CN115948544B - Cited4和/或metrn在椎间盘退变程度的鉴别诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CITED4和/或METRN在椎间盘退变程度的鉴别诊断中的应用，所述CITED4、METRN在不同椎间盘退变程度的组织中呈现显著性的差异，对椎间盘退变的程度具有较高的鉴别诊断价值，能够用于椎间盘退行性病变的鉴别诊断、相关干预措施的效用评价中，为本领域有关椎间盘退变的程度鉴别诊断提供了一种新思路，具有重要的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及CITED4和/或METRN在椎间盘退变程度的鉴别诊断中的应用。
背景技术
椎间盘退行性病变（Intervertebral disc degeneration，IDD）是由于年龄增长，运动系统功能减退，腰椎的稳定性降低，椎间盘所受应力增加，发生的退行性改变，又称为椎间盘退变，常见于中老年人。当椎间盘所承受的负荷超过了最大限度，纤维环破裂，最终可致髓核从中突出，引起腰腿痛。而椎间盘退行性病变是引起下腰背痛的主要原因之一。据统计，成年人中约有84%一生中至少会经历一次腰痛，其中由椎间盘退行性病变引起的腰痛占绝大多数。严重的椎间盘退行性病变甚至会引起下肢感觉障碍、大小便失禁等。椎间盘退行性病变已成为全球致残的重要因素，且随着世界人口老龄化，椎间盘退行性病变威胁健康的问题日益严重。因此，椎间盘退行性病变的早期诊断以及椎间盘退变的程度的量化对于及时干预治疗椎间盘退行性病变并延缓椎间盘退行性病变的进一步发展具有十分重要的临床价值。
临床上对椎间盘退行性疾病的诊断目前仍然主要以影像学病变诊断为主，即采用核磁共振及X射线等影像学技术，通过观察椎间盘异常改变的情况判断椎间盘组织的退变程度。然而与经典的病理组织学诊断及基于病理组织学的分子病理诊断技术相比，影像学诊断虽然特异性较好且无创安全，但组织的影像学特征改变缓慢，将影像学特征作为椎间盘退行性病变的标志在探索治疗方案的前期基础研究及其后期临床诊疗方案的优化方面仍然存在一定的局限性。在更深层次的细胞和分子层面探索更多的椎间盘退行性病变诊断生物标志物，可能对其临床诊疗具有潜在的意义和价值。分子生物学的异常改变通常伴随甚至早于疾病组织形态学的变化，基因及蛋白水平的变化相较于疾病组织形态学通常也可以更加灵敏的反应。研究表明，髓核组织的退变早于其它椎间盘组织，与细胞老化、凋亡、自噬、细胞外基质稳态的改变、髓核中水分减少密切相关。而软骨细胞在成年人髓核中占有较大比例，承担了较大的负荷，是维持椎间盘生物学活性的重要成分。因此，探索退变髓核组织中软骨细胞的分子特征是该领域的热点。
目前，尚未见有关CITED4和/或METRN在椎间盘退变程度的鉴别诊断中的应用的相关研究或报道。
发明内容
为了克服目前本领域存在的上述技术问题，本发明提供了CITED4和/或METRN在椎间盘退变程度的鉴别诊断中的应用。
本发明利用单细胞转录组测序技术和生物信息学分析技术，通过分析本发明的发明人临床收集得到的人椎间盘髓核组织的单细胞基因表达谱，分离、表征、识别了一种能反映椎间盘退变过程的软骨细胞亚群，并通过进一步的研究确定了该细胞亚群所表达的新的特征基因CITED4、METRN，所述特征基因对椎间盘髓核组织退变的程度的鉴别诊断具有较高的诊断价值，对椎间盘髓核组织病理性退变的发生发展具有标记意义。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了检测样本中CITED4和/或METRN表达水平的试剂在制备鉴别诊断椎间盘退变程度或评估椎间盘退变治疗疗效的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括：
检测样本中CITED4和/或METRN的mRNA表达水平的试剂；
检测样本中CITED4和/或METRN的蛋白表达水平的试剂；或
检测样本中CITED4和/或METRN阳性表达细胞数的试剂。
进一步，所述检测样本中CITED4和/或METRN的mRNA表达水平的试剂包括：
特异性扩增CITED4和/或METRN的引物；或
特异性识别CITED4和/或METRN的探针。
进一步，所述检测样本中CITED4和/或METRN的蛋白表达水平的试剂包括：
特异性结合CITED4和/或METRN编码的蛋白的抗体；或
特异性结合CITED4和/或METRN编码的蛋白的亲和性蛋白。
进一步，所述检测样本中CITED4和/或METRN阳性表达细胞数的试剂包括通过免疫组化实验检测CITED4和/或METRN阳性表达细胞数的试剂。
在本发明中，所述基因CITED4、METRN的信息如下：基因CITED4（Cbp/p300interacting transactivator with Glu/Asp rich carboxy-terminal domain 4）的GeneID为163732，基因METRN（meteorin, glial cell differentiation regulator）的Gene ID为79006，所述基因的详细信息可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。
在本发明中，所述基因CITED4、METRN包括人CITED4基因、人METRN基因以及人CITED4基因、人METRN基因的任何功能等同物的多核苷酸。可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达CITED4、METRN的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。所述病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于：逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒（例如，单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体、甲病毒载体。所述真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于：pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
进一步，所述引物同扩增引物，是指包含5-100个核苷酸的核酸片段，优选地，所述引物或扩增引物包含能起始酶促反应（例如，酶促扩增反应）的15-30个核苷酸，在本发明的具体实施方式中，所述引物是指特异性扩增基因CITED4和/或METRN的引物。
进一步，所述探针是指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。在本发明的具体实施方式中，所述探针是指特异性识别CITED4和/或METRN的探针。除非另有指出，探针通常是指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸（往往称为靶多核苷酸）结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。杂交方式包括但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。本发明中的示例性探针包括基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
杂交反应的严格性可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。
进一步，所述特异性结合CITED4和/或METRN编码的蛋白的试剂包括但不限于：抗体、亲和性蛋白，还包括与CITED4和/或METRN编码的蛋白特异性结合的肽、适配体和/或化合物。
进一步，所述抗体是本领域众所周知的，是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。本发明中所述的抗体是指与本发明所述的CITED4和/或METRN编码的蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体。抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段（诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段）、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体（诸如双特异性抗体）、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物学结合活性即可。
进一步，所述肽具有与靶物质（本发明所述的CITED4和/或METRN编码的蛋白）高度结合的能力，并且在热处理或化学处理期间不会发生变性。而且，由于其尺寸小，可以通过将其附接到其它蛋白上而用作融合蛋白。具体而言，因为可以特异性地附接到高分子蛋白链上，其可以用作诊断试剂盒和药物递送物质。
进一步，所述适配体是指一种由特定类型的单链核酸（DNA、RNA或修饰的核酸）组成的多核苷酸，所述单链核酸自身具有稳定的三级结构，并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子（本发明所述的CITED4和/或METRN编码的蛋白）结合的特性。如上所述，由于适配体可以像抗体那样特异性结合抗原性物质，但比蛋白更稳定、具有更简单的结构，并且是由易于合成的多核苷酸组成，因此可以代替抗体来使用。
进一步，所述通过免疫组化实验检测CITED4和/或METRN阳性表达细胞数的试剂包括但不限于任何通过免疫组化实验检测CITED4和/或METRN阳性表达细胞数所需的试剂，例如，固定剂、缓冲液、显色液、粘附剂、封固剂、酶消化液、蔗糖溶液。其中，所述固定剂包括但不限于：甲醛、戊二醛、多聚甲醛、乙醇、HneFIX、丙酮；所述缓冲液包括但不限于：PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、EDTA缓冲液、TBS缓冲液；所述显色液包括但不限于：DAB显色液、4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液、3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液、TMB显色液、NBT显色液；所述粘附剂包括但不限于：明胶、树脂胶、多聚赖氨酸、商品化粘附剂；所述封固剂包括但不限于：脱脂奶粉、BSA、血清以及Fab片段单链二抗；所述酶消化液包括但不限于：胰蛋白酶消化液、胃蛋白酶消化液。
进一步，所述鉴别诊断椎间盘退变程度是指鉴别诊断受试者椎间盘退变的程度，在本发明的具体实施方案中，所述鉴别诊断椎间盘退变程度尤其是指CITED4和/或METRN对中度和重度退变组织、轻度和重度退变组织、轻中度和重度退变组织的鉴别诊断，且经实验验证发现CITED4和/或METRN在鉴别诊断上述不同退变程度的组织中的AUC值均大于0.9，灵敏度和特异性均较高，具有优异的诊断效能。
进一步，所述评估椎间盘退变治疗疗效是指评估受试者对某种治疗方法或治疗药物的疗效，在本发明的具体实施方案中，所述评估椎间盘退变治疗疗效尤其是指CITED4和/或METRN通过对椎间盘退变受试者的中度和重度退变组织、轻度和重度退变组织、轻中度和重度退变组织进行鉴别诊断，进一步评估得出受试者对某种治疗方法或治疗药物的疗效，具有较好的临床应用前景。
进一步，所述表达水平是指本发明中所述CITED4和/或METRN的绝对量或相对量，可以通过本领域技术人员熟知的多种技术确定本发明中所述CITED4和/或METRN的表达水平，特别地，可以通过使用本领域技术人员熟知的免疫组化检测方法对本发明中所述的CITED4和/或METRN的绝对量或相对量进行检测。
进一步，所述样本是指获自或衍生自目标受试者的组合物，其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。该样本可以获自受试者的血液和生物来源的其他流体样本及组织样本，如活检组织样本或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样本的来源可以是实体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样本、活检组织或吸出物；血液或任意血液组分；体液；来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞；或血浆。术语样本包括在其获得后以任何方式处理过的生物样本，如经试剂处理、稳定化、或针对某些成分（如蛋白质或多核苷酸）富集、或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。
进一步，所述样本包括但不限于：组织、血液、血清、血浆、血液来源的细胞、淋巴液、滑膜液、脑脊髓液、胸膜液、腹腔液、膀胱冲洗液、分泌物（例如，乳腺分泌物）、口腔冲洗液、拭子（例如，口腔拭子）、触碰准备物、细针穿刺物、细胞提取物及其组合，在本发明的具体实施方案中，所述样本优选为受试者来源的组织样本，更优选为受试者来源的退变椎间盘组织样本。
进一步，所述鉴别诊断是指基于与个体相关的一个或多个的症状、数据或其他信息，来对个体的健康状态或状况的发现、判断、鉴别或认知。在本发明的具体实施方式中，所述椎间盘退变程度的鉴别诊断是指对不同椎间盘退变程度的个体进行区分，尤其是指对中度和重度椎间盘退变、轻度和重度椎间盘退变、轻中度和重度退变椎间盘退变的个体的区分。
进一步，所述试剂是通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、免疫组化技术检测受试者待测样本中CITED4和/或METRN表达水平。
进一步，所述测序技术为核酸测序技术，包括链终止子（Sanger）测序技术和染料终止子测序技术，本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此，在测序前通常将RNA逆转录成DNA，此外，所述测序技术还包括下一代测序技术（即深度测序/高通量测序技术）。
进一步，所述核酸杂交技术包括但不限于：原位杂交（ISH）、微阵列和Southern或Northern印迹。
进一步，所述核酸扩增技术包括但不限于：聚合酶链式反应（PCR）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、转录介导的扩增（TMA）、连接酶链式反应（LCR）、链置换扩增（SDA）、基于核酸序列的扩增（NASBA）。
进一步，所述蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别CITED4和/或METRN上不同表位的两种抗体进行该标志物的检测；放射免疫测定（RIA）、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定（ELISA）、酶免疫测定（EIA）、荧光免疫测定（FIA）、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定（如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点）。
本发明的第二方面提供了一种用于鉴别诊断椎间盘退变程度或评估椎间盘退变治疗疗效的产品。
进一步，所述产品包括检测样本中CITED4和/或METRN表达水平的试剂。
进一步，所述产品包括检测试剂盒、生物芯片。
进一步，所述检测试剂盒包括特异性结合CITED4和/或METRN的引物、探针；
所述生物芯片包括固相载体、附着在固相载体上的特异性识别CITED4和/或METRN的探针。
进一步，所述检测试剂盒还包括选自以下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
进一步，所述检测试剂盒包括：RT-PCR检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、蛋白芯片检测试剂盒、快速检测试剂盒、DNA芯片检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、或MRM（多反应监测）检测试剂盒。
进一步，所述检测试剂盒可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。RT-PCR检测试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物。各引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的核苷酸，其长度可为约7至50 bp，更特别为约10-39 bp。此外，所述试剂盒可进一步包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物；优选地，所述RT-PCR检测试剂盒还可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液（不同pH值和镁浓度）、脱氧核苷酸（dNTP）、酶（例如Taq聚合酶和反转录酶）、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水、和无菌水。
进一步，所述检测试剂盒可包含用于操作DNA芯片所必需的元件。所述DNA芯片试剂盒可包含与基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外，所述底物可包含对照基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本发明公开的检测试剂盒可包含用于进行ELISA所必需的元件。所述ELISA检测试剂盒可包含特异性针对蛋白（本发明所述的CITED4和/或METRN编码的蛋白）的抗体。所述抗体具有针对标记物蛋白的高选择性和亲合力，与其他蛋白无交叉反应性，并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，所述ELISA检测试剂盒可包含特异性针对对照蛋白的抗体。此外，所述ELISA检测试剂盒可进一步包含能够检测被结合的抗体的试剂，例如，标记的第二抗体、发色团、酶（例如，与抗体缀合）、及其底物或能够结合所述抗体的物质。
进一步，所述生物芯片也称为阵列，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为微阵列，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
微阵列是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针（例如寡核苷酸）或结合剂（例如抗体）。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
在本发明中，所述生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于CITED4和/或METRN所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的CITED4和/或METRN编码的蛋白的特异性抗体或配体。
进一步，所述抗体明确包括嵌合抗体（免疫球蛋白），其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而重链和/或轻链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
进一步，所述配体可包含能够特异性结合CITED4和/或METRN的肽、抗体或其片段、或适配体或寡核苷酸。本发明中使用的针对CITED4和/或METRN编码的蛋白的抗体以最广义使用，具体涵盖例如单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。只要所述片段能够保留与CITED4和/或METRN编码的蛋白的结合能力即可。
本发明的第三方面提供了检测样本中CITED4和/或METRN表达水平的试剂在制备鉴别诊断椎间盘退变程度或评估椎间盘退变治疗疗效的系统和/或装置中的应用。
本发明的第四方面提供了一种鉴别诊断椎间盘退变程度或评估椎间盘退变治疗疗效的系统和/或装置。
进一步，所述系统/装置包括处理器、输入模块、输出模块；
其中，处理器用于对输入的信息采用生物信息学方法进行逻辑运算；输入模块用于输入受试者样本中CITED4和/或METRN的表达水平，包含指令的计算机可读介质，所述指令在由所述处理器执行时在CITED4和/或METRN的输入表达水平上执行算法；输出模块用于输出受试者椎间盘退变的程度或椎间盘退变的治疗疗效。
进一步，本发明中所述的受试者意指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物（特别是高等灵长类动物）、绵羊、狗、啮齿类动物（如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等，在本发明的具体实施方式中，所述受试者优选为人。
本发明还提供了一种计算机可读存储介质。所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现本发明第四方面所述的系统和/或装置。
进一步，所述系统/装置是用于区分不同级别的不同组件、元件、部件、部分或装配的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换所述词语。本领域所属技术领域的技术人员熟知，本发明可以实现为设备、方法或计算机程序产品。因此，本发明公开的内容可以具体实现为以下形式，即可以是完全的硬件、也可以是完全的软件（包括固件、驻留软件、微代码等），还可以是硬件和软件结合的形式。此外，在一些具体实施例中，本发明还可以实现为在一个或多个计算机可读介质中的计算机程序产品的形式，该计算机可读介质中包含计算机可读的程序代码。
可以采用一个或多个计算机可读的介质的任意组合。计算机可读介质可以是计算机可读信号介质或者计算机可读存储介质。计算机可读存储介质例如可以是但不限于电、磁、光、电磁、红外线、或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。在本发明中，所述计算机可读存储介质可以是任何包含或存储程序的有形介质，该程序可以被指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
（1）本发明首次发现CITED4、METRN在不同退变程度的椎间盘退变组织中存在显著差异表达，其与椎间盘退变的程度具有极高的关联度，在本发明收集的临床样本中表现出对椎间盘退变程度的较高的鉴别诊断效能，准确性、灵敏度和特异性均较高，其中，CITED4分别用于鉴别诊断中度与重度、轻度与重度、轻中度与重度退变的AUC值分别为0.917、0.961、0.938，METRN分别用于鉴别诊断中度与重度、轻度与重度、轻中度与重度退变的AUC值为0.911、0.929、0.92，CITED4和METRN共同用于鉴别诊断中度与重度、轻度与重度、轻中度与重度退变的AUC值为0.933、0.953、0.949。表明CITED4、METRN能够作为鉴别诊断椎间盘退变程度的生物标志物，有效用于椎间盘退变程度的鉴别诊断中，进而在早期进行及时有效的干预和治疗。
（2）本发明提供的CITED4和/或METRN对椎间盘退变程度的鉴别诊断的诊断效能较高，具有良好的开发为诊断方法的前景。此外，本发明为解决本领域存在的在临床实践中影像学诊断依赖于组织的影像学特征、而组织的影像学特征改变缓慢导致诊断结果滞后这一技术问题，以及疾病组织形态学的变化往往晚于分子生物学的异常改变导致的基于组织形态学的相关诊断方法的灵敏度较低这一技术问题提供了全新的解决策略。本发明从分子水平鉴定出的特征基因能够为椎间盘退变生物标志物的发掘、推广应用提供一定的理论依据，对椎间盘退行性病变的鉴别诊断、相关干预措施的效用评价以及了解该疾病的发病机制和病程进展均具有重要的应用意义。
附图说明
图1为人椎间盘髓核组织单细胞悬液制备质控结果图；
图2为人椎间盘髓核组织单细胞亚群结果图；
图3为展示人椎间盘髓核组织软骨细胞第8亚群标记分子CITED4和METRN的mRNA表达情况的小提琴图；
图4为人椎间盘髓核组织中Aggrecan（ACAN）表达阳性的细胞被鉴定为软骨细胞的结果图，其中，左图：100X，右图：400X；
图5为免疫组织化学染色后不同Pfirrmann分级的人椎间盘髓核组织中CITED4+表达的软骨细胞存在差异的结果图，100X；
图6为在训练集中，不同组别人椎间盘髓核组织中CITED4+细胞个数、METRN+细胞积分光密度差异统计结果图，其中，A图：CITED4+细胞，B图：METRN+细胞；
图7为在训练集中，CITED4+细胞对不同退变的人椎间盘髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）；
图8为在训练集中，METRN+细胞对不同退变的人椎间盘髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）；
图9为在训练集中，METRN+CITED4+细胞对不同退变的人椎间盘髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）；
图10为在验证集中，不同组别人椎间盘髓核组织中CITED4+细胞个数、METRN+细胞积分光密度差异统计结果图，其中，A图：CITED4+细胞，B图：METRN+细胞；
图11为在验证集中，CITED4+细胞对不同退变的人椎间盘髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）；
图12为在验证集中，METRN+细胞对不同退变的人椎间盘髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）；
图13为在验证集中，METRN+CITED4+细胞对不同退变的人椎间盘髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）；
图14为不同组别人椎间盘髓核组织中CITED4+细胞个数差异统计结果图，其中，L：轻度退变，n=17；M：中度退变，n=18；S：重度退变，n=15；LM：轻中度退变，n=35；MS：中重度退变，n=33；* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001，N.S. p>0.05；
图15为CITED4+细胞对不同退变的人椎间盘髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）；
图16为免疫组织化学染色后不同Pfirrmann分级的椎间盘髓核组织中METRN+表达的软骨细胞存在差异的结果图，100X；
图17为不同组别人椎间盘髓核组织中METRN+细胞积分光密度差异统计结果图，其中，L：轻度退变，n=17；M：中度退变，n=18；S：重度退变，n=15；LM：轻中度退变，n=35；MS：中重度退变，n=33，* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001，N.S. p>0.05；
图18为METRN+细胞对不同退变的髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）；
图19为METRN+CITED4+细胞对不同退变的髓核病理组织绘制得到的ROC曲线图，其中，A图：L/M（轻度退变与中度退变比较），B图：M/S（中度退变与重度退变比较），C图：L/S（轻度退变与重度退变比较），D图：LM/S（轻中度退变与重度退变比较），E图：L/MS（轻度退变与中重度退变比较）。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 单细胞转录组测序分析实验
1、实验材料
人退变椎间盘髓核组织5例，ChromiumTM Single Cell 3' Solution微流体平台，10 X Genomics单细胞测序平台。
2、实验方法
（1）收集人椎间盘髓核组织样本
收集人退变椎间盘髓核组织5例。样本为根据临床实际诊疗情况，必须行手术摘除治疗外伤导致腰椎爆裂性骨折患者或退行性腰椎间盘突出患者所必要留取的椎间盘病理组织，本研究获得医院医学伦理委员会的批准和所述受试者或受试者家属（监护人）的知情同意。
（2）获取椎间盘髓核组织的软骨细胞并制备单细胞悬液
用PBS将髓核组织清洗干净，眼科剪将清洗干净后的髓核组织剪碎。将剪碎的组织转移到含有组织解离液的5 mL离心管中，37℃条件下胰酶消化0.5 h，II型胶原酶37℃条件下旋转消化2.5-3 h，通过70 μm细胞筛滤膜，孵育结束后，裂解红细胞，通过40 μm细胞筛滤膜，去除死细胞，4℃条件下梯度离心，PBS重悬细胞至适当的体积。
（3）上机测序
采用基于10 X Genomics平台的ChromiumTM Single Cell 3' Solution一次性分离、并标记500-10000范围内的所有单细胞，在单细胞水平进行基因表达检测。具体流程是ChromiumTM Single Cell 3' Solution是建立在GemCode技术上的微流体平台，将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA。液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，一次性获得大量单细胞的基因表达数据，从而实现在单细胞水平进行表达测序。
（4）数据处理和细胞亚群的鉴定
分别对所有样本进行分群分析，鉴定细胞亚群，发现罕见细胞亚群。对实验组和对照组数据进行合并，进行分群分析。比较两组样品在细胞分群中的不同分布以及不同细胞类型的差异占比情况。进行差异基因表达分析，差异分析是基于细胞分群结果进行的，目的是找到每个亚群的显著差异基因，作为亚群的特征基因，从而协助识别细胞类型。通过差异基因功能注释和富集分析，即GO注释富集分析、KEGG注释富集分析、疾病注释富集分析、转录因子注释、蛋白互作网络，协助识别细胞的功能。通过以上技术对人椎间盘髓核细胞进行亚群识别。
3、实验结果
在单细胞测序上机前，对制备的单细胞悬液进行质控，以其中1例人椎间盘髓核组织样本为例，结果见图1，细胞活率为84.17%，细胞结团率为26.09%，活细胞浓度为730cells/μL，细胞平均直径为12.26 μm，活细胞颗粒比为77.05%。
通过采用基于10 X Genomics平台的ChromiumTM Single Cell 3' Solution对人椎间盘髓核组织单细胞进行分离，在单细胞水平进行基因表达检测。通过数据处理和生物信息学分析，识别人椎间盘髓核组织单细胞亚群，结果见图2，其中，第8亚群为新发现的椎间盘髓核组织软骨细胞亚群。
为了进一步准确识别第8亚群，本实施例对该亚群的差异基因进行分析，结果见图3，结果显示CITED4和METRN为这种新发现的椎间盘髓核组织软骨细胞亚群的特征基因。
实施例2 椎间盘髓核组织MRI分级及样本分组
1、实验材料
人退变椎间盘组织50例。
2、实验方法
（1）样本收集
收集人退变椎间盘组织50例。样本为根据临床实际诊疗情况，必须行手术摘除治疗外伤导致腰椎爆裂性骨折患者或退行性腰椎间盘突出患者所留取的退变椎间盘病理组织，本研究获得医院医学伦理委员会的批准和所述受试者或受试者家属（监护人）的知情同意。
（2）MRI（核磁共振成像）技术鉴定不同椎间盘组织的退变程度
采用Pfirrmann椎间盘退变的MRI（T2WI）分级标准对所有患者椎间盘退变的程度进行分级。I级：椎间盘结构质均、色亮白，髓核与纤维环边界清，信号强度高或等于脑脊液，椎间盘高度正常。II级：椎间盘结构非均质、有或无水平带，髓核与纤维环边界清，信号强度高或等于脑脊液，椎间盘高度正常。III级：椎间盘结构非均质、灰，髓核与纤维环边界不清，信号强度中等，椎间盘高度正常或轻度降低。IV级：椎间盘结构非均质、灰或黑，髓核与纤维环边界消失，信号强度中等或低信号，椎间盘高度正常或中度降低。V级：椎间盘结构非均质、黑，髓核与纤维环边界消失，信号强度低信号，椎间盘间隙塌陷。
（3）样本分组
将椎间盘组织根据MRI结果进行Pfirrmann分级后，结果I~II级分为轻度退行性病变组（L），III为中度退行性病变组（M），IV~V级分为重度退行性病变组（S）。此外，为了区别该生物标志物随着退变严重程度而存在的表达差异，从而更好的评价CITED4和METRN作为生物标志物的诊断效能，将I~II和III进一步合并为轻中度退行性病变组（LM），III和IV~V级分为中重度退行性病变组（MS）。
3、实验结果
50例人椎间盘退变组织的Pfirrmann退变分级结果见下表1，结果显示Pfirrmann退变分级I~II（轻度，L）样本17例，III（中度，M）样本18例，IV~V（重度，S）样本15例。进一步分组得到I~III（轻中度，LM）样本共35例，III~V（中重度，MS）样本共33例。
实施例3 ACAN软骨细胞鉴定实验
1、实验材料
人退变椎间盘组织50例，Anti-Aggrecan Antibody(ACAN)（博士德生物，BA2967-1，Lot No:D-blj2-08F183）。
2、实验方法
（1）样本收集
收集实施例2中经MRI鉴定过的人退变椎间盘组织50例。样本为根据临床实际诊疗情况，必须行手术摘除治疗外伤导致腰椎爆裂性骨折患者或退行性腰椎间盘突出患者所留取的退变椎间盘病理组织，本研究获得医院医学伦理委员会的批准和所述受试者或受试者家属（监护人）的知情同意。
（2）免疫组化染色及判读
常规组织固定、脱水、包埋、石蜡切片，65℃烤片1 h，脱蜡、水化，酶修复法进行抗原修复，细胞样本用95%乙醇充分固定，3%过氧化氢孵育10 min，PBS洗2次，一抗孵育30min，Anti-Aggrecan Antibody稀释浓度为1：50，PBS洗2次，二抗孵育20 min，PBS洗2次，DAB染色，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
切片的病理学结果由两名病理学家独立复查，并使用共识解释作为最终的结果。不同的结果由第三位病理学家裁决。
3、实验结果
软骨蛋白聚糖Aggrecan（ACAN）是软骨细胞外基质的重要成分，通常作为标志物用于鉴定软骨细胞。本实施例的鉴定结果见图4，通过免疫组化技术用Aggrecan（ACAN）抗体鉴定人椎间盘髓核组织中表达阳性的细胞即为软骨细胞。
实施例4 CITED4、METRN免疫组化实验及ROC曲线分析
1、实验材料
人退变椎间盘组织50例，Anti-CITED4 antibody（美国abcam公司，ab134072，YJ082412CS），Meteorin Polyclonal Antibody（美国Invitrogen公司，PA5-62335，XF3619498A）。
2、实验方法
（1）样本收集
收集实施例2中经MRI鉴定过的人退变椎间盘组织50例。样本为根据临床实际诊疗情况，必须行手术摘除治疗外伤导致腰椎爆裂性骨折患者或退行性腰椎间盘突出患者所留取的病变椎间盘病理组织，本研究获得医院医学伦理委员会的批准和所述受试者或受试者家属（监护人）的知情同意。
（2）免疫组化染色及判读
常规组织固定、脱水、包埋、石蜡切片，65℃烤片1 h，脱蜡、水化，酶修复法进行抗原修复，细胞样本95%乙醇充分固定，3%过氧化氢孵育10 min，PBS洗2次，一抗孵育30 min，Anti-CITED4 antibody和Meteorin Polyclonal Antibody稀释比例分别为1：100和1：50，PBS洗2次，二抗孵育20 min，PBS洗2次，DAB染色，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
（3）ROC曲线分析
随机对每张免疫组化切片进行3个视野的随机采图，每个视野在10X镜下被拍摄。通过Image Pro Plus软件分析每张切片3个随机视野的CITED4+的阳性细胞数，将细胞总数进行统计分析；METRN+阳性表达的积分光密度采用3个随机视野的总和。病理学结果由两名病理学家独立分析，并使用共识解释作为最终的结果，不同的结果由第三位病理学家裁决。采用SPSS软件通过平均值对轻度退行性病变和中重度退行性病变绘制ROC曲线，计算AUC曲线下面积和阈值，评价新发现的软骨细胞亚群特征基因CITED4、METRN、以及CITED4和METRN联合对椎间盘退变程度的诊断价值。
此外，本实施例将本发明收集得到的50例人退变椎间盘组织采用R语言caret包的createDataPartition函数随机分成两组（训练集和验证集），各占50%，也即训练集包含25例人退变椎间盘组织，验证集包含25例人退变椎间盘组织，进一步采用训练集和验证集进行了分析和验证。
3、实验结果
在训练集中，CITED4和METRN在各组之间的差异表达结果见图6，结果显示CITED4和METRN在不同椎间盘退变程度的患者之间存在显著性的差异表达。
在训练集中，CITED4+对应的各组间的ROC曲线分析结果见图7和下表2。除轻度与中度（L/M）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为0.875，对应的特异性为77.8%，灵敏度为87.5%；轻度与重度相比（L/S）AUC值为0.931，对应的特异性为88.9%，灵敏度为87.5%；轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为0.903，对应的特异性为83.3%，灵敏度为87.5%。结果表明CITED4是能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度的生物标志物，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在极高的应用价值。
在训练集中，METRN+对应的各组间的ROC曲线结果见图8和下表3。除轻度与中度（L/M）和轻度与中重度（L/MS）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为0.806，对应的特异性为66.7%，灵敏度为100%，轻度与重度相比（L/S）AUC值为0.875，对应的特异性为77.8%，灵敏度为100%，轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为0.840，对应的特异性为72.2%，灵敏度为100%。结果表明METRN是能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度的生物标志物，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在极高的应用价值。
在训练集中，CITED4+METRN+对应的各组间的ROC曲线结果见图9和下表4。除轻度与中度（L/M）和轻度与中重度（L/MS）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为0.875，对应的特异性为77.8%，灵敏度为87.5%，轻度与重度相比（L/S）AUC值为0.875，对应的特异性为100%，灵敏度为75.0%，轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为0.917，对应的特异性为88.9%，灵敏度为87.5%。结果表明CITED4和METRN两者联合能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在显著更优的应用价值。
在验证集中，CITED4和METRN在各组之间的差异表达结果见图10，结果显示CITED4和METRN在不同椎间盘退变程度的患者之间存在显著性的差异表达。
在验证集中，CITED4+对应的各组间的ROC曲线分析结果见图11和下表5。除轻度与中度（L/M）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为0.968，对应的特异性为100%，灵敏度为85.7%；轻度与重度相比（L/S）AUC值为1.000，对应的特异性为100%，灵敏度为100%；轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为1.000，对应的特异性为100%，灵敏度为100%。结果表明CITED4是能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度的生物标志物，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在极高的应用价值。
在验证集中，METRN+对应的各组间的ROC曲线结果见图12和下表6。除轻度与中度（L/M）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为0.984，对应的特异性为88.9%，灵敏度为100%，轻度与重度相比（L/S）AUC值为0.982，对应的特异性为87.5%，灵敏度为100%，轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为0.983，对应的特异性为88.2%，灵敏度为100%。结果表明METRN是能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度的生物标志物，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在极高的应用价值。
在验证集中，CITED4+METRN+对应的各组间的ROC曲线结果见图13和下表7。除轻度与中度（L/M）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为1.000，对应的特异性为100%，灵敏度为100%，轻度与重度相比（L/S）AUC值为1.000，对应的特异性为100%，灵敏度为100%，轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为1.000，对应的特异性为100%，灵敏度为100%。结果表明CITED4和METRN两者联合能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在显著更优的应用价值。
在本发明收集得到的总的样本集中，CITED4在软骨细胞的核中呈阳性表达。如图5可见，随着退变严重程度增加，CITED4+的阳性细胞的数量明显增多。轻度退变的CITED4+细胞约占总细胞的3%，中度退变的CITED4+细胞约占10%，而重度退变的CITED4+细胞约为60%。组间统计学差异分析结果见图14，中度与重度相比（M/S）存在显著差异（P<0.001），轻度与重度（L/S）相比存在显著差异（P<0.001），轻中度与重度相比（LM/S）存在显著差异（P<0.001），轻度与中重度相比（L/MS）存在显著差异（P=0.002）。
在本发明收集得到的总的样本集中，CITED4+对应的各组间的ROC曲线分析结果见图15和下表8。除轻度与中度（L/M）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为0.917，对应的特异性为77.8%，灵敏度为93.3%；轻度与重度相比（L/S）AUC值为0.961，对应的特异性为88.2%，灵敏度为93.3%；轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为0.938，对应的特异性为82.9%，灵敏度为93.3%。结果表明CITED4是能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度的生物标志物，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在极高的应用价值。
在本发明收集得到的总的样本集中，METRN在软骨细胞的胞浆中呈阳性表达。如图16可见，随着退变严重程度增加，METRN+的阳性细胞的数量明显增多。轻度退变的METRN+细胞约1%，中度退变的METRN+细胞约占5%，而重度退变的METRN+细胞约为50%。组间统计学差异见图17，中度与重度相比（M/S）存在显著差异（P<0.001），轻度与重度（L/S）相比存在显著差异（P<0.001），轻中度与重度相比（LM/S）存在显著差异（P<0.001），轻度与中重度相比（L/MS）存在显著差异（P=0.012）。
在本发明收集得到的总的样本集中，METRN+对应的各组间的ROC曲线结果见图18和下表9。除轻度与中度（L/M）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为0.911，对应的特异性为77.8%，灵敏度为100%，轻度与重度相比（L/S）AUC值为0.929，对应的特异性为82.4%，灵敏度为100%，轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为0.920，对应的特异性为80%，灵敏度为100%。结果表明METRN是能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度的生物标志物，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在极高的应用价值。
在本发明收集得到的总的样本集中，CITED4+METRN+对应的各组间的ROC曲线结果见图19和下表10。除轻度与中度（L/M）外，其余组别的ROC曲线AUC值均大于0.7。其中，中度与重度相比（M/S）AUC值为0.933，对应的特异性为72.2%，灵敏度为100%，轻度与重度相比（L/S）AUC值为0.953，对应的特异性为100%，灵敏度为86.7%，轻中度与重度（LM/S）相比AUC值为0.949，对应的特异性为85.7%，灵敏度为93.3%。结果表明CITED4和METRN两者联合能够标记椎间盘髓核组织退变严重程度，尤其在区别诊断中度和重度、轻度和重度、轻中度和重度退变组织中存在显著更优的应用价值。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.检测样本中CITED4和/或METRN表达水平的试剂在制备鉴别诊断椎间盘退变程度的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：
检测样本中CITED4和/或METRN的mRNA表达水平的试剂；
检测样本中CITED4和/或METRN的蛋白表达水平的试剂；或
检测样本中CITED4和/或METRN阳性表达细胞数的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测样本中CITED4和/或METRN的mRNA表达水平的试剂包括：
特异性扩增CITED4和/或METRN的引物；或
特异性识别CITED4和/或METRN的探针。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测样本中CITED4和/或METRN的蛋白表达水平的试剂包括：
特异性结合CITED4和/或METRN编码的蛋白的抗体；或
特异性结合CITED4和/或METRN编码的蛋白的亲和性蛋白。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测样本中CITED4和/或METRN阳性表达细胞数的试剂包括通过免疫组化实验检测CITED4和/或METRN阳性表达细胞数的试剂。
6.检测样本中CITED4和/或METRN表达水平的试剂在制备鉴别诊断椎间盘退变程度的系统和/或装置中的应用。
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