面板凸出部设置第二卡口；并在第二盖板翻折对应第二卡口的位置设置有第二卡扣。
本申请还可以另外采用一种盖板的锁紧方式，比如，在第一盖板翻折对应第一面板背向第一盖板的第二侧边位置设置有第三卡扣，第三卡扣翻折扣合在第二侧边上。当然，作为最优选，本申请应该是同时采用两者锁紧的方式。
再优选，在第二盖板翻折对应第二面板背向第二盖板的第二侧边位置设置有第四卡扣，第四卡扣翻折扣合在第二侧边上。
作为优选，该装置之整体采用PE、PP、PA、PC、PPS、PET、PVC和PMMA中的一种模压或注塑成型。
进一步，本申请还提供了一种核酸快速提取试剂盒，该试剂盒包括所述的四联管装置、端部具有磁头的搅拌棒和磁珠；所述磁珠单独设置或者预先加入到裂解液试管中。
优选，搅拌棒包括提手、外套和所述的磁头，磁头封闭设置在外套的底部，外套的上部与提手固定连接。再优选，提手及磁头可与外套分离。
进一步，本申请还提供了一种核酸快速提取方法，其特征在于，该方法采用所述的试剂盒，包括以下的步骤：
1）将生物样本加入到含有磁珠及核酸提取蛋白溶解酶和裂解液的裂解液试管中进行裂解并释放核酸，利用纳米磁珠吸附释放的核酸；
2）将搅拌棒伸入裂解液试管进行上下抽动或者搅拌，将磁珠吸附到搅拌棒外套的磁性端部；
3）将吸附有磁珠的搅拌棒，依次进入第一漂洗液试管和第二漂洗液试管进行上下抽动漂洗；
4）漂洗完成的搅拌棒直接进入洗脱液试管进行洗脱，洗脱完成后，将第二面板从第一面板上折断，第一面板以及第一面板上的裂解液试管、第一漂洗液试管和第二漂洗液试管废弃处理，将洗脱液试管低温保存或直接取样进行检测。
本申请由于采用了上述的技术方案，可以在一个装置中实现裂解、漂洗和洗脱过程，洗脱完毕后只需要折下洗脱液试管保存即可，采用本申请的装置10分钟内即可获得高质量、高纯度核酸，可处理多种类型样本，如全血、组织、唾液等，提取过程无需移液设备、离心机；真正实现了快速提取核酸，简单、快捷、高效，特别适用于野外采样、宠物疾病检测等服务。
附图说明
图1为本申请四联管装置的结构示意图。
图2为本申请搅拌棒的结构示意图。
图3为本申请四联管装置的俯视结构示意图。
图4为图A-A剖视图。
图5为本申请与传统磁珠提取检出度对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式做一个详细的说明。
如图1、图3所示的一种核酸快速提取四联管装置，该装置之整体采用PE、PP、PA、PC、PPS、PET、PVC和PMMA中的一种模压或注塑成型。该装置包括第一面板1、裂解液试管2、第一漂洗液试管3、第二漂洗液试管4、第二面板5和洗脱液试管6，裂解液试管2、第一漂洗液试管3和第二漂洗液试管4设置在第一面板1上，所述第二面板5设置在第一面板1的端板，在第一面板1和第二面板5之间设置有能使第一面板1和第二面板5折断的连接部7，如图1所示，连接部7为在连接第一面板1和第二面板5之间的缩小的连接条带，连接条带上设置刻线或缺口。所述洗脱液试管6设置在第二面板5上；裂解液试管2、第一漂洗液试管3、第二漂洗液试管4和洗脱液试管6中分别预先封存用于核酸提取的裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱液。
如图4所示，裂解液试管2内部底部预先封存有纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶21，在纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶21的上方设置有隔离层22，除核酸提取蛋白溶解酶以外的其他裂解液成分23封存在隔离层22的上方；所述的隔离层22采用熔点为40-65℃的有机固态材料。核酸提取蛋白溶解酶选用蛋白酶K或胃蛋白酶；所述的隔离层22采用石蜡；所述的第二漂洗液不含乙醇。裂解液试管2底部壁厚增加，形成半球状腔室；所述的纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶储存在半球状腔室内。所述的洗脱液试管6底部为离心管61，在离心管61的外侧设置有支撑套管62。
如图1所示，该装置还包括第一盖板8，第一盖板8上设置有与裂解液试管2、第一漂洗液试管3和第二漂洗液试管4相互匹配的三个端盖9，并且第一盖板8与第一面板1的一侧通过第一翻折连接部10相连接，通过第一翻折连接部10能使第一盖板8翻折至第一面板1的上方，使三个端盖9分别盖在裂解液试管2、第一漂洗液试管3和第二漂洗液试管4上。第一面板1朝向第一盖板8的第一侧边位置设置有第一面板凸出部11，所述的第一翻折连接部10与第一面板凸出部11相连接，在第一面板凸出部11设置第一卡口12；并在第一盖板8翻折对应第一卡口12的位置设置有第一卡扣13。
如图1所示，该装置还包括第二盖板14，第二盖板14上设置有与洗脱液试管6相互匹配的端盖9，并且第二盖板14与第二面板5的一侧通过第二翻折连接部15相连接，通过第二翻折连接部15能使第二盖板14翻折至第二面板5的上方，使端盖9分别盖在洗脱液试管6上。第二面板5朝向第二盖板14的第一侧边位置设置有第二面板凸出部16，所述的第二翻折连接部15与第二面板凸出部16相连接，在第二面板凸出部16设置第二卡口17；并在第二盖板14翻折对应第二卡口17的位置设置有第二卡扣18。
如图1所示，在第一盖板8翻折对应第一面板1背向第一盖板8的第二侧边位置设置有第三卡扣19，第三卡扣19翻折扣合在第二侧边上。在第二盖板14翻折对应第二面板5背向第二盖板14的第二侧边位置设置有第四卡扣20，第四卡扣20翻折扣合在第二侧边上。
如图1、图2，本申请的一种核酸快速提取试剂盒包括所述的四联管装置、端部具有磁头30的搅拌棒和磁珠；所述磁珠单独设置或者预先加入到裂解液试管2中。搅拌棒包括提手32、外套31和所述的磁头30，磁头30封闭设置在外套31的底部，外套31的上部与提手32固定连接。
本申请的一种核酸快速提取方法，该方法采用所述的试剂盒，包括以下的步骤：
1）将裂解液试管2至于水浴或金属浴中，温度上升至石蜡溶解，核酸提取蛋白溶解酶与裂解液磁珠充分混合；
2）将生物样本加入到含有磁珠及核酸提取蛋白溶解酶和裂解液的裂解液试管中进行裂解并释放核酸，利用纳米磁珠吸附释放的核酸；
3）将搅拌棒伸入裂解液试管进行上下抽动或者搅拌，将磁珠吸附到搅拌棒外套的磁性端部；
4）将吸附有磁珠的搅拌棒，依次进入第一漂洗液试管和第二漂洗液试管进行上下抽动漂洗，无需晾干；
5）漂洗完成的搅拌棒直接进入洗脱液试管进行洗脱，洗脱完成后，将第二面板从第一面板上折断，第一面板以及第一面板上的裂解液试管、第一漂洗液试管和第二漂洗液试管废弃处理，将洗脱液试管低温保存或直接取样进行检测。
本申请通过采集猪血、河蟹组织以及猫腹水的核酸物质，通过对比本申请的方法和传统磁珠方法，检出率显著提高，结果如图5所示。
以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。
Claims (12)
1.一种核酸快速提取四联管装置，其特征在于，该装置包括一体成型的第一面板（1）、裂解液试管（2）、第一漂洗液试管（3）、第二漂洗液试管（4）、第二面板（5）和洗脱液试管（6），裂解液试管（2）、第一漂洗液试管（3）和第二漂洗液试管（4）设置在第一面板（1）上，所述洗脱液试管（6）设置在第二面板（5）上，所述第二面板（5）设置在第一面板（1）的端板，在第一面板（1）和第二面板（5）之间设置有能使第一面板（1）和第二面板（5）折断的连接部（7）；裂解液试管（2）、第一漂洗液试管（3）、第二漂洗液试管（4）和洗脱液试管（6）中分别预先封存用于核酸提取的裂解液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱液；
所述连接部（7）为在连接第一面板（1）和第二面板（5）之间的缩小的连接条带；所述的连接条带上设置刻线或缺口；
所述裂解液试管（2）内部底部预先封存有纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶（21），在纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶（21）的上方设置有隔离层（22），除核酸提取蛋白溶解酶以外的其他裂解液成分（23）封存在隔离层（22）的上方；所述的隔离层（22）采用熔点为40-65℃的有机固态材料；核酸提取蛋白溶解酶选用蛋白酶K或胃蛋白酶；裂解液试管（2）底部壁厚增加，形成半球状腔室，所述的纳米磁珠和核酸提取蛋白溶解酶（21）储存在半球状腔室内；所述的洗脱液试管（6）底部为离心管（61）。
2.根据权利要求1所述的一种核酸快速提取四联管装置，其特征在于，所述的隔离层（22）采用石蜡；所述的第二漂洗液不含乙醇。
3.根据权利要求1所述的一种核酸快速提取四联管装置，其特征在于，在离心管（61）的外侧设置有支撑套管（62）。
4.根据权利要求1所述的一种核酸快速提取四联管装置，其特征在于，该装置还包括第一盖板（8）和第二盖板（14），第一盖板（8）上设置有与裂解液试管（2）、第一漂洗液试管（3）和第二漂洗液试管（4）相互匹配的三个端盖（9），并且第一盖板（8）与第一面板（1）的一侧通过第一翻折连接部（10）相连接，通过第一翻折连接部（10）能使第一盖板（8）翻折至第一面板（1）的上方，使三个端盖（9）分别盖在裂解液试管（2）、第一漂洗液试管（3）和第二漂洗液试管（4）上；
第二盖板（14）上设置有与洗脱液试管（6）相互匹配的端盖（9），并且第二盖板（14）与第二面板（5）的一侧通过第二翻折连接部（15）相连接，通过第二翻折连接部（15）能使第二盖板（14）翻折至第二面板（5）的上方，使端盖（9）分别盖在洗脱液试管（6）上。
5.根据权利要求4所述的一种核酸快速提取四联管装置，其特征在于，第一面板（1）朝向第一盖板（8）的第一侧边位置设置有第一面板凸出部（11），所述的第一翻折连接部（10）与第一面板凸出部（11）相连接，在第一面板凸出部（11）设置第一卡口（12）；并在第一盖板（8）翻折对应第一卡口（12）的位置设置有第一卡扣（13）；
第二面板（5）朝向第二盖板（14）的第一侧边位置设置有第二面板凸出部（16），所述的第二翻折连接部（15）与第二面板凸出部（16）相连接，在第二面板凸出部（16）设置第二卡口（17）；并在第二盖板（14）翻折对应第二卡口（17）的位置设置有第二卡扣（18）。
6.根据权利要求4或5所述的一种核酸快速提取四联管装置，其特征在于，在第一盖板（8）翻折对应第一面板（1）背向第一盖板（8）的第二侧边位置设置有第三卡扣（19），第三卡扣（19）翻折扣合在第一面板（1）的第二侧边上；在第二盖板（14）翻折对应第二面板（5）背向第二盖板（14）的第二侧边位置设置有第四卡扣（20），第四卡扣（20）翻折扣合在第二面板（5）的第二侧边上。
7.根据权利要求1-5任意一项权利要求所述的一种核酸快速提取四联管装置，其特征在于，该装置之整体采用PE、PP、PA、PC、PPS、PET、PVC和PMMA中的一种模压或注塑成型。
8.一种核酸快速提取试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1-7任意一项权利要求所述的四联管装置、端部具有磁头（30）的搅拌棒和纳米磁珠；所述裂解液试管（2）内部底部不预先封存纳米磁珠，所述纳米磁珠单独设置。
9.根据权利要求8所述的一种核酸快速提取试剂盒，其特征在于，搅拌棒包括提手（32）、外套（31）和所述的磁头（30），磁头（30）封闭设置在外套（31）的底部，外套（31）的上部与提手（32）固定连接。
10.一种核酸快速提取试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1-7任意一项权利要求所述的四联管装置、端部具有磁头（30）的搅拌棒和纳米磁珠；将所述纳米磁珠预先加入到裂解液试管（2）中。
11.根据权利要求10所述的一种核酸快速提取试剂盒，其特征在于，搅拌棒包括提手（32）、外套（31）和所述的磁头（30），磁头（30）封闭设置在外套（31）的底部，外套（31）的上部与提手（32）固定连接。
12.一种核酸快速提取方法，其特征在于，该方法采用权利要求8-11任意一项所述的试剂盒，包括以下的步骤：
1）将生物样本加入到含有磁珠及核酸提取蛋白溶解酶和裂解液的裂解液试管中进行裂解并释放核酸，利用纳米磁珠吸附释放的核酸；
2）将搅拌棒伸入裂解液试管进行上下抽动或者搅拌，将磁珠吸附到搅拌棒外套的磁性端部；
3）将吸附有磁珠的搅拌棒，依次进入第一漂洗液试管和第二漂洗液试管进行上下抽动漂洗；
4）漂洗完成的搅拌棒直接进入洗脱液试管进行洗脱，洗脱完成后，将第二面板从第一面板上折断，第一面板以及第一面板上的裂解液试管、第一漂洗液试管和第二漂洗液试管废弃处理，将洗脱液试管低温保存或直接取样进行检测。
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