CN110331089B - 一种全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒及检测方法和应用，由芯片盒主体、核酸扩增检测仓体、和加注盖组成，其中芯片盒主体包括废液仓、裂解仓和试剂仓；核酸扩增检测仓体包括反应池以及与反应池相连的混合管和反应池负压管；加注盖置于裂解仓之上，加注盖上设置有一个以上液体加注孔；裂解仓中设置有将裂解仓分隔为两部分的核酸提取膜，裂解仓两部分中未设置加注盖的部分通过洗脱管联通试剂仓并通过废液管联通废液仓，试剂仓通过混合管联通反应池。本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒可以高效完成核酸提取、试剂混合等步骤，满足核酸扩增检测的需要。

Description

一种全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学核酸检测领域，具体地，本发明提供了一种全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，与相应的自动化荧光检测仪器相配合，可以实现“样本-结果”的快速自动化核酸分子检测。

背景技术

核酸分子检测已经广泛应用于病原体检测、遗传病防控、品种鉴定，污染监控等检验领域。由于样本保存问题和检测时效性问题，这些领域中有迫切的快速完成检测需求，传统的样本处理—核酸提取—核酸扩增—核酸扩增的实验室操作流程显然不能满足快速现场检测的需求。

全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒以及配套的全自动核酸提取扩增检测仪将核酸提取、扩增、检测全过程集中在一个小体积轻重量的便携设备内完成内，设备集成度、自动化程度高并且有利于检测的标准化，能较好的满足病原体检测、遗传病防控、品种鉴定、污染监控等领域所需的快速现场核酸检测需求。核酸提取扩增检测微流控芯片盒是近年来才广泛研究应用的领域，如何在小结构内实现自动化操作，无误无污染无干扰地完成核酸提取、体系构建、废液处理等一系列核酸扩增前准备过程，需要对芯片结构进行精巧的设计和不断的改进。

发明内容

本申请提供的一种PCR微流控制芯片盒，涉及核酸的全自动提取过程，实现了核酸提取的自动化与智能化的目的。该芯片盒由列解仓、废液仓、试剂仓、PCR反应池及一些管道、夹管口等部件组成。该芯片盒配合全自动PCR测试设备可以实现列解、清洗、洗脱、试剂混合过程，最后可以核酸试剂的混合液体送入PCR反应池以便进行PCR生物反应。在检测前，只需要将样本注入裂解仓，用户只要点一下启动键，设备即可完成整个PCR的全过程，实现了PCR的自动化。

本发明提供的一种基于微流控技术的快速核酸提取扩增检测芯片盒以及配套的全自动检测仪器，该微流控芯片含有核酸提取模块和核酸扩增检测模块。核酸提取模块通过玻璃纤维膜吸附样本中的已裂解的核酸，并通过洗液洗涤，并最终通过洗脱液完成核酸的提取与纯化。纯化的核酸通过微流控通道，重新溶解冻干的核酸扩增酶和探针等，并最终到达核酸反应池。在此过程中，洗液和洗脱液等液体的使用时通过外部的自动检测仪的蠕动泵和负压抽引，完成在微流控芯片内部的转运，从而完成复杂的核酸提取和转运过程。同时检测仪器配有多通道荧光检测功能，可以实时定性或定量分析检测目标。微流控技术的快速核酸提取扩增检测芯片盒也可以和等温核酸扩增检测试剂和仪器或设备配合，实现核酸等温扩增检测。因此，该芯片与其配套的荧光检测仪可以实现“样本-结果”的全自动快速分析。

核酸提取扩增检测微流控芯片盒预装有实现核酸扩增、检测的冻干试剂，适合于常温运输与保存，使得该快速核酸检测系统在重大传染病监测，食品安全检测，生物安全，水产畜牧病原体检测等方面具有重要作用。另外该微流控芯片中的核酸提取模块、核酸扩增、以及荧光检测模块构成了一个封闭的体系，避免了核酸提取中的交叉污染和核酸扩增后的产物污染，从而避免了核酸检测的污染问题。通过该微流控芯片和全自动化检测仪，核酸检测成为现场、快速核酸检测的重要利器。

一方面，本发明提供了一种全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，所述全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒由核酸提取芯片盒主体22、核酸扩增与检测仓体23、和加注盖24组成。

进一步地，芯片盒主体22包括废液仓19、裂解仓5和试剂仓15和缓冲仓9；核酸扩增与检测仓体23包括反应池12、混合管14和反应池负压管10，反应池12与混合管14和反应池负压管10相连。

进一步地，加注盖24置于裂解仓5上，加注盖24上设置有一个以上液体加注孔4。

进一步地，裂解仓5中设置有将裂解仓5分隔为两部分的核酸提取膜17，裂解仓5两部分中未设置加注盖24的部分通过洗脱管16联通缓冲仓9并通过废液管3联通废液仓19，试剂仓15一端与缓冲仓9连通，另一端通过混合管14联通反应池12。

进一步地，试剂仓15上设置有用于加入试剂的试剂放置口25，从试剂放置口25向试剂仓内预先填充了核酸扩增反应的冻干试剂，试剂仓15和洗脱管16之间设有缓冲仓9，缓冲仓9上还设有洗脱负压管7。

进一步地，裂解仓5与洗脱管16之间设置有裂解仓开关18，反应池12与混合管14之间设置有反应池开关13。

进一步地，洗脱负压管7未连接缓冲仓9的一端设置有抽洗脱口6，反应池负压管10未连接反应池12的一端设置有抽反应池口8，废液仓19上还连接有废液仓负压管1，废液仓负压管1未连接废液仓19的一端设置有抽废液口2。

进一步地，核酸扩增与检测仓体23通过固定卡11固定于芯片盒主体22上。

进一步地，抽废液口2上设置有胶塞20和隔离膜21。

进一步地，液体加注孔4上有可掀起的隔离盖26将裂解仓5与外界分隔开。

一方面，本发明提供了上述全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒在非诊断核酸现场检测中的应用。

进一步地，非诊断核酸现场检测为病原体核酸检测或基因筛查。

一方面，本发明提供了上述全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的非诊断使用方法，包括：

a.关闭裂解仓开关18，将样本与裂解液加入裂解仓5，将全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒放置于全自动核酸提取扩增检测仪内，进行裂解，裂解完毕后，在抽废液口2抽气使废液仓19中形成负压，裂解液经过核酸提取膜17后被抽入废液仓19，而裂解后的核酸留在核酸提取膜上；

b.经过加注盖24将洗液加注至裂解仓5，洗涤后，将洗涤后的废液抽入废液仓19中，根据需要洗涤一次以上，直到洗涤完成；

c.经过加注盖24注入洗脱液，等待一段时间后，打开裂解仓开关18，并从抽洗脱口6抽气，使得缓冲仓9中形成负压，带有的核酸的洗脱液抽入缓冲仓9中；

d.缓冲仓9的液体进入试剂仓15，与试剂仓15中事先加入的试剂试剂充分混合和溶解；

e.将反应池开关13打开，从抽反应池口8抽气，试剂与核酸的混合液体经混合管14进入反应池12，然后关闭反应池开关13；

f.进行核酸扩增反应并由设备检测反应结果。

本发明的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒各种非诊断用途，包括但不限于非诊断目的的病原体核酸检测、环境微生物核酸检测、污染检测、基因筛查、遗传数据收集等。

本发明的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒可以制备成各种大小和形状，以配合专门设计的PCR仪或者与现有的全自动核酸提取扩增检测仪配合使用。

本发明的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒可以支持等温核酸扩增和变温核酸扩增等多种形式的核酸扩增。

本发明本申请的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒使用过程中的抽气，加样，加入试剂，开关开闭等动作可以全部或部分由机器自动完成。

本发明的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒可以使用一种或多种本领域已知可用的各种材料制备，包括但不限于金属、塑料、聚合物材料、纺织材料等。

可以分别加入各种核酸扩增试剂液体，加入混合PCR或等温扩增试剂液体，加入固体核酸扩增试剂粉末如冻干的核酸扩增试剂粉末，加入固体核酸扩增试剂球如冻干的核酸扩增试剂球等方式向本申请的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒中的试剂仓中加入试剂。

使用于本发明的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片的试剂包括已知的各种PCR试剂或不同形式的等温扩增试剂，其可以以单独成分、混合物或试剂盒的形式存在。

使用于本发明的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的核酸提取膜、洗涤液、洗脱液可以使用已知的各种核酸提取膜、洗涤液、洗脱液，包括但不限于硅胶膜、玻璃纤维膜、纤维素膜，包括但不限于Biocomma、BIOG等的此类产品。

附图说明

图1：本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的主要结构侧视图；

图2：本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒主要结构斜45度视图；

图3：本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的详细结构侧视图；

图4：本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的详细结构示意图；

图5：本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的加注盖斜45度视图以及隔离盖打开示意图；

图6：本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的实物图；

图7：本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒配套全自动PCR测试仪示意图；

图8：使用本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒HIV-1、HBV、HCV病毒三联检测的PCR结果；

其中1为废液仓负压管；2为抽废液口；3为废液管；4为加注口；5为裂解仓；6为抽洗脱口；7为洗脱负压管；8为抽反应池口；9为缓冲仓；10为反应池负压管；11为核酸扩增检测仓固定卡；12为反应池；13为反应池开关；14为混合管；15为试剂仓；16为洗脱管；17为核酸提取膜；18为裂解仓开关；19为废液仓；20为胶塞；21为隔离膜；22为芯片盒主体；23核酸扩增与检测仓体；24为加注盖；25为试剂放置口；26为隔离盖。

具体实施方式

实施例1本申请全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的制备

使用聚丙烯或聚碳酸酯等工程塑料作为主体制备了本申请的微流控芯片盒，实物如图6所示，结构如图1-5所示，包括废液仓负压管；抽废液口；废液管；加注口；裂解仓；抽洗脱口；洗脱负压管；抽反应池口；缓冲仓；反应池负压管；核酸扩增检测仓固定卡；反应池；反应池开关；混合管；试剂仓；洗脱管；核酸提取膜；裂解仓开关；废液仓；胶塞；隔离膜；芯片盒主体；核酸扩增与检测仓体；加注盖；试剂放置口；隔离盖。

实施例2使用本申请全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒进行HIV-1、HBV、HCV病毒三联检测

整套全自动PCR测试仪由本公司自制，包括荧光检测单元、温度控制单元、自动化控制单元、传感及数据分析、显示单元、全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒等部分构成。其中，荧光检测单元主要功能为PCR反应过程中对检测样本进行实时荧光定量检测；温度控制单元实现对核酸提取及PCR反应中的温度变化进行精确控制；自动化控制单元负责核酸提取反应中试剂用量的精确控制；传感及数据分析、显示单元主要功能是将荧光检测单元的检测信号转化为数字信号并经过图像数据处理，将结果实时显示在屏幕上；本发明的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒是实现样本的核酸提取、扩增及检测的载体。

使用本发明微流控芯片盒配合全自动核酸提取与扩增检测仪进行HIV-1、HBV、HCV病毒三联检测步骤如下：

1.检测准备：

设计引物和TaqMan探针,由生物公司制备合成；HIV-1引物(LTR-F:5’-TAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-3’，LTR-R2:5’-GTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG-3’)及探针(LTR-P:5’-AGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTG-3’)序列设计来源于HIV-1病毒基因组的LTR区。荧光基团及淬灭基团分别为HEX和MGB。HBV引物(HBV-Taq1:5’-CAACCTCCAATCACTCACCAACC-3’,HBV-Taq2:5’-ATATGATAAAACGCCGCAGACAC-3’)及探针(BS-1：5’-TCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCT-3’)序列设计来源于HBV病毒表面基因的保守区。荧光基团及淬灭基团分别为ROX和MGB。HCV引物(MAD-1:5’-TGCTAGCCGAGTAGYGTTGG-3’,MAD-2:5’-ACTCGCAAGCACCCTATCAG-3’)及探针(MAD-3:5’-ACTCGCAAGCACCCTATCA-3’)序列设计来源于HCV病毒基因组5-UTR区。荧光基团及淬灭基团分别为FAM和MGB。

PCR反应体系包括0.48μM DNTP，1.28μM HIV-1、HCV引物，1.6μM HBV引物，三种病毒核酸的荧光探针各0.32μM，4U Taq酶。所需PCR反应试剂已预先封装入全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的试剂仓中。

2.关闭裂解仓开关18，将样本与裂解液加入裂解仓5，将全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒放置于全自动核酸提取扩增检测仪内进行全自动核酸提取、扩增与检测。以下过程由仪器自动完成。首先进行裂解，裂解完毕后，在抽废液口2抽气使废液仓19中形成负压，裂解液经过核酸提取膜17过滤后被抽入废液仓19，而裂解后的核酸留在核酸提取膜上；

3.经过加注盖24将洗液加注至裂解仓5，洗涤后，将洗涤后的废液抽入废液仓19中，根据需要洗涤一次以上，直到洗涤完成；

4.经过加注盖24注入洗脱液，等待一段时间后，打开裂解仓开关18，并从抽洗脱口6抽气，使得缓冲仓9中形成负压，带有核酸的洗脱液抽入缓冲仓9中；

5.缓冲仓9的液体进入试剂仓15，与试剂仓15中事先加入的试剂充分混合和溶解；

6.将反应池开关13打开，从抽反应池口8抽气，试剂与核酸的混合液体经混合管14进入反应池12，然后关闭反应池开关13；

7.进行PCR反应95度3分钟，后续95度10秒加60度30秒的40个循环并检测反应结果。荧光检测设备在循环开始后对反应仓的荧光，强度进行实时监测，荧光定量曲线将实时显示在PCR仪屏幕上。

PCR反应结果如图8所示，表明本发明全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒可以高效完成核酸提取、试剂混合等步骤，满足核酸扩增检测的需要。

Claims (11)

1.一种全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，其特征在于，所述全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒由核酸提取芯片盒主体22、核酸扩增与检测仓体23、和加注盖24组成；

其中芯片盒主体22包括废液仓19、裂解仓5和试剂仓15和缓冲仓9；核酸扩增与检测仓体23包括反应池12、混合管14和反应池负压管10，反应池12与混合管14和反应池负压管10相连；

加注盖24置于裂解仓5上，加注盖24上设置有一个以上液体加注孔4；

裂解仓5中设置有将裂解仓5分隔为两部分的核酸提取膜17，裂解仓5两部分中未设置加注盖24的部分通过洗脱管16联通缓冲仓9并通过废液管3联通废液仓19，试剂仓15一端与缓冲仓9连通，另一端通过混合管14联通反应池12。

2.根据权利要求1的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，其特征在于，其中试剂仓15上设置有用于加入试剂的试剂放置口25，从试剂放置口25向试剂仓内预先填充了核酸扩增反应的冻干试剂，试剂仓15和洗脱管16之间设有缓冲仓9，缓冲仓9上还设有洗脱负压管7。

3.根据权利要求2的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，其特征在于，其中裂解仓5与洗脱管16之间设置有裂解仓开关18，反应池12与混合管14之间设置有反应池开关13。

4.根据权利要求3的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，其特征在于，其中洗脱负压管7未连接缓冲仓9的一端设置有抽洗脱口6，反应池负压管10未连接反应池12的一端设置有抽反应池口8，废液仓19上还连接有废液仓负压管1，废液仓负压管1未连接废液仓19的一端设置有抽废液口2。

5.根据权利要求1-4任一项的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，其特征在于，其中核酸扩增与检测仓体23通过核酸扩增与检测仓固定卡11固定于芯片盒主体22上。

6.根据权利要求5的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，其中抽废液口2上设置有胶塞20和隔离膜21。

7.根据权利要求1-6任一项的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒，其特征在于，其中液体加注孔4上有可掀起的隔离盖26将裂解仓5与外界分隔开。

8.根据权利要求1-7任一项的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒在非诊断核酸现场检测中的应用。

9.根据权利要求8的应用，所述全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒和相应的等温扩增配套试剂和设备相结合进行快速核酸等温扩增检测。

10.根据权利要求8或9的应用，其中非诊断核酸现场检测为病原体核酸检测或基因筛查。

11.根据权利要求1-7任一项的全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒的非诊断使用方法，包括：

a.关闭裂解仓开关18，将样本与裂解液加入裂解仓5，将全自动核酸提取扩增检测微流控芯片盒放置于全自动核酸提取扩增检测仪内，进行裂解，裂解完毕后，在抽废液口2抽气使废液仓19中形成负压，裂解液经过核酸提取膜17后被抽入废液仓19，而裂解后的核酸留在核酸提取膜上；

b.经过加注盖24将洗液加注至裂解仓5，洗涤后，将洗涤后的废液抽入废液仓19中，根据需要洗涤一次以上，直到洗涤完成；

c.经过加注盖24注入洗脱液，等待一段时间后，打开裂解仓开关18，并从抽洗脱口6抽气，使得缓冲仓9中形成负压，带有的核酸的洗脱液抽入缓冲仓9中；

d.缓冲仓9的液体进入试剂仓15，与试剂仓15中事先加入的试剂充分混合和溶解；

e.将反应池开关13打开，从抽反应池口8抽气，试剂与核酸的混合液体经混合管14进入反应池12，然后关闭反应池开关13；

f.进行PCR反应并检测反应结果。