CN111575152B - 一种集成核酸提取扩增检测功能于一体的封闭式卡盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种集成核酸提取扩增检测功能于一体的封闭式卡盒及检测方法，包括卡盒本体、试剂通道、气路通道、阀、扩增液存储腔、清洗液存储腔、裂解管、扩增管和动力源，整体形成一个封闭空间，扩增液存储腔预埋了扩增液，清洗液存储腔预埋了清洗液，不同试剂通道和气路通道的通断使用阀进行切换；核酸提取和检测时，转动阀到不同的位置，进而导通不同的试剂通道和气路通道，然后外接动力源提供动力给气源接口，进而控制卡盒内的试剂流动，即将裂解管中的样本转移进入扩增管，随后在扩增管内完成核酸吸附、杂质清洗、废液转移至裂解管、扩增液注入至扩增管，扩增管密封等核酸提取过程，最后直接在扩增管中对反应液中的核酸进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型核酸检测卡盒，特别涉及一种集成核酸提取、扩增、检测功能于一体的封闭式卡盒及检测方法。
背景技术
传统的病原微生物检测方法都要经过分离培养、生化鉴定等步骤，一般需要3-7天， 检测时间较长，在应对突发性公共卫生事件上，很难满足快速、准确、灵敏和特异性高等要求。因此，如何应对这一新挑战已成为急需解决的重要问题。
随着分子生物学的发展，体外快速扩增目的DNA/RNA片段的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术获得广泛应用，已成为病原体基因快速检测的 主要方法。实时荧光PCR技术通过引入荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR过 程进行实时监控，实现了从定性判断到定量分析的飞跃，能对病原体基因进行高效、特 异性检测，大大缩短了检出窗口期，有利于实现早诊断、早治疗，降低病死率。
核酸检测周期短，灵敏度特异性与培养法相当，但存在以下的问题：1)将包括临床样品裂解释放核酸、核酸吸附、洗涤杂质、洗脱核酸，配置PCR反应体系以及核酸扩 增分开进行，不仅操作步骤繁杂，而且耗时长；2)多设备联用，需要专业实验室及人 员，过多的人工操作还易造成样品的交叉污染，进而造成假阴性或假阳性，同时检验人 员被感染的风险倍增，严重制约了这项技术的应用和推广。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案，一种集成核酸提取、扩增、 检测功能于一体的封闭式卡盒，包括卡盒本体、第一试剂通道、第二试剂通道、第三试剂通道、第四试剂通道、第一气路通道、第二气路通道、第三气路通道、第四气路通道、 第一阀、第二阀、扩增液存储腔、清洗液存储腔、裂解管、扩增管和动力源，整体形成 一个封闭空间；
所述裂解管用于样本高温裂解，所述扩增管用于核酸吸附和扩增检测；
所述扩增液存储腔预埋有扩增液，清洗液存储腔预埋有清洗液；第一试剂通道、第二试剂通道、第三试剂通道、第四试剂通道和第一气路通道、第二气路通道、第三气路 通道、第四气路通道的通断分别使用第一阀、第二阀进行切换；核酸提取和检测时，第 一阀、第二阀分别转到的不同位置，进而导通第一试剂通道、第二试剂通道、第三试剂 通道、第四试剂通道和第一气路通道、第二气路通道、第三气路通道、第四气路通道， 然后动力源提供动力进而控制卡盒内的试剂流动，即将裂解管中的样本转移进入扩增管， 随后在扩增管内完成核酸提取过程，包括：核酸吸附、杂质清洗、废液转移至裂解管、 扩增液注入至扩增管，扩增管密封，最后直接在扩增管中对反应液中的核酸进行检测。
进一步的，通过旋转第二阀，导通第一气路通道、第二气路通道、第一导气管，使其与裂解管导通；通过旋转第二阀，导通第一导液管、第一试剂通道、第二试剂通道、 第二导液管，进而连接扩增管和扩增管；通过旋转第一阀，第三气路通道、第四气路通 道、第二导气管，使其与扩增管导通；通过旋转第二阀，导通第三试剂通道、第二试剂 通道、第二导液管，进而连接清洗存储腔和扩增管；通过旋转第二阀，导通第四试剂通 道、二试剂通道、第二导液管，进而连接扩增液存储腔和扩增管。
进一步的，所述卡盒本体左侧设置有第一密封盖，并安装有第一透气不透液膜，用于防止气溶胶污染。
进一步的，所述卡盒本体底部设置有两个梯形凸台，即第一梯形凸台、第二梯形凸台，用于密封安装裂解管和扩增管。
进一步的，所述卡盒本体底部第一梯形凸台安装有第一导液管和第一导气管，插入 裂解管内部；卡盒本体底部还安装有第二梯形凸台安装有第二导液管和第二导气管；插入扩增管的内部，分别用于作为液体试剂转移和气源动力提供通道。
进一步的，所述裂解管和扩增管设置在卡盒本体底部，卡盒本体顶部设置有动力源， 用于提供卡盒内部试剂转移所需的动力。
进一步的，所述裂解管用于裂解样本释放核酸，所述扩增管的内表面经过修饰，用于吸附负电荷核酸并进行扩增检测。
进一步的，所述卡盒本体上端设置有扩增液存储腔和清洗液存储腔，用于存放扩增 液和清洗液；扩增液存储腔配有第三密封盖，第三密封盖上安装有第三透气不透液膜，用于扩增液存储腔内的气压平衡和防止气溶胶污染；清洗液存储腔配有第二密封盖，第 二密封盖上含安装有第二透气不透液膜，用于清洗液存储腔内的气压平衡和防止气溶胶 污染。
进一步的，用于从生物样本中分离DNA和RNA，并直接在扩增管中完成核酸扩增 检测。
根据本发明的另一方面，提出一种一体化核酸提取、扩增、检测方法，包括如下步骤：
步骤1)、取临床样本加入一定体积的悬浮液重悬拭子样本；
步骤2)、取一定体积的样本注入裂解管并将裂解管安装在封闭式卡盒的第一梯形凸台，在第二梯形凸台处预先安装有扩增管；
步骤3)、裂解样本，释放核酸：关闭第一阀、第二阀，使各试剂通道和气路通道 保持关闭状态，裂解管和扩增管处于完全密封的状态，然后，启动加热过程，使裂解管 中的样本被充分地裂解；
步骤4)、转移裂解液：将裂解管中的被裂解后样本转移进入扩增管；
步骤5)、核酸吸附：驱动机构与第一阀、第二阀连接，控制第一阀、第二阀旋转， 进而使裂解管与扩增管相互关断，使扩增管核酸吸附分钟；
步骤6)、废液转移步骤：将扩增管中的废液转移进入裂解管，此时裂解管作为废液腔使用；第一气路通道与第一密封盖相互连接；
步骤7)、扩增管清洗步骤：即将清洗液存储腔中的清洗液转移进入扩增管，以完成杂质清洗步骤；清洗液存储腔含有第二密封盖，第二密封盖上含安装有第二透气不透 液膜，用于清洗液存储腔内的气压平衡和防止气溶胶污染；
步骤8)、废液转移步骤：即将扩增管中的废液转移进入裂解管，此时裂解管作为废液腔使用；第一气路通道与第一密封盖相互连接；
步骤9)、转移扩增液：将扩增液存储腔中的扩增液转移进入扩增管，以完成扩增前的试剂准备工作；；
步骤10)、扩增反应：使裂解管和扩增管处于完全密封的状态，接着控制一体化 核酸检测仪启动生降温过程，并直接在扩增管中对反应液中的核酸进行检测。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
本发明提供的一种集成核酸提取、扩增、检测功能于一体的封闭式卡盒，集成了核酸提取和扩增检测两个步骤，在一个小的密闭的盒体内完成，可用于没有分子诊断实验 室环境下的核酸提取和扩增检测，具有结构紧凑、易于操作、结构简单、易装配等优点， 有效提高分子诊断类产品的环境适应度。
附图说明
图1是本发明的卡盒结构示意图；
图2是本发明的封闭式卡盒和商品化手工磁珠法核酸提取试剂盒提取混入血清中的 H5-Re6疫苗株样本的扩增曲线对比结果。
附图标记说明：1卡盒本体；2第一密封盖；22第一透气不透液膜；222第一气路 通道；3第二气路通道；4第一梯形凸台；5第一导气管；6裂解管；7第一导液管；8 第一试剂通道；9第二试剂通道；10第二梯形凸台；11扩增管；12第二导液管；13第 二导气管；14第三气路通道；15第一阀；16动力源；161第四气路通道；17第二密封 盖；171第二透气不透液膜；172清洗液存储腔；173第三试剂通道；18第三密封盖； 181第三透气不透液膜；182扩增液存储腔；183第四试剂通道；19第二阀。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施 例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
如图1-2所示，一种集成核酸提取、扩增、检测功能于一体的封闭式卡盒，包括卡盒本体1、第一试剂通道8、第二试剂通道9、第三试剂通道173、第四试剂通道183、 第一气路通道222、第二气路通道3、第三气路通道14、第四气路通道161、第一阀15、 第二阀19、扩增液存储腔182、清洗液存储腔172、裂解管6、扩增管11和动力源16， 整体形成一个封闭空间。通过旋转第二阀19，导通第一气路通道222、第二气路通道3、 第一导气管5，使它们与裂解管6导通。通过旋转第二阀19，导通第一导液管7、第一 试剂通道8、第二试剂通道9、第二导液管12，进而连接裂解管6和扩增管11。通过旋 转第一阀15，第三气路通道14、第四气路通道161、第二导气管13，使它们与扩增管 11导通。通过旋转第二阀19，导通第三试剂通道173、第二试剂通道9、第二导液管12， 进而连接清洗存储腔172和扩增管11。通过旋转第二阀19，导通第四试剂通道183、第 二试剂通道9、第二导液管12，进而连接扩增液存储腔182和扩增管11。裂解管6可供 样本高温裂解使用。扩增管11可供核酸吸附和扩增检测使用。扩增液存储腔182预埋 了扩增液。清洗液存储腔172预埋了清洗液。第一试剂通道8、第二试剂通道9、第三 试剂通道173、第四试剂通道183和第一气路通道222、第二气路通道3、第三气路通道 14、第四气路通道161的通断使用第一阀15，第二阀19进行切换。核酸提取和检测时， 第一阀15，第二阀19到不同的位置，进而导通第一试剂通道8、第二试剂通道9、第三 试剂通道173、第四试剂通道183和第一气路通道222、第二气路通道3、第三气路通道 14、第四气路通道161，然后动力源16提供动力进而控制卡盒内的试剂流动，即将裂解 管6中的样本转移进入扩增管11，随后在扩增管11内完成核酸吸附、杂质清洗、废液 转移至裂解管6、扩增液注入至扩增管11，扩增管11密封等核酸提取过程，最后直接 在扩增管11中对反应液中的核酸进行检测。
在裂解管6内放置有裂解液，扩增液存储腔182内放置扩增液，在清洗液存储腔172加入清洗液。扩增液存储腔182和清洗液存储腔172分别含有第二密封盖17和第三密 封盖18，第二密封盖17和第三密封盖18上分别含有第二透气不透液膜171和第三透气 不透液膜181，用于平衡试剂室内的气压和防止气溶胶污染。裂解管6可作为废液腔使 用。扩增管11的内表面经过修饰，可用于吸附负电荷核酸并进行扩增检测。
所述卡盒工作前需将卡盒置于一体化核酸检测仪内部，保证裂解管6和扩增管11对正插入加热模块，完成整个卡盒的正确安装。第一阀15，第二阀19可以与驱动机构 连接完成旋转运动，用于切换不同的第一试剂通道8、第二试剂通道9、第三试剂通道 173、第四试剂通道183和第一气路通道222、第二气路通道3、第三气路通道14、第四 气路通道161。卡盒本体1顶部设置动力源16，可以为卡盒内部试剂转移提供所需的动 力。
根据本发明的一个实施例，上述封闭式卡盒具体操作流程如下：
1)取临床样本加入一定体积的悬浮液重悬拭子样本；
2)取一定体积的样本注入裂解管6并将裂解管6安装在封闭式卡盒的第一梯形凸台4，在第二梯形凸台10处预先安装有扩增管11；
3)裂解样本，释放核酸：关闭第一阀15，第二阀19，使各试剂通道和气路通道保 持关闭状态，裂解管6和扩增管11处于完全密封的状态。然后，启动加热过程，使裂 解管6中的样本被充分地裂解，并尽可能多的释放核酸；
4)转移裂解液：一体化核酸检测仪中的驱动机构与第一阀15，第二阀19连接，控制第一阀15，第二阀19旋转，导通第一气路通道222、第二气路通道3、第一导气管5、 裂解管6、第一导液管7、第一试剂通道8、第二试剂通道9、扩增管11、第二导液管 12、第二导气管13，进而使裂解管6与扩增管11相互导通；然后动力源16提供负压动 力，动力通过第四气路通道161、第三气路通道14传递给扩增管11，进而控制卡盒内 的试剂流动，即将裂解管6中的被裂解后样本转移进入扩增管11；
5)核酸吸附：一体化核酸检测仪中的驱动机构与第一阀15，第二阀19连接，控制第一阀15，第二阀19旋转，进而使裂解管6与扩增管11相互关断，使扩增管11核酸 吸附10分钟；
6)废液转移步骤1：一体化核酸检测仪中的驱动机构与第一阀15，第二阀19连接，控制第一阀15，第二阀19旋转，导通第一气路通道222、第二气路通道3、第一导气管 5、裂解管6、第一导液管7、第一试剂通道8、第二试剂通道9、扩增管11、第二导液 管12、第二导气管13，进而使裂解管6与扩增管11相互导通；然后动力源16提供正 压动力，动力通过第四气路通道161、第三气路通道14传递给扩增管11，进而控制卡 盒内的试剂流动，即将扩增管11中的废液转移进入裂解管6，此时裂解管6作为废液腔 使用；第一气路通道222与第一密封盖2相互连接，第一密封盖2配置有第一透气不透 液膜22，用于防止气溶胶污染；
7)扩增管清洗步骤：一体化核酸检测仪中的驱动机构与第一阀15，第二阀19连接，控制第一阀15，第二阀19旋转，导通第三试剂通道173、第二试剂通道9、扩增管11、 第二导液管12、第二导气管13，进而使清洗液存储腔172与扩增管11相互导通；然后 动力源16提供负压动力，动力通过第四气路通道161、第三气路通道14传递给扩增管 11，进而控制卡盒内的试剂流动，即将清洗液存储腔172中的清洗液转移进入扩增管11， 以完成杂质清洗步骤；清洗液存储腔172含有第二密封盖17，第二密封盖17上含安装 有第二透气不透液膜171，用于清洗液存储腔172内的气压平衡和防止气溶胶污染；
8)废液转移步骤2：一体化核酸检测仪中的驱动机构与第一阀15，第二阀19连接，控制第一阀15，第二阀19旋转，导通第一气路通道222、第二气路通道3、第一导气管 5、裂解管6、第一导液管7、第一试剂通道8、第二试剂通道9、扩增管11、第二导液 管12、第二导气管13，进而使裂解管6与扩增管11相互导通；然后动力源16提供正 压动力，动力通过第四气路通道161、第三气路通道14传递给扩增管11，进而控制卡 盒内的试剂流动，即将扩增管11中的废液转移进入裂解管6，此时裂解管6作为废液腔 使用；第一气路通道222与第一密封盖2相互连接，第一密封盖2配置有第一透气不透 液膜22，用于防止气溶胶污染；
9)转移扩增液：一体化核酸检测仪中的驱动机构与第一阀15，第二阀19连接，控制第一阀15，第二阀19旋转，导通第四试剂通道183、第二试剂通道9、扩增管11、 第二导液管12、第二导气管13，进而使扩增液存储腔182与扩增管11相互导通；然后 动力源16提供负压动力，动力通过第四气路通道161、第三气路通道14传递给扩增管 11，进而控制卡盒内的试剂流动，即将扩增液存储腔182中的扩增液转移进入扩增管11， 以完成扩增前的试剂准备工作。扩增液存储腔182含有第三密封盖18，第三密封盖18 上含安装有第三透气不透液膜181，用于扩增液存储腔182内的气压平衡和防止气溶胶 污染；
10)扩增反应：一体化核酸检测仪中的驱动机构与第一阀15，第二阀19连接，控 制第一阀15，第二阀19旋转，使裂解管6和扩增管11处于完全密封的状态。接着控制 一体化核酸检测仪启动生降温过程，并直接在扩增管11中对反应液中的核酸进行检测。
本发明的一种集成核酸提取、扩增、检测功能于一体的封闭式卡盒，可用于没有分子诊断实验室环境下的核酸提取和扩增检测，具有结构紧凑、易于操作、环境容忍度高、 可检测多个指标等优点。
对比例1
对比实施例1，采用商品化手工磁珠法核酸提取试剂盒(QIAGEN kit)提取混入血清中的H5-Re6疫苗株样本(10^5copies/mL)。
DNA质量采用罗氏LC96荧光定量PCR仪进行扩增并记录循环阈值，)。
结果分析：
图2显示了手工方法和本发明的封闭式卡盒的方法的对比曲线，纵坐标为荧光强度， 横坐标为循环阈值，单位，Ct。
可见，本发明提出的一种集成核酸提取、扩增、检测功能于一体的封闭式卡盒，可提取混入血清中的H5-Re6疫苗株样本，性能与商品化手工磁珠法核酸提取试剂盒相当。
综上，本发明提出了一种集成核酸提取、扩增、检测功能于一体的封闭式卡盒，包括卡盒本体、阀、裂解管、扩增管和动力源，整体形成一个封闭空间。注入样本进入裂 解管后，将卡盒安放在一体化核酸提取仪上后，即可自动化完成核酸提取和扩增检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施 例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。
Claims (7)
1.一种集成核酸提取扩增检测功能于一体的封闭式卡盒，其特征在于：包括卡盒本体、第一试剂通道、第二试剂通道、第三试剂通道、第四试剂通道、第一气路通道、第二气路通道、第三气路通道、第四气路通道、第一阀、第二阀、扩增液存储腔、清洗液存储腔、裂解管、扩增管和动力源，整体形成一个封闭空间；
所述裂解管用于样本高温裂解，所述扩增管用于核酸吸附和扩增检测；
所述扩增液存储腔预埋有扩增液，清洗液存储腔预埋有清洗液；第一试剂通道、第二试剂通道、第三试剂通道、第四试剂通道和第一气路通道、第二气路通道、第三气路通道、第四气路通道的通断分别使用第一阀、第二阀进行切换；核酸提取和检测时，第一阀、第二阀分别转到的不同位置，进而导通第一试剂通道、第二试剂通道、第三试剂通道、第四试剂通道和第一气路通道、第二气路通道、第三气路通道、第四气路通道，然后动力源提供动力进而控制卡盒内的试剂流动，即将裂解管中的样本转移进入扩增管，随后在扩增管内完成核酸提取过程，包括：核酸吸附、杂质清洗、废液转移至裂解管、扩增液注入至扩增管，扩增管密封，最后直接在扩增管中对反应液中的核酸进行检测；
通过旋转第二阀，导通第一气路通道、第二气路通道、第一导气管，使其与裂解管导通；通过旋转第二阀，导通第一导液管、第一试剂通道、第二试剂通道、第二导液管，进而连接扩增管和扩增管；通过旋转第一阀，第三气路通道、第四气路通道、第二导气管，使其与扩增管导通；通过旋转第二阀，导通第三试剂通道、第二试剂通道、第二导液管，进而连接清洗存储腔和扩增管；通过旋转第二阀，导通第四试剂通道、二试剂通道、第二导液管，进而连接扩增液存储腔和扩增管；
所述卡盒本体底部第一梯形凸台安装有第一导液管和第一导气管，插入裂解管内部；卡盒本体底部还安装有第二梯形凸台安装有第二导液管和第二导气管；插入扩增管的内部，分别用于作为液体试剂转移和气源动力提供通道；
所述卡盒本体上端设置有扩增液存储腔和清洗液存储腔，用于存放扩增液和清洗液；扩增液存储腔配有第三密封盖，第三密封盖上安装有第三透气不透液膜，用于扩增液存储腔内的气压平衡和防止气溶胶污染；清洗液存储腔配有第二密封盖，第二密封盖上含安装有第二透气不透液膜，用于清洗液存储腔内的气压平衡和防止气溶胶污染。
2.根据权利要求1所述的一种集成核酸提取扩增检测功能于一体的封闭式卡盒，其特征在于：
所述卡盒本体左侧设置有第一密封盖，并安装有第一透气不透液膜，用于防止气溶胶污染。
3.根据权利要求1所述的一种集成核酸提取扩增检测功能于一体的封闭式卡盒，其特征在于：
所述卡盒本体底部设置有两个梯形凸台，即第一梯形凸台、第二梯形凸台，用于密封安装裂解管和扩增管。
4.根据权利要求1所述的一种集成核酸提取扩增检测功能于一体的封闭式卡盒，其特征在于：
所述裂解管和扩增管设置在卡盒本体底部，卡盒本体顶部设置有动力源，用于提供卡盒内部试剂转移所需的动力。
5.根据权利要求1所述的一种集成核酸提取扩增检测功能于一体的封闭式卡盒，其特征在于：
所述裂解管用于裂解样本释放核酸，所述扩增管的内表面经过修饰，用于吸附负电荷核酸并进行扩增检测。
6.根据权利要求1所述的一种集成核酸提取扩增检测功能于一体的封闭式卡盒，其特征在于：
用于从生物样本中分离DNA和RNA，并直接在扩增管中完成核酸扩增检测。
7.一种一体化核酸提取、扩增、检测方法，利用权利要求1-6之一的封闭式卡盒，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）、取临床样本加入一定体积的悬浮液重悬拭子样本；
步骤2）、取一定体积的样本注入裂解管并将裂解管安装在封闭式卡盒的第一梯形凸台，在第二梯形凸台处预先安装有扩增管；
步骤3）、裂解样本，释放核酸：关闭第一阀、第二阀，使各试剂通道和气路通道保持关闭状态，裂解管和扩增管处于完全密封的状态，然后，启动加热过程，使裂解管中的样本被充分地裂解；
步骤4）、转移裂解液：将裂解管中的被裂解后样本转移进入扩增管；
步骤 5）、核酸吸附：驱动机构与第一阀、第二阀连接，控制第一阀、第二阀旋转，进而使裂解管与扩增管相互关断，使扩增管核酸吸附分钟；
步骤 6）、废液转移步骤：将扩增管中的废液转移进入裂解管，此时裂解管作为废液腔使用；第一气路通道与第一密封盖相互连接；
步骤 7）、扩增管清洗步骤：即将清洗液存储腔中的清洗液转移进入扩增管，以完成杂质清洗步骤；清洗液存储腔含有第二密封盖，第二密封盖上含安装有第二透气不透液膜，用于清洗液存储腔内的气压平衡和防止气溶胶污染；
步骤 8）、废液转移步骤：即将扩增管中的废液转移进入裂解管，此时裂解管作为废液腔使用；第一气路通道与第一密封盖相互连接；
步骤 9）、转移扩增液：将扩增液存储腔中的扩增液转移进入扩增管，以完成扩增前的试剂准备工作；
步骤 10）、扩增反应：使裂解管和扩增管处于完全密封的状态，接着控制一体化核酸检测仪启动生降温过程，并直接在扩增管中对反应液中的核酸进行检测。
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