CN112760210B - 一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔、带第一清洗液的第一清洗腔和带第二清洗液的第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液，和新型冠状病毒检测引物和探针组合；所述裂解腔内设有能穿过柱塞的柱塞孔的磁珠。本发明可以在相对较低成本的情况下，一体化地对新型冠状病毒进行核酸提取和PCR扩增，进而可直接进行光学检测所需的数据收集和分析。

Description

一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒
技术领域
本发明涉及一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，属于医学检测技术领域。
背景技术
2020年1月12日，世界卫生组织正式命名新型冠状病毒为 2019-nCoV，并将由该病毒引起的肺炎命名为COVID-19。
目前临床应用的新型冠状病毒的检测方法主要有以下几种：
(1)分离培养
病毒可在体外感染多种人源或者非人源细胞系，将病毒接种在细胞系上培养，就可观察细胞病变并做病毒分离，从而对病毒做出鉴定。培养所需周期较长，且需在生物安全三级实验室中进行，该法在临床诊断中应用受限。
(2)特异性抗体检测
病毒感染人体后会使人体出现特异性免疫反应，产生特异性的抗体，可通过酶联免疫(ELISA)或胶体金等方法检出。因IgM、IgG抗体产生的窗口期及交叉反应，所以此法适用于初步筛查。
(3)核酸分子检测法
对于有呼吸道症状和流行病学接触史的可疑病例，采用实时荧光 PCR方法，通过对痰液、鼻咽拭子、肺泡灌洗液等标本进行新型冠状病毒核酸检测，可对感染进行确诊。但常规荧光PCR整体检测操作时间需要3-4小时，过程繁杂，且需要PCR实验室和专业人员，限制条件较多。
由于分离培养检测周期长，且要求的三级生物安全实验室仅在非常少数的顶级医院才有配备，故目前新冠检测主要集中在抗体和核酸检测。核酸检测目前是新型冠状病毒检测的“金标准”，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点；但抗体检测操作便捷、检测迅速，可作为核酸诊断的补充手段，但由于抗体检测“假阳性”和“假阴性”的局限性，不适合用于复工复产复学等普通人群筛查，也不适用于在低流行地区的流行病学调查。
常规的核酸检测采用实时荧光定量PCR方法，操作技能要求严格，需经专业培训，执PCR上岗证上岗，必须在PCR认证实验室开展。新冠病毒核酸检测根据核酸提取的方式的不同一般耗时30分钟至 120分钟不等、核酸扩增时间在2小时之内，而加上试剂准备、加样、结果分析等人工操作的时间，一般一次实验需要耗时4-5小时，如果考虑到样本在院内的流转时间，则从患者取样到拿到检测结果一般需要6-8小时。绝大多数基层医院实验室并不具备上述专业人员和设备设施，只会将样本运送至有资质的实验室，而大部分情况下，有资质的实验室自己医院的样本都做不完，核酸确诊的难度可想而知。所以，真正受到临床认可的还是分子POCT进行的核酸检测。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒。它可以在相对较低成本的情况下，一体化地对新型冠状病毒进行核酸提取和PCR扩增，进而可直接进行光学检测所需的数据收集和分析，无需像常规核酸检测技术那样需要二级生物安全资质的核酸检测实验室(包括试剂配制间，核酸提取间和PCR扩增间)和专业技术人员进行手工PCR扩增体系的配制，提取核酸的加样，扩增基因的检测，荧光数据的分析和实验结果的判定。它可以用于真正实现从样本到结果输出的自动化，帮助条件有限地区实现快速的核酸检测。
本发明的技术方案：一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特点是：包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔、带第一清洗液的第一清洗腔和带第二清洗液的第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液，和新型冠状病毒检测引物和探针组合；所述裂解腔内设有能穿过柱塞的柱塞孔的磁珠。通过推动柱塞，可以使柱塞孔对准两个相邻腔体的连通区间，此时两个腔体件依靠附着在柱塞孔内的疏水性液态封闭材料进行隔离，然后磁珠(利用外部磁钢拖动)便可穿过柱塞孔的疏水性液态封闭材料，从一个腔体转移到另一个腔体。磁珠也可以在使用时加入。
上述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，所述反应腔中的反应液的部分反应组分包埋在可熔性材料内。使反应液体系的反应液和酶促金属离子分离，避免金属离子刺激酶蛋白，延长卡盒的有效期。
前述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，扩增反应所需的锰离子液包埋在可熔性材料内。可熔性材料为石蜡、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃类物质中的任意一种或多种的组合，熔点范围为20℃-95℃，优选石蜡，使用时熔化为液态的石蜡油可以防止形成气溶胶的PCR产物污染环间；石蜡油热传导性弱，有效保证PCR的温度条件；石蜡的低温凝固特性在磁珠回拖温度下降后可以固定磁珠位置。石蜡可熔性使包埋物可以使反应液从隔离状态合并。
前述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，所述反应液内含有Tth DNA聚合酶或rTth DNA聚合酶。选用该酶，能够同时对病原RNA进行逆转录和DNA扩增，且能够在卡盒使用时耐受盒内可熔性材料熔化时所需的高温(65度-95度)，能够在2-8度下长期保存。
前述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，所述新型冠状病毒检测引物和探针组合包括：用于检测新型冠状病毒S靶基因的引物对和探针、N靶基因的引物对和探针，以及用于检测内标RNase P 基因的引物对和探针，具体为
名称 序列号 序列(5'--3')
2019-nCoV S基因上游引物 SEQ ID NO:1 CATGTTCTTTTGGTGGTGTCAG
2019-nCoV S基因下游引物 SEQ ID NO:2 GCATGAATAGCAACAGGGACTT
2019-nCoV S基因探针 SEQ ID NO:3 AATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCT
2019-nCoV N基因上游引物 SEQ ID NO:4 GGTGATGCTGCTCTTGCTT
2019-nCoV N基因下游引物 SEQ ID NO:5 CCTTGTTGTTGTTGGCCTTTAC
2019-nCoV N基因探针 SEQ ID NO:6 CATTTTGCTCTCAAGCTGGTTCAATC
内标RNaseP基因上游引物 SEQ ID NO:7 ACATCAAGAAGGTGGTGAAGCA
内标RNaseP基因下游引物 SEQ ID NO:8 GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA
内标RNaseP基因探针 SEQ ID NO:9 TCAAGGGCATCCTGGGCTACACTG
前述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠，0.1-10％聚乙二醇8000，0.1-10M异硫氰酸胍，0.1-10％Triton X-100，0.1-5％月桂基硫酸钠，pH为 3.0-7.0，溶剂为ddH2O。以上百分比均为质量百分比。
前述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，所述所述第一清洗液和第二清洗液均包含1-500mM Tris-HCl，10-500mM KCl， 0.1-10％聚乙二醇8000，pH为7.0-9.0，溶剂为ddH2O。上述裂解液和清洗液的选择，不含蛋白酶K，使产品无需-20度保存。以上百分比均为质量百分比。
前述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，所述柱塞的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠的直径为20-200nm，疏水性液态封闭材料的密度为0.8-1.5g/cm3，粘度为2000-20000MPa.s。该设置可以确保疏水性液态封闭材料能够利用附着力隔离不同区间的液体，又能顺利通过磁珠，且对磁珠有分散作用，清楚磁珠上的非极性杂质。
前述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，所述疏水性液态封闭材料为硅油。
前述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒中，所述反应腔为置于盒体外侧的锥管，锥管一侧设有平面，便于外部磁钢将磁珠拉回至上方的可熔性材料中(降温后凝固)，进而不会对光学检测产生干扰。
与现有技术相比，本发明使用柱塞结合疏水性液态封闭材料的方式对多个功能性腔体进行隔离，使各个腔体间的液体不会外溢，生物样本能够在各个腔体内分别进行裂解、清洗纯化和扩增反应，并可以利用磁珠以附着方式将核酸依次带入各个腔体，其中疏水性液态封闭材料能够对磁珠有个分散作用，它能够允许穿过磁珠和磁珠上的核酸，阻隔其它杂质，当磁珠穿过时，磁珠上附着的如一些非极性大颗粒的杂质会浸润在疏水性液态封闭材料内而被截留，可以降低杂质对检测结果的影响。此外，本发明的卡盒内还通过在反应液中设置筛选出的新型冠状病毒检测引物和探针组合，使其能够以较高的准确性和灵敏度对新型冠状病毒检进行核酸的检测。
本发明的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒具有以下优点：
1)全封闭式设计：1台够拖动磁珠并可以进行荧光分析的检测设备，少量实验室基础小设备就能完成复杂的核酸检测实验。它采用将核酸提取、扩增、检测等流程集中在全封闭卡盒内，从结构上杜绝气溶胶污染，保护检测人员安全性，无需PCR实验室。大大降低了核酸检测对实验室建设标准的要求。有助于条件有限地区的联防布控；
2)极简操作：以手工操作时间2-5分钟，装入检测设备后30-90 分钟即可出结果，便于实现核酸提取与扩增一体化的全自动化，大大降低了对检验人员专业技能的要求，适合于快速现场的床边诊断；
3)冷藏保存：2-8度冷藏保存，无需常规的-20度冷冻保存，有助于产品的冷链运输和保存。
附图说明
图1是本发明卡盒的结构示意图；
图2是图1的侧向示意图。
附图中的标记为：1-盒体，2-盒盖，3-裂解腔，4-第一清洗腔， 5-第二清洗腔，6-反应腔，7-柱塞，8-磁珠。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例。一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，如图1所示：包括顶部带盒盖2的盒体1，盒体1内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔3、带第一清洗液的第一清洗腔4和带第二清洗液的第二清洗腔5，其中裂解腔3连通至盒盖2，第二清洗腔5连通至盒体1 外侧底部设置的反应腔6；所述裂解腔3、第一清洗腔4、第二清洗腔5和反应腔6的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞7，柱塞7的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔6内设有扩增反应液，和新型冠状病毒检测引物和探针组合；所述裂解腔3内设有能穿过柱塞7的柱塞孔的磁珠8。所述反应腔6中的反应液的部分反应组分包埋在可熔性材料内。扩增反应所需的锰离子液包埋在可熔性材料内。所述反应液内含有Tth DNA聚合酶或rTth DNA聚合酶。所述新型冠状病毒检测引物和探针组合包括：用于检测新型冠状病毒S靶基因的引物对和探针、N靶基因的引物对和探针，以及用于检测内标RNase P基因的引物对和探针，具体为
名称 序列号 序列(5'-3')
2019-nCoV S基因上游引物 SEQ ID NO:1 CATGTTCTTTTGGTGGTGTCAG
2019-nCoV S基因下游引物 SEQ ID NO:2 GCATGAATAGCAACAGGGACTT
2019-nCoV S基因探针 SEQ ID NO:3 AATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCT
2019-nCoV N基因上游引物 SEQ ID NO:4 GGTGATGCTGCTCTTGCTT
2019-nCoV N基因下游引物 SEQ ID NO:5 CCTTGTTGTTGTTGGCCTTTAC
2019-nCoV N基因探针 SEQ ID NO:6 CATTTTGCTCTCAAGCTGGTTCAATC
内标RNaseP基因上游引物 SEQ ID NO:7 ACATCAAGAAGGTGGTGAAGCA
内标RNaseP基因下游引物 SEQ ID NO:8 GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA
内标RNaseP基因探针 SEQ ID NO:9 TCAAGGGCATCCTGGGCTACACTG
所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠，0.1-10％聚乙二醇 8000，0.1-10M异硫氰酸胍，0.1-10％Triton X-100，0.1-5％月桂基硫酸钠，pH为3.0-7.0。
所述所述第一清洗液和第二清洗液均包含1-500mM Tris-HCl， 10-500mM KCl，0.1-10％聚乙二醇8000，pH为7.0-9.0。
所述柱塞7的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠的直径为20-200nm，疏水性液态封闭材料的密度为0.8-1.5g/cm3，粘度为2000-20000 MPa.s。所述疏水性液态封闭材料为硅油。
所述反应腔6为置于盒体1外侧的锥管，锥管一侧设有平面，如图2中的A部所示。
实施例1引物探针设计及筛选。
1、本发明对新型冠状病毒2019-nCoV序列进行分析和研究，设计了表1-表4所示的引物探针组。
表1本发明引物探针
Figure BDA0002933471640000071
Figure BDA0002933471640000081
表2对照组1引物探针
Figure BDA0002933471640000082
表3对照组2引物探针
Figure BDA0002933471640000083
Figure BDA0002933471640000091
表4对照组3引物探针
Figure BDA0002933471640000092
2、同时经过检测体系优化，建立如下检测体系：每管PCR加入 30ul RT-PCR扩增液及5ul锰离子液。并加入5ul模板RNA。
30ul RT-PCR扩增液：包括引物、探针和PCR缓冲液；
用于检测S靶基因的探针使用浓度200nM，用于检测N靶基因的探针使用浓度200nM，用于检测内标的探针使用浓度100nM，用于检测S靶基因的上下游引物使用浓度400nM，用于检测N靶基因的上下游引物使用浓度400nM，用于检测内标的上下游引物使用浓度200nM。
PCR缓冲液的组成为：50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L (NH4)SO4，30mmol/LKCl，4.0mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs， 5U rTth DNA聚合酶。5ul锰离子液(25mM醋酸锰)，5ul模板RNA。
3、利用上述表1-表4所示各组引物探针进行检测，使用 2019-nCoV质控品进行测试
荧光通道设定如下表
Figure BDA0002933471640000093
Figure BDA0002933471640000101
扩增程序如下
Figure BDA0002933471640000102
4、各组引物探针配置的反应液检测结果如下：
引物探针组合 S基因CT N基因CT 内标CT效率
本发明 29.23 27.26 26.42
对照1 30.82 28.18 26.5
对照2 31.65 29.33 27.98
对照3 34.49 29.62 28.16
结果显示：对比对照组1-3，本发明的引物探针的检测敏感性和特异性最优。
实施例2。试剂卡盒的建立。
1、试剂卡盒包括如下组分：
①引物探针组合
Figure BDA0002933471640000103
②检测液组分：
PCR缓冲液的组成为：50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L (NH4)SO4，30mmol/LKCl，4.0mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，5U rTth DNA聚合酶，检测S靶基因的探针使用浓度200nM，用于检测N靶基因的探针使用浓度200nM，用于检测内标的探针使用浓度 100nM，用于检测S靶基因的上下游引物使用浓度400nM，用于检测N 靶基因的上下游引物使用浓度400nM，用于检测内标的上下游引物使用浓度200nM；
5ul锰离子液(25mM醋酸锰)；
③纯化试剂组分：
裂解液：100mM乙酸-乙酸钠，1％聚乙二醇8000，3.5M异硫氰酸胍，5％Triton X-100，0.5％月桂基硫酸钠，pH＝5.0；
第一清洗液：100mM Tris-HCl，100mM KCl，2％聚乙二醇8000， pH＝8.0；
第二清洗液：10mM Tris-HCl，100mM KCl，2％聚乙二醇8000， pH＝8.0；
④卡盒装配：按图1所示，将各组分分装至卡盒内；
1、分装PCR缓冲液：向扩增区底部分装35ul PCR缓冲液；
2、包埋锰离子液：在PCR缓冲液上层用可熔性材料包埋5ul锰离子液；
3、封闭：用适量硅油封闭反应液；
4、分装洗液2：向洗液2区分装140ul洗液2；
5、封闭：用适量硅油封闭洗液2；
6、分装洗液1：向洗液1区分装140ul洗液1；
7、封闭：用适量硅油封闭洗液1；
8、分装裂解液：向裂解液区分装800ul裂解液。
⑤样本采集及处理：
1鼻咽拭子：用无菌拭子拭取鼻腔、咽部分泌物，将其置于无菌试管(400-500μL生理盐水或PBS)，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。
2痰液：留取前清水漱口3次，用力咳出呼吸道深部的痰液吐至无菌痰液收集器中。患者痰液较深不易咳出时，可在咳痰前捶背、协助排痰。采集痰量不能少于1mL。液化方法：痰液样本中加入等体积的乙酰半胱氨酸(10g/L)，室温振荡30分钟，待充分液化后才可进行后续核酸提取。
3肺泡灌洗液：收集支气管肺泡灌洗液密闭送检。
⑥卡盒使用方法：
1.试剂准备：取出检测卡盒、磁珠，室温下复温。磁珠在使用前请充分振荡混匀。
2.样本检测：打开卡盒的盒盖，再打开封口膜，加入10μL的磁珠(使用前请振荡使之充分悬浮)。再加入200μL样本，用移液器分吹打试剂混匀(建议至少吹打15次)，后盖紧盒盖。
3.将卡盒插入设备的卡槽(可应用全自动核酸检测荧光定量PCR 仪Life ReadyK1000)，插入过程中顶开柱塞，是柱塞孔对准两腔体的连通处；
4.利用检测设备中的磁钢移动，依次将磁珠穿过各个腔体，实现样本裂解(核酸提取)、纯化(2次清洗)，最终进入反应腔，设备还通过加热反应腔，使反应腔中的石蜡溶解，裂解液进入反应液中，开始进行核酸的恒温扩增；
5.利用磁钢将磁珠通过反应腔上的平面拉回上方，并通过降温使磁珠封固在重新凝固的石蜡内；
6.对反应完成后的反应腔进行荧光检测。
7.数据分析：
检测完成后，数据出来后，仪器将直接对结果进行分析并自动判断待测样本的定性检测结果：结果显示新型冠状病毒(2019-nCoV) S(FAM)基因、N(ROX)基因、内部质控(Cy5)的检测结果。新型冠状病毒(2019-nCOV)S(FAM)基因、N(ROX)基因结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤35，判为新型冠状病毒 (2019-nCOV)阳性。
内部质控Cy5荧光通道检测结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)。当双靶标(FAM/ROX)阴性且内部质控Ct≤ 35时，实验结果有效。否则需要重新取样后检测。
如S基因或N基因仅其中之一阳性，则样本判定为高度疑似，建议重测或过3-5天后取样。如结果仍相同，则建议用其它方法复核。
实施例3.检测实例1。
1、为检测本发明卡盒针对2019-nCoV检测的准确性和有效性，我们对卡盒的灵敏度和特异性进行测试。
1.1对不同浓度的2019-nCoV质控品进行检测，来确认检测限；
1.2对地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)，SARS 冠状病毒，MERS冠状病毒，H1N1，H3N2，H7N9，乙型流感，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1、2、3型，腺病毒，风疹病毒，水疱性口炎病毒，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，结核分枝杆菌，白色念珠菌，光滑念珠菌及人基因组进行检测，来验证特异性
2、结果：
2.1我们对不同浓度的2019-nCoV质控品进行检测，如下2表分别是S基因和N基因的结果。
Figure BDA0002933471640000131
Figure BDA0002933471640000141
Figure BDA0002933471640000151
确认本发明的检测卡盒对2019-nCoV的检测限为500copies/ml。
2.2我们对地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)， SARS冠状病毒，MERS冠状病毒，H1N1，H3N2，H7N9，乙型流感，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1、2、3型，腺病毒，风疹病毒，水疱性口炎病毒，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，结核分枝杆菌，白色念珠菌，光滑念珠菌及人基因组进行检测，结果显示本发明的卡盒对地方性人类冠状病毒(HKU1，OC43，NL63和229E)，SARS 冠状病毒，MERS冠状病毒，H1N1，H3N2，H7N9，乙型流感，呼吸道合胞病毒，副流感病毒1、2、3型，腺病毒，风疹病毒，水疱性口炎病毒，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，结核分枝杆菌，白色念珠菌，光滑念珠菌及人基因组均无非特异性扩增。
实施例4。检测实例2.
军事医学研究院微生物流行病研究所检测验证结果。
样本类型：鼻咽拭子
样本数量：60例
临床样本检测结果如表如示：
Figure BDA0002933471640000152
Figure BDA0002933471640000161
36例阳性样本经对比方法确认后，检测结果一致。
结论：60例样本检测结果中36例阳性样本符合率100％，24例阴性样本符合率100％。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州遂曾生物技术有限公司
<120> 一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒
<130> 2021012901
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
catgttcttt tggtggtgtc ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gcatgaatag caacagggac tt 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
aatacttcta accaggttgc tgttct 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
ggtgatgctg ctcttgctt 19
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
ccttgttgtt gttggccttt ac 22
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
cattttgctc tcaagctggt tcaatc 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
acatcaagaa ggtggtgaag ca 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
ggagtgggtg tcgctgttga 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
tcaagggcat cctgggctac actg 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
ttacaaccag aactcaatta cccc 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
aaaagaaagg taagaacaag tcctg 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
ctttcacacg tggtgtttat taccct 26
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
tgcaacaatc catgagcagt 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
cgtaaacgga aaagcgaaaa cg 22
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
tgcatgagtt taggcctgag ttgagt 26
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
aggtacttgg tgctacagtc ag 22
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
tctccctgca gagggttaag gcgc 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
tctccctgca gagggttaag gcgc 24
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
atttcaactg aaatctatca ggccg 25
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
ccattagtgg gttggaaacc ata 23
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
acaccttgta atggtgttga aggtt 25
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
ctgcagattt ggatgatttc tcc 23
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
ccttgtgtgg tctgcatgag tttag 25
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 24
attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc 30
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 25
cttccctcct cagatcattg ctcc 24
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 26
tcatactcct gcttgctgat cca 23
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 27
tcctgagcgc aagtactccg tgtgg 25
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 28
tcctggtgat tcttcttcag gt 22
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 29
tctgagagag ggtcaagtgc 20
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 30
agctgcagca ccagctgtcc a 21
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 31
gggagccttg aatacaccaa aa 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 32
tgtagcacga ttgcagcatt g 21
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 33
aycacattgg cacccgcaat cctg 24
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 34
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 35
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 36
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

Claims (8)

1.一种新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特征在于：包括顶部带盒盖(2)的盒体(1)，盒体(1)内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔(3)、带第一清洗液的第一清洗腔(4)和带第二清洗液的第二清洗腔(5)，其中裂解腔(3)连通至盒盖(2)，第二清洗腔(5)连通至盒体(1)外侧底部设置的反应腔(6)；所述裂解腔(3)、第一清洗腔(4)、第二清洗腔(5)和反应腔(6)的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞(7)，柱塞(7)的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔(6)内设有扩增反应液，和新型冠状病毒检测引物和探针组合；所述裂解腔(3)内设有能穿过柱塞(7)的柱塞孔的磁珠(8)；所述柱塞(7)的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠(8)的直径为20-200nm，疏水性液态封闭材料的密度为0.8-1.5g/cm3，粘度为2000-20000MPa.s；
所述新型冠状病毒检测引物和探针组合包括：用于检测新型冠状病毒S靶基因的引物对和探针、N靶基因的引物对和探针，以及用于检测内标RNase P基因的引物对和探针，具体为
名称 序列号 序列(5'--3') 2019-nCoV S基因上游引物 SEQ ID NO:1 CATGTTCTTTTGGTGGTGTCAG 2019-nCoV S基因下游引物 SEQ ID NO:2 GCATGAATAGCAACAGGGACTT 2019-nCoV S基因探针 SEQ ID NO:3 AATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCT 2019-nCoV N基因上游引物 SEQ ID NO:4 GGTGATGCTGCTCTTGCTT 2019-nCoV N基因下游引物 SEQ ID NO:5 CCTTGTTGTTGTTGGCCTTTAC 2019-nCoV N基因探针 SEQ ID NO:6 CATTTTGCTCTCAAGCTGGTTCAATC 内标RNaseP基因上游引物 SEQ ID NO:7 ACATCAAGAAGGTGGTGAAGCA 内标RNaseP基因下游引物 SEQ ID NO:8 GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA 内标RNaseP基因探针 SEQ ID NO:9 TCAAGGGCATCCTGGGCTACACTG
。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特征在于：所述反应腔(6)中的反应液的部分反应组分包埋在可熔性材料内。
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特征在于：扩增反应所需的锰离子液包埋在可熔性材料内。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特征在于：所述反应液内含有Tth DNA聚合酶或rTth DNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特征在于：所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠，0.1-10％聚乙二醇8000，0.1-10M异硫氰酸胍，0.1-10％Triton X-100，0.1-5％月桂基硫酸钠，pH为3.0-7.0。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特征在于，所述第一清洗液和第二清洗液均包含1-500mM Tris-HCl，10-500mM KCl，0.1-10％聚乙二醇8000，pH为7.0-9.0。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特征在于：所述疏水性液态封闭材料为硅油。
8.根据权利要求1所述的新型冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒，其特征在于：所述反应腔(6)为置于盒体(1)外侧的锥管，锥管一侧设有平面。
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