CN111440696A - 胎儿细胞捕获模块、用于胎儿细胞捕获的微流控芯片，及它们的使用方法 - Google Patents

胎儿细胞捕获模块、用于胎儿细胞捕获的微流控芯片，及它们的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及胎儿细胞捕获模块、用于胎儿细胞捕获的微流控芯片，及它们的使用方法。所述胎儿细胞捕获模块包括细胞捕获载体和用于特异性捕获所述细胞的识别分子，该识别分子经由包含二硫键的有机偶联体连接至载体表面。所述用于胎儿细胞捕获的微流控芯片表面经由包含二硫键的有机偶联体修饰以特异性捕获胎儿细胞的识别分子，该识别分子在捕获细胞后，通过化学切割所述有机偶联体中的二硫键实现对所述细胞的释放。本发明的捕获模块、微流控芯片及它们的使用可实现未经预处理全血的胎儿细胞捕获，捕获率高，细胞损失小，且细胞释放操作简单、作用准确，使胎儿细胞的高效、无损释放及全基因组分析成为可能。

Description

胎儿细胞捕获模块、用于胎儿细胞捕获的微流控芯片，及它们 的使用方法
技术领域
本申请涉及细胞捕获领域。具体涉及胎儿细胞捕获模块、用于胎儿细胞捕获的微流控芯片，及它们的使用方法。
背景技术
提高生殖健康水平及防控重大出生缺陷是健康中国的重要目标之一。2012年卫生部发布的《中国出生缺陷防治报告》指出我国出生缺陷总发生率约为5.6％，每年新增出生缺陷数约90万例。“全面二孩”政策实施后，高龄孕妇增加，出生缺陷防控也面临更多挑战。“产前筛查和诊断”是预防出生缺陷中最为重要的手段。羊膜腔穿刺、绒毛活检、脐带血穿刺术作为目前产前诊断的金标准，存在侵入性强、取样难及取样时间窗口窄等局限，易引发并发症、流产等风险。而血清学筛查和超声影像学等无创性产前检测方法的灵敏度和准确性欠佳，难以替代有创筛查手段。因此，建立安全、准确的产前诊断体系，是减少缺陷儿出生、提高人口素质的重要课题。发展新型无创产前检测技术具有重要的临床意义，也是当前产前诊断领域发展的主要方向之一。
无创产前检测技术的核心是分析孕妇外周血中存在的痕量胎儿基因信息，实现遗传筛查及诊断。孕妇外周血中胎儿基因来源有两种：1)来源于凋亡胎儿细胞的游离DNA碎片。以其为研究对象的无创产前DNA筛查(Non-invasive Prenatal Testing，NIPT)开辟了产前检测的新篇章，有效补充了现有的产前筛查体系，使得三体综合征的检出率提高到了99％。然而，游离DNA存在以下特点：a)主要来源于胎盘细胞的凋亡，DNA序列片段化程度高，一般认为平均166bp左右；b)存在大量的母体DNA背景干扰；c)基因检测的准确性依赖胎儿DNA的含量。因此，基于游离DNA的NIPT技术虽然可以提高常染色体非整倍体(21、18、13三体综合征)的检出率，对于性染色体异常、染色体的平衡结构异常(易位和倒位)以及大片段缺失等类型的胎儿染色体疾病检测困难。且当存在限制性胎盘嵌合体或者母体染色体异常时，均可造成假阴/阳性结果。通过无创产前游离DNA检测技术不能检测到完整的染色体结构和遗传信息，NIPT目前只能作为一项常染色体非整倍体筛查技术，用于提高唐氏综合征的检出率，尚无法推广到其他遗传疾病的筛查，且仍需要通过有创的检测金标准进行核型分析鉴定，最终实现临床确诊。2)循环胎儿细胞(Circulating Fetal Cells,CFCs)是母体外周血中存在的胎儿有核细胞，来源于滋养层细胞的脱落或是母血物质交换过程中进入母体循环的胎儿细胞。循环胎儿细胞携带完整的细胞生物学信息，被认为是最有潜力的非侵入性产前诊断对象。循环胎儿细胞主要类型包括滋养层细胞(trophoblasts)、淋巴细胞(leukocytes)、有核红细胞(nucleated red blood cells)等。其中滋养层细胞和有核红细胞是由于含有特异性的表面抗原，只存在于妊娠期，胎-胎之间无干扰等优点，是最适的产前诊断的分析靶标。
然而，循环胎儿细胞至今尚未实现临床应用，其主要原因是外周血中胎儿细胞捕获/富集的技术壁垒太高。主要技术难点包括：1)CFCs含量极低(1～10/mL)，母体血液细胞背景极高(红细胞：109/mL，白细胞：107/mL)；2)CFCs与血细胞尺寸区分度低(CFCs:9～13μm；白细胞:7～15μm；红细胞:6～8μm)，物理分离难度大，需依赖标志物分离；3)CFCs释放效率低、操作复杂，目前绝大多数方法是通过免疫染色后，应用单细胞显微操作仪、激光显微切割(LCM)等方法实现高纯度胎儿细胞的获取，操作复杂，效率低下。使用LCM释放捕获细胞，往往增加应用的复杂性、成本和灵活性，技术门槛高。而通过物理分离方法，虽然不依赖标志物，但容易造成细胞的丢失，进而无法高效富集胎儿细胞。此外，这些方法都要求初始富集，如红细胞裂解、密度离心或稀释，这往往会导致胎儿细胞的丢失或损伤。因此，目前仍有很大的必要开发能够以高通量、高纯度的方式捕获CFCs的技术，并实现无损、快速的细胞释放。
发明内容
为解决现有胎儿细胞分析技术捕获效率低、纯度低、成本高、难以进行全基因组分析的问题，提出以下胎儿细胞捕获模块、用于胎儿细胞捕获的微流控芯片及它们各自的使用方法，以实现胎儿细胞的高效、高纯度捕获及释放，并使胎儿全基因组分析成为可能。
一方面，本发明提供一种胎儿细胞捕获模块，包括细胞捕获载体和用于特异性捕获所述细胞的识别分子，所述识别分子经由包含二硫键的有机偶联体L连接至所述细胞捕获载体表面。所述识别分子在捕获细胞后，通过化学切割所述有机偶联体L中的二硫键实现对所述细胞的释放。可选用二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或谷胱甘肽(GSH)中的一种或多种，优选二硫苏糖醇作为化学切割试剂。
一些实施方案中，所述识别分子包括但不限于核酸适体、蛋白质受体、多肽、抗体、有机小分子化合物等。一些实施方案中，所述识别分子为抗体，特别是上皮粘附因子抗体(抗EpCAM抗体)和抗转铁蛋白受体抗体(抗CD71抗体)中的一种或两种；或所述识别分子为其他胎儿细胞特异性识别抗体，特别是其他滋养层细胞特异性识别抗体。
一些实施方案中，所述胎儿细胞为有核红细胞或滋养层细胞，优选滋养层细胞。一些实施方案中，所述胎儿细胞，特别是滋养层细胞，取自外周血和/或宫颈拭子分散液。
一些实施方案中，所述有机偶联体L具有通式：
-A-X-，
A是一端为硫键，另一端共价连接至所述捕获载体的基团；根据捕获载体材质不同，可选用不同的A基团与捕获载体相连，这对于本领域技术人员而言是已知的；
X是一端为硫键，另一端直接或间接连接所述识别分子的基团；
X具有通式：
-S-(B)p-D-，
p＝0-10，
S为硫，
D是用于与所述识别分子连接的基团；本领域公知有机偶联体与识别分子连接基团的选择，通常D可选自酰胺基、氨酰基、硫基、琥珀酰亚胺基、炔基、叠氮基等。
B为
Figure BDA0002393061670000031
其中，q、r、t分别为0-10，优选1-5；s为0-115，优选20-50；B可通过任一端与S连接，另一端与D连接。
一些实施方案中，所述有机偶联体L具有通式：
-A-X-，
其中：
A一端为单硫键，用于与X连接；另一端固定至所述捕获载体。可基于不同的捕获载体材质对A的非S结构部分进行选择，使其与捕获载体共价连接。本发明的一些实施方案中，A包括但不限于
Figure BDA0002393061670000032
Figure BDA0002393061670000033
A通过非硫键端共价连接至所述捕获载体，
其中n＝1-10,f＝1-10；优选地，n＝3-8，f＝2-8。
X一端为单硫键，用于与A连接，构成有机偶联体L中的二硫键；X另一端直接或间接与识别分子相连，例如通过酰胺键、琥珀酰亚胺键等基团连接所述识别分子。X的非S结构部分除包含用于连接识别分子的基团外，还可包含其他连接片段，例如聚乙二醇衍生物分子片段，其中这些分子片段可以是直链结构，也可以是支链结构，聚乙二醇的分子量分布优选为200-5000分子量例如200、500、600、800、1000、1500、2000、3000、5000，更优选为1000-2000。一些实施方案中，X包括但不限于
Figure BDA0002393061670000041
优选X包括但不限于
Figure BDA0002393061670000042
其中X硫键端与A共价连接形成二硫键，另一端直接或间接连接至所述识别分子，
m＝0-115，u＝1-10；优选地，m＝20-50，u＝2-8。
一些实施方案中，有机偶联体L除包含用于将A与X共价连接的二硫键外，还可包含其他二硫键。
一些实施方案中，所述有机偶联体L选自如下结构中的一种或多种：
Figure BDA0002393061670000043
其中m＝0-115；优选地，m＝20-50。
一些实施方案中，所述有机偶联体L与识别分子直接连接。一些实施方案中，所述有机偶联体L识别分子间接连接；优选的实施方案中，所述有机偶联体L经链酶亲和素修饰后与生物素化的识别分子间接连接。
本发明中，所称细胞捕获载体可为所有能够固定所述识别分子，以进行细胞捕获的基质、界面或细胞捕获装置。这些载体可以不参与细胞分离捕获，只发挥固定识别分子的作用，这些载体还可以具有特定的分离功能，与固定于其上的识别分子共同或协同工作，实现细胞捕获。
一些实施方案中，所述细胞捕获载体包括磁珠、微流控芯片、聚苯乙烯微球或滤膜等，例如微米级磁珠、纳米级磁珠、鱼骨型微流控芯片、微柱型微流控芯片等等。磁珠的材质可选为商品化或者自制所得的四氧化三铁球，可选商品化供应商为赛默飞世尔有限公司、苏州为度生物科技有限公司等，可选合成方法为油相合成法、水热法等。微流控芯片可选为通过倒模法、刻蚀法获得，具体操作方法可参考科学出版社《微流控芯片实验室》、《图解微流控芯片实验室》，其材质可选为硅基底、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate、PMMA)、聚碳酸酯(Polycarbonate、PC)、环烯烃聚合物(CycloOlefin Polymer)等。这些细胞捕获载体可以是本领域常规用于细胞分离的装置，本领域技术人员掌握这些装置的基本使用方法。
本发明中所述细胞捕获载体的获取或制备，其具体操作及工艺条件，可参考本领域公知方式实施，例如参见科学出版社出版的《循环肿瘤细胞：基础研究与临床应用进展(中文翻译版)》(美)科特(Richard J.Cote)等、《现代医学实验仪器与实验技术》等。
另一方面，本发明提供一种捕获模块的使用方法，包括使所述捕获模块与包含胎儿细胞的液体相接触，以实现胎儿细胞的捕获。
一些实施方案中，所述液体包括怀孕哺乳动物或孕妇的外周血、宫颈拭子分散液或悬浮液，或者包含胎儿细胞的非孕妇外周血、缓冲液或培养液。一些实施方案中，所述液体是怀孕哺乳动物的外周血，或宫颈拭子分散液或悬浮液。一些实施方案中，所述液体是包含所述胎儿细胞的缓冲液或培养液。一些实施方案中，所述液体是包含胎儿细胞的非孕妇外周血或宫颈拭子分散液/悬浮液，其中胎儿细胞被人工添加至非孕妇外周血或宫颈拭子分散液/悬浮液中。
一些实施方案中，所述液体不经预分离处理直接与所述捕获模块接触。
一些实施方案中，将捕获有所述胎儿细胞的捕获模块与化学切割剂接触，使所述二硫键断裂，实现所述胎儿细胞的释放。一些实施方案中，所述化学切割剂为二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、谷胱甘肽(GSH)，优选所述切割剂为二硫苏糖醇。
另一方面，本发明提供一种用于胎儿细胞捕获的微流控芯片，表面经由包含二硫键的有机偶联体L修饰以特异性捕获所述胎儿细胞的识别分子，所述识别分子在捕获细胞后，通过化学切割所述有机偶联体L中的二硫键实现对所述细胞的释放。
当包含细胞的液体通入所述芯片后，胎儿细胞与芯片表面固定的识别分子接触，实现细胞的捕获。一些实施方案中，所述微流控芯片设置有供流体通过的入口、出口和流体通道，例如流体微通道。所述识别分子修饰于所述流体通道表面。一些实施方案中，所述流体微通道(例如微通道的内壁)上，还设置有微阵列，所述微阵列由多个成一行或多行排列的微柱组成。相邻微柱间距大于待捕获胎儿细胞直径，以足以使所述胎儿细胞，特别是滋养层细胞通过。所述特异性识别分子可进一步固定至所述微柱表面。由于不同细胞尺寸不同，胎儿细胞与微柱碰撞实现多次接触，得以被有效捕获并与其他细胞分离。
一些实施方案中，所述微柱截面形状为圆形或三角形，优选三角形，例如等边三角形。
一些实施方案中，所述三角形的边长为10～200μm，例如20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm。一些实施方案中，所述三角形的水平旋转角度为0度-15度，例如1度、2度、3度、4度、5度、6度、7度、8度、9度、10度、11度、12度、13度、14度、15度。其中，三角形的一边与所述流体微通道水平方向平行时设为0度，三角形可基于该边的任一顶点旋转，旋转后该边与水平方向夹角为水平旋转角。旋转三角形的特定角度使微柱三面呈现梯度剪应力，增加胎儿细胞和识别分子的接触时间，提高捕获效果和纯度。
一些实施方案中，同一行相邻微柱的垂心间水平距离x为100～150μm，例如，110μm、120μm、130μm、140μm；后一微柱垂心相较前一微柱垂心于流体微通道平面竖直方向的偏移距离Δy为0～20μm，例如1μm、3.5μm、6.5μm、7.5μm；所述微柱为多行排列时，同一列上一微柱底端至下一微柱顶端于流体微通道平面的竖直方向间距y为0～50μm，例如10μm、20μm、30μm、40μm。
本发明微流控芯片所设置的入口和出口可分别为一个或多个。优选的实施方案中，所述芯片设置有两个入口及一个出口，以供分别使包含细胞的液体、缓冲液或培养液从不同入口注入。当缓冲液与血液一同通入到芯片中时，缓冲液可对血液进行稀释，能够进一步提高细胞的捕获效率。
一些实施方案中，所述流体微通道和/或微阵列的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
一些实施方案中，所述化学切割通过二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、谷胱甘肽等中的一种或多种实现，其中优选二硫苏糖醇实现化学切割。加入二硫键切割试剂后，二硫键断裂，捕获有胎儿细胞的抗体从所述芯片脱离，实现胎儿细胞的特异性释放。本发明的化学切割可最大程度上减少对母体细胞的干扰，实现靶向释放的目的。
一些实施方案中，所述识别分子是特异性识别胎儿细胞的膜标志物。这些识别分子包括但不限于核酸适体、蛋白如受体、多肽、抗体或小分子等。一些实施方案中，所述识别分子为抗体，特别是抗EpCAM抗体。外周血中的胎儿滋养层细胞，来源于胎盘内绒毛层，高表达上皮粘附因子即EpCAM，因此优选为抗EpCAM抗体。或所述识别分子为其他胎儿细胞，特别是滋养层细胞的特异性识别抗体。
一些实施方案中，所述胎儿细胞为有核红细胞或滋养层细胞，优选滋养层细胞。更为优选地，所述有核红细胞或胎儿滋养层细胞取自外周血和/或宫颈拭子分散液。
一些实施方案中，所述有机偶联体L具有通式：
-A-X-，
A是一端为硫键，另一端共价连接至所述捕获载体的基团；根据捕获载体材质不同，可选用不同的A基团与捕获载体相连，本领域技术人员知晓A基团选取的一般原则；
X是一端为硫键，另一端连接所述识别分子的基团；
X具有通式：
-S-(B)p-D-，
p＝0-10，
S为硫，
D是用于与所述识别分子连接的基团；本领域公知有机偶联体与识别分子连接基团的选择，通常D可选自酰胺基、氨酰基、硫基、琥珀酰亚胺基、炔基、叠氮基等。
B为
Figure BDA0002393061670000071
其中，q、r、t分别为0-10，优选1-5；s为0-115，优选20-50；B可通过任一端与S连接，另一端与D连接。
一些实施方案中，所述有机偶联体L具有通式：
-A-X-，
其中：
A一端为单硫键，用于与X连接；另一端固定至所述捕获载体。可基于不同的捕获载体材质对A的非S结构部分进行选择，使其与捕获载体共价连接。本发明的一些实施方案中，A包括但不限于
Figure BDA0002393061670000072
Figure BDA0002393061670000073
A通过非硫键端共价连接至所述捕获载体，
其中n＝1-10,f＝1-10；优选地，n＝3-8，f＝2-8。
X一端为单硫键，用于与A连接，构成有机偶联体L中的二硫键；X另一端直接或间接与识别分子相连，例如通过酰胺键、琥珀酰亚胺键等基团连接所述识别分子。X的非S结构部分除包含用于连接识别分子的基团外，还可包含其他连接片段，例如聚乙二醇衍生物分子片段，其中这些分子片段可以是直链结构，也可以是支链结构。聚乙二醇的分子量分布优选为200-5000分子量例如200、500、600、800、1000、1500、2000、3000、5000，更优选为1000-2000。一些实施方案中，X包括但不限于
Figure BDA0002393061670000074
优选选自
Figure BDA0002393061670000075
其中X硫键端与A共价连接形成二硫键，另一端直接或间接连接至所述识别分子，
m＝0-115，u＝1-10；优选地，m＝20-50，u＝2-8。
一些实施方案中，所述有机偶联体L选自如下结构中的一种或多种：
Figure BDA0002393061670000081
其中m＝0-115；优选地，m＝20-50。
一些实施方案中，有机偶联体L除包含用于将A与X共价连接的二硫键外，还可包含其他二硫键。
一些实施方案中，所述有机偶联体L与识别分子直接连接。一些实施方案中，所述有机偶联体L识别分子间接连接；优选的实施方案中，所述有机偶联体L经链酶亲和素修饰后与生物素化的识别分子间接连接。
本发明用于胎儿细胞捕获的微流控芯片可通过本领域已知的方法制备。一些实施方案中，还可将所述微流控芯片键合至载片使用。在一些实施方案中，所述载片材料为玻璃，键合方式为等离子体键合。芯片入口与出口可采用本领域常规使用的打孔笔打孔制得，其大小可根据预捕获细胞选择。打孔笔尺寸优选为(内径*外径,mm)3.3×4.0，3.3×3.5，2.4×3.0，2.3×2.8，1.9×2.4，1.6×2.1，1.2×1.8，0.9×1.3，0.6×0.9，0.5×0.8，0.4×0.7。例如，入口打孔尺寸可为0.4×0.7mm，出样口打孔尺寸为1.2×1.8mm。
另一方面，本发明提供一种上述微流控芯片的使用方法，包括：
(1)获取包含胎儿细胞的液体；
(2)使步骤(1)所得液体注入所述微流控芯片，使所述液体中的胎儿细胞与所述特异性识别分子接触，实现所述胎儿细胞的捕获。
一些实施方案中，步骤(1)可将2-10mL包含胎儿细胞的液体注入所述芯片。
一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：
(3)向所述微流控芯片中加入化学切割剂，使所述有机偶联体中的二硫键断裂，释放所述捕获的胎儿细胞。
在一些实施方案中，所述液体包括怀孕哺乳动物或孕妇的外周血、宫颈拭子分散液或悬浮液，或者包含胎儿细胞的非孕妇外周血、缓冲液或培养液。一些实施方案中，所述液体是怀孕哺乳动物的外周血或宫颈拭子分散液或悬浮液。一些实施方案中，所述液体是孕妇的外周血，或宫颈拭子分散液或悬浮液。一些实施方案中，所述液体是包含所述胎儿细胞的缓冲液或培养液。一些实施方案中，所述液体是包含所述胎儿细胞的非孕妇的外周血或宫颈拭子分散液/悬浮液，其中胎儿细胞被人工添加至非孕妇外周血或宫颈拭子分散液/悬浮液中。
一些实施方案中，所述液体不经预分离处理直接通入所述微流控芯片。
一些实施方案中，所述液体通过所述微流控芯片的流速为0.1-10mL/h，优选0.1～1mL/h，例如0.1mL/h、0.3mL/h、0.5mL/h、1mL/h等，更优选为0.5mL/h。当流速太高时，会导致细胞捕获效率较低；过慢会导致捕获效率降低。因此针对细胞个数较少的样本，为实现最佳捕获效果，应选取适当进样流速。
一些实施方案中，步骤(2)的细胞捕获后，可用缓冲液冲洗芯片，以去除与待捕获细胞无关的非特异性结合的其他细胞等生物物质，再进行步骤(3)的细胞释放。
一些实施方案中，对释放的胎儿细胞进行单碱基突变分析。收集释放后的细胞，采用(例如95℃下)热裂解实现基因组的释放，后采用数字PCR技术对其中的单碱基突变进行分析。
一些实施方案中，对释放的胎儿细胞进行特定RNA表达量分析。
一些实施方案中，对释放的胎儿细胞扩增后进行全基因组分析。胎儿细胞全基因组扩增采用本领域常规的扩增方法，可优选为Multiple displacement amplification(MDA)参考商品化试剂盒Qiagen(德国快而精公司-凯杰公司)、Multiple Annealing andLooping Based Amplification Cycles(MALBAC)参考商品化试剂盒上海亿康医学检验所有限公司等。细胞扩增后采用柱纯化(参考Qiagen(德国快而精公司-凯杰公司)的DNA纯化产品)或磁珠(参考贝克曼、诺维赞等公司的磁珠纯化试剂盒)纯化对产物进行纯化，后才用测序技术，例如NovaSeq技术(Illumina)进行基因分析。
本发明中，所述用于特异性捕获所述细胞的识别分子指以特异性方式与待捕获的生物分子(或称为靶分子，例如细胞)通过分子间弱相互作用或共价作用结合的物质。这些识别分子可包括：核酸如DNA、RNA、PNA；蛋白质如受体、抗体；多肽；有机小分子等。所述抗体优选可以是抗EpCAM抗体、抗CD71抗体、SLY3C核酸适体(参考专利ZL201310328256.0)中的一种或多种。
所述蛋白质可以是经修饰或改造的，其指所述蛋白所含有的一个或多个氨基酸由于加入的新的化学基团，和/或去除原有的化学基团所发生的改变。这些改变可以是天然的或人工合成的。合成性修饰包括但不限于：加入化学或生物小分子，或使化学或生物小分子与蛋白上已有基团反应并连接。
本发明的识别分子可以是商业购买的。例如商用抗EpCAM抗体的来源包括但不限于abcam公司，R&D system,Biolegend,Sigma等品牌；进一步，抗EpCAM抗体可选自如下品种：Sigma公司，货号SAB4700423-100UG；R&D system公司，货号为BAF960；Biolegend公司，货号为324216。
所述特异性识别分子经由有机偶联体与细胞捕获载体相连。所述特异性识别分子可直接或间接与有机偶联体连接。例如，当所述特异性识别分子为抗体时，可将有机偶联体与链霉亲和素连接，再与生物素化的抗体连接。特异性识别分子，例如蛋白，通常通过结构中游离的氨基酸侧链，例如巯基、氨基等基团，与所述偶联体中功能性基团进行共价连接(即直接连接)。这些游离的氨基酸侧链可以是自然存在的，也可以是经人工改造获得的。本领域技术人员已知有机偶联体与特异性识别分子的具体连接方式。特异性识别分子还可通过生物素化，和经链霉亲和素共价连接的有机偶联体连接，形成识别分子-生物素-链霉亲和素-有机偶联体连接系统。该连接系统的具体连接方式，对本领域技术人员而言也是已知的。生物素化的特异性识别分子可在使用前通过本领域已知方法自行制备，也可直接使用可商购上市产品。
所述胎儿细胞于怀孕哺乳动物，或孕妇母体血液中循环，具有完整的胎儿基因组。本发明所称胎儿细胞包括有核红细胞(fnrbc)和滋养层细胞(TBs)等。虽然本申请中采用术语“细胞”，但应理解其包括携带有特异性识别分子表面配体的细胞片段和/或碎片。本发明所称含有胎儿细胞的液体，包括含有所述胎儿细胞的缓冲液、培养液、怀孕哺乳动物或孕妇外周全血、宫颈拭子分散液或悬浮液等，还包括包含胎儿细胞的非孕妇外周血或宫颈拭子分散液/悬浮液，其中胎儿细胞被人工添加至非孕妇外周血或宫颈拭子分散液/悬浮液中。
包含二硫键的有机偶联体，指包含至少一个二硫键的有机小分子片段。
本发明的-A-X-通式中，当X为-S-(B)p-D-，B为
Figure BDA0002393061670000101
时，p＝0-10，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9；q、r、t分别为0-10，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选1-5；s为0-115，例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100，优选20-50。
当A为
Figure BDA0002393061670000102
时，n＝1-10,f＝1-10，例如，n、f可分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选n＝3-8，f＝2-8。
当X选自
Figure BDA0002393061670000103
时，m＝0-115，例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100，优选20-50；u＝1-10，例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，优选2-8。
本发明包含二硫键的有机偶联体可通过分子间弱相互作用(例如氢键、疏水作用等)和/或共价作用直接或间接固定于细胞捕获载体的表面。将所述有机偶联体连接于细胞捕获载体表面时，可将有机偶联体整体固定于载体表面，也可先将有机偶联体的部分片段固定于载体表面，再与有机偶联体的其他部分进行反应，最终使全部有机偶联体固定于载体表面。有机偶联体或部分有机偶联体，在固定于载体表面之前，可以依据上文所述，连接特异性识别分子；也可在固定于载体表面之后，再与所述特异性识别分子连接。应理解，包含二硫键的有机偶联体或部分有机偶联体，在连接至捕获载体和/或特异性识别分子之前；和/或部分有机偶联体在相互连接之前，可含有用于与所述捕获载体、特异性识别分子或另一部分部分有机偶联体连接的反应基团，这些基团在连接完成后会因反应而脱除，形成新的化学键。
例如，可以首先对细胞捕获载体进行巯基化，即，将包含二硫键的有机偶联体的部分片段固定于所述载体表面。本发明中用于巯基化的试剂可根据载体材质进行选择。当载体材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)时，可选用的载体表面巯基化试剂包括巯基硅烷衍生物(例如(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTS)、巯基乙基-三甲氧基硅烷、(4-巯基丁基)三甲氧基硅烷(MPTS))等。当载体材料为聚碳酸酯时，可选用的载体表面巯基化试剂包括巯基氨基化合物(例如3-巯基-2丙胺，5-氨基-1-巯基-戊烷)、氨基硅烷化试剂(例如3-氨丙基三乙氧基硅烷)。用于与巯基化载体连接的部分有机偶联体，可以为直链或支链的聚乙二醇衍生物，其一端为巯基，用于与巯基化载体偶联。一些实例中，该聚乙二醇衍生物在连接至特异性识别分子之前，含有可与特异性识别分子直接或间接连接的功能性基团，例如马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、炔基衍生物、叠氮基衍生物等。优选的与巯基化载体连接的部分有机偶联体可为芳香基二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯，其实例包括但不限于邻吡啶二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯(OPSS-PEG-SVA)、间吡啶二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯、对吡啶二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯。
示例性地，本发明中，可使用以下方案对微流控芯片进行识别分子(例如本发明优选的抗EpCAM抗体和抗CD71抗体)修饰：向微芯片中通入(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTS)于溶剂中的溶液，间隔性重复通入，并持续一段时间。其中的溶剂优选为乙醇，上述操作可采用手动注射器或自动微量进样器进行自动注射进样，其中自动进样器可优选为美国Harvard Apparatus Pump 11Pico Plus Elite syringe pump。随后用溶剂清洗通道若干次，烘箱中加热，加热温度可选为60到100℃，更优选为100℃，以获得最高效率的表面巯基化。取出该芯片，降温至室温后，向其中通入芳香基二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯于溶剂(例如乙醇)中的溶液。通入浓度可为0.005％～10％(质量分数)，优选0.01％(质量分数)。所述芳香基二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯优选为邻吡啶二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯或间吡啶二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯。
反应一段时间后，利用去离子水冲洗芯片，再利用冲液冲洗若干次，然后向微通道中通入识别分子，如抗体、氨基修饰核酸适体等。识别分子的浓度可为5μg/ml到1000μg/ml，更优选的为20μg/ml，孵育若干小时，得到含有识别分子的芯片界面。将所述芯片放置于冰箱，例如4℃冰箱待用。识别分子的修饰成果可通过带有荧光基团的识别识别分子的物质进行验证，例如带有荧光的二抗或带有荧光的核酸适体互补链。利用倒置荧光显微镜(品牌可为尼康、蔡司、莱卡等倒置荧光显微镜)成像，当阳性芯片的荧光值与阴性芯片的荧光值之比大于等于1.5时，证明识别分子修饰成功。
本发明中，还可使用如下方案进行微流控芯片的识别分子(例如本发明优选的抗EpCAM抗体和抗CD71抗体)修饰：通过生物素-链霉亲和素相互作用将识别分子连接至微芯片，其中有机偶联体的修饰如上文所述。将有机偶联体修饰至微芯片后，利用去离子水和缓冲液冲洗芯片，然后向微通道中通入5μg/ml到1000μg/ml，优选15μg/ml的链霉亲和素，孵育，得到链霉亲和素的微流控芯片界面，将所述芯片放置于4℃冰箱待用。使用前一个小时，将芯片取出后，利用缓冲液冲洗若干次，然后向微通道中通入浓度为5μg/ml到1000μg/ml，优选20μg/ml的含有生物素的识别分子，得到含有识别分子的微通道。
本发明中，使用细胞释放液对有机偶联体中的二硫键进行化学切割，使其断裂以切割细胞。优选的细胞释放液可优选为二硫苏糖醇溶液，三(2-羧乙基)膦溶液、谷胱甘肽溶液等，浓度可优选为10mM～100mM，例如10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM，90mM，100mM，更优选为50mM的二硫苏糖醇溶液。示例性的具体操作为使细胞释放液通过捕获有细胞的捕获模块或微流控芯片，孵育，冲洗，收集释放的细胞悬液。
本发明中，所述孕妇外周血，通常为孕7周至分娩前的孕妇所采外周血。应理解，本领域中为防止凝血等，采集的孕妇外周血将置于专用采血管中保存，这些采血管中通常含有抗凝剂(例如EDTA二钾)、缓冲剂或其他添加剂。使用本发明的捕获模块或用于捕获胎儿细胞的微流控芯片捕获分离孕妇外周血，或其它含有胎儿细胞的液体时，还可向其中加入细胞核染料、荧光示踪剂等，以辅助细胞追踪。
本发明有益效果：
本发明的捕获模块及微流控芯片，可对全血进行胎儿细胞捕获而不需进行预处理分离，克服了现有技术需要预分离造成的细胞缺损，提高最终的捕获、释放效率。
使用本发明的捕获模块及微流控芯片捕获胎儿细胞，捕获效率高、纯度高，并能有效避免背景干扰，使得捕获液体中极少量胎儿细胞成为可能。
使用本发明的捕获模块及微流控芯片捕获胎儿细胞，可对捕获的胎儿细胞进行高效、准确的无损释放，提高了回收胎儿细胞的纯度，避免了直接向芯片中注入细胞裂解液或酶解液导致的背景污染，无法进行全基因组分析；同时也避免了使用激光切割或毛细显微挑取的复杂操作及无法批量获取细胞的弊端；此外，本发明的捕获模块及微流控芯片捕获胎儿细胞还实现了对少量胎儿细胞的可控释放；上述优势对尽可能地去除污染物，高效进行下游分析具有重要意义。
附图说明
图1为微流控芯片的整体结构示意图及实物图。
图2为微流控芯片微阵列中微柱排布及参数示意图(非实际比例)，同一行相邻微柱的垂心间水平距离为x，后一微柱垂心相较于前一微柱垂心于流体微通道平面竖直方向的偏移距离为Δy；同一列上一微柱底端至下一微柱顶端于流体微通道平面的竖直方向间距为y。
图3A为微流控芯片进行特异性识别分子修饰的流程示意图。
图3B为经修饰的微流控芯片捕获及释放胎儿细胞流程示意图。
图4为微流控芯片捕获胎儿细胞后，释放前及释放后的细胞荧光成像图，白色光点为捕获的细胞。
图5为对释放后的胎儿细胞进行扩增测序后，与人类基因组的校准比对图：图5A为所捕获胎儿细胞全基因组拷贝数分析；图5B为所获得原始细胞溶液全基因组拷贝数分析。
具体实施方式
实施例1磁珠+二硫键修饰抗体的实验实施例
1.1实验方法磁珠选择Thermo Fisher公司，DynabeadsTMMyOneTMCarboxylicAcid，货号为65012，使用方法参考使用说明书，具体展示为：磁珠取出后，震荡混匀，取20μL磁珠用15mM MES buffer pH 6.0洗涤三次，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液(浓度见说明书)，反应30分钟，磁分离，15mM MES buffer pH 6.0洗涤三次，加入3-巯基-2-丙胺，反应30分钟，磁分离，15mM MES buffer pH 6.0洗涤三次，再加入0.01％(质量分数)的间吡啶基二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯(聚乙二醇分子量为2000)的溶液，反应30分钟，磁分离，15mM MES buffer pH 6.0洗涤三次。加入20μg/mL的识别抗体，室温下孵育1小时，用1×PBS+0.01％BSA清洗三次，得到免疫磁珠(重悬于20μL缓冲液中)。取5μL免疫磁珠与2mL孕妇外周血液混合，室温下孵育45分钟，磁分离。将磁分离得到的细胞进行抗体染色，荧光显微镜成像分析。其中，血液处理方法参考以下实施例3中的步骤3.1。实现细胞捕获后，取100微升，50mM DTT溶液，37度反应10分钟，磁分离，计算上清液中细胞的个数，细胞活性分析，具体步骤参考实施例4 4.1，结果见表1。
2)对比例1，如上实验，细胞捕获后，取100微升商品化胰酶(Thermo Fisher公司，Trypsin-EDTA(0.25％),phenol red,货号25200056)进行细胞释放，释放后细胞活性分析参考实施例4 4.1)。
1.2实验结果
表1磁珠为细胞捕获载体，二硫键化学切割释放及胰酶释放方法比较
Figure BDA0002393061670000141
实施例2制备用于胎儿细胞捕获的微流控芯片
参见图1的结构，制作微流控芯片。芯片的掩模版是由紫外光刻得到的含有su-8光刻胶通道的硅基芯片，将二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物倒入到芯片中，经过抽气、加热、脱模、打孔四步操作，可以得到含有微流控通道的PDMS通道层。将PDMS通道层和载玻片，使用等离子清洗机(Harrick，型号：PDC-002)键合成完整芯片。载玻片优选为帆船牌25.4×76.2mm无磨砂边载玻片。
芯片设置有两个进样口：入口(1)和入口(2)和一个出样口：出口(3)，进样口与出样口之间为布满微阵列的流体微通道，其结构如图1所示。本实施例中进样口、出样口采用微流控芯片打孔笔制备，打孔笔尺寸优选为(内径*外径,mm)3.3×4.0，3.3×3.5，2.4×3.0，2.3×2.8，1.9×2.4，1.6×2.1，1.2×1.8，0.9×1.3，0.6×0.9，0.5×0.8，0.4×0.7，更优选的，进样口打孔尺寸为0.4×0.7，出样口打孔尺寸为1.2×1.8。
作为具体示例(参见图2)，用于以下实施例进行细胞捕获释放的微流控芯片长4cm，宽1cm，进样口(1)为血样进样口，(2)为缓冲液进样口，采用相同的流速，同时进样。进样口与出样口间为流体微通道，上布设成行排列的三棱柱型微柱，所述微柱三角形截面边长为80μm，旋转角为15°，柱高50μm，x值为122μm，y值为32μm，Δy值为3.5μm。
可分别采用如下两种方法进行识别分子的偶联：
识别分子偶联方法一：直接将识别分子偶联在微通道上，具体操作如下：将本实施例具体示例的流体微通道通过等离子清洗机照射之后，立刻黏合在载玻片上，通入体积比为4％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTS)乙醇溶液20微升，每隔5分钟通一次，持续1小时，该操作捕获可采用手动注射器进样，也可以利用自动微量进样器进行自动注射进样，自动进样器可优选为美国Harvard Apparatus Pump 11Pico Plus Elite syringe pump。紧接着用乙醇溶液清洗通道三次，每次100微升，放入烘箱中加热一小时，加热温度为100℃，以获得最高效率的表面巯基化。取出该芯片，降温至室温后，向其中通入0.01％(质量分数)的邻吡啶二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯(聚乙二醇分子量为2000)。
反应30分钟之后，利用去离子水冲洗微通道，再利用PBS缓冲液冲洗三次，每次100微升，然后向微通道中通入20μg/ml的含有氨基的识别分子，孵育1小时，得到含有识别分子的流体微通道界面，将所述芯片放置于4℃冰箱待用。芯片制备后，利用PBS缓冲液清洗芯片三次，每次100微升，通入含有20μg/ml的带有荧光的二抗或者10μM带有荧光的核酸适体互补链，孵育30分钟后，利用PBS缓冲液清洗芯片三次，每次100微升，利用倒置荧光显微镜(尼康倒置荧光显微镜)成像，当修饰后的阳性芯片的荧光值与未经修饰的阴性芯片的荧光值之比大于等于1.5时，证明识别分子修饰成功。
识别分子偶联方法二：通过生物素-链霉亲和素相互作用将识别分子连接到微通道上，具体操作如下：将本实施例具体示例的微通道通过等离子清洗机照射之后，立刻黏合在载玻片上，通入体积比为4％的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTS)乙醇溶液20微升，每隔5分钟通一次，持续1小时，该操作捕获可采用手动注射器进样，也可以利用自动微量进样器进行自动注射进样，自动进样器可优选为美国Harvard Apparatus Pump 11Pico PlusElite syringe pump。紧接着用乙醇溶液清洗通道三次，每次100微升，放入烘箱中加热一小时，加热温度为100℃。取出该芯片，降温至室温后，向其中通入0.01％(质量分数)的芳香基二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯的乙醇溶液，该化合物可优选为邻吡啶二硫化物聚乙二醇琥珀酰亚胺戊酸酯(聚乙二醇分子量2000)。
反应30分钟之后，利用去离子水冲洗微通道，再利用PBS缓冲液冲洗三次，每次100微升，然后向微通道中通入15μg/ml链霉亲和素，孵育1小时，得到链霉亲和素化的流体微通道界面，将所述芯片放置于4℃冰箱待用。使用前一个小时，将芯片取出后，利用PBS缓冲液冲洗三次，每次100微升，然后向微通道中通入20μg/ml含有生物素的识别分子(人EpCAM/TROP1生物素亲和纯化的PAb，货号BAF960)，孵育1个小时，得到含有识别分子的流体微通道。偶联步骤示意图可见图3A。
以下使用偶联方法二制得的芯片用于胎儿细胞捕获/释放效果测试。
实施例3检测微流控芯片对胎儿细胞的捕获效率
3.1实验方法
取实施例2中的识别分子偶联方法二得到的微流控芯片，利用3％的牛血清白蛋白溶液作为封闭液封闭芯片30分钟。
利用外加可培养的细胞系到1mL健康人外周血中以模拟孕妇外周血环境，(其中可培养的胎儿细胞株为JEG-3(人绒毛膜癌细胞系)，购置于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，目录号TCHu195)。具体为：JEG-3细胞个数大约100个、白细胞9.63×106个/mL、红细胞3.98×109个/mL，将所得血液通过注射泵通过进样口(1)，同时进样口(2)同时通入缓冲液，流速为0.3mL/h。血液通入完毕后，利用PBS缓冲液以1.0mL/h的流速冲洗15分钟芯片。JEG-3细胞系在加入到血液中，预先进行了钙黄绿素染色，以区分靶标细胞和血液中的血细胞，染色方法为：利用0.02％EDTA(乙二胺四乙酸二钠)消化液，pH为7.2～7.4之间，消化细胞10分钟，去掉消化液，加入PBS缓冲液，将细胞吹下来，得到1*105个/ml浓度的细胞，取200微升细胞液，加入1微升钙黄绿素溶液(赛默飞世尔公司，货号C34852)，37度染色10分钟，500微升PBS缓冲液洗涤三次，每次离心为1000g，3分钟，得到预染细胞液。捕获步骤示意图可见图3B。
芯片洗涤后，通过倒置荧光显微镜(蓝色激光激发)成像，计算荧光细胞的个数来考察胎儿细胞的捕获效率，结果如表2所示。
其中以人B淋巴细胞瘤细胞Ramos及白细胞WBCs作为阴性细胞，用来考察芯片的特异性识别，以及非特异性吸附，其操作参考JEG-3细胞的处理方法。
3.2实验结果
表2捕获效率分析
Figure BDA0002393061670000161
3.3对比例2血液预处理对带捕获细胞的影响
将100个JEG-3细胞加入1mL人外周全血以模拟孕妇外周血，JEG-3处理参考2.1实验方法。采用3种不同的方法进行对比分析：1)全血无处理，直接通入芯片中进行进样分析；2)取外周血与配好的梯度分离液(percoll密度采用1.090)以4:3体积比取于离心管中，离心条件400g，时间30分钟，温度18-20℃。离心后可得到4层溶液，分别为成熟红细胞层、离心液层、单核细胞层、血小板和血浆层，用巴氏吸管取出单核细胞层，转移到2mL离心管中，离心、洗涤，最后重悬于300μL PBS中备用；3)采用红细胞裂解液(碳酸氢钾(KHCO3)1.0g；氯化氨(NH4Cl)8.3g；EDTA-Na2 0.037g，加双蒸水至1000mL，即为红细胞裂解液)，以5倍体积的红细胞裂解液与血液颠倒混合5分钟，将裂解后的溶液使用400-500g离心5分钟，弃红色上清，4℃离心效果更佳，富集底部单核细胞，重悬于300μL PBS中备用。
将通过上述3种方法处理的样本，使用以3.1中相同的方法通入到微流控芯片中，流速优选为0.3mL/h，芯片洗涤后，通过倒置荧光显微镜(蓝色激光激发)成像，计算荧光细胞的个数来考察胎儿细胞的捕获效率。不同外周血处理方法下，经微流控芯片捕获前后的细胞计数分别如表3和表4所示。
表3不同外周血处理方法下经芯片捕获前的细胞计数
Figure BDA0002393061670000171
血液的前处理，虽然可以去掉部分红细胞及血清，降低细胞样本的复杂程度，但是也造成了不等的细胞丢失。而本申请技术方案可以允许全血的运行，因此，能够在待捕获细胞很少的情况下，进一步降低细胞的丢失。
表4不同外周血处理方法下，经芯片捕获后的细胞计数
Figure BDA0002393061670000172
备注：由于红细胞不含有细胞核，不对后续分析产生影响，故不计入统计范围。
实施例4检测胎儿细胞的释放效率
4.1实验方法
1)使用化学切割法释放实施例3中捕获的胎儿细胞，具体实验操作如：将50mM的二硫苏糖醇溶液通入到捕获有细胞的芯片中(入口1)，37℃孵育10分钟，后利用含3％牛血清白蛋白的PBS缓冲液，冲洗，流速设定为3mL/h，总使用体积为1毫升，通过出口(3)收集释放的细胞悬液。
2)通过对比芯片中释放前和释放后的细胞个数，统计释放效率，通过统计最终1毫升细胞悬液中细胞的个数，来统计释放后细胞的回收率。释放效率及回收率之间的差异原因可能来来源于收集过程中，管道对细胞的吸附，可通过封闭液封闭得到一定的改善，封闭液为3％的牛血清白蛋白溶液。细胞个数的统计方法，参考3.1实验方法部分。释放步骤示意图可见图3B。
3)释放后细胞活性分析：细胞活性分析，采用传统的双重染色法(即钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液)对释放后的细胞进行分析，具体方法描述为：取释放后细胞回收悬液，采用离心浓度，1000g,3分钟离心，得到200微升的悬液，加入1微升Calcein-AM(Thermo Fisher公司，货号C3099)及1微升PI溶液(Sigma公司，货号P4864)，37℃下，孵育30分钟，采用荧光倒置显微镜进行成像分析，滤色片Ex 465-495nm/BA 521-558nm成像得到活细胞个数，滤色片Ex 520-555nm/BA 570-630nm成像得到细胞个数，得到细胞活性，计算公式为细胞活性＝活细胞个数/(活细胞个数+死细胞个数)*100。
4)对比例3，使用胰酶消化法进行释放实施例3中捕获的胎儿细胞，具体实验操作为：将0.25％胰酶溶液(赛默飞世尔公司，货号25200056)通入到捕获有细胞的芯片中(入口1)，37℃孵育3分钟，后利用含3％牛血清白蛋白的PBS缓冲液，冲洗，流速设定为3mL/h，总使用体积为1毫升，通过出口(3)收集释放的细胞悬液。后续细胞活性分析实验参考实验4.1(3)。
4.2实验结果
释放的直观图参考如图4所示，捕获到相同位置的细胞可通过细胞释放液的作用，得到特定的释放，其统计结果，见表5。
表5细胞释放效率、回收率及释放后活性分析
Figure BDA0002393061670000181
实施例5捕获细胞的基因组及转录组分析
5.1实验方法
1)基因组分析：从实施例4中释放的胎儿细胞收集在1.5ml无RNase的Eppendorf管中，离心去上清(条件1000g,3分钟)，浓缩体积至10微升，并用DNA提取试剂盒或热裂解方式进行DNA回收，本实施例中采用热裂解的形式进行裂解，经过对比实验显示，热裂解的处理方法能得到最低的DNA丢失率。将样本置于95℃加热器上，热裂解10分钟，后置于-80℃冰箱中备用(注：样本存放不超过48个小时)。使用Bio-Rad的PrimePCR ddPCR检测试剂盒检测DNA样品，该试剂盒能够检测EGFR L858突变(货号#1863104；这里检测EGFR L858突变，是因为参入的细胞发生了该突变，而正常的血液样本为野生型，以此来对富集后细胞的基因分析进行特定分析)。使用Bio-Rad配套软件包对数据进行分析，以计算从单个样品中检测到的EGFR L858突变数。
2)转录组分析：从实施例4中释放的胎儿细胞收集在1.5ml无RNase的Eppendorf管中，离心去上清(条件1000g,3分钟)，浓缩体积至10微升，并用RNA提取试剂盒进行RNA回收，本实施例中采用Zymo Research Corp公司的TRI Reagent(货号R2050-1-50)进行细胞的裂解，实验方法参考说明书；使用Zymo Research Corp公司的Direct-zol RNA MicroPrep(货号R2060)试剂盒纯化收集的RNA，使用方法参考说明书。得到RNA后，采用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，本实施例中选用Thermo Fisher公司的Scientific Maxima H Minus(货号M1661)逆转录酶试剂盒将纯化的RNA反转录为cDNA。使用Bio-Rad的PrimePCR ddPCR检测试剂盒检测cDNA样品，该试剂盒涵盖14种ROS1基因重排亚型(货号qHsaCID0016464；这里检测ROS1基因，是因为参入的细胞高表达，而正常的血液不表达或者表达量很低)。使用Bio-Rad配套软件包对数据进行分析，以计算从单个样品中检测到的ROS1重排的相应拷贝数。
3)对比例4，芯片中裂解方法简述：从实施例3中得到捕获有细胞的微芯片，进行DNA或者RNA的回收，回收方法采用上述5.1步骤1)、2)的回收试剂盒，直接通入到芯片中进行细胞裂解后，吸出溶液，再进行进一步的提纯。
5.2实验结果
1)对于稀有细胞基因突变的检测，本发明释放方法比在芯片上直接进行细胞裂解的方法更优，能够保持更高基因浓度，进而提高检出率，减低假阴性率。如下表5所示，即使细胞个数低至2个，本申请芯片仍可以得到较好的检出率。而对比例4中，即使细胞个数高至25个，其检出率也非常低。
表6突变型/野生型检出率比值分析
Figure BDA0002393061670000191
2)对于细胞转录组的检测，如表7所示，本发明释放方法比在芯片上直接进行细胞裂解的方法更优，能够保持更高基因表达分析，进而提高检出率，减低假阴性率。
表7转录组ROS1拷贝数分析
Figure BDA0002393061670000201
实施例6胎儿细胞全基因组分析
6.1实验方法
1)从实施例4中释放的胎儿细胞，通过荧光显微镜实现胎儿细胞的挑取，收集在0.2ml无RNase的Eppendorf管中，转移试剂控制在1微升以内，利用商品化的全基因组扩增试剂盒进行后续操作，试剂盒为
Figure BDA0002393061670000202
单细胞全基因组扩增试剂盒，上海亿康医学检验所有限公司。细胞扩增后采用磁珠(参考南京诺唯赞生物科技有限公司，货号N412-01)纯化对产物进行纯化。对所获基因组进行全基因组建库(参考南京诺唯赞生物科技有限公司，货号TD502-01)，采用磁珠(参考南京诺唯赞生物科技有限公司，货号N412-01)纯化对产物进行纯化。定量后，送到公司进行测序分析(参考北京诺禾致源科技股份有限公司，二代全基因组测序分析，NovaSeq技术(Illumina))。通过与参考序列号h19进行比对，得到胎儿细胞的全基因组拷贝数。
2)参比实施例，为了验证所获得的细胞的基因组完整性，以未经过任何芯片处理、释放的原始细胞溶液做为参考品，进行测序分析，与6.1步骤1)的结果进行对比。原始细胞溶液处理如下：取105个细胞，利用基因组提取试剂盒进行基因的提取，(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号DC111-01)。对所获基因组进行全基因组建库(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号TD501-01)，采用磁珠(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号N412-01)纯化对产物进行纯化。定量后，送到公司进行测序分析(北京诺禾致源科技股份有限公司，二代全基因组测序分析，NovaSeq技术(Illumina))。通过与参考序列号h19进行比对，得到原始细胞溶液的全基因组拷贝数。
6.2实验结果分析
如附图5所示，结果表明，通过芯片富集后的细胞(图5A)仍然保持了原有亲本(图5B)的基因信息，为胎儿遗传疾病的研究提供了保真性的保障前提，该方法为遗传疾病的筛查奠定了基础。

Claims (14)

1.一种胎儿细胞捕获模块，包括细胞捕获载体和用于特异性捕获所述细胞的识别分子，所述识别分子经由包含二硫键的有机偶联体L连接至所述细胞捕获载体表面。
2.根据权利要求1所述的捕获模块，其特征在于，所述有机偶联体L具有通式：
-A-X-，
A是一端为硫键，另一端共价连接至所述捕获载体的基团；
X是一端为硫键，另一端直接或间接连接所述识别分子的基团，
X具有通式：
-S-(B)p-D-，
p＝0-10，
S为硫，
D是用于与所述识别分子连接的基团；优选D为酰胺基、氨酰基、硫基、琥珀酰亚胺基、炔基或叠氮基；
B为
Figure FDA0002393061660000011
其中，q、r、t分别为0-10，优选1-5；s为0-115，优选20-50。
3.根据权利要求1所述的捕获模块，其特征在于，所述有机偶联体L具有通式：
-A-X-
其中：
A选自
Figure FDA0002393061660000012
A通过非硫键端共价连接至所述捕获载体，
其中n＝1-10,f＝1-10；优选地，n＝3-8，f＝2-8；
X选自
Figure FDA0002393061660000013
优选选自
Figure FDA0002393061660000014
其中X硫键端与A共价连接形成二硫键，另一端直接或间接连接至所述识别分子，
m＝0-115，u＝1-10；优选地，m＝20-50，u＝2-8；
优选地，所述有机偶联体L选自如下结构中的一种或多种：
Figure FDA0002393061660000021
其中m＝0-115；优选地，m＝20-50。
4.根据权利要求1或2所述的捕获模块，其特征在于，所述识别分子包括核酸适体、多肽或抗体中的一种或多种；
优选地，所述识别分子为抗EpCAM抗体和抗CD71抗体中的一种或两种。
5.根据权利要求1或2所述的捕获模块，其特征在于，所述胎儿细胞为有核红细胞或滋养层细胞。
6.根据权利要求1或2所述的捕获模块，其特征在于，所述细胞捕获载体包括磁珠或微流控芯片。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的捕获模块的使用方法，包括使所述捕获模块与包含所述胎儿细胞的液体相接触，以实现所述细胞的捕获；
优选地，所述包含所述胎儿细胞的液体包括怀孕哺乳动物或孕妇的外周血、宫颈拭子分散液或悬浮液，或者包含胎儿细胞的非孕妇外周血、缓冲液或培养液；
优选地，所述液体不经预分离处理直接与所述捕获模块接触；
优选地，在所述胎儿细胞捕获后，将所述捕获模块与化学切割剂接触，使所述有机偶联体L的二硫键断裂，实现所述胎儿细胞的释放；
优选地，所述化学切割剂为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、谷胱甘肽中的一种或多种。
8.一种用于胎儿细胞捕获的微流控芯片，其特征在于，表面经包含二硫键的有机偶联体L修饰以特异性捕获所述胎儿细胞的识别分子，所述识别分子在捕获细胞后，通过化学切割所述有机偶联体L中的二硫键实现对所述细胞的释放；
优选地，所述微流控芯片设置有供流体通过的入口、出口和流体微通道；
优选地，所述流体微通道上还设置有微阵列，所述微阵列由多个成一行或多行排列的微柱组成；
优选地，所述微柱截面形状为三角形。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述有机偶联体L具有通式：
-A-X-，
A是一端为硫键，另一端共价连接至所述捕获载体的基团；
X是一端为硫键，另一端直接或间接连接所述识别分子的基团，
X具有通式：
-S-(B)p-D-，
p＝0-10，
S为硫，
D是用于与所述识别分子连接的基团；优选D为酰胺基、氨酰基、硫基、琥珀酰亚胺基、炔基或叠氮基；
B为
Figure FDA0002393061660000031
其中，q、r、t分别为0-10，优选1-5；s为0-115，优选20-50。
10.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，所述有机偶联体L具有通式：
-A-X-，
其中：
A选自
Figure FDA0002393061660000032
A通过非硫键端共价连接至所述芯片，
其中n＝1-10,f＝1-10；优选地，n＝3-8，f＝2-8；
X选自
Figure FDA0002393061660000033
优选选自
Figure FDA0002393061660000034
其中X硫键端与A共价连接形成二硫键，另一端直接或间接连接至所述识别分子，
m＝0-115，u＝1-10；优选地，m＝20-50，u＝2-8；
优选地，所述有机偶联体L选自如下结构的一种或多种：
Figure FDA0002393061660000035
其中m＝0-115，优选地，m＝20-50。
11.根据权利要求8或9所述的微流控芯片，其特征在于，所述化学切割通过二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦和谷胱甘肽中的一种或多种实现。
12.根据权利要求8或9所述的微流控芯片，其特征在于，所述识别分子包括核酸适体、多肽或抗体中的一种或多种；
优选地，所述特异性识别分子为抗EpCAM抗体或抗CD71抗体中的一种或两种。
13.根据权利要求8或9所述的微流控芯片，其特征在于，所述胎儿细胞为有核红细胞或滋养层细胞。
14.一种权利要求8-13中任一项所述微流控芯片的使用方法，所述方法包括：
(1)获取包含胎儿细胞的液体；
(2)将步骤(1)所得液体注入所述微流控芯片，使所述液体中的胎儿细胞与所述特异性识别分子接触，实现所述胎儿细胞的捕获；
优选地，所述方法还包括：
(3)向所述微流控芯片中加入化学切割剂，使所述有机偶联体中的二硫键断裂，释放所述捕获的胎儿细胞；
优选地，所述包含胎儿细胞的液体包括怀孕哺乳动物或孕妇的外周血、宫颈拭子分散液或悬浮液，或者包含胎儿细胞的非孕妇外周血、非孕妇宫颈拭子分散液或悬浮液、缓冲液或培养液；
优选地，所述液体不经预分离处理直接通入所述微流控芯片；
优选地，所述液体通过所述微流控芯片的流速为0.1-10mL/h，优选0.1～1mL/h。
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