CN112760209B

CN112760209B - 一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒

Info

Publication number: CN112760209B
Application number: CN202110155803.4A
Authority: CN
Inventors: 赵怀; 赵志敬; 华灿忠; 李青青
Original assignee: Hangzhou Suizeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Suizeng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112760209A

Abstract

本发明公开了一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，包括盒体，盒体内从上至下依次设有裂解腔、第一清洗腔和第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液，扩增反应液包括猫冠状病毒ORF基因的引物探针混合液；所述反应腔中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有DNA聚合酶溶液。本发明可以在相对较低成本的情况下，快速一体化地对猫冠状病毒进行PCR扩增及检测，解决现行技术重复性差、检测方法耗时、操作复杂等问题。

Description

一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒

技术领域

本发明涉及一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，属于医学检测技术领域。

背景技术

猫冠状病毒感染症是由猫冠状病毒(Feline Coronavirus)引起的一种传染病，已知FCoV有两种生物型：猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和猫肠道冠状病毒(FECV)。虽然FIPV和FECV都可以引起病毒血症，但是，只有FIPV可以在巨噬细中复制并引起猫传染性腹膜炎(FelineInfectiousPeritonitis，FIP)。FIP是由猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)感染引起的猫科动物一种慢性进行性致死性传染病，以腹膜炎、大量腹水积聚为主要特征，FIP是具有多种临床表现的一种疾病。

目前猫冠状病毒的检测方法主要有以下几种：

(1)电镜检测：通过电镜观察可从粪便中检测到病毒(FCoV)。

(2)染色法：对组织切片进行染色镜检是诊断FIP较好的一种方法，H&E染色可较好地定位巨噬细胞，中性粒细胞，淋巴细胞和浆细胞的局部炎症，但灵敏度较低，设备要求较高，且操作麻烦。

(3)抗体检测：病毒感染后会使体内出现特异性免疫反应，产生特异性的抗体，可通过酶联免疫(ELISA)或胶体金等方法检出。该方法设备简单，需要的试剂较少，操作简捷方便，可以在数小时内得到结果。但因IgM、IgG抗体产生的窗口期及交叉反应，所以此法适用于初步筛查。

(4)核酸分子检测法：能较为敏感地检测鼻咽拭子、胸腹水及粪便样品中的FCoV。样品需要仔细保存处理，以防环境中到处存在的RNA降解酶。

电镜检测对仪器设备要求太高，普通的宠物检测单位极少配备。染色法灵敏度不高且需要丰富的技术经验来进行结果的判定。故目前猫冠状病毒的检测主要集中在抗体和核酸检测。抗体检测操作便捷、检测迅速，可作为核酸诊断的补充手段，但由于抗体检测“假阳性”，“假阴性”和灵敏度等局限性，不适合用于病原确诊，也不适用于在低流行地区的流行病学调查。核酸检测目前是猫病毒检测的“金标准”，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点。

常规的核酸检测采用实时荧光定量PCR方法，操作技能要求严格，需经专业培训。猫冠状样本核酸提取较为麻烦，根据核酸提取的方式的不同一般耗时30分钟至120分钟不等、核酸扩增时间在2小时之内，而加上试剂准备、加样、结果分析等人工操作的时间，一般一次实验需要耗时4-5小时，绝大多数宠物医院实验室并不具备上述专业人员和设备设施，只会将样本运送至有设备的宠物医院，而这种情况下，患猫需等待的时间较长，不能即刻得到有效的治疗。所以，分子POCT进行的核酸检测得到迫切需要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒。它可以在相对较低成本的情况下，快速一体化地对猫冠状病毒进行PCR扩增及检测，解决现行技术重复性差、检测方法耗时、操作复杂等问题。

本发明的技术方案：一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，其特点是：包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔、带第一清洗液的第一清洗腔和带第二清洗液的第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液，扩增反应液包括猫冠状病毒ORF基因的引物探针混合液和DNA聚合酶溶液；所述反应腔中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有扩增反应所需的锰离子液。

上述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，所述裂解腔内设有能穿过柱塞的柱塞孔的磁珠。通过推动柱塞，可以使柱塞孔对准两个相邻腔体的连通区间，此时两个腔体件依靠附着在柱塞孔内的疏水性液态封闭材料进行隔离，然后磁珠(利用外部磁钢拖动)便可穿过柱塞孔的疏水性液态封闭材料，从一个腔体转移到另一个腔体。

前述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，DNA聚合酶溶液包含Tth DNA聚合酶或rTth DNA聚合酶，所述DNA聚合酶溶液的体积为0.5-10μl，含有的酶为0.1-100个活性单位。

前述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，扩增反应所需的锰离子液在可熔性材料内，使反应液体系的锰离子与DNA聚合酶分离，有效保存DNA聚合酶的活性，延长卡盒的有效期。可熔性材料为石蜡、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃类物质中的任意一种或多种的组合，熔点范围为20℃-95℃，优选石蜡，使用时熔化为液态的石蜡油可以防止形成气溶胶的PCR产物污染环间；石蜡油热传导性弱，有效保证PCR的温度条件；石蜡的低温凝固特性在磁珠回拖温度下降后可以固定磁珠位置。石蜡可熔性使包埋物可以使反应液从隔离状态合并。

前述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，所述猫冠状病毒ORF基因的引物探针混合液包括：猫冠状病毒ORF基因上游引物和猫冠状病毒ORF基因下游引物，内标上游引物和内标下游引物，以及猫冠状病毒ORF基因探针和内标探针，具体为

前述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，所述裂解液包含所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠，0.1-10％聚乙醇8000，0.1-10M盐酸胍，0.1-10％TX-100(曲拉通X-100)，0.1-5％NP40(乙基苯基聚乙二醇),0.1-5％Tween-20(吐温-20)，pH值3.0-7.0，溶剂为ddH₂O。以上百分比为质量百分比。

前述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，所述所述第一清洗液包含1-500mM磷酸缓冲液，10-500mM NaCl，0.1-10％聚乙醇8000，pH值为5.0-9.0；第二清洗液包含1-500mMTris-HCl，10-500mM KCl，0.1-10％聚乙醇8000，pH值为5.0-9.0。乙酸-乙酸钠溶液提供低pH值环境便于DNA吸附到磁珠。核酸纯化试剂(清洗液)及裂解液中不含蛋白酶K，使产品无需-20度保存。清洗液中无需醇类。

前述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，所述柱塞的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠的直径为0.1-100μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm³，粘度为2000-200000CSt。该设置可以确保疏水性液态封闭材料能够对液体进行隔离，又能让磁珠穿过。

前述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，所述疏水性液态封闭材料为硅油。

前述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒中，所述反应腔为置于盒体外侧的锥管，锥管一侧设有平面，便于外部磁钢将磁珠拉回至上方的可熔性材料中(降温后凝固)，进而不会对光学检测产生干扰。

与现有技术相比，本发明的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，可对猫冠状病毒进行快速准确的检测。结合本发明经过反复研究试验而筛选出的引物与探针，使其在检测的时效性、特异性、灵敏性、便捷性和技术参数等多个方面都优于其它分子诊断试剂盒。

本发明涉及的猫冠状病毒一体化核酸快速检测卡盒具有以下优点：

1)全封闭式设计：1台与够拖动磁珠并可以进行荧光分析的检测设备，少量实验室基础小设备就能完成复杂的核酸检测实验。它采用将核酸提取、扩增、检测等流程集中在全封闭卡盒内，从结构上杜绝气溶胶污染，保护检测人员安全性，无需PCR实验室。大大降低了核酸检测对实验室建设标准的要求。有助于条件有限地区的联防布控；

2)极简操作：以手工操作时间2-5分钟，装入检测设备后30-90分钟即可出结果，便于实现核酸提取与扩增一体化的全自动化，大大降低了对检验人员专业技能的要求，适合于快速现场的床边诊断；

3)冷藏保存：2-8度冷藏保存，无需常规的-20度冷冻保存，有助于产品的冷链运输和保存。

此外，本发明使用柱塞结合疏水性液态封闭材料的方式对多个功能性腔体进行隔离，使各个腔体间的液体不会外溢，生物样本能够在各个腔体内分别进行裂解、清洗纯化和扩增反应，并可以利用磁珠以附着方式将核酸依次带入各个腔体，其中疏水性液态封闭材料能够对磁珠有个分散作用，它能够允许穿过磁珠和磁珠上的核酸，阻隔其它杂质，当磁珠穿过时，磁珠上附着的如一些非极性大颗粒的杂质会浸润在疏水性液态封闭材料内而被截留，可以降低杂质对检测结果的影响。

图1是本发明卡盒的结构示意图；

图2是图1的侧向示意图。

附图中的标记为：1-盒体，2-盒盖，3-裂解腔，4-第一清洗腔，5-第二清洗腔，6-反应腔，7-柱塞，8-磁珠。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，如图1所示：包括顶部带盒盖2的盒体1，盒体1内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔3、带第一清洗液的第一清洗腔4和带第二清洗液的第二清洗腔5，其中裂解腔3连通至盒盖2，第二清洗腔5连通至盒体1外侧底部设置的反应腔6；所述裂解腔3、第一清洗腔4、第二清洗腔5和反应腔6的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞7，柱塞7的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔6内设有扩增反应液，扩增反应液包括猫冠状病毒ORF基因的引物探针混合液和DNA聚合酶溶液；所述反应腔6中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有扩增反应所需的锰离子液；所述裂解腔3内设有能穿过柱塞7的柱塞孔的磁珠8。所述DNA聚合酶溶液的体积为0.5-10μl，含有的酶为0.1-100个活性单位。所述猫冠状病毒ORF基因的引物探针混合液包括：猫冠状病毒ORF基因上游引物和猫冠状病毒ORF基因下游引物，内标上游引物和内标下游引物，以及猫冠状病毒ORF基因探针和内标探针，具体为

所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠，0.1-10％聚乙醇8000，0.1-10M盐酸胍，0.1-10％TX-100，0.1-5％NP40,0.1-5％Tween-20，pH值3.0-7.0。所述所述第一清洗液包含1-500mM磷酸缓冲液，10-500mM NaCl，0.1-10％聚乙醇8000，pH值为5.0-9.0；第二清洗液包含1-500mM Tris-HCl，10-500mM KCl，0.1-10％聚乙醇8000，pH值为5.0-9.0。

所述柱塞7的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠8的直径为0.1-100μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm³，粘度为2000-200000CSt。所述疏水性液态封闭材料优选为硅油。所述反应腔6为置于盒体1外侧的锥管，锥管一侧设有平面,如图2的A部所示。

一、猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒的建立。每管PCR加入30ul RT-PCR扩增液及5μl锰离子液。并加入5ul模板DNA。

1分装PCR缓冲液：20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L(NH₄)SO₄，70mmol/L KCl，4.0mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTPs，5％海藻糖，5U rTth DNA聚合酶，用于检测FCoV ORF基因的探针使用浓度200nM，用于检测内标的探针使用浓度100nM，用于检测FCoV ORF基因的上下游引物使用浓度375nM，用于检测内标的上下游引物使用浓度250nM。

2包埋锰离子液：在PCR缓冲液上层用可熔性材料包埋5μl锰离子液(25mM醋酸锰)。

3封闭：用适量硅油封闭反应液；

4分装第二清洗液：向第二清洗腔分装130ul第二清洗液；

5封闭：用适量硅油封闭第二清洗液；分装第一清洗液：

6向第一清洗腔分装130ul第一清洗液；

7封闭：用适量硅油封闭第一清洗液；

8分装裂解液：向裂解液区分装800ul裂解液。

二、使用方法及快速鉴定。

1样本的采集及处理。

1.1胸腹水：胸腹水上样量为100μl，加样时应注意不要加入腹水中的膜状沉淀物质；如样本为血性胸腹水，则上样量降为50μl。

1.2鼻咽拭子：用无菌拭子拭取鼻腔、咽部分泌物，将其置于采样管中(400-500μl生理盐水或PBS)，将拭子在其中充分振荡、挤压、洗涤，取出拭子。如液体中较多的大颗粒悬浊物，应低速离心后(3000rpm，2min)取上清液。

1.3血清、血浆:需要选用专业的采血管采集。若为含有惰性分离胶及促凝剂的采血管，采血后直接静置30分钟，然后离心(3000rpm，10mim)取上清液，该上清液为检测血清样本；若为抗凝采血管，取血后充分振荡混匀，然后离心((3000rpm，10mim))取上清液，此上清液为检测血浆样本。

2检测卡盒的使用。

打开卡盒的盖子，再打开封口膜，加入10μL的磁珠(使用前请振荡使之充分悬浮)。再加入200μL样本，用移液器分吹打试剂混匀(建议至少吹打15次)，后盖紧盖子。

3.实时荧光定量PCR扩增及检测。

3.1样本检测

应用全自动核酸检测荧光定量PCR仪Life Ready K1000，采用全自动核酸检测分析系统对PCR扩增产物进行分析，综合扩增曲线与Tm值判定结果。荧光通道设置如下表。

Detector	Target
		FAM	FCoV
ROX	内标

设置扩增程序如下：

3.2对照组设置。

本发明对猫冠状病毒FCoV序列进行分析和研究，设计了下表所示的引物探针组。

本发明引物探针

对照组1引物探针

对照组2引物探针

对照组3引物探针

各组引物探针配置的反应液检测结果如下：

引物探针组合	FCoVCT	内标CT效率
			本发明	28.69	25.98
对照1	29.81	26.92
			对照2	29.28	27.35
对照3	30.30	27.41

结果显示：对比对照组1-3，本发明的引物探针的检测敏感性和特异性最优。

3.3结果分析。

1.检测程序运行结束后，适用仪器自动报告检测结果。

2.结果显示猫冠状病毒(FCoV)(FAM)、内部质控(ROX)的检测结果。

3.猫冠状病毒(FCoV)(FAM)结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且Ct≤35，判为猫冠状病毒(FCoV)阳性。

内部质控ROX荧光通道检测结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)。当目的基因(FAM)阴性且内部质控Ct≤35时，实验结果有效。否则需要重新取样后检测。

3.4为检测本发明卡盒针对FCoV检测的准确性和有效性，我们对卡盒的灵敏度和特异性进行测试。

1)对不同浓度的FCoV质控品进行检测，来确认检测限；

2)对猫细小病毒、猫杯状病毒、猫疱疹、猫支原体、猫衣原体及猫基因组进行检测，来验证特异性。

结果：我们对不同浓度的FCoV质控品进行检测，如下表是FCoV基因的结果。

确认本发明的检测卡盒对UU的检测限为500copies/ml。

3)我们对猫细小病毒、猫杯状病毒、猫疱疹、猫支原体、猫衣原体及猫基因组进行检测，均无非特异性扩增。

三、检测实例。

来自重庆名望宠物医院已确认样本的检测验证结果。

样本类型：胸腹水

样本数量：44例

临床样本检测结果如下表所示：

25例阳性样本经对比方法确认后，检测结果一致.

结论：44例样本检测结果中25例阳性样本符合率100％，19例阴性样本符合率100％。

以上所述实施例为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，其他的任何未背离本发明的实质原理所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州遂曾生物技术有限公司

<120> 一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒

<130> 2021012908

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<212> DNA

<213> 内标基因探针

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<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<213> FCoV下游引物

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<213> 人工序列（Artificial sequence）

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<213> 人工序列（Artificial sequence）

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tcacccttcc ctaggtccca a 21

Claims

1.一种猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：包括顶部带盒盖(2)的盒体(1)，盒体(1)内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔(3)、带第一清洗液的第一清洗腔(4)和带第二清洗液的第二清洗腔(5)，其中裂解腔(3)连通至盒盖(2)，第二清洗腔(5)连通至盒体(1)外侧底部设置的反应腔(6)；所述裂解腔(3)、第一清洗腔(4)、第二清洗腔(5)和反应腔(6)的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞(7)，柱塞(7)的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔(6)内设有扩增反应液，扩增反应液包括猫冠状病毒ORF基因的引物探针混合液和DNA聚合酶溶液；所述反应腔(6)中设有可熔性材料层，可溶性材料层内包埋有扩增反应所需的锰离子液；所述裂解腔(3)内设有能穿过柱塞(7)的柱塞孔的磁珠(8)；所述猫冠状病毒ORF基因的引物探针混合液包括：猫冠状病毒ORF基因上游引物和猫冠状病毒ORF基因下游引物，内标上游引物和内标下游引物，以及猫冠状病毒ORF基因探针和内标探针，具体为

所述柱塞(7)的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠(8)的直径为0.1-100μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm³，粘度为2000-200000CSt。

2.根据权利要求1所述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：所述DNA聚合酶溶液包含Tth DNA聚合酶或rTth DNA聚合酶，DNA聚合酶溶液的体积为0.5-10μl，含有的酶为0.1-100个活性单位。

3.根据权利要求1所述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠，0.1-10％聚乙醇8000，0.1-10M盐酸胍，0.1-10％曲拉通X-100，0.1-5％乙基苯基聚乙二醇,0.1-5％吐温-20，pH值3.0-7.0。

4.根据权利要求1所述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于，所述所述第一清洗液包含1-500mM磷酸缓冲液，10-500mM NaCl，0.1-10％聚乙醇8000，pH值为5.0-9.0；第二清洗液包含1-500mM Tris-HCl，10-500mM KCl，0.1-10％聚乙醇8000，pH值为5.0-9.0。

5.根据权利要求1所述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：所述疏水性液态封闭材料为硅油。

6.根据权利要求1所述的猫冠状病毒一体化核酸检测卡盒，其特征在于：所述反应腔(6)为置于盒体(1)外侧的锥管，锥管一侧设有平面。